EMBRİYO SEÇİMİNDE İNVAZİV YAKLAŞIMLAR. Yard. Doç. Dr. Evrim ÜNSAL

Transkript

1 EMBRİYO SEÇİMİNDE İNVAZİV YAKLAŞIMLAR Yard. Doç. Dr. Evrim ÜNSAL

2 İnvaziv Embriyo Seçim Yöntemleri Ekspresyon Düzeyinde Seçim Yöntemleri PGD Anöploidi ve Translokasyonlar Tek gen hastalıkları PGS FISH (8-12 Kromozom değerlendirilmesi) Array CGH (24 Kromozom değerlendirilmesi)

3 İnterlökin-I (IL-I) embriyonik implantasyonda rol aldığı gösterilmiş olup bu çalışmada IL-I in başlıca bileşenlerinin ekspresyonunun insan embriyolarında blastomer hücrelerinde gösterilip mrnapatternlerinin biyopsi yapılan embriyoların ileri gelişimi ile kıyaslanması amaçlanmıştır. IL-Ira pozitif embriyoların hiçbiri blastokist aşamasına ulaşamamıştır. IL-Iβ mrna sı hatch olan blastokistlerin %60 ında arrest olanların ise %83.3 ünde eksprese olmuştur. Bu çalışmanın en önemli sonucu tek bir blastomer hücresinde birkaç farklı mrna nın eş zamanlı olarak belirlenmesi teknik olarak mümkün olmuştur.

4 Canlı, arrest, cansız embriyolar immatur, fertilize olmamış yumurtalarda tek hücreden RT-PCR tekniği ile apoptotik markerlara bakılmış ve çalışmanın pek çok bulgusundan biri olarak bazı embriyolarda oluşan fragmentlerin Bax geninin yüksek ölçüde eksprese olduğunu göstermişlerdir.

5 Sci. Transl Med 5,, 172 ra21 (2013) Grubun önceki çalışmalarında BRCA1 geninde germline mutasyonları taşıyan kadınlarda overyan cevabın düşük olduğu, yeni bir çalışmada ise BRCA1 mutasyonu taşıyan kadınların menopoza daha erken girdikleri rapor edilmiştir. Bu çalışma DNA kırıklarının tamirinin oosit rezervinin korunmasında ve yaşlanmayla etkinliğinin düşmesi nedeniyle ovaryen yaşlanmada önemli bir rol oynadığı hipotezi üzerine kurgulanmıştır. Çalışmada 24 kadının GV oositlerinde DNA kırıkları tamir genlerinin (BRCA1-2, MRE11, RAD51) ekspresyonuna bakılmıştır. Tek hücreden gen ekspreyonuna bakılan bu çalışma da ekspresyon düzeyindeki çalışmaların gelişimi bakımından güncel ve önemlidir. Ancak tek hücre biyopsisi yaparak bazı implantasyonda görev alan bileşenlerin incelenerek embriyo seçimi uzak bir yaklaşım olarak görünmektedir.

6 Embriyo Biyopsi Yöntemleri Asit tyrode Zona dissection (mekanik) Lazer Lazer tekniğinin gelişmesiyle embriyonun her aşamasında hücre biyopsisi rahatlıkla Uygulanabilir hale gelmiştir. Eski moda mekanik ve kimyasal yöntemler hala pek çok merkez tarafından uygulanan Etkin yöntemler olarak yerini korumakta.

7 Polar body ler embriyonun ileri gelişiminde işlevsiz olduğundan bu hücrelerin biyopsisinden embriyo etkilenmez Tüm PGD endikasyonlarına uygulanabilir Maternal ve paternal genetik bozukluklar test edilebilir Genetik testlerin uygulanması için zaman tanır Kryoprzervasyon gerektirmez Birden fazla hücreyi inceleme şansı Embriyo hasarlanmasının az olması Daha az lethal kromozomal monozomi ve kaotik anomali gözlenir Mozaisizm (trofoektodermde görülen mozaisizm ihtimali ICM ile aynıdır (Evsikov et al 1998) Düşük ADO oranına sahip olması Sadece maternal genomik bilgi Oositteki mayoz kaynaklı anöploidiler e maternal genetik hastalıklar Yaygın kullanılan bir hücre tipi değil. Birkaç merkez ve legal sınırlamalar ebebiyle bazı ülkeler tercih etmekte. Biyopsi edilen PB ler 3. güne kadar aklanarak embriyonun akıbetinin elirlenmesi üzerine incelemeye lınabilir. 6-8 hücreli embriyodan 1 veya 2 blastomer alınması embriyonik kitllenin >% oranında bir kayba neden olmaktadır. Mozaisizm Hatch olmuş embriyolara uygulanabilmesi nedeniyle incelenen embriyo sayısının azlığı 6 gün transferi ya da dondurma yapılması gerekliliği Blastokist aşamasına gelebilen embriyo sayısının azlığı Genetik testin uygulanabilmesi için sınırlı bir zaman kalması

8 PGT ve Embriyo Gelişimi??? Biyopsi embriyoyu hasarlar mı? Bir veya iki blastomer biyosisi yapılarak PGD uygulanmış IVF bebeklerinde uzun dönem olumsuz etkiler görülüyor mu? Klivaj aşamasındaki embriyonik hücreler farklılaşmış hücreler midir? Farklılaşma tam olarak hangi aşamada olmaktadır Her bir klivaj aşaması blastomerleri eşit gelişim potansiyeline mi sahiptir ya da bazıları embriyonik gelişimde daha önemli bir rol mü oynamaktadır?

9 Semin Reprod Med 2012;30: Erken klivaj embriyolarında bulunan blastomer hücreleri totipotent tir. İnsan embriyolarında dört hücreli bir embriyonun her bir hücresi birer blastokist oluşturabilir (Johnson et al 1995) Herbir blastomerin RNA ları arasında fark olmadığı tespit edilmiştir hücre aşamasındaki blastomerler farklılaşmamış hücreler olup bunlarda 1 ya da 2 hücre almak embriyonun gelişimini etkilemez. Ayrıca yeni bazı çalışmalarla 2 yaş civarındaki PGD bebeklerinin kontrol bebeklerle perinatal bulgularının benzer olduğu ortaya koyulmuştur

10 Polar body ler embriyonun ileri gelişiminde işlevsiz olduğundan bu hücrelerin biyopsisinden embriyo etkilenmez Tüm PGD endikasyonlarına uygulanabilir Maternal ve paternal genetik bozukluklar test edilebilir Genetik testlerin uygulanması için zaman tanır Kryoprzervasyon gerektirmez Birden fazla hücreyi inceleme şansı Embriyo hasarlanmasının az olması Daha az lethal kromozomal monozomi ve kaotik anomali gözlenir Mozaisizm (trofoektodermde görülen mozaisizm ihtimali ICM ile aynıdır (Evsikov et al 1998) Düşük ADO oranına sahip olması Sadece maternal genomik bilgi Oositteki mayoz kaynaklı anöploidiler e maternal genetik hastalıklar Yaygın kullanılan bir hücre tipi değil. Birkaç merkez ve legal sınırlamalar ebebiyle bazı ülkeler tercih etmekte. Biyopsi edilen PB ler 3. güne kadar aklanarak embriyonun akıbetinin elirlenmesi üzerine incelemeye lınabilir. 6-8 hücreli embriyodan 1 veya 2 blastomer alınması embriyonik kitllenin >% oranında bir kayba neden olmaktadır. Mozaisizm Hatch olmuş embriyolara uygulanabilmesi nedeniyle incelenen embriyo sayısının azlığı 6 gün transferi ya da dondurma yapılması gerekliliği Blastokist aşamasına gelebilen embriyo sayısının azlığı Genetik testin uygulanabilmesi için sınırlı bir zaman kalması

11 Blastokist biyopsisi hızlı ve güvenilir PGT metotları geliştiğinde 6. gün fresh embriyo transferlerinin artması ile rutin biyopsi yöntemi olarak kullanılabilir hale gelecektir.

12 Yaş ortalaması 36 olan 119 kadına 127 taze blastokist transfer edilmiş ve implantasyon oranı %41 olarak kaydedilmiştir. 146 blastokist dondurulmuş, 27 si Çözülmüştür ve bu grupta da %26 implantasyon oranı saptanmıştır. Düşük ve ikiz oranının düşük olması, yüksek implantasyon oranı sayesinde tek embriyo transferi için daha uygun olması trofoektoderm biyopsisini ön plana çıkarmaktadır

13 PGD-PGS İnvitro embriyolarda biyopsi yapılmış hücrelere iki farklı sebeple genetik test uygulanmaktadır 1. Ailenin genetik hastalıklı (mendelyan ya da kromozomal bozukluklar) çocuğa sahip olma olasılığı yüksekse (PGD) 2. IVF embriyolarının test edilmesi. (PGS) Bugünkü imkanlarla PGS ile sadece anöploidileri tarayabilmekteyiz. Bazı ya da tüm kromozomlar monozomi, trizomi, tetrazomi ya da pentazomi yönünden kontrol edilip sadece iki kopya kromozom taşıyan öploid embriyolar transfer edilir.

14 Dünya üzerinde pek çok merkez PGS i İleri anne yaşı Tekrarlayan IVF başarısızlıkları Tekrarlayan gebelik kayıpları sebepli olarak önermektedir ASRM, ESHRE ve BFS,FISH tekniği ile yapılan PGS uygulamasının canlı doğum oranlarını arttırmayacağı görüşünde birleşmekteler. Mozaisizm : biyopsi ile alınan hücre embriyonun tümünü yansıtmamaktadır. (özellikle klivaj aşamasındaki embriyo) Sınırlı sayıda kromozomun bakılabilmesi değerlendirilmeyen kromozomlara ait önemli bilgilerin atlanmasına neden olmaktadır. Klivaj aşamasındaki biyopsinin embriyonun canlılığını etkileyebilmektedir Polar body ve trofoektoderm hücreleri kullanıldığında uygulamanın daha az invaziv olduğu görüşü hakim olmuştur.

15 Mikrogen Genetik Tanı Laboratuvarı Sure Hasta Dataları anükleer blastomer, uygun olmayan tüpe koyma amplifikasyon olamama STD: 0.34 STD: 0.15

16 Yeni Nesil Sekanslama Ayrıntılı genetik testler; mikroarray analizi ve tüm-genom sekanslanması Ayrıntılı genetik testlerle embriyo hakkında bidiklerimizde köklü değişiklikler yapacak ve embriyo seçimindeki opsiyonlarımızı arttıracaktır.ancak genetik alanındaki ilerlemeler IVF ile ilgili tekniklerin gelişimi ile sınırlanmaktadır. (Vitrifikasyon ve invitro oosit maturasyonu)

17 Maastrich Üniversitesi nde PGD alanında uzman kişilerin davet edilerek yapıldığı panelde embriyo testinde ileri yaklaşımlarla ilgili dört ana husus konu alınmıştır. 1. Anöploidi taramasının belirli hastalıklar için yapılan PGD uygulamasına eklenip eklenmeyeceği, 2. Aynı anda birden fazla Mendelian hastalığın PGD ve PGS kapsamında bakılabileceği bir tarama yapılma ihtimali, 3. Multifaktöriyel hastalıklar için de embriyo taraması yapma ihtimalimiz olacak mı? 4. Preconception Carrier Testing (PCS) IVF tedavisine alınacak tüm hastalara uygulanmalı mı?

18 İleri anne yaşı Limitasyonlar; Kromozom anomalili olmayan embriyo sayısı son derece sınırlıdır. De novo mutasyonlar Genetik geçişin ebeveynlerin en az birinden geldiği bilinmelidir de vizyona giren GATTACA filminde Özel görevler için yetiştirilen yeni süper insan ırkı yüzünden, normal yollardan dünyaya gelmiş insanlar işsiz kalmakta ve ikinci plana itilmektedir.

19

20 Morfolojik kirterlere göre embriyo seçimi ve PGS ile embriyo seçimini kıyaslamada bazı sınırlamalar vardır. 1. Dondurulmuş çözülmüş embriyoların taze embriyolarla birlikte değerlendirilmesi 2. Embriyo transfer sayısındaki farklılık (Morfolojik seçimle: 2.4 embriyo, PGS ile 1.8 embriyo transferi) 3. Morfolojik seçimle embriyo transfer günü 2-3 iken PGS ile 4-5. gün olması 4. Gruplar arasında farklı stimülasyon protokollerinin uygulanmış olması

21 Klinik IVF te hastaya özgü tedavi planı oluşturmak esastır. PGS yüksek sayıda embriyosu beşin üzerinde tekrarlayan gebelik kayıpları Anöploidi öyküsü olan İleri anne yaşı olgularında (>41) PGS bu hasta grupları için ardışık embriyo skorlaması ile kombine edilerek uygulanmalıdır.

22 Prospektif, randomize olarak eşleştirilmiş kontrollü çalışma.. Blastomer ve trofoektoderm biyopsilerinin embriyoyu hasarlanmasındaki etkileri araştırılmıştır.

23

24 Klivaj transferi: + biyopsi : % biyopsi : %50 Blastokist transferi: + biyopsi : %51 - biyopsi : %54

25 İleri anne yaşı olgularında PGS için en uygun hücre kaynağı hangisidir? Polar body, blastomer, trofoblast. Aynı embriyoya ait polar body, blastomer, trofoblast hücreleri ardışık olarak CGH yöntemiyle taranmıştır.

26

27 İleri anne yaşı olgularında PGS in doğum oranlarını arttırdığı düşünülmektedir. Ancak canlı doğum oranlarındaki etkisini ortaya koyan bir çalışma bulunmamaktadır. Bu durumun iki ana sebebi olabilir; FISH tekniği gibi sitogenetik araştırma metodları az sayıda kromozomların sadece kopya sayısı varyasyonlarını belirleyebilmektedir ve tek hücrelere uygulandığında ciddi miktarda kromozom tanısal hata oranına yol açmaktadır. Hücre aşaması ve kullanılan hücre tipi her zaman embriyonun kromozom kopya sayısını yansıtmamaktadır.

28 Mayotik segregasyon sırasındaki farklı geçişler polar body analizi sonucu farklı tanı koymaya neden olabilir. Bu nedenle her iki polar body nin ardışık değerlendirmesi gerekmektedir. Sadece1. polar body hücrelerinin incelenmesi, ikinci mayoz bölünmedeki dengelenmeler nedeniyle hatalı tanıya neden olabilmektedir. Blastokist aşamasında ciddi oranda dişi mayotik anöploidilerinde düzelme görülmektedir. Mitotik ve erkek kaynaklı anöploidilerin yüksek oranda gözlenmesi Polar body analizindeki limitasyonlardır.

29 3. günde IVF embriyolarının %60 ının en az bir hücresi anormal yapıdadır. Bu embriyoların çoğu mozaik yapıdadır. CGH çalışmaları sonrasında klivaj aşamasındaki embriyoların %30 unda mayotik hatalar bulunduğu yaşındaki kadınlarda blastokist aşamasındaki embriyoların %56 sı kromozom bozukluğu göstermektedir. (ortalama 38 yaş) FISH ve CGH teknikleri birlikte uygulandığında Blastokistlerde görülen anöploidi oranı %58 olarak bulunmuştur. Polar body biyopsisi planlanan hasta gruplarında birinci polar body ile birlikte ikinci polar body nin de test edilmesi gerekmektedir.

30 Aşama I: Oosit ve embriyolar arasındaki karyotipik korelasyon Aşama II: en fazla 2 seçilmiş öploid balstokist transferinin IVF implantasyon potansiyelini ve devam eden gebelik oranlarını ne ölçüde etkiliyor?

31 Tek gen hastalıkları tarama protokolü

32 # OBJ SAYI 1 Toplam vaka sayısı 30 2 Gebelik Gebelik Sonuç bilinmeyen 18 5 ET iptali 4 6 İncelenen Embriyo Normal Homozigot 57 8 Taşıyıcı (Heterozigot) 77 9 Mutant (Homozigot) HLA Uyumlu Embriyo Normal/Taşıyıcı HLA Uyumlu Embryo Transfer 29

33 Prof Dr Volkan Baltacı

34 Msc. Fatma Akyiğit Msc Pelin Çelikkol Bio Mehmet Comart İrfan Atmaca

35 Teşekkürler