NOS aktivitesinin radyoaktif L- argininin L-sitruline dönüşümü yöntemi ile ölçülmesi. Hakan Gürdal

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "NOS aktivitesinin radyoaktif L- argininin L-sitruline dönüşümü yöntemi ile ölçülmesi. Hakan Gürdal"

Bercu Erdal
7 yıl önce
İzleme sayısı:

1 NOS aktivitesinin radyoaktif L argininin Lsitruline dönüşümü yöntemi ile ölçülmesi Hakan Gürdal Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji ve Klinik Farmakoloji Ana Bilim Dalı NOS 1

2 NOS aktivitesinin ölçüleceği örnekler Kültür hücreleri Doku örnekleri Dondurulmuş veya canlı hücrelerden hazırlanmış örnekler Dondurulmuş veya canlı dokulardan hazırlanmış örnekler 2

3 [3H]Larginin ile işaretleme; Canlı hücre ve dokularda işaretleme Hücreler veya dokular 20dk 3 saat 13 µci/ml [3H]Larginin ile fizyolojik bir tampon ile 37 C bekletilebilir. (DMEM, CO2 inkübatörü) (damar,beyin,kc vs) İnkübasyon sonrası yıkama opsiyonel Etkisine bakılacak madde ile inkubasyon (1060dk) Reaksiyonun sonlandırılması Hücre proteinleri ve yağlarının presipite edilip çözünür fraksiyonun elde edilmesi TCA, Metanol/HCl, kloroform/metanol TCA uzaklaşırılması veya ph ın ayarlanması 3

4 Katyondeğiştirici kolon kromatografisi ile [3H]Larginin [3H]Lsitrulin ayrıştırılması nrzso 3 H Na RzSO 3 Na H nrzso 3 Na [3H]Larginin RzSO 3 [3H]Larginin Na nrzso 3 H M n (RzSO 3 ) n M nh L arginin L sitrülin NaOH çözeltisi styrenedivinyl benzene kafes (lattice) RSO 3 L arginin L sitrülin Na Na _ Na Na Na Na Na OOH OH Na OH Na Na Na Na Na OH Na Na OH Na OH OH L arginin Na H Na 4

5 Hücre ve doku homojenatlarında ölçüm: Dondurulmuş veya taze hücre ve dokular homejanizasyon tamponu (HT)(yaklaşık 5ml/g doku) içinde parçalanır ve homejenize (soğukta ve hızlı yapılmalıdır) edilir Xg 30 dk (sitozol mikrozomal fraksiyonlar) (NOS aktivitesini artırıcı etkinin nasıl nereden geldiği önemli) veya xg 60dk (sitozol) santrifuj edilir. Supernatan alınır, protein ölçümü yapılır deney için kullanılır. Endojen Larginin yüksek olduğu düşünülüyorsa veya biliniyorsa Larginin ortamdan uzaklaştırılır. Hücre ve doku homojenatlarında ölçüm: DT(örnek1): 50mM KPO4, 1.2 mm MgCl2, 0.25 mm CaCl2, 120mM NADPH, 1.2 mm sitrullin (ph 7.2). DT(örnek2): 50 mm HEPES, 1.25 mm CaCl2, 1mM EDTA 1mM NADPH, 10mg calmodulin (ph:7.4) DT (100200µl) Örnek (20100µl) 12 µci/ml [3H]Larginin 510 dk Maddeyi ekle 1030dk bekle Reaksiyonu durdur 5

6 Reaksiyon katyon değiştirici kolon konularak durdurulabilir 20mM HEPES (ph 7.2), 1mM EDTA, NOS inhibitöru (Sethylisothiourea veya LNNA) içeren tamponla sonlandırılır örneklerdeki [3H] Lsitrullin, [3H] Larginin kolondan geçirilerek ayrıştırılır % Bazal artış (Citrülin/Total) Ach 6

7 NOS proteinlerinin Westernblot tekniği ile saptanması enos, inos ve nnos Western blot tekniği ile kros reaktivite vermeyen antikorlar kullanılarak saptanabilmektedir 7

8 1NOS poteinlerinin elde edileceği örneklerin hazırlanması 2Örnekteki proteinlerin ayrıştırılması 3İmmunoblot ile antikorlar kullanarak proteinlerin saptanması 1NOS poteinlerinin elde edileceği örneklerin hazırlanması Dokuların elde edilmesi sırasında kandan arındırma Hemoglobin bulaşmasını en aza indirme Homojenizasyon Tampon (sukroz, deterjan içerebilir) 100mg doku veya 1milyon hücre/ 13 ml tampon Hızlı ve mümkün olduğunca buz soğukluğunda 8

9 Santrifügasyon ( xg, 30 dk sitozol mikrozomal fraksiyonlar ( xg, 60 dk sitozol Süpernatanda protein en az 1 mg/ml olacak şekilde tüm protokol optimize edilmelidir Elektroforez Proteinler en az 20µgr olacak şekilde %10 SDSPAGE ile ayrıştırılabilir Protein miktarı artırılabilir ( µgr) ve akrilamit yüzdesi % 85 olacak şekilde SDSPAGE yapılabilir Transfer 9

10 Blot zarının bloklanması NOS proteinlerinin antikor ile işaretlenmesi 1Zar nonspesifik proteinler ile kaplanır (bloklama) 2Spesifik primer antikor ile NOS bağlanması 3Primer antikorun işaretlenmesi (primer antikora karşı geliştirilmiş bir probla işaretli (HRP) sekonder antikorla primer antikor bağlanması) 4Görüntüleme (ECL) NOS Sekonder antikor Asit Işık Primer antikor HRP Luminol Zar Filim 10

11 enos (133 kd, ) nnos (160 kd, ) Ferihan Çetin 11

12 NOS proteinlerinin immunohistokimyasal saptanması. enos, inos ve nnos her üç izoform immunohistokimyasal ve immunositokimyasal yöntemlerle görüntülenebilmektedir. 12

13 Örneklerin hazırlanması (fiksasyon ve kesit hazırlanması ( sectioning)) Hücreler öncelikle cam bir lamel üzerine oturtulmalı ve fiksasyon yapılmalıdır. Mümkünse doku çıkarılma esnasında öncelikle fizyolojik bir tampon ile perfüze edilmeli ve perfüzyon solusyonuna uygun bir fiksatif konulup fikse edilmeli (% 3.5 PFA) Doku çıkarıldıktan sonra fiksasyona devam edilmeli (% 3.5 PFA, 4 saat) Fiksatif Frozen Parafin nnos YOK nnos PFA, Aseton, PLP enos YOK enos PFA, Aseton, Etanol inos YOK inos PFA,Aseton, PLP, Formalin PLP; periodatlisinparaformaldehit 13

14 Hücre ve dokuların permeabilize edilmesi, kesitin bloklanması, işaretleme 1Kesit nonspesifik proteinler ile kaplanır (bloklama) 2Spesifik primer antikor ile NOS bağlanması (permeabilizasyon, fiksatif, Triton X, Tween) 3Primer antikorun işaretlenmesi (primer antikora karşı geliştirilmiş bir probla işaretli (floresan) sekonder antikorla primer antikor bağlanması) 4Görüntüleme (Floresan prob konfokal mikroskopisi veya floresan mikroskopisi, enzim prob ışık mikroskopisi, metal prob elektron mikroskopisi) Emisyon Sekonder antikor Primer antikor NOS CY3 Eksitasyon 14

15 Çeşitli Floresan problar Cy3 Cy5 FITC Rhodamine Teksas Kırmızısı Fluorescein Eksitasyon (nm) Emisyon (nm) enos aorta 15

16 enos aorta NOS mrna larının RTPCR tekniğiyle saptanması 16

17 enos, inos ve nnos bazı durumlarda dokularda düşük düzeyde bulunmaları nedeniyle saptanamazlar. RTPCR ile çok düşük düzeylerdeki NOS mrna ları saptanabilir. RTPCR PCR RT 17

RNA izolasyonu 1Klasik Chomcynski ve Sacchi yöntemi Guanidin tiyosiyanat/deterjan Organik ektraksiyon (fenol, cloroform) Alkol ile presipitasyon 2Nükleik asit bağlayan silika jel kolonlara RNA nın

18 RNA izolasyonu 1Klasik Chomcynski ve Sacchi yöntemi Guanidin tiyosiyanat/deterjan Organik ektraksiyon (fenol, cloroform) Alkol ile presipitasyon 2Nükleik asit bağlayan silika jel kolonlara RNA nın bağlanması ve elusyonu Önemli 1RNA yıkılımını azaltmak (RNaz inhibisyonu, Total RNA nın %15 mrna) 2DNA bulaşmasını engellemek (DNase ile inkübasyon) DNA kontaminasyonundan şüpheleniliyorsa alınan örnekte βactin primeri kullanılarak PCR yapılır. Kontaminasyon yok ise her hangi bir ürün oluşmaz. Özel primer sentezlenmesi. 18

19 RNA izolasyonu PolyAmRNA izolasyonu total RNA veya doğrudan örneklereden polyamrna bağlayan kolon materyalleri (oligo(dt) nin kovalent bağlandığı lateks boncuklara bağlama) Elde edilen RNA nın kalitesi (puritesi ve bütünlüğü) 260 ve 280 dalga boyundaki absorbsiyon oranlarının 1.8 ve 2.1 aralığında olması RNA ların bütünlüğü (integrity) denature agorose jel elktroforezi ile kontrol edilebilir. 28 S ve 18 S olmak üzere iki adet band görülmelidir. Tek aşamalı uygulama (RT ve PCR reaksiyonu tek aşamalı aynı tüp içerisinde yapılır 135 siklus 94 C 15 saniye, 55 C 30 saniye, 68 C 1 saniye, 68 C 15 dk bekleme ve 4 C örnekleri tutma. PCR DNA polimeraz, spesifik primerler RT inaktivasyonu 94 C 2 dk cdna sentezi için örnekler 4250 C 5060 dk RT RT, Deoksinükleotidler (200µΜ, RNaz inhibitör) Total RNA 220 pmol/µl veya poly (A) mrna 19

20 İki aşamalı uygulama (RT ve PCR reaksiyonu ayrı yapılır) 135 siklus 94 C 15 saniye, 55 C 30 saniye, 68 C 1 saniye, 68 C 15 dk bekleme ve 4 C örnekleri tutma. PCR cdna (35µl) DNA polimeraz, spesifik primerler, deoksinükleotidler RT inaktivasyonu 94 C 2 dk cdna sentezi için örnekler 4250 C 5060 dk RT RT, deoksinükleotidler (500µΜ, RNaz inhibitör) Total RNA µg/µl veya poly (A) mrna, Örnek primerler Sekans 5 3 Annealing Temp. cdna bp enos sense CTG GCA AGA CCG ATT ACA CGA enos anti CGC AAT GTG AGT CCG AAA ATG enos sense GTG ATG GCG AAG CGA GTG AAG enos anti CCG AGC CCG AAC ACA CAG AAC inos sense TCG GAG GCA AAC AGC ACA TTCA inos anti GGG TTG GGG GTG TGG TGA TGT 20

21 enos aorta 21

Benzer belgeler

M. Kerem ÇALGIN 1, Fikret ŞAHİN 1, Melike ATASEVER 2, Deniz KÖKSAL 2, Djursun KARASARTOVA 1, Mehmet KIYAN 1. AÜTF Tıbbi Mikrobiyoloji ABD 2

Mycobacterium tuberculosis Suşlarında Eflüks Pompa Yapısına Katılan Gen Ekspresyonlarının Çoklu İlaç Direnci Gelişimi Üzerine Olan Etkisinin Araştırılması M. Kerem ÇALGIN 1, Fikret ŞAHİN 1, Melike ATASEVER