HERBİSİTLERE DAYANIKLI TRANSGENİK BİTKİLER GİZEM HACIMUTO YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

Transkript

1 HERBİSİTLERE DAYANIKLI TRANSGENİK BİTKİLER GİZEM HACIMUTO YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

2 YABANCI OT NEDİR? Tarım alanlarında bulunan ve yarardan çok zarar veren bütün bitkiler olarak tanımlanabilir. Hububat, meyve, sebze ve bağlarda yabancı otlara bağlı olarak gözlenen ürün kayıpları oldukça önemli seviyelerdedir.

3 Yabancı ot mücadelesinde kullanılan başlıca yöntemler; a-mekanik, b-fiziksel, c-biyolojik ve d-kimyasal yöntemler olarak sınıflndırılabilir. Bunlardan kimyasal yöntem sentetik/doğal yabancı ot öldürücüler (HERBİSİTLER) ile gerçekleştirilen, etkinliği ve ekonomik olması nedeniyle en yaygın yabancı ot mücadele yöntemidir.

4 HERBİSİD NEDİR? Herbisidler, pestisit grubu içerisinde bulunup bitkilere toksik etkisi bulunan, genellikle sentetik bir organik kimyasal ya da yaşayan organizmalardır. Ne amaçla kullanılır? Bitki (çalı, yabani ot, rakip ve istenmeyen ağaçlar gibi vejetasyonun) büyümesi, kontrolü veya öldürülmesi için kullanılılır. Herbisitler seçici olabilir ve seçilen türü öldürürler ya da geniş spektrumlu olup seçici davranmazlar ve tüm bitkileri öldürürler. Seçici herbisitler, ise belirli hedefleri öldürürler.

5 Bir kimyasalın ticari açıdan herbisit olarak nitelendirilebilmesi için; a)geniş bir yabancı ot populasyonuna karşı etkin olması, b)kültür bitkisine, memelilere ve omurgasız canlılara karşı toksik etki göstermemesi, c)ekosisteme en az seviyede toksik etki vermesi, toprakta kalıcılığının kısa olması, d)üretim maliyetinin düşük olması gerekmektedir. Herbisitler, nihayi hedefi olan bitkiye zarar verdiklerinden dolayı, bitki üzerinden beslenen ve barınan tüm canlıları olumsuz etkilemektedir. Bu nedenle herbisitler, pestisitler içerisinde doğaya en fazla zarar veren grup olarak nitelendirilirler. Ancak çoğu insektisit insan ve hayvanlar için toksik olmalarına karşın herbisitler bu organizmalar üzerinde toksik etki yapmamaktadır. Herbisitler genellikle bitkilere özgün biyokimyasal yolları etkilemekle birlikte değişik etki mekanizmaları olan farklı grup herbisitler de mevcuttur.

6 Herbisitlerin hedef aldıkları sistem ve hedef moleküller Etkili madde Etkilediği sistem Hedef Protein Spektrum Sulfonilurea Alifatik amino asit sentezi Asetolaktat sentaz seçici İmidazolinon Alifatik amino asit sentezi Asetolaktat sentaz seçici Glifosat Aromatik amino asit sentezi 5-enolprivil-shikimate-3-fosfat sentaz (EPSPS) total Phosfinotrisin (PTT) Glutamin sentezi Glutamin sentaz total Triazin Fotosentez (fotosistem-ii) Q B proteini total Bromoxinil Fotosentez (fotosistem-ii) Q B proteini total Bipiridiliumlar (paraquat) Fotosentez (fotosistem-i) Ferrodoksin total Ariloksifenoksipropionat Lipid sentezi Asetil coenzim A karboksilaz (ACCase) seçici Fenoksiasetik asitler (2,4-D)?? seçici Dinitroanilinler Hücre bölünmesi Tübilin seçici Bipiridilumlar, paraquat, diquat Fotosentez (fotosistem-i) Elektron transfer sistemi total

7 Herbisite dayanıklı bitki nedir? Kültürdeki bitki hücrelerinin ya da bir tür veya daha büyük bir takson içindeki bir bitki populasyonunun, normal yaşam siklusu sürerken, yabani ırkın dayanabileceği dozdan daha fazla herbiside dayanabilme kabiliyeti, özelliği ya da kalite özelliğine sahip bitkilerdir.

8 Niçin herbisite dayanıklı bitki? Pazar payları % 60 olan Dünyanın 7 en büyük agrokimyasal şirketi GM bitkiler üretmektedirler. Yıllık herbisit satışları 5 milyar $ a ulaşmış olup yeni GM bitkilerin oluşturulması ile bu rakam artış gösterecektir. Ürün veriminin % 20 si böcek ve hastalık kayıpları iken % 20 si yabancı ot nedeniyle olan kayıplardır. GM bitkilerin üretilme amacı; Total herbisitlerin tarlada kültür bitkileri de dahil tüm bitkileri öldürebilmesi, Herbiside dayanıklı bitki üretimi ile kültür bitkilerine zarar vermeksizin yabancı ot kontrolü amacıyla geniş spektrumlu herbisitlerin kullanımının sağlanabilmesi.

9 HERBİSİTLERE DAYANIKLI BİTKİ ELDE EDİLMESİ Kültür bitkilerine herbisitlere karşı dayanıklılık kazandırılması yönünde yapılan çalışmalarda 3 değişik strateji izlenmektedir: 1. Hedef molekülün modifikasyonu 2. Hedef molekülün fazla üretimi 3. Etken maddenin detoksifikasyonu Bu stratejilerden ilk iki tanesi herbisitin etkilediği hedef molekülün aktif maddeden korunmasına yönelik olup üçüncü stratejide ise aktif maddenin farklı bir bileşiğe çevrilerek etkenliğinin ortadan kaldırılmasını amaçlamaktadır.

10 Bu stratejilerin başarılı olarak uygulanabilmesi için, moleküler biyoloji, genetik mühendisliği, genetik transformasyon, bitki doku kültürü yöntem ve uygulamalarının birlikte kullanılması gerekmektedir. hedef gen klonlanması uygun bir transformasyon vektörünün oluşturulması uygun bir gen aktarım sistemi ile kültür bitkisinin genetik transformasyonu kültür bitkisinin rejenerasyonu, moleküler biyoloji genetik mühendisliği genetik transformasyon bitki doku kültürü

11 1)Hedef molekülün modifikasyonu Amaç herbisitin aktif maddesinin hedef aldığı proteinin modifikasyonu (proteinin aktif maddeye duyarsız hale getirilmesi)dur. Böylece kültür bitkilerine, normal hücresel fonksiyonunu yerine getirebilen fakat herbisitin aktif maddesince etkilenmeyen, yeni bir protein sentezlettirilir. Bu çalışmalarda iki farklı yaklaşım gözlenmektedir: 1. Hedef proteinin sentezinden sorumlu gen kültür bitkisinden izole edilip manipüle edildikten sonra tekrar kültür bitkisine aktarılır. 2. Hedef proteinin sentezinden sorumlu gen, herbisite dayanıklılık gösteren bir diğer organizmadan izole edilip kültür bitkisine aktarılmaktadır.

12 (1) Hedef genin kültür bitkisinden izolasyonu Hedef genin manipülasyonu Manipülasyonu yapılan genin, gen aktarım vektörüne klonlanması Vektör aracılığı ile hedef genin bitki hücrelerine aktarımı Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi

13 (2) Herbisite dayanıklı organizmanın belirlenmesi Hedef genin organizmadan izolasyonu Hedef genin vektöre klonlanması Vektör aracılığı ile genin bitki hücrelerine aktarımı Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi

14 Bu stratejiler izlenerek : mutant ALS genleri kullanılarak sulfonilurea tipi herbisitlere dayanıklı transgenik bitkiler, psba geni (Triazine dayanıklı yabancı otlardan ve siyanobakterilerden izole edilen) tütüne aktarılarak triazine dayanıklı transgenik bitkiler, Mutant aroa geni tütün ve domatese aktarılarak Glifosata dayanıklı transgenik bitkiler, Memelilerde P450 monooksigenaz enziminin sentezinden sorumlu genin (ilaçları metabolize eden) tütüne aktarılması ile herbiside dayanıklı transgenik bitkiler, Hedef molekülün yapısı aktarılan sentetik RNA/DNA mol.leri ile değiştirilerek İmmidazolin bazlı herbisitlere dayanıklı tr mısır bitkileri geliştirilmiştir.

15 2)Hedef Molekülün Fazla Üretimi Amaç, bitkilerdeki hedef molekülün bazı genetik manipülasyonlarla daha fazla üretilmesi sonucu, herbisit aktif maddesinin varlığında da hedef molekülün sorumlu olduğu hücresel fonksiyonları yerine getirebilmesidir. Bu yöntem kullanılarak: Petunya da EPSPS aktivitesi 20 kez arttırılarak glifosata toleranslı bitkiler, Darıdan izole edilen EPSPS geni,buğdaya aktarılarak glifosata dayanıklı kallus dokusu, Brassica napus ta glutamin sentetaz enziminin fazla sentezi ile PPT ne dayanıklı bitkiler, Tütünde glutamin sentetaz enziminin fazla sentezi ile PPT ne dayanıklı bitkiler elde edilmiştir.

16 3)Etken Maddenin Detoksifikasyonu Bitkiye herbisitin aktif maddesini detoksifiye eden yeni bir enzimin sentezlettirilmesidir. Bu amaçla, detoksifikasyon yapan enzimin sentezinden sorumlu gen bitkilere aktarılmakta ve bunun sonucunda herbisitin aktif maddesi hedef molekülü etkileyemeyen bir bileşiğe çevrilmekte ve dolayısıyla hedef molekül herbisitin varlığında bile normal hücresel işlevini sürdürebilmektedir. Bu yöntemle: Bitkilere 2-4,D detoksifikasyonunu sağlayan bakteri orjinli monooksigenaz enzimi sentezlettirilerek bu herbisite dayanıklı tütün ve pamuk bitkileri, PPT nin detoksifikasyonu amacıyla bakteri orjinli bar ve pat genleri bitkilere aktarılarak Bialafos ve/veya glufosinat amonyuma dayanıklı tr bitkiler geliştirilmiştir.

17 Glutamin Sentetaz İnhibitörleri YA DA PPT e Dayanıklı Bitki Üretilme Mekanizması Gram pozitif toprak bakterileri olan Streptomyces hygroscopicus ve Streptomyces viridochromogenes suşları fosfonotrisil-alanil-alanin yapısında bir tripeptid üretmektedirler. Bialaphos olarak adlandırılan bu bileşiğin hücre içerisinde peptidaz aktivitesi ile hidrolizi sonucu oluşan fosfinotrisin (PPT) glutamin amino asidinin bir analoğu olup amino asid biyosentezinde rol alan Glutamin Sentaz (GS) enziminin rakip inhibitörüdür. PPT amino asit biyosentezinde önemli rolü olan glutamin sentetaz enzimini inhibe etmektedir. GS enzimi glutamik asit ile amonyumun tepkimeye girerek glutamini oluşturduğu tepkimeyi katalizleyen enzimdir. GS enzimi Glutamik asit + NH4 + ATP > Glutamin +ADP +Pi + H +

18 PPT ye Dayanıklı Transgenik Bitkilerin Geliştirilmesi Bahsedilen avantajları nedeniyle yabancı ot mücadelesinde yaygın olarak kullanımı sözkonusu olan PPT nin kontak etkili herbisit olması yaygın olarak kullanımını etkileyen en önemli faktördür. Bu nedenle PPT ye dayanıklılık gösteren kültür bitkilerinin geliştirilmesi yönünde bir çok çalışma bulunmaktadır. Bu yönde 2 temel strateji vardır: 1. GS enziminin arttırılması 2. PPT nin hücre içindeki detoksifikasyonu

19 ROUNDUP READY RoundupTM glyphosate olarak bilinen kimyasal ismi N- phosphonomethylglycine olan glisin amino asidinden türemiş bir organofosfat bileşiğidir. Çok geniş spektrumludur ve yeşil olan her bitkiyi öldürür. Monsanto herbisit kullanımını arttırmak için glifosata dirençli ticari bitki çeşitleri geliştirmek istemiş ve 1980 lerin başlarında EPSPS genini izole ederek klonlamış ve bitkilere transforme ederek bu enzimin fazla üretilmesini sağlama metoduyla transgenik çeşitler elde etmiştir.

20 Petunia hybrida Yüksek EPSPS seviyeleri gösteren bitkilerin seçimi Enzimin saflaştırılması Petunia yaprak disklerinin transfekte edilmesi Ti vektör içine ekleme cdna hazırlanması EPSPS geninden mrna izolasyonu Kallus dokusunun alınıp bitki rejenerasyonu yapımı EPSPS in kez fazla üretimi P.Hybrida dan EPSPS üretimi

21 Bu EPSPS enziminin aşırı üretimi transgenik bitkilerin glifosata artan tolerans göstermelerini sağlamış fakat büyümede gecikmelere neden olduğu için ticari olarak kullanılamamıştır ların ortalarında CP4 EPSPS geni olarak adlandırılan Agrobacterium CP4 ırkından elde edilen farklı bir EPSPS geni kullanıldı. Yürütülen bu çalışmalar sonucunda soya DNA sı içerisine sabit olarak entegre olmuş CP4 EPSPS ve EPSPS CTP genlerini bütün olarak içeren PV-GMGT04 plasmidinin bir fragmenti bulundu. Son transgenik türler yabani türlerden 3 kez daha fazla glifosata dirençli olmuşlardır. Glifosat işlemlerinin kullanımından kaynaklanan verim artışı Monsanto tarafından % 7 olarak belirtilirken bu transgenik türlerin geleneksel ıslah yöntemleri ile aynı seviyede eldesinin ise 20 yıl aldığı belirtilmiştir.