Efe Kemal Akdoğan, Hande Erdoğan, Erencan Gündoğdu, Gonca Saraç Danışman: Derya Aldemir

Transkript

1 ASETAMİNOFEN İLE UYARILAN KARACİĞER TOKSİSİTESİNİN İNCELENMESİ: N-ASETİLSİSTEİNİN OLASI KORUYUCU ROLÜ Efe Kemal Akdoğan, Hande Erdoğan, Erencan Gündoğdu, Gonca Saraç Danışman: Derya Aldemir ÖZET Asetaminofen (APAP) sıklıkla kullanılan ir analjezik/antipiretik ajandır. APAP ın aşırı dozda alınması akut karaciğer yetmezliğine neden olmaktadır. APAP ın seep olduğu hepatotoksisitenin gelişiminde reaktif oksijen ve nitrojen türleri önemli ir rol oynamaktadır. L-Arjinini sustrat olarak kullanan NOS ve arjinaz enzimlerinin irçok fizyopatolojik durumda ters regülasyonları önem taşımaktadır. Bu çalışmada APAP ile uyarılan karaciğer toksisitesinde oksidatif ve nitrozatif stres ile Arjinaz/NO ilişkisinin irdelenmesi ve koruyucu olarak N-asetilsistein (NAC) kullanımının etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır gr ağırlığında, erkek, swiss-alino cinsi 24 adet fare 4 eşit grua ayrılarak kullanılmıştır. Kontrol gruuna taze hazırlanan salin, APAP gruuna suletal dozda APAP uygulaması (550 mg/kg), NAC gruuna 400mg/kg dozda N-asetil sistein uygulaması ve APAP+NAC gruuna tek doz APAP uygulamasından sonra ikinci saatte tek doz NAC uygulaması gerçekleştirilmiştir. Tüm uygulamalar ir gecelik açlık sonrasında, intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon yolu ile yapılmış ve 24 saat sonra hayvanlar anestezi altında sakrifiye edilmiştir. Kontrol gruu ile karşılaştırıldığında, APAP gruunda serum aspartat aminotransferaz (AST) ve alanin aminotransferaz (ALT) aktiviteleri anlamlı olarak yüksek ulunmuştur (p<0.01). APAP uygulaması kontrol gruuna göre karaciğer malondialdehit (MDA) derişimini anlamlı olarak artırırken, redükte glutatyon (GSH) derişimini, anlamlı olarak azaltmıştır (p<0.05). NAC uygulaması ise, karaciğer MDA derişiminde azalmaya, GSH derişiminde artmaya neden olmuştur (p<0.05). Hepatik arjinaz aktivitesinde herhangi ir değişim gözlenmezken, NOS aktivitesinin göstergesi olarak karaciğer nitrit derişimleri APAP uygulanan grupta tüm gruplara göre anlamlı yüksek ulunmuştur (p<0.01). Bulgularımız, u dozda APAP uygulamasının karaciğer hasarına neden olduğunu, lipit peroksidasyonunu ve NO oluşumunu artırdığını, N-asetilsisteinin ise oksidatif ve nitrozatif stres ağlamında koruyucu etki gösterdiğini ortaya koymuştur. GİRİŞ Asetaminofen (APAP) sıklıkla kullanılan ir analjezik/antipiretik (ağrı kesici/ateş düşürücü) tir. Terapötik dozlarda kullanıldığında yararlı olan APAP ın yüksek dozlarda kullanıldığında deney hayvanları ve insanlarda hepatik nekroz, örek toksisitesi ve ölüme neden olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. APAP ın aşırı dozda alınması Amerika Birleşik Devletleri, İngiltere ve Avrupa da akut karaciğer yetmezliğinin en sık nedeni haline gelmiştir(1, 12). APAP (C 8 H 9 NO 2 ), katı, kütlesi 151,2 g/mol olan, suda çözünürlüğü az, sentetik ir moleküldür (Şekil 1). Zayıf ir asit olması nedeniyle fizyolojik ph aralığında aniyonize formda ulunmaktadır (28). Şekil 1 Asetaminofen (10) 1

2 APAP öncelikle karaciğerde glukuronidasyon ve sülfasyon ile metaolize edilir. Terapötik dozda alınan APAP (< 4g/gün) ın % i sülfat-glukronit konjugasyonu ile, % i ise hepatik CYP450 sistemi (CYP2E1-1A2) ile ir reaktif toksik metaolit olan N-asetil-penzokinonimin (NAPQI) e dönüştürülerek detoksifiye edilmektedir. Bu toksik metaolit glutatyon (GSH) a ağlanarak detoksifiye edilir (Şekil 2). APAP ın aşırı doz alımı, CYP enzimlerinin indüksiyonu, glutatyonun azalması ve/veya glukuronidasyonun inhiisyonunun gerçekleştiği durumlarda u metaolit yeterince detoksifiye edilemez. Yüksek doz APAP uygulaması sonrası konjugasyon yolu doygunluğa ulaştığı için CYP450 yolu ile metaolize edilen APAP miktarı artar ve u durum toksik reaktif metaolit oluşum hızında artışla sonuçlanır (3,35). Bu artış, hücre içi redükte glutatyonda (GSH) azalma ile sonuçlanır ve ortamdaki fazla NAPQI hücredeki makromoleküllerle etkileşerek sentriloüler nekroza neden olur. Erken dönemde mitokondrial disfonksiyon görülürken unu mitokondrial kollaps, onkotik nekroz izler ve sonuçta in vivo hücre ölümü meydana gelir (3,33). Şekil 2 Karaciğerde Asetaminofen Metaolizması ( 11 ) Oksidatif stres, serest radikal oluşumu ile antioksidan savunma ve tamir sistemleri arasındaki dengenin ozulması durumudur. Reaktif oksijen türleri (ROS) hücrede lipit, protein, DNA gii makromoleküllerle etkileşime girmektedir. Bu nedenle ROS ve lipit peroksidasyonu irçok hastalığın patogenezinde önemli rol oynamaktadır. Lipit peroksidasyonu ROS aracılı hücre hasarının en önemli sonuçlarından iridir. Fizyolojik şartlar altında düşük hızda gerçekleşen lipit peroksidasyonunun oksidanlar ve oksidatif stres ile oluşum hızı artailmektedir. Lipit peroksidasyonunun en önemli hedefi çoklu doymamış yağ asidi (PUFA) içeriği fazla olan memran fosfolipitleridir. PUFA lar ve metaolitleri enerjinin sağlanması, hücre içi sinyal oluşumu ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi gii önemli fizyolojik rollere sahiptir. Bu nedenle lipit peroksidasyonu memran lipit taakasının fizyolojik yapısını değiştirerek hücresel işlev kayına neden olailmektedir. Oksidatif stres mekanizmasının APAP toksisitesinde önemli rol oynadığı kaul edilmektedir. - APAP ın NAPQI ya oksidasyonunda artış, O 2 ve hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) oluşumunda artışla sonuçlanmaktadır. NAPQI nın yüksek oksidatif kapasitesi nedeniyle oluşan tiyol oksidasyonunun karaciğer toksisitesinin ana nedeni olaileceği düşünülmektedir. NAPQI nın GSH ı okside etmesi sonucu hücede GSH/GSSG oranı ve ayrıca NADPH/NADP + oranı azalmaktadır. GSH derişiminde u azalma, GPx enzim aktivitesinde azalma ve/veya kayıpla sonuçlanmaktadır (17). 2

3 APAP ın seep olduğu hepatotoksisitenin gelişiminde reaktif oksijen ve nitrojen türleri önemli rol oynamaktadır (15). APAP toksik dozunu izleyen süreçte nekrotik hücrelerdeki proteinde tirozin nitrasyonu meydana gelmektedir. Tirozin nitrasyonu artan NO ve süperoksitin reaksiyona girmesi sonucu oluşan peroksinitrit aracılığı ile gerçekleşmektedir. APAP ın toksik dozu NO sentezi ve nitrotirozin-protein eklentilerinin yapımının artışına öncülük eder (12). Nitrotirozin karaciğerdeki nekrotik sentrilouler ölgede APAP-protein eklentileriyle aynı yerleşimlidir. Peroksinitritin GSH/GSH peroksidaz tarafından detoksifiye edildiği ilinmektedir. Ancak hücre içi GSH ın, APAP toksisitesinde önemli ölçüde azalmaktadır (12, 15). Hepatik GSH iyosentezini arttırmak için mevcut APAP aşırı dozunun tedavilerinde N-asetilsistein kullanılmaktadır (12). APAP hepatotoksisitesi inos ekspresyonunun artmasıyla ve nitrotrozin-protein eklentilerinin oluşması ile ilişkilidir. Aminoguanidin ile inos un inhie edilmesinin APAP tarafından oluşturulan karaciğer hasarını önemli ölçüde azalttığı gösterilmiştir. NO hepatik mikrovaskülasyona yeterli kan rezervinin sağlanmasında kritik ir rol oynar. Bu işlevini lökosit, platelet ve endotelyal hücrelerinde adezyon moleküllerinin eksprese edilmesini etkileyerek gerçekleştirmektedir (14). Hepatik üre döngüsünün ir enzimi olan arjinaz (EC ), L-arjinini üre ve ornitine hidroliz eder. Arjinazın, doku dağılımına, susellüler yerleşimine ve immünolojik reaktifliğine göre değişiklik gösteren iki ayrı izoenzimi tanımlanmıştır. Arjinaz I, karaciğerde çok miktarda ifadelenen sitozolik ir enzimdir ve toplam vücut arjinaz akivitesinin çoğunu oluşturur. Arjinaz II ise geniş doku dağılımına sahip, en çok örek ve prostatta, çok az miktarda ise karaciğerde ifadelenen mitokondrial ir enzimdir. Nitrik oksit sentaz (EC ) NADPH ve O 2 varlığında arjininin nitrik oksit (NO) ve sitrüline dönüşümünü katalizleyen ir monooksijenazdır (Şekil 3). Memelilerde üç farklı NOS ifadelenir: Nöral NOS (nnos), endotelyal NOS (enos) ve indükleneilir NOS (inos). Bunların hepsi homodimerik, hem içeren flavoproteinlerdir. NOS flavinleri NADPH kaynaklı elektronları hem e transfer ederler. Bu her iki asamakta da hem in dioksijene ağlanmasına ve onu aktive etmesine yol açar. Ayrıca tetrahidroiopterin kofaktör olarak gereklidir ve enzime hem in yanından sıkıca ağlanmıştır. NOS un elektron transfer reaksiyonları kalsiyum ağlayan ve NOS a tersinir içimde ağlanailen kalmodulin tarafından düzenlenir (29). Ancak, ilk olarak makrofajlarda tanımlanan inos (tip2) kalsiyum ağımsızdır ve indükleneilir (26). Nitrik oksit (NO) memeli vücudundaki irçok önemli olayda rol oynayan ir sinyal molekülüdür (29). En önemli özelliği ir serest radikal olmasıdır. NO nun kimyası onun ir serest radikal olmasına yoğunlaşmasına rağmen, NO diğer serest radikaller ile aynı kimyasal özellikleri göstermez. Örneğin, diğer karon-, oksijen- ya da nitrojen- merkezli serest radikallerin aksine nitrik oksit dimerize olmaya yatkın değildir (8). NO nun iyokimyası onu direk ve indirek olarak iki sınıfa ayırır. Direk etkileri, NO yu iyolojik hedef molekül ile direk tepkimeye sokacak kadar hızlı oluşan kimyasal tepkimelerdir. Bu durumun tersine; indirek etkileri NO nun O 2 veya superoksit (O 2 ) ile tepkimeye girerek reaktif nitrojen radikalleri/molekülleri (RNS) oluşturması, ardından RNS nin iyolojik hedefle tepkimeye girmesiyle oluşan kimyasal tepkimelerdir. Direk etkiler genelde düşük derişimlerde oluşurken, indirek etkiler çok daha yüksek derişimlerde gözlenir. NO nun normal fizyolojik süreci düzenleyen damar ve stroma hücrelerindeki gii düşük derişimlerinden enos ve nnos sorumludur. Makrofajlar tarafından aktive edilen, sitotoksik 3

4 fonksiyonlarının olduğu düşünülen yüksek seviyelerinden ise inos sorumludur (32). NO, özgün ölgedeki derişimi, diğer ROS ların derişimi ve özellikle hücre redoks durumuna ağlı olarak antioksidan, düzenleyici veya toksik etki göstereilmektedir. Nitrasyon, nitrozilasyon ve oksidasyon dolaylı etkileri arasında yer almaktadır. Genel olarak, düşük derişimlerde (<1μM) doğrudan, una karşın yüksek derişimlerde (>1μM) dolaylı etki göstermektedir (34). Arjinazın hücrelerdeki aktivitesi NO iyosentezini NOS sustratı olan L-arjinin için yarışarak düzenlemektir (6,24,25). Arjinaz I ve Arjinaz II, inos tarafından NO yapımının sınırlandırılmasında eşit etkiye sahiptir. Egzojen L-arjinin alımının olmadığı durumda Arjinaz I in artmış ekspresyonunun nitrit üretimini askıladığı gösterilmiştir (25). Arjinaz ayrıca, inos proteinin translasyonunu ve kararlılığını askılamayı, üre yapımıyla ve endojen inhiitörü olan ADMA ile NOS aktivitesini askılamayı içeren irtakım potansiyel mekanizmalar yoluyla NO yapımını inhie eder. Öte yandan arjinazın artmış sentezinin, enos ile NO sentezini askıladığı ve hipertansiyon, yaşlanma, iskemi-reperfüzyon ve diyaetteki endotelyal işlev ozukluğuna yol açtığı gösterilmiştir (24). Şekil 3 Nitrik Oksit Sentaz Tepkimesi ( 29) Şekil 4 Arjinin Metaolik Ürünleri (27) N- asetilsistein (NAC) indirgenmiş glutatyon (GSH) un ve L- sistein (L-Cys) in asetillenmiş halidir. Güçlü nükleofilik özelliği nedeni ile serest radikalleri temizleme yetisine sahiptir. NAC sülfidril gruu içerdiği için oral alımı sonrasında gastrointestinal sistemden hızlıca emilir. Barsak ve karaciğerde asetil gruu uzaklaştırılarak metaolize edilir. Oral kullanımından 1 saat sonra en yüksek plazma değerine ulaşır ve 12 saat sonra plazmada yer almaz. Sülfidril gruu vericisi olarak GSH sentezini uyarır, zenoiyotik iyotransformasyonunu askılayarak, karaciğer toksik hasarında koruyucu işlev gösterir. NAC; klinikte solunum hastalıkları, APAP ve diğer zehirlenmeler, HIV enfeksiyonları, kanser ve çeşitli kalp hastalıkları gii azı hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Kronik solunum hastalıklarında mukolitik ajan ve asetaminofen doz aşımına ağlı karaciğer hasarında GSH ve L-Cys öncüsü olarak kullanılır (12,15,22). Bu çalışmada APAP ın neden olduğu karaciğer toksisitesi üzerinde N-asetilsisteinin koruyucu etkisinin oksidatif ve nitrozatif stres ile hepatik arjinaz/nitrik oksit sentaz ilişkisi ağlamında karşılaştırılması amaçlanmaktadır. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları kullanım kurallarına uygun olarak Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Etik Kurulu nun 2010/sayı:B.30.2.BŞK /215 no lu kararı ve desteğiyle gerçekleştirildi. Deney Hayvanları ve Gruplar Çalışmada, ağırlıkları gr arasında değişen 24 adet erkek Swiss Alino fare kullanıldı. Deney hayvanları 12 saat aydınlık, 12 saat karanlıkta ırakıldı ve eslenmeleri standart 4

5 diyet ve su (ad liitum) ile sağlandı. APAP LD 50 dozu 550 mg/kg ve NAC dozu 400 mg/kg olarak elirlendi. Uygun dozlar seçildikten sonra deney hayvanları 4 grua ayrıldı. Grup 1 (Kontrol gruu): Salin uygulanan grup (KONT) (n=6) Grup 2: 400 mg/kg NAC (i.p., tek doz) (n=6) Grup 3: 550 mg /kg APAP (i.p., tek doz ) (n=6) Grup 4: 550 mg/kg APAP (i.p., tek doz) mg/ kg NAC (APAP sonrası 2. saat) (i.p., tek doz) (n=6) Tüm uygulamalar ir gecelik açlık sonrasında, intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon yolu ile (8ml/kg) yapıldı ve 24 saat sonra hayvanlar anestezi altında (50 mg/kg ketamin; 7 mg/kg ksilazin) sakrifiye edildi. Bütün gruplarda intrakardiak kan alımı sonrası karaciğer dokusu izole edildi. Serum Biyokimyasal Parametrelerinin Ölçümü 3000g de 15 dk santrifügasyon sonrası elde edilen serum örneklerinde aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), laktat dehidrogenaz aktiviteleri uv yöntem ile Roche diagnostik reaktifleri kullanılarak Roche Hitachi modüler PP sisteminde (Roche Diagnostik GmH, Mannheim, Almanya) analiz edildi. Doku MDA ve GSH Derişiminin Saptanması Dokular 0,15 M potasyum klorür içinde cam-cam homojenizatör kullanılarak (1/10; w/v) homojenize edildi. Doku örneklerinde MDA derişimi Buege ve Aust un yöntemi kullanılarak saptandı (4). Yöntem MDA nın tiyoaritürik asit (TBA) ile yaptığı kompleksin kolorimetrik olarak ölçümü esasına (Shimadzu-1601) dayanmaktadır (A 535 ). MDA derişimleri molar ekstinksiyon katsayısı (1,56x10 5 M -1 cm -1 ) kullanılarak hesaplandı ve nmol/g doku olarak ifade edildi. Doku GSH derişimleri Ellman ın doku sülfidril grup analizi yöntemi ile gerçekleştirildi (7). GSH derişimleri standart eğri kullanılarak hesaplandı ve mol/g doku olarak ifade edildi. Doku Arjinaz Aktivitelerinin Saptanması Doku örnekleri %1 Triton X-100, 0.1 M PMSF, 0.2 mm leupeptin içeren 20 mm Tris-HCl ph 7,68 tamponunda cam-cam homojenizatör kullanılarak homojenize edildi (1/10, w/v). Homojenat örneklerinin 15,000g de 10 dk santrfüj işlemi sonrası elde edilen süpernatant enzim kaynağı olarak kullanıldı. Enzim aktivite tayini Geyer ve Daich in yöntemine göre gerçekleştirildi (9). Yöntem oluşan ürenin kolorimetrik olarak ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Renk oluşumu sonrası asoranslar 520 nm de (Shimadzu-1601) renk körüne karşı ölçüldü. Üre derişimleri standart eğri kullanılarak elirlendi ve 1 ünite enzim aktivitesi 1 mol üre/dk/g doku olarak (U/g doku), spesifik aktivite ise U/mg protein olarak ifade edildi. Doku NOS Aktivitelerinin Saptanması Doku NOS aktivitelerinin elirlenmesi, dolaylı olarak, NO in kararlı son ürünleri olan total nitrit analizi ile gerçekleştirildi. Doku örnekleri 2 mm EDTA içeren 20 mm ph 7,68 Tris-HCl tamponunda cam-cam homojenizatör kullanılarak (1/10, w/v) homojenize edildi. Total nitrit analizleri Nitrik Oksit Kolorimetrik Analiz Kiti (Roche Diagnostik, Mannheim, Almanya) kullanılarak önerilen protokole göre gerçekleştirildi. Asorans değerleri 550 nm de, mikroplate okuyucu (Bio-Tek, Winooski-USA) kullanılarak köre karşı elde edildi. 5

6 Derişimler standart eğri kullanılarak hesaplandı ve total NO 2 derişimleri nmol/g doku olarak ifade edildi. Doku Total Protein Analizi Doku homojenatlarında total protein analizi Bradford yöntemine göre gerçekleştirildi (2). Protein derişimleri BSA (Bovine serum alumin) standart eğrisi kullanılarak hesaplandı ve sonuçlar mg/ml olarak ifade edildi. İstatistiksel Analiz Değişkenlerin normal dağılıma uyumu Shapiro- Wilk testi ile kontrol edildi. Normal dağılım göstermeyen ve grup varyansları homojen olmayan değişkenlere ilişkin karşılaştırmalar Kruskal- Wallis testi ve ardından çoklu karşılaştırma yöntemlerinden Bonferroni- Dunn testi ile yapıldı. Parametrik testlerin önşartlarını sağlayan değişkenlere ilişkin grup karşılaştırmalarında Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karılaştırma yöntemlerinden Tukey testi kullanıldı. Sonuçlar ortalama standart sapma ve ortanca değer olarak ifade edildi. p<0,05 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kaul edildi. Veri setinin istatistiksel analizi SPSS 11,5 yazılımı ile gerçekleştirildi. BULGULAR APAP ve NAC uygulamalarının serum ALT, AST ve LDH aktiviteleri üzerine etkileri Talo 1 ve sırasiyle Şekil 5 ve 6 da verilmiştir. ALT ve AST aktiviteleri APAP uygulanan grupta, diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek ulunmuştur (p<0,01 ve p<0,05). APAP+NAC uygulanan grupta ise kontrol gruuna göre anlamlı ir değişiklik ulunmamıştır. LDH aktiviteleri gruplar arasında anlamlı değişiklik göstermemiştir. Talo 1 Serum Biyokimyasal Parametreleri ALT (U/L) AST (U/L) LDH (U/L) Grup 1 Kontrol (n=6) 59 ± 22,8 (51) 200 ± 138,6 (174) 739 ± 321,8 (691) Grup 2 NAC (n=5) 108 ± 50,1 ** (77) 176 ± 41,7 (148) 611 ± 229,2 (470) Grup 3 APAP (n=5) 1302 ± 2389,2 **, # (144) 1446 ± 2138,2 (395) 2540 ± 3668,4 (894) Grup 4 NAC+APAP (n=6) 70 ± 31,2 (58) 140 ± 77,2 # (127) 564 ± 128,6 (539) Veriler ort ± SD ve (ortanca) olarak verilmiştir ** p<0,01 Grup 1 ve 4 ile karşılaştırıldığında; # p<0,05 Grup 2 ile karşılaştırıldığında; p<0,01 Grup1, 2 ve 4 ile karşılaştırıldığında 6

7 ALT (U/L) AST (U/L) N = 6 Kontrol ** 5,, NAC Şekil 5 Serum ALT aktiviteleri **, # 5 APAP 6 APAP+NAC N = 6 5 Kontrol NAC Şekil 6 Serum AST aktiviteleri 5 APAP # 6,, APAP+NAC Talo 2 Doku MDA, GSH, total nitrit derişimleri ile arjinaz aktiviteleri Arjinaz (U/g) Arjinaz (U/mg prt) Total nitrit (nmol/g) MDA (nmol/g) GSH (μmol/g) Kontrol (n=6) 680,4 ± 109,80 (661,17) 55,7 ± 8,35 (53,04) 244,8 ± 68,17 (256,57) NAC (n=5) 723,2 ± 69,78 (744,23) 51 ± 4,34 (50,29) 271,18 ± 65,97 (310,24) APAP (n=6) 614,1 ± 106,60 (595,75) 51,8 ± 3,77 (51,18) 405,5 ± 132,35 (369,21) NAC+APAP (n=6) 721, 37 ± 33,84 (726,77) 51 ± 4,48 (50,02) 197,7 ± 89,04 ## (199,82) 23,3 ± 4,33 29,4 ± 8,67 38,5 ± 12,12 * 23,9 ± 5,61 7,3 ± ,0 ± 1,24 4,0 ± 1,49 6,6 ± 1,27 Veriler ort ± SD ve (ortanca) olarak verilmiştir APAP uygulaması, kontrol ve APAP+NAC gruplarına göre MDA derişimlerini anlamlı olarak yükseltmiştir (p<0,05). APAP + NAC gruunda ise kontrol gruuna göre anlamlı ir değişiklik ulunmamıştır (Talo 2, Şekil 10). GSH derişimleri, APAP uygulanan grupta diğer tüm gruplara göre anlamlı olarak azalırken (p<0,01), APAP+NAC uygulanan grupta ise kontrol gruuna göre anlamlı ir değişiklik ulunmamıştır (Talo 2, Şekil 11). 7

8 Şekil 7 Karaciğer arjinaz aktiviteleri Şekil 8 Karaciğer arjinaz spesifik aktiviteleri ## Şekil 9 Karaciğer total nitrit derişimleri * Şekil 10 Karaciğer MDA derişimleri Şekil 11 Karaciğer GSH derişimleri * p<0,05 Grup 1 ve 4 ile karşılaştırıldığında; ## p<0,01 Grup 2 ile karşılaştırıldığında; p<0,01 Grup1, 2 ve 4 ile karşılaştırıldığında TARTIŞMA APAP sıklıkla kullanılan analjezik/antipiretik ir ilaçtır. Terapötik dozlarda kullanıldığında yararlı olan APAP ın aşırı dozda alınması akut karaciğer yetmezliğinin en sık nedeni haline gelmiştir. Aşırı doz APAP alımında, CYP enzimlerinin indüksiyonu, glutatyonun azalması 8

9 veya glukuronidasyon inhiisyonu ile yeterince nötralize edilemeyen NAPQI hücredeki proteinlerin sistein gruplarına kovalan ağlanır ve hepatik sentrilouler nekroz meydana gelir (1,12,21). En çok APAP ın toksik etkisine karşı kullanılan N-Aseilsistein (NAC) güvenli ve tolere edileilir ir andidottur. APAP toksisitesine karşı NAC ın irincil rolü hücre içi GSH ı tekrar sağlamasıdır (21). Bu çalışmada 550 mg/kg suletal dozda APAP uygulanması ile serum ALT ve AST aktivitelerinin kontrole göre artışı akut karaciğer hasarını desteklemektedir. Ayrıca APAP toksisitesinde insanlarda tedavi amaçlı kullanılan NAC uygulaması enzim aktivitelerinin kontrol düzeylerine inmesini sağlayarak koruyucu etki göstermiştir. L- arjinin in poliaminlere, nitrik oksit (NO) e ve üre sentezine giden metaolik yolları arasındaki ilişki toksisite dahil irçok durumda etkileneilir. Arjinin, hem arjinaz hem de NOS için ortak ir sustrattır. Arjinaz ve NOS aktivitelerinin kontrolü söz konusu enzimlerin fizyolojik ve klinik işlevleri nedeni ile üyük önem taşımaktadır. Aynı sustratı, ilgileri farklı olmak üzere kullanmaları, sentezlerinin indüksiyonu ve aktivitelerinin düzenlenmesindeki olası ters işlevleri nedeni ile çeşitli araştırmalarda ekspresyonları/aktiviteleri incelenmiştir (16). Tiyoasetamid ile uyarılmış akut karaciğer hasarının arjinaz aktivitesinde düşüşe yol açarken total hepatik NO 2 derişimini arttırdığı gösterilmiştir. Karaciğer doku arjinaz aktivitesindeki azalmanın enzimin karaciğerden salınmasını ve/veya hasara ağlı olarak sağlam hepatosit sayısının azalmasını yansıtaileceği ildirilmiştir. (18). Karon tetraklorür ile uyarılmış ir karaciğer hasarı modelinde ise azı üre döngüsü enzimlerinin karaciğer hücreleri zarar gördüğü zaman hepatositlerden hızlı ir şekilde sızdığı ve serum tip I arjinaz ının önemli ölçüde arttığı gösterilmiştir.araştırmalar, karaciğer arjinazının irden fazla formunun olduğunu; ancak çeşitli patofizyolojik durumlarda Tip I arjinazın indüklenmediğini göstermektedir. Buna karşın karaciğer hasarlarında Tip II arjinaz ekspresyonunun ve aktivitesinin arttığı gösterilmiştir (13). Çalışmamızda karaciğer dokusu total nitrit derşiminde APAP uygulanan gruplarda anlamlı artış gözlenirken, hepatik arjinaz aktivitesi ve/veya spesifik aktivitesi gruplar arasında anlamlı ir değişim göstermemiştir. Bu sonucun; olasılıkla nitrozatif ve oksidatif strese ikincil olarak, tip I hepatik arjinazın turnover hızının değişmesine veya tip II arjinaz sentezinde olası uyarılmaya ağlı olaileceği düşünülmektedir. Benzer içimde Chrzanowska ve ark. (5) yaptıkları çalışmada; siroz tanısı almış karaciğerde görülen ozulmuş amonyak inaktivasyonu ve artmış kollajen iyosentezinin hepatik arjinaz I ve II düzeylerindeki değişiklikle ilgili olaileceği düşünülmüştür. Normal karaciğer ile karşılaştırıldığında arjinaz I aktivitesi ve mrna derişiminde önemli ölçüde azalma, arjinaz II ekspresyonunda ise olasılıkla ornitin ve poliamin iyosentezindeki işlevi nedeni ile yükselme görülmüştür. Serest radikal olan NO hem sitotoksik hem de hücre koruyucu özellikleri olan ir reaktif moleküldür. Bazı araştırmalar endojen NO nun toksik olduğunu açıkça elirtirken, diğerleri ise koruyucu olduğunu göstermiştir. Koruyucu etkileri antioksidan mekanizmalar üzerinden sunulurken, NO aracılı toksisite hücre ölümüne yol açan reaktif nitrojen türlerinin oluşumuna dayandırılır. NO nun yarılanma ömrü yani iyolojik aktivitesi superoksit gii oksijen 9

10 kaynaklı serest radikaller tarafından elirlenir. Superoksit hızla NO ile tepkimeye girerek yüksek reaktif ir ara ürün olan peroksinitriti oluşturur. Bu tepkime superoksit dismutasyonundan 3-4 kat daha hızlıdır. Peroksinitrit yüksek derişimlerde sitotoksiktir; proteinlerde, yağlarda, ve DNA da oksidatif hasar meydana getireilir (30). APAP metaolizmasının ve kovalan ağlanmanın hepatotoksisite gelişiminde önemli asamaklar oldukları ilinmektedir. Fakat reaktif nitrojen ve oksijen türlerinin mekanizma açısından önemli olailecekleri de ileri sürülmüştür. APAP ile muamele edilmiş sentrilouler hücrelerde nitrotirozin ve APAP eklentilerinin iriktiği gösterilmiştir. APAP ın proteinlere ağlanması toksisitenin en iyi elirteci olduğu için tirozin kalıntılarının nitrasyonu da toksisite ile ağlantılı olailir. APAP kalıntıları NAPQI metaolitinin sistein ile reaksiyonu sonucu oluşurken nitrotirozin kalıntıları tirozin ile NO ve süperoksitten yapılan peroksinitritin reaksiyonu sonucu yapılır. inos knockout ve wildtype farelerde APAP hepatotoksisitesi araştırılmış, APAP ın inos knockout farelerde yaklaşık %50 oranında daha az toksik olduğu gösterilmiştir (21). APAP ın toksik dozlarının hepatositlerde inos un uyarılmasına yol açtığı ilinmektedir. Bu yüzden wild-type farelerde APAP, NO sentezinin üç kat artmasına ve hepatik proteinlerin nitrasyonunda yükselişe neden olmuştur. Bu çalışmada APAP uygulaması karaciğer dokusunda MDA düzeyinde kontrol gruuna göre anlamlı artışa neden olmuştur. Yapılan çalışmalarda toksik doz APAP uygulaması sonucu MDA değerlerinde kontrole göre % kat artış olaileceği gösterilmiştir (19). Mladenoviç ve ark. APAP uygulamasından (300 mg/kg) 6 saat sonra farelerin doku ve serum MDA derişimlerinde anlamlı ir artış olduğunu göstermişlerdir. APAP toksisite düzeylerinin deney hayvanı cins ve türüne göre değişeildiğini destekleyen yayınlar mevcuttur (20). GSH, ROS ve elektrofilik ksenoiyotiklere karşı hücre içi savunmasının ana kaynağını oluşturmaktadır. Ksenoiyotiklere yüksek derecede maruziyet hepatik GSH derişimini azaltmaktadır. Ksenoiyotikler ve metaolitlerinin GSH ile konjugasyonunu GSH-Stransferaz (GST) enzimi katalizlemekte olup, karaciğerin GST akımından zengin olduğu ilinmektedir. Oluşan toksik olmayan konjugatlar safrayla atılmakta ve parçalanıp NAC konjugatı şeklinde asetillenerek idrar yolu ile uzaklaştırılmaktadır (6). GSH, proteinlerin yapısındaki tiyol ve diğer nükleofilik grupların APAP ın toksik metaolitinden korunmasında esansiyeldir. Bu nedenle APAP kaynaklı karaciğer hasarının anahtar elirleyicisi hücre içi GSH düzeyidir (31). Bu çalışmada; APAP uygulaması, karaciğer GSH derişimini tüm gruplara göre anlamlı olarak azaltmıştır. Farklı doz ve sürelerle APAP uygulaması yapılan iki çalışmada da, enzer şekilde GSH derişiminde anlamlı ir azalma olduğu gösterilmiştir (1, 35). Meotti ve ark. APAP uygulamasından 4 saat sonra total hepatik GSH derişiminde anlamlı ir azalma gözlemlenirken, 24 saat sonunda ise anlamlı ir değişim olmadığını ildirmişlerdir. Başka ir çalışmanın sonucunda ise, APAP ın hepatik GSH ı anlamlı olarak azalttığı, una karşın 8 saat sonrasında GSH ın normal düzeylere geri döndüğü ildirilmiştir (20). Farelere 300 mg/kg APAP uygulanan ir çalışmada 6, 24 ve 48 saat sonunda sülfidril grup derişimine akılmıştır. Uygulama sonrası sülfidril gruplarında gözlenen azalmanın 6 saat sonra artmaya aşlayarak 24 saat sonunda pik yaptığı ve 48 saatin sonunda yeniden düşüşe geçtiği gösterilmiştir. GSH nun hepatositteki sülfidril gruplarının ana kaynağı olup, gözlenen artışın hepatositin adaptif yanıtı ile ilişkili olaileceği ve sonraki dönemdeki düşüşün ise ROS detoksifikasyonundan kaynaklanaileceği ildirilmiştir. 10

11 Çalışmamızda uygulanan APAP dozu u çalışmalara göre daha yüksek olup, 24 saat sonunda GSH derişiminin kontrol değerlerine göre anlamlı düşük olması da u ulguları desteklemektedir. Ayrıca çalışmamızda 24 saatin sonunda artan lipit peroksidasyonu ve total nitrit derişimi ile irlikte GSH ın önemli ölçüde azalması; olasılıkla APAP ile uyarılan inos aktivitesi artışı sonucunda gelişen nitrozatif stresin de oksidatif stres mekanizmasına eşlik ettiğini düşündürmektedir. Artan NO derişimi göz önüne alındığında, GSH daki tükenmenin olasılıkla peroksinitrit aracılı hasara ve/veya S-nitrozilasyona ağlı olaileceği düşünülmektedir. NAC ın APAP ın toksik etkisine karşı antidot olarak kullanım nedeni APAP ile uyarılan hepatotoksisitedeki Cys/GSH eksikliğidir. NAC proteinlerdeki disülfit ağlarını indirger, serest radikalleri askılar ve serest metal ağlayıcı özellik gösterir. NAC uygulaması hepatik GSH in de novo sentezi için gerekli olan Cys i sağlar. Bu özelliklerinden dolayı farmakolojik olarak temel kullanım yeri APAP toksisitesidir (2,3,4). NAC sisteine göre daha az toksik olduğu ve suda daha fazla çözündüğü için, NAC kullanımı parenteral Cys kullanımına göre daha yaygın olarak tercih edilir. in vitro çalışmalarda NAC ın oksidatif strese ağlı hücre hasarını ve apoptozise ağlı hücre ölümlerini azalttığı gösterilmiştir (22). Bu çalışmada da APAP uygulamasından 2 saat sonra gerçekleştirilen parenteral NAC kullanımının lipit peroksidasyonunu azalttığı, GSH derişimini kontrol değerlerine yükselttiği ve nitrit derişimini de azalttığı gösterilmiştir. SONUÇ Deneysel modelimizde asetaminofen; 1. Akut karaciğer hasarına neden olmuştur. Bu durum serum transaminaz düzeylerinin artışı ile desteklenmektedir. 2. Karaciğerde artmış lipit peroksidasyonu, azalmış GSH düzeyleri APAP ile uyarılan hepatotoksisitenin oksidatif stres aracılı geliştiğini göstermektedir. 3. Karaciğerde total nitrit artışının gözlenmesi APAP ve/veya türevlerinin NOS indüksiyonuna yol açtığını düşündürmektedir. Karaciğerde yüksek suletal APAP uygulamasına yanıt olarak artan NOS aktivitesi, nitrozatif stresin modelimizde gelişen hepatotoksisitede rol oynadığını düşündürmektedir. 4. Uygulamanın hepatik arjinaz aktivite ve/veya spesifik aktivitesinde değişikliğe yol açmaması u modelde arjinaz ve NOS aktivitelerinin ters düzenlenmesinin söz konusu olmadığını göstermektedir. 5. N-asetisistein uygulaması karaciğerde GSH düzeylerinin yeniden sağlanması, lipit peroksidasyonunun ve nitrozatif stresin askılanması yolu ile uygulanan dozda koruyucu işlev göstermiştir. 6. APAP aracılı hepatotoksisitede; arjinaz/no ilişkisine açıklık getirilmesi amacı ile karaciğer arjinaz izozimlerinin ve arjinin metaolitlerinin analiz edileceği ileriye dönük çalışmalara gereksinim ulunmaktadır. KAYNAKLAR 1. Ajith TA, Hema U, Aswathy MS. Zingier officinale Roscoe prevents acetaminopheninduced acute hepatotoxicity y enhancing hepatic antioxidant status. Food and Chemical Toxicology: 45 (11): , Bradford MM. QA rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-dye inding. Analytical Chemistry: 72 (1-2), ,

12 3. Bromer MQ, Black M. Acetaminophen hepatotoxicity. Clinics in Liver Disease: 7, , Buege, J.A. ve Aust, A.D. (1978). Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology, Chrzanowska A, Gajewska B, Barańczyk- Kuźma A. Arginase isoenzymes in human cirrhotic liver. Acta Biochimica Polonica; 2009; Vol:56 No:3, Durante W, Johnson FK, Johnson RA. Arginase: A Critical Regulator of Nitric Oxide Synthesis and Vascular Function. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007; 34(9): Ellmann, G.L. (1959). Tissue sulphydryl groups. Archieves of iochemistry and iophysics, 82, Fukuto JM. Nitric oxide: iochemistry, molecular iology, and therapeutic implications. First ed. San Diego: Academic Pres, Inc; p Geyer, J.W. ve Daich, D. (1971). Rapid method for determination of arginase activity in tissue homogenates. Analytical Biochemistry, 39, ; 23 Mayıs 2010; 16: ; 23 Mayıs 2010; 16: Hinson JA, Bucci TJ, Irwin LK, et al. Effect of inhiitors of nitric oxide synthase on acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Biology and Chemistry 2002; 6: Ikemoto, M., Tsunekawa, S., Toda, Y., Totani, M. (2001). Liver type arginase is a highly sensitive marker for hepatocellular damage in rats. Clinical Chemistry, 47 (5), Ito Y, Aril ER, Bethea NW et al. Role of nitric oxide in hepatic microvascular injury elicited y acetaminophen in mice 2004; 286, James LP, McCullough SS, Lamps LW et al. Effect of N-acetylcysteine on acetaminophen toxicity in mice: relationship to reactive nitrogen and cytokine formation; 2003; 75, Jenkinson, C.P., Grody, W.W., Cederaum, S.D. (1996). Comparative properties of arginases. Comparative Biochemistry and Physiology. 114 (1), Jos GM, Bessems and Nico PE, Vermeulen. Paracetamol (Acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and iochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology: 31 (1), , Karaay G, Aldemir D, Türkoğlu S, et al. The effect of melatonin treatment on oxidative and nitrosative stress in rats with thioacetamide-induced hepatic damage. Hepatology Research; 2005; 31, Lai JT, Fang HL, Hsieh WT, Cun W. Protective effects of a fermented sustance from saccharomyces cerevisice on liver injury in mice caused y acetaminophen. Bioxci. Biotechniol Biochem.: 72 (10), , Meotti FC, Rosa JM, Bracardo PS, Balz D, Waltrick AP, Bagio A, Golulart EC, Dafre AL, Rodrigues AL, Santos RS. Protective effect of crude extract from wedelia paludosa on the hepatotoxicity induced y paracetamol in mice. J.of Pharmacy and Pharmacology: 58, , Michael S.L., Mayeux P.R., Bucci T.J., et al. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in Mice Lacking Inducile Nitric Oxide Synthase Activity. NITRIC OXIDE: Biology and Chemistry; 2001; Vol:5 No:5, pp Moling O, Cairon E, Rimenti G, et al. Severe hepatotoxicity after therapeutic doses of acetaminophen. Clinical Therapeutics 2006; 28, Mori M. Regulation of Nitric Oxide Synthesis and Apoptosis y Arginase and Arginine Recycling. The Journal Of Nutrition 2007; 137: 1616S 1620S 24. Nikolic J, Stojanovic I, Pavlovic R, et al. The role of L-Arginine in toxic liver failure: interrelation of arginase, polyamine cataolic enzymes and nitric oxide synthase. Amino Acids 2007;32,

13 25. Que LG, George SE, Gotoh T et al. Effects of Arginase Isoforms on NO Production y nnos. Nitric Oxide 2002; 6, Sehapial PK, Lander HM. Stress response: methods and protocols. First ed. New Jersey: Humana Press Inc; p Sidney M, Morris Jr. Arginine: eyond protein 1-4. Am J Clin Nutr; 2006; 83(suppl): 508S- 12S. 28. Slattery J.T, Levy G. Acetaminophen kinetics in acutely poisoned patients. Clin. Pharmac. Therap. ; 25: , Stuehr DJ. Enzymes of the L-Arginine to Nitric Oxide Pathway. The Journal Of Nutrition 2004; 134:2748S 2751S 30. Sydow K, Münzel T. ADMA and oxidative stres. Atherosclerosis Supplements 2003; 4: Şener G, Omurtag G, Sehirli Ö, Tozan A, Yüksel M, Ercan F, Gedik N. Protective effects of ginkgo iloa against acetaminophen induced toxicity in mice. Molecular and Cellular Biochemistry: 283, 39-45, Thomas DD, Ridnour LA, Jeffrey SI et al. The Chemical Biology of Nitric Oxide. Implications in Cellular Signaling. Free Radic Biol Med. 2008; 45(1): Vaquero J, Belanger M, James L, Herrero R, Desjardins P, Cote J, Blei A, Butterworth R. Mild hypothermia attenuates liver injury and improves survival in mice with acetaminophen toxicity. Gastroenterology: 132, , Wink, D.A ve Mitchell, J.B. (1998). Chemical iology of nitric oxide: insights into regulatory, cytotoxic and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radica Biology and Medicine, 25 (4/5), Yapar K, Kart A, Karapehlivan M, Atakişi O, Tunca R, Erginsoy S, Citil M. Hepatoprotective effect of l-carnitine against acute acetaminophen toxicity in mice. Experimental and Toxicologic Pathology : 59 (2): ,