BAKTERİLERDE MUTASYON VE GEN AKTARIM MEKANİZMALARI

Transkript

1 BAKTERİLERDE MUTASYON VE GEN AKTARIM MEKANİZMALARI DIS213 Mikrobiyoloji Ders 10 Doç.Dr. Evrim GÜNEŞ ALTUNTAŞ

2 MUTASYON ve REKOMBİNASYON Mutasyon: Genomun mükleotit baz diziliminde meydana gelen kalıtsal değişiklik, Rekombinasyon: İki farklı genomda bulunan genlerin tek bir molekülde bir araya gelmesidir. MUTASYON + REKOMBİNASYON = EVRİMİN İTİCİ GÜÇLERİ

3 YATAY GEN TRANSFERİ Yatay gen transferi: genler verici hücreden alıcı hücreye aktarılır (horizontal gen akışı) Vertikal gen akışında ise jenerasyonlar arasında gen akışı sözkonusudur. Mutasyon sırasında bir veya birkaç baz çifti üzerinden olay gerçekleşebileceği gibi bütün bir gen üzerinden de gidebilir.

4 Mutant organizma Ebeveyninden farklı bir genotipe sahip organizmalardır. Mutant organizmanın fenotipi de ebeveyninden farklı olabilir. ÖR: E.coli de Histidin aminoasit sentezi: hisc: gen HisC: protein His + : histidin üretimi pozitif His - : histidin üretimi negatif

5 Mutant İzolasyonu TARAMA: pigment oluşturmayan suşun besiyerinde taranması SEÇME: Antibiyotikli besiyerinde antibiyotiğe dirençli suş seçimi

6 Kendiliğinden ve Teşvik ile gerçekleşen mutasyonlar Kendiliğinden Doğal radyasyon(kozmik ışınlar) ile Oksijen radikalleri ile DNA replikasyonunda hatalı eşleşme ile Teşvik ile Kimyasal mutajenler ile (nükleotit baz analogları, alkilleyici ajanlar) İyonize olan ve olmayan ışınlar

7 Tablo: mutant tipleri Fenotip Değişikliğin niteliği Mutantın belirlenmesi Oksotrof Biyosentetik yolda enzim kaybı Gereksinim duyulan besini içermeyen ortamda çoğalamama Soğuğa duyarlı İlaca dirençli Temel bir proteinin düşük sıcaklıkta inaktive olacak şekilde değişikliğe uğraması İlaca karşı geçirgenlikte, ilacın detoksifikasyonunda değişiklik Normalde üreyebileceği düşük sıcaklıkta çoğalamama Üremeyi engelleyici konsantrasyonda gelişebilme Hareketsiz Flagella kaybı Düz geniş koloniler yerine, kompakt koloniler görülmesi Virüse dirençli Virüs reseptörü kaybı Çok miktarda virüs içeren ortamda üreyebilme

8 Nokta mutasyonları Bir baz çiftinde oluşan mutasyon; fenotipik değişiklik ile hangi bölgede olduğu tespit edilebilir. 5 TAC 3 3 ATG 5 AAC TAG TAT TAC TTG ATC ATA ATG DNA Normal DNA replikasyonu transkripsiyon AAC UAG UAU UAC Asparajin Dur Tirozin Tirozin kodonu kodonu kodonu kodonu translasyon Hatalı protein (yanlış anlamlı mutasyon) Eksik protein (anlamsız mutasyon) Normal protein (sessiz mutasyon) Normal protein (yabani tip)

9 Delesyon ve insersiyon Şekiller! Çerçeve kayması Her iki durumda da çerçeve kayması gözlenir!!! Nokta mutasyonları yeni bir mutasyonla düzelebilir ancak delesyonlar düzelemez!!!

10 Translokasyon ve inversiyon

11 Geri mutasyonlar (Reversiyonlar) Gerçek revertant: mutasyonun olduğu bölgede geri dönüşümü sağlayan ikinci bir mutasyon olması. İkinci bölge revertantlarda, ikinci mutasyon ilk mutasyondan farklı bölgede gerçekleşir ve kaybedilen özellik yeniden kazanılır. Delesyon ile gerçekleşen mutasyonların geriye dönüşü zordur ve genetik çalışmalarda bunlar daha stabil mutantlar vereceğinden tercih edilir.

12 Mutasyon Oranları Mutasyonların bazıları oldukça sık, bazıları nadiren gözlenir. Bir DNA replikasyon döngüsünde replikasyon hatası görülme sıklığı baz çifti başına dir. 1 gen=1000 baz çifti 1 gende mutasyon görülme oranı = bakteri içeren kültürde mutasyon görülen suş sayısı= birkaç adet Bir kodonda tek baz değişikliği ile 27 kodondan her hangi birine dönüşüm gerçekleşir. 27 kodon 2 sessiz 1 anlamsız 24 yanlış anlamlı

13 RNA mutasyonları Bazı virüslerde RNA bulunur. RNA DNA ya oranla mutasyona 1000 kat daha açıktır (RNA da tamir mekanizması yok!!!)

14 Kimyasal Mutajenler Nükleotit baz analogları (Bromourasil, 2- aminopürin Alkilleyici ajanlar (nitroguanidin) İnterkalasyon yapanlar (Etidyum bromid)

15 Işınlar İyonize ışınlar (X, gama) İyonize olmayan ışınlar (UV) İyonize ışınlar zararlı ve kolay sağlanamadığından UV daha çok tercih edilir. 260 nm de UV DNA da primidin çifti (T veya C) oluşturur, DNA replikasyonunda hatalar gözlenir.

16 DNA Tamiri Kaynaklı Mutasyonlar DNA hasarı LexA proteini ile SOS un baskılanması, RecA ile LexA nın baskılanması Tamir mekanizması (SOS sistemi) Mutagenez! Hasarın giderilmesi sırasında kalıp bilgisi yok!

17 Mutasyon oranındaki değişiklikler Mutasyon olmalı mı, olmamalı mı??? Mutasyonlar tamamen ortadan kaldırılamaz! Mutasyon yoksa EVRİM de yok! Avantaj ve dezavantaj ları? Aşırı doğru fenotipli organizmalar X Mutasyona yatkın mikroorganizmalar

18 Mutagenez ve Karsinogenez AMES testi

19 Prokaryotlarda Genetik Madde Değişimi Transformasyon Bir hücreden ortama salınan DNA nın başka hücre tarafından alınması Transdüksiyon Verici hücreye ait DNA nın virüs aracığı ile aktarılması Konjugasyon Hücrelerarası temas ile verici hücreden alıcı hücreye DNA ve konjugatif plazmit aktarılması

20 TRANSFORMASYON Transformasyon şekil!

21 TRANSFORMASYON Gr (-) ler, Gr (+) ler, Arkeler transforme olabilen organizmalardır. Liziz sonucu DNA kırılmış halde ortama salınır. ÖR: Bacillus subtilis DNA sı 1700μm uzunluğunda (4.2 Mbç), kırılma sırasında en az 10 parçaya (10 kbç lik) parçaya bölünür. 1 gen=1000 nükleotit 10 kbç DNA parçası=10 gen Transformasyon için uygun büyüklük!!!

22 Kompetans (Yeterlilik) KOMPETANT: Transforme olabilen ve DNA alabilen hücreler Yüksek verimli doğal transformasyon yapan bakteriler: Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Thermus Doğal koşullar altında çoğu mikroorganizma ya zayıf kompetanttır ya da kompetant değildir. Escherichia coli!!! Yüksek Ca iyonu içeren ortamda bekletildikten sonra birkaç dakika soğutulursa transforme olabilir forma dönüşür. Bu durumda çift zincirli DNA moleküllerini içine alabilir ve plazmit DNA ile transformasyonda oldukça başarılıdır. E. coli genetik mühendisliğinde ve biyoteknolojide en çok çalışılan mikroorganizmadır!!!

23 Transformasyonda DNA alınması ve entegrasyonu Kompetant bakteri DNA molekülüne geri dönüşümlü olarak bağlanır, kısa süre sonra bu bağlanma geri dönüşümsüz hale gelir. Bağlanma sırasında DNA bağlanma proteinleri etkilidir. Bağlanan DNA ya çift zincir halinde ya da tek zincir halinde hücre içine alınır. Hücre içinde «kompetans spesifik» proteinler DNA yı kromozoma kadar nükleaz saldırısından korur. Kromozoma ulaşınca RecA proteini ile DNA kromozoma rekombinasyon ile entegre olur.

24

25 Transfeksiyon Bakterilerin transformasyonunda genellikle bir bakteriyofaj DNA sı kullanılır. Bakteri DNA sı parçalara ayrıldığından yönlendirmek/kontrol oldukça zordur. Ancak virüs DNA ları bir bütün halinde hücre içine dahil olabilir.

26 TRANSDÜKSİYON

27 TRANSDÜKSİYON Konak genleri Genelleşmiş transdüksiyon Konak DNA sının bir kısmı virüs DNA sına katılır. Özelleşmiş transdüksiyon Konak DNA sının bir kısmı virüs DNA sının bir kısmı çıkarılarak virüs DNA sına katılır. Her iki durumda da oluşan VİRONLAR virüsler gibi enfektif değildirler; genomlarının bir kısmında bakteriyel DNA bulunur. Tüm bakteriler transdüksiyon için uygun olmadığı gibi tüm virüsler de transdüksiyon yapamaz. Yine de bu olay doğada gen aktarımında yaygın olarak kullanılır!!! Escherichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella,Staphylococcus vb. transdüksiyon yapan bakterilerdir.

28 Genelleşmiş ve özelleşmiş transdüksiyon

29 Plazmit aktarım mekanizması Plazmit Benziyor mu? Virüs Plazmitlerde yaşamsal faaliyetler için önemli olmayan ama hücreye oldukça önemli fonksiyon kazandıran bilgiler bulunur. E.coli de tanımlanmış 300 kadar plazmit sözkonusudur.

30 Plazmitlerin genel özellikleri Çoğu çift zincirli halkasal formdadır. Büyüklükleri 1 kb ile 1 mb arasında değişir (kromozomun %5 i kadar büyüklüktedir.) Her plazmitin hücre içindeki kopya sayısı farklıdır (1-100) Kromozomal DNA ile benzer şekilde replike olurlar. Episome olarak adlandırılan bazı plazmitler, virüslere benzer şekilde kromozomal DNA ile birleşebilirler! Plazmitler bazı durumlarda hücreden elemine edilebilirler.

31 Hücreler arası Plazmit aktarımı Konjugasyon esastır!!!

32 Plazmitlerin prokaryotlara kazandırdığı özellikler Fenotip sınıfı Antibiyotik üretimi konjugasyon Herbisit yıkımı Bütanol ve aseton oluşumu Pigment üretimi Antibiyotik direnci Kadmiyum, Kobalt, Civa vb. direnci Bakteriyosin direnci ve üretimi Enterotoksin üretimi organizmalar Streptomyces Esherichia, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus Alcaligenes Clostridium Erwinia, Staphylococcus Campylobacter, Staphylococcus, Listeria, Neisseria vb. Acidocella, Alcaligenes, Listeria vb. Bacillus, Lactococcus, Propionibacterium Staphylococcus, Escherichia

33 Plazmit çeşitleri Direnç plazmitleri Tıp alanında önemli sorun Konjugatif olanları hızla türler arasında yayılmaktadır Bir gen veya birkaç antibiyotik direnç geni taşıyabilirler. Toksin ve virülans özellikleri kodlayan plazmitler Patojenin hücreleri istila etmesi ve toksin üretiminden bazı durumlarda plazmitler sorumludur. E.coli de hemolisin (kırmızı kan hücrelerinin parçalanması ve enterotoksin (bağırsak içine aşırı tuz ve su salınmasını sağlayan toksin) plazmitlerde kodludur. Bakteriyosinler Bakterilerin yakın türleri üzerine etki gösteren protein yapısında bileşikler Kolisin (E.coli), Subtilin (B.subtilis), Nisin (Laktik asit bakterileri)

34 KONJUGASYON

35 Konjugasyon Hücrelerarası temas esastır. Plazmit temelli bir mekanizmadır. Bazen diğer genetik materyal de konjugasyon sırasında aktarılabilir. Konjugatif plazmit içeren hücre verici hücre konumundadır. Plazmitin tra bölgesi hem konjugasyon olayından hem de bu olayda görev alan eşey piluslarının üretiminden sorumludur.