T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MAKROFUNGUSLARIN ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ VE DİĞER TIBBİ ETKİLERİ. Hazırlayan Dönay KARAKAYA

Transkript

1 1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MAKROFUNGUSLARIN ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ VE DİĞER TIBBİ ETKİLERİ Hazırlayan Dönay KARAKAYA Danışman Doç. Dr. Gökçen Yuvalı ÇELİK Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2012 KAYSERİ

2 2 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MAKROFUNGUSLARIN ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ VE DİĞER TIBBİ ETKİLERİ Hazırlayan Dönay KARAKAYA Danışman Doç. Dr. Gökçen Yuvalı ÇELİK Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2012 KAYSERİ

3 i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Dönay Karakaya

4 ii Makrofungusların Antimikrobiyal Aktiviteleri ve Diğer Tıbbi Etkileri adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Dönay Karakaya Danışman Doç. Dr. Gökçen Yuvalı Çelik Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ONAY: Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın / /.. tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / /. Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

5 iii TEŞEKKÜR Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen danışmanım Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK e ve tezimin hazırlanmasında bana her zaman destek olan aileme teşekkür ederim. Dönay KARAKAYA

6 iv MAKROFUNGUSLARIN ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ VE DİĞER TIBBİ ETKİLERİ Dönay KARAKAYA Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi, Mayıs 2012 Danışman: Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK ÖZET Günümüzde bilim ve teknolojideki büyük ilerlemelere rağmen, insanoğlunun sağlıkla ilgili sorunları artmıştır. Bu gün bu sorunların en önemlilerinden biri enfeksiyon hastalıklarına neden olan mikroorganizmaların mevcut antimikrobiyal ilaçlara özellikle de antibiyotiklere direnç kazanmasıdır. Bunun en büyük nedeni antibiyotiklerin yanlış ve gereksiz kullanılmalarıdır. Bu durum yeni ilaçların keşfini zorunlu hale getirmiştir. Böylece doğal kaynakların kullanılması tekrar gündeme gelmiştir. Yüzyıllardır besin olarak kullanılan makrofunguslar tıbbi açıdan önem kazanmış ve bilimsel çalışmalara konu olmuşlardır. Son yıllarda yapılan araştırmalarda ise bazı makrofungusların ve onlardan elde edilen metabolitlerin önemli derecede antimikrobiyal aktiviteye sahip oldukları ve günümüzde sık rastlanan hipertansiyon, diyabet, hiperlipidemi gibi kronik rahatsızlıklara karşı tedavi edici ve insan sağlığının korunmasına yardımcı bileşenler içerdiği tespit edilmiştir. Geleneksel Uzak Doğu tıbbında yaygın olarak kullanılan makrofungusların çoğu Japon, Çin ve Kore kaynaklı ilaç firmaları tarafından piyasaya sunulmaktadır. Anahtar kelimeler: tıbbi makrofunguslar, antimikrobiyal aktivite

7 v ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND OTHER MEDICAL EFFECTS OF MACROFUNGI Dönay KARAKAYA Erciyes University, Faculty of Pharmacy Graduation Project, May 2012 Adviser: Assoc. Prof. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK ABSTRACT Nowadays the problems with related to health of human being have been increasing, although important development at science and tecnology. This day is one of the most important of these problems of micro-organisms that cause infectious diseases to acquire resistance to existing antimicrobial drugs, especially antibiotics. The biggest reason is their use of antibiotics is wrong and unnecessary. This condition caused necessary that new drug discovering. Thus the use of natural resources have been becoming a current issue. Macrofungi used as food for centuries have gained importance in the medical point of macrofungi and have been the subject of scientific study. Recent researchs shown that some macrofungi and their component have very important antimicrobial activity, also these components have treatment effect aganist chronic illness like hypertension, diabetes, hyperlipidemia and they are useful for protecting health of human. Macrofungi are being used frequently at Traditional Far Eastern medical. Some macrofungi and their components are being sold by Japanese, Chinese, Korean drug company. Key Words: medical macrofungi, antimicrobial activity

8 vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... i KABUL ONAY... ii TEŞEKKÜR... iii ÖZET... iv ABSTRACT... v İÇİNDEKİLER... vi TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ... viii SİMGELER VE KISALTMALAR... ix 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER DÜNYADA MANTAR ÜRETİMİ MAKROFUNGUSLARIN ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ Antimikrobiyal etki mekanizması Antimikrobiyal aktivite belirleme testleri Bazı Makrofungusların Antimikrobiyal Etki Tespit Çalışmaları MAKROFUNGUSLAR ÜZERİNE YAPILAN DİĞER TIBBİ ÇALIŞMALAR Bazı Önemli Tıbbi Makrofunguslar Cordyceps sinensis Tricholoma spp Coriolus versicolor Pleurotus spp Ganoderma lucidum Agaricus spp Cantharellus tubaeformis... 22

9 vii Lentinus edodes Laetiporus sulphureus TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ

10 viii TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1. Dünya ve A.B.D. de yılları mantar üretimi... 5 Şekil 2. Toplam dünya üretimi... 6 Şekil 3. Cordyceps sinensis in görünümü Şekil 4. Tricholoma mongolicum un görünümü Şekil 5. Coriolus versicolor un görünümü Şekil 6. Pleurotus ostreatus un görünümü Şekil 7. Ganoderma lucidum un görünümü Şekil 8. Agaricus blazei in görünümü Şekil 9. Cantharellus tubaeformis in görünümü Şekil 10. Lentinus edodes in görünümü Şekil 11. Laetiporus sılphureus in görünümü Tablo 1. Dünyada kültür mantarı üretiminin türlere göre oransal dağılımı... 5

11 ix SİMGELER VE KISALTMALAR AIDS HIV MİK MLK S İ R MRSA AK 30 LDL TML Β α : Edinilmiş bağışıklık eksikliği sendromu : İnsan bağışıklık yetmezlik virüsü : Minimal inhibitör konsantrasyonu : Minimal letal konsantrasyon : Duyarlı : İndermediate : Duyarsız : Metisilin dirençli S. aureus : Amikasin : Düşük yoğunluklu lipoprotein : T. mongolicum lektini : Beta : Alfa LM-3 : Düşük molekül fraksiyonu - 3 µ : Mikro

12 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Mantarlar doğu kültüründe uzun yıllardır çay ve besleyici gıda olarak kullanılmaktadır. Bunun başlıca nedeni kendilerine has kokuları ve yumuşak yapılarıdır (1). Tatlı ve besleyici bir gıda olarak değerlendirilen birçok yabani mantar türü, dünya genelinde farklı milletler tarafından düzenli olarak toplanır ve sonra direkt olarak ana besin kaynağı olarak kullanılır ya da yemeğe katılırlar. Antik Romalılara göre; mantarlar Tanrıların yiyecekleriydi, Mısırlılar mantarları Tanrı Osiris ten bir hediye olarak nitelendirirken, Çinliler de mantarları hayatın iksiri olarak düşünmüşlerdir. İlk kavimler, deneme yanılma yoluyla yenilebilen ve yenilemeyen zehirli mantarlar hakkında bilgi sahibi olmuşlardır (2). Mantarlara duyulan ilgiden dolayı hazırlanan listeler ve tanımlar arasında sık sık zehirli olanlardan da bahsedilmesi sanıldığı kadar yeni değildir. Nitekim Çin, Roma ve Yunan medeniyetlerinde makrofungusların bu devirlerden çok daha öncelerinde bile Sibirya, Meksika ve Orta Amerika'da halusinojenik bazı makrofungusların büyücülükte ve dinsel ayinlerde kullanıldığı M.Ö yılları civarına kadar uzanan tarihî delillerle ortaya konulmuştur. Yine M.Ö ve M.S. 200 yılları arasına ait olduğu sanılan bazı fresk, çanak, çömlek ve hatta öykülerde, örneğin Roma İmparatoru Neron'un ailesinin, Mozart'ın ve Buda dininin kurucusu Gotama'nın mantar zehirlenmesinden öldüğü anlatılmaktadır (3). Ancak mantar zehirlemesi gibi üzücü olaylarla ortaya çıkan korku, yine de makrofungusların besin hatta afrodizyak, keyif verici ve kanamayı durdurucu droglar olarak kullanılmalarını önleyememiştir (3,4). Ayrıca Çin tababetinde koruyucu olarak, mantarın sıcak su ekstratlarının küçük çocukların göğsüne ve ayak tabanlarının altına sürülme işleminin yıllardır uygulandığı bilinmektedir (5).

13 2 Botanistler tarafından Herbalistler Devri olarak adlandırılan devirde, yalnızca makrofungusları kapsayan ilk bilimsel anlamdaki eser Johanner Franciscus Van Sterbeeck ( ) 'in"theatrum Fungorum of het Toonel der Campernoelien" adlı eseridir. Burada yazar yenebilir ve zehirli makrofunguslan ayırımlarını oldukça iyi bir tarzda ortaya koymuştur (6). Medikal mantarların ortaya çıkış tarihi geleneksel doğu terapilerine kadar uzanır. Modern klinik uygulamalarında Japonya, Çin, Kore ve diğer Asya ülkelerinde kurutulmuş mantar materyallerine günümüzde de güvenilmeye devam edilmektedir (1). Mantarlar fotosentez yapamazlar, besinlerini başka canlıların ürettiklerinden dönüştürerek elde ederler. Heterotrofturlar. Besinlerin hücreye alınma yolu, absorbsiyon dur. Hiflerden oluşan ağsı bir yapıya sahiptirler. Hifler büyür ve dallanır, hiflerin kaynaşmasına ise anastomoz denir. Oluşan hif yığınları miselleri oluşturur. Ortam şartları uygunsa miseller büyüyerek toprak ustu yapı olan karpofor adını verdiğimiz şapkayı oluştururlar. Ökaryötik hücre yapısına sahip olan makrofunguslar, eşeyli ve eşeysiz üreyebilir. Yayılmak için spor adı verilen yapıları kullanırlar. Çok değişken sekil ve büyüklüklerde olabilirler. Bugün bilinen şapkalı mantar türü sayısı e yakındır. (7). Mantarlar, birçok et ve sütten daha az ancak birçok sebzeden daha çok protein içeren, kolayca sindirilebilir bir protein kaynağıdır. Protein miktarı (kuru ağırlık) %10-40 arasında değişebilir. Mantarlar esansiyel tüm aminoasitleri içerir ancak metiyonin, sistin ve sülfür aminoasitlerini az miktarda bulundurur. İçeriklerine bakıldığında mantarlar büyük oranda fosfor ve potasyum, az miktarda demir ve kalsiyum dahil, var olan tüm mineralleri gelişimlerinin tüm basamaklarında bulundururlar (8). Mantarlar özellikle tiyamin (B1), riboflavin (B2), niyasin (B3), biyotin (B7) ve askorbik asit (C vitamini) gibi vitaminlerin kaynağıdırlar. Ayrıca bu mantarlar folik asit bakımından da zengin olduğundan kansızlık tedavisinde kullanılabilir. Mantarlar potasyum, fosfor, kalsiyum, demir ve bakır yönünden de oldukça zengindir. Bazı türler fark edilebilir miktarda β- karoten ve ergosterol içerir. (Bunlar ultraviyole ışınlarına maruz kaldıklarında aktif D vitaminine dönüşürler.) Mantarlardaki ham yağlar, yağ asitleri mono-, di- ve trigliserid leri, sterolleri, sterol esterleri ve fosfolipidleri dahil tüm ana lipid bileşenlerini içerir. Yağ asitleri genelde düşük olup kuru mantarın yaklaşık % 2-8 ini oluşturur. Hiç

14 3 şüphesiz yenen mantarların tazeyken ve işlendikten sonraki halleri birçok insan için, özellikle de vejetaryenler için önemli bir besin kaynağıdır (2). Uzun zamandan beri lezzetine ve yapısına değer verilen mantarlar, şimdilerde besleyici bir yiyecek olmalarının yanı sıra az da olsa biyolojik aktif maddeleri ile de tanınmaktadırlar (2). Buna bağlı olarak lezzeti bakımından komplementer olan ticari mantarlar ayrıntılı olarak çalışılmaktadır (9). Tedavi amaçlı kullanıldığında tıbbi mantarlar normalde daha çok pudra haline getirilmiş konsantreler olarak veya sıcak su ekstraktları yapılarak kullanılır. Chang ve Buswell tarafından sıvı konsantrasyon halinde veya kuru toz haline getirilmiş mantar ekstraktlı kapsüllerin, diyet maddesi veya sağlıklı yaşamı destekleyecek besin maddesi olarak rahatlıkla kullanılabileceğini bildirmiştir (10). Ülkemizde makrofungus biyota yönelik çalışmaların son zamanlarda artmasına karşın makrofungusların medikal etkileri üzerine çok az çalışma bulunmaktadır. Bu konuya bilimsel anlamda ilgilenilmesine gerek vardır. Bu çalışma bazı önemli makrofungusların antimikrobiyal aktiviteleri ve diğer tıbbi etkileri üzerine daha önce yapılmış olan çalışmaların derlemesi niteliğindedir.

15 4 2.GENEL BİLGİLER 2.1. DÜNYADA MANTAR ÜRETİMİ Dünya da yenilebilir 5000 mantar türü vardır. Bunlardan yaklaşık 30 türün ticari ve endüstriyel alanda üretimi yapılmaktadır. Doğal mantarların bazı türleri kültüre alınmışken (Agaricus bisporus, Pleurotus sp., Lentinus edodes, Flammulina velutipes.), diğer türlerin üzerinde çalışmalar (özellikle mikorizalı mantarlar) halen devam etmekte ve bu türler yaygın olarak doğadan toplanarak tüketilmektedir. Günümüzde dünyada yaygın ticari olarak yetiştirilen mantar türleri Tablo 1 de verilmiştir (11). Tablo 1 de görüldüğü gibi dünyada en yaygın üretilen mantar türü Agaricus bisporus tur. Bu tür Türkiye de yaygın olarak yetiştirilen ve satışa sunulan beyaz şapkalı kültür mantarıdır. Agaricus bisporus ABD ve Avrupa da yaygın olarak yetiştirilirken, özellikle Pleurotus spp. (kayın mantarları) ve Lentinus edodes (Japon mantarı) türleri Uzakdoğu ülkelerinde yaygın bir şekilde yetiştirilmektedir. Son yıllarda dünya genelinde tıbbi mantar yetiştiriciliği ki bunlar Lentinus edodes, Grifolia frondosa, Tremella fuciformis, Schizophyllum commune, Trametes versicolor, Inonotus obliquus, ve Flammulina velutipes, hızla artmaktadır. Bu mantarlar kanser tedavisinde etkili, bağışıklık sistemini güçlendirmekte ve AIDS tedavisinde kullanılmaktadır. Ayrıca mantarların organik olarak kolayca yetiştirilebilmesi mantarın önemini artırmaktadır (11). Son 40 yılda, dünya mantar üretimi sürekli artmıştır (Sekil 1). Dünya mantar üretiminde Çin en basta yer alırken onu sırayla Amerika, Hollanda, Fransa, Polonya, İspanya takip etmektedir (Sekil 2) (12).

16 5 Tablo 1. Dünya kültür mantarı üretiminin türlere göre oransal dağılımı (11). TÜR ÜRETİM % Agaricus bisporus Pleurotus spp Auricularia spp Lentinus edodes (Shiitake) Volveriella volvacae Flammulina velutipes Tremella fuciformis Hericium erinaceus Pholita nameko Hypsizigus marmoreus Grifolia frondosa (Maitake) Diğerleri Toplam ÜRETİM(TON) Dünya Amerika YILLAR Şekil 1. Dünya ve A.B.D de mantar üretimi (12).

17 6 Diğerleri 25% A.B.D 12% Hollanda 8,10% Fransa 5,30% Polo onya 3,70% İspany ya 3,60% % Çin 42,30% Fransa Polonya İspanya Çin Diğerleri A.B.D Hollanda Şekil 2. Toplam dünya üretimi (12) MAKROFUNGUSLARIN ANTİMİKROBİYALL AKTİVİTELERİ Klinikte enfeksiyonlara karşı antibiyotikler kullanılmaktadır. Bunların esas etkilerii patojen mikroorganizmaların faaliyetlerinin engellenmesi üzerine olsa da, bu uygulamadan bazı yararlı mikroorganizmalar da etkilenmektedir. Ayrıca antibiyotiklerin sıkça kullanımı patojen mikroorganizmaların direnç kazanmasına ve antibiyotiklerin etkilerininn giderek azalmasınaa neden olmaktadır. Kontrolsüzz kullanılan ilaç ve antibiyotikler, canlının sindirim sistemindee mevcut mikrofloradam a ki dengeyi bozmaktaa ve birçok organda rahatsızlıklaraa neden olmaktadır. Bugün yeterince önem gösterilmesee de funguslardan da birçok ilaçç ve penisilin, griseofulvin gibii antibiyotikler, ergot alkolodi ve siklosporin elde edilmektedir. Günümüzde 8000 den fazla antibiyotik bilinmektee ve her yıl yüzlerce yeni antibiyotik buna b ilave edilmektedir. Ancak araştırmalar Streptomyces, Penicillium ve Bacilluss cinslerinee ait türler üzerindee yoğunlaşmıstır. Bazı araştırıcılar ise yeni antibiyotiklerinn keşfi için diğer mikroorganizma gruplarını da incelemektedir (13).

18 7 Dünya nüfusunun giderek artması, beslenme ve sağlıkla ilgili sorunları da artırmıştır. Günümüzde bilim ve teknolojideki büyük ilerlemelere rağmen, doğal kaynakların bilinçsizce tüketimi ve karşılaşılan ekonomik güçlükler, doğal kaynakların çok amaçlı kullanılmalarını zorunlu kılmıştır. Diğer taraftan enfeksiyöz hastalıklarla mücadelede bugüne kadar geliştirilen doğal ve sentetik antibiyotiklerin, mikropların direnç kazanmaları sonucu etkisiz kalmaları ve çeşitli yan etkilerinin bulunması, tıp ilmini yeni ve değişik antimikrobiyal maddeler keşfetmek için doğaya yöneltmiştir. Doğal kaynaklar bakımından oldukça zengin olan ülkemizde sahip olduğumuz en önemli değerlerden birisi de halkımızın tükettiği doğal bir besin durumunda olan makrofunguslardır (14). Son yıllarda bulaşıcı hastalıkların tedavisinde kullanılan birbirinden farksız ticari antimikrobiyal ilaçlara ve çok yönlü droglara dirençli insan patojeni mikroorganizmalar gelişmektedir. Bilim adamları alışılmamış olan çeşitli antimikrobiyal kemoterapik ajanların kaynaklarından yeni antimikrobiyal maddeler bulmak için çaba sarfetmektedirler (15). Günümüze değin yapılan bilimsel araştırmalar sonucu bazı makrofungus türlerinin antibakteriyal, antifungal, antiviral ve antiprotozoal özellik gösteren çeşitli kimyasal bileşiklere sahip oldukları belirlenmiştir. Organizma yaşadığı ortamda varlığını sürdürebilmek ve çevresindeki rekabetçi türlere üstünlük sağlayabilmek için bu tür kimyasallara ihtiyaç duymaktadır. Bu kimyasalların etki düzeyleri zayıf veya kuvvetli olabilmektedir fakat henüz eczanelerde makrofunguslardan izole edilerek satışa sunulmuş herhangi bir antibiyotik özellikli ilaç bulunmamaktadır. Kullanılan antibiyotiklerin pek çoğu mikrofunguslardan ve aktinomisetlerden izole edilerek hazırlanmaktadır (16) Antimikrobiyal etki mekanizması Mikroorganizmaların canlılığı üzerindeki negatif etki, genel olarak antimikrobiyal olarak adlandırılır. Aktivitenin derecesi, mikroorganizmaların önemli ölçüde tahribatını gösteren sidal eki ve çok fazla tahribat olmadan mikrobiyal gelişimin inhibisyonunu gösteren statik ifadesiyle birbirinden ayrılır (17). Bakterileri etkileyen aktivite antibakteriyal, ve fungusları etkileyen aktivite antimikotik olarak bilinmektedir. Antimikrobiyal maddeler farklı yollarla iş görür.

19 8 Bütün bunlar medikal, toksikolojik ve ekolojik temellere dayanarak yeni teknolojilerle geliştirilmelidir (17). Antimikrobiyal ajanlar, mikroorganizmaların yok edilmesini veya gelişimlerinin engellenmesini şu mekanizmalarla gerçekleşir: Hücre duvarının tahribi, Hücre duvarı sentezinin inhibisyonu, Hücre duvar permeabilitesinin değiştirilmesi, Protein ve nükleik asit sentezinin inhibisyonu, Enzim aktivitesinin inhibisyonu (18) Antimikrobiyal aktivite belirleme testleri Mikroorganizmaların antimikrobiyal maddelere duyarlılığın saptanmasında, yaygın olarak kullanılan, başlıca 2 yöntem vardır. 1) Tüp dilüsyon tekniği: Bu teknik antimikrobial ilaçların MİK (minimal inhibitör konsantrasyonunu ) ve MLK (minimal letal konsantrasyonu) değerlerini belirlemede yardımcı olur. Bu amaçla, Mueller-Hinton buyyonunda antimikrobiyal ilacın 2 veya 10 katlı dilüsyonları yapılarak gittikce azalan yoğunlukta ilaç içeren dilüsyonları elde edilir. Örn. ilaç 1 ml'de 256 µg'dan başlayarak, 256, 128, 64, 32, 16, 8,4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.12 µg/ml giderek azalan şekilde iki katlı sulandırılır. Üzerlerine, izole edilen test mikroorganizmanın saatlik sıvı besiyeri kültüründen 0.1 ml. miktarında ekilir ve iyice karıştırıldıktan sonra saat 37 C' de inkube edilir. Tüplerdeki üreme gözle değerlendirilir. Böylece üremenin olmadığı son dilüsyon MİK değeri olarak kabul edilir. Ancak, bu noktanın kesin olması için, testin ikili paralel yapılması uygundur. Eğer, süre yetersiz ise uygun bir süre yine inkubasyonda tutulabilir (19). Üremenin olmadığı bu son dilusyondan alınan 0.1 ml. miktarındaki inokulum 10 ml sıvıbesiyerine (veya agara) ekilerek uygun bir süre inkubasyonda tutulur. Tüpte üremenin olmaması MLK değerini, eğer tüpte üreme varsa MIK değerini yansıtır. Agarda ya bazı koloniler meydana gelecek veya hiç koloni oluşmayacaktır. Koloni oluşursa MİK değerini, oluşmazsa MLK değerini belirler. Ancak, antibiyotik, inokulum

20 9 ile birlikte agar yüzeyine aktarılacağından etkisi devam edebilir ve koloni oluşmayabilir. Bu nedenle broth kültürü daha uygundur (19). 2) Disk difüzyon tekniği: Kirby-Bauer yöntemi olarak da bilinen bu teknikte, test mikroorganizmanın 6-8 saatlik buyyon kültüründen (hafif bulanık) Mueller-Hinton agar plaklarına 0,1-0,2 ml miktarında ekilir ve bir baget'le iyice yayılır (steril swab'ta aynı amaç için kullanılabilir). Agarın yüzeyi oda ısısında kuruduktan sonra (5-10 dk), agarın yüzeyine antimikrobiyal medenin emdirildiği diskler yerleştirilir ve saat inkube edilir. Bu sürenin sonunda diskler etrafındaki inhibisyon zonları kompas veya cetvelle ölçülür ve standart zon tablosu ile karşılaştırılarak duyarlı (S), indermediate (İ) ve duyarsız (R) olarak değerlendirme yapılır (19) Bazı Makrofungusların Antimikrobiyal Etki Tespit Çalışmaları Yamaç ve Bilgili çalışmalarında on farklı makrofungus türüne ait misellerin antimikrobiyal aktivitelerini incelemişler ve sonuçta Clavariadelphus truncatus ve Trametes versicolor un yüksek antibakteriyal etkiye sahip olduklarını belirtmişlerdir (20). Gerasimenya ve arkadaşları Rusya'nın Moskova kenti yakınlarından topladıkları P.ostreatus 'a ait 14 strainin antimikrobiyal aktivite denemelerinde makrofunguslara ait şapka ve misel formlarını kullanmışlar ve sonuç olarak her iki formun etanol ekstrelerinden şapkada orta düzeyde antifungal etkinin miselde ise yüksek düzeyde antibakteriyal etkinin var olduğunu rapor etmişlerdir (21). Efremenkova ve arkadaşları Rusya'nın farklı bölgelerinden topladıkları Coprinus genusuna dahil altı farklı türe ait 14 tür üzerinde antimikrobiyal aktivite çalışması yapmışlardır. Bu çalışmada C. digitalis tüm suşlara ait misellerin etanol ekstreleri test mikroorganizmaları üzerinde denenmiş ve türüne ait misellerin geniş bir antimikrobiyal aktivite gösterdiği ve beta laktam grubu antibiyotiklere dirençli S. aureus (MRSA) ve glikopeptid türü antibiyotiklere dirençli Leuconostoc mesenteroides üzerinde de etkili olduğu rapor edilmiştir (22). Kalyoncu ve arkadaşları bazı yabani makrofungus miselleri üzerine yaptıkları çalışmada miselleri kullanılan 21 tane makrofungus türlerinin çoğunun antimikrobiyal aktiviteye

21 10 sahip olmadığı veya zayıf aktivite gösterdiği saptanmıştır. En yüksek antimikrobiyal aktiviteye sahip tür olarak G.lucidum (Curtis) P. Karst belirlenmiştir. Bu tür test mikroorganizmalarının çoğu üzerinde farklı düzeylerde inhibisyon etkisi göstermiştir. İnhibisyon gösterdiği mikroorganizmalar üzerindeki etkisi standart antibiyotiklerin bazılarından daha iyi, bazılarına ise yakın değerlerdedir (23). Tricholoma terreum (Fr) Kummer den elde edilen ekstrelerin bazı Gram (-) ve Gram (+) bakterilere karsı etkili bir antimikrobiyal aktivite gösterdiğini, fakat kullanılan maya kültürlerine karsı ise antagonistik bir aktiviteye sahip olmadıklarını tespit etmişlerdir (24). Macrolepiota procera makrofungusunden elde edilen çeşitli ekstrelerin Gram (+) ve Gram (-) bakterilere ve bazı mayalara karsı antagonistik etki gösterdiğini belirlemişlerdir. Özellikle E. aerogenes, C. utilis ve Hansenula sp. Üzerine oldukça etkili olduğunu tespit etmişlerdir (25). Demirhan ve arkadaşları çalışmalarında en yüksek antibakteriyal aktiviteyi; E. coli de P. florida nın kloroform çözgeninde 13,33 mm; S. aureus da S. commune nin etil asetat çözgeninde 13, 33 mm ve P. aeruginosa da ise H. leucomelaena nın kloroform çözgeninde ise 14 mm çap olarak saptanmıştır (26). Dülger ve Arslan çalışmalarında Coriolus versicolor (L. ex Fr.) Quel. den hazırlanan tüm ekstrelerin Aeromonas hydrophila, Listeria monocytogenes, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Sarcina lutea, Alcaligenes feacalis, Alcaligenes eutrophus, Citrobacter freundii, Bordatella bronchiseptica ve Xanthomonas campestris bakteri kültürlerine karşı hiçbir antagonistik etkisi bulunmadığını rapor etmişlerdir. E.coli, Enterobacter aerogenes, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium glutamicum, Salmonella thyphi, Salmonella thyphimurium (CCM 5445), Salmonella parathypi B, Klebsiella pneumoniae, Erwinia amylovora, Pseudomonas putida, Pseudomonas extorquens, Pseudomonas fluroscens ve Pseudomonas aeruginosa bakteri kültürlerine karşı ise değişik ekstrelerde mukayese antibiyotiği olarak kullanılan AK 30 (amikasin) un gösterdiği etkiye yakın seviyelerde bir aktivitenin varlığı saptanmıştır. Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium ve S. aureus bakteri kültürlerine karşı kloroform ve etanol ekstresinin mukayese antibiyotiğinden daha etkili olduğu belirlenmiştir. Ayrıca Bacillus brevis, Bacillus sphaericus, Mycobacterium smegmatis,

22 11 Micrococcus luteus, Micrococcus flavus, Micrococcus roseus ve Staphylococcus epidermidis bakteri kültürlerine karşı ise tüm ekstrelerde mukayese antibiyotiğine nazaran oldukça yüksek bir antimikrobiyal aktivitenin varlığını tespit etmişlerdir. Ekstrelerin çalışmada kullanılan maya kültürlerine karşı ise hiçbir antagonistik aktivitesinin bulunmadığını belirtmişlerdir (27). Russula delica Fr. makrofungusundan elde edilen ekstrelerin özellikle başta Corynebacterium xerosis ve Listeria monocytogenes olmak üzere bazı Gram (+) ve (-) bakterilere ve bazı mayalara özellikle Kluyveromyces fragilis karşı bir antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu tespit edilmiştir (28). G. pfeifferi Bres. den üretilen ganomisin olarak adlandırılan terpenoidin methisillin antibiyotiğine dirençli S.aureus ve diğer bakterilerin gelişmelerini inhibe edici etkisi saptanmıştır (29). C. cibarius ve T. anatolicum mantarlarının, dörder çözgen ile yapılan ekstraktlarının üçer deneme sonucunda çalışmada kullanılan bazı Gram pozitif ve Gram negatif bakterilere ve mayaya karşı yeterli antimikrobiyal etki göstermedikleri anlaşılmıştır. Bunun yanı sıra C. cibarius un aseton ekstraktı S. mutans a 10 mm, E. coli ye 7 mm ve L. monocytogenesis e karşı 8 mm inhibisyon zonları oluştururken hekzan ekstraktı aynı bakteriye karşı 5 mm ve T. anatolicum un kloroform ekstraktı S. mutans a karşı 5 mm, aseton ekstraktı E. coli ye karşı 5 mm genişliğinde inhibisyon zonu oluşturarak az da olsa antimikrobiyal etki göstermişlerdir (30). P. linteus un bütanol ekstresi S. aureus un metisillin dirençli tüm suşlarına karşı (MIK, μg/ml) iyi bir antimikrobiyal aktivite göstermiştir (31). Coletto ve arkadaşları, Basidiomycetes türlerinin 34 ünün miselyal ekstraktlarının Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp. Gr. D ve Candida albicans a karşı antimikrobiyal aktivite gösterdiğini tespit etmişlerdir (32). Smania ve arkadaşları Ganoderma applanatum dan izole edilen birkaç triterpenoidin B.cereus, C. diphtheriae, E.coli, P. aeruginosa, S.aureus, Staphylococcus saprophyticus

23 12 ve Streptococcus pyogenes gibi bazı gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı inhibitör etkisini tespit etmişlerdir (33). L. edodes den ekstraksiyonla elde edilen üç çeşit antibakteriyal substansın ağız orijinli Streptococcus, Actinomyces, Lactobacillus, Prevotella ve Porphyromonas cinsleri türlerine karşı etkili oldukları bildirilmiştir (34). Hygrophorus agathosmus (Fr.) Fr. un kloroform ekstraktı disk difüzyon metoduna göre yapılan çalışmada Enterobacter aerogenes (NRRL-B-3567), Salmonella typhimurium (NRRL-B-4440), Staphylococcus epidermidis (NRRL-B-4377), Bacillus subtilis (NRRL-B-558), Saccharomyces cerevisiae (NRRL-Y-2034) ve Suillus collitinus un diklorometan ekstraktı Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (NRRL-B-3567), Salmonella typhimurium (NRRL-B-4440), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (NRRL-B-4377), Bacillus subtilis (NRRL- B-558), Candida albicans (ATCC 10259), Saccharomyces cerevisiae (NRRL-Y- 2034) nin de aralarında bulunduğu mikroorganizmalara karşı iyi derecede antimikrobiyal aktivite göstermişlerdir (20). Clitocybe alexandri (Gill.) Konr. ve Rhizopogon roseolus un çeşitli çözgenlerle hazırlanan ekstraktlarının agar disk difüzyon metodu ile bazı mikroorganizmalar üzerine denendiği bir çalışmada her iki mantarın da metanolik ekstraktları E. coli (15-13mm), B.subtilis (25-18mm) ve E.aerogenes (25-16mm) e karşı antimikrobiyal aktivite göstermiştir. Ayrıca C. alexandri nin etilasetat ekstraktı C.albicans (14mm) ve S.cerevisiae (12mm) mayalarına karşı etkili olduğu bulunmuştur (16). Antimikrobiyal etkinin agar disk difüzyon yöntemi ile yedi gram negatif bakteri, altı gram pozitif bakteri ve bir maya üzerine denendiği bir çalışmada, M.conica nın etanolik ekstraktına karşı en duyarlı bakteri M. flavus (29 mm) olmuştur. S. aureus ATCC ve S. aureus Cowan I e karşı da (13 ve 10 mm) ekstraktın etkili olduğu bulunmuştur. S. aureus un deri hastalıklarına neden olan bir patojendir. Buna göre M. conica belki de deri hastalıklarının tedavisinde kullanılabilir. Bu çalışmada M.conica nın antimikrobiyal özelliğinin ticari droglar kadar etkili olmadığı ortaya çıkmıştır. Fakat belli bir süreden sonra mikroorganizmalar antibiyotiklere karşı direnç kazanmaktadırlar (35).

24 13 Laetiporus sulphureus un antimikrobiyal etkisi agar disk difüzyon yönteminin kullanıldığı diğer bir çalışmada, yedi gram negatif bakteri, altı gram pozitif bakteri ve bir maya üzerine denenmiştir. L. sulphureus Gram negatif bakterilere karşı pek etkili olmazken; aralarında B.subtilis, B.cereus, M.luteus ve M.flavus unda içinde bulunduğu Gram pozitif bakterilere karşı güçlü bir inhibisyon etkisi göstermiştir. Zonların maksimum değerleri mm. olmuştur. Ayrıca C.albicans a karşı da iyi bir antimikrobiyal etki göstererek 21 mm lik bir zon oluşturmuştur (36). R.delica nın antimikrobiyal etkisi, bir başka çalışmada agar disk difüzyon yöntemi ile yedi gram negatif bakteri, altı gram pozitif bakteri ve bir maya üzerine denenmiştir. R. delica Gram negatif bakterilere karşı pek etkili olmazken; M. luteus ve M. flavus unda içinde bulunduğu Gram pozitif bakterilere karşı güçlü bir inhibisyon etkisi göstermiştir. Zonların maksimum değerleri mm. olarak bulunmuştur (37). Agar disk difüzyon metodunun ve çukur difüzyon metodunun kullanıldığı çalışmada Lycoperdon pusillum ve Langermannia gigantea nın metanolik, etanolik ve sulu ekstraktları bazı gram pozitif ve gram negatif bakteriler ile mayalara karşı denendiği bu çalışmada etanolün bu mantarların antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesinde daha iyi sonuçlar verdiği ortaya çıkmıştır. En geniş inhibisyon zonu disk difüzyon metodunda görülmüş ve bu zonu L. pusillum un etanolik ekstraktı E. coli bakterisine karşı verirken (19 mm), aynı mantarın metanolik (12 mm) ve etanolik ekstraktları (15 mm) daha düşük sonuçlar vermiştir. En iyi antifungal aktiviteyi L.gigantea nın etanolik ekstraktı M.boulardil e karşı (17 mm) vermiştir (38). Cantharellus cibarius un çeşitli çözgenleri kullanılarak yapılan bir çalışmada aralarında 44 bakteri ve mayanın bulunduğu mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal etkisi denenmiştir. Sonuç olarak C.cibarius un birçok bakteri ve mayaya karşı çok iyi bir antimikrobiyal etki göstererek bazı antibiyotiklerden dahi daha büyük zonlar elde edilmiştir (39). Cordyceps cinsi makrofunguslar geleneksel Çin tıbbında çok sık kullanılmıştır (40). C.sinensis in antifungal etkiden yoksun olan bir antibakteriyel protein içerdiği rapor edilmiştir (41). C.sinensis ile karşılaştırıldığında C.militaris in protein içeriği hakkındaki bilgi oldukça azdır. Wong ve arkadaşları C. militaris ten elde ettikleri eksrattan antifungal etkiye sahip bir peptit izole etmişlerdir. Peptidin C fraksiyonu