Karotis Arter Aterom Plaklar nda Chlamydia Pneumoniae ve Helicobacter Pylori DNA s n n Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saptanmas

Transkript

1 Kaplan ve Arkada¾lar Türk Göüs Kalp Damar Cer Derg Karotis Arter Aterom Plaklar nda Chlamydia Pneumoniae ve Helicobacter Pylori DNA s n n Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saptanmas DETECTION OF CHLAMYDIA PNEUMONIAE AND HELICOBACTER PYLORI DNA IN ATHEROSCLEROTIC PLAQUES OF CAROTID ARTERY BY POLIMERASE CHAIN REACTION Mehmet Kaplan, *Serap ½im¾ek Yavuz, **Vedat Köksal, Bayer Ç nar, Mustafa Sinan Kut, Fikri Yap c, Hakan Gerçekolu, Mahmut Murat Demirta¾ Dr. Siyami Ersek Göüs Kalp Damar Cerrahisi Merkezi, Kalp Damar Cerrahisi Klinii, stanbul *Dr. Siyami Ersek Göüs Kalp Damar Cerrahisi Merkezi, Enfeksiyon Hastal klar ve Klinik Mikrobiyoloji Uzman, stanbul **Histoloji ve Embriyoloji Uzman, stanbul Özet Amaç: Aterosklerozun patogenezi multifaktöriyeldir ve hala tart ¾mal d r. Konvansiyonel risk faktörleri, ateroskleroz patogenezini tam olarak aç klayamamaktad r. Uzun süredir ateroskleroz patogenezinde baz mikroorganizmalar n, özellikle Chlamydia pneumoniae ve Helicobacter pylori nin olas rolü ileri sürülmektedir, ancak konu hala çözümlenmi¾ deildir. Bu çal ¾mada, karotis arter aterom plaklar nda C. pneumoniae ve H. pylori DNA s n n varl (polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi ile ara¾t r lm ¾t r. Materyal ve Metod: Bu prospektif çal ¾maya cerrahi giri¾im için merkezimize ba¾vuran dei¾ik tipte aterosklerotik hastal olan 104 ard ¾ k hasta dahil edildi. Karotis endarterektomi yap lan hastalar n karotis arterlerinden elde edilen 52 aterosklerotik plak örnei çal ¾ma grubunu, koroner arter bypass greft operasyonu geçiren hastalar n asandan aortalar n n makroskobik olarak sal kl bölgeleri kontrol grubunu olu¾turdu. Endarterektomi örneklerinde C. pneumoniae ve H. pylori DNA lar n n varl ara¾t r ld. Bulgular: C. pneumoniae DNA s, 52 aterom pla n n 16 s nda (%30.77), 52 makroskobik olarak sal kl asandan aort duvar örneklerinin ise 1 nde (%1.92) saptand (p < 0.001). H. pylori DNA s ise, 52 aterom pla n n 9 unda (%17.31) saptan rken kontrol grubunda görülmedi (p = 0.003). Elli iki pla n 25 inde (%48) ya C. pneumoniae ya da H. pylori DNA s saptand. Sonuç: Sal kl vaskuler duvar örnekleri ile kar¾ la¾t r ld nda, aterosklerotik plaklarda C. pneumoniae ve H. pylori DNA s n n yüksek insidans, bu mikroorganizmalar n aterogenez patogenezinde rol oynayabileceini dü¾ündürmektedir. Anahtar kelimeler: Ateroskleroz, Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, polimeraz zincir reaksiyonu Summary Türk Göüs Kalp Damar Cer Derg Background: Conventional risk factors cannot completely explain the pathogenesis of atherosclerosis. A possible role of some microorganisms, particularly Chlamydia pneumoniae and Helicobacter pylori has been proposed in the pathogenesis of atherosclerosis for a long time, but it is still an unresolved issue. We explored the presence of Chlamydia pneumoniae and Helicobacter pylori DNA in carotid artery atherosclerotic plaques by using polymerase chain reaction. Methods: Onehundredfour consecutive patients with various types of atherosclerotic diseases who admitted to our center for surgical intervention were included in this prospective study. Fifty-two atherosclerotic plaque specimens that were obtained from carotid arteries of the cases who had carotid endarterectomy constituted the study group and 52 specimens obtained from the macroscopically healthy regions of ascending aorta in cases who undergone coronary artery bypass grafting were the control group. Results: Chlamydia pneumoniae DNA was detected in 16 (30.77%) of 52 atherosclerotic plaques and 1 (1.92%)of 52 macroscopically healthy ascending aorta wall specimens (p < 0.001). Helicobacter pylori DNA was detected in 9 (17.31%) of 52 atherosclerotic plaques and none of the controls (p = 0.003). Twenty-five of 52 plaques (48%) were positive either for Chlamydia pneumoniae or Helicobacter pylori. Conclusion: Higher incidence of Chlamydia pneumoniae and Helicobacter pylori DNA in atherosclerotic plaques, compared to healthy vascular walls suggests that these microorganisms may play a role in the pathogenesis of atherogenesis. Keywords: Atherosclerosis, Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, polymerase chain reaction Turkish J Thorac Cardiovasc Surg Sunulduu Kongre: Türk Kalp Damar Cerrahisi Dernei VII. Ulusal Kongresi, Ekim 2002, Antalya Adres: Dr. Mehmet Kaplan, 67. Ada Kardelen 4-4, D:11 Ata¾ehir, stanbul mehmetkaplan@superonline.com 160

2 Turkish J Thorac Cardiovasc Surg Kaplan ve Arkada¾lar Giri¾ Ateroskleroz, multifaktöriyeldir ve kronik inflamatuvar hastal k olarak tan mlan r. Aterosklerotik pla n olu¾umu, ilerlemesi ve destabilizasyonu için tan mlanan aile öyküsü, hiperlipidemi, hipertansiyon, diabetes mellitus, cinsiyet ve sigara al ¾kanl gibi risk faktörleri ateroskleroz patogenezini tam olarak aç klayamamakta, sadece baz yönlerine aç kl k getirebilmektedir [1]. Son y llarda elde edilmi¾ veriler, duodenal ülser, kronik akcier hastal (astma dahil) ve aterosklerotik hastal klar gibi kronik inflamatuvar hastal klarda bir veya birden fazla infeksiyöz ajan n nedensel rolü olabileceini desteklemektedir [2]. Kronik inflamatuar hastal klarda infeksiyöz ajanlar n nedensel rolü ve birliktelii, halk sal, tedavi ve korunma aç s ndan oldukça önemlidir. Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) ve Helicobacter pylori (H. pylori) ateroskleroz patogenezinde en çok sorumlu tutulan mikroorganizmalard r [3]. Bu çal ¾mada, karotis endarterektomi plaklar nda ve sal kl asandan aort duvar örneklerinde, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile C. pneumoniae ve H. pylori DNA s ara¾t r ld ve seroepidemiyolojik bulgular literatür bilgileri ile birlikte tart ¾ ld. Materyal ve Metod Çal ¾ma Hastalar Haziran 2000 Aral k 2001 tarihleri aras nda, aterosklerotik hastal klar n cerrahisi için merkezimize ba¾vuran ard ¾ k 104 hasta çal ¾maya dahil edildi. Çal ¾ma hastanemiz etik komitesi taraf ndan onayland ve çal ¾ma için tüm hastalar n r zas al nd. Karotis endarterektomi yap lan hastalar n (n = 52; 36 erkek, 16 kad n; ortalama ya¾ ± 7.84) karotis arterlerinden al nan aterosklerotik plaklardan elde edilen 52 örnek çal ¾ma grubunu; koroner arter bypass greft operasyonu yap lan hastalar n (n = 52; 38 erkek, 14 kad n; ortalama ya¾ ± 8.62) makroskobik olarak sal kl görünen asandan aort bölgelerinden al nan 52 örnek ise kontrol grubunu olu¾turdu. Çal ¾ma grubundaki tüm hastalar semptomatikti ve karotis arter stenozu %70 in üzerinde idi. Her iki gruptaki hastalar n operasyon öncesi demografik karakteristikleri ve hipertansiyon, diabetes mellitus, lipid profili, sigara al ¾kanl ve miyokard enfarktüsü gibi ateroskleroza ait risk faktörleri ve dier medikal hikayeleri kay t edildi (Tablo 1). Cerrahi Teknik Çal ¾ma grubundaki 40 hastaya yaln zca karotis endarterektomi, 12 hastaya ise hem karotis endarterektomi hem de koroner arter baypas greft operasyonu [9 hastada (%75) kardiyopulmoner bypass ile, 3 hastada (%25)ise atan kalpte] yap ld. E¾zamanl uygulanan bu giri¾imlerde, genel anestezi Tablo 1. Çal ¾ma ve kontrol gruplar ndaki hastalar n demografik verileri. Karakteristikler Çal ¾ma Grubu Kontrol Grubu p deeri* (n = 52) (n = 52) Ortalama ya¾ (y l) ± ± 8.62 Cinsiyet Kad n Erkek Sigara al ¾kanl KOAH Koroner arter hastal 25 52; (grup karakteristii) < Periferik arter hastal Hipertansiyon Hiperkolesterolemi Total kolesterol düzeyi (mg/dl) 228 ± ± Obezite Diabetes mellitus TIA öyküsü 22; 4 < (grup karakteristii) Ansteybl anjina pektoris Risk faktörlerinin kombinasyonu Sigara + hipertansiyon Sigara + hiperkolesterolemi Sigara + hipertansiyon + hiperklosterolemi *p < 0.05 anlaml KOAH = kronik obstrüktif akcier hastal ; TIA = transiyent iskemik atak 161

3 Kaplan ve Arkada¾lar Türk Göüs Kalp Damar Cer Derg Resim 1. Chylamydia pneumoniae Cloned PstI geni ve Helicobacter pylori glmm (Urease C) geni amplifikasyonu. (+) kontrol (C. pneumoniae): 1. kolon, C. pneumoniae (+) hastalar: 2. ve 3. kolon, (+) kontrol (H. pylori): 4. kolon, H. pylori (+) hastalar: 5. ve 8. kolon, (-) kontrol: 6. ve 7. kolon alt nda karotis endarterektomi yap ld ktan sonra, aorto-sa atriyal kanülasyon ile kardiyopulmoner bypassa geçilip koroner arter bypass cerrahisi uyguland. Yaln zca karotis endarterektomisi yap lan olgularda ise lokal anestezi teknii kullan ld. Lokal anestezi teknii olarak, marcain (Bupivacaine Hidrochloride) ile servikal blokaj tercih edildi. Kontrol grubundaki hastalara ise, aorto-sa atriyal kanülasyonla kardiyopulmoner bypassta (n = 45 hasta, %86.53) veya atan kalpte (n = 7 hasta, %13.47) aortokoroner bypass greft operasyonu uyguland. Örnek Toplama Tüm örnekler operasyon odas nda steril ko¾ullar alt nda al nd. Yakla¾ k cm büyüklüündeki karotis arter ateroskleroz örnekleri, Tris-EDTA buffer içeren ependorf mikrosantrifüj tüplerine yerle¾tirildi. Ependorf tüpleri operasyon odas nda etiketlendi. Mikrobiyolojik incelemeyi yapacak laboratuvar çal ¾anlar, örneklerin hangi gruptan olduu konusunda bilgilendirilmedi. Resim 2. Chylamydia pneumoniae 16S rrna geni ve Helicobacter pylor glmm (Urease C) geni amplifikasyonu. M: Marker: 100 bp ladder (Promega), (+) kontrol (C. pneumoniae): 1. kolon C. pneumoniae (+) hastalar: 2. ve 3. kolon, (+) kontrol (H. pylori): 4. kolon, H. pylori (+) hastalar: 5. ve 6. kolon, (-) kontrol: 7. kolon Örneklerin Transportu ve ¾lenmesi Tüm örnekler 24 saat içinde ve +4 C de laboratuvara gönderildi. Vaskuler doku örneklerinin kalsifiye alanlar ç kar ld, kalan örnekler küçük parçalara (~25 mg) ayr ld ve DNA ekstraksiyonu için i¾leme sokuldu. Tüm doku örnekleri, PCR için, proteinase K (Sigma Chemical) digestion, phenolchloroform extraction ve ethanol precipitation ile i¾lendi. Birden fazla çözme-dondurma i¾leminden kaç nmak için, DNA ekstraktlar, küçük miktarlara bölünerek sakland. PCR Amplifikasyonu DNA amplifikasyonlar, her bir deoksinükleotid trifosfattan (dntp) (Fermentas) 200 µm, her bir primerden 2 µm, 2 U Taq polymerase (Fermentas), 10 µm Tris-HCL, 50 µm KCl ve 1.5 µm MgCl 2 içeren 50 µl volümde yap ld. Reaksiyon tüpleri PTC-100 thermal cycler (MJ Research) a yerle¾tirildi. Globulin primerleri internal pozitif kontrol olarak çal ¾maya dahil edildi. Miks kontrolü olarak, iki pozitif ve iki negatif kontrol kullan ld. PCR yönteminin primer düzenleri, ko¾ullar ve büyüklükleri C. pneumoniae için [4,5] Tablo 2 de ve H. pylori için [6] ise Tablo 3 te gösterildi. PCR ile C. pneumoniae nin saptanmas için 2 farkl PCR analizi 2 farkl primer seti kullan larak yap ld (Tablo 2). PCR, her bakteri için fakl günlerde olacak ¾ekilde, herbir primer için en az iki kez yap ld. Amplifikasyon ürünleri, ethidium bromide içeren %2 agaroz jelde elektroforez ile C. pneumoniae için bp, H. pylor için ise 294 bp düzeyinde gösterildi. Doku haz rlanmas, PCR amplifikasyonu ve elektroforez i¾lemleri, kontaminasyon riskinden kaç nmak için ayr odalarda gerçekle¾tirildi. statistiksel Analiz Tablo 2. Chlamydia pneumoniae PCR analizleri. PCR hedef geni ve PCR ürünlerinin büyüklükleri Primer isim ve sekanslar PCR ko¾ullar 1) Cloned PstI, 437 bp HL1 : 5 gtt gtt cat gaa ggc cta ct 3 94 C - 45 s, 48 C - 30 s, 72 C - 30 s HR1 : 5 tgc ata acc tac ggt gtg tt 3 (40 devir) 2) 16S rrna, 463 bp CpnA : 5 tga caa ctg tag aaa tac agc 3 94 C - 1 dk, 45 C - 30 s, 72 C - 30 s CpnB : 5 cgc ctc tct cct ata aat 3 (40 devir) bp = base pair; Cpn = Chlamydia pneumoniae; dk = dakika; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; s = saniye 162

4 Turkish J Thorac Cardiovasc Surg Kaplan ve Arkada¾lar Tablo 3. Helicobacter pylori PCR analizleri. PCR hedef geni ve PCR ürünlerinin büyüklükleri Primer isim ve sekanslar PCR ko¾ullar GlmM gene, 294 bp Forward, 5 aag ctt tta ggg gtg tta ggg gtt 3 93 C - 1 dk, 55 C - 1 dk, Reverse, 5 aag ctt act ttc taa cac taa cgc 3 72 C - 1 dk (35 devir) bp = base pair; dk = dakika; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu Tablo 4. Çal ¾ma grubunda Chlamydia pneumoniae ve Helicobacter pylori saptanan hastalar n demografik verileri. Çal ¾ma Grubu ODDS Ratio Karakteristikler (n = 52) (%95 CI: Alt s n r < OR < Üst s n r) CP (+) HP (+) CP HP Ortalama ya¾ (y l) ± ± 8.04 Cinsiyet Kad n < < < 0.90 < 5.33 Erkek 13 6 Sosyoekonomik düzey p = 0.790* p = 0.205* Kötü 7 2 Orta 6 4 yi 3 3 Aterom pla p = 0.630* p = 0.603* Organize 8 7 Yumu¾ak 3 1 Tromboze 2 0 Ülsere 2 1 Sigara al ¾kanl < 0.66 < < 0.14 < 1.14 KOAH < 1.53 < < 2.02 < 13.5 Koroner arter hastal < 42.8 < < 0.11 < 0.86 Periferik arter hastal < 13.6 < < 1.44 < 12.4 Hipertansiyon < 2.58 < < 0.25 < 1.49 Hiperkolesterolemi < 0.28 < < 0.59 < 3.48 Obezite < 0.62 < < 1.44 < 12.4 Diyabetes mellitus < 3.55 < < 0.53 < 4.28 TIA öyküsü < 0.95 < < 0.82 < 4.72 Ansteybl anjina pektoris < 3.37 < < 7.69 < 92.8 *p < 0.05 anlaml, Pearson Chi-Square testi; CP = Chlamydia pneumoniae; HP = Helicobacter pylori; KOAH = kronik obstrüktif akcier hastal ; OR = odds ratio; TIA = transiyent iskemik atak statistiksel analiz, SPSS 10.0 (Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) ve MATLAB Release 12 (MATrix LABoratory, The MathWorks, Inc, Boston, MA, USA) programlar kullan larak yap ld. Veriler ortalama ± standart sapma olarak verildi in alt ndaki p deeri istatistiksel olarak anlaml kabul edildi. Çal ¾ma ve kontrol gruplar n n demografik verilerinin istatistiksel kar¾ la¾t r lmas nda cinsiyet, sigara içme al ¾kanl, kronik obstrüktif akcier hastal, koroner arter hastal, periferik arter hastal, hipertansiyon, hiperkolesterolemi, obezite, diabetes mellitus, transiyent iskemik atak öyküsü ve anstabil anjina pektoris için ba ms z grup oranlar n n kar¾ la¾t r lmas esas na dayanan Likelihood Ratio testi ve Fisher s Exact testi, kolesterol düzeyleri için ise ba ms z 2 grup ortalamas n n kar¾ la¾t r lmas esas na dayanan Independent-Samples T testi ve kolesterol düzeylerinin varyanslar n n homojenitesini kontrol etmek amac yla da Levene s f testi kullan ld. Çal ¾ma grubunda C. pneumonia ve H. pylori saptanan olgular n sahip olduklar ki¾isel ve çevresel özelliklerinin mevcut olma olas l Pearson Chi-Square testi ve Odds Ratio (OR) testi ile ara¾t r ld. Hesaplanan OR deerlerinin anlaml l, %95 Confidence Interval (CI; güven aral ) s n rlar hesaplanarak test edildi ve 1 deerini içermeyen aral klar istatistiksel olarak anlaml kabul edildi (p < 0.05). Mikrobiyolojik inceleme sonucu saptanan C. pneumonia ve H. 163

5 Kaplan ve Arkada¾lar Türk Göüs Kalp Damar Cer Derg Tablo 5. Çal ¾ma grubu olgular n n demografik özelliklerinin Chlamydia pneumoniae ve Helicobacter pylori pozitifliine etkilerinin analizi. p deeri* Çal ¾ma Grubu ODDS Ratio (n = 52) (%95 CI: Alt s n r < OR < Üst s n r) CP HP CP HP Karakteristikler (n = 16) (n = 9) Cinsiyet Kad n 3 3 Erkek 3 6 p = p = < 1.84 < < 1.10 < 2.90 Sigara 7 1 p = p = < 1.11 < < 3.16 < Hipertansiyon 14 5 p = p = < 0.52 < < 1.81 < 4.47 Hiperkolesterolemi 4 3 p = p = < 1.49 < < 1.08 < 2.56 Diyabetes mellitus 6 1 p = p = < 0.46 < < 1.73 < 5.57 *p < 0.05 anlaml. CP = Chlamydia pneumoniae; HP = Helicobacter pylori; OR = odds ratio pylori için risk etkenlerinin öneminin belirlenmesi amaçland ve C. pneumonia ve H. pylori pozitiflii Dikotom nominal ba ml dei¾ken olarak kabul edildiler. Cinsiyet, sigara, hipertansiyon, hiperkolesterolemi ve diabetes mellitus ise kategorik ba ms z dei¾kenler olarak regresyon analizine dahil edildi ve uygulanacak regresyon modelinin Binary Lojistik Regresyon Analizi olmas na karar verildi. Bulgular Çal ¾ma ve kontrol gruplar ndaki hastalar n demografik verileri Tablo 1 de gösterildi. ki grup aras nda ya¾, cinsiyet ve bilinen risk faktörleri (sigara al ¾kanl, kronik obstrüktif akcier hastal, periferik arter hastal, hipertansiyon, hiperkolesterolemi, obezite ve diabetes mellitus) aç s ndan fark saptanmad. Preoperatif transiyent iskemik atak oran (p < 0.001, Likelihood Ratio testi) çal ¾ma grubunda, koroner arter hastal (p < 0.001, Likelihood Ratio testi) ve anstabil anjina pektoris (p = 0.011, Likelihood Ratio testi) ise kontrol grubunda istatistiksel olarak anlaml oranda yüksek idi. Çal ¾ma grubunda C. pneumoniae pozitiflii %30.77 (16 hasta) iken, H. pylori pozitiflii %17.31 (9 hasta) idi. Kontrol grubunda ise, C. pneumoniae %1.9 (1 hasta), H. pylori ise %0 oran nda saptand. Üç ay arayla sa ve sol karotis endarterektomi yap lan bir hastan n, her iki karotis endarterektomi materyalinde de H. pylori pozitif saptand. Bu hastaya ait risk faktörleri hipertansiyon, hiperkolesterolemi ve sigara idi. C. pneumoniae pozitiflii aç s ndan çal ¾ma ve kontrol gruplar nda elde edilen sonuçlar (s ras yla %30.77 ve %1.9) aras ndaki fark istatistiksel olarak anlaml idi [p < (2- yönlü), Pearson Chi-Square testi]. H. pylori pozitiflii yönünden çal ¾ma ve kontrol gruplar aras ndaki farka (s ras yla %17.31 and %0) bak ld nda ise, sonuç yine istatistiksel olarak anlaml bulundu [p = (2-yönlü), Fisher s Exact testi]. Mikrobiyolojik incelemelerinde C. pneumoniae ve H. pylori saptanan olgular n sahip olduklar demografik özellikler incelendi ve bu özellikleri ta¾ ma olas l klar hesaplanarak Tablo 4 te gösterildi. Aterom plaklar nda C. pneumoniae pozitif olan çal ¾ma grubu hastalar n n ortak özellikleri de Tablo 4 te özetlendi. Bu grupta C. pneumoniae saptanan olgularda koroner arter hastal bulunma olas l 42.8 kat, periferik arter hastal bulunma olas l 13.6 kat, obezite bulunma olas l ise 3.55 kat fazla bulundu ve bu deerler istatistiksel olarak anlaml idi (p < 0.05). Kronik obstrüktif akcier hastal 1.53 kat, hipertansiyon 2.58 kat, anstabil anjina pektoris 3.37 kat fazla olas l kla görülmesine ramen bu deerler istatistiksel olarak anlaml bulunmad (p > 0.05). Dier özellikler ise istatistiksel olarak anlams z olas l klarla dü¾ük saptand (p > 0.05). H. pylori pozitif olan hastalar n ortak özellikleri de Tablo 4 te gösterildi. H. pylori saptanan olgularda koroner arter hastal bulunma olas l anlaml olarak artmam ¾t (OR = 0.11, p < 0.05). Kronik obstrüktif akcier hastal 2.02 kat, periferik arter hastal 1.44 kat, obezite 1.44 kat ve anstabil angina pektoris 7.69 kat yüksek olas l kla bulunmas na ramen bu deerler istatistiksel olarak anlaml bulunmad (p > 0.05). Dier özellikler ise istatistiksel olarak anlams z olas l klarla dü¾ük saptand (p > 0.05). Olgular n, varsay lan risk etkenlerinin C. pneumoniae ve H. pylori pozitifliine etkilerinin analizinde nominal ba ml dei¾kenler C. pneumoniae ve H. pylori, kategorik ba ms z dei¾kenler ise cinsiyet, sigara, hipertansiyon, hiperkolesterolemi ve 164

6 Turkish J Thorac Cardiovasc Surg Kaplan ve Arkada¾lar diabetes mellitus olarak belirlendi; %95 CI deerleri ve risk etkenlerinin gerçekle¾me olas l klar C. pneumoniae ve H. pylori için ayr ayr hesapland. Yap lan analizlerde hiçbir risk etkeninin bu olas l klar istatistiksel olarak anlaml oranda artt rmad saptand (Tablo 5). Tart ¾ma Ateroskleroz patogenezinde diabetes mellitus, hipertansiyon, hiperlipidemi, sigara kullan m ve aile öyküsü gibi birçok risk faktörü tan mlanm ¾ olmakla birlikte, bu faktörler patogenezi tam olarak aç klayamamaktad r ve ateroskleroza ne ¾ekilde neden olduklar na dair gerçek mekanizmalar henüz tan mlanmam ¾t r [1,4]. Son y llarda aterosklerozda kronik bir inflamatuvar sürecin söz konusu olduu güçlü kan tlarla gösterilmi¾tir [7]. Ateroskleroz için bilinen klasik risk faktörleri ile kronik inflamasyon göstergeleri aras nda balant kurulamamas, bunlar n d ¾ nda faktörlerin söz konusu olabileceini dü¾ündürmü¾ ve duodenal ülserde olduu gibi, kronik enfeksiyonun bu inflamasyona yol açabileceini akla getirmi¾tir. Günümüzde ateroskleroz patogenezinde rolü olabilecei konusunda en çok incelenen mikroorganizmalar C. pneumoniae, H. pylori, sitomegalovirus ve periodontal infeksiyonlara yol açan baz bakterilerdir [3]. Çal ¾mam zda, bu ajanlardan ¾u ana kadar en güçlü kan tlar n yer ald C. pneumoniae ve ülkemizde yayg n olarak enfeksiyona yol açan H. pylori nin aterosklerotik plaklardaki varl PCR yöntemi ile ara¾t r ld. S kl kla solunum yollar infeksiyonlar na yol açan C. pneumoniae nin aterogenezde rol alan makrofajlar ve endotel hücreleri gibi hücrelere tropizm göstermesi nedeniyle ateroskleroz patogenezinde rolü olabilecei dü¾ünülmektedir [8]. C. pneumoniae ve ateroskleroz aras nda ili¾ki olabilecei ilk kez 1988 y l nda Saikku ve arkada¾lar [9] taraf ndan yap lan seroepidemiyolojik bir çal ¾ma ile gösterildi. Bu çal ¾madan sonra yap lan 25 den fazla seroepidemiyolojik çal ¾man n büyük çounluunda C. pneumoniae pozitiflii ile ateroskleroz aras nda pozitif bir balant bulundu [3]. Seroepidemiyolojik çal ¾malardan sonra aterom plaklar nda C. pneumoniae n n varl n gösteren patolojik ve mikrobiyolojik çal ¾malar yap ld [10,11]. lk kez Shor ve arkada¾lar [10], koroner arter aterom plaklar nda PCR yöntemi ve elektron mikroskobisi ile C. pneumoniae varl n gösterdi. Bu çal ¾madan sonra PCR yöntemi kullan larak yap lm ¾ çal ¾malar n çounluunda aterom plaklar nda C. pneumoniae pozitiflii belirlenmekle birlikte, oranlar oldukça farkl l k gösterdi [3]. Baz çal ¾malar, incelenen örneklerin tümünde C. pneumoniae pozitiflii olduunu [11], baz lar ise hiç saptayamad klar n [12] bildirdi. Bunun en önemli nedeni, PCR yöntemlerinin standardize olmamas d r. Apfalter ve arkada¾lar [13] taraf ndan yap lan bir çal ¾mada, 15 endarterektomi örneinde 9 ayr merkezde ayr ayr PCR yöntemi ile C. pneumoniae arand ve bu çal ¾ma sonucunda laboratuarlar aras C. pneumoniae pozitiflik oran n n %0-60 aras nda gerçekle¾tii bildirilmektedir. PCR ile yap lan deneylerde bu ¾ekilde dei¾ken sonuçlar al nmas n n nedenleri C. pneumoniae nin aterosklerotik lezyonlardaki da l m n n parçal olmas, incelenen ateromatöz dokunun yetersizlii, laboratuvar yöntemlerinin standart olmamas, aterom plaklar ndan C. pneumoniae DNA ekstraksiyonunun yap lamamas ve aterom plaklar nda PCR inhibitörlerinin yer almas olarak ileri sürülmektedir [14]. C. pneumoniae PCR testlerinin standardizasyonunu salamak ve PCR ile C. pneumoniae belirlenmesini engelleyebilecek faktörleri ortadan kald rabilmek amac yla, Center for Disease Control (CDC) of USA ve CDC of Canada taraf ndan, C. pneumoniae deneylerinin standardizasyonu ad alt nda bir rehber haz rland [15]. Çal ¾mam zda C. pneumoniae için örnek alma, transport, ekstraksiyon ve PCR i¾lemlerinde bu öneriler dorultusunda hareket edildi ve bu rehberde standart metod olarak önerilen dört yöntemden ikisi [4,5] kullan ld. Bu iki yöntem ile de C. pneumoniae pozitiflik oran %30.77 olarak belirlendi. Ülkemizden k sa süre önce, yine 16S rrna primerleri kullan larak yap lan bir çal ¾mada da aterom plaklar nda C. pneumoniae oran %26 olarak bildirildi [16]. Çal ¾mam zda kullan lan dier primerle Washington Üniversitesi nden yap lm ¾ bir çal ¾mada, karotis arter aterom plaklar nda PCR ile C. pneumoniae pozitiflik oran %24 olarak bildirilmi¾tir [17]. Arteryel örneklerden al nm ¾ aterom plaklar nda C. pneumoniae varl n ara¾t ran 30 çal ¾man n genel olarak deerlendirildii bir ba¾ka ç a l ¾ m a d a, C. pneumoniae nin PCR yöntemi ile pozitiflik oran ortalama %25, normal vasküler dokularda ise %1 veya daha az oranda belirlendi [14]. Çal ¾mam zda karotis aterom plaklar nda PCR ile belirlenen %30.77 lik pozitiflik oran bu sonucu desteklemektedir. Çal ¾mam zda, C. pneumoniae pozitif hastalarda koroner arter hastal n n ve periferik arter hastal n n var olma olas l klar s ras yla 42.8 ve 13.6 kat yüksek bulundu ve bu deerler istatistiksel olarak anlaml idi. Bu bulgular, C. pneumoniae nin aterosklerozdaki rolünün, sadece belli arterleri etkileyen lokal bir mekanizma ile deil, tüm arterlerin (koroner, periferik, karotis gibi) aterosklerozu ile sonuçlanan sistemik bir mekanizma ile olabileceini dü¾ündürmektedir. Literatürde de koroner arter, aort, karotis arteri, baziller arter ve renal arter aterosklerotik plaklar nda PCR yöntemi ile C. pneumoniae gösterilmi¾tir [16,18,19]. Serolojik olarak C. pneumoniae ile ateroskleroz aras ndaki balant n n belirlenmi¾ olmas ve mikrobiyolojik ve patolojik olarak C. pneumoniae nin aterom plaklar nda yer almas, C. pneumoniae enfeksiyonu ile ateroskleroz aras nda kesin bir neden-sonuç ili¾kisi olduunu göstermemekte ve mikroorganizman n aterom plaklar nda masum bulunma olas l n ekarte edememektedir. C. pneumoniae ile ateroskleroz aras nda nedensel bir ili¾kiyi gösterebilmek için hayvan deneyleri ve aterosklerotik hastal bulunan insanlarda antiklamidyal antibiyotiklerle tedavi çal ¾malar yap ld. Hayvan deneylerinde, C. pneumoniae infeksiyonunun aterosklerotik lezyonlar n geli¾mesine yol açt ve antiklamidyal tedavinin bu lezyonlar n geli¾imini büyük oranda engelledii gösterildi [20]. Aterosklerotik hastal bulunan insanlarda antiklamidyal antibiyotiklerle yap lan çal ¾malarda farkl sonuçlar bildirildi. lk kez Gupta ve arkada¾lar [21] taraf ndan 1997 y l nda, miyokard infartüsü geçirmi¾ 220 hastada azitromisin tedavisi uygulanmas n n kardiyak olay riskini azaltt gösterildi. Ancak bu küçük çal ¾madan sonra yap lan ve sonuçlar k sa süre önce aç klanan 7,700 hastal k weekly intervention with 165

7 Kaplan ve Arkada¾lar Türk Göüs Kalp Damar Cer Derg zithromax (Azitromisin) for atherosclerosis and its related disorders (WIZARD) çal ¾mas nda [22,23], 3 ayl k Azitromisin tedavisinin kardiyak olay riskinde plasebo ile kar¾ la¾t r ld nda %7 lik azalma gösterdii, fakat bu azalman n istatistiksel olarak anlaml olmad bildirildi y l nda tamamlanmas beklenen ve daha uzun süreli (1 y ll k) Azitromisin uygulanan Azithromycin coronary events study (ACES) çal ¾mas n n [24] sonuçlar n n bu konuyu daha büyük oranda ayd nlataca dü¾ünülmektedir. Ancak klinik çal ¾malar n sonuçlar n n olumlu ya da olumsuz olmas, C. pneumoniae nin aterosklerozdaki rolü konusuna kesin bir yan t veremeyecektir. Çünkü mikroorganizma verilen tedavi ile eradike edilemeyebilir veya C. pneumoniae aterogenezin ba¾lang ç a¾amas nda söz konusu olabilir ki, bu da sekonder deil primer korumay gündeme getirmekte ve a¾ gereksinimini dourmaktad r [3]. Ateroskleroz patogenezinde rol alabilecei dü¾ünülen dier bir mikroorganizma da H. pylori dir. H. pylori gram negatif, spiral bir basil olup, duodenal ülserde nedensel bir rolü olduu gösterilmi¾tir [2]. H. pylori ile ateroskleroz aras ndaki balant ya dair, C. pneumoniae da olduu gibi güçlü kan tlar henüz yoktur. Ancak, ülkemiz gibi H. pylori infeksiyon s kl n n %80 lerin üzerinde olduu ülkelerde [25], bu konunun ayd nlat lmas büyük önem ta¾ maktad r. H. pylori ile ateroskleroz aras nda ili¾ki olduuna dair yap lm ¾ çal ¾malar n çounluu serolojiktir. Bu tür bir ili¾ki ilk kez 1994 y l nda Mendall ve arkada¾lar [26] taraf ndan bildirildi. Daha sonra yap lan yakla¾ k 20 kadar serolojik çal ¾man n bir k sm bu çal ¾may desteklemi¾ olmakla birlikte [3], 1998 y l nda Danesh ve arkada¾lar [27] taraf ndan yap lan 18 çal ¾man n meta-analizinde, H. pylori seropozitivitesi ile belli vasküler risk faktörleri aras nda bir ili¾ki belirlenemedii ve daha önce bildirilen bu ili¾kilerin rastlant sal olduu ileri sürüldü. Ancak H. pylori infeksiyon s kl n n özellikle ülkemiz gibi geli¾mekte olan ülkelerde çok yüksek olmas, serolojik çal ¾malar n deerini azaltmaktad r. Çünkü yap lacak herhangi bir çal ¾mada kontrol grubunda da H. pylori seropozitivitesi %80 in üzerinde olacak ve hasta grubu ile kar¾ la¾t rma ¾ans olmayacakt r. Bu nedenle çal ¾mam zda, aterom plaklar nda PCR yöntemi ile direkt H. pylori varl ara¾t r ld. Aterom plaklar nda direkt H. pylori arayan literatürde bizim d ¾ m zda toplam 8 çal ¾maya ula¾ labildi [16,18,19,28-32]. Bu çal ¾malar n 4 ünde aterom plaklar nda H. pylori varl belirlenemezken [18,28-30], dier dört çal ¾mada ise H. pylori varl gösterildi [16,19,31,32]. Aterom plaklar nda PCR yöntemi ile H. pylori belirlenememesinde C. pneumoniae da olduu gibi PCR ile ilgili standardizasyon problemlerinin rolü olabilir. Çal ¾mam zda H. pylori belirlemek için kullan lan glmm (üreaz C) primeri, H. pylori nin belirlenmesinde, günümüzdeki en spesifik primer olarak kabul edilmektedir [33]. Aterom plaklar nda PCR yöntemi ile H. pylori belirlemi¾ olan çal ¾malarda, pozitiflik oran %22-51 aras nda dei¾mektedir [16,30-32]. Bizim çal ¾mam zda da aterom p l a k l a r n d a H. pylori pozitiflik oran %17.31 olarak saptan rken, sal kl damar dokular nda %0 olarak belirlendi ve aradaki fark istatistiksel olarak anlaml bulundu (p = 0.003). Ayr ca 3 ay ara ile sa ve sol karotis endarterektomi operasyonu uygulanan bir hastan n sa ve sol karotisinden al nm ¾ aterom plaklar n n ikisinde de H. pylori pozitif bulunmas, H. pylori nin aterogenezde lokal deil, sistemik bir etki olu¾turma olas l n göstermektedir. Sosyoekonomik seviyenin H. pylori infeksiyonlar ile ili¾kili olduu bilinmektedir [34]. H. pylori pozitiflii saptanan bizimle birlikte toplam 5 çal ¾man n 2 sinin ülkemizden [16], birinin de yine geli¾mekte olan bir ülke olan Arjantin den [31] bildirilmi¾ olmas, H. pylori infeksiyon s kl n n %80 lerin üzerinde olduu ülkelerde, bu mikroorganizman n aterosklerozda rolü olabileceini akla getirmektedir. C. pneumoniae da olduu gibi, aterom pla nda H. pylori nin de belirlenmi¾ olmas, aterosklerozla H. pylori aras nda bir nedensellik olduunu kesin olarak göstermemektedir. Böyle bir nedensellik ili¾kisini ara¾t rmak için k sa süre önce yap lan bir hayvan deneyinde, H. pylori nin farelerde ateroskleroz yaratmad gösterildi [35]. Eldeki veriler, H. pylori nin aterogenezdeki rolünü belirlemek için oldukça yetersizdir ve ileri deneysel ve klinik ara¾t rmalara gereksinim vard r. Dikkati çeken dier bir konu, gerek C. pneumoniae nin, gerekse H. pylori nin eldeki verilere göre aterogenezde olmazsa olmaz bir faktör olmad d r. Çünkü bizim olgular m zda da olduu gibi, yakla¾ k %50 olguda bu mikroorganizmalar n herhangi birine rastlanmad. Bu durumda, söz konusu mikroorganizmalar n ateroskleroz patogenezinde zorunluluk deil, kolayla¾t r c faktör olma olas l yüksektir. Sonuç olarak, çal ¾mam zda karotis arter aterom plaklar nda, sal kl damar duvar na göre anlaml derecede yüksek oranda C. pneumoniae ve H. pylori (C. pneumoniae için p < 0.001; H. pylori için ise p = 0.003) saptanmas, ateroskleroz patogenezinde hem C. pneumoniae nin, hem de H. pylori nin rolü olabilecei dü¾üncesini desteklemektedir. Kaynaklar 1. Wilson PW, D Agostino RB, Levy D, Belanger AM, Silbershatz H, Kannel WB. Prediction of coronary heart disease using risk factor categories. Circulation 1998;97: Cassel GH. Infectious causes of chronic inflammatory disease and cancer. Emerg Infect Dis 1998;4: Muhlestein JB. Chronic infection and coronary artery disease. Med Clin North Am 2000;84: Campbell LA, Perez Melgosa M, Hamilton DJ, Kuo CC, Grayston JT. Detection of Chlamydia pneumoniae by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992;30: Gaydos CA, Quinn TC, Eiden JJ. Identification of Chlamydia pneumoniae by DNA amplification of the 16S rrna gene. J Clin Microbiol 1992;30: Bickley J, Owen RJ, Fraser AG, Pounder RE. Evaluation of the polymerase chain reaction for detecting the urease C gene of Helicobacter pylori in gastric biopsy samples and dental plaque. J Med Microbiol 1993;39: Haverkate F, Thompson SG, Pyke SD, Gallimore JR, Pepys MB. Production of C-reactive protein and risk of coronary events in stable and unstable angina. European Concerted Action on Thrombosis and Disabilities Angina Pectoris Study Group. Lancet 1997;349: Saikku PA. Chlamydia. In: Armstrong D, Cohen J, eds. Infectious Disease. London: Mosby, 1999:

8 Turkish J Thorac Cardiovasc Surg Kaplan ve Arkada¾lar 9. Saikku P, Leinonen M, Mattila K, et al. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet 1988;2: Shor A, Kuo CC, Patton DL. Detection of Chlamydia pneumoniae in coronary arterial fatty streaks and atheromatous plaques. S Afr Med J 1992;82: Juvonen J, Juvonen T, Laurila A, et al. Demonstration of Chlamydia pneumoniae in the walls of abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg 1997;25: Paterson DL, Hall J, Rasmussen SJ, Timms P. Failure to detect Chlamydia pneumoniae in atherosclerotic plaques of Australian patients. Pathology 1998;30: Apfalter P, Blasi F, Boman J, et al. Multicenter comparison trial of DNA extraction methods and PCR assays for detection of Chlamydia pneumoniae in endarterectomy specimens. J Clin Microbiol 2001;39: Kuo C, Campbell LA. Detection of Chlamydia pneumoniae in arterial tissues. J Infect Dis 2000;181(Suppl 3): Dowell SF, Peeling RW, Boman J, et al. Standardizing Chlamydia pneumoniae assays: Recommendations from the centers for disease control and prevention (USA) and the laboratory centre for disease control (Canada). Clin Infect Dis 2001;33: Farsak B, Y ld r r A, Akyön Y, et al. Detection of Chlamydia pneumoniae and Helicobacter pylori DNA in human atherosclerotic plaques by PCR. J Clin Microbiol 2000;38: Jackson LA, Campbell LA, Kuo CC, Rodriguez DI, Lee A, Grayston JT. Isolation of Chlamydia pneumoniae from a carotid endarterectomy specimen. J Infect Dis 1997;176: Blasi F, Denti F, Erba M, et al. Detection of Chlamydia pneumoniae but not Helicobacter pylori in atherosclerotic plaques of aortic aneurysms. J Clin Microbiol 1996;34: Rassu M, Cazzavillan S, Scagnelli M, et al. Demonstration of Chlamydia pneumoniae in atherosclerotic arteries from various vascular regions. Atherosclerosis 2001;158: Fong IW. Antibiotics effects in rabbit model of Chlamydia pneumoniae-induced atherosclerosis. J Infect Dis 2000;181(Suppl 3): Gupta S, Leatham EW, Carrington D, Mendall MA, Kaski JC, Camm AJ. Elevated Chlamydia pneumoniae antibodies, cardiovascular events, and azitromisin in male survivors of myocardial infarction. Circulation 1997;96: Dunne MW. Rationale and design of a secondary prevention trial of antibiotic use in patients after myocardial infarction: The WIZARD (weekly intervention with zithromax [Azitromisin] for atherosclerosis and its related disorders) trial. J Infect Dis 2000;181(Suppl 3): O Connor C, Dunne MW. Weekly intervention with zithromax (Azitromisin) for atherosclerosis and its related disorders (WIZARD) trial. First large-scale study of antibiotic potential in reducing cardiovascular events. March : zithromaxrelease0318.html. 24. Grayston JT. Secondary prevention antibiotic treatment trials for coronary artery disease. Circulation 2000;102: Özden A, Dumlu S, Özkan H ve ark. Transmission of Helicobacter pylori. Gastroenteroloji 1994;5: Mendall MA, Goggin PM, Molineaux N, et al. Relation of Helicobacter pylori infection and coronary heart disease. Br Heart J 1994;71: Danesh J, Peto R. Risk factors for coronary heart disease and infection with Helicobacter pylori: Meta-analysis of 18 studies. Br Med J 1998;316: Malnick SD, Goland S, Kaftoury A, et al. Evaluation of carotid arterial plaques after endarterectomy for Helicobacter pylori infection. Am J Cardiol 1999;83: Danesh J, Koreth J, Youngman L, et al. Is Helicobacter pylori a factor in coronary atherosclerosis? J Clin Microbiol 1999;37: Radke PW, Merkelbach-Bruse S, Messmer BJ, et al. Infectious agents in coronary lesions obtained by endartherectomy: Pattern of distribution, coinfection, and clinical findings. Coron Artery Dis 2001;12: Ameriso SF, Fridman EA, Leiguarda RC, Sevlever GE. Detection of Helicobacter pylori in human carotid atherosclerotic plaques. Stroke 2001;32: Kowalski M. Helicobacter pylori (H. pylori) infection in coronary artery disease: Influence of H. pylori eradication on coronary artery lumen after percutaneous transluminal coronary angioplasty. The detection of H. pylori specific DNA in human coronary atherosclerotic plaque. J Physiol Pharmacol 2001;52(Suppl 1): Lu JJ, Perng CL, Shyu RY, et al. Comparison of five PCR methods for detection of Helicobacter pylori DNA in gastric tissues. J Clin Microbiol 1999;37: Megruad F, van Loon FPL, Thijsen SFT. Curved and spiral bacilli. In: Armstrong D, Cohen J, eds. Infectious Disease. London: Mosby, 1999; Mach F, Sukhova GK, Michetti M, Libby P, Michetti P. Influence of Helicobacter pylori infection during atherogenesis in vivo in mice. Circ Res 2002;90:E