T.C. NİĞDE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 NİĞDE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ O. MURAT PAŞAOĞLU, 2011 T.C. NİĞDE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI L-NAME UYGULANAN SIÇAN DOKULARINDA BAZI BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ÜZERİNE PROPOLİSİN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI OĞUZ MURAT PAŞAOĞLU Temmuz 2011

2

3 T.C. NİĞDE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI L-NAME UYGULANAN SIÇAN DOKULARINDA BAZI BİYOKİMYASAL PARAMETRELER ÜZERİNE PROPOLİSİN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI OĞUZ MURAT PAŞAOĞLU Yüksek Lisans Tezi Danışman Doç. Dr. ZELİHA SELAMOĞLU TALAS Temmuz 2011

4

5 ÖZET L-NAME UYGULANAN SIÇAN DOKULARINDA BAZI BĠYOKĠMYASAL PARAMETRELER ÜZERĠNE PROPOLĠSĠN ETKĠLERĠNĠN ARAġTIRILMASI PAġAOĞLU, Oğuz Murat Niğde Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı DanıĢman : Doç. Dr. Zeliha SELAMOĞLU TALAS Temmuz 2011, 58 sayfa Bu çalıģmada, Wistar albino türü sıçanlara nitrik oksit (NO) inhibitörü olan L-NAME (N-nitro-L-arginin-metil ester) uygulanarak oluģturulan oksidatif stresin giderilmesinde, propolisin koruyucu rolünü tespit etmek amacıyla, böbrek ve kalp dokularında bazı biyokimyasal analizler yapılmıģtır. ÇalıĢmada deney hayvanları; kontrol, propolis, L-NAME ve L-NAME +propolis olmak üzere dört gruba ayrılmıģtır. Sıçan böbrek dokularında; L-NAME uygulama grubunda katalaz (CAT) aktivitesi ve malondialdehit (MDA) düzeyinde, kontrol grubuna göre anlamlı artıģlar belirlenirken, NO düzeyinde önemli azalma meydana geldi (P 0.001). L-NAME + propolis grubunda ise L-NAME grubu ile karģılaģtırıldığında CAT aktivitesi ve MDA miktarında anlamlı azalmalar meydana gelirken, NO düzeyinde önemli artıģ olduğu gözlendi (P 0.001). Propolis grubu CAT aktivitesi ve MDA seviyesinde kontrol grubuna göre anlamlı azalmalar saptanırken, NO düzeyinde önemli artıģ gözlendi (P 0.001). iii

6 Sıçan kalp dokularında; L-NAME uygulanan grupta CAT aktivitesi ve MDA miktarında, kontrol grubuna göre anlamlı artıģlar (P<0.01) gözlenirken, NO seviyesinde önemli azalma belirlendi (P=0.012). L-NAME + propolis grubunda ise L-NAME grubu ile karģılaģtırıldığında CAT aktivitesi ve MDA değerinde önemli azalmalar (P<0.01) saptanırken, NO düzeyinde anlamlı artıģ (P=0.012) olduğu tespit edildi. Propolis grubu CAT ve MDA değerlerinde kontrol grubuna göre anlamlı azalmalar (P<0.01) elde edilirken, NO miktarında önemli artıģ gözlendi (P=0.012). Elde edilen bu veriler sonucunda, NO inhibitörü olan L-NAME uygulanmıģ sıçanlarda meydana gelen oksidatif stresin propolis tarafından giderilebileceği biyokimyasal analizler ile ortaya konulmuģtur. Anahtar sözcükler: Böbrek, Kalp, Katalaz (CAT), L-NAME, Malondialdehit (MDA), Nitrik oksit (NO), Oksidatif stres, Propolis, Sıçan iv

7 SUMMARY STUDIES ON EFFECTS OF PROPOLIS ON SOME BIOCHEMICAL PARAMETERS IN TISSUES OF RATS L-NAME ADMINISTRATED. PASAOGLU, Oguz Murat Nigde University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Zeliha SELAMOGLU TALAS July 2011, 58 page In this study, some biochemical analyses have been conducted on kidney and hearth tissues to determine the protective role of propolis eliminating oxidative stress created by L-NAME (N-Nitro-L-arginine methyl estere) which inhibitor of nitric oxide (NO) to Wistar albino rats. In the study, the experiment animals divided into four groups; control, propolis, L- NAME, and L-NAME+propolis. In the rat kidney tissues; compared with the control group, significant increases were determined (P 0.001) on the activity of catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA) level in L-NAME group aso significant decrease in the level of NO was observed. On the other hand, in L-NAME + propolis group, as well as significant decreases were determined on CAT activity and MDA level compared with L-NAME group also significant increase in the level of NO was observed (P 0.001). Compared with the control group, significant decreases were determinedon the CAT activity and MDA level in propolis group and also significant increase was determined in the level of NO (P 0.001). v

8 In the rat heart tissues; compared with the conrol group, significant increases (P<0.01) were determined on the activity of CAT and MDA level in L-NAME group and also significant decrease in the level of NO was determined (P=0.012). On the other hand, in L-NAME + propolis group, as well as significant decreases were determined on CAT activity and MDA level (P<0.01) compared with L-NAME group also significant increase in the level of NO was observed (P=0.012). Compared with the control group, significant decreases were determined on the CAT activity and MDA level in propolis group (P<0.01) and also significant increase was determined in the level of no (P=0.012). As a result of these data, it has been determined with the biochemical analyses that propolis eliminates the effects of oxidative stres caused by the L-NAME which the inhibitor of NO. Keywords: Kidney, Heart, Catalase (CAT), L-NAME, MDA (Malondialdehyde), Nitric Oxide (NO), Oxidative stress, Propolis, Rat vi

9 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen, tezimin hazırlanmasında büyük emeği geçen saygıdeğer hocam Doç. Dr. Zeliha SELAMOĞLU TALAS a, deneysel çalıģmalar esnasında laboratuvar imkanlarını bize sunan Ġnönü Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyelerinden Prof. Dr. Ġsmet YILMAZ a, deney hayvanları temini ve deney hayvanlarına yapılan uygulamalar sırasında desteklerini gördüğüm Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakolji Anabilim Dalı öğretim üyelerinden Doç. Dr. Engin ġahna ya, biyokimyasal ve istatistiksel analizlerin yapılmasındaki yardımlarından dolayı Ġnönü Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyelerinden Yrd. Doç. Dr. Ġlknur ÖZDEMĠR e, yüksek lisans öğrencisi Oğuz ÇAKIR a ve Ġnönü Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı öğretim üyelerinden Yrd. Doç. Dr. Osman ÇĠFTÇĠ ye teģekkürlerimi bir borç bilirim. Ayrıca yüksek lisans eğitimim boyunca birlikte çalıģtığım yüksek lisans öğrencileri Hüsnü DOĞAN a, Hamide BALI ya, Seda Pınar DÜNDAR a ve AyĢe GÖĞEBAKAN a, doktora öğrencisi Mehmet Fuat GÜLHAN a, tezimin yazımı boyunca yardımlarını esirgemeyen Gaziantep Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı doktora öğrencisi Mustafa IġIK a ve Hacettepe Üniversitesi Biyomühendislik Anabilim Dalı doktora öğrencisi Ayfer ÇALIġ a manevi desteğinden dolayı Doç. Dr. Mustafa TALAS a sonsuz Ģükran ve saygılarımı sunarım. Ayrıca bugünlere gelmemde çok büyük emeği olan ve her türlü desteği sağlayan çok kıymetli aileme de teģekkürü bir borç bilirim. vii

10 İÇİNDEKİLER DİZİNİ ÖZET... iii SUMMARY... v TEġEKKÜR... vii ĠÇĠNDEKĠLER DĠZĠNĠ... viii ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ... x ġekġller DĠZĠNĠ... xi KISALTMALAR VE SĠMGELER... xii BÖLÜM I. GĠRĠġ... 1 BÖLÜM II. GENEL BĠLGĠLER Fizyolojik Stres ve Etkileri Hipertansiyon Nitrik Oksit (NO) Nitrik oksit sentaz (NOS) Nitrik oksitin etki mekanizması Nitrik oksit sentaz inhibitörleri ve L-NAME Nitrik oksit ve hipertansiyon Serbest Radikaller ve Reaktif Oksijen Türleri Süperoksit radikali Hidrojen peroksit Hidroksil radikali Nitrik oksit (NO) Oksidatif Stres ve Etkileri Antioksidan Savunma Sistemleri Endojen antioksidanlar Süperoksit dismütaz (SOD) Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) Mitokondiyal sitokrom oksidaz sistemi Glutatyon-S-transferaz (GST) Katalaz Ekzojen antioksidanlar Propolis Propolisin fiziksel özellikleri viii

11 2.6.2 Propolisin kimyasal yapısı ve bileģimi Propolisin biyolojik aktiviteleri ÇalıĢmalarda Kullanılan Dokular Böbrek dokusu ve böbreğin yapısı Böbrek dokusu ve kan basıncı Kalp dokusu ve kalbin yapısı Kalp dokusu ve kan basıncı BÖLÜM III. MATERYALVE METOD Propolis Ekstraktının Hazırlanması Deney Hayvanları Deney Grupları ve Uygulamalar Deneyde Kullanılan Kimyasal Maddeler Deneyde Kullanılan Cihazlar Doku Örneklerinin Alınması Doku Homojenatların Hazırlanması Toplam Protein Miktarının Ölçümü Katalaz (CAT) Aktivitesinin Ölçümü Malondialdehit (MDA) Düzeylerinin Ölçümü Nitrik Oksit Düzeylerinin Ölçümü Kadmiyum Granüllerinin AktifleĢtirilmesi Ġstatistiksel Analizler BÖLÜM IV. BULGULAR Böbrek Dokusu CAT Aktivitesi Böbrek Dokusu MDA Düzeyleri Böbrek Dokusu NO Düzeyleri Kalp Dokusu CAT Aktivitesi Kalp Dokusu MDA Düzeyleri Kalp Dokusu NO Düzeyleri BÖLÜM V. TARTIġMA KAYNAKLAR ix

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Nitrik oksit sentaz enzimleri arasındaki farklar... 7 Çizelge 3.8 Lowry ve ark. na göre protein miktarı ölçüm prosedürü Çizelge 3.9 Aebi ye göre CAT aktivitesi ölçüm prosedürü Çizelge 3.10 Yagi ye göre MDA düzeyleri ölçüm prosedürü Çizelge 4.1 Böbrek dokusunda CAT aktivite değerleri Çizelge 4.2 Böbrek dokusunda MDA düzeyleri Çizelge 4.3 Böbrek dokusunda NO düzeyleri Çizelge 4.4 Kalp dokusunda CAT aktivite değerleri Çizelge 4.5 Kalp dokusunda MDA düzeyleri Çizelge 4.6 Kalp dokusunda NO düzeyleri x

13 ŞEKİLLER DİZİNİ ġekil 2.3 Serbest radikaller ve reaktif oksijen oluģumu ġekil NO Sentezi ġekil 2.1 Glutatyonun okside ve redükte formları arasındaki dönüģümü ġekil 2.2 Böbreğin yapısı ġekil 2.3 Kalbin yapısı xi

14 KISALTMALAR VE SİMGELER KISALTMA/SĠMGE ADMA BH 4 cgmp CAT Cd EDRF EDHF enos ETS GSH-Px GSH GSSG GST HPA H 2 O 2 inos L-NAME LNMA L-NAA MDA NADPH NaOH NNDA - NO 3 - NO 2 NO NOS nnos ONOO. O 2. Asimetrik Dimetilarjinin Tetrahidrobiyopiterin Siklik Guanozin Monofosfat Katalaz Kadminyum Endotel kaynaklım gevģeme faktörü Endothelium-Derived Hyperpolarising Factor Endoteliyal Nitrik Oksit Sentaz Elektron taģıma sistemi Glutatyon Peroksidaz Redükte Glutatyon Okside Glutatyon Glutatyon-S-transferaz Hipotalamus-hipofiz-adrenal aks Katalaz Ġndüklenebilir Nitrik Oksit Sentaz N G -nitro-l-arjinin metil ester N-monometil-L-arjinindir N--amino-L-arjinin Malondialdehit Nikotinamid adenin denükleotit 3 - fosfat Sodyum hidroksit n-naphtylethylenediamine Nitrat Nitrit Nitrik Oksit Nitrik Oksit Sentaz Nöronal Nitrik Oksit Sentaz Peroksinitrit Süperoksit xii

15 ROT sgc SOD TBA TCA Reaktif oksijen türleri Siklik Guanilat Siklaz Süperoksit Dismutaz Tiobarbütirik asit Triklorasetik asit xiii

16 BÖLÜM I GİRİŞ Besinlerin oksijen kullanılarak enerjiye dönüşümü sırasında oluşan reaktif moleküller serbest radikaller olarak adlandırılır. Oksijen molekülü, canlıda enerji elde etmenin yanı sıra serbest radikallerin oluşumunda da son derece önemlidir. Oksijen molekülünden oluşan reaktifler canlıda lipid, protein ve DNA gibi önemli yapılara zarar vermektedirler [1]. Serbest radikaller eşlenmemiş elektron çifti bulunduran kararsız, kısa ömürlü ve düşük molekül ağırlığına sahip moleküllerdir. Çoğu olayda serbest radikal üretimi, patomekanizmanın bir parçası olup pek çok toksik madde de serbest radikal üretimi ile ilgilidir [2]. Oksijenli solunum yapan canlılarda, serbest radikal oluşumunu engellemek ve bu moleküllerin zararlarını azaltmak amacıyla antioksidan adı verilen savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bu mekanizmalar serbest radikal oluşumunu tam anlamıyla önleyemez ise bu durumda oksidatif stres olarak tanımlanan sonuç ortaya çıkmaktadır [1]. Oksidatif stres, vücudun antioksidan savunması ile lipid peroksidasyonunun sebebi olan serbest radikallerin oluşumu arasındaki fark olarak tanımlanabilir. Toksisitenin sebeplerinden biri olarak oksidatif stres, özellikle 1994 yılından itibaren toksikolojik çalışmaların odağı haline gelmiştir [2]. Serbest radikal oluşumunu ortadan kaldıran önemli bir molekül olan nitrik oksit (NO) belirli düzeylerde kuvvetli bir antioksidan olarak görev yapmaktadır [3]. Nitrik oksit memelilerde ilk kez 1916 yılında tespit edilmiş ve 1985 yılında da aktive olmuş makrofajların nitrik oksit saldığı belirlenmiştir. Daha sonraki çalışmalarda L- arjininin nitrik oksit sentezi için öncül madde olduğu ve nitrik oksit inhibisyonu için de L-arjinin analoglarının kullanılabileceği görülmüştür. Daha önceki yıllarda çevre kirleticisi olarak bilinen nitrik oksitin, özellikle son yıllarda yapılan çalışmalarda vücut 1

17 sistemlerinde meydana gelen biyolojik reaksiyonların büyük bir kısmıyla yakın ilişki içinde olduğu vurgulanmıştır. Moleküler oksijen varlığında L-arjininin L-sitrüline dönüştürülmesiyle nitrik oksit sentezlenir. Bu sentezden sorumlu enzim nitrik oksit sentaz (NOS) olarak bilinir [4]. Nitrik oksit sentezini katalizleyen nitrik oksit sentaz tanımlanıp L-arjininden nitrik oksit sentez yolu aydınlatılmaya çalışılmış, böylelikle L-arjinin analoglarının bu yolu inhibe ettiği tespit edilmiştir. Yapılan araştırmalar neticesinde tespit edilen L-arjinin analoglarından biri olan N-nitro-L-arjinin-metil ester (L-NAME) in hem yapısal hem de indüklenebilen nitrik oksit sentaz izoformlarını inhibe ettiği ortaya çıkmıştır [5]. Bu çalışmada, L-NAME tarafından NOS inhibisyonu ile oluşturulan hipertansiyon sonucu ortaya çıkan oksidatif stresin etkilerinin giderilebilmesinde doğal bir arı ürünü olan propolis kullanılmıştır. Propolisin antioksidan etkisinin yanı sıra antmikrobiyal, antiseptik, antibakteriyal, antiinflamatuar, antimutajenik, immünomodülatör ve sitotoksik etkilere de sahip olduğu bilinmektedir [6]. Bu bilgiler doğrultusunda, sıçan dokularında nitrik oksit sentaz (NOS) inhibitörü olan nitro-arjinine-methyl-ester (L-NAME) ile oluşturulan oksidatif stres sonucu meydana gelen olumsuzlukların giderilebilmesinde propolisin antioksidan özellikleri; katalaz (CAT) aktivite tayini, malondialdehit (MDA) ve NO düzeyleri belirlenerek tespit edilecektir. 2

18 BÖLÜM II GENEL BİLGİLER 2.1 Fizyolojik Stres ve Etkileri Stres, günlük yaşantımızda sıkça duyduğumuz ve farklı anlamları bulunan baskı veya gerginlik diyebileceğimiz bir sözcüktür. Stresin kelime anlamı günlük konuşmalarda kullanıldığı gibi endişe ve sıkıntı anlamına gelmez. Stres; insanın karşılaştığı yeni durumlar karşısında ruhsal, bedensel sınırlarının zorlanmasıdır. Bu yeni duruma adapte olabilmek için organizma belli tepkiler verir. Buna stres tepkisi denir. Endişe ve sıkıntı ise strese karşı mücadele edememe durumunda ortaya çıkan pisişik bir durumdur. Organizmada stres 1950 lere kadar fizyolojik ve fizyopatolojik değişiklikler meydana getiren uyaran olarak kabul edilmekteydi. Kanada lı fizyolog Selye ise 1952 de stresi uyaranlara karşı organizmanın verdiği cevap olarak nitelendirdi. Bireyde stresi meydana getiren etmenler ise Stresörler diye tanımlanmaktadır [7]. Stres genel olarak psikolojik stres ve fizyolojik stres olmak üzere ikiye ayrılabilir. Fizyolojik stres sadece HPA aksı (Hipotalamus-hipofiz-adrenal aks) üzerinden etki gösterirken, psikolojik stres varlığında bu aksa limbik sistem özellikle de hipokampus ve amigdala dahil olmaktadır [8]. Stres maruziyetinin artması; katekolaminler (adrenalin, noradrenalin) ve adrenal glukokortikoitlerin sempatoadrenal salınımını artırarak katabolizmayı artırmaktadır. Bunun sonucunda lipolizis olayı ve glukoz rezervlerinin mobilizasyonu artar. Bu olay, enerji substratlarının dağılımını ve kullanılabilirliğini arttırmada rol oynamaktadır [9] Hipertansiyon Yüksek arteriyel kan basıncı ile kendini gösteren bir hastalık olan hipertansiyon, olumsuz sonuçlara yol açması ve sık görülmesi sebebiyle ciddi bir hastalıktır. Hipertansiyonun yaklaşık olarak bir milyar insanı etkilediği düşünülmektedir [10]. 3

19 Hipertansiyon; ırk ve coğrafik bölgeye göre farklı sıklıklarda ortaya çıkmaktadır. ABD, Avrupa ve diğer birçok ülkede yetişkin insan populasyonunun yaklaşık olarak % 25 inde hipertansiyon görülmektedir [11]. Birincil (primer, idyopatik, esansiyel) ve ikincil (sekonder) olarak ikiye ayrılan hipertansiyon durumlarının yaklaşık % 95 i birincil hipertansiyon, % 5 lik bölümü ise ikincil hipertansiyondur. Hipertansiyon olgularının büyük bir kısmı da böbrek dokusu kaynaklıdır [11]. Uzun yıllar boyunca belirtisi ortaya çıkmayan hipertansiyonun ciddi komplikasyonları çok daha sonra kendini gösterebilmektedir [11, 12]. Hipertansiyona yol açan etmenleri aşağıdaki gibi sıralayabiliriz: Cinsiyet: Kadınlarda hamilelik ve menopoz dönemleri hariç erkeklerde görülme sıklığı kadınlara oranla daha yüksektir. Yaş: İlerleyen yaşlarda risk daha fazla olmakla beraber genellikle 35 yaş üstünde bu risk artmaktadır. Genetik yatkınlık: Ailesinde hipertansiyon gözlenen bireylerde risk oldukça yüksektir. Obezite: Obez kişilerde diğer bireylere oranla hipertansiyon riski daha yüksektir. Sigara: Nikotin damarlarda vasokonstrüksiyona yol açarak kan basıncını yükseltir ve daha sonraki dönemlerde kronik hipertansiyona yol açar. Beslenme: Kolesterolce zengin gıdalarla beslenmek hipertansiyon oluşumunu arttırmaktadır. Stres: Kan basıncında artışa sebep olur. Aşırı Tuz: Sodyum duyarlılığının vücut sıvılarında artması hipertansiyon ile sonuçlanır. Alkol: Fazla miktarda düzenli olarak alkol kullanımı kan basıncını arttırır. Oral kontraseptifler: Özellikle kadınlarda sigara içimi ile birlikte oral kontraseptifler kan basıncında artışa yol açabilmektedirler [13, 14, 15]. Hipertansiyonun engellenmesine yönelik çalışmalar özellikle son zamanlarda artmış ve bunun sonucunda ilaçla tedavi yöntemlerinin yanı sıra alternatif yeni yöntemler de araştırılmıştır. Bunlardan en önemlisi ise hipertansiyonu önlemede gaz kullanımıdır yıl öncesine kadar bir atmosfer atığı olarak kabul edilen nitrik oksit gazının 1987 yılında yapılan çalışmalar sonucunda, damar endotelinden endotel kaynaklı gevşeme faktörü (EDRF) olarak bilinen yapının izole edilmesi sırasında, nitrik oksit sentaz (NOS) keşfedilmiş ve bunu takip eden yıllarda yapılan çalışmalar EDRF nin nitrik oksit 4

20 olduğunu göstermiştir. Endotel kaynaklı gevşeme faktörünün NO olduğu hipotezi daha sonraki yıllarda yapılan çok sayıda çalışma ile de doğrulanmıştır. Özellikle L-arjinin analogları (L-NMA, L-NNA, L-NAME, L-CPA, L-NIO) ve diğer NOS inhibitörleri, enzimi değişik düzeylerde inhibe etmektedir. Yapılan inhibisyon denemelerinde, endotel kaynaklı NOS ın inhibe edilmesi ile vazokonstriksiyon ve bunun sonucunda hipertansiyon ortaya çıkmaktadır. Bu bilgiler göz önüne alındığında, bu inhibitörlerin insan ve hayvana uygulanması ile NO sentezi durdurularak veya azaltılarak, NO temelli bütün fonksiyonlar bloke edilebilmektedir. Bu şekilde insan ve hayvanlarda endotel kaynaklı vazodilatasyon mekanizması engellendiği için hipertansiyon oluşabilmektedir. NO, vazodilatör etkisi sonucu kan basıncını ve akışını düzenleyerek hipertansiyonun engellenmesinde önemli bir rol oynadığı için özellikle hipertansiyon tedavisinde son yıllarda sıkça kullanılmaya başlanmıştır [16]. 2.2 Nitrik Oksit (NO) Doğadaki varlığı çok eski yıllardan beri bilinenen NO, basit bir gaz formundadır. NO atmosfer tabakalarında bulunmasının yanı sıra zehirli bir gaz olarak taşıt egzozlarında, elektrik trafolarında ve asit yağmurlarında da ortaya çıkabilmektedir. NO in organizmalardaki rolü bundan yıl önce ortaya çıkarılmıştır. İlk olarak Furchgott ve Zawatzki, endotele bağımlı damar gevşemelerinden EDRF (Endothelium-Derived Relagsing Factor) nin sorumlu olduğunu göstermişlerdir. Daha sonraki çalışmalarada EDRF ün NO olduğu anlaşılmıştır. Fakat yapılan diğer çalışmalarda EDRF nin sadece NO den oluşmadığı, EDHF nin (endothelium-derived Hyperpolarising Factor) de, EDRF içinde yer aldığına dair bulgulara rastlanmıştır [16, 17]. Yakın geçmişe kadar hakkında yeterli bilgi bulunmayan, yalnızca damar duvarında bir bariyer olarak bilinen endotel, organizmanın en büyük organı özelliğini taşımaktadır. Vazomotor tonusun sağlanmasında, homeostazisde, vasküler hücre büyümesinde, inflamasyon cevaplarında önemli etkiler göstermektedir. Endotel fonksiyonlarının bozulması sonucu; immunolojik hastalıklar, ateroskleroz, diyabet ve hipertansiyon gibi önemli hasarlar oluşmaktadır. Uzun bir süre EDRF etkisini neyin oluşturduğu konusunda çalışmalar yapılmış ve NO ya da benzeri moleküller olduğu 1980 li yıllarda saptanmıştır [18, 19, 20]. 5

21 NO sentezlendikten sonra depolanmayıp difüze olarak etraf dokulara geçebilmektedir. Nitrik oksit; nöronlar, perivasküler sinirler ve serebrovasküler endotel tarafından sentezlendiği gibi, beyne giden inflamatuvar hücrelerce de sentezlenmektedir [21]. NO, canlılarda normal şartlarda salgılanıp damar tonusunu düzenleyebildiği gibi ekzojen ve endojen uyarılarla da salgılanabilmektedir. Asetilkolin, ADP, ATP, anjiotensin II, noradrenalin, araşidonik asit, substans P, histamin, bradikinin, serotonin, endotelin, trombin, vazopressin gibi bazı maddeler NO salgılanmasını uyaran etkenlerdendir. Yarı ömrü oldukça kısa olan NO in etkisi lokal olup kısa sürmekte ve derhal inaktif hale geçmektedir. NO in organizma üzerinde vazodilatör, venodilatör, (-) inotrop, hücre koruyucu, düz kas proliferasyonu engelleyici, nörotransmitter, nöromodülatör, immün modülatör, mikroorganizma ve tümör hücresi öldürücü gibi biçok önemli fonksiyonları bulunmaktadır [16, 17]. NO in canlıda oluşabilmesi için çeşitli zincir reaksiyonları meydana gelmektedir. Bu reksiyonların oluşması için enzimler görev yapmaktadır. Canlı organizmalarda NO sentezi, nitrik oksit sentaz (NOS) varlığında L-arjininin L-strüline dönüşümü ile gerçekleşmektedir [22] Nitrik oksit sentaz (NOS) Canlılarda NO, L-arjininin L-strüline dönüşümü ile oluşur ve bu reaksiyonu nitrik oksit sentaz (NOS) katalizlemektedir. NO sentezini katalizleyen NOS ın, nöronal NOS (nnos), indüklenebilir NOS (inos) ve endotelyal NOS (enos) olmak üzere üç izoformu bulunmaktadır. Bu enzimlerden nnos ve enos a beraber yapısal NOS da denilmektedir. Kalsiyuma bağımlı olan nnos ve enos canlılarda sürekli olarak belirli miktarlarda aktivite gösterirken, inos bazı sitokinlerin uyarısıyla NO üretmektedir [16, 17]. NOS enzimlerinin her üç formuda katalizledikleri substrat, içerdiği prostetik gruplar ve koenzimleri bakımından ortak özellik gösterirler. nnos ve enos ın aktiviteleri kalsiyum/kalmodulin (Ca 2+ /CaM) bağımlıdır. Kalmodulin inos izoformunun bir alt birimi olup enzimin aktivitesinde Ca 2+ un etkisi bulunmaz [22]. 6

22 Tablo 2.1 Nitrik oksit sentaz enzimleri arasındaki farklar Özellik Yapısal NOS İndüklenebilir NOS Bulundukları hücreler Endotel, nöron Makrofaj, kuffer hücresi, monosit, damar düz kası İndükleyen Fiziksel egzersiz LPS, INF-gama, IL-I, TNF α, okside LDL Salgılanma miktarı Az miktarda (pmol) Çok miktarda (nmol) Salgılanma süresi Kısa süreli salgılanır Uzun süreli salgılanır Aktivasyonu Kalsiyuma bağımlıdır Kalsiyumdan bağımsızdır Glukokortikoidlerin etkisi GK le ile inhibe olmaz GK ler ile inhibe olur Nitrik oksitin etki mekanizması Ekzojen ve endojen uyarılara maruz kalmadan fizyolojik şartlarda ortaya çıkan NO in sentezinden, genellikle enos ve nnos sorumludur. NO, bazı enzimlerle etkileşimde bulunabilmektedir. Örneğin, Fe-sülfür merkezleri içeren enzimlerle, hem grubu içeren miyoglobin, hemoglobin ve sgc (siklik guanilat siklaz) enziminin hem prostetik grubuyla etkileşebilir. NO in önemli etkileri sgc enziminin aktivitesiyle gerçekleşir [23, 24, 25]. NO, hedef hücresine difüzyonla ulaştıktan sonra sgc enziminin hem prostetik grubuna bağlanarak aktivite kazanabilmektedir [23, 24]. Aktive olan enzim sayesinde cgmp üretimi artar böylece hedef hücredeki işlevsel mekanizmalar harekete geçirilir ve NO aracılığıyla etki oluşturulur. cgmp düzeylerinin artışı, hücrelere göre değişkenlik göstermekle birlikte, sıklıkla hücre içi Ca konsantrasyonunun düşmesine ve cgmp bağımlı protein kinazların aktive olmasına yol açar [25]. Bu sayede cgmp, düz kasların gevşemesini sağlar bunun yanı sıra, trombosit tutunmasını ve kümeleşmesini, polimorf çekirdekli lökosit kemotaksisini durdurucu etki gösterir. cgmp'ın inaktivasyonu ise fosfodiesteraz aracılığıyla GMP'ye dönüştürülerek gerçekleşir [25]. Patolojik şartlarda NO sentezi inos tarafından gerçekleştirilir. Sentezlenen NO aynı olduğu halde NO in miktarı ve sentezlenme süresi farklıdır. Bu fark sentezlenen NO'in başka etkilerini de ortaya çıkarmaktadır. NO bu durumda solunum zincirinde ve nükleik asit sentezinde rol alan bir grup enzimi inhibe etmektedir. Bu inhibisyon NO'e maruz kalan hücrenin ölümüne sebep olmaktadır. Patolojik şartlarda NO in gerçekleştirmiş olduğu inhibisyonlar; hem demirine bağlanma (Oksido redüktazların, NADP ubikinonun, süksinat ubikinonun inhibisyonu), demir-sülfür merkezine bağlanma (cisakonitaz, ribonükleotid redüktaz inhibisyonu), ADP ribozilasyonunun inhibisyonu, 7

23 deaminasyon (nükleik asit sentezinin bozulması), radikallere bağlanma (süperoksit radikale bağlanıp peroksinitrit radikali oluşturma) şeklindedir [25]. inos aktivitesi sonucu oluşan fazla miktardaki NO, septik şoktaki hipotansiyondan sorumludur ve NO sentez inhibitörleri bu hipotansiyonu düzeltebilmektedirler. Bu sebeple NO üretiminin arttığı patolojilerde, NO yapımının azaltılması yaşamsal faaliyetler için büyük önem taşımaktadır. NO sentezinin önlenmesinde L-arjinin analogları (L-NAME, NARG, L-NMMA) substrat taklit edici maddeler olarak görev yaparlar ve böylelikle NO sentezini engellerler. NO azlığı söz konusu olan patolojilerde NO in endojen inhibitörü olan asimetrik dimetilarjinin (ADMA) in sorumlu tutulmasının yanı sıra, fazla miktarda NO sentezinin engellenmesinden de sorumlu tutulduğu bilinmektedir. Diğer yandan NO eksikliği olan patolojilerde (pulmoner hipertansiyon, yeni doğan veya yetişkin solunum distresi, kronik obstrüktif akciğer hastalıkları) NO'in mutlaka yerine konması gerekmektedir. NO in gaz olarak solutulması yeni doğan veya yetişkin solunum distresinde tedavi edici özellik göstermektedir. NO vericisi olarak kullanılan nitrovazodilatörler uzun zamandır koroner kalp hastalıklarının tedavisinde kullanılmaktadırlar. NO eksikliği olan durumlarda NO seviyesini arttırmada, NO'in substratı olan L-arijninin yararlı olabileceği bilinmektedir. Vücutta L-arjinin kaynakları yeterince bulunmaktadır, fakat sadece NO sentezi için kullanılmamakta başka enzimler için de substrat olabilmektedir (arginaz, arjinin-glisin transaminaz, kyotorphinesentetaz). L- arjinini substrat olarak kullanan dekarboksilaz, arjininden agmatin sentezler ve agmatin santral alfa-2 reseptörlerinin nonkatekolamin endojen ligandıdır. Bu mekanizma, L-arjininin hipotansif etkisinde önemlidir ve NO sentezine ilave olarak kan basıncının düzenlenmesinde de rol oynayabileceğini ortaya koymaktadır [16, 17, 23-25] Nitrik oksit sentaz inhibitörleri ve L-NAME NO sentezini katalizleyen enzim olan NOS ın tanımlanıp L-arjininden NO sentezini nasıl gerçekleştirdiği araştırılırken L-arjinin analoglarının bu reaksiyonları inhibe ettiği tespit edilmiştir. NOS inhibitörü olarak ilk gözlenen L-arjinin analoğu, yapısında metil grubu bulunduran N-monometil-L-arjinindir (L-NMMA veya diğer adıyla LNMA; N- metil-l-arjinin) [24, 26]. L-arjinin aminoasidinin yapısına çeşitli gruplar katılarak değişik L-arjinin analogları geliştirilmiş ve bunların da NO yapımı üzerine etkileri 8

24 araştırılmıştır. L-NMMA dışında N-nitro-L-arjinin (L-NA), N-amino-L-arjinin (L- NAA), N-nitro-L-arjinin-metil ester (L-NAME) ve N-iminoetil-l-ornitin (L-NIO) gibi L-arjinin analogları oluşturulmuştur. L-arjinin analoglarından olan L-NIO sadece enos ve nnos izoformlarına etki ederken, L-NNA, L-NA, L-NMMA ve L-NAME her üç izoforma da etki etmektedir. En güçlü inhibisyon etkisine L-NIO sahiptir ve bunu geri dönüşümsüz olarak gerçekleştirir. L-NMMA'nın etkisi geri dönüşümlüdür ve etki gücü olarak L-NIO'dan daha zayıf, L-NAME ve L-NA'dan ise daha güçlüdür [25, 27]. L- NMMA'in insan damarlarındaki etkisi kol arterine ve el sırtındaki venlere infüzyon yoluyla araştırılmıştır. Asetilkolin ve bradikininin bu damarlarda oluşturduğu gevşemenin L-NMMA ile önlendiği bildirilmiştir [24]. Benzer şekilde kobaylarda ve köpeklerde de L-NMMA'in vazokonstriktör ve kan basıncını arttırıcı etkileri tespit edilmiştir [27]. L-NMMA ve L-NAME'in ağız yoluyla verilmesi de sıçanlarda kan basıncında artışa yol açmıştır [24] Nitrik oksit ve hipertansiyon Nitrik oksit, sistemik kan basıncının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. NO in hipertansiyon üzerine nasıl bir etki yaptığı henüz tam olarak aydınlatılamamıştır [25, 26]. NO sentezinin uzun süre engellenmesi, sistemik kan basıncının yükselmesine ve renovasküler parankimal hasarın oluşmasına yol açmaktadır. Renovasküler sistem NO sentezi inhibisyonuna, sistemik dolaşımdan daha duyarlıdır. NO sentez inhibisyonu ile renal kan akımınının ve glomerül filtrasyon hızının azalması durumları, NO'in böbrek dolaşımı için ne denli önemli olduğunu göstermektedir. enos geni bloke edilmiş farelerde sistemik kan basıncının normalden daha yüksek çıktığı bulunmuştur. Bu durum genetik bozuklukların NO eksikliğine yol açabileceğini düşündürmektedir. İnsanlarda yapılan araştırmalarda ise enos geni ile hipertansiyon arasındaki ilişki tam olarak ortaya konamamıştır. Dolaşımda NO in azalmasıyla birlikte ADMA de düzeylerinde artış ortaya çıkmaktadır. Oksidatif stresle birlikte NO düzeylerinin azalması sonucu endotel fonksiyonlarında da bozulmalar meydana gelmektedir. Bu durumda, gelişen hipertansiyonun düzeltilebilmesinde, artan antioksidan düzeylerinin etkili olabileceği bildirilmektedir [28]. Endotel hücrelerinin damarlardaki önemi, onun çeşitli risk faktörlerine karşı ilk olarak maruz kalmasıyla ortaya çıkmaktadır. Esansiyel hipertansiyon gelişiminde gözlenen periferal, koroner ve renal vasküler sistemlerdeki endotel hücrelerinin işlevlerinde ortaya çıkan bozukluklar sonucunda, NO 9

25 salgılanmasının durdurulduğu veya azaltıldığı bildirilmektedir. Esansiyel hipertansiyonun gideriminde NO sentezinin arttırılması, son zamanlarda kullanılan etkili yöntemler arasında yer almaktadır [28]. Hipertansiyonun gelişimi esnasında veya sonucunda, lipid oksidasyonu gibi canlı organizmada birçok önemli hasara yol açabilen, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi de önemli ölçüde artmaktadır. ROS, aynı zamanda hipertansiyonda çok önemli etkilere sahip olan vasküler düz kas proliferasyonunu ve hipertrofiyi de arttırmaktadır. ROS, damarların şekillenmesi ve akut koroner sendromlarda etkili olan plak oluşumlarına yol açan matriks metalloproteinazların aktivitesini ve ekspresyonunu da arttırmaktadır. Süperoksit, NO ile birlikte tepkimeye girerek organizmada önemli hasarlara sebep olabilen güçlü oksidan peroksinitrit (ONOO. ) oluşumuna yol açarak NO in organizmadaki aktivitesinin kaybolmasına öncülük eder [28]. 2.3 Serbest Radikaller ve Reaktif Oksijen Türleri Dış orbitalinde ortaklanmamış elektron bulunduran atom veya moleküller serbest radikaller olarak adlandırılır. İnorganik ve organik moleküller olarak bulunurlar. Eğer elektron ortaklanmamış ise, molekül daha reaktif duruma geçer ve kararsızlaşır. Reaktif oksijen molekülleri, radikal ve radikal olmayan moleküller olmak üzere ikiye ayrılırlar. Radikal olanlar tek elektronunu başka bir moleküle verebilirken radikal olmayanlar elektron eksiği olmadığı halde başka moleküllerle, radikallere göre daha zayıf bir şekilde bağlanabilirler. Oksijen canlılarda toksisiteye sebep olan molekül değildir. Toksisiteyi, oksijenin eksik indirgenmesi ile oluşan oksijen radikalleri oluşturmaktadırlar [29, 30]. Normal şartlar altında biyolojik sistemlerdeki moleküler oksijenin çoğu, elektron taşıma sisteminde (ETS) bir dizi reaksiyon neticesinde ATP üretmek amacıyla suya indirgenir. Bu reaksiyon dizileri esnasında bir miktar moleküler oksijende tam olarak indirgenmeme meydana gelmektedir. Süperoksit anyon radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali gibi reaktif özellikteki ürünler oksijenin eksik redüksiyonu ile açığa çıkmaktadır. O 2 e bir elektronun ilavesi sonucu süperoksit anyon radikali (O. 2 ) oluşur. Bu radikal ise süperoksit dismutaz enzimi tarafından hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) e indirgenir. H 2 O 2 kolayca hücresel membranlarından geçebilen düşük toksisiteye sahip 10

26 bir moleküldür. O 2. ve H 2 O 2, demir ve bakır gibi geçiş metallerinin varlığında son derece reaktif özelliğe sahip hidroksil radikalinin oluşumuna sebep olurlar, bu reaksiyon Fenton Reaksiyonu olarak bilinir [29, 30]. Şekil 2.3 Serbest radikaller ve reaktif oksijen oluşumu Süperoksit radikali (O2 - ) Reaktivitesi diğer radikallere göre daha az olan ve oluşmalarına sebep olan diğer radikallerle organizmada oksitleyici olarak görev yapan O 2. oksijenin bir elektron alıp indirgenmesiyle meydana gelir. O 2 + e - O 2. Süperoksit radikalinin tehlikeli olmasının ve dokularda hasara yol açmasının en önemli sebebi Haber-Weiss olarak adlandırılan reaksiyon neticesinde hidroksil radikali (OH. ) ni meydana getirmesidir. O2 - + H 2O 2 1 O 2 + OH - + OH. Süperoksit radikali, ortam ph sinin düşük olduğu durumlarda bir proton alarak daha reaktif olan perhidroksil radikaline (HO. ) dönüşebilir. Ancak ortamın ph si fizyolojik sınırlarda iken oluşan perhidroksil formu % 1 in altındadır [16, 17, 30] Hidrojen peroksit Zarlardan kolayca geçebilme özelliğine sahip olan H 2 O 2, uzun ömürlü bir oksidandır. Canlı organizmalarda H 2 O 2 in asıl üretimi süperoksidin dismutazyonu ile gerçekleşmektedir. İki proton alan iki süperoksit molekülü, hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni meydana getirirler. 11

27 2O H + H 2 O 2 + O 2 Serbest radikal olmayan H 2 O 2, reaktif oksijen türleri içerisinde yer almakta ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynamaktadır. H 2 O 2 in bu kadar önemli olmasının sebebi, süperoksit ile reaksiyona girerek çok reaktif özelliğe sahip ve zararlı etkiler göstererek önemli hasarlara sebep olan hidroksil radikalini oluşturmak üzere yıkılmasıdır [16, 17, 30] Hidroksil radikali Hidroksil radikali (OH. ), hidrojen peroksidin geçiş metalleri varlığında indirgenmesiyle meydana gelir. Suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucu da hidroksil radikali oluşabilmektedir. Yarılanma ömrü çok kısadır ve oluştuğu yerde büyük hasara sebep olabilmektedir. H 2 O 2 + Fe +2 OH - + OH. + Fe +3 Demir iyonlarının katalizlemesiyle gerçekleşen bu reaksiyon fenton reaksiyonu olarak da bilinmektedir [16, 17, 30] Nitrik oksit (NO. ) Renksiz bir gaz formunda olup inorganik serbest radikal olan NO. tek sayıda elektron içerir. NO canlı organizmalarda NOS enziminin aktivitesi ile gerçekleştirilir. NO, NOS tarafından L-arjininin L-sitrüline dönüşümü esnasında üretilir. Şekil NO. sentezi 12

28 NO, beyinde nörotransmitter olarak etki gösteren çok önemli bir molekül olup bellek oluşumu, öğrenme, koklama, görme ve ağrı algılanmasında önemli roller üstlenmiştir. Canlılarda aşırı NO sentezi sonucunda nöronlarda hasar meydana gelir. NO kaynaklı toksisitede asıl sorumlu, O. 2 nin NO ile reaksiyonu sonucu oluşan peroksinitrit (ONOO - ) olduğu düşünülmektedir. Çok hızlı gerçekleşen bu reaksiyonda oluşan ONOO - in difüzyonu sınırlıdır. Fizyolojik ph de ONOO -, hızlı bir şekilde OH. ve nitrojen diokside (NO 2 ) parçalanır. Neticede hücrelerde önemli hasarlara sebep olur ve hatta hücre ölümlerine yol açabilir [31, 32]. NO in hem serebral kan akımını artırıcı vazodilatatör etkisi, hem de nöronal hasar yapıcı serbest radikal özelliği nedeniyle nöron hasarındaki yeri konusunda çelişkili görüşler bulunmaktadır [33]. NO in nöronal koruyucu olarak mı yoksa hasar verici olarak mı etki göstereceğinin, radikalin redoks durumu ile belirlenebildiği öne sürülmektedir. Yapılan bazı çalışmalarda NO - ONOO - yolunun apoptotik hücre ölümüne sebep olduğu ortaya konmuştur [34]. Radikaller, paylaşılmamış elektron içermeleri nedeniyle çok reaktif türlerdir. Buna rağmen paylaşılmamış elektronu bulunan NO. in, diğer radikal türlerine göre reaktivitesi son derece düşüktür. Bunun sebebi paylaşılmamış elektronun N ve O atomları üzerine lokalize olmaması, yani iki atom üzerine delokalize olmasından kaynaklanır [22]. 2.4 Oksidatif Stres ve Etkileri Reaktif oksijen türleri ve antioksidanlar arasında bulunan dengenin reaktif oksijen türleri yönünde bozulması sonucunda organizma için zararlı etkilerin ortaya çıkması olayı oksidatif stres olarak tanımlanır. Oksidatif stres antioksidan sistemin yetersiz kalması ya da reaktif oksijen türlerinin fazla miktarlarda üretilmesi sonucu açığa çıkar [35, 36]. 13

29 Canlılarda oksidatif stres ve antioksidan olayların birçok hastalığın patofizyolojisinde etki gösterdiği yapılan çalışmalarda tespit edilmiştir. Ancak çoğu hastalıkta serbest radikallarin, hastalığın tek başına sebebi mi yoksa hastalığın bir sonucu olarak mı oluştuğu henüz net değildir [37]. Serbest radikaller tarafından geliştirilen oksidatif stres; nükleik asitler, proteinler, lipidler ve karbonhidratlar gibi biyomoleküller üzerinde direkt ya da dolaylı olarak hasar meydana getirebilen çok sayıda etkilere sahiptir. Serbest radikaller DNA da direkt hasara yol açabilirken, bir kısım faktörler de DNA da tamir bozuklukları oluşturup dolaylı olarak hasara yol açmaktadırlar. Serbest radikaller, DNA yı etkileyerek hücrenin mutasyona uğramasına veya hücre ölümlerine sebep olmaktadırlar [38, 39]. Glutatyon, triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi doymamış bağ ve sülfür içeren aminoasitlerden oluşan proteinler de serbest radikallerden kolayca etkilenme özelliğine sahiptir. Reaktivasyonları için bu aminoasitlere bağımlı olan enzimler de serbest radikaller tarafından kolaylıkla inhibe edilebilirler [37, 38]. Proteinlerde serbest radikallerin etkisiyle çeşitli fragmantasyon ve çapraz bağlanmalar meydana gelebilir, sonuçta protein fonksiyonlarında bozulmalar ortaya çıkmaktadır [37, 38]. Sebest radikaller membran lipidlerini de geri dönüşümsüz olarak hasar uğratırlar. Reaktif oksijen türleri kolayca membran lipidlerinin yapısını bozarak doymamış aldehitlerin oluşmasını sağlarlar. Bu yapılar, serbest radikallere göre daha dayanıklı olup, hücrelerdeki biyomoleküllerin yapısını bozarak lipid peroksidasyonuna yol açarlar [40]. Serbest radikaller, hücre komponentleri ile etkileşime girebilmeleri için hücre membranını geçmek zorundadırlar. Bu sebeple hücre membranı serbest radikaller için kritik bir bariyer oluşturmaktadır. Lipid peroksidasyonu, lipid hidroperoksitlerinin aldehit ve diğer karbonil bileşiklerine dönüşmesiyle son bulur. Bu ürünlerden başlıcaları olan malondialdehit ve 4-hidroksinonenal; proteinlere ve DNA ya bağlanarak kalıcı değişiklikler oluşturmaktadırlar [38]. 14

30 2.5 Antioksidan Savunma Sistemleri Canlı organizmalarda serbest radikallerin yol açtığı olumsuz etkilerin giderilebilmesi için birçok savunma sistemi geliştirilmiştir. Bu sistemlere antioksidan savunma sistemi adı verilirken kullanılan moleküllere de antioksidanlar denilmektedir. Serbest radikallerin ortaya çıkardığı hasarların giderilmesinde ve oksidatif stresin engellenmesinde önemli etkileri bulunan antioksidanlar endojen ve ekzojen kaynaklı olabilirler. Endojen antioksidanlar, süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz gibi enzimatik antioksidanlar ile askorbik asit, ürik asit, sistein, transferrin, laktoferrin, glutatyon, α-tokoferol ve β-karoten gibi enzimatik olmayan antioksidanları içermektedir. Folik asit, NADPH oksidaz inhibitörleri ve sitokinler gibi bazı moleküller ise ekzojen antioksidanlar olarak bilinirler [41]. Antioksidan moleküller enzimatik olanlar ve olmayanlar şeklinde sınıflandırılabildiği gibi serbest radikal oluşumunu engelleyenler ve mevcut serbest radikalleri etkisiz hale getirenler olarakta sınıflandırılabilirler [42, 43]. Antioksidanlar canlılarda serbest radikallere ve bunların oluşturmuş olduğu hasarlara karşı süpürücü, onarıcı, bastırıcı ve zincir kırıcı etki gösterebilirler. Antioksidanlar süpürücü etkisini serbest oksijen radikallerini tutma veya daha zayıf bir moleküle dönüştürme şeklinde yerine getirirler. Bastırıcı etkisini ise serbest oksijen radikalleriyle tepkimeye girerek ve onlara bir hidrojen verip aktivitelerini azaltarak veya inaktif hale getirerek gerçekleştirirler. Zincir kırıcı etkilerini ise serbest oksijen radikallerini kendilerine bağlayarak, zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyerek gösterirler [43] Endojen antioksidanlar Süperoksit dismutaz (SOD) Canlılarda süperoksit radikalinin hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen enzim SOD dır. Gerçekleştirmiş olduğu bu tepkime sayesinde oksidatif hasar oluşturan süperoksit radikalinin kontrolü sağlanır [16]. 15

31 Yukarıda verilen reaksiyon kendiliğiden de gerçekleşebilir, fakat SOD reaksiyonun daha kısa bir sürede gerçekleşmesini sağlar. Enzimin birincil fonksiyonu, hücreleri süperoksit radikalinin zararlı etkilerinden korumaktır. Bu şekilde hücrelerdeki lipid peroksidasyonuda inhibe edilmiş olur [16, 17] Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) Glutatyon peroksidaz, H 2 O 2 in indirgenmesini katalizleyen bir enzimdir. Tetramerik yapılı olup 4 selenyum atomu içermektedir. Selenyum desteği enzim aktivitesini modüle etmektedir. Glutatyon peroksidazın aktivitesi heksoz monofosfat yolunda üretilen NADPH a bağımlıdır. Düşük konsantrasyonlardaki H 2 O 2, öncelikle GSH-Px tarafından temizlenir. Bu enzim, redükte glutatyonun okside glutatyona çevrildiği ortamda yüksek spesifite ile hidrojen peroksidin zararlı etkisini gidermektedir. Redükte glutatyonun (GSH) okside glutatyon (GSSG) haline dönüştüğü reaksiyonda, GSH-Px enzimiyle hidrojen peroksit suya indirgenmiş olur. Daha sonra glutatyon redüktaz enziminin katalizlediği reaksiyon ile NADPH harcanarak, okside glutatyon tekrar redükte hale dönüştürülür [16, 17]. Şekil 2.1 Glutatyonun okside ve redükte formları arasındaki dönüşümü [16, 17] Mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemi Ökaryotik organizmaların mitokondrilerinde bulunan solunum zincirinin son bileşeni sitokrom oksidazdır. Aerobik solunumda substratların oksidasyonu neticesinde meydana gelen elektronların, son alıcıları olup elektronları moleküler oksijene 16

32 taşımakla görevlidirler. Bu enzim; karbonmonoksit, siyanür ve hidrojen sülfür gibi moleküller tarafından inhibe edilir. Bu enzim sitokrom a 3 olarak da adlandırılmaktadır. Geçmiş yıllarda sitokrom a ve sitokrom a 3 olmak üzere iki ayrı molekül bilinmekteydi, fakat bunu takip eden çalışmaların neticesinde bu iki sitokromun aynı proteinle birleştiği ve sitokrom aa 3 olarak bilinen bir yapının ortaya çıktığı belirlenmiştir [44] Glutatyon-S-transferaz (GST) Glutatyon-S-transferazlar (GST), dimerik özelliğe sahip ve büyük oranda sitozolik bir enzim ailesidir. Bu ailede bulunan enzimlerin hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı fonksiyonlarının yanında, detoksifikasyon yapıcı özelliği de bulunmaktadır. GST lar mutajen veya karsinojen olabilen maddelerin detoksifikasyonunda rol oynarlar. Bu özelliklerinin belirlenmesiyle birlikte GST ların karsinojen, mutajen ve toksik özelliğe sahip kimyasal maddelerin detoksifikasyonunda önemli olduğu tespit edilmiştir. Bunun yanı sıra metabolize edilemeyen birçok bileşiği ve ksenobiyotikleri bağladıkları ve bu yapıları hücre içinde taşıma görevini de üstlendikleri belirlenmiştir [45] Katalaz (CAT) Glukoprotein yapısında bir hemoprotein olan CAT dört alt üniteden meydana gelmiştir. Beyindeki spesifik aktivitesi diğer birçok dokuya oranla daha azdır. Peroksizom partikülleri ve mitokondrilerde fazla miktarda bulunmakla birlikte daha az yoğunlukta sitoplazma ve endoplazmik retikulumda yer alır. Fazla miktarda H 2 O 2 bulunduğu durumlarda devreye girerek, bu molekülü suya çevirir [30, 46, 47]. CAT ın aktivitesi küçük moleküllere (hidrojen peroksid ve metil, etil hidroperoksitler) karşı olup büyük moleküllerin hidroperoksitlerine etki etmez. Bu enzimin peroksidaz aktivitesine ilave olarak hidrojen peroksidi elektron verici substrat olarak kullanma özelliği de vardır [30]. Eritrositler yüksek oranda CAT içerirler ve CAT aktivitesinin çok büyük bir kısmını eritrositler gösterir. Böbrek, kalp ve karaciğer gibi dokularda CAT enzim aktivitesi diğer dokulara oranla daha fazladır. CAT başlıca mitokondri, peroksizom, endoplazmik retikulum ve sitoplazmada aktivite göstermektedir. Ortamdaki H 2 O 2 miktarının düşük 17

33 olduğu durumlarda, H 2 O 2 i substrat olarak kullanan diğer antioksidan enzimler (GSH- Px) devreye girerek hidrojen peroksidi ortamdan uzaklaştırırlar. Aynı etkiye sahip olan CAT ve GSH-Px enzimlerinin hücre içi etki yerleri farklılık göstermektedir. CAT peroksizomlarda daha etkili iken, GSH-Px sitozol ve mitokondrilerde etkili olmaktadır [16, 17]. Enzim olmayan antioksidanların; lipid fazda bulunanlar (α-tokoferol, ß- karoten), sıvı fazda bulunanlar (askorbik asit, ürik asit, sistein, seruloplazmin, transferin, laktoferrin, miyoglobin, hemoglobin, ferritin, albumin, bilirubin, glutatyon) ve hem sıvı hem de lipid fazda bulunanlar (melatonin) olmak üzere üç farklı çeşidi bulunmaktadır [16, 17] Ekzojen antioksidanlar Başlıca ekzojen antioksidanlar; soya fasülyesi inhibitörleri, ksantin oksidaz (allopürinol, oksipürinol, folik asit, pterin aldehit) inhibitörleri ve NADPH oksidaz (adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, non-steroid antiinflamatuar ilaçlar) inhibitörleri olmak üzere üç sınıfta gruplandırılabilirler [6]. Antioksidan savunma sisteminde önemli bir yer tutan gruplardan biri de vitaminlerdir. Bunlardan en önemlileri; E vitamini (α-tokoferol), A vitamini (β-karoten), C vitamini (askorbat) gibi vitaminlerdir. Vitaminlerin yanında antioksidan savunma sisteminde kullanılan önemli diğer gruplar ise Cu, Zn, Fe, Mn, Se gibi eser elementler olup bu sistemin önemli birer parçasıdırlar [6]. Ekzojen antioksidanlar arasında yer alan önemli bir grup ise doğal olarak üretilen ve oldukça önemli etkiler gösterebilen doğal antioksidan ürünlerdir. Bunlar arasında bir arı ürünü olan propolis de antioksidan aktiviteleri ile koruyucu ajan olarak sıkça kullanılmaktadır. 2.6 Propolis Propolis; işçi arılar tarafından bitkilerin çiçeklerinden toplanan reçinemsi maddeleri ve bitki salgılarını enzimatik olarak biyokimyasal değişikliğe uğratmaları sonucu 18

34 oluşturulan ve oda sıcaklığında yarı katı halde bulunan, sarıdan koyu kahverengiye değişen renkte bir maddedir [48]. Arılar propolisi kovan içinde delik ve çatlakların kapatılmasında, peteklerin tamir edilmesinde ve birbirlerine yapıştırılmasında, kovan girişini daraltmak amacıyla ve savunmayı kolaylaştırmak gibi birçok amaca yönelik kullanmaktadırlar. Propolis dezenfektan özellikte bir madde olup petek gözlerinin dezenfeksiyonunu sağlar. Propolisin en önemli özelliğinden biri mikroorganizmalara karşı olan etkisidir. Kovan içinde dış ortamdan çok daha az oranda mikroorganizma bulunmasının sebebi ise propolisin varlığıdır. Kovan içinde görevli bazı arılar, kovan giriş deliğinde dışarıdan gelen işçi arıları propolisle temizleyerek kovanı çeşitli enfeksiyonlara karşı korumaktadırlar. Propolis; petek gözlerinin temizliğinde, ana arının bıraktığı yumurtanın steril bir ortamda gelişmesinde ve yavrunun enfeksiyonlara karşı korumasında etkili olmaktadır [49, 50, 51] Propolisin fiziksel özellikleri Reçineli ve yapışkan bir madde olan propolisin rengi kaynağına ve depolama süresine göre sarıdan koyu kahverengiye kadar değişebilmektedir. Sıcakta yumuşak ve yapışkan, soğukta sert ve kırılgan bir yapısı vardır. Ham propolisin içeriği genellikle % 30 mum, % 50 reçine, % 10 esansiyel ve aromatik yağlar, % 5 polen ve % 5 diğer organik maddelerden oluşmaktadır [52]. Propolis suda ve hidrokarbonlarda çok az miktarda çözünür. Genellikle alkolde çözünen propolis, eter ya da kloroformda ise tamamen çözünür [53] Propolisin kimyasal yapısı ve bileşimi Propolis örneklerinde bitkisel kaynağa bağlı olarak 160 dan fazla bileşik veya kimyasal yapı saptanmıştır. Bunlardan bazıları flavonlar ve flavonoidler, terpenler ve terpenoidler, aromatik asit ve esterleri, alifatik asit ve esterleri, aminoasitler ve alkoller dir [54]. 19

35 2.6.3 Propolisin biyolojik aktiviteleri İnsan sağlığı ve savunma sistemi açısından oldukça önemli etkilere sahip olan propolis, insanlar tarafından enfeksiyonların tedavisinde çok eski çağlardan günümüze kadar kullanılagelmiştir. Propolisin eski çağlarda savaşlarda yara ve dokuların iyileştirilmesinde merhem olarak kullanıldığı bilinmektedir. Arılar tarafından doğal yollarla üretien propolis son yıllarda tıp alınında oldukça fazla kullanılmaktadır. Propolisin biyolojik etki olarak antibakterial, antiviral, antiseptik, antioksidan, antifungal ve antibiyotik özellik taşıması, yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. Propolisin yapısında bulunan flavonoidler ve terpenler, kuvvetli antioksidan bileşiklerdir. Flavanoidlerin çok sayıda bakteri üzerine etkisinin olduğu bilinmektedir. Bunun yanı sıra flavonoidlerin kalp damar sistemi üzerine olumlu etkileri olduğu, kan dolaşımını düzenlediği, kılcal damar çatlamalarını azalttığı, mide mukozasını ülsere karşı koruduğu, mide yaralarını küçülttüğü ve iç salgı sistemini düzenlediği belirlenmiştir [53, 54]. Propolisin içeriğinde bulunan yapılardan biri de sinamik asit ve türevleridir. Sinamik asit ve türevlerinin pıhtılaşmayı hızlandırdığı, gram (+) ve gram (-) bakterilere karşı antibiyotik etki gösterdiği saptanmıştır. Propolisin içeriğinde bulunan bioflavonoidlerin, virüslerin enzim salgılamalarını ve üremelerini engelleyici özelliklerinin olduğu yapılan çalışmalar ile tespit edilmiştir. Hipertansiyon, damar sertliği ve koroner kalp hastalıklarının tedavisinde 30 gün süre ile üç kez alınan 300 mg propolis dozlarının olumlu etkiler verdiği yapılan klinik çalışmalarla da kanıtlanmıştır [53, 54]. 2.7 Çalışmalarda Kullanılan Dokular Böbrek dokusu ve böbreğin yapısı Canlılığın normal sonucu olarak vücuttaki her hücre, metabolizma sonucu bir takım artık maddeler üretir. Bu artıklar ürünler; fazla su, tuzlar, karbondioksit, üre gibi maddelerdir. Vücut için zararlı olan bu maddelerin organizmadan atılması olayına boşaltım denmektedir. Canlıda boşaltımla görevli olan bütün organların veya yapıların oluşturduğu sisteme boşaltım sistemi denir. Boşaltım sisteminin en önemli görevi metabolizma sonucu meydana gelen artık maddeleri vücuttan uzaklaştırarak hücrelerin 20

36 yaşaması için uygun ve dengeli bir iç ortamın yani homeostasisin devamını sağlamaktır [55]. Boşaltım sisteminin en önemli elemanlarından birisi böbreklerdir. Görünüm olarak fasulyeye benzer ve vücutta çift olarak bulunur. Karnın arka ve yan tarafında yerleşmiştir [56]. Böbreğin dış tarafı bir zarla örtülmüştür, bu zara capsula renalis adı verilir. Böbrekte bir dış bölge (cortex renalis) bir de iç bölge (medulla renalis) bulunur. Börek dokusu piramitlerden meydana gelmiştir. Bu piramitlerin sivri olan uç kısımları hilus renalis adı verilen böbrek boşluğuna doğrudur [57]. Canlı vücudunda homeostasis çok önemlidir. İç ortamın kimyasal yapısının sabitlenmesinde ve kanın ph sinin ayarlanmasında böbreklerin önemli rolü vardır. İç ortamın böbrekler tarafından dengesinin ayarlanması üç önemli olayla gerçekleştirilir. Bunlar; filtrasyon, resorpsiyon ve sekresyondur. Kan plazma suyunun bir kısmının içinde erimiş maddelerle birlikte süzülmesi olayına filtrasyon adı verilir. Filtrasyon ile kandan ayrılıp homeostasis için gerekli olan maddelerin tekrar kana verilmesine resorpsiyon, vücut için faydası olmayan veya toksik özellik gösteren yabancı maddelerin kandan tubul sıvısına verilmesine de sekresyon denilmektedir [58]. Böbreğin işlevini sağlayan ana bölümü böbreğin boşaltım birimi olan nefronlardır. Her nefron bağımsız süzme ünitesine sahiptir. Nefron: Malpigi cisimciği (glomerulus + bowman kapsülü) + henle kanalı (U kanalı) + boşaltım kanalı (kıvrımlı boru) ndan oluşmuştur. Her bir nefron kendi kılcal kan damarlarına sahiptir. Buna ek olarak her nefron kendi idrar toplama kanalına sahiptir. Malpighi cisimciğinin bir bölümünü oluşturan glomerulus, kılcal kan damarı yumağıdır. Diğer bölümünü oluşturan bowman kapsülü ise boşaltım kanalının yarımay şeklindeki kapalı ucudur. Boşaltım kanalı, böbreğin medulla bölgesine inerek henle kanalını (U borusu) meydana getirir. Tekrar kabuk bölgesinde çok kıvrımlı bir hal alır ve sonra idrar toplama kanalına bağlanır. Nefronların en önemli kısımları böbreğin cortex renalis bölgesinde yer alır [59]. Böbrekler kılcal damarlar bakımında oldukça zengindirler ve vücut ağırlığının % 0,5 lik bir bölümünü meydana getirmiş olsalar da kardiyak debinin % 25 ini alırlar ve bu oran daha da artabilir. Böbreğin en dıştaki cortex renalis bölgesi en çok damara sahip olan bölge olup, böbreğe gelen kanın % 90 ı bu kısımda toplanır. Böbreğe gelen atardamar 21

37 ön ve arka olmak üzere iki kola ayrılır. Bu kollardan loplar arası damarlar ayrılıp loplar arasında ilerleyerek yayımsı damarlara ayrılır. Bu damarlar da cortex renalis ve medulla renalis arasında yayılarak lopçuklar arası damarlara ayrılırlar. Lopçuklar arası damarlardan getirici damarlar ayrılıp glomerulus (yumakçık) yapısına girer. Bu damarlar glomerulus içerisinde daha da küçük dallara ayrılıp arasında değişen kılcal damar kıvrımlarına dönüşürler. Bu kılcal damarlar glomerulus içindeki tampon bölge (mezenşim) ile çevrelenmiştir. Kılcal damarlar birleşerek glomerulustan götürücü damarlar olarak ayrılırlar. Genel olarak kabuk bölgesinin yüzeyine yakın olan nefronlardan ayrılan götürücü damarlar borucukları çevreleyerek pretubular damar ağını meydana getirirler. Diğer yandan kabuk bölgesinin daha derinlerinde yer alan yumakçıklardan ayrılan damarlar vasa recta (dik damar) denen, öz bölgesinin derinliklerine inen damarları oluştururlar. Bu damarlar öz bölgenin derinliklerine indikten sonra toplardamar olarak yukarı çıkarlar [55]. Şekil 2.2 Böbreğin yapısı [55] Böbrek dokusu ve kan basıncı Yüksek kan basıncının sebeplerinin en başında böbrek hastalıkları gelmektedir. Bu hastalıklar, böbreği ilgilendiren nefrit, kist, tümör, taş vb. olabileceği gibi, damarlardaki bir daralma veya böbrek üstü bezi hastalıkları ile de ilgili olabilir. Hipertansiyonun en 22

38 önemli hedef organlarından birisi böbreklerdir. Bilindiği gibi, böbrek hastalarında koroner kalp hastalığı ihtimali normale göre yüksektir. Kontrolsüz hipertansiyon bu ihtimali daha da arttırır. Yapılan çalışmalar, yüksek kan basıncının kontrolü ile böbrek hastalarında kalp komplikasyonlarının azaldığını göstermiştir [58]. Kronik böbrek hastalığında hipertansiyon ve kan yağ oranlarındaki anormallikler, damar sertliğine bağlı kalp hastalıklarının en önemli sebeplerindendir [58] Kalp dokusu ve kalbin yapısı Gelişmiş ve büyük yapılı organizmalar vücutlarındaki bütün hücrelere oksijen, yiyecek ve diğer maddeleri sağlamak için dolaşım sistemine ihtiyaç duyarlar. Canlılarda dolaşım sisteminin en önemli organı kalptir. Kalbin fonksiyonu vücuda kan pompalamaktır. Kardiyak kaslar adı verilen özel bir kas tipinden meydana gelmektedir. Bu kaslar, canlı yaşamını sürdürdüğü sürece düzenli bir şekilde kasılıp gevşeme hareketini sürdürürler. Memelilerde kalp dört bölüme ayrılmıştır. Üstte bulunan iki bölmeye atrium (kulakçık) alttaki iki bölmeye de ventrikül (karıncık) adı verilmektedir. Sol odacıklar sağ odacıklardan septum (bölme) ile tamamen ayrılmıştır. Üstte bulunan her iki kulakçık kan alır. Sol kulakçık pulmoner toplardamarlardan gelen kanı, sağ kulakçık ise ana toplardamarlar (vena cava) dan gelen kanı alır [60]. Kan, kulakçıklardan karıncıklara gider ve karıncıklar da kanı kalbin dışına pompalar. Sol karıncıktaki kan, vücudun her tarafına kanı taşıyan aort atardamarına, sağ karıncıktaki kan ise akciğerlere giden pulmoner atardamarına pompalanır [61]. Karıncıkların fonksiyonu kulakçıklarınkinden farklıdır. Kulakçıklar kanı genel olarak akciğerlerden ya da vücudun diğer kısımlarından alır ve karıncıklara gönderir. Karıncıklar ise kanı kalp dışına ve bütün vücuda pompalar. Bu sebeple de karıncıkların kulakçıklara nazaran daha kalın ve daha kaslı duvarları bulunur [62]. Kalbin yapısı incelendiğinde dış kısmının kan damarlarıyla çevrili olduğu gözlenir. Bu damarlara koroner atardamarlar denilmektedir. Bu damarlar kalbin sürekli olarak düzenli bir şekilde çalışmasını sağlayan kaslara kan sağlar. Eğer bu koroner atardamalarda bir tıkanma meydana gelirse kalp kasılamaz ve bu sebeple kalp atışı durur, buna kalp krizi veya kardiak tutulma adı verilmektedir [59]. 23

39 Şekil 2.3 Kalbi yapısı 1. Sağ atrium (Atrium dextra), 2. Sol atrium (Atrium sinistrum), 3. Superior vena kava (Vena cava superior), 4. Aort, 5. Pulmoner arter, 6. Pulmoner ven, 7. Mitral kapak, 8. Aort kapağı, 9. Sol ventrikül, 10. Sağ ventrikül, 11. Inferior vena kava (Vena cava inferior), 12. Triküspit kapak, 13. Pulmoner kapak [55] Kalp dokusu ve kan basıncı Tıp literatüründe arter basıncının normal değerlerin üstüne çıkması durumuna arteriyel hipertansiyon denilmektedir. Arter basıncının ölçümüyle iki değer elde edilir. Bunlardan biri kalbin kan pompaladığı kasılma esnasında ölçülen basınçtır. Sistolik veya maksimal basınç adı verilir (büyük tansiyon). Diğeri ise kalbin gevşemesi sırasında damarlardaki basınç olup diastolik ya da minimal basınçtır (küçük tansiyon). Normal şartlarda yetişkin bir insanın arter basıncı 100/70 mmhg ile 140/90 mmhg arasındadır. Sistolik basıncın 140 mmhg, diastolik basıncın da 90 mmhg nın üzerine çıkması hipertansiyon olarak değerlendirilir. Aort atardamarlarında oluşabilecek daralmalar (aort koarktasyonu), aort yetersizliği, tam kalp blokları ve arteryovenöz fistüller gibi oluşumlar hipertansiyona sebep olan en önemli etkenler arasında yer almaktadır [ 63]. 24