KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman POLAT Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Tez Danışmanı Doç. Dr. Adem KARA Yüksek Lisans Tezi

2 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman POLAT Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Doç. Dr. Adem KARA ERZURUM 2015

3 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIP HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman POLAT Tez Savunma Tarihi : Tez Danışmanı Jüri Üyesi Jüri Üyesi : Doç. Dr. Adem KARA : Prof.Dr.Bünyamin ÜNAL : Yrd. Doç. Dr. İsmail CAN Onay Bu çalışma yukarıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Yavuz Selim SAĞLAM Enstitüsü Müdürü Yüksek Lisans Tezi ERZURUM 2015

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... IV ÖZET... V ABSTRACT... VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... VII ŞEKİLLER DİZİNİ... VIII TABLOLAR DİZİNİ... X 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Kanser Kanser Patogenezisi Hücre Siklusu ve Karsinogenez Kolon Kanseri Kolon Kanseri Patogenezi Kolorektal Kanser Etiyolojisi Kanserogenezde Tedavi Seçenekleri Hücre ölümü Apoptozis Otofaji Cisplatin Etki Mekanizması Cisplatinin doz sınırlayıcı etkileri; Kanser Tedavisinde Antioksidanların Rolü Melatonin Melatonin Hormonunun Biyosentezi ve Salgılanması Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi MATERYAL VE METOT Hücre Kültürü Hücre Kültür Medyumunun Hazırlanışı Hücre İnkübasyon Koşulları I

5 Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing) Hücre Dondurma ve Saklanması Hücre Sayılarının Hesaplanması Hücre Canlılığı Analizi MTT Yöntemi Yapılış Yöntemi Tunel Boyama Metodu Hücrelerin lamda üretilmesi Fiksasyon Tunel Boyama Tunel Pozitif Hücre Değerlendirmesi Kantitatif Real Time PCR (qrt-pcr) Analizleri RNA İzolasyonu cdna Sentezi Real Time PCR Cihazına Yükleme Aşaması RT-PCR (Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mrna Ekspresyonlarının Ölçülmesi TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mrna Ekspresyon Tayininde Roche Lightcycler 480 Real-Time PCR Cihazı İstatistiksel Analiz BULGULAR MTT Sitoksisite Sonuçları Tunel Analizi Sonuçları mrna ekspresyonu Değerleri Sonuçları TP53 mrna ekspresyonu değerleri MDM2 mrna ekspresyon değerleri CDKN1A (P21) mrna ekspresyonu değerleri CDKN1B (P27) mrna ekspresyonu değerleri BECLİN1 mrna ekspresyonu değerleri ATG-4 mrna ekspresyonu değerleri LC3 mrna ekspresyonu değerleri TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER II

6 KAYNAKLAR EKLER EK 1. ÖZGEÇMİŞ EK 2. ETİK KURUL ONAY FORMU III

7 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tezi olarak sunduğum bu çalışmanın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen yapıcı, yönlendirici değerli bilgi, tecrübe ve katkılarıyla bana daima yol gösteren öğrencisi olmaktan mutluluk duyduğum danışman hocam Doç. Dr. Adem KARA ya sonsuz teşekkür ederim. Tez çalışmam süresince yardım ve birikimlerinden yararlandığım Prof. Dr. Bünyamin Ünal a ve Histoloji ve Embriyoloji Anabilim dalı öğretim üyeleri ile eğitim öğretimim sırasında ilgi ve desteklerini esirgemeyen Atatürk Üniversitesi Acil Biyokimya çalışma arkadaşlarıma, rahmetle andığım dostum Recep TEPE ye, yoğun eğitim dönemim boyunca sabırla beni destekleyen eşime ve evlatlarım Mustafa Göktuğ Tuğsem Yüsra ya dualarını esirgemeyen anneme, babama ve büyüklerime, bana selam veren ve alan insanlara, varlığıma şahit olan doğada bulunan bütün varlıklara teşekkür ederim. Süleyman POLAT IV

8 ÖZET Kolorektal Kanser Hücrelerinde Melatonin ve Cisplatin Uygulamasının Otofaji ve Apoptoz Üzerine Etkilerinin Araştırılması Amaç: Melatonin vücutta salgılanan ve güçlü bir antioksidan madde olup günümüzde anti-kanser etkileri önemle çalışılmaktadır. Cisplatin ise birçok kanser türü tedavisinde kullanılan ve vücuda önemli toksik bir etki bırakan platin grubu kemoterapotik ajandır. Çalışmada HT-29 insan kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve/veya cisplatin uygulamalarının otofajik ve apoptotik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot: Tüm uygulamalar in vitro şartlarda insan kolon kanseri hücrelerinde (HT-29) gerçekleştirildi. Melatonin 5 ve 10 nm ve cisplatin 50 µm dozlarda uygulanarak 24 ve 48 saat süre ile inkübe edilen gruplarda sitotoksisite değerlendirmesi için MTT analizi kullanıldı. Tunel analizi ile apoptotik hücreler belirlendi. Ayrıca BECLİN1, ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3 genleri mrna ekspresyonu seviyeleri kantitatif Real-Time PCR yöntemiyle belirlendi. Bulgular: Çalışma MTT sonuçlarında 24-sa inkübasyon gruplarında en yüksek toksik etkinin cisplatin uygulamasıyla olduğu görülürken, melatonin grupları önemli oranda sitotoksik olmamışlarıdır. Kırk-sekiz saatlik gruplardaysa melatonin ve/veya cisplatin uygulamalarının sitotoksik olduğu belirlendi. Ayrıca, tunel analizlerinde ciplatin ve/veya melatonin gruplarında pozitif hücre yoğunluklarının hem 24-saat hemde 48-saat inkübasyon gruplarında kontrol grubuna göre artmış olduğu görüldü. apoptotik ve otofajik genlerdeki mrna ekspresyon seviyelerinin melatonin ve/veya cisplatin uygulaması ile değiştiği tespit edildi. Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları apoptotik ve otofajik etkinliğin melatonin ve cisplatinmelatonin kombine uygulamaları ile anlamlı düzeyde etkilendiğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz,, cisplatin, kolon kanseri, melatonin, otofaji V

9 ABSTRACT Investigation the Effects of Melatonin and Cisplatin Treatment on Autophagy and Apoptosis in Colorectal Cancer Cells Aim: Melatonin is a powerful antioxidant agent and produced in the body what anticancer effects has been investigated. Also, cisplatin is a platinum group chemotherapeutic agent, which has used for treatment of many cancer types and it has severe toxic effect on body. In the present study, it was aimed to investigate the apoptotic and autophagic effects of melatonin and/or cisplatin treatment on HT-29 human colorectal cancer cells. Material and Method: All experiments were performed in human colon cancer cells (HT-29). Doses of Melatonin 5 and 10 nm and cisplatin 50 µm were treated with colon cancer cells for 24 and 48 hours incubation groups and MTT analysis was used for evaluation of cytotoxicity. Quantitative Real time PCR was used to determine the mrna expression levels of TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 and LC3 genes. Results: In the analysis of MTT, while it was seen that cisplatin showed the highest cytotoxicity in 24 hours period, melatonin groups has showed no severe cytotoxicity in 24 hours period. In addition, 48 hours incubation groups, there were cytotoxic effect in the groups of cisplatin and/or melatonin. As well as in the Tunel analysis, there were increased positive cell densities in the groups of cisplatin and/or melatonin for 24 and 48-hours incubation periods. Changed levels of expression of mrna apoptotic and autophagic genes in cisplatin and/or melatonin groups. Conclusion: The results of current study revealed that melatonin and combined of melatonin and cisplatin treatments significantly effected apoptotic and autophagic activities. Key words: Apoptosis, autophagy, cisplatin, colon cancer, melatonin VI

10 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ APC : Adenomatous Polyposis Coli ATG : Autophagy-related proteins (Otofaji ilişkil proteinler) CAMKK2 : Kalmodulin bağımlı protein kinaz 2 CDDP : Cis-dimminedichloroplatinum II CDKs : Siklin-bağımlı kinazlar DCC : Deleted in colorectal carcinoma (Silinmiş kolorektal karsinoma) DMSO : Dimetilsülfoksit DNA : Deoksiribonükleik asit ER : Endoplazmik retikulum FAP : Familial adenomatous polyposis (Ailesel Adenomatöz polipozis) G0 : Gap 0 G1 : Gap 1 G2 : Gap 2 GTP : Guanozin trifosfat IAP : İnhibitors of apoptosis (Apoptoz baskılayıcılar) MMR : Mismatch repair gen, yanlış onarılmış gen mtor : Mammalian target of rapamycin (Memeli rapamisin hedefi) NPCC : Hereditary non-polyposis colorectal carcinoma (Herediter non-polipoz kolorektal karsinoma) PBS : Fostat tampon solüsyonu prb : Retinoblastoma proteini qrt-pcr : Kantitatif rreal time polimeraz zincir reaksiyonu RNA : Ribonükleik asit ROS : Reaktik oksijen türleri S : Sentez fazı TNF : Tümör nekroz edici faktör TOR : Target of rapamycin (Rapamisin hedefi) TP53 : Tümör protein 53 VII

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 2.1 Hücre siklusu, siklinler ve CDKs ilişkisi ( mitoza G2 fazının geçişini artırır) komplekslerinin aktivitesini artırır... 7 Şekil 2.2. Hücre siklusunun düzenlenmesinde siklinler, CDK ve CDK inhibitörlerinin rolü... 9 Şekil 2.3. Cisplatin moleküler yapısı Şekil 2.4. Cisplatine karşı gelişen direnç mekanizması Şekil 2.5. Melatonin salgılanmasının fizyolojisi Şekil 3.1. Stereolojik Optik Fractionator Frame metodu ile tunel pozitifliğinin değerlendirilmesi Şekil 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçları Şekil 4.2. Kontrol grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.3. Mel-5µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.4. Mel-10µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.5. Cisplatin grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.6. Mel-10µM- Cis grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.7. Kontrol grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.8. Şekil 4.9. Şekil Mel-5µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Mel-10µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Cisplatin grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü VIII

12 Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Şekil Mel-10µM- Cis grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri IX

13 TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 3.1 cdna sentezi reaksiyon karışımı Tablo 3.2. cdna sentezi için PCR sıcaklık ve süre basamakları Tablo 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçlar.. 43 Tablo 4.2. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait 1000 µm 2 alandaki Tunel pozitif hücre yoğunlukları Tablo 4.3. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri Tablo 4.4. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri Tablo 4.5. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri Tablo 4.6. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri Tablo 4.7. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri Tablo 4.8. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri Tablo 4.9. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri X

14 1. GİRİŞ Kanser hem çevresel hem de kalıtsal faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan mortalitesi yüksek bir hastalıktır. Kanser genellikle deoksiribonükleik asit (DNA) hasarına bağlı olarak normal hücrelerden orijinlenmektedir. Bununla birlikte bazı kanserlerin anne babanın DNA larındaki hasara bağlı olarak ta kalıtımsal olarak meydana geldiği belirtilmektedir. Kanserde ölüm oranlarının yüksek olması da bu hastalığın insan sağlığı açısından önemini daha da artırmaktadır. 1 Kolon kanseri genetik ve epigenetik değişimlere bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Kolon kanserinin meydana gelmesinde beslenme tarzının çok önemli olduğu belirtilmektedir. Yağ ve protein oranı yüksek fakat fiber oranı düşük meyve ve sebzelerle beslenmenin bu hastalığın oluşumunu artırdığı belirtilmektedir. 2,3 Hücre ölümünün düzenlenmesi embriyolojik gelişim ve doku hemostazisi için önemli bir aşamadır. Son yıllarda hücre ölümünü kontrol eden birçok yolak hücre ve dokuda tarif edilmiştir. Hücre ölümü sırasında oluşan morfolojik değişikliklerin, apoptoz ile mi yoksa tip II programlı hücre ölümü olarak bilinen otofaji sonucunda mı oluştuğunun tanımlanabilmesi zordur. 4 Bununla birlikte, otofajik ve apoptotik hücre ölümü arasında biyokimyasal ve morfolojik farklar bulunmaktadır. Otofajide, kaspaz uyarımı ve DNA parçalanması ortaya çıkmaz. Otofaji hücresel organellerdeen olan mitokondri, golgi gibi sitoplazmik organelleri ve sitoplâzma parçalayan inta sitoplazmik keselerin ortaya çıkmasıyla tanımlanır. İnta sitoplazmik keselerin ortaya çıkmasında etkili olan hücrenin yoğunluğu, oksijen miktarının konsantrasyonu, ısı, hormonların etkisi ve besin miktarı gibi durumların otofaji mekanizmasında önemi bulunmaktadır. Apoptozda, hücre iskelet proteinlerinde erken yıkım olayı ortaya çıkarken organeller geç aşamaya kadar varlıkları sürdürürler. Otofaji de ise bu durum farklıdır, organeller erken yıkıma uğrar ve geç döneme kadar hücre iskelet elementleri parçalanmaz. 1

15 Cisplatin uygulaması ile kanser hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyon artışının uyarılması sonucunda kemoresistans gelişimi bildirilmiştir. 6 Bu direnci ortadan kaldırmak için cisplatinin yüksek dozlarda uygulanması gerekmektedir ancak yüksek dozlarda cisplatinin nefrotoksisite ve hepatotoksisite gibi toksik etkileri ortaya çıkarmaktadır. 7, 8 Dolayısıyla, bu kemoterapötiklerden birkaçının kombine kullanımı ya da antioksidan bir madde ile kombine kullanımı son yıllarda birçok kanser tedavisinde başvurulan seçeneklerden birisi olmaktadır. Böyle kombine kullanımın sonucu olarak kanser tedavisinde daha etkin bir sonuç ve daha düşük toksisitenin oluşması sağlanabilmektedir. 9 Diğer taraftan melatoninin kanser hastalarında biyolojik regülasyonu düzenleyerek yeni tümör oluşumlarını engellediği ve kanser hastalarının yaşam kalitesini iyileştirdiği görülmüştür. 10 Bu amaçla, bu çalışmada, melatonin ve/veya cisplatin kullanımının kolorektal kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik, apoptotik ve otofajik etkinliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. 2

16 2.1. Kanser 2. GENEL BİLGİLER Kanser, yüzyıllar öncesinen günümüze kadar gelinen süreçte etkisini sürdürmekte ve insanları geçmişte olduğundan daha fazla tehdit eden ölümcül bir hastalık olmaktadır. Kanser terimini ilk olarak, Yunan fizikçi Hippocrates (MÖ ) tarafından tanımlanmaya çalılşılmıştır. Yunan fizikçi Hippocrates carcinos ve carcinoma terimlerini ülser oluşumuna sebep olan ve ülser oluşturmayan tümörler için kullanmıştır. Bununla birlikte hastalığın ilk keşfi Hippocrates tarafından olmamıştır. Kanserin varlığına yönelik olarak daha eski bilgilere mısırdaki mumyalarda ve yazıtlarda rastlanmıştır. 11 Kanserin ilk tanımlandığı günden bugüne asırlar geçmesine rağmen bazı kanser tiplerinin tedavisinin çok kısıtlı ya da mümkün olmadığı, bazı kanser türlerinin ise büyük oranda tedavi edilebileceği bildirilmektedir. 12 Hücrelerin kontrolsüz çoğalmasına bağlı olarak ortaya çıkan kanser, sadece bulunduğu dokuda değil aynı zamanda uzaklardaki doku ve organlarda da işlev kaybına sebep olmaktadır. Kanserde ölüm oranlarının yüksek olması da bu hastalığın insan sağlığı açısından önemini daha da artırmaktadır. 1 Kanserogenez, hücrelerin kontrolsüz ve aşırı çoğalmalarının yanı sıra, immün sistemin gözetiminden kaçarak daha uzaktaki dokulara sıçrayarak o dokuları işgal eden, metabolik ve davranışsal değişikliklere sebep olan çok basamaklı bir süreçtir. 13 Kanserli vaka sayısı yıllar içinde artış göstermiş ve 2025 yılına kadar kanser vakalarının dünya çapında görülme olasılığı yirmi beş milyonu aşacağı öngörülmektedir. Bu nedenle kanserogenez süreci ve tedavisi bugünkü araştırmacılar tarafından en çok araştırılan konular arasında olup ve kanserin ortaya çıkma nedenleri ve tedavisi üzerine yapılan çalışmalar her geçen gün artmakta, daha etkili ve en az yan etkiye sahip tedavi süreci arayışları sürmektedir. 14 3

17 Tümör hücrelerinin tiplendirilmelerinde çevre dokulara yayılış özellikleri isimlendirmede önemli bir kriter olup, yayılış özelliğine göre iyi huylu (benign) ve kötü huylu (malign) tümörler olarak adlandırılır. Benign tümörler büyümezler, çevre dokulara metastaz yapmaz ve cerrahi yolla uzaklaştırılabilmektedirler. Dolayısıyla da yaşamı tehdit edici unsurlar değildirler. Oysa malign tümörler, vücudun çeşitli organ ve dokularına yayılabilir ve sürekli çoğalabilir, Malign tümörler kendilerini apoptozdan koruyabilirler. Tümör hücrelerinin tiplendirilmesinde, bulundukları hücre, doku ya da organ çeşitleri de dikkate alınmaktadır. Bu kanser tipleri adlandırılırken köken aldığı yer ve nerede büyümeye başladığı gibi faktörler göz önünde bulundurulmaktadır. Lökositlerin kanseri (beyaz kan hücreleri) lösemi, bağdokuda özelleşmiş lenfositlerin tümörü lenfoma, derinin melanosit denilen pigment hücrelerinden köken alan kanserler melanoma, mide, akciğer gibi boşluklu organların epitelinden köken alan tipleri karsinoma, bağdoku ve kas dokudaki kanserler de sarcomas olarak adlandırılır. 12 Terminolojik olarak spesifik tip kanserler; meme, kolon, akciğer ve prostat kanserleri gibi organ adlarıyla da isimlendirilirler Kanser Patogenezisi Kanser hem çevresel hem de kalıtsal faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan mortalitesi yüksek bir hastalıktır. Kanser genellikle DNA hasarına bağlı olarak normal hücrelerden orijinlenmektedir. Bununla birlikte bazı kanserlerin anne babanın DNA larındaki hasara bağlı olarak ta kalıtımsal olarak meydana geldiği belirtilmektedir. Kanserde diyet, çevresel faktörler, kalıtılan mutasyonlar ve somatik mutasyonlar gibi birçok durum kanser nedeni olabilmektedir. Normal vücut hücrelerin kanser hücrelerine dönüşmesi DNA nın hasara görmesiyle ya da mutasyonlar ile ortaya çıkar. DNA daki bu hasar, DNA replikasyonunda bağlı ya da metabolik bir ürün olan serbest radikallerin organellere ya da DNA da hasat oluşturmasına bağlı olarak görülmektedir. DNA iyonize radyasyon, 4

18 ultraviyole radyasyon ve kimyasal karsinojen gibi maddeler ile de hasarlanabilir. Bu şekilde DNA hasar görür ve sonraki nesillere mutant DNA lar aktarılır. 15, 16 Diğer taraftan DNA nın kendi kendini tamir mekanizması vardır. Fakat DNA onarım mekanizması bazen yetersiz kalır ve mutasyon adı verilen DNA dizisindeki daimi değişiklikler oluşur. Normal hücrelerdeki DNA hasarı çoğu zaman tamir edilmektedir. Tam tersine kanser hücrelerindeki DNA hasarı ise tamir edilememektedir. 11 Yapılan araştırmalarda çevresel ve kalıtsal faktörlerin yanı sıra virüslerin de çeşitli kanserlere sebep olabileceği bildirilmiştir. Örneğin, Hepatit B veya C virüsünün gelişimi karaciğer kanserine, Epstein-Barr virüsünün non-hodgkin lenfomaya ve nazofaringeal kansere, insan papilloma virüsünün servix, vulva ve penis kanserine yine HIV virüsünün non-hodgkin lenfomaya sebep olduğu belirtilmektedir. 11 Hücre siklusunda iki tip gen grubu rol oynar. Bunlar onkogenler plan Myc, Ras genleri ve tümör baskılayıcı genler olan P53, Rb geni gibi genlerdir. Onkogenler, kanserin ortaya çıkmasında dolaylı olarak etkin olan genler olup tümör oluşumunu tetiklerler. Tümör baskılayıcı genler ise kanser gelişimini engelleyen genlerdir. Hücre siklusunu baskılayan bu genlerde değişim olursa ve tamir edilmezse bu gen hücre bölünme kontrolünü sağlayamaz ve kanser oluşur. Normal hücrelerde DNA hasarı oluştuğu durumda hücre siklusu inhibitör siklinler aracılığı ile G evresi sırasında inhibe edebilmekte ve hücreye tamir için zaman kazandırmaktadır. DNA hasarı tamir edilemeyecek boyutta ise hücre apoptozise gider Hücre Siklusu ve Karsinogenez Normal hücre siklusunda unipotent kök hücrelerden yeni hücrelerin oluşumu esnasındaki bölünme (mitoz) ve hazırlık (interfaz) dönemleri halindedir. Hücre bölünme aşamaları; 5

19 İnterfaz dönemi: Hücrenin dinlendiği ve mitoz bölünme için bir hazırlık dönemdir. Genelde memeli hücrelerinde saat sürer. Bu dönemde hücre içerisinde ribonükleik asit (RNA) sentezi, protein üretimi ve hücre boyutunda artış görülür. İnterfaz aşaması 4 alt döneme ayrılır. Bunlar; Gap 0 (G0), Gap 1 (G1), Sentez dönemi (S), ve Gap2 (G2) dir. G0: Hücre bölünme olmadan dinlendiği süreçtir. Bu süreç nöral hücrelerde olduğu çol uzunca bir süre olabilir. G1: Hücre hacmini arttırır ve RNA üretimi ve protein sentezi görülür. DNA sentezi için hazırladık yapılır ve hücre kontrolü mekanizması aktiftir. Sentez dönemi (S): DNA replikasyonu olur ve DNA iki katına çıkar. G2: Bu dönem de DNA sentezi biter ve hücre büyümesine devam eder. Daha sonra protein sentezi olur. Bu aşama sonrasında G2/M kontrol noktası hücrenin mitoz ve bölünmeye ilerleyişini belirler. Mitoz veya M dönemi: Bu dönemde hücrede protein sentezi durur ve hücre iki eşit hücreye bölünür. Mitoz bölünme aşamalarında olan metafazda kontrol noktası (metafaz kontrol noktası) bulunur. Bu kontrol noktası hücrenin eşit bölünmesini sağlar. Mitoz sonrası yeni hücreler G0 ya da G1 dönemine geçerler. 17 Hücrede bölünme işlemi hücresel mekanizma ile kontrol edilmektedir. Bu mekanizma hücrenin metabolik fonksiyonlarını bölünmesini kontrol eder. Hücre içerisinde mitoz bölünme aşamalarını kontrol eden siklin-bağımlı kinazlardan (CDKs) bulunmaktadır. Bu siklinler hücrede bir dizi protein ailesi tarafından kontrol edilmektedir. Bu siklinlerin görevini tamamlamasından sonra, başka bir grup protein ailesi etkinleşir. Hücre döngüsünün özel evrelerinde aktifleşen bu siklinler, tutundukları bu aktif olmayan CDK moleküllerini etkinleştirirler. Bu Siklin -CDK molekülleri hücre içerisinde ardışık bir görev üstlenirler. Aktifleşen bu siklin molekülleri onkogenleri 6

20 etkinleştirir ve tümör baskılayıcılarının engellerler. Pek çok onkogen ve tümör baskılayıcılarının genlerin proteinleri S fazı öncesi G1 fazı başlangıcından sorumlu (hücrenin çeşidine göre değişen CDK4 veya CDK6 ile siklin D1-D3 kompleksleri) olan ve DNA nın kendini eşlemesinden sonra (sikline-cdk2) G1 fazına geçişini kontrol eden siklin bağımlı kinazların etki alanını arttırır. Hücrede bulunan proteinin yapısındaki herhangi bir değişiklikle veya proteini kodlayan segmentteki bir değişiklikle tamamlanabilen onkogene dönüşebilen gen ile tümör baskılayıcılar genler olan siklina- CDK2 (DNA eşleşmesinden sorumlu) ve siklin-b-cdk1 (Mitoza G2 safhasında geçişini artırır) etkinliğinin artıtırlar. 5 Şekil 2.1. Hücre siklusu, siklinler ve CDKs ilişkisi ( mitoza G2 fazının geçişini artırır) komplekslerinin aktivitesini artırır. 18 Hücre siklusunun kontrolü siklinler proteinlerin bulunması ve siklinlerin, siklin bağımlı kinazalar (CDKs) ile tutunması ile sağlanır. Erken G1 fazında sentezlenmekte olan siklin D, CDK4 ve CDK6 ya bağlanmaktadır. Geç G1 fazında sentezlenmekte olan siklin E ve CDK2 ye bağlanmaktadır. 7

21 Bu üç bileşik, diğer aracılarla beraber hücrenin S evresine girmesine ve S evresinde ilerlemesini sağlamaktadır. CDK2 ve CDK1 e bağlanan Siklin A ile oluşan kompleksler, hücrenin S fazından çıkıp G2 fazına girmesini sağlar ve Siklin B nin oluşumunu başlatır. İndüklenen Siklin B, CDK1 e bağlanır ve hücre G2 fazından ayrılıp M fazına geçişine müsaade eder. Vazifelerini yerine getiren siklinler, ubikuitin-proteazom yoluyla yıkımlanırlar. 12 Proteinkinazların aktif hale gelmesi için ekstrasellüler mesajlaşmadan sorumlu moleküllerinin (mitogenler) kendi almaçlarına bağlanması gerekmektedir. Aktif hale gelen proteinkinazlar, sitoplazmada bulunan sinyal ileti moleküllerini (Ras ve Jak) ve transkripsiyon etkenlerini (Jun, Fos, NF-AT, NFκβ, Myc) fosforilleyen kinazları (proteinkinaz C ve ERK) tetiklerler. Transkripsiyonel düzenlemeyi etkili bir şekilde sağlayan E2F, prb (retinoblastoma proteini) ile bağımlıdır ve prb tarafından baskılanır. E2F, G1 evresinden çıkıp S evresine girmesini sağlayan kontrol noktasının geçilmesi için gerekmektedir. DNA nın sentez evresine girmesi için G1 fazından S fazına geçişi sağlanmalıdır. Bunun için proteinkinazların uyarısıyla (Siklin D CDK4, Siklin D-CDK 6 bileşikleri ile) E2F bağlı Rb fosforilasyonu sonucu, E2F serbestlerin. DNA replikasyonu için zorunlu olan proteinler E2F transkripsiyon etkisinin aktif hale gelmesi sonucu, Deoksiribonükleotit ve bazı düzenleyici proteinlerden üretilirler (Şekil 2.2). 8

22 Şekil 2.2. Hücre siklusunun düzenlenmesinde siklinler, CDK ve CDK inhibitörlerinin rolü Kolon Kanseri Kolon Kanseri Patogenezi Kolorektal kanser Kuzey Amerika, Batı Avrupa, Yeni Zelanda, Avustralya gibi endüstriyel ülkeler başta olmak üzere çok geniş bir coğrafik alanda yayılış göstermektedir. Ayrıca, bu ülkeler içinde de görülme sıklığı açısından farklı bölgeler mevcuttur. Örneğin Amerika Birleşik Devletlerinde, endüstriyelin gelişmiş olduğu kuzeydoğuda oran çok fazla iken, endüstrinin gelişmediği kırsal alan güneydoğuda en azdır. Japonya, Polonya gibi düşük riskli bölgelerden yüksek riskli bölge olan Amerika Birleşik Devletleri, Avustralya gibi ülkelere göç edenlerde kolon kanser oranlarında hızlı bir yükselme görülmektedir. Kısaca, Amerika, Avusturalya, Yeni Zelanda, Kanada ve Avrupa nın bazı kısımlarında kolon kanserinin görülme oranı fazla iken, Çin ve Hindistan ın yanı sıra Afrika ve Güney Amerika kıtalarında görülme sıklığı oldukça azdır. 17 Türkiye de kaba prevalans tahmini yaptığımızda kanser teşhis edilmiş ve hayatta olan bin kişi olduğu bilinmektedir kayıtlarına göre, Türkiye de de ölüm nedenleri arasında 2. sırada yerini almaktadır. Kanser hastalığı 2015 yılından itibaren tüm 9

23 dünyada ilk sıradaki ölüm nedeni olacağı öngörülmektedir. Kolekteral kanserin dünyada de 20 lerde iken, Avrupa da de 37, Türkiye de ise de 17 lerdedir. Dünyada, erkeklerde kanser görülme sıklığına bakıldığında ilk 3 sıra kanser türü olan prostat, akciğer ve kolon iken, Türkiye de bu sıralama akciğer, prostat ve mesane kanseri şeklindedir. Ülkemizde görülme sıklığı açısından erkeler de 4. sırayı kolon kanseri almaktadır. Dünyada kadınlarda görülme sıklığına bakarsak ilk üç kanser türü meme, kolon ve akciğer kanseriyken Türkiye de bu sıralama meme, tiroit ve kolorektal kanseri şeklindedir. 20 Gelişmiş ülkelerde kolon kanseri üçüncü sırada görülen kanser türü olup görülen bütün kanser vakalarının yaklaşık %9 unu oluşturur. Dünya üzerinde kanser vakalarında 3. sıradadır. Bu kanser tipi ayrıca dünyadaki kanserler arasında ölüm sebepleri arasında 4. sırada yer almaktadır. Kanserin bu tipi genetik ve epigenetik değişimlerden dolayı ortaya çıkmaktadır. Kolon kanserinin meydana gelmesinde beslenme tarzının çok önemli olduğu belirtilmektedir. Yağ ve protein oranı yüksek fakat fiber oranı düşük meyve ve sebzelerle beslenmenin bu hastalığın oluşumunu artırdığı belirtilmektedir. 2,3 Kolorektal karsinomların yeni vaka sayısı tahmini olarak her yıl için dir. İnsanının yaşamı boyunca kolorektal karsinom gelişme riski yaklaşık % 6 dır. Kolon kanseri vakaları he erkek ve kadınlarda birbirine yakın olmakla birlikte erkeklerde kadınlara oranla biraz daha yüksektir. 21 Bir bireyin hayatı boyunca kolektaral kanser gelişme riski % 6 iken, birinci derece akrabalarında kolon kanseri veya adenomatöz polip öyküsü olan bireylerde ise bu oran 2-3 kat daha fazla olarak rapor edilmektedir. 22, Kolorektal Kanser Etiyolojisi Kolekteral kanser kolon veya rektumda meydana gelmektedir. Kolekteral kanserlerin yaklaşık olarak %72 si kolonda, %28 i ise rektumda oluşmaktadır. 24 Kolorektal kanser gelişiminde yaş, kolekteral adenom (senkron yada metakron) varlığı, 10

24 kalıtımsal faktörler, inflamatuar barsak hastalıkları ve çevresel faktörler (Diyet, sigara tüketimi, alkol) etkili olmaktadır. Yaş: Kanser gelişme riski 40 yasından sonra erkek ve kadınlar için artmaktadır. Kolon kanserlerinin %90 nından fazlası 50 yaş ve üzerindeki bireylerde görülmektedir. Kolekteral kanser olguların sadece %5 ine 40 yaşın altında rastlanmaktadır. Bununla birlikte kolon kanserinin genç insanlarda da meydana gelme olasılığı gün geçtikçe daha da artmaktadır. 25,26,27 Kolekteral adenom (senkron yada metakron) varlığı: Kolorektal kanserlerin %90 nından daha fazlası daha önce gelişmiş adenom poliplerin varlığından kaynaklanmaktadır. Diğer bir ifade ile adenoma sahip olan bireylerin, adenoma sahip olmayanlara oranla kolekteral kansere yakalanma riskleri daha fazladır. Adenomlardan malignansi gelişmesi için yaklaşık olarak 5-10 sene gibi bir süreye ihtiyaç duyulmaktadır. Diğer bir ifade ile anormal olmayan bir kolon mukozasından adenom, adenomdan da displazi, insitu ve invazif kanser gelişiminin yaklaşık 10 sene aldığı bildirilmektedir. Adenomların malignanta dönüşmeden önce tespit edilmesi ve uzaklaştırılması kolon 28, 29 kanseri riskini azaltmaktadır. Kolon kanseri riski, adenomların sayısı ve büyüklüğü ile de direkt olarak alakalıdır. Tubuler adenomlarda kanserleşme risk oranı %5 iken, bu oran tubulo-villöz adenomlarda oran %22, villöz adenomlarda ise oran %40 civarındadır. Polip boyutu 2 cm den büyük olduğunda da, kanserleşme riski artmakta ve %35-50 düzeyine ulaşmaktadır. 30 Kolorektal kanser oluşumunda rol alan bir takım faktörler vardır. Bunlar; a- Kalıtımsal Faktörler Kolekteral kanserlerin yaklaşık olarak %5-10 nun kalıtımsal faktörlere bağlı olarak geliştiği belirtilmektedir. 31 Kalıtımsal kolekteral kanserlerin en yaygın tipleri FAP (Familial Adenomatous Polyposis) ve HNPCC (Hereditary Non-polyposis Colorectal Carcinoma) dir.fap ve HNPCC fertler kalıtıma bağlı olarak mutant genlerle doğdukları 11

25 için, adenom oluşumu ve adenomdan da karsinoma dönüşüm süreci bu kişilerde daha hızlı olmaktadır. Lynch sendromu olaraktan bilinen HNPCC tipi DNA tamir mekanizmalarında görev alan genlerdeki (MLH1 ve MSH2) mutasyonlara bağlı olarak ortaya çıkar. Bu iki gendeki mutasyonların ayrıca uterus, mide, pankreas, böbrek ve uretra kanserlerinin ortaya çıkmasında da etkili olduğu da bildirilmektedir. HNPCC kolekteral kanserlerin %2-6 sını oluşturmaktadır. FAP ise tümör baskılayıcı genlerinden birisi olan APC genindeki mutasyonlara bağlı olarak meydana gelmektedir. FAP tipi kolekteral kanserlerin %1 den daha azını oluşturmaktadır. HNPCC tipi kolekteral kanserde birkaç adenom gelişimi olurken, bunların tam aksine FAP lı bireylerde yüzlerce adenom gelişebilmektedir. APC bağlantılı polipler otozomal dominant kalıtım göstermektedir. 21 Kolon kanseri oluşumunda rol alan faktörler; tümör supressör genlerin etkin olmaması, ve DNA tamiriyle ilgili genlerdeki (MMR: mismatch repair gen) problemler, genetik değişiklikler (mutasyonlar) ve en önemlilerinden birisi olan proto-onkojenlerin aktivasyonudur. Proto-onkojenlerin aktivasyonları, hücre yüzeyinden nükleusa gelecek olan iletileri yanlış iletme, anormal hücre bölünmesine ve neticede tümöre sebep olur. Mutasyona uğrayan proto-onkojenler onkojen olarak adlandırılır ve baskın olarak fonksiyon gösterirler. Üzerinde en fazla çalışılan onkojen Ras genidir. İnsanlarda hücre içi uyarı sistemimin de iletiyi düzenleyen 3 Ras geni (K-Ras, N-Ras, H-Ras) bulunmaktadır. K-Ras geni mutasyona uğradı zaman, hücre içindeki guanozin trifosfat (GTP) hidrolizi yapılamadığı, G proteininin ise sürekli aktif formda kaldığı, sonuç olarak da hücrenin kontrolsüz bir şekilde bölünmesine neden olduğu öngörülmektedir. Kolekteral kanser vakalarının yaklaşık %65 inde, bir Ras geninde (genellikle K-Ras geni) nokta mutasyonu saplanmıştır. Fakat tümör gelişimi için K-Ras gen mutasyonu tek olarak yeterli değildir. Kolon kanserleri ve 100 mm den büyük adenomların yarısından 12

26 fazlasında Ras mutasyonu rastlanırken, 100 mm den küçük adenomlarda bu oran %10 a kadar inmektedir. 30 Mutasyona uğradığı takdirde kolorektal kanser oluşumunda rol alan devamlı karşılaşılan tümör süpressör genleri; APC (Adenomatous Polyposis Coli), DCC (deleted in colorectal carcinoma) ve p53 genleridir. Tümör süpressör genler resesif özellik taşıdığından, tümör gelişiminin başlayabilmesi için her iki allelde de mutasyonun olması gerekmektedir. APC geninde bulunan bir eksiklik ya da kusurdan dolayı, ilk olarak FAP lı bireyli vakalarda bu tanı konulmuştur. Mutasyonların meydana geldiği bu gende, FAP lı ve diğer sporadik kolon adenomlarının gelişiminde çok önemli başlangıç noktası olduğu tahmin edilmektedir. 11,14 APC geni, 5. kromozomun uzun kolunda (q21) mevcuttur. FAP lı hastalar, APC geninin bir allelinde ortaya çıkmış olan mutasyonla, mutasyonlu olarak hayatlarına başlarlar. İkinci allel, bireyin yaşamı sırasında meydana gelen çevresel etkenlerin de etkisinde kalarak mutasyona uğrarlar. Polip oluşumunun başlayabilmesi için, birinci ve ikinci APC geninin de mutasyon geçirmesi gerekmektedir. Ancak, polipin kanserleşmesi için ek genetik mutasyonların da eklenmesi olmazsa olmazıdır. 30 p53 geni 17. kromozomun kısa kolunda (17p) yer almaktadır. p53 proteini, DNA onarım ve sentezi kontrolü ve programlanmış olan hücre ölümünde (apoptoz) rol alır. Apoptozu başlatmakta görevli olan bu gendeki mutasyon insanda çeşitli tümörlerin gelişimine neden olmaktadır. Bu gene ait mutasyon, kolekteral kanserlerin %75 inde görülmektedir. b- İnflamatuar Barsak Hastalıkları Ülseratif kolit ve Crohn hastalığı gibi barsak hastalığı olan kişilerde kolekteral kanser hastalığına yakalanma riskinin 4-20 kat daha fazla olduğu belirtilmektedir. 13

27 Dolayısıyla, bu hastalıkları taşıyan kişilerde yaşın kaç olduğuna bakılmaksızın erken kanser taraması yapılması tavsiye edilmektedir. 33 c- Diyet Hayvansal yağlar başta olmak üzere, yüksek yağ oranına sahip besinler kolekteral kanserlerin önemli sebeplerinden birisi sayılmaktadır. Bu yüzden özellikle yağlı besinlerle beslenen batı ülkelerinde kolekteral kanser riski yüksek olmaktadır. Diyette yağ alımıyla karaciğer tarafından kolesterol ve safra asidi sentezi artar. Kolon bakterileri bu bileşikleri sekonder safra asitlerine, kolesterol metabolitlerine ve diğer toksik metabolik bileşiklere dönüştürür. Safra asitleri ve serbest yağ asitlerinin kolon mukozasında hasar yaptığı ve epitel hücrelerinin proliferatif aktivitesinde artışa yol açtığı gösterilmiştir. Balık ve tavuk eti yerine kırmızı et tüketiminin artması, kolon kanseri insidansında artmayla ilişkili bulunmuştur. Kırmızı et tüketimi ile kolekteral kanser arasındaki ilişki kırmızı etteki hem demirinin varlığı ile açıklanmaktadır. Ayrıca, yüksek sıcaklıklarda pişirilen etlerde heterosiklik aminlerin ve polisiklik hidrokarbonların meydana geldiği ve bu maddelerinde kolekteral kansere sebep olduğu belirtilmektedir Epidemiyolojik çalışmalarda sebze ve meyvenin bol tüketimi, kolon kanseri riskiyle ters orantılıdır. Diyetteki lif, dışkı hacmini ve buna bağlı transit hızını arttırarak intraluminal karsinojenlerin mukoza ile temasını azaltır. Ayrıca lifli gıdalar, bağırsaktaki karsinojen safra asitlerinin derişimini azaltırlar d- Çevresel faktörler Kolekteral kanser riskini artıran çevresel faktörlerden en önemlilerinden birisi sigara tüketimidir. Sigara dumanı kolon ve rektuma karşı son derece zararlıdır. Kolekteral kanserlerin yaklaşık olarak %12 sinin sigara tüketimine bağlı olduğu belirtilmektedir. Sigara dumanının, kolekteral kanserlerin öncüsü olarak kabul edilen adenomo poliplerin oluşumunu ve büyümesini artırdığı belirtilmektedir. Büyük poliplerin varlığı ise uzun 14

28 süreli sigara içimi ile ilişkilendirilmektedir. Ayrıca, kadın ve erkeklerde sigara tüketimine bağlı olarak kolekteral kanserlerin daha erken yaşlarda ortaya çıktığında açıklanmaktadır Bir diğer çevresel faktör olan alkol tüketiminin de yine kolekteral kanseri teşvik ettiği bildirilmektedir. Özellikle alkol tüketimine bağlı olarak kolekteral kanser oluşumunun çok daha erken yaşlarda başladığı bildirilmektedir. Sigara ile alkolün birlikte alımının çok daha tehlikeli olduğu da dile getirilmektedir. Bu durumun ise, sigara kullanımına bağlı olarak DNA mutasyonlarının alkol varlığında onarımında olasılıklarının çok daha düşük olması gösterilmektedir. Diğer taraftan, bir solvent olarak görev yapan alkolün diğer karsinojenik maddelerin hücreye girişini artırması gösterilmektedir. Ayrıca, alkolün hücrelerde serbest radikal oluşumuna, lipit peroksidayonuna ve prostoglandin üretimine bağlı olarak kolekteral kanser oluşumunu 38, 39, 41 artırdığı belirtilmektedir. Kolorektal kanserin oluşumu sırasında yaş, beslenme şekli, genetik yatkınlık, önceki kanser öyküsü, polipler, virus (human papilloma virus),vücuda dışarıdan verilen hormonlar, alkol tüketimi, düşük selenyum ve çevresel etkenler sayılabilmektedir. Birçok epidemiyolojik çalışma kolorektal kanserde diyetin ve yaşam tarzının ne kadar önemli olduğunun altını çizmektedir. Yağ, kırmızı et, alkol alımı ve sigara tüketiminin pozitif korelasyon gösterdiği, sebze ve lifli gıdaların tüketiminin ise ters korelasyon gösterdiği raporlarla belirtilmektedir. Bunlara ek olarak yüksek fiziksel aktivite, bayanlarda menopaz öncesi hormon tedavisi, aspirin gibi anti-enflamatuarların düzenli olarak kullanımı gibi faktörlerin ise koruyucu etkisi olduğu bildirilmiştir Kanserogenezde Tedavi Seçenekleri Kanser tedavisinde; cerrahi işlemler, lazer, radyoterapi, kemoterapi, immünoterapi, adjuvantlar ve hormon uygulamasına başvurulmaktadır. Kanser tedavisinde en çok kullanılan tedavi şekli; tümörün uzaklaştırılmasını sağlayan cerrahi yöntemleri içine alır. 15

29 Bu, diğer doku ve organlara yayılmayan ya da yayılamayan birçok kanser türü için etkili bir tedavi seçeneğidir. Eğer kanser ilerlemiş ya da çevre dokulara yayılmışsa; cerrahi müdahale, radyoterapi ve kemoterapi ikisi veya üç tedavi yöntemi birlikte uygulanabilir. Radyasyon tedavisinde kanser tedavisinin yapıldığı bölgeye X ışınları, gama ışınları ve protonlar kullanılmaktadır. Bu radyoaktif ışınlar; kanserli hücreyi tahrip ederek etkilemektedir. Örneğin, gamma ışınlarının beyin tümörlerinin uzaklaştırılmasında kullanıldığı belirtilmektedir. Ancak, yapılan çalışmalar radyasyon tedavisinin normal hücrelerin yanı sıra sağlıklı hücrelerde zarar verdiğini göstermektedir. İmmünoterapi yöntemi, BCG aşısı, interlökin ve interferonlar gibi biyolojik molekülleri kullanarak bağışıklık sisteminin aktif hale getirilerek uyarılmasıdır. Bu uyarı ise hücre büyümesini kontrol eden hücre sinyallerini etkilemek şeklinde olmaktadır. Adjuvant terapi ameliyattan sonra kemoterapi kullanılmasıdır. Hormon ile tedavisi yönteminde ise; hormon salım miktarı ve zamanına bağlı olarak gelişen meme ve prostat kanseri gibi vakalarda bazı özel hormonların kullanımıyla tatbik edilen tedavidir. Lazer tedavisi ise, cerrahi müdahalelerde yararlı olabilmektedir. Bundan dolayı, beyin tümörleri ve gırtlak kanserinde kullanılmaktadır. Kemoterapi ise, kanserin ilaçla tedavi edilmesi olarak tanımlanır. Kanser kemoterapisi çok kullanılan bir tedavi yöntemi şeklidir. Kemoterapi sırasında kullanılan ilaçlar, kanserli hücrelerin bölünüp sayılarının artmasını engellemek de durdurmakta ya da yok etmektedir. Ancak; kemoterapide kullanılan ilaçlar vücuttaki normal olan hücrelere de etki edebilmekte ve çok ciddi yan etkilere yol açabilmektedirler Hücre ölümü Hücre ölüm mekanizmasının düzenlenmesi embriyolojik gelişim ve doku hemostazisi için önemli bir aşamadır. Son yıllarda yapılan araştırmalarda hücre ölümünü kontrol eden birçok yolak hücre ve doku da izah edilmiştir. Hücre ölümü gerçekleşmeye 16

30 başlayan hücrede aynı anda değişik hücre ölüm yolakları paralel olarak tetiklenmiş olabileceğinden hücre ölüm mekanizmaları birbirlerini etkileyebilir ve tanımlanması her zaman kolay olmayabilir. Hücre ölümü gerçekleşmeye başladığı zaman oluşan morfolojik değişikliklerin, apoptoz ile mi yoksa otofaji sonucunda mı oluştuğunun tanımlanabilmesi zordur. 4 Bununla birlikte, otofajik ve apoptotik hücre ölümü arasında biyokimyasal ve morfolojik farklar bulunmaktadır. Otofajik hücre ölümünde, kaspaz aktivasyonu ve DNA fragmentasyonu gözlenememektedir. Otofaji sitoplazmik organellerin; mitokondri, golgi aygıtı gibi ve sitoplâzmayı yutan sitoplazmik keseciklerin görülmesiyle tanımlanmaktadır. Otofajide, oluşan membran yapıları otofagozom veya otofajik vakuol olarak da adlandırılan iki veya ikiden daha fazla yapılar ortaya çıkar. Hayvan hücrelerinde otofagozomun dış membranı lizozomla, maya ve bitkilerde ise bu yapı vakuolle bütünleşir. Hücrelerde, DAPK1 in belirtilmesi ise otofajik keseciklerin meydana gelmesi ve zar balonlaşmasına neden olur. Otofajik veziküller ve bu veziküllerin içeriğinin yok edilmesi için aynı hücrenin lizozomal hidrolazları tarafından yararlanılır. Otofaji; hücrelerin hücre içi besine ve enerji üretimine gereksinim duyduğu zaman hızla up-regüle edilir. Otofajinin kontrolü için hücrenin yoğunluğu, oksijen konsantrasyon oranı, sıcaklık, hormonal etkenler ve besin miktarının durumu önemli etkilere sahiptirler Apoptozis Hücrenin patolojik bir şekilde yok olması olan ve ATP miktarının azaldığı, hücre homeostazının çok hızla bir şekilde bozulduğu, yangı esnasında gelişen nekrozdan çok farklı olarak, apoptoz; yangı olmaksızın hücrelerin kendi kendilerini yok ettikleri, programlı hücre ölümü olup organizmada homeostazı koruyan bir durumdur. 42 Günümüzde de bu terimin kullanımı doğru kabul edilmektedir ve fizyolojik etkenlerden kaynaklanan hücre ölümünü ifade eder. Hormonsal olarak aktif hale gelen çeşitli 17

31 maddeler, iyonize radyasyon ve kemoterapiyi içeren travmatik ajanlar aracılığıyla gerçekleşen hücresel hasarların ya da genetik faktörlerle başlatılan hücresel süreç apoptoza sebep olur. Vücutta fizyolojik bir durum olan apoptoz, anormal olmayan hücrelerin yok edilmesinden de sorumludur. Apoptotik hücre sayısı bireyin ya da organizmanın sağlıklı mı yoksa hasta olup olmadığını belirlediğinden, apoptozun fonksiyonel mekanizmaları hücrede denge unsurudur. Bunun da anlamı; apoptoz oranının azalması ile hücre sayısı artar tam tersi olarak apoptoz oranı artarsa hücre sayısı azalır ve istenmeyen doku bozuklukları ortaya çıkar 43. Apoptoz tek hücreli organizmalarda hücrenin yaşamının sonlanmasının alternatifsiz tek yoludur. Bu durum çok hücreli organizmalarda ise genetik oluşumlu hücre hasarının durdurulması ya da hücrenin tamamen ortamdan kaldırılması apoptoz aracılığıyla olur. Bu şekilde hasarlı hücrenin yayılması ve tümör oluşumu gibi zararlı olasılıkların önüne geçilmiş olur. Apoptoz olayının başlamasından önce hücresel replikasyon işlemi durur (DNA onarımı) eğer bu esnada tahrip olan DNA nın tamiri gerçekleşemezse apoptoz ile sonuçlanan olaylar zinciri başlar. Bu sırada apoptozun başlayıp başlamaması bozulan yapının büyüklüğüne, hücrenin tipine ve hücrenin üretkenlik potansiyeli olan tümör geliştirme riskine bağlıdır. 43 Apoptoz, hücrede, stoplazmik azalma ve çevre hücrelerle olan ilişkisinin kaybolması ile ortaya çıkar. Hücresel büzüşmenin sebebi olarak gösterilen, sodyum (Na), potasyum (K), klor (Cl) taşıyıcı sisteminin durmasından dolayı hücrenin içi ve dışı arasındaki sıvı hareketinin olmayışıdır. Apoptotik uyarım alan hücre hacmi azalır ve çevre hücreler ile bağlantısı kopar mikrovillusları kaybolur. 42 Apoptoz, kanser gelişiminin engellenmesinde hücre tarafından başvurulan temel düzenleyicilerden biridir. Apoptozun bu düzenleyici mekanizmaları ise çok kompleks özellikler taşımaktadırlar. Tümör nekroz edici faktör (TNF), reaktik oksijen türleri 18

32 (ROS), kaspazın aktivasyonu, protein kinaz ve mitokondriyal yolak apoptozun önceliğini olustururmaktadır. 44 Apoptozun düzenleyici mekanizmasında kullanılan başlıca yol kaspazların aktivasyonudur. Proapoptotik kaspazlar kalsiyum bağımsız hücre içi sistein proteazların atkin bir kısmını meydana getirirler. Bu kaspaz ailesi proteinler biyolojik fonksiyonlarına göre üç ana grupta incelenirler. Bunlar Sitokin aktivasyonu yapanlar, apoptozisi başlatanlar ve apoptozu yürütenler (efektör grup). Sitokin aktive eden grup kaspazlar (kaspaz-1, -4, -5, -11, -12, -13 ve -14) ve apoptozu uyaran kaspazlar (kaspaz- 2, -8, -9 ve -10) ve apoptozu devam ettiren kaspazlar (kaspaz -3, -6 ve -7) dır. Kaspaz -3 ise programlı hücre ölümünde çok önemli bir rol- üstlenir. 45 Apoptozisi başlatan kaspazlar apoptotik uyarıyla başlama alan ölüm sinyallerini efektör kaspazlara iletirler. Sinyali alan efektör kaspazlar ise görevli olan proteinleri parçalayarak apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine sebep olurlar. Kaspazlar apoptozisi aktive eden sinyaller tarafından tetiklenip, apoptozisin her üç yolunda da (intrinsik yol, ekstrinsik yol ve endoplazmik retikulum aracılı yol) aktif olarak görev alırlar. 45 Apoptozun genetik olarak düzenlenme mekanizması ilk olarak Caenorhabditis elegans isimli nematotta belirlenmiştir. Bu nematotta Ced-3, Ced-4 ve Ced-9 adı verilen 3 genin apoptoz sürecini kontrol ettiği tespit edilmiştir. Ced 3 ve Ced 4 hücrede apoptozise neden olmaktadır. Ced 9 ise Ced 3 ve Ced 4 ün aktivasyonunu engelleyerek sağlıklı hücrelerde apaoptozisi engellemektedir. Ced-4 insanlarda apaf-1 ile homoloji göstermektedir. Ced-9'un insandaki homoloğu ise Bcl-2 proto-onkojen genidir. 46,47 Bcl-2 mitokondri dış zarında yer alıp, kaspaz 3 ün aktivasyonunu engellemektedir. Bu işlevi ise kazpaz 3 ün aktivasyonu için kofaktör olarak işlev gören sitokrom C nin mitokondriden salınımını engellemek suretiyle yerine getirmektedir

33 Apoptoz ve hücre proliferasyonu dengesi kansere yol açan ve onkogen olarak isimlendirilen genler tarafından bozulabilir. Onkogenler proliferasyon ve hücre ölümü gibi olayları denetleyip kontrol edebilen ve protoonkogen olarak bilinen anormal olmayan hücresel genlerin mutasyona uğramış formlarıdır. Büyümenin durdurulması, DNA tamiri ve apoptozise engel olunması kanserin başlaması ve gelişiminde kritik yolaklardır. Tümör baskılayıcı genlerde mutasyonlar yapısı bozulmuş hücrelerin hücre sikluslarının ilerlemesine ve tümör gelişimine sebep olur. Bilinen birçok tümör baskılayıcı gende etkinin görülebilmesi için her iki allelde de mutasyon olmalıdır ve kanserlerin çoğunda tümör baskılayıcı gen olarak bilinen ve tümör protein 53 olarak adlandırılan (TP53) geni mutasyona uğramıştır. TP53 geni hücre siklusunu kontrol eden düzenleyen bir transkripsiyon etkenidir ve yapılan birçok araştırmada organizmada kanseri inhibe eden çok önemli bir proteindir. Ayrıca p53 proteini DNA da mutasyon olmasını engeller ve DNA yı mutasyondan korur. Eğer DNA hasar görmüşse DNA tamir proteinlerini harekete geçirir ve DNA tamir edilemeyecek kadar zarar gördüğünde ise 48, 14 apoptozu başlatır. Kanser hücrelerinin normal hücrelerden farkları: büyüme faktörlerine duyarsızlık, hücreler arası sinyallerle etkileşmeme, programlanmış hücre ölümünden (apoptoz) kaçabilme, kontrolsüz ve sınırsız bölünme potansiyelinde olma, genellikle daha büyük hücre çapına ve nukleusuna sahip olma, anjiogenezi devamlı olarak destekleyebilme, doku invazyonu ve metastaz yapabilme olarak belirtilmektedir. 49, Otofaji Otofaji, hücre içi makro moleküllerin ve organellerin bir membran içine alınarak lizozomal enzimler birleşerek burada yıkımlanması olayına verilen isimdir. Daha açık ifade edersek, bu tip hücre ölümünde en belirgin morfolojik değişiklik, sitoplazmada oluşan iki veya daha fazla katmanlı membranla çevrili, sitoplazma parçaları ya da 20

34 mitokondiri, endoplazmik retikulum (ER) gibi hücre içi organelleri içeren veziküllerin mevcudiyetidir. Bu vesiküller lizozoma birleşip, içerisinde taşıdıkları yüklerinin lizozomal enzimler tarafından parçalamasını sağlarlar. Ömürleri kısa olan proteinlerin ubikitin-proteozom sisteminde parçalananıyken, bunun aksine hücre içi organeller ve uzun ömürlü proteinler otofaji sistemi tarafından parçalanırlar ve hücre kullanımı için yeniden kazandırılan yapı taşları (örneğin amino asitler) oluşur. Otofaji kelime manası olarak kendi kendini anlamına gelir ve hücrenin besinsiz kaldığı durumlarda fizyolojik olarak besin elde etmek için hücre içindeki yapıları parçalandığını anlatmak için 4, 51 kullanılmıştır. Otofaji 4 formda açıklanabilir; 1- Makrootofaji; İki zarla çevrili organellerin sitoplazma içinde parçalanması 2- Mikrootofaji; Membran invajinasyonu ile sitoplazmanın lizozom içine taşınarak parçalanması 3- Spesifik moleküllerin lizozom içerisine alınması olan şaperon bağımlı otojaji 4- Kanonikal olmayan- alternatif (Atg5/7 bağımsız) makrootofajidir. Bu dört otofaji formundan makrootofaji, birçok hücrede bazal seviyede meydana gelmekte, parçalanan protein ve yapısı bozulmuş olan organellerin parçalanmasında çok önemli bir fonksiyonu vardır. Genel olarak da hücrelerde makrootofaji denildiğinde otafaji kastedilmektedir. 51 Yapılan araştırmalarda günümüzde 30 dan fazla Atg geni (Autophagy-related proteins) tanımlanmıştır. Atg proteinleri olarak ilk olarak mayalarda bulunmuştur. Atg proteinlerinin bir kısmı ve çeşitli protein kompleksleri otofajik kesecik ya da bir başka deyişle izolasyon membranının ve otofagozom oluşumunda rol almaktadır. 51 Otofajiyle ya da otofagozom oluşumuyla ilgili proteinler 4 temel kategoride incelenmektedir. Bunlardan birincisi, Atg1/Unc-51-like kinase (ULK) kompleksi, 21

35 ikincisi ubiqutin-benzeri (Atg12 ve Atg8) konjugasyon sistemleri, üçüncüsü sınıf III fosfotidilinozitol 3-kinaz (PtdIns3K)/Vps34 kompleksi ve dördüncüsü iki transmembran proteinleri (Atg9 ve VMP1) dir. 52 Hücredeki otofajik aktivitevi başlatan açlık, hipoksi ve çeşitli stres faktörleridir. Otofajik aktivitenin denetiminde rol oynayan, target of rapamycin (TOR) protein kompleksi önemlidir. TOR, ilk olarak mayada mantar tedavisi için geliştirilmiş bir ilaç olan Rapamisinin hedefi olarak ortaya çıkarılmıştır. TOR hücrede protein sentezini ve hücrenin büyümesinin kontrolünü sağlayan bir kinazdır. Bu proteinin baskılanması ile mayalarda ve memelilerde otofaji aktif olmuştur. Dolayısıyla, mammalian target of rapamycin (mtor) yolağı otafajiden sorumlu bir oluşum olarak kabul edilmektedir. 51 mtor iki farklı kompleksin (mtorc1 ve mtorc2) katalitik alt ünitesi olarak işlev yapmaktadır. mtorc1, mtor ve raptor birimlerinden oluşur. Raptor, mtor un regulasyonundan sorumlu protein birimi olarak görev yapar. mtorc1 ULK1/2 (mayadaki Atg1 in homoloğu), matg13 ve FIP200 (mayadaki ATG17 in insandaki homoloğu) ile bileşik yapar. mtorc1 in mtor kısmı ULK1 ve Atg13 yi fosforlar bu sayede de ULK1 nin kinaz aktivitesinin devamını sağlar. Kısaca, besin varlığında mtor proteini ULK1 ve Atg1 proteinleri üzerinde gerçekleştirdiği fosforilasyon sayesinde otofajiyi baskılar. Hücrelerde, mtorc1 aktivitesi inhibe olduğunda ise mtorc1 Atg13 ü fosforlayamaz ve ULK1 nin kinaz aktivitesi ortadan kalkar. Buna bağlı olarakta otofagozom oluşumu ve bunun takibinde otofaji meydana gelir. Dolaysıyla, besinin bol olduğu durumlarda mtor proteini, otofaji proteinlerinden biri olan Atg13 u uyarmakta ve otofajiyi inhibe etmetkedir. Açlık durumunda ise mtor etkinliğinin azalmasına ile Atg13 fosforile olmamakta ve otofaji inhibe edilmektedir. 52 Hücrelerde mtor aktivitesinin düzenlenmesinde ise PI3K-Akt-mTOR, LKB1- AMPK-mTOR, P53, Beclin1 ve Bcl-2 yolakları görev almaktadır. PI3K-Akt-mTOR 22

36 yolağındaki Akt aktivasyonu mtor u inaktif ettiğinde otafaji inhibisyona uğramaktadır. PI3K sınıflarıda mtor üzerindeki etkisini Akt aracılığıyla gerçekleştirmektedir. Sınıf I PI3K Akt yi aktive ederek otafajiyi inhibe ederken, sınıf III PI3K Akt yi inhibe ederek otofajiyi uyarmaktadır. Bir tümör supresör geni olan PTEN de Akt aktivitesini inhibe ederek otofajiyi uyarmaktadır. Yine bir tümor baskılayıcı gen olan ARHI de PI3K-Akt yolunu inhibe ederek otofajiyi indüklemektedir. 53 AMPK (Adenosine monophosphate-activated protein kinase) lipid, kolesterol, glikoz metabolizmalarının yanı sıra kanserlerde yakın ilişkili olan bir moleküldür. Enerji stresi koşullarında bu molekül mtor u baskılayarak otofajiyi başlatmaktadır. LKB1- AMPK-mTOR yolağında, serine/threonine kinase LKB1 (ayrıca STK11 olarak bilinir) AMPK yı aktive etmekte, AMPK da mtor u baskılamaktadır. Bu şekilde de LKB1- AMPK-mTOR yolağıyla otofayi gerçekleştirilmektedir. Yapılan çalışmalar ayrıca, AMPK nın kalsiyum ve kalmodulin bağımlı protein kinaz 2 (CAMKK2) tarafından da aktif edildiğini göstermiştir. 54,55,56,57 Tümör baskılayıcı gen olarak bilinmesinin yanı sıra, P53 geni DNA hasarlarının tamirinde de görev almaktadır. Diğer taraftan, P53 ün AMPK yı aktive ettiği, mtor u inhibe ettiği ve bu şekilde de otafajiyi uyardığı bilinmektedir. Ayrıca, P53 ün kanserli hücrelerde Sestrin2 ve Bax (Bcl-2 bağlantılı X proteini) gibi diğer yolakları da aktive ederek otofajiyi uyardığı da belirtilmektedir. P53 ün aktivasyonuna besin eksikliği ve diğer stres faktörlerinin etken olduğu, aktifleşen p53 ün ise bahsedilen yolaklar aracılığıyla otafajiyi uyardığı açıklanmaktadır. 53 Beclin 1 (Atg6 olarak ta bilinir) insan dokularında ifade edilir ve endoplazmik retikulum, mitokondri ve perinukleer aralıkta bulunur. Beclin 1 otofajinin yanı sıra tümor gelişiminin baskılanmasında görev alır. Otofaji olayında otofaji için gerekli olan çift zarlı otofagozom oluşumunda görev alır. Beclin 1 in kaybı insanda meme, ovaryum ve prostat 23

37 kanserlerine sebep olmaktadır Beclin 1, hücrede otofaji oluşumu ile ilgili yer alan Bcl-2, Vps34, p150, UVRAG, Bif1, Atg14L ve Rubicon gibi diğer proteinlerle bağlanarak büyük bir kompleks meydana getirir ve bu şekilde otafajide görev üstlenirler. 53 Beclin 1 in aksine, Beclin 2 familyasındaki proteinlerin ise genellikle apoptozis ve otafajiyi inhibe ettikleri belirlenmiştir. 59 Örneğin, Bcl-2 nin knockdown edilmesiyle meme kanseri hücrelerinde otofajinin indüklendiği belirlenmiştir. 61 Yine, antisens RNA kullanılmasıyla Bcl-2 susturulmuş kanser hücrelerinde otafajinin tekrar indüklendiği gösterilmiştir. 62 Yapılan çalışmalar besin yetersizliğinin, hipoksi, oksidatif stres, patojen enfeksiyonu, radyasyon ve anti kanser ilaçlarının uygulanması durumunda otofajinin devreye girerek hücre homeostezisini sağladığını göstermektedir. Bununla birlikte aşırı veya düzensiz otafaji durumlarında sinirsel bozuklukların, yaşlanmanın ve hatta kanserin ortaya çıkabileceği belirtilmektedir. 63 Özellikle, insan meme, prostat ve ovaryum kanserlerinin %40-70 inde otafajiden sorumlu bir gen olan Beclin 1 de monoallelik kaybın olduğu tespit edilmiştir. Bu da tümör gelişiminin engellenmesinde otafajinin çok önemli bir süreç olduğunu ortaya çıkarmıştır. 64 Otofaji tümör gelişiminin engellenmesinde her ne kadar gerekli bir süreç olduğu belirtilmiş olsa da, tümörlü hücrelerde stresle oluşturulan yapay otofajinin tümör hücrelerine tedaviye karşı direnç kazandırdığı ve tümör hücrelerini dormansiye soktuğu açıklanmaktadır. Nihayetinde de bu durumun tümörlerin yeniden büyümesini ve ilerlemesini sağladığı rapor edilmektedir. Bununla birlikte, tümör hücrelerindeki otofaji başlangıcının genetiksel yöntemlerle veya ilaç uygulamalarıyla engellenmesi sayesinde tümör hücrelerinin öldürülebileceği ve apoptotik hücre ölümünün başlatılabileceği bildirilmektedir. Dahası, kemoterapik ilaçlarla otofaji inhibitörlerinin birlikte 24

38 verilmesinin, tek başına kemoterapik ilaç verilmesine oranla in vivo ve in vitro koşullar altında tümör büyümesini çok daha fazla engellediği ve hücre ölümünü de çok daha fazla tetiklediği belirtilmiştir. Bu yüzdende ön otofajinin engellenmesi şeklinde gerçekleştirilen uygulamanın kanser tedavilerinde çok başarılı bir adım olabileceği ileri sürülmektedir. 52 Normal hücrelerin aksine kanserli hücreler normal hücre ölüm sinyallerine cevap vermeyerek hayatta kalma başarısı göstermektedirler. Mevcut anti kanser ilaçları ise kanser hücrelerini apoptoz yolundaki ölüm sinyallerine cevap verecek şekilde etkilemektedirler. Bununla birlikte, bazı kanser türlerinin apaptotik yollarını tamamen kaybettiği ve bu yüzdende uygulanan tedavilerden veya antikanser ilaçlarından etkilenmediği belirlenmiştir. Böyle durumlar içinde, araştırmacılar diğer bir hücre ölüm mekanizması olan otafajiyi harekete geçirerek kanserli hücreleri yok eden antikanser ilaçlarına yönelmeye başlamışlardır. 65 Bu doğrultuda da mtor inhibitörleri ve dolayısıyla da otofaji indükleyici ajanlar olan rafamisin (sirolimus), rafamisin türevleri (everolimus, temsirolimus vb.), arsenik triokside ve temozolomide gibi maddeler apoptozis-dirençli kanserlerde ilaç olarak kullanılmaktadır. 66 Yine yapılan bir başka çalışmada bazı anti-deprasantların (maprotiline ve fluoxetine) apoptozis-dirençli kanserli hücrelerde otafajiyi harekete geçirerek kanser gelişimini durdurduğu rapor edilmiştir Cisplatin Etki Mekanizması Platin bileşikleri kemoterapi de çok kullanılan ilaçlardır. Bu grup içinde bugün için 3 molekül mevcuttur: cisplatin, kaboplatin ve oksaplatin. Bunlardan cisplatin en nefrotoksik olanıdır. 67 Cisplatin (cis-dimminedichloroplatinum II, CDDP) inorganik divalent, suda çözülebilen platin bir bileşiktir. İki değerlikli bir merkez atomuna bağlı iki amonyum ve iki klor bağı içerir

39 Şekil 2.3. Cisplatin moleküler yapısı 68 Birçok kanser türünde kullanılan bir kemoterapötik olan cisplatin yıllardır başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. 6, 7 DNA ve RNA gibi nükleofilik moleküllerle kolaylıkla etkileşime girme özelliğine sahip bir ilaçtır. Sitotoksisitesinin bu özelliğinden kaynaklandığı sanılmaktadır. Cisplatinin anti kanser özelliği, hücre döngüsüne girerek onu bloke etmesinden, DNA replikasyonunu ve RNA transkripsiyonunu engellemesinden ve apoptoza yol açmasından gelmektedir. 6 Bütün kemoterapötikler gibi cisplatine karşı da bir direnç oluşmaktadır. Cisplatin uygulaması ile kanser hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyon artışının uyarılması sonucunda kemoresistans gelişimi şekillenmektedir. 6 Bu direnci ortadan kaldırmak için cisplatinin yüksek dozlarda uygulanması gerekmektedir ancak yüksek dozlarda cisplatinin nefrotoksisite ve hepatotoksisite gibi toksik etkileri ortaya çıkarmaktadır. 7,8 Düşük dozlarda ise cisplatinin etki oranı azalmaktadır. Bu oran cisplatinin diğer kemoterapötiklerle kombine kullanılması ile arttırılabilir ve böylece toksik etkisi de düşürülebilir. 7 Yapılan bir çalışmada gemcitabin ile cisplatinin kombine kullanımı yalnız gemcitabin kullanımına oranla daha iyi etki ve daha hafif toksisite gösterdiği rapor edilmektedir. 69 Ayrıca bu kemoterapötiklerden birkaçının kombine kullanımı son yıllarda birçok kanser tedavisinde başvurulan seçeneklerden birisi olmaktadır. Böyle kombine kullanımın sonucu olarak kanser tedavisinde daha etkin bir sonuç ve daha düşük toksisitenin oluşması sağlanabilmektedir. 9 26

40 Şekil 2.4. Cisplatin karşı gelişen direnç mekanizması Cisplatinin doz sınırlayıcı etkileri; Cisplatin farklı kanser gruplarında antineoplastik bir ajan olarak kullanılmaktadır. Ancak bu ilacın yüksek dozlarda alınmasının büyük oranda nefrotoksisiteye neden olmasının yanısıra hepatotoksisiteye de neden olduğu bilinmektedir. 8 Cisplatinin toksisitesinde en büyük hedefi mitokondride meydana gelen oksidatif strestir. Bunun sonucu olarak mitokondrial protein-sülfidril kaybolmaya başlamakta ve mitokondrial membran potansiyeli düşmektedir. Yapılan incelemelerde cisplatinin, ALT ve AST seviyelerinde yükselmeye ve nitrit oksit, kalsiyum ve albümin seviyelerinde de düşme etkeni olduğu belirtilmektedir. 8 Schmid ve ark. nın akciğer kanserli hastalar üzerinde yapmış olduğu bir çalışmada, cisplatinin sitotoksite ile hücreleri apoptoza uğrattığını bildirmektedir. p53 seviyelerinin artıp artmadığı konusunda ise net bir bilgi bulunmamaktadır Kanser Tedavisinde Antioksidanların Rolü Kanser tedavisinde hücresel hasara neden olması için serbest radikallere ihtiyaç vardır. Yapılan bir çalışmada kemoterapi ile eşzamanlı olarak alınan antioksidanların, kemoterapinin etkinliğini düşürdüğünü göstermektedir. Buna rağmen insanlar üzerinde yapılan iki çalışmada, melatoninle kemoterapinin kombine kullanımının, yalnız 27

41 kemoterapi kullanımından daha etkili olduğunu gösterdiler. 72 Bu çalışmaların biri, meme kanserinde tamoxifenin melatonin ile kombine kullanımıdır. Bu çalışmada tomoxifenin melatonin ile kombine kullanılması, tamoxifenin yalnız kullanılmasından daha etkili sonuç verdiği ve kanda tümör büyüme faktörlerinin seviyelerinin düştüğü görülmektedir. 73 Bir başka çalışmada ise melatoninin MCF-7 hücrelerinde p53 ve p21 ekspresyonunu arttırdığı ve proliferasyonu düşürdüğü belirtilmektedir Melatonin Melatonin hormonunun keşfi 1950 li yılların sonlarında yapılmıştır. Fakat bu tarihten tam üç yüz yıl önce ünlü Fransız Filozof Rene Descartes melatonin hormonunun salgılandığı yer olan pineal bezi ruhun sığınağı olarak tanımlamıştır. Günümüzde ise birçok makalede melatonin uyku, ruh hali, tümör büyümesi ve yaşlanmanın biyolojik düzenlenmesinde görevli olduğu bulgularına rastlanmaktadır. Yapılan birçok hayvan deneyi çalışmalarında melatoninin hormonunun asıl görevlerinden başka özelliklerinin keşfedilmeye başlanmasıyla birlikte bu hormon popular hale gelmiştir. Ancak melatoninin insan fizyolojisi ve patofizyolojisi üzerine etkileri hala tam olarak belirsizliğini korumaktadır. 75,76 N-asetil 5-metoksi triptamin olarakta bilinen melatonin hormonu ilk olarak sığır pineal bez kaynaklı molekülün kurbağa derisinin rengini açması ve bu derinin pigment 75, 77 hücrelerindeki melatonin granüllerini aglutine etmesiyle tanımlanmıştır. Melatonin hormonu memelilerde başlıca beynin serebral yarım küreleri arasında bulunan pineal bezden salgılanmakla birlikte ayrıca over, retina, harder bezi, lakrimal bez, eritrositler, trombositler ile gastrointestinal sistemden de sentezlenip salgılanan nöro transmitter bir hormondur. Bu hormon hem yağda hem de suda çözünebilir özelliğin de olduğu için nucleus dâhil hücrenin her organeline ulaşabilir. 78,79 Melatoninin sentezi ve salınımı karanlıkla uyarılır ışıkla inhibe edilir. Gün ışığı boyunca, fotoreseptör hücreleri 28

42 hiperpolarizedir yani norepinefrin salınımı inhibe edilir. Sistem çok az miktarda melatonin salgılar. Karanlıkla birlikte fotoreseptörler norepinefrin salar ve böylece sistem aktif hale geçer. Aril alkilamin enziminin seviyesinin artmasıyla da melatonin sentezi ve salınımı artar. Melatonin sentezi arttıkça kan dolaşımına giren melatonin seviyesi de orantılı biçimde artmaktadır. İnsanlarda melatonin salgılanması karanlıkla birlikte artmaya başlar ve gece 2-4 saatleri arasında pik noktaya ulaşır ve sonrasında yavaş yavaş düşmeye başlar. 80, Melatonin Hormonunun Biyosentezi ve Salgılanması Memelilerde pieal bez hormonu olan melatonin esansiyel bir amino asit olan triptofandan sentezlenmektedir. İlk basamakta triptofan hidroksilaz enzimi tarafından 5- hidroksi triptofana daha sonrada bunun dekarboksile olmasıyla 5- hidroksitriptamine (seratonine) dönüşür. Seratonin arylalkylamine-n- asetilltransferaz enzimiyle N-asetilseratonin formuna dönüştürülür. Son olarak N-asetilserotonin hidroksiindole-o-metiltransferaz enzimi aracılığıyla N-asetyl- metoksitriptamine (melatonin) dönüşür. Sentezin düzenlenmesi pirimer olarak karanlığa bağlıdır. Sentezden sorumlu N-asetiltransferaz ın aktivitesi fotoperiyotik şartlar altında düzenlenmektedir. Işık altında retinada oluşan sinirsel impulslar hipotalamusta bulunan suprachiasmatic nukleus ve digger hipotalamusta bulunan yapılara aktarılır. Bu bölgelerin uyarılmasıyla beraber karanlığında etkisiyle postgangliyonik sempatik liflerden salıverilen nonadrenalin β1 reseptörlerine bağlanarak serotonin ve N-asetiltransferaz ın salıverilmesine neden olur. Nöronlarda ve pineal bezdeki biyokimyasal sinyallerin etkisiyle melatonin anabolizması hızlanır ve bu hormonun sirkadiyen ritme bağlı olarak sentez ve salıverilmesi gerçekleşir. 19,

43 Şekil 2.5. Melatonin salgılanmasının fizyolojisi Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi Melatoninin ile ilgili yapılan birçok in vivo ve invitro çalışmalarda bu hormonun onkostatik etkiye sahip olduğu, birçok kanser türünde oluşan semptomları hafiflettiği, tümör anjiogenezisini, poliferasyonunu, metastaz oluşumunu yok edici etkiye sahip olduğu görülmektedir. 85,86 Pinealektomi yapılan hayvanlarda tümör büyümesinin artırdığı ve daha sonra bu hayvanlara melatonin uygulaması yapıldıktan sonra tümör gelişiminin 75, 87 yavaşladığı bildirilmiştir. Melatoninin etkileri, ileri derece kanserli bazı hastalarda çalışılmış ve olumlu sonuçlar alınmıştır. Örneğin, glioblastomalı hastaların bir kısmına yalnız radyoterapi verilirken diğer bir kısmına melatonin ile kombinasyon uygulanmıştır. Kombine kullanım yalnız radyoterapiye göre çok daha iyi sonuçlar alınmasını sağlamıştır. 88 Melatoninin tümör gelişimindeki olumlu etkilerinin; 1- Kanser hücreleri tarafından yağ asidi büyüme faktörü alınımını kısıtlayarak, 2- Telomer uzunluğunu azaltılması yoluyla telomeraz aktivitesini kısıtlayarak kanser hücrelerinde apoptoza neden olarak, 3- Tümörlerde damar gelişmesini sebep olan anjionik bir faktör olan endotelin-1 sentezini baskılayarak, 30

44 4- Tümör baskılayıcı bir gen olan P53 geninin ekspresyonunu sağlayarak gerçekleştirmektedir. 85 Son yıllarda yapılan çalışmalarda hastalarda tümör oluşumuyla birlikte uyku bozukluğunun da görüldüğü bildirilmiştir. 89 Melatoninin kanser hastalarında biyolojik regülasyonu düzenleyerek yeni tümör oluşumlarını engellediği ve kanser hastalarının yaşam kalitesini iyileştirdiği görülmüştür. 10 Hayvan deneyi çalışmaları ve klinik denemelerde melatonin hormonunun meme kanseri, prostat kanseri, akciğer kanseri, kolon kanseri ve diğer kanser türlerinin gelişmesini baskılayıcı özelliğinin olduğu görülmüştür. 90,91 Ayrıca melatoninin kemoteröpotik ilaçlarla beraber kullanıldığında ilaçların yan etkilerini azalttığı bu sebepten dolayı da hastaların yaşam standartlarını iyileştirdiği görülmüştür. 89 Shilian Hu ve ark., akciğer kanserli hastalarda yapmış oldukları bir çalışmada kemoterapi uygulanan hastaların serumlarında triptofan ve melatonin hormonunun düşük olduğunu, bu hastalara dışarıdan triptofan verilerek melatonin sentezini arttırmanın önemli olabileceğini bildirmişlerdir. 91 Bizim çalışmamızda melatonin ve/veya cisplatin uygulamaları ile amaçlananlar; -Kolorektal kanser hücrelerinde melatonin apoptotik ve otojajik etkilerinin araştırılması -Kolorektal kanser hücrelerinde cisplatin uygulamasının apoptotik ve otojajik etkilerinin araştırılması -Kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve cisplatin uygulamalarının cisplatinin apoptotik ve otojajik etkinliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. 31

45 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Hücre Kültürü Hücre Kültür Medyumunun Hazırlanışı 87 ml hazır DMEM hücre kültürü medyumu (Sigma Co., USA) 2 ml L-Glutamin (Gibco, USA) 1ml Penisilin+Streptomisin+Amfoterisin B (Sigma Co., USA) Maddeleri eklenerek100 ml kullanıma hazır hücre kültür medyumu elde edildi Hücre İnkübasyon Koşulları Parental HT-29 monolayer hücre kültürü medyumu içerisinde %5 CO2 37 o C e sıcaklıktaki etüvde (Esco) 25 cm 2 lik flasklarda steril şartlarda inkübe edilerek hücrelerin çoğalması sağlandı Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing) Üremekte olan hücre pasajları %80-90 doygunluğa (confluent) ulaşınca hücreler yeniden pasajlandı. 92 Bu amaçla üremekte olan hücreler istenen çoğunluğa ulaştığında; Üzerlerindeki besi yeri pipetle alınarak steril fostat tampon solüsyonu (PBS) (25 cm 2 için 2 ml) ile yıkandı. PBS pipetle uzaklaştırıldıktan sonra hücrelerin kaldırılması için 3 ml tripsin- EDTA solüsyonu ilave edilerek etüvde 10 dk. bekletildi. Tüm yüzeye yapışık hücrelerin kaldırılmasının ardından süspansiyon halindeki hücre tripsin-edta solüsyonu 15 ml hacimli bir tüp içerisine alınarak üzerine tripsinin inhibisyonu için tripsin hacminin 2 katı medyum eklendi. Tüpe alınan süspansiyon 1500 rpm de 10 dk. santrifüj edilerek tripsin-edta solüsyonu uzaklaştırıldı ve hücreler taze hücre medyumu ile süspanse edilerek 3 adet 25 cm 2 lik flaska bölünerek yeniden pasajlandı. Yeniden pasajlanan hücreler 37 o C de %5 CO2 ortamında inkübe edildi. 32

46 Hücre Dondurma ve Saklanması Tripsin-EDTA ile yüzeyden kaldırılan hücreler santrifüj edildi ve tripsin besi yerinden uzaklaştırıldı. Sonra hücre pelleti 1 ml besi yeri ile sulandırılarak sayıldı. Tripsin, hacminin en az iki katı serumlu besi yeriyle inhibe edildi. Hücreler pipetleyerek tek hücre süspansiyonu haline getirilip bir falkon tüpe aktarıldı. Üzerine 2-3 ml daha medyum ilave edildi. Hücre süspansiyonu santrifüjlenerek (1500 rpm de 10 dk), süpernatant uzaklaştırıldı. Pelet 900 µl hücre medyumu ile sulandırılarak sayıldı. Dondurma tüpleri içerisine 100 µl dimetilsülfoksit (DMSO) ve 900 µl hücre medyumu ile süspanse edilen hücre solüsyonu eklendi. Tüpler dondurma kabına yerleştirilerek - 80 o C de derin dondurucuda gerektiğinde analizlerin tekrarı için hücre hattı saklandı Hücre Sayılarının Hesaplanması 1 ml kültür medyumunda sulandırılan hücre süspansiyonundan 10 µl alınarak ependorf tüpe kondu ve üzerine 90 µl tripan blue boyası eklenerek karıştırıldı. Bu karışım Neubauer lamı üzerine konularak 5 bölmedeki hücreler sayıldı, daha sonar bulunan bu sayı sulandırma miktarı x sayısı ile çarpıldı. Sonuç olarak 1 ml medyumda kaç milyon hücre olduğu bulundu. Böylece ekim yapılacak sayı belirlenip hücrelerin petriye ekimleri yapıldı. 100 mm lik kültür petrisine 5x10 6 hücre ve 96 kuyucuklu kültür plağının her kuyucuğuna 5000 hücre transfer edildi. 33

47 3.2. Hücre Canlılığı Analizi MTT Yöntemi MTT analizi, formazon boyalarının ya da MTT azalmasına bağlı olarak enzim atik aktivitesinin kolorimetrik ölçümüne dayanan hücre çoğalma miktarının tespit edildiği yöntemdir. Bu yöntemle kullanılacak olan herhangi bir terapotik ajanın hücre üzerindeki sitotoksikya da proliferatif etkileri belirlenebilmektedir. Melatonin ve Cisplatinin, MCF-7 hücre hattı üzerindeki olası sitotoksik etkileri MTT kiti ile üretici firmanın (Sigma Co. Germany) kullanım talimatına göre uygulandı. Yöntem MTT ajanı ile inkübe edilen hücrelerde meydana gelen renk değişiminin kolorometrik olarak belirlenmesi prensibine dayanmaktadır. Oluşan renk değişikliği sarı ile renklendirilmiş formazon tuzlarının aktif hücre mitokondrilerinde tetrazolyum tuzu azalmasıyla oluşmaktadır. Bu bileşiklerin absorbans değeri metabolik olarak aktivitelerinin belirlenebilmesi açısından orantılıdır Yapılış Yöntemi MTT yönteminin uygulamasından 1 gün önce 96 lik plak içerisine sayımı yapılan 5000 hücre (5000/kuyu) ile 100 µl medium hazırlanarak kuyulara ekimi yapıldı. Mikroplak 24 saat 37 C ve %5 CO2 ayarlı inkübatörde bekletilerek hücrelerin yüzeye yapışmaları sağlandı. Bu yolla tripsin enziminin hücre membran proteinleri ve büyüme faktör reseptörleri üzerinde oluşturduğu zararlar ortadan kaldırılmış oldu. Bu protein ve faktörlerin yeniden sentezlenebilmesi için 24 saatlik bir süreye ihtiyaç duyulmaktadır. 93 Aynı zamanda bu yolla medium içerisindeki terapotik ajanların hücreyle muamelesinden önce hücrelerin metabolik aktivite kazanması sağlanır. 24 saatlik inkübasyondan sonar seri dilusyonlar halinde hazırlanan melatonin ve cisplatin maddeleri seriler halinde gruplara bölünen hücre hattı medyumuna ilave edildi (100 µl olan medium ve hücre karışımı üzerine 100 µl içerisinde dilusyonu yapılan ve 34

48 konsantrasyonu ayarlanan melatonin ve/veya cisplatin eklendi). A serinin birinci sütunu hücre kontrol ve A serisinin ikinci sütunu meydum kontrol olarak ayarlandı. Melatonin ve cisplatin uygulanan hücre hatlarına 24 ve 48 saat süreli inkübasyonlardan sonra MTT yöntemi uygulandı. MTT analizi; 1- Doksanaltılık plak kuyucuklarında bulunan 100 µl medium ve hücre karışımı üzerine, hazırlanmış tiazolil mavi tetrazolium bromid solüsyonundan 10 µl ilave edildi. Bu solüsyon ilavesini takiben 96 lık plak inkübatöre alınarak 3 saat beklenildi. 2- Üç saatlik inkübasyonun ardından hücrelerin yüzeyinde bulunan medium bir pipet ile alınarak MTT çözücü solüsyonundan 100 µl ilave edilip 20 dk. inkübatörde bekletildi. 3-İnkübasyonu yapılan hücrelerin, mikroplak okuyucu spektrofotometre (µ- Quant, BioTek Instruments, Winooski, Vermont, USA) ile 570 nm absorbans değerinde ölçümleri 3 tekrarlı olarak yapıldı Tunel Boyama Metodu Hücrelerin lamda üretilmesi i. Poly-L-lysine kaplı lamlar (Thermo Fisher Scientific, USA) Lamlar, 10 cm çapındaki petri kutularına hücre ekimi yapılmadan önce yerleştirilerek class II tip biyogüvenlik kabini içerisinde 4 saat süreyle ultraviyole ışık altında sterilize edildi. ii. 25 cm 2 lik flasklarda çoğaltılan hücrelerden, ultraviyole ışık altında steril edilen petrilere her bir petri içerisindeki lamların üst yüzeylerine eşit miktarda (100 µl mediumda suspense yaklaşık 5000) hücre gelecek şekilde ekim yapıldı. iii. Lam üzerine hücrelerin yapışmasını takiben (ortalama 24 saat sonra), petriler gruplara ayrıldı ve melatonin ve cisplatin uygulanacak olan grupların petrilerine çeşitli 35

49 konsantrasyonlarda melatonin ve cisplatin eklenirken, kontrol grubundakilere aynı miktarda besi yeri medyumu konuldu. v. İnkübasyon sürelerinin bitimini takiben (24 ve 48 saat sonra) petri içindeki medyum pipet yardımıyla uzaklaştırıldı ve fosfat tampon solüsyonu PBS eklenerek hücre yıkama işlemi yapıldı Fiksasyon 1.PBS ile yıkanan ve lam üzerinde yapışık bulunan hücreler petrilerden çıkarılarak-20 o C de soğutulmuş metanol içerisinde10 dakika tespit edildi. 2. Tespit edilen lamlar PBS ile yıkandı kurutuldu ve boyama prosedürüne başlanıncaya kadar -20 o C de saklandı Tunel Boyama Boyama işlemine alınacak lamlar derin dondurucudan çıkarılarak oda ısısına gelinceye kadar bir süre bekletildi ve takiben PBS ile yıkandı. Endojen peroksitlerin bloklanması için %3 lük H2O2 solüsyonuda 10 dk bekletildi. Daha sonra 5 dk süre ile 3 kez PBS solüsyonuyla yıkandı. Permeabilizasyon için (intrasellüler protein tespiti için oldukça önemlidir); lamlar %0.1Triton X-100-PBS solüsyonunda 10 dk. bekletildi. Lamlar 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra %1 BSA PBS (bloklama) solüsyonunda 30 dk bekletilerek non-spesifik bağlanmaların önüne geçildi. Daha sonra Tunel solüsyonu damlatılarak 60 dk. beklendi Sonra PBS solüsyonu ile her biri 5 dk. süreyle 3 kez yıkandı. Yıkama işleminden sonra Converted Pod solüsyonu damlatılarak 30 dk. beklendi. Sonra PBS solüsyonu ile her biri 5 dk. süreyle 3 kez yıkandı. 36

50 Çekirdek boyaması için Harris in Hematoksilen solüsyonunda 2 dk. bekletildikten sonra dereceli alkol ve ksilol serilerinden geçirilip entellan (Merck, Germany) ile kapatıldı Tunel Pozitif Hücre Değerlendirmesi Tunel boyama sonuçlarının gruplar arası kıyaslamalarını yapabilmek için Stereolojik Optic Fractionator Frame metodu kullanıldı. Bu analizler stereoloji workstation sistemi (BioPrecision MAC 5000controller system) ve stereoloji software (Stereo Investigator version 9.0, Microbrightfield, Colchester, VT) ataçmanlı ışık 94, 95 mikroskop (Leica DM4000 B, Tokyo, Japan) altında yapıldı. Çalışmamızda HT-29 hücre preparatları üzerinde tunel pozitifliği Unbiased Counting Frame and Fractionator metodu 112, 113 kullanılarak tüm gruplara ait her bir preparattaki pozitif hücre yoğunluğu aşağıdaki formüle göre hesaplandı (Şekil4): PHY = PHS/(ÇA x ÇS), PHY; µm² alana düşen pozitif hücre yoğunluğu, PHS; pozitif hücre sayısı, ÇA; çerçeve alanı (µm²) ve ÇS; çerçeve sayısı. Elde edilen veriler her bir grup için iki tekrarlı ölçüme dayanmakta olup, her gruptan 4 paralel preparat boyandı. 37

51 Şekil 3.1. Stereolojik Optik Fractionator Frame metodu ile tunel pozitifliğinin değerlendirilmesi Kantitatif Real Time PCR (qrt-pcr) Analizleri RNA İzolasyonu Hücre kültürü ortamından total RNA izolasyonu ticari kit kullanılarak üretici firmanın önerileri dikkate alındı (Qiagen RNA Mini Kit, USA). İzolasyon kiti spin kolon metoduna dayalı olup özetle, - mrna nın spin kolon membranına bağlanması, - mrna dışındaki kirliliklerin uzaklaştırılması ve - Kolon membranından RNA nın çözülerek steril toplama tüpü içerisine elüsyonu aşamalarından oluşmaktaydı. İzole edilen total RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometrik yöntemle miktarı belirlendi. Bu amaçla DNA/RNA ölçümleri için dizayn edilmiş mikro hacimde ölçüm yapabilen Nanodrop cihazı kullanıldı (u-biotek, USA) ve 260/280 nm değerlerine 38

52 göre RNA konsantrasyonu ve saflığı cihaz üzerindeki yazılımla otomatik olarak hesaplandı ve sonuçlar ng/μl olarak belirlendi cdna Sentezi Total RNA dan cdna sentezi QuantiTect Reverse Transcription Kiti (Cat No: , Qiagen, USA) kullanılarak gerçekleştirildi. Her bir örnek için ters transkriptaz (reverse transkriptase) reaksiyon karışımı Tablo 3.1 de belirtildiği gibi hazırlandı. cdna sentezi, 200 µl lik steril tüplerde Thermal Cycler PCR cihazı (Applied Bioscience, USA) kullanılarak Tablo 3.2 de belirtilen sıcaklık ve süre şartlarında gerçekleştirildi. Tablo 3.1. cdna sentezi reaksiyon karışımı İçerik Reverse-transcription master mix Quantiscript Reverse Transcriptase (RNase inhibitörü içerir) Quantiscript RT Buffer RT Primer Mix Template RNA Total hacim Hacim (μl) 1 μl 4 μl 1 μl 14 μl 20 μl Tablo 3.2. cdna sentezi için PCR sıcaklık ve süre basamakları Basamak 1 Basamak 2 Basamak 3 Basamak 3 Sıcaklık ( C) Sıcaklık ( C) 42 Sıcaklık ( C) 42 Sıcaklık ( C) 95 Sıcaklık ( C) 4 Süre Süre 2 dk Süre 15 dk Süre 3 dk Elde edilen cdna ların konsantrasyonları spektrofotometrik yöntemle (μ-biotek Nanodrop, USA) ölçülerek kaydedildi ve cdna lar qrt-pcr (Roche, German) ile rölatif kantitasyon analizleri yapılana kadar -20 C de saklandı Real Time PCR Cihazına Yükleme Aşaması Öncelikle karışım hazırlanacaktır. Her bir örnek için; 39

53 - 8 μl distile su - 5 μl probe master mix - 2 μl her bir primer için TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 primerlerinden) - 5 μl cdna Standartlar İçin Hazırlanacak Mix; - 8 μl distile su - 5 μl probe master mix - 2 μl G6PD primer standartı - Farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış standartlardan 5 μl cdna Standartların Hazırlanışı; - Standart 1: hiç sulandırma yapılmaz. Con: Standart 2: standart1 den alınan 5 μl cdna üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde edilen Con : Standart3: standart2 den alınan 5 μl cdna üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde edilen Con :100 - Standart4: standart2 den alınan 5 μl cdna üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde edilen Con :10 - Real Time PCR da Costom Assay PCR programı seçilir. Preinkibasyon - 1 cycles Analiz modu None te 10dk Ramprate 4.4 Cooling - 1 Cycles Analis Mode None - 40 te 30 sn None Ramp Rate:

54 Absolite Quantificationda değer elde edebilmemiz için 4 adet standart kullanılır. Hazırlanan karışımlar plak üzerindeki her bir kuyucuğa uygun şekilde total hacim 20 μl olacak şekilde yüklenecek ardından plaktaki yükleme cihazına tanıtıp program başlatılacaktır. Real Time PCR programı tamamladıktan sonra Absolite Quantificatinda analiz yapılıacak ve standartları baz alarak cihazın örneklere verdiği değerler not edilecektir RT-PCR (Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mrna Ekspresyonlarının Ölçülmesi Her bir örneğe ait cdna lar kullanılarak genlerinın ekspresyonları (BECLİN1, ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3) Roche LightCycler 480 Real-Time PCR cihazında çalışılacaktır. Cihazın 96 kuyucuklu PCR plağı vardır. PCR işlemleri olurken, her bir kuyucuktaki amplifkasyon miktarını kantitatif olarak eş zamanlı verme özelliğine sahiptir. Bir plağa her bir örnek 7 kuyu kullanılacak şekilde yükleme yapılacaktır. Çalışmada 4 gen (TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3) ve farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış standart G6PD kullanılacaktır. Her bir örnek için kullanılan 5μl cdna, 8 μl ddh2o, 5 μl Probe Master mix 2 μl TP53, 2 μl MDM2, 2 μl CDKN1A 2 μl, CDKN1B, 2 μl BECLİN1, 2 μl ATG4 ve 2 μl LC3 primerleri aktarılacaktır TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mrna Ekspresyon Tayininde Roche Lightcycler 480 Real-Time PCR Cihazı Real Time PCR da Costom Assay PCR programı seçilir. Absolite Quantificationda değer elde edebilmemiz için 4 adet standart kullanılır. Hazırlanan karışımlar plak üzerindeki her bir kuyucuğa uygun şekilde total hacim 20 μl olacak şekilde yüklenecektir. 41

55 Ardından plaktaki yükleme cihaza tanıtıp program başlatılır. Real Time PCR programı tamamladıktan sonra Absolite Quantificatinda analiz yapılarak standartları baz alarak cihazın örneklere TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 verdiği değerler not edilecektir İstatistiksel Analiz MTT sonuçlarının analizi için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) sonrası Duncan Post hoc testi kullanıldı. Önemlilik değeri (P) 0.05 olarak kabul edildi. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 gen ekspresyon seviyelerinin belirlenmesinde referans (Housekeeping) gen olarak G6DP kullanıldı. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 için hedef Gen/referans gen oranı alınarak normalize edildi. 42

56 4. BULGULAR 4.1. MTT Sitoksisite Sonuçları MTT analizleri sonuçlarının değerlendirmesinde, 24 saat inkübasyonu sağlanan gruplarda cisplatin uygulamasının sitotoksik etkisinin önemli oranda fazla olduğu belirlenirken, 48 saat inkübasyon gruplarında cisplatin ve melatonin (5µM) ile cisplatin uygulanan gruplarda da cisplatine yakın bir sitotoksik etki görülürken, yüksek dozda melatonin uygulamasının sitotoksik etkisinin çok az olduğu (Tablo 4.1 ve Şekil 4.1). Tablo 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçlar Gruplar 24h 48h Kontrol 0.854±0.08 a 0.751±0.11 a Mel-5µM 0.839±0.13 a 0.696±0.23 b Mel-10µM 0.863±0.21 a 0.728±0.19 a Cisplatin 0.728±0.14 b 0.622±0.12 b Mel-5µM-Cis 0.847±0.17 a 0.649±0.15 b Harflendirmeler gruplar arasındaki istatistiksel farkı göstermektedir. 48h 24h Kontrol Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Şekil 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçları 43

57 4.2. Tunel Analizi Sonuçları Tunel pozitif hücrelerin değerlendirmesinde, Kontrol, Mel-5µM ve Mel-10µM- Cis uygulanan 24 saat inkübe edilen HT-29 hücreleri tünel pozitif hücre yoğunlukları arasında önemli bir farklılığın olmadığı görülürken (P>0.05), sadece cisplatin uygulanan HT-29 hücrelerinde önemli tünel pozitif hücre yoğunluğunda önemli oranda artışın olduğu belirlendi (P<0.05), (Tablo 4.2). Ayrıca, 48 saat süreli inkübasyon grubunda Cisplatin ve Mel-5µM- Cis grupları tünel pozitif hücre yoğunluğunun diğer gruplara göre önemli oranda yüksek olduğu görülürken (P<0.05), Mel-5µM ve Mel-10µM grupları tünel pozitif hücre yoğunluğunun kontrol grubu ile aralarında anlamlı bir farklılığın olmadığı belirlendi (P>0.05), (Tablo 4.2). Tablo 4.2. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait 1000 µm 2 alandaki Tunel pozitif hücre yoğunlukları Gruplar 24h 48h Control 0.101±0.04 a 0.151±0.02 a Mel-5µM 0.115±0.02 a 0.167±0.03 a Mel-105µM 0.146±0.03 a 0.203±0.04 a Cisplatin 0.235±0.04 b 0.426±0.07 b Mel-5µM-Cis 0.165±0.07 a 0.278±0.06 c Harflendirmeler gruplar arasındaki istatistiksel farkı göstermektedir. 44

58 Şekil 4.2. Kontrol grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.3. Mel-5µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 45

59 Şekil 4.4. Mel-10µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.5. Cisplatin grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 46

60 Şekil 4.6. Mel-10µM- Cis grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.7. Kontrol grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 47

61 Şekil 4.8. Mel-5µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.9. Mel-10µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 48

62 Şekil Cisplatin grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil Mel-10µM- Cis grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 49