T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

Transkript

1 1 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Sonuç Raporu Proje No: 2011/57 Solunum Yoluyla Transfluthrine Maruz Bırakılan Sıçanlarda Oluşabilecek Biyokimyasal ve Histopatolojik Değişimler Üzerine Ginkgo Bilobanın Etkisi Proje Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Duygu ÇAKIL Fizyoloji ABD Araştırmacılar ve Birimleri Yrd. Doç. Dr. Ufuk TAŞ, Anatomi ABD Doç. Dr. Fatih EKİCİ, Fizyoloji ABD Öğr. Gör. Şeyma ÖZSOY, Fizyoloji ABD Uzm. Bio. Zafer İsmail KARACA, Histoloji ve Embriyoloji ABD Ocak/2013

2 2 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Sonuç Raporu Proje No: 2011/57 Solunum Yoluyla Transfluthrine Maruz Bırakılan Sıçanlarda Oluşabilecek Biyokimyasal ve Histopatolojik Değişimler Üzerine Ginkgo Bilobanın Etkisi Proje Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Duygu ÇAKIL Fizyoloji ABD Araştırmacılar ve Birimleri Yrd. Doç. Dr. Ufuk TAŞ, Anatomi ABD Doç. Dr. Fatih EKİCİ, Fizyoloji ABD Öğr. Gör. Şeyma ÖZSOY, Fizyoloji ABD Uzm. Bio. Zafer İsmail KARACA, Histoloji ve Embriyoloji ABD Ocak/2013

3 3 ÖNSÖZ Bu çalışmada bir insektisit olan transfluthrine maruz bırakılan sıçanlarda akciğer ve beyinlerinde apoptoz ve oksidatif stres üzerine ginkgo bilobanın etkisi araştırıldı. Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fizyoloji, Histoloji ve Biyokimya Anabilim Dalları nda yapmış olduğumuz bu çalışma sürecinde bilgi, birikim ve desteğini esirgemeyen değerli hocalarımız Doç. Dr. Sevil Çaylı, Yrd. Doç. Dr. Erkan Söğüt ve Yrd. Doç. Dr. Ufuk Taş a ve asistan arkadaşlarımıza teşekkürlerimi sunarım. Yrd. Doç. Dr. Duygu Çakıl

4 4 ÖZET* Solunum Yoluyla Transfluthrine Maruz Bırakılan Sıçanlarda Oluşabilecek Biyokimyasal ve Histopatolojik Değişimler Üzerine Ginkgo Bilobanın Etkisi Bu çalışmada ginkgo bilobanın transfluthrinin sıçanlarda beyin ve akciğer üzerine biyokimyasal ve histopatolojik etkisi incelendi. Bu amaçla 28 adet Wistar- Albino cinsi erkek sıçan kontrol grubu, ginkgo biloba (100 mg/kg,ip) grubu, transfluthrin (solunum yoluyla 8 saat/gün), ginkgo biloba + transfluthrin olmak üzere 4 gruba ayrıldı. Deney sonunda hayvanlar derin anestezi altında sakrifiye edilerek akciğer, beyin ve kan örnekleri alındı. Histopatolojik olarak doku örneklerinde apoptoza giden hücre sayımı yapıldı. Biyokimyasal olarak dokularda ve kanda oksidatif stres markırlarının ölçümü yapıldı. Verilerin istatistiksel değerlendirmesi sonucunda, histopatolojik olarak transflutrinin akciğer ve beyinde apoptoza neden olduğu, transfluthrin+ginko biloba verilen grupla transfluthrin grubu karşılaştırıldığında; apoptoza giden hücre sayısının anlamlı olarak azaldığı, biyokimyasal incelemede ise transflutrinin dokularda ve kanda oksidatif stres markırlarını anlamlı derecede artırdığı, ginkgo bilobanın ise bu etkiyi önemli ölçüde önlediği bulunmuştur. Bu sonuçlar, Ginkgo bilobanın phretiroid insektisitlere karşı koruyucu etkisinin olabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Transfluthrin, Ginkgo Biloba, oksidatif stres, apoptoz (*) Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir (Proje No: 2011/57).

5 5 ABSTRACT Effects of Ginkgo Biloba on Biochemical and Histopathological Changes in Rats Exposed to Transfluthrin by Whole Body Inhalation In this study, we investigated the biochemical and histopathological effects of transfluthrin inhalation on brain and lung tissues of rats. For this purpose, 28 Wistaralbino male rats were divided into 4 groups as control, ginkgo biloba (100 mg/kg; i.p), transfluthrin (by inhalation; 8 hours/day), ginkgo biloba + transfluthrin. At the end of the experiment, animals were sacrified under deep anesthesy, lung, brain and blood samples were taken. Histopathologically, apoptotic cells were counted in tissue samples. Biochemically; oxidative stress markers were evaluated in both blood and tissue samples. At the end of the statistical analysis of data; histopathological investigations show that transfluthrin causes apoptosis in lung and brain tissues and ginkgo biloba significantly reduces this damage. Biochemically; oxidative stress markers significantly increase by transfluthrin inhalation and ginkgo biloba decreases this effect. These results show that ginkgo biloba may have a protective effect against prethroid insectisides. Keywords: Transfluthrin, Ginkgo biloba, oxidative stress, apoptozis (*) This study was supported by Gaziosmanpaşa University Scientific Research Projects Commission (Project No: 2011/57).

6 6 İ Ç İ N D E K İ L E R Sayfa ÖNSÖZ... i ÖZET... ii ABSTRACT... iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ... iv TABLOLAR LİSTESİ... vi ŞEKİLLER LİSTESİ... vi KISALTMALAR... vii 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Apotozis Tanım Apoptozisin görüldüğü olaylar Fizyolojik olaylar Patolojik olaylar Apoptozisin başlatılması Hücre dışından kaynaklanan sinyaller Hücre içinden kaynaklanan sinyaller Hücre içi biyokimyasal ve morfolojik değişimler Biyokimyasal değişiklikler Hücre iskeletinin yıkılması DNA kırıklarının oluşturulması Hücre membran değişiklikleri Oksidatif Stres Serbest ve serbest olmayan radikaller Serbest ve serbest olmayan radikallerin oluşumu Serbest ve serbest olmayan radikallerin etkileri Phrethroid insektisitler Phrethroidler ve iyon kanalları Gingko Biloba Farmakolojik etkileri Endikasyonları Kontrendikasyonları Uyarılar/Önlemler Yan etkileri Transfluthrin GEREÇ VE YÖNTEM Deney Grupları Deney Prosedürü Biyokimyasal İşlemler Histopatolojik İşlemler Apoptozisin değerlendirilmesi İstatistiksel Analiz BULGULAR Biyokimyasal Bulgular Akciğer doku bulguları Beyin doku bulguları... 23

7 Serum sonuçları Histopatolojik Bulgular Akciğer doku bulguları Beyin doku bulguları TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR

8 8 TABLOLAR LİSTESİ Sayfa Tablo 4.1. Gruplar arasında akciğer dokularının MDA, GSH-Px, NO, SOD düzeyi karşılaştırılması Tablo 4.2. Gruplar arasında beyin dokularının MDA, GSH-Px, NO, SOD düzeyi karşılaştırması Tablo 4.3. Gruplar arasında serum örneklerinin MDA, GSH-Px, NO, SOD düzeyi karşılaştırması Tablo 4.4. Akciğer dokularında gruplar arasında Tunel yöntemi sonuçlarının karşılaştırması Tablo 4.5. Beyin dokularında gruplar arasında Tunel yöntemi sonuçlarının karşılaştırması ŞEKİLLER LİSTESİ Sayfa Şekil 2.1. Apoptozis mekanizması... 8 Şekil 2.2. Transfluthrin yapısal formülü Şekil 4.1. Akciğer doku örneklerinde gruplar arasında MDA düzeyi karşılaştırması Şekil 4.2: Akciğer doku örneklerinde gruplar arasında GSH-Px düzeyi karşılaştırması Şekil 4.3: Akciğer doku örneklerinde gruplar arasında NO düzeyi karşılaştırması Şekil 4.4: Akciğer doku örneklerinde gruplar arasında SOD düzeyi karşılaştırması Şekil 4.5: Beyin doku örneklerinde gruplar arasında MDA düzeyi karşılaştırması Şekil 4.6: Beyin doku örneklerinde gruplar arasında GFAP düzeyi karşılaştırması Şekil 4.7: Beyin doku örneklerinde gruplar arasında SOD düzeyi karşılaştırması Şekil 4.8: Beyin doku örneklerinde gruplar arasında NO düzeyi karşılaştırması Şekil 4.9: Beyin doku örneklerinde gruplar arasında GSH-Px düzeyi karşılaştırması Şekil 4.10: Serum örneklerinde gruplar arasında MDA düzeyi karşılaştırması Şekil 4.11: Serum örneklerinde gruplar arasında GSHPx düzeyi karşılaştırması Şekil 4.12: Serum örneklerinde gruplar arasında NO düzeyi karşılaştırması Şekil 4.13: Serum örneklerinde gruplar arasında GFAP düzeyi karşılaştırması Şekil 4.14: Serum örneklerinde gruplar arasında GFAP düzeyi karşılaştırması Şekil 4.15: Akciğer doku örneklerinde gruplar arasında Tunel yöntemi ile Apoptotik hücre düzeyi karşılaştırması Şekil Akciğer dokusunda TUNEL yöntemi ile apoptotik hücre gösterilmesi..29 Şekil 4.17: Beyin doku örneklerinde gruplar arasında Tunel yöntemi ile apoptotik hücre düzeyi karşılaştırması Şekil 4.18: Beyin dokusunda TUNEL yöntemi ile apoptotik hücre gösterilmesi... 31

9 9 KISALTMALAR ATP : Adenozin trifosfat Ca : Kalsiyum camp : Siklik adenozin monofosfat CTL : Sitotoksik T lenfositleri DNA : Deoksiribonükleik asit EGB761 : Ginkgo biloba ER : Endoplazmik retikulum FDA : Food and Drug Administration Fe : Demir GABA : Gamma amino butirik asit GFAP : Glial fibrillary acidic protein GSH : Glutathione GSH-Px : Glutatyon peroksidaz H 2 O 2 : Hidrojen peroksit HADYEK : Hayvan deneyleri yerel etik kurulu i.p. : İntraperitoneal K3 : Kaspaz 3 K8 : Kaspaz 8 MDA : Melondialdehit Mg : Magnezyum Na : Sodyum NBT : Nitroblue tetrazdium NNDA : N-naftiletilen diamin NO : Nitrik oksit O2 : Oksijen PBS : Phosphate Buffer Saline RNT : Reaktif nitrojen türleri ROT : Reaktif oksijen türleri SOD : Süperoksit dismutaz TBA : Tiyobarbitürik asit TNFR : Tümör nekroz faktör reseptörü Tunnel : Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Deoxyuridine Triphosphate Nick End Labeling

10 10 1. GİRİŞ VE AMAÇ Pyrethroidler; yüksek etkinlik, düşük toksisite ve kolay biyotransformasyon özelliğine sahip bir insektisit grubudur. Günümüzde ticari olarak çok sayıda sentetik türevleri üretilmekte (allethrin,transfluthrin, esbiothrin,deltamethrin vs), sivrisinek ve böceklerden korunmada hem tarımsal uygulamalarda hem de aerosol, mat, spiral ve sıvı buhar halinde evlerde 40 yıldan uzun süredir yaygın olarak kullanılmaktadır (Tsunode ve ark., 1994). Etkinlikleri değişkenlik göstermekle birlikte tümü voltaja bağlı Na + kanallarının kapanmasını geciktirerek etki gösterir. Bu durum hücre içine Na + girişinin uzamasına, membran potansiyel farkının daha pozitif olmasına ve sonuç olarak nöronlarda tekrarlayıcı deşarjlara yol açar. Pyrethroidler bunun dışında K + kanallarını, Na + /Ca ++ ATPaz ı, Ca ++ /Mg ++ ATPaz ı ve kalmodulini de inhibe ederek nörotoksik etki oluştururlar (Soderlund ve ark., 1989). Memelilerde toksisitesi düşük olmasına rağmen yapılan deneysel çalışmalarda ratlarda burun mukozası, akciğer, karaciğer, lenfoid dokular, timus gibi dokular üzerinde patolojik değişikliklere neden olduğu; yine kanda oksidatif stresi işaret eden enzim düzeylerinde artışa neden olduğu saptanmıştır (Doğruman ve ark., 2000; Ünal ve ark., 2009). Apoptoz çeşitli uyaranlar tarafından başlatılan veya inhibe edilebilen genetik olarak programlanmış aktif yani enerji harcayan bir ölüm programıdır. İskemik strok, travmatik beyin yaralanması ve epileptik nöbet gibi önemli derecede nöronal hücre ölümüne yol açabilen çeşitli akut olaylarda sekonder hasarın fizyopatolojilerinde önemli derecede rol oynar. Apoptotik hücre ölümü, başlatıcı yolaklardan herhangi birinin tetiklenmesi ve bunların uygulayıcı apoptotik yolağı harekete geçirmesi sonucunda oluşur. Yapılan çalışmalar bu yolakların kaspaz-aracılı olan ve olmayan yolaklar diye iki ana grup altında toplanabileceğini göstermiştir (Liou ve ark., 2003). Bunların içinde sistein proteazlar ailesinden olan kaspazların birçoğunun özellikle kaspaz 3 (K3) ve kaspaz 8 (K8) in apoptozis sürecinde önemli başlatıcı veya uygulayıcılar olarak görev yaptıkları birçok çalışmada gösterilmiştir (Burguillos ve ark., 2011). Bu iki kaspaz birçok konuda olduğu gibi travmatik beyin yaralanmasında da çalışılan ve en iyi karakterize edilen iki kaspazdır (Dressler ve Vemuganti, 2009). Ginkgo Biloba ekstresi (EGB761) özellikle nörodejeneratif hastalıklarda tedaviye destek amaçlı olarak kullanılan bir bitki ekstresidir. Bu maddenin serbest radikallerin ve oksidatif hasarın neden olduğu bozuklukların tedavisindeki rolü birçok çalışmanın konusu olmuştur. EGB761 çok yönlü bir etki mekanizmasına sahiptir. Birçok invivo ve invitro çalışmada serbest radikal yakalayıcı etkinliği gösterilmiştir (Smith ve Luo, 2004), aynı zamanda antioksidan enzim aktivitesini de artırarak hücredeki redoks durumunu stabilize eder (Ahlemeyer ve Krieglstein, 2003). Bu etkileri ile süperoksit radikallerinin başlıca hedeflerinden olan mitokondriyi ve buradaki ATP, sitokrom C oksidaz ve GSH gibi enzim üretimini de stabilize eder (Shi ve ark., 2009). Mitokondriyel membran stabilizasyonu sonucu apoptozom oluşumunu bloklayarak, antiapoptotik gen transkripsiyonunu artırarak apoptozisi de azalttığı gösterilmiştir. Tüm bu mekanizmalar sonucunda EGB761 hücre koruyucu etkileri ile öne çıkmaktadır. Bu çalışmanın amacı; transfluthrinin solunum havasına uzun süre uygulanmasının sıçanlarda oksidatif stres, akciğer ve beyin hücrelerinde apoptozis gibi nörotoksik etkili değişiklikleri saptayıp ve bu değişiklikler üzerine Ginkgo biloba ekstresinin etkisini azaltıp azaltmadığını araştırmaktır. Bu şekilde; tarımda ve evlerde çok yaygın kullanım alanları olan bu insektisit grubunun oluşturabileceği toksik etkilere dikkat çekmeyi ve eğer bu etkiler üzerine EGB761 in koruyucu potansiyeli olduğu ispatlanırsa güncel spesifik bir tedavisi olmayan bu duruma yeni bir tedavi yaklaşımı

11 11 ortaya koymayı hedefledik. Bu çalışmada FDA tarafından onay alınmış bir ilaç kullanıldığı için insektisitlerin oluşturduğu oksidatif stres, karaciğer enzim bozuklukları veya nörotoksikasyon üzerine oluşabilecek olumlu etkiler ispatlandığında, bu tip toksikasyon durumlarında hemen kullanıma girebileceği için daha da önem arz etmektedir.

12 12 2. GENEL BİLGİLER 2.1. APOPTOZİS Tanım Apoptozis, eski Yunanca apo (ayrı) ve ptosis (düşmek) kelimelerinin birleşmesiyle oluşan ve Homeros tarafından sonbaharda yaprak dökümünü tanımlamak için kullanılmış bir sözcüktür. Bu nedenle bazı hücrelerin sonbahar yaprakları gibi adeta kuruyarak vücudu terketmesi ve arkadan gelen hücrelere yer açmasıyla gerçekleşen hücre ölüm tipi, klasik Yunan tarihçisi olan James Cormack ın önerisiyle "apoptoz" olarak adlandırılmıştır (Öniz, 2004). Apoptozis, gelişmiş organizmalarda hücrelerarası ilişkilerin gereği olarak artık gereksinim duyulmayan ve fonksiyonları bozulan hücrelerin çevreye zarar vermeden ortadan kaldırılmasını sağlayan genetik olarak kontrol edilen bir olaydır. Ayrıca bu olayın gelişmekte olan omurgalı ve omurgasız canlıların yanı sıra bitkilerde de meydana geldiği görülmüştür (Öktem ve ark., 2001). Embriyonik dönemden başlamak suretiyle tüm yaşam boyunca apoptotik mekanizma mevcuttur. Bazı hücreler yıllarca yaşarken, bazıları ise sadece birkaç saat yaşarlar. Örneğin; bağırsak hücreleri 3-5 günlük bir yaşam süresini takiben ölürken, derinin epidermal hücreleri günlük bir süre sonunda ölmektedirler. Tüm bu ölümler fizyolojik şartlarda meydana geldiği için fizyolojik hücre ölümü olarak da adlandırılır (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). İlk önceleri hücre ölümünün sadece fizyolojik formu olduğu düşünülmesine rağmen bugün patolojik hücre ölümüne de aracılık ettiği bilinmektedir. Programlanmış hücre ölümü, hücre intiharı, hücre kaybı ve fizyolojik hücre ölümü apoptozis ile aynı anlamda kullanılan terimlerdir (Öktem ve ark., 2001). Hücre proliferasyonu nasıl ki mitoz ile belirlenmekte ise belirli bir dokuda olması gereken hücre sayısı da apoptozis ile belirlenir. Apoptozis, mitozisden 20 kat daha hızlı gerçekleşmektedir. Mitozis (yapım) ve apoptozis (yıkım) dokuda sürekli bir denge halindedir. Normal apoptotik hücre ölümü ve yerine yeni hücre yapımının günde yaklaşık hücreyi bulduğu hesaplanmıştır. Bu dengenin apoptozisin lehine veya aleyhine bozulması birçok önemli hastalığın patogenezine katkıda bulunur. Görüldüğü gibi apoptozis mekanizması, organizmada doğru bir şekilde işlemelidir. Olmaması gerekirken gerçekleşen, hızlanmış veya tam tersine yavaşlamış apoptozis organizma için tehlikelidir. Apoptozisin gereksiz yere oluştuğu veya hızlandığı süreçlere örnek olarak AIDS, nörodejeneratif hastalıklar, insilüne bağımlı diyabet, hepatit C enfeksiyonu gibi hastalıklar verilebilirken; apoptozisin yavaşladığı hastalıklara ise otoimmün hastalıklar ve kanser örnek olarak gösterilebilir (Öztürk, 2002; Cohen, 1993; Friedlander, 2003) Apoptozisin görüldüğü olaylar Fizyolojik olaylar 1. Embriyogenez ve fötogenez sırasında normal gelişimin sağlanabilmesi amacıyla oluşmuş olan hücrelerin bir kısmı apoptozise gitmektedir. El ve ayak parmaklarının arası başlangıçta kapalıyken parmaklar arasındaki hücreler apoptoz ile yıkılarak parmaklar ayrılır (Öztürk, 2002). 2. İmmün sistemin çok önemli hücreleri olan T lenfositler, timusta olgunlaşırlar. Bu hücrelerin etkisiz olanları veya organizmanın kendi dokularına karşı reaksiyon verme potansiyeli taşıyanları kan dolaşımına girmeden önce apoptozisle ortadan kaldırılır (Öztürk, 2002). 3. Sinir sisteminde sinapsların oluşumu sırasında bazı nöronlar apoptozisle ortamdan

13 13 uzaklaştırılır (Liu ve ark., 1997). 4. İnce bağırsaklardaki kriptaların tabanlarında oluşan yeni hücreler, kriptaların uçlarına doğru göç ederler ve bu göç sonunda ölerek bağırsak boşluğuna dökülürler (Öztürk, 2002). 5. Derinin keratinositleri, derinin bazal tabakasında oluştuktan sonra derinin üst tabakasına doğru göç ederler. Bu göç esnasında derinin her tabakasında çeşitli farklılaşma özellikleri gösterip en sonunda derinin organizmayı dış etmenlerden koruyucu ölü tabakasını oluşturmak üzere apoptozise giderler (Öztürk, 2002). 6. Erişkinlerde hormon yetersizliğine bağlı olarak oluşan organların işlevlerinin azalmasında apoptozis rol oynamaktadır. Örnek olarak laktasyon sonrası meme bezlerinde gerileme ve menapozda ovaryum foliküllerinin atrezisi (dejenerasyonu) verilebilir (Öktem ve ark., 2001). 7. Menstruasyon esnasında uterusun iç duvarındaki hücreler ölürler ve menstruasyon kanı ile uzaklaştırılırlar böylece uterusun iç tabakası olan endometrium apoptozis ile dökülerek uzaklaştırılır (Öztürk, 2002). 8. Yaşlılıkta apoptozis izlenmektedir (Parlakpınar ve ark., 2004) Patolojik olaylar 1. Virüslerle enfekte olmuş veya kalıcı DNA hasarı oluşmuş hücreler, sıklıkla apoptozis yoluyla kendilerini öldürürler. Eğer bu hücreler, apoptozise gidemezse ileride kanser gelişimine neden olabilirler (Roseborough ve ark., 2006). 2. Tümörlerde hem büyüme hem de gerileme aşamasında hücre ölümü gözlenmektedir (kemoterapi, radyoterapi, hormon tedavisi) (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). 3. Çeşitli zedeleyici etkenlere (ısı, radyasyon, antikanser ilaçları, hipoksi vb.) bağlı olarak hücre ölümü oluşmaktadır (Carloni ve ark., 2006) Apoptozisin başlatılması (Sinyal üretimi) Hücrenin apoptozise gidebilmesi için ilgili genetik mekanizmayı hareketegeçirecek hücre içi veya hücre dışı bir sinyale ihtiyaç vardır (Erdoğan ve Uzaslan, 2003) Hücre Dışından Kaynaklanan Sinyaller a) Çevresel yaşam sinyallerinin ve büyüme faktörlerinin yetersizliği: Hücreler çevrehücrelerden ve ekstraselüler matriksden gelen yaşam sinyallerine ve büyüme faktörlerine ihtiyaç duyarlar. Bu sinyaller düzenli bir şekilde ve yeterli miktarda olmazsa hücreler apoptozise giderler. Çevreden gelen sinyallerin kesilmesi ile hücre ölümü başlamaktadır. Büyüme faktörlerine bağımlı hücre kültürlerinde büyüme faktörleri çekildiği zaman hücrelerin metabolizmalarında ani bozulmalar ve hücre siklusunda duraklama olduğu gözlenmiştir (sitokin, büyüme hormonları) (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). b) Ölüm reseptörlerinin aktivasyonu: Bazı sitokinler hücre membranında bulunan reseptörlere bağlanarak ölüm programını harekete geçiren sinyaller üretebilirler. Apoptozisde rol alan membran proteinleri içinde en önemli grup tümör nekroz faktör reseptörü (TNFR) ailesidir. Bu reseptörlerin biyolojik etkileri çeşitlidir ve apoptozis ile sınırlı değildir. Bir kısmı apoptozis oluştururken bir kısmı proliferasyona (hücrelerin kontrolsüz olarak çoğalması) neden olur. Bir kısmı da her ikisinde görev alır. TNFR içinde apopitoz oluşturan reseptörlerden en önemlileri Fas ve TNFR1` dir. Bu reseptörler uyarıldıklarında, hücrenin sitoplazmasında bulunan parçaları adaptör proteinlere bağlanır. Adaptör proteinlerin ölüm efektör parçaları vardır. Bunlar da

14 14 apoptozis için başlatıcı olan kaspazlara bağlanırlar (prokaspaz 8) (Matsushita ve ark., 2000). c) Sitotoksik T lenfosit aracılığıyla gerçekleşeı apoptozis: Sitotoksik T lenfositler (CTL) infekte olmuş konakçı hücrelerin yüzeyinde bulunan yabancı antijenleri tanırlar. CTL lerin ana görevi malign veya virüs ile infekte olmuş olan hücrelerin öldürülmesidir. Yabancı antijenleri tanıdıklarında yüzeylerinde Fas ligand oluşur. Hedef hücrelerin Fas reseptörlerine tutunurlar. CTL ler sitoplazmalarında granzim B (serin proteaz) ve perforin adı verilen apoptozis oluşmasını sağlayan proteinler içeren sitoplazmik granüllere sahiptirler. Perforin, transmembran por oluşturucu proteindir. CTL ler hedef hücrelerin membranlarında perforin ile porlar oluşturarak granzim B salgılarlar. Granzim B hedef hücrelere giderek kaspazları aktive eder (Öniz, 2004; Erdoğan ve Uzaslan, 2003; Matsushita ve ark., 2000). d) Hücrelerin maruz kaldığı dış etkenler: Hipoksi, ısı, antikanser ilaçlar, radyasyon, gamma ve ultraviyole ışınlar gibi etkenler apoptozise neden olabilirler. Bu etkenler DNA hasarı oluşturarak apoptozis meydana getirirler (Roseborough ve ark., 2006) Hücre İçinden Kaynaklanan Sinyaller a) DNA hasarı: Hücrede herhangi bir nedenle (radyasyon, kemoterapi) DNA hasarı oluştuğunda eğer hasar onarılabilecek düzeyde ise hücre siklusu G1 fazında durdurulur ve hücreye DNA sını tamir edebilmesi için zaman kazandırır. Eğer DNA hasarı tamir edilemeyecek kadar büyükse bu durumda aktive olan bazı genler, hücrenin apoptozisine neden olabilir. Bu genlerden en önemlisi p53 genidir (Schuler ve Gren, 2001). Tümör baskılayıcı bir gen olan p53 geninin insan tümörlerinde %80 mutasyona uğradığı tespit edilmiştir. Normalde inaktif durumda bulunan p53 geni DNA hasarı oluştuğunda aktifleşerek p21 genini harekete geçirir. p21 geni hücrenin geç G1 fazında kalarak, S fazına geçmesini engeller. Böylece hücrenin siklusu durdurularak oluşmuş olan DNA hasarlı hücrenin çoğalması engellenmiş olur. p53 geni DNA tamiri yapan proteinlerin transkripsiyonunu sağlar. Bu proteinler DNA hasarını tamir edebilirse hücre siklusundaki blok kalkar (Schuler ve Gren, 2001). Hücre hasarının tamiri başarılı olmazsa p53 geni bax proteinini (bcl-2 grubu proteinlerinden, pro-apoptotik) aktive ederek mitokondri aracılığı ile hücrenin apoptozise giderek ölmesini sağlar. Böylece DNA hasarlı hücre ortadan kaldırılmış olur (Roseborough ve ark., 2006; Schuler ve Gren, 2001). b) Hücre içi kalsiyum (Ca ++ ) düzeyi artışı: Apoptotik süreç boyunca hücre içine sürekli kalsiyum girişi olur. Sitoplazmadaki Ca ++ iyonu miktarındaki hafif artış c- myc, ısı şok proteinlerini harekete geçirir ve hücrenin apoptozise gitmesine neden olur. camp ve protein kinazlar üzerinden sinyal iletimini etkiler. Hücre içi camp konsantrasyonundaki artışın çeşitli hücre tiplerinde apoptozisi uyardığı gözlenmiştir. Ca ++ dan bağımsız olarak da apoptozisin gerçekleşebileceği gösterilmiştir. Sitoplazmada artan Ca ++, inaktif durumdaki Ca ++ bağımlı proteazları ve nükleazları aktifleştirerek sitoplazmik proteinlerin parçalanmasına ve apoptozise özgü internükleozomal DNA kırıklarının oluşmasına neden olur (Berliocchi ve ark., 2005). Kalsiyum iyonları hücre içinde eşit oranda dağılmamıştır. Endoplazmik retikulum içinde sitoplazmadan daha fazla Ca ++ iyonu mevcuttur. Endoplazmik retikulumda yüksek Ca ++ iyonu olmasını sağlayan ve sitoplazmadan Ca ++ taşıyan Ca ++ -ATPaz pompasının inhibe edilmesi durumunda, sitoplazmada Ca ++ yoğunluğunun artması ile

15 15 hücrenin apoptozise gittiği gözlenmiştir (Öktem ve ark., 2001; Erdoğan ve Uzaslan, 2003). Endoplazmik retikulum aracılığıyla gerçekleşen apoptozis mitokondrial/sitokrom-c ve ölüm reseptörleri aracılığıyla gerçekleşen apoptozisden farklı bir yoldur. ER, hücre içi kalsiyum dengesi, sentezi ve membran proteinlerinin katlanmasını içeren birçok süreçte kritik öneme sahiptir. Kaspaz-12, ER membranında lokalize olan ve ER aracılığıyla gerçekleşen apoptozis için esas teşkil eden bir kaspazdır. Son çalışmalar Ca ++ seviyelerinin ve kalpainin ER u etkilemesi ile prokaspaz-12 aktiflenir. Ayrıca kaspaz-7 nin salınımı ile prokaspaz-12 salınımı arasında bir bağlantı olduğu bulunmuştur. Aktifleşmiş kaspaz-12 sitoplazmaya yönelir, kaspaz-9 ile aktifleşerek kaspaz kaskadını aktive eder. Son çalışmalar, in-vitro ve invivo olarak kaspaz-12 nin kaspaz-9 u aktive ettiğini göstermiştir. Ca ++ iyonu, inaktif durumdaki endonükleaz, proteaz, transglutamaz, fosfolipaz gibi gizli enzimleri aktive ederek apoptozise neden olur (Berliocchi ve ark., 2005). Kalsiyuma bağlı endonükleazlar: Endonükleazlar sitoplazmada artan Ca ++ tarafından aktif hale getirilir. DNA zinciri, H1 histon bölgesinden baz çifti ve katları uzunluğunda parçalara ayrılır (Berliocchi ve ark., 2005). Transglutamazlar: Apoptozisde hücreler büzüşür ve küçük parçalara ayrılır. Bu parçalar, transglutamazların yaptığı protein çapraz bağlanmaları ile kimyasal maddelere karşı dayanıklı hale getirilir (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). Proteazlar: Proteazlar histonları ve kromatin yapısını düzenleyen proteinleri parçalarlar. Kalsiyum bağımlı nötral bir proteaz olan kalpin hücrenin iskelet yapısını bozar. Lizozomal bir proteaz olan katepsin-d apoptozisin geç evresinde ortaya çıkan bir endopeptidazdır ve lizozomların proteolitik aktivitesinin oluşumunda önemlidir (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). Lipid modifiye edici enzimler: Normal hücrelerin plazma membranlarında fosfolipid asimetrisi vardır (Membran fosfolipidlerinin hücre içi ve dışında kalan kısımları farklıdır). Bu asimetri ATP ye bağımlı fosfolipid translokaz enzimi tarafından sağlanır. Apoptotik süreç oluştuğunda bu enzim etkilenir ve zar asimetrisi bozulur. Makrofajlar hücreyi yabancı bir hücre olarak algılar ve fagosite ederler (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). Protein kinazlar: Protein fosforilasyonunda rol oynayan zar ve sitoplazma enzimlerinin apoptotik sinyallerin iletiminde önemli oldukları kanıtlanmıştır. Bu enzimlerden protein kinaz-a apoptozisi sağlarken, protein kinaz-c apoptozisi durdurur (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). Şekil 1. Apoptozis mekanizması

16 Hücre içi biyokimyasal ve morfolojik değişimler Apoptozis klasik hücre ölüm şekli olarak bilinen nekrozisten birçok özelliği açısından oldukça farklı olan bir hücre ölüm mekanizmasıdır. Organizma sürekli bir denge halindedir. Yeni hücreler sentez edilirken, varolan hücrelerin bir kısmı hücre ölümü ile ortadan kalkmakta ve böylece denge sağlanmaktadır (Çetin ve Özçelik, 2007) Biyokimyasal Değişiklikler Sonlandırıcı kaspazlar aktive olduktan sonra sitoplazmada ve çekirdek içinde hedef proteinleri yıkarlar (Çetin ve Özçelik, 2007) Hücre iskeletinin yıkılması Kaspazlar, aktive olmasıyla hücre iskeletinin ana bileşenlerinden olan aktini yıkan proteinin aktif hale gelmesini sağlar. Böylece hücre normal şeklini kaybeder. Hücrenin komşu hücrelerle bağları kesilir. Hücre yüzeyindeki mikrovillüslerin diğer hücrelerle yaptıkları özel bağlar ortadan kalkar, hücre yüzeyi yuvarlaklaşır (Çetin ve Özçelik, 2007) DNA kırıklarının oluşturulması Hedef proteinlerden bir tanesi DNA endonükleaz ile bağ yapan bir proteindir. Kaspazlar bu proteini yıkarak endonükleazı serbestleştirirler. Çekirdek içine giren Ca ++ - Mg ++ bağımlı endonükleaz, DNA kırıkları oluşturur. Kırıklar nükleozomların arasından mono veya oligonükleozomal olarak meydana gelir. 180 baz çifti ve katları şeklinde kırılmalar oluşur (Berliocchi ve ark., 2005) Hücre membran değişiklikleri Kaspazların etkisiyle hücre zarının asimetrisi bozulur. Sağlıklı hücrelerde plazma zarının iç yüzünde bulunan fosfatidilserin yer değiştirerek zarın dış yüzüne yerleşir. Bu değişim fagositik hücreler için sinyal görevi görür. Transglutaminaz aktivasyonu ile membran proteinlerinde oluşan çapraz bağlanmalar, membranların parçalanmasını ve apoptotik cisimlerin oluşmasını sağlar (Budihardjo ve ark., 1999) Morfolojik değişiklikler Hücreler özelleşmiş yapılarını ve diğer hücrelerle olan temas yüzeylerini kaybederler. Böylece hücreler su kaybederek küçülüp, büzüşürler. Sitoplazmanın yoğunlaştığı ve organellerin birbirine yaklaştığı gözlenir. Membranlar bütünlüklerini korurlar. Organeller ise genelde sağlamdır, bazen ribozomlarda çökme izlenebilir. Sitoplazmada yüzeye paralel olarak yerleşmiş olan mikroflament kümeleşmeleri ve endoplazmik retikulumda geçici genişlemeler görülür. Bu genişlemelerin sitoplazmadaki suyun endoplazmik retikuluma geçmesi ile oluştuğu sanılmaktadır. Genişleyen sisternalar hücrenin yüzeyi ile birleşerek yüzeyde krater manzarası oluştururlar ancak mitokondriler genellikle normal yapılarını korurlar (Çetin ve Özçelik, 2007). Morfolojik olarak en önemli değişiklikler nükleusta izlenir. Kromatin çekirdek membranına yakın kısımlarda yoğunlaşarak değişik şekil ve büyüklükte çöker. Elektron mikroskobundaki incelemede kromatinin yoğun granüler yarımay, hilal veya yüzük şeklinde çekirdek membranının iç yüzünde yerleştiği gözlenir. Çekirdekte hücre

17 17 gibibüzüşür ve bazen membranla sarılı olarak birkaç parçaya ayrılabilir. Nükleer porlar kromatinin membrana komşu olmadığı bölgelerde yoğunlaşırlar (Öniz, 2004) Apoptozis ve Fagositoz Ölüm mekanizması nasıl olursa olsun, ölü hücrelerin ortadan kaldırılması gerekmektedir. Gerek nekroz gerekse apoptozisde ölü hücre fagositozla ortadan kaldırılır (Majno ve Jorıs, 1995). Oluşan apoptotik hücreler, hücreler arası alana dağılırlar veya lümene dökülürler. Dokuda 4-9 saat tanınabilir halde kalan apoptotik hücreler daha sonra fagozomlar içinde birkaç saat kadar görülebilir, sonra da sindirilemeyen materyal olarak kalırlar. Apoptotik cisimlerin makrofajlar tarafından tanınması, normalde hücre zarının iç membranda yer alan fosfatidilserinin apoptotik mekanizmayla birlikte hücre zarının dış kısmına çıkmasıyla olur. Ayrıca bu olayda fibronektin benzeri bir serum proteini olan ve doku hücrelerinin birbirine bağlanmasını kolaylaştırdığı bilinen vitronektin reseptörünün rol oynadığı belirlenmiştir. Apoptotik cisimlerin makrofajlarca tanınmasında rol oynayan diğer reseptörler; trombospondin reseptörleri olan αvb ve CD-36 ile Fas reseptörüdür. Trombospondin, trombositler tarafından sentezlenen ve hücre içi granüllerde depolanan bir glikoprotein olup, trombosit bağlanmasında otokrin büyüme düzenleyicisi olarak işlev görmektedir. Trombospondine trombosit dışında epitelyum hücrelerinin ekstraselüler matrikslerinde, düz kas hücrelerinde ve fibroblastlarda da rastlamak mümkündür. Fakat bu hücrelerdeki fonksiyonu bilinmemektedir. Fas, tümör nekroz edici faktör (TNF) ve sinir büyüme faktörü (NGF) ile yapısal benzerlik gösteren bir hücre yüzeyi proteini olup, apoptozisin başlamasında rol oynar. Apoptotik hücrenin tanınmasında lektinin de rolü olabilir (Erdoğan ve Uzaslan, 2003). Apoptozisde izlenen hücre zar değişiklikleri, apoptotik hücre zarındaki bu moleküller aracılığı ile makrofajlara ve çevre hücrelere iletilerek hücrenin fagositozuna yol açar (Majno ve Jorıs, 1995) OKSİDATİF STRES Oksijen insanın hayatta kalması için hayati bir bileşendir. Oksijen doğada istikrarlı bir üçlü radikal (3O2) olarak bulunur. Solunduğunda, aşamalı bir indirgeme işleminden geçirilir ve sonuçta su ile metabolize edilir. Bu süreçte, küçük bir miktar süperoksit anyon radikalleri (O2-), hidroksil radikalleri (OH), nitrik oksit (NO) gibi reaktif aracılar ve hidrojen peroksit (H2O2) ve tekli oksijen (1O2) gibi, serbest olmayan radikal türleri oluşturulur. Bu reaktif aracılara topluca reaktif oksijen türleri (ROT) veya reaktif nitrojen türleri (RNT) denir. ROT ve RNT ler serbest radikal reaksiyonlar oluşturarak moleküler destrüksiyonlara yol açabilirler. H2O2, 1O2 ve tekli oksijen (ozon) serbest radikaller değildir ama canlı organizmada kolayca serbest radikal reaksiyonlarına yol açabilirler. İnsan organizması ROT ve RNT ile indüklenen oksidatif strese yani oksijenin toksisitesine karşı kendisini korumak için etkili bir savunma sistemine ve enzimatik sistemlere sahiptir. Bu antioksidan sistem olarak adlandırılır. Ancak, bu antioksidan sistem muhtemelen reaktif oksijen (ROT) ve nitrojen türlerinin (RNS) aşırı üretiminin olduğu patolojik durumlarda yetersiz kalabilir ve bu durum oksidatif stress olarak adlandırılır (Aruoma, 1998; Gülçin ve ark., 2002).

18 Serbest ve Serbest Olmayan Radikaller Serbest ve serbest omayan radikallerin oluşumu Serbest radikaller, dış orbitalinde bir veya birden fazla elektron içeren molekül veya molekül parçalarıdır. Bir atom veya molekül, bir elektron vererek (oksidasyon) veya alarak (indirgenme) serbest radikal haline gelebilir (Southorn ve Powis, 1988). Biyolojik sistemler; normal koşullarda içerdikleri O2 nin büyük bölümünü tetravalan olarak indirgerler. Bu işlem için mitokondrilerdeki sitokrom oksidaz benzeri sistemleri kullanırlar. Normal koşullar içerisinde nadiren kullanılan, ancak bazı patolojik olaylarda artan univalan indirgeme ile değişik reaktivitelere sahip serbest radikalller oluşur. Bir, iki veya üç elektronun O2 ile reaksiyona girmesi sonucu sırasıyla; süperoksit radikali (O2-), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (OH-) meydana gelir. H2O2 serbest radikal değildir. Ancak hidroksil radikaline dönüşür. Lipid, protein ve DNA molekülleri ile reaksiyona giren hidroksil radikali ise oldukça toksik bir yapıya sahiptir (Ikeda ve Long, 1990). Bu indirgenme mitokondrial solunum zincirinin ilk basamağında oluşur. Ekstramitokondrial reaksiyonlarda ise hipoksantin ve ksantinin, ksantin oksidaz tarafından ürik asite okside edildikleri reaksiyonda serbest radikaller oluşmaktadır. Bu reaksiyon iskemi ve yeniden kanlanma esnasında serbest radikallerin başlıca oluşum şeklidir. Çünkü iskemi esnasında hipoksantin ve ksantin birikimi olmakta ve Ca2+ yükselmesi de ksantin dehidrogenazı ksantin oksidaza çeviren proteazları aktive etmektedir (Schmidley, 1990) Serbest ve serbest olmayan radikallerin etkileri Hidroksil radikali son derece toksik bir yapıdır ve komşu lipid, protein ve DNA molekülleri ile reaksiyona girer. Hidroksil radikali, oksijen radikali ve H2O2 nin oluşturduğu kimyasal reaksiyonda oluşur. Bu reaksiyona Haber-Weiss reaksiyonu adı verilmektedir. Bu reaksiyon doğal durumda çok yavaş olurken demir tarafından katalize edildiğinde hızlanmakta ve böylece hidroksil radikali oluşumu hızla artmaktadır (Ikeda ve Long, 1990). Normal şartlar altında taşıyıcı proteinlerine (ferritin ve transferrin) sıkı şekilde bağlı olan Fe3+, oksijen radikali varlığında ferritinden, asidoz varlığında da transferinden ayrılır (Ikeda ve Long, 1990; Schmidley, 1990). Serbest radikaller kimyasal olarak güçlü reaktif moleküllerdir. Hücrenin savunma mekanizmaları ile ortadan kaldırılamazlarsa serbest radikal olmayan bir molekülle reaksiyona girerek yeni serbest radikallerin oluştuğu zincirleme bir reaksiyonu başlatırlar. Serbest radikallerin patolojik etkisiyle iki yoldan hücre hasarı gelişir; 1-Lipidlerin peroksidasyonu ile hücre zarının geçirgenliği bozulur, 2-Oluşan serbest radikaller çevrelerindeki zincirleme reaksiyonun yayılmasıyla daha uzaklardaki biyolojik moleküllerle reaksiyona girerek hasar oluşturur. Reaksiyona girdikleri biyolojik moleküller arasında, plazma membranı, hücre organellerinde bulunan doymamış yağ asitleri, çeşitli enzimlerin yapısına giren proteinler, karbonhidratlar ve çeşitli sentez ve genetik kod aktarımını yöneten nükleik asitler yer alır (Ikeda ve Long, 1990; Schmidley, 1990). Serbest radikallerin oluşturduğu patolojik süreç; lipid peroksidasyonuna yol açarak hücre membranının geçirgenliğinin bozulmasına yol açar. Bu süreç sonucunda oluşan zincirleme reaksiyonlar ile hücrenin organelleri içerisinde bulunan doymamış yağ asitleri, bazı proteinler, karbonhidratlar ve nükleik asitlerde hasar görürler (Schmidley, 1990).

19 19 Lipid peroksidasyonu, lipid hidroperoksitlerinin aldehit ve diğer karbonil bileşiklerine dönüşmesi ile sona erer. Peroksidasyon, membranın lipid yapısındaki değişiklikler nedeni ile zar işlevinin bozulması, oluşan serbest O2 radikallerinin hücrenin diğer bileşenlerine etkisi ile vasküler geçirgenlikte artma, enflamasyon, ödem, kemotaksis ile sekonder hücre hasarına yol açar. Lipid peroksidasyon son ürün olarak malonildialdehid (MDA) meydana getirir. MDA hücre zarından kolayca geçer ve hücre içinde Schiff bazlarıyla birleşerek, lipofuksin şeklinde sitoplazma içinde toplanır. Hücre kültürlerinde yapılan çalışmalar, MDA nın genotoksik ve mutajenik etkileri olduğunu ortaya koymuştur (Schmidley, 1990) PYRETHROİD İNSEKTİSİTLER Tarım ilaçlarının böcek öldürücü türlerine insektisit adı verilir. İnsektisitler tarım ilaçlarının en yaygın kullanılan grubunu oluştururlar. İnsektisitlerin büyük çoğunluğu nörotoksik etkiye sahiptirler ve etkilerini böceklerin sinir sisteminde hasar oluşturarak gösterirler. Piretrinler; Chrysanthemum cinerariaefolium bitkisi ve akraba türlerinden elde edilen esterlerdir. Doğal piretrinler yüksek toksik etkiye sahiptirler, ultraviyole ışık, gün ışığı, asit ve bazlar tarafından kolaylıkla bozulurlar. Bu doğal formların yerini 1945 li yıllardan sonra daha ucuza mal olan ve daha stabil organik klorlu, organik fosforlu ve karbamatlı insektisitler almıştır. Ancak 1970 lerden itibaren organik klorlu, organik fosforlu ve karbamatlı insektisitlerin, hedef canlılar dışında memeliler, kuşlar ve balıklara da zarar vermeleri nedeniyle piretrinler yeniden kullanılmaya başlanmıştır. Doğal piretrinlerin yapılarının kolayca bozulması ve maliyetlerinin yüksek olması nedeniyle, doğal formların yapısında bulunan karbon, hidrojen ve oksijen moleküllerine azot, sülfür, halojen grupları eklenerek etkileri ve stabiliteleri arttırılmış ve sentetik piretrinler elde edilmiştir. Bu sentetik piretrinlerin türevlerine pyretroidler adı verilir (Casida ve ark., 1983; Valentine, 1990; Elliot, 1980; Verschoyle ve Aldridge, 1980). Memeliler için toksik etkilerinin az olması nedeniyle pyrethroid insektisitler tarımsal savaşımda, veterinerlikte ve halk sağlığında yaygın olarak kullanılmaktadır (Casida ve ark., 1983; Hossain ve ark., 2001). Pyrethroidler iki büyük gruba ayrılarak incelenebilir. Tip I pyrethroidler (alletrin, permethrin, piretrin) alfa cyano grubu içermeyen pyrethroid esterleridir. Tip II pyrethroidler (deltametrin, cypermethrin) ise alfa cyano grubu içerirler. Tip I pyrethroidler canlılarda hareketsiz kalma, koordinasyon bozukluğu, aşırı yorgunluk, felç olma, agresif davranışlar ve tüm vücutta tremora yol açarlar Tip II pyrethroidler ise hiperaktivite, tükrük salgısında artma, kontrolsüz davranışlar, kasılma ve titreme nöbetlerine yol açar (Gray, 1985; Narahashi, 1985; Vijverberg ve De Weille, 1985) Pyrethroidler ve İyon Kanalları Pyrethroid insektisitler etkilerini Na + kanallarını etkileyerek gösterirler. Membranı depolarize ederek sodyum akımını arttırırlar (Narahashi, 1985; Narahashi, 1996). Tip I pyrethroidler sodyum kanallarının ms düzeyinde açık kalmasına neden olurken, Tip II pyrethroidler Na + kanallarının saniyeler düzeyinde açık kalmasına yol açarlar (Ecobichon ve ark., 1990). Pyrethroidlerin diğer etki yerlerinden birinin kalsiyum kanalları olduğu bildirilmiştir. Tip II esterlerinin yüksek konsantrasyonlarda memeli beyinlerindeki GABA kapılı klorür kanallarını da etkilediği bildirilmiştir. Ancak diğer bazı çalışmalarda pyrethroid insektisitlerin GABA için antagonistik aktiviteye sahip olmadığı gösterilmiştir. Sinir dokusunda voltaj duyarlı kalsiyum

20 20 bağımsız klorür kanalları hücre eksitabilitisini kontrol eden kanallardandır ve bunların çeşitli tipleri vardır. Pyrethroid esterleri bunlardan maxi-chlorid kanal tipine duyarlıdır. Klorür iyon akımında pyrethroidlerin yol açtığı azalma hücre eksitabilitisinde artışla sonuçlanır. Bu etki sodyumun etkisi ile sinerji gösterir. Sadece Tip II esterleri klorür kanallarını etkilemektedir (Casida, 1983; Gordon ve Amdur, 1991; Lawrance ve Casida, 1983). 2.4.GİNKGO (GİNKGO BİLOBA, GİNGOBİL TABLET) : Bir film tablet etken madde olarak 9.6 mg. Ginkgo özütleri içerecek şekilde standardize edilmiş 40 mg. Ginkgo biloba yaprakları kuru ekstresi ve boyar madde olarak Titan Dioksit, sarı demir oksit içerir Farmakolojik etkileri: Gingobilde bulunan özel Ginkgo biloba ekstresi ile aşağıdaki farmakolojik etkiler çalışmalarda ispatlanmıştır. Özellikle beyin dokusunda olmak üzere hipoksiye töleransta artış, travmatik veya toksik nedenlerle oluşan beyin ödeminin gelişmesinde inhibisyon ve regresyonun hızlanması retina ödeminin ve retina hücrelerinde lezyonların azalması, hipokampusta kolin alınımında düzelmeyle birlikte muskarinerjik kolin reseptörleri ve alfa 2-adrenoseptörlerin yaşa bağlı azalmasının inhibisyonu, hafıza performansının ve öğrenme kapasitesinin gelişmesi, özellikle mikrosirkulatuvar alanda olmak üzere kan akımının düzelmesi kanın akışkanlık özelliklerinin iyileşmesi, toksik oksijen radikallerinin inaktivasyonu,paf antagonizmi ve nöroprotektif etki. Gingobil karbonhidrat metabolizması üzerinde olumsuz etkisi olmadığından diabetli hastalar tarafından da kullanılabilir Endikasyonları: Organik beyin sendromuna bağlı olarak gelişen serebral performans bozukluklarının (major semptom olarak görülen demans sendromlarının genel tedavisi çerçevesinde) semptomatik tedavisinde; Hafıza zayıflığı, konsantrasyon bozukluğu, ruhsal uyum bozuklukları, baş dönmesi, kulak çınlaması ve başağrısı. Primer hedef grup, primer dejeneratif demans, vasküler demans ve her ikisinin miks formlarındaki demans sendromları olan hastalardır. Periferik arteriyel okluzif hastalıklarda Fontain stage II (intermittan kladikasyo) de ağrısız yürüme mesafesinin iyileştirilmesi. Vasküler veya involüsyona bağlı vertigo ve kulak çınlaması Kontrendikasyonları: Bileşimindeki maddelerden herhangi birine karşı önceden oluşmuş aşırı duyarlılık durumlarında kullanılmamalıdır Uyarılar/ Önlemler: Serebral endikasyonlarda Gingobil ile tedaviye başlamadan önce, patolojik semptonların spesifik bir tedavi gerektiren herhangi bir nedene bağlı olup olmadığı belirlenmelidir. Gebelerde kullanılması önerilmez Yan etkileri: Çok sayıda hastada hafif gastrointestinal rahatsızlık, başağrısı, alerjik deri reaksiyonları gözlenmiştir.

21 TRANSFLUTHRİN Transfluthrin [(1R,3S) 3 - (2,2-Dichlorovinyl) - 2,2-dimethyl -1- cyclopropanecarboxylic acid (2,3,5,6- tetrafluorophenyl) methyl ester] düşük kalıcılığa sahip hızlı etkili pyrethroid insektisittir. C15H12Cl2F4O2 bu moleküler formülüne sahiptir. Transfluthrin yavaş uygulama hızıyla son derece etkili bir phrethroiddir. Sinekler, sivrisinekler ve hamamböceğine karşı kapalı bir ortamda kullanılabilir. Bu nispeten uçucu bir maddedir, temas ve inhalasyon ajanı olarak etki eder. Zehirlenme septomlarında deri ve gözde tahriş, yorgunluk, başağısı, ishal, kusma, baş dönmesi, bulantı görülebilir (Anonim). Şekil 2. Transfluthrin yapısal formülü

22 22 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER Çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı Laboratuarı nda gerçekleştirlildi. Çalışmaya başlamadan önce Gaziosmanpaşa Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu nun onayı alındı (2011-HADYEK- 030 numaralı karar). Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonunun 2011/57 numaralı kararı ile desteklendi. Çalışmada, gr ağırlığında Wistar-Albino cinsi 28 adet erkek sıçan kullanıldı. Deney sürecinde sıçanlar sabit ısılı bir odada (22 ± 3 C), 12 saat aydınlık 12 saat karanlık döngüsüne maruz bırakıldı, sınırsız yiyecek ve içme suyu sağlandı DENEY GRUPLARI Sıçanlar dört gruba ayrıldı; GRUP 1 (Kontrol, n=7): 4 hafta süreyle serum fizyolojik (i.p) uygulan grup. GRUP 2 (Ginkgo Biloba (100 mg/kg, i.p), n=7): 4 hafta günde tek doz Ginkgo Biloba (100 mg/kg, i.p) uygulan grup. GRUP 3 (Trasfluthrin (Solunum yoluyla, 8 saat/gün), n=7): 4 hafta günde 8 saat süreyle kapalı bir ortamda transfluthrin uygulan grup. GRUP 4 (Trasfluthrin (Solunum yoluyla, 8 saat/gün) + Ginkgo Biloba (100 mg/kg, i.p), n=7): 4 hafta günde 8 saat süreyle kapalı bir ortamda transfluthrin uygulan ve bu süre içerisinde günde tek doz Ginkgo Biloba (100 mg/kg, i.p) uygulan grup DENEY PROSEDÜRÜ Deney grupları 4. haftanın sonunda tüm hayvanlara i.p olarak verilen 30 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg ksilazin ile sağlanan derin anestezi altında sakrifiye edildi. Tüm hayvanlardan intrakardiyak kan ve doku (beyin, akciğer) örnekleri alınarak biyokimyasal analiz için derin dondurucuya (-80 0 C) konuldu. Alınan örneklerden oksitatif stres markerları olan nitrik oksit (NO), malondialdehit (MDA) seviyeleri ile, superoksid dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktiviteleri ayrıca beyinde glial asidik fibriler protein (GFAP) düzeyleri incelendi. Sol beyin ve akciğer %10 luk formalin içine konarak tespit edildi. Aynı tespit solüsyonu içinde bir hafta süreyle postfiksasyona tabi tutulduktan sonra rutin histolojik işlemlerden geçirilip dokular parafine bloklandı. Bloklanan dokulardan Rotary mikrotom (Leica RM 2135, Leica Instruments, Nussloch, Germany) ile 5 µm kalınlığında ince kesitler alındı. Örneklenerek seçilen kesitler jelatin kaplı lamlara alındı ve 8 saat süreyle 60 o C deki etüvde bekletildi. Beyinde hipokampus ve striatum bölgelerinde ve akciğer hücrelerinde apoptotik hücreler Tunnel yöntemi (In situ Cell Death Detection Kit, Roche) ile boyanarak apoptotik indeksleri hesaplandı ve nöronal hasar değerlendirildi BİYOKİMYASAL İŞLEMLER Sıçanlardan alınan kan örnekleri yaklaşık otuz dakika pıhtılaşmaya bırakıldıktan sonra on beş dakika kadar santrifüj edilerek (+4 C 0, 1000 g) serumları ayrıştırıldı. Daha sonra ependorf tüplerine ayrılan serumlar analiz edilene kadar C de saklandı. Sıçanlardan alınan akciğer ve beyin doku örnekleri soğuk muhafazalı tutularak 5 ml distile su içerisinde homojenaratör (Ultra Turrax IKA TI8 basic) kullanılarak homojenanizasyon yapıldı. Elde edilen homojenattan süpernatan elde etmek için 3 ml alınıp propilen tüpe konularak 4000 g devirde 30 dak santrifüj edildi. Ayrılan serumlardan ve beyin doku örneklerinden hazırlanan homojenattan Rat GFAP ve MDA ELISA Kit (Uscn Life Science Inc, USA) kullanılarak GFAP ve MDA

23 23 düzeyleri, SOD ve GSHPx Cayman Chemical Assay kit (Cayman, USA) kullanılarak da SOD ve GSHPx seviyeleri üretici firmanın talimatları doğrultusunda ölçüldü. Akciğer dokusundan hazırlanan homojenizasyonda MDA, NO, SOD, GSHPx seviyeleri ölçüldü. Doku protein düzeylerinin ölçümü Lowry yöntemi ile yapıldı (Lowry ve ark., 1951). Akciğer dokusunda SOD aktivitesi düzeyi, Sun ve arkadaşlarının yöntemine göre tespit edildi (Sun ve ark., 1988). Bu yöntemde SOD aktivitesi, ksantin/ ksantin oksidaz sistemi ile üretilen süperoksitin nitroblue tetrazoliumu (NBT) indirgemesi esasına dayanır. Meydana gelen süperoksit radikalleri NBT yi indirgeyerek renkli formazon oluşturur. Oluşan kompleks spektrofotometrede (Cintra 10e) 560 nm de maksimum absorbans verir. Akciğer dokusunda GSH-Px aktivitesi, Paglia ve arkadaşlarının yöntemine göre ölçüldü (Paglia ve ark., 1967). GSH-Px aktivitesi NADPH ın NADP ye yükseltgenmesi sırasında ki absorbans seviyesinde meydana gelen azalmanın 340 nm de okunmasıyla hesaplanır. Akciğer dokusunda lipid peroksidasyonunun son ürünü olan malonildialdehid (MDA), tiyobarbitürik asit (TBA) ile 90 ºC de reaksiyona girer ve pembe renkli kromojen oluşturur. MDA düzeyinin tayini oluşan pembe renkli bileşiğin 532 nm de spektrofotometrik olarak ölçümü esasına dayanır (Esterbauer ve ark., 1990). Serum, beyin ve akciğer dokularında nitrat miktarı Griess reaksiyonu ile belirlendi (Cortas ve ak., 1990). Tüm grupların total nitrit (nitrit + nitrat) düzeyi modifiye kadmiyum redüksiyon metodu ile tespit edildi. Ph 9.7 glisin tamponunda bakır kaplı kadmiyum granülleri deproteinize numune süpernatantı ile 90 dakkalık inkübasyon sonunda nitrat redüksiyonu sağlandı. Üretilen nitrit düzeyi; sülfanilamid ve buna bağlı N-naftiletilen diamin (NNDA) diazotizasyonuyla reaksiyon sonu oluşan pembe bir rengin 545 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunması ile belirlendi (Cortas ve ak., 1990) HİSTOPATOLOJİK İŞLEMLER Apoptozun değerlendirilmesi Doku örnekleri doku takip kasetlerine alınarak parafin blok haline getirildi. Her parafin bloktan 5 mikron kalınlığında kesitler alındı, kesitler etüvde 60 o C de 8 saat bekletilerek deparafinize edildi. TUNNEL yöntemi (In situ Cell Death Detection Kit; TUNNEL Metodu: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Deoxyuridine Triphosphate Nick End Labeling) için, deparafinize edilen kesitler alkol (%70, %80, %90, %100 ; 5 dk/saat) ve xylen ( dk/saat) serilerinde tutuldu. Daha sonra PBS de 5 dk yıkandıktan sonra 0.1 M, ph 6.0, 200 ml Sitrat buffer da 600 W da 1 dk kaynatıldı. PBS ile iki kez yıkandı ve kurulandı. TUNNEL reaksiyon mixture ile 60 dk 37 o C de bekletilerek, PBS ile tekrar yıkandı ve kurulandı. Conventer-POD (vial-3) de, 30 dakika oda ısısında bekletildi. PBS ile tekrar yıkanarak boyama işlemi Fast Red ile tamamlandı. Işık mikroskopunda en büyük büyütmede (x40) 100 hücre sayıldı. Pozitif boyanan hücre sayısı % olarak belirtildi.

24 3.4. İSTATİSTİKSEL ANALİZLER Biyokimyasal istatistik analizleri, SPSS programı ile yapıldı. Gruplar arası farkların karşılaştırılmasında One way ANOVA testi ve sonrasında Post Hoc testlerinden Tukey HSD ile karşılaştırılmıştır. Sonuçlar ortalama (Mean) ± standart hata (SEM) olarak ifade edildi. p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Histopatolojik istatistik analizleri, SigmaPlot 12 (systat sofware, Inc. Sigma Plot) programı ile yapıldı. Gruplar arası farkların karşılaştırılmasında One way ANOVA testi uygulandı ve sonrasında Post Hoc testlerinden beyin dokuları Tukey HSD ile akciğer dokuları Holm-Sidak metoduyla karşılaştırılmıştır. Sonuçlar ortalama (Mean) ± standart hata (SEM) olarak ifade edildi. p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 24

25 25 4. BULGULAR 4.1. Biyokimyasal Bulgular Akciğer Doku Bulguları Tablo 4.1. Gruplar arasında akciğer dokularının MDA, GSH-Px, NO, SOD düzeyi karşılaştırması MDA (nmol/g GSH-Px (U/g NO (μmol/g SOD (U/g protein) protein) protein) protein) Kontrol 3,98±0,93 3,01±1,62 0,23±0,01 17,78±2,89 Ginkgo Biloba 4,55±0,40 3,19±1,12 0,24±0,02 18,84±2,53 Transfluthrin 4,55±0,40** 2,93±1,15 0,30±0,03** 20,19±2,03 Transfluthrin+ Ginkgo biloba 4,16±0,93 2,82±1,19 0,27±0,06 17,56±2,51 (**): Kontrol grubu ile istatistiksel fark ( p<0,01) MDA 6 MDA (nmol/g protein) Kontrol EGB Transfluthrin Transfluthrin EGB Şekil 4.1: Akciğer doku örneklerinde gruplar arasında MDA düzeyi karşılaştırması. Trasfluthrin grubu, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur ( **p<0,01).