ORTEOARTRÝTDE NÝTRÝK OKSÝT VE MALONDÝALDEHÝD DÜZEYLERÝ

Transkript

1 KLÝNÝK ARAÞTIRMA / CLINICAL RESEARCH Vol. 15,, No. 1,, ( ), 2004 ORTEOARTRÝTDE NÝTRÝK OKSÝT VE MALONDÝALDEHÝD DÜZEYLERÝ Erhan YILMAZ*, Seval YILMAZ**, Lokman KARAKURT**, Erhan SERÝN*** ÖZET Giriþ: in fizyopatolojisi tam olarak aydýnlatýlmamýþ olmakla birlikte, kýkýrdak hasarý ve enflamasyonun oluþumunda rolü olduðu bildirilen nitrik oksit ve oksijen radikallerinin sinovyal sývý düzeylerini ölçmeyi amaçladýk. Hastalar ve Yöntem: Sinoviyal sývý örnekleri normal ve osteoartritli bireylerin dizlerinden iðne aspirasyonu ile elde edildi. li 15 olgunun yaþ ortalamasý 57 idi ve örnekler diz protezi cerrahisi sýrasýnda alýndý. Yaþ ortalamasý 26 olan kontrol grubuna ait örnekler ise, herhangi bir eklem içi lezyon saptanmayan, tanýsal artroskopi uygulanmýþ 15 olgudan elde edildi. Sinovyal sývý örneklerinde; nitrik oksit düzeyi Griess reaksiyonu ile, malondialdehid düzeyleri de Satoh yöntemiyle spektrofotometrik olarak ölçüldü. Bulgular: li olgularýn sinoviyal sývýlarýndaki nitrik oksit ve malondialdehid düzeyleri, kontrol grubuna oranla belirgin derecede yüksek olarak ölçüldü (p<0.01 ve p<0.001). Tartýþma: Enflamatuvar sitokinlerin uyarýsý ile sinovyal doku ve kýkýrdakta oluþan metabolik olaylar sonucunda, nitrik oksit ve reaktif oksijen radikalleri açýða çýkmaktadýr. Kýkýrdak hasarýnýn baþlamasýnda rol oynayan bu radikallerin baskýlanmasý ile osteoartritin tedavisinde yeni aþamalar kaydedilecektir. Anahtar Kelimeler:, Sinoviyal sývý, Nitrik oksit, Lipid peroksidasyon, Malondialdehid. SUMMARY NITRIC OXIDE AND MALONDIALDEHYDE LEVELS IN OSTEOARTHRITIS Introduction: Nitric oxide and oxygen radicals has been considered as an important mediator in inflammatory phases and in loss of cartilage. The objective of this study was to evaluate the nitric oxide and oxygen radical levels in the synovial fluid of osteoarthritic knee. Patients and Method: Synovial fluid was collected during the knee arthroplasty of 15 cases with osteoarthritis (group I) and during the diagnostic knee arthroscopy of 15 cases (group II) without osteoarthritis. Mean age was 57 years in group I and 26 years in group II. Synovial fluid level of nitric oxide was measured spectrophotometrically utilizing the Griess reaction and synovial fluid level of malondialdehyde level was measured spectrophotometrically utilizing the Satoh method. The synovial fluid levels of nitric oxide and malondialdehyde of groups were compared. Results: Synovial fluid levels of nitric oxide and malondialdehyde in group I were found higher than group II, and this difference was statistically significant (p<0.01 for nitric oxide, p<0.001 for malondialdehyde). Discussion: Cytokines induce nitric oxide and reactive oxygen radicals synthesis by stimulating the synovial and chondral tissue metabolism. By inhibition of these radicals synthesis, chondral tissue damage and osteoarthritis may be prevented. Key Words: Osteoarthritis, Synovial fluid level, Nitric oxide, Lipid peroxidation, Malondialdehyde. GÝRÝÞ ; genetik, mekanik ve biyokimyasal etkenlerin etkisi ile ileri yaþlarda oldukça sýk görülen bir eklem hastalýðýdýr 1,2. Ýnsan eklem kýkýrdaðýnda yaþlanma ile birlikte kondrosit sayýsýnda azalma ve matriks komponentlerinin yýkýmýnda artmayý içeren bir dizi deðiþiklikler oluþur 3. Kýkýrdaðýn yaþ ile iliþkili olarak oluþan dejenerasyonu osteoartritin geliþiminde majör risk etkenidir, fakat yaþlanmanýn osteoartrit etiyolojisindeki mekanizmasý henüz açýklýða kavuþmamýþtýr 3,4. * * Doç. Dr., Fýrat Üniversitesi Týp Fakülesi Ortopedi ve Travmatoloji Anabilim Dalý, Elazýð. *** Yrd. Doç. Fýrat Üniversitesi Týp Fakülesi Ortopedi ve Travmatoloji Anabilim Dalý, Elazýð. *** Yrd. Doç. Fýrat Üniversitesi Veteriner Fakülesi Biyokimya Anabilim Dalý, Elazýð.

2 8 ARTROPLASTÝ ARTROSKOPÝK CERRAHÝ / JOURNAL OF ARTHROPLASTY & ARTHROSCOPIC SURGERY de eklem içindeki enflamatuar etkenlerin biyokimyasal uyarýsý ile sinovyal doku, kýkýrdak ve subkondral kemikte yapýsal ve iþlevsel deðiþikliklerin baþlamasýna yol açan bir dizi olaylar zinciri geliþmektedir 1,2,5. Kondrositlerle beraber sinovyal fibroblastlar ve sinovyal membrandaki makrofaj benzeri hücreler aktiflenir. Bunun sonucunda matriks metallo proteinazlar (MMP), prostoglandin- E 2 (PG E 2) ve nitrik oksit (NO) gibi katabolik etkenler açýða çýkar. Açýða çýkan NO ve PG E 2 ; matriks sentezinde azalma ve yýkýmýnda artma, kondrosit hücre ölümü ve hastalýkla iliþkili diðer yapýsal deðiþikliklere neden olurlar 1,2,5-9. NO; moleküler oksijen, süperoksit anyonu (O 2. ), sülfhidril ve tiol gruplarý ile hemoglobin demirine yüksek affinite gösteren iki atomlu serbest bir radikaldir 4,10,11. Ýnflamatuar olaylarda indüklenebilir nitrik oksit sentaz (inos) olarak adlandýrýlan bir enzim tarafýndan sentezlenir. Bu enzim hem eklem içi hem de eklem dýþý pek çok hücre grubu tarafýndan sentezlenebilmektedir. inos un eklem içi kaynaklarý; sinovyal fibroblastlar, sinoviositler, sinovyal doku monosit/makrofajlarý, endotelyal hücreler, kondrositler ve osteoblastlardýr 7,8,10, Konsantrasyonuna ve hücresel kaynaðýna baðlý olarak NO hem proinflamatuar hem de antienflamatuar özellik gösterir 4,8,10,13,15. NO oksijen varlýðýnda nitrit ve nitrata, diðer reaktif oksijen radikallerinin varlýðýnda ise önce peroksinitrite (ONOO ) sonra da hidroksil radikallerine (OH ve H 2 O 2 ) dönüþür 16,17. Peroksinitrit, kondrositlerdeki lipid peroksidasyonunu baþlatan sitotoksik bir radikaldir. Radikallerin membran lipidlerine etkisi sonucunda ise malondialdehid (MDA) adý verilen bir ürün ortaya çýkmaktadýr 18. Peroksinitrit ve reaktif oksijen radikalleri ile hücre dýþý matriks yýkýmý aktiflenmekte ve kýkýrdak dejenerasyonuna yol açan oksidatif hasar ortaya çýkmaktadýr 19. Çalýþmamýzda; genellikle ileri yaþlarda ortaya çýkan osteoartritde eklem içindeki enflamasyonla iliþkili olarak geliþen biyokimyasal reaksiyonlarýn göstergeleri olan nitrit ve MDA nýn sinovyal sývý düzeylerini belirlemek ve bu düzeylerin eklem hastalýðý öyküsü olmayan saðlýklý, genç bireylerin sonuçlarý ile karþýlaþtýrýlmasý amaçlandý. HASTALAR VE YÖNTEM Sinovyal sývý örnekleri osteoartrit nedeniyle diz protezi yapýlan ve yaþ ortalamasý 57 (52-64) olan 15 olgu ile artroskopi yapýlan ve yaþ ortalamasý 26 (21-33) olan 15 normal diz olgusundan elde edildi. Ortalama hastalýk süresi 4 (3-5) yýl olan osteoartritli olgularýn tanýsýnda klinik ve radyolojik taný araçlarý kullanýldý. grubunu oluþturan hastalar ise; travma geçirmemiþ, menisküs lezyonu þüphesi ile tanýsal artroskopi yapýlan ve menisküs lezyonu ile birlikte herhangi bir kondral ve sinovyal patolojisi olmayan hastalardan oluþuyordu. li olgular ile artroskopi yapýlan olgularda, cerrahiye baþlamadan önce iðne aspirasyonu ile sinoviyal sývý örnekleri alýndý. Sinovyal sývý örnekleri NO ve MDA düzeylerinin saptanmasý için +20 C de bekletildi Örnekler ZnSO 4 ve NaOH ile deproteinize edilerek rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Nitrik oksidin son stabil ürünü olan nitrit düzeylerinin saptanmasý amacýyla sývý içerisindeki nitratlar nitrat redüktaz ile nitrite redüklendi ve toplam nitrit düzeyi Griess 20 reaksiyonuyla spektrofotometrik olarak 545 nm dalga boyunda ölçüldü. NO düzeyleri mmol/l cinsinden saptandý. Malondialdehid (MDA) tayini Satoh 21 un geliþtirdiði spektrofotometrik bir yöntem ile yapýldý. Bu yöntem, lipid peroksidasyonunun aldehid ürünlerinden biri olan MDA ile tiyobarbitürik asitin reaksiyonu esasýna dayanmaktadýr. MDA, tiyobarbitürik asit ile pembe renkli bir kompleks oluþturmakta ve bu çözeltinin absorbansýnýn 532 nm de spektrofotometrik ölçümü ile lipid peroksidasyonun derecesi ve MDA düzeyi nmol/ ml cinsinden saptanmaktadýr. li olgular ile kontrol grubunu oluþturan olgularýn sinoviyal sývýlarýndaki NO ve MDA düzeylerinin istatistiksel olarak karþýlaþtýrýlmasýnda Baðýmsýz örneklerde t testi kullanýldý. NO ve MDA düzeyleri ile osteoartrit ile arasýndaki iliþkiyi ortaya koymak için de Spearman korelasyon testi yapýldý. BULGULAR li olgulardan elde edilen sinoviyal sývý örneklerinde nitrik oksitin son metaboliti olan total nitrit düzeyi 160 ± µmol/l iken, kontrol grubunda bu düzey ± µmol/l olarak ölçüldü. grubuna oranla osteoartritli olgulardaki sinoviyal sývý nitrit düzeyi anlamlý þekilde yüksek olarak saptandý (p<0.01) (Þekil 1). Lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olan malondialdehid düzeyleri ise osteoartritli olgularda ± 3.45 nmol/ml iken, kontrol grubunda 5.01 ± 1.38 nmol/ml olarak saptandý. Sinovyal sývý MDA düzeyinin, kontrol grubuna göre osteoartritli olgularda anlamlý derecede yüksek olduðu gözlemlendi (p<0.001) (Þekil 2).

3 ARTROPLASTÝ ARTROSKOPÝK CERRAHÝ / JOURNAL OF ARTHROPLASTY & ARTHROSCOPIC SURGERY 9 Nitrit ( micro.mol/l) MDA (nmol/ml) ** P < 0.01 (t: 3,97) NO ve MDA düzeyleri ile osteoartrit arasýnda pozitif yönde güçlü bir iliþki olduðu gözlendi (NO için r s : ve p=0.002, MDA için r s : ve p<0.001). TARTIÞMA Nitrik oksit, nitrik oksit sentaz adý verilen ve üç izoformu bulunun bir enzim ailesi tarafýndan L-arginin amino asidinden sentezlenen serbest bir radikaldir. Yapýsal nitrik oksit sentaz (cnos = konstitüsyonel nitrik oksit sentaz) adý verilen izoformu nöronlarýn ve endotelyal hücrelerin yapýsýnda bulunarak dolaþýmýn ve sinir iþlevlerinin düzenlenmesinde görev alýr. Buna karþýn indüklenebilir inos un ise; immun regülasyon, enflamasyon ve artritlerin oluþumunda rol aldýðý ve osteoartrit, osteoporoz, inflamatuar artrit ve eklem protezlerinde aseptik gevþeme gibi eklemi ilgilendiren birçok olayda inos aracýlýðý ile oluþan nitrik oksitin sorumlu olduðu bildirilmiþtir 9,15-17,22,23. Düþük konsantrasyondaki nitrik oksitin kýkýrdak matriksi üzerine yararlý etkileri vardýr 11,16. Ancak yüksek konsantrasyondaki nitrik oksitin kondrosit fonksiyonlarýný zararlý yönde etkilediði ve ** Þekil 1: Sinovyal sývý nitrit düzeyleri. *** P < (t: 4,812 ) *** Þekil 2: Sinovyal sývý malondialdehid düzeyleri. kondrositlerde; metalloproteinaz aktivasyonu ile kollojen (özellikle tip II) ve proteoglikan sentezini baskýladýðý, interleukin-1 reseptörlerinin salýnýmýnda ve kondrosit proliferasyonunda azalma ile birlikte kondrosit hücre ölümüne yol açtýðý bildirilmiþtir 3,11,19. Yavaþ ilerleyen ve hücresel düzeydeki kesin nedenleri tam olarak bilinmeyen osteoartritte, kýkýrdaðýn yýkýmý muhtemelen kondrositler tarafýndan üretilen bu katabolik etkenlerin serbestleþmesi ve sentezi ile iliþkilidir 16. Farrell ve ark. 24 osteoartrit ve romatoid artritte sinovyal sývý nitrit konsantrasyonunun serumdan yüksek olduðunu ve sinovyum tarafýndan nitrik oksit üretildiðini, bu durumun da endotelial hücreler, PNL ve makrofaj gibi nitrik oksit üreten hücrelerin enflame sinovyum içerisinde bulunmasý ile iliþkili olduðunu açýklamýþlardýr. Bu çalýþmada; osteoartritli olgularýn serum nitrit düzeyi µmol/l, osteoartritli olmayan olgularýn serum nitrit düzeylerini ise µmol/l olarak bulmuþlardýr (p<0.05). li olgularýn sinovyal sývýlarýndaki nitrit düzeyini de µmol/l olarak saptamýþlardýr 24. Bu çalýþmada araþtýrmacýlarýn sinovyal sývýdaki NO düzeyini seruma göre daha yüksek konsantrasyonda bulmalarý, eklemdeki enflamasyona baðlý olarak inos yolunun aktiflendiðinin bir göstergesidir. Çalýþmamýzda eklemdeki enflamasyonu ve bu enflamasyona baðlý olarak inos yolunun aktiflendiðini belirlemek için serum nitrit düzeyi yerine sinovyal sývýdaki nitrit düzeyini belirlemek amaçlandý. Bu amaçla alýnan sinovyal sývý örneklerinde nitrit düzeyinin osteoartrit grubundaki olgularda kontrol grubuna oranla anlamlý þekilde yüksek olduðunu saptandý (p<0.01). Min ve ark. 3 eklem hastalýðý öyküsü olmayan 40 yaþýnýn altýndaki ve 60 yaþýnýn üzerindeki iki kontrol grubunun sinovyal sývý NO düzeyleri ile 60 yaþýnýn üzerindeki osteoartritli olgularýn sinoviyal sývý NO düzeylerini karþýlaþtýrmýþlardýr. 60 yaþýndan büyük osteoartritli bireylerdeki sinovyal sývý NO düzeylerinin özellikle 40 yaþýndan küçük olan kontrol grubu olgularýna oranla belirgin bir biçimde 7 kat daha yüksek olduðunu gözlemlemiþlerdir. Onlarýn bu bulgularýna dayanarak bizde çalýþmamýzda kontrol grubumuzu eklem hastalýðý öyküsü olmayan genç olgulardan oluþturulmasý tercih edildi. Serbest radikallerin membran lipidlerine etkisi ile oluþan lipid peroksidasyonunu deðerlendirmek için MDA düzeylerine bakýlmaktadýr. Chaturvedi ve ark. 25 osteoartrit, romatoid artrit ve kontrol grubunu oluþturan bireylerin serum ve sinovyal

4 10 10 ARTROPLASTÝ ARTROSKOPÝK CERRAHÝ / JOURNAL OF ARTHROPLASTY & ARTHROSCOPIC SURGERY sývýlarýnda MDA düzeylerini ölçmüþlerdir. ve kontrol grubunda serum MDA düzeyleri romatoid artrite göre düþük iken, sinoviyal sývýda osteoartit ve romatoid artritli grup arasýnda herhangi bir fark saptamamýþlardýr. Haklar ve ark. 16 sinovyal sývýda bir diðer serbest radikal olan süperoksid (O 2. ) radikal düzeyini ölçmüþler ve kondral lezyonu olan hastalarda, kontrol grubuna oranla süperoksid düzeyinin yüksek olduðunu saptamýþlardýr (p<0.05). Bizde osteoartritli olgularda sinovyal sývý MDA düzeyinin saðlýklý kontrol grubunu oluþturan bireylere oranla artmýþ olduðunu gözlemledik (p<0.001). Sinovyal sývý MDA düzeylerindeki yükseklik, eklemdeki reaktif oksijen radikallerinin varlýðýný açýkça ortaya koymaktadýr. Deneysel olarak OA modeli oluþturulmuþ hayvanlarda inos enziminin selektif baskýlanmasý ile; ONOO-, IL-1β, MMP, siklooksijenaz-2 ve NO üretiminde azalma olduðu ve buna baðlý olarak kýkýrdak lezyonlarýnýn sayý ve büyüklüðü ile osteofit sayý ve büyüklüðünün azaldýðý, osteoartrite baðlý erken lezyonlarýn ilerlemesinde yavaþlama olduðu, sinovyal membranda PMN hücre infiltrasyonu gibi akut enflamasyon bulgularýnýn azaldýðý saptanmýþtýr 5,9,13,15. Kabak ve ark. 26 larý sýçanlarda oluþturduklarý deneysel artrit modelinde, eklemde NO sentaz oluþumunu engelleyecek profilaktik N G - monometil-l-arginin (NMMA) ve indometazinin birlikte verilmesi ile nitrat düzeyinde azalma ve artrit tablosunda gerileme olduðunu gözlemlemiþlerdir. Sonuç olarak; eklemdeki bazý inflamatuar etkenlerin biyokimyasal uyarýsý ile geliþen katabolik olaylar sonucunda NO ve oksijen radikalleri oluþmaktadýr. Bunlarýn selektif baskýlanmasýný saðlayacak ajanlar ile osteoartritin tedavisinde yeni aþamalarýn kaydedilebileceði kanýsýndayýz. KAYNAKLAR 1. Hedbom E, Hauselmann HJ. Molecular aspects of pathogenesis in osteoarthritis: the role of inflammation. Cell Mol Life Sci 2002; 59: Goldring MB. The role of the chondrocyte in osteoarthritis. Arthritis Rheum 2000; 43(9): Min BH, Kim HJ, Lim H, Park CS, Park SR. Effects of ageing and arthritic disease on nitric oxide production by human articular chondrocytes. Exp Mol Med 2001; 33(4): Stefanovic-Racic M, Stadler J, Evans CH. Nitric oxide and arthritis. Arthritis Rheum 1993; 36(8): Pelletier JP, Pelletier JM, Abramson SB. Osteoarthritis, an inflammatory disease. Potential implication for the selection of new therapeutic tangets. Arthritis Rheum 2001; 44(6): Presle N, Cipolletta C, Jouzeau JY, Abid A, Netter P, Terlian B. Cartilage protection by nitric oxide synthase inhibitors after intraarticular injection of interleukin-1 β in rats. Arthritis Rheum 1999; 42(10): Murrell GAC, Dolan MM, Jang D, Szabo C, Warren RF, Hannafin JA. Nitric oxide: an important articular free radical. J Bone Joint Surg 1996; 78-A: Miyasaka N, Hirata Y. Nitric oxide and inflammatory arthritides. Life Sci 1997; 61(21): Amin AR, Attur M, Abramson SB. Nitric oxide synthase and cyclooxygenases: distribution, regulation, and intervention in arthritis. Curr Opin Rheumatol 1999; 11(3): Jang D, Murrell GAC. Nitric oxide in arthritis. Free Radic Biol Med 1998; 24(9): Carlo MD, Loeser RF. Nitric oxide-mediated chondrocyte cell death requires the generation of additional reactive oxygen species. Arthritis Rheum 2002; 46(2): Bernardeau C, Dernis-Labous E, Balnchard H, Lamarque D, Breban M. Nitric oxide in rheumatology. Joint Bone Spine 2001; 68: Nishida K, Doi T, Inoue H. The role of nitric oxide in arthritic joints: a therapeutic target? Mod Rheumatol 2000; 10: Sakurai H, Kohsaka H, Liu MF, Higashiyama H, Hirata Y, Kanno K et al. Nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase expression in inflammatory arthritides. J Clin Invest 1995; 96: Mello SBV, Novaes GS, Laurindo IMM, Muscara MN, Maciel FMB, Cossermelli W. Nitric oxide synthase inhibitor influences prostaglandin and interleukin-1 production in experimental arthritic joints. Inflamm Res 1997; 46: Haklar U, Yüksel M, Velioðlu A, Türkmen M, Haklar G, Yalçýn AS. Oxygen radicals and nitric oxide levels in chondral or meniscal lesions or both. Clin Orthop 2002; 403: Cedergren J, Forslund T, Sundqvist T, Skogh T. Inducible nitric oxide synthase is expressed in synovial fluid granulocytes. Clin Exp Immunol 2002; 130: Tiku ML, Shh R, Allison GT. Evidence linking chondrocyte lipid peroxidation to cartilage matrix protein degradation. Possible role in cortilope agong and the pathogenesis of osteoanth niths. J Biol Chem 2000; 275(26): Mazetti I, Grigolo B, Pulsatelli L, Dolzani P, Silvestri T, Roseti L et al. Differential roles of nitric oxide and oxygen radicals in chondrocytes affected by osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Clin Sci 2001; 101: Giovannoni G, Land JM, Keir G, Thompson EJ, Heales SJ. Adaptation of the nitrate reductase and Griess reaction methods for the measurement of serum nitrate plus nitrite levels. Ann Clin Biochem 1997; 34 ( Pt 2): Satoh K. Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determined by a new colorimetric method. Clin Chim Acta 1978; 90: Wanchu A, Khullar M, Sud A, Bambery P. Elevated nitric oxide production in patients with primary Sjögren s syndrome. Clin Rheumatol 2000; 19:

5 ARTROPLASTÝ ARTROSKOPÝK CERRAHÝ / JOURNAL OF ARTHROPLASTY & ARTHROSCOPIC SURGERY Lee MS, Trindade MCD, Ikenoue T, Schurman DJ, Goodman SB, Smith RL. Effects of shear stress on nitric oxide and matrix protein gene expression in human osteoarthritic chondrocytes in vitro. J Orthop Res 2002; 20: Farrel AJ, Blake DR, Palmer RM, Moncada S. Increased concentrations of nitrite in synovial fluid and serum samples suggest increased nitric oxide synthesis in rheumatic diseases. Ann Rheum Dis 1992; 51: Chaturvedi V, Handa R, Rao DN, Wali JP. Estimation & significance of serum & synovial fluid malondialdehyde levels in rheumatoid arthritis. Indian J Med Res 1999; 109: Kabak Þ, Halýcý M, Yakan B, Kutlubay R, Kula M. Tüberküloz artritini engellemede N G -monometil L-arginin ve indometazinin birlikte veya tek tek kullanýmdaki etkinliði. Acta Orthop Traumatol Turc 2002; 36(2):