MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER-2

Transkript

1 HÜCRE PARÇALAMA YÖNTEMLERİ MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER-2 Moleküler biyolojideki araştırmalar büyük ölçüde saflaştırılmış moleküllerle yapılan analitik çalışmalara dayanmaktadır. En basit hücre bile karmaşık bir yapıya sahiptir ve binlerce farklı çeşitteki moleküllerden oluşur. Bu nedenle öncelikle ilgilenilen molekül grubunu hücredeki diğer kısımlardan moleküllerden ayırmak ve daha sonra da yapılacak çalışmanın amacına göre saflaştırmak gerekir. 1 2 Çalışılacak biyolojik molekül grubunun izolasyonu amacıyla gerçekleştirilen işlemlere ekstraksiyon (özütleme) denir. Ekstraksiyon işlemi; parçalama, ayırma ve saflaştırma aşamalarından oluşur. Daha sonra tam veya kısmen saflaştırılmış makromoleküllerin (nükleik asitler, proteinler) yapısal ve/veya işlevsel analizlerine yönelik çeşitli yöntemler uygulanır. 3 PARÇALAMA (homojenizasyon) YÖNTEMLERİ Bu aşamada çalışılacak molekül grubunu içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilir. Elde edilen karışıma homojenat denir. Hücre yapısı ortadan kalkmış olan homojenatta, serbest ya da organeller içerisindeki, hücre bileşenleri parçalamanın yapıldığı ortamda dağılmış bir süspansiyon halinde bulunur. 4 Hücre parçalama yöntemleri 1. Fiziksel yöntemler a) Mekanik işlemler: Bu yöntemlerin en basit ve ilkel şekli materyali bir havan içinde kumla öğütmektir. Ezerek parçalama daha gelişmiş şekilde, doku veya hücrelerin sıvı azotta (-196 C) ya da -20, -70 C de dondurulduktan sonra soğuk havanlarda yapılır. FİZİKSEL YÖNTEMLER Mekanik Yöntemler Ultrasonifasyon Ozmotik şok Dondurma-çözme KİMYASAL YÖNTEMLER Çözücülerin kullanılması enzimlerin kullanılması Donma sonucu kristal hale geçen yapılar toz haline gelene kadar kolaylıkla parçalanabilmektedir. İşlemin çözünme olmadan kısa sürede bitirilmesi gereklidir. Ezme sırasında alumina, kum ya da cam tozu katılırsa, parçalanma etkinliği artar

2 Günümüzde mekanik olarak parçalamada daha çok homojenizatör denilen aletler kullanılmaktadır. Bunlar: Karıştırıcı tipinde olanlar (blender): Evlerde kullanılanların daha güçlü olanlarıdır. Yüksek hızda dönen bıçaklar yardımıyla biyolojik materyaller kesilerek parçalanır. Bunlar daha çok bitki ve hayvan doku veya organlarının parçalanmasında kullanılır. Bakteri gibi m.o ların parçalanması için uygun değildir. 7 Milli homojenizatör (Ultra turrax): ucunda özel dişleri bulunan metal bir milin çok yüksek devirde döndürülmesi ile parçalama yapar. Dişli kısım parçalanacak materyali içeren tampona daldırılır; motor çalıştırıldığında mil döner ve materyal dişler arasında kesilerek parçalanır. 8 Pistonlu homojenizatörler: Basınç etkisiyle parçalama yapan ve ucunda genellikle teflondan yapılmış bir pistonu bulunan aletlerdir. Basınç uygulaması elle veya motor gücüyle yapılabilir. Fransız basınç hücresi (French pressure cell): Basınç yardımıyla parçalama sağlar. Çelik silindir bir kap, piston ve silindir üzerindeki basıncın giderilmesi için kullanılan bir vanadan oluşur. Sistem gerek biçim gerekse çalışma mekanizması açısından büyük metal bir şırıngaya benzer 9 10 Hücre süspansiyonu silindirik kabın haznesine döküldükten sonra piston arada hava kalmayacak şekilde takılır ve hidrolik basınç motoru ile süspansiyon üzerine basınç (yaklaşık 10 ton/cm2) uygulanır. Basınç istenilen değere ulaşınca vana biraz açılır ve hücre süspansiyonunun damla damla akması sağlanır. Balistik homojenizatörler: dayanıklı cam veya metal bir kap içine konulan hücre süspansiyonu çapları mm arasında değişen cam, plastik veya çelik kürecikler ile birlikte yüksek hızda çalkalanır. Çalkalama sırasında küreciklerin birbirine çarpması ile hücre parçalanması gerçekleşir. Bu yöntem özellikle diğer parçalama yöntemlerine dirençli m.o ların parçalanmasında kullanılır

3 b) Ultrasonikasyon: Bu yöntemin en basit uygulama şekli içerisine cam boncuklar eklenmiş hücre süspansiyonunun vorteks de karıştırılmasıdır. İnsanın duyma sınırının üzerindeki frekanslarda (18 khz üstü) ses dalgaları (ultrases, ultrason) sıvı bir ortamdaki hücrelere uygulandığında parçalanmaya yol açar. Bu uygulama süspansiyondaki su moleküllerinin kinetik enerjilerini arttırır. Basınç farkları çok sayıda mikro hava kabarcığının oluşumuna yol açar. Bu kabarcıklar hızla hareket eder ve bir süre sonra patlayarak yoğun şok dalgaları yaratır. Patlama sırasında ses enerjisinin mekanik parçalama enerjisine dönüşümüyle ortamdaki hücreler (özellikle bakteri hücreleri) parçalanır Ultrasonikatörler elektrik enerjisini kesikli karakterde mekanik enerjiye çevirerek, titanyumdan yapılmış bir prob yardımıyla ultrases dalgalarını solüsyon içindeki materyale iletirler. Mekanik yolla veya ultrasonikasyonla yapılan parçalama sırasında sürtünme nedeniyle açığa çıkan ısıyı yok etmek için işlem kabı soğuk ortamda tutulmalıdır (buz veya sıvı azot) c) Ozmotik şok: Hücrelerin yüksek ozmotik basınçlı bir çözeltiden (örneğin %20 sakkaroz) hipotonik bir ortama (örn su) geçirilmesi ile suyun hücrelerin içine girmesi zarlarda patlamaya yol açar. Bu yöntem hücre duvarı bulunmayan ya da yok edilmiş hücreler için uygundur D) Dondurma-çözme: Hücrelerin çok düşük sıcaklıklarda (-20, -80 C) tutulup sonra yeniden ısıtılarak çözündürülmesi ve bu işlemin birkaç kez tekrarlanması parçalanmaya yol açar. İşlemin temeli, donan su moleküllerinin hacminin genişlemesi ve hücrelerde oluşan buz kristallerinin hücre zarına zarar vererek parçalanmayı sağlamasıdır. 2. Kimyasal yöntemler Çözücülerin kullanılması Bu uygulamaların prensibi: hücre zarındaki bileşiklerin çözündüğü uygun çözücü (solvent) yardımıyla zar yapısının eritilmesidir. Bu amaçla kullanılan; Organik çözücüler (örn, etil asetat, toluen vb) zardaki lipitler çözerek yapıyı bozarlar. Deterjanlar: (sodyum dodesil sülfat) ise uygun ph koşullarında zardaki protein ve lipoproteinlerle etkileşime girerek onları uzaklaştırır. Bazik çözeltiler (ph ) ise hücre duvarının hidrolizini sağlar

4 Enzimlerin kullanılması: Lizozim: bakterilerin peptidoglikan tabakasındaki β-1,4- glikozidik bağları hidroliz etmektedir. Bu enzim, özellikle Gram (+) bakteriler üzerine etkilidir. Gram (-) bakterilerin parçalanması için hücrelerin bir süre EDTA uygulamasında tutulması gerekir. EDTA, lipopolisakkarit moleküllerini birbirine bağlayan Ca +2 iyonlarının ortamdan çekilmesini sağlamakta ve böylece lizozimin içteki peptidoglikan tabakasına ulaşmasını kolaylaştırmaktadır. Ayrıca, tripsin, proteinaz K, gibi proteazlar ve zimoliyaz da (maya hücreleri için) bu amaçla kullanılan enzimlerdir. Enzimatik parçalama genelde mekanik parçalamaya dayanıklı yapılar için uygulanmaktadır Sonuç olarak, kullanılan parçalama yöntemi, amaçlanan çalışmaya, kullanılan biyolojik materyalin tipine (organizma, doku, veya hücre tipine), izole edilecek molekül grubuna, eldeki olanaklara ve kabul edilebilir etkinliğe bağlıdır. Buna göre, fiziksel veya kimyasal yöntemlerden ya da iki tipi de içeren karma yöntemlerden yararlanılabilir. AYIRMA (SEPERASYON), SAFLAŞTIRMA (PÜRİFİKASYON) VE ANALİZ YÖNTEMLERİ Parçalama sonrasında, üzerinde çalışılacak molekül grubunu homojenattaki diğer molekülllerden ayırmaya ve saf bir şekilde elde etmeye yönelik bir seri işlem uygulanır. Homojenattaki zar parçalarını, parçalanmamış doku veya hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ön ayırma işlemlerinden sonra elde edilen ve çalışılacak molekülle birlikte birçok karışıma ham özüt (crude extract) denir. Ham özüt bazı biyokimyasal analizlerde doğrudan kullanılabildiği gibi moleküler biyolojik çalışmalarda ilgilenilen molekül, hedeflenen saflık derecesine göre uygulanan yöntemlerle, ham özütteki diğer moleküllerden ayrılabilir. Bu yöntemler karışımdaki molekül gruplarının çözünme özelliklerine Kitle, yoğunluk elektriksel yük gibi fiziksel özelliklerine Veya diğer moleküllere ilgisine göre (affinite) ayrılmalarını sağlayan işlemleri kapsar Bu tekniklere hazırlayıcı (preparative ) teknikler denir. Hazırlayıcı süreç oldukça fazla miktardaki bir biyolojik materyalin saflaştırılmasına yöneliktir

5 Bu yöntemlerin amacı daha sonraki belirleyici analitik çalışmalar için ilgilenilen moleküllerin elde edilmesidir. Ayırma/saflaştırma işlemlerinden sonra, üzerinde çalışılan molekülün nicel ve/veya nitel analizi yapılabilir. Örn. miktar tayini, alt tiplerinin saptanması, yapısal analiz, aktivite belirlenmesi vb. Bir makromolekülün homojenattan ayrılması, saflaştırılması ve analizi için kullanılan yöntemlerin başlıcaları aşağıda açıklanmaktadır. Çalışmanın biyolojik materyalin çeşidi ve eldeki olanaklara bağlı olarak bu yöntemlerin uygulanma sıraları değişebilir ve aynı zamanda birden çok yöntemden yararlanılabilir. Burada açıklanan yöntemler, uygulamadaki kullanım sıralarından çok dayandıkları temele göre basitten karmaşığa doğru açıklanmıştır Süzme (Filtrasyon) Homojenatin filtre edici bir materyalden geçirilerek, süspansiyonda bulunan partiküllerin sıvı kısımdan ayrılmasıdır. Bu yolla, kullanılan filtre edici materyalin gözeneklerinin çapına göre, filtreden geçen kısımda belli büyüklükte partikül bulunabileceği gibi bunların tamamı da filtrenin üzerinde kalabilir. En çok kullanılan filtre edici materyaller filtre kağıdı, sinterli cam huni, membran (zar) filtrelerdir. Kullanılan sisteme vakum veya basınç uygulanarak süzme işlemi hızlandırılabilir Filtre kağıtları Süzme işleminde kullanılan filtre kağıtları çok çeşitlidir. Homojen por çapına sahip olmayan kaba filtre kağıtlarından, çok duyarlı ayırım yapabilen çeşitli boyutlardaki tiplerine kadar farklı seçeneklerden amaca uygun olanı belirlenebilir. Membran filtreler çok küçük gözenekleri olan polimer yapıdaki filtrelerdir. Biyolojik olarak inert ve çoğunlukla saf selüloz esterlerinden yapılırlar Por çapları nm arasında değişen membran filtreler bulunmaktadır. Bu filtreler en uygun akışkanlık değerine, ilgilenilen molekülün özelliğine ve ağırlığına göre seçilebilir

6 Membran filtrelerin en genel kullanım amaçları: Mikrometre boyutundaki partikülleri ortadan kaldırarak çözeltilerin bulanıklığını yok etmek otoklavlanamayan çözeltilerin sterilizasyonunu sağlamak çok az miktardaki örnekleri toplamak ve biyomolekülleri içeren çözeltileri konsantre etmek Tamponlardaki ve diğer çözeltilerdeki tuz vb küçük molekülleri yok etmektir. Ultrafiltrasyon: Membran filtrelerle yapılan bir filtrasyon uygulamasıdır. Moleküllerin boyut, biçim veya yüklerine göre ayrılmaları sağlanır. Ayırımı yapılacak olan molekülleri içeren solüsyon dışarıdan oluşturulan bir kuvvetle yarı geçirgen bir zarda gecmeye zorlanır. Filtrelerden sıvının geçişini sağlamak için vakum, basınç yada santrifüj kuvveti gerekir Ultrafiltrasyonda kullanılan zarların por çapı genelde 1-20 nm arasında değişir Kullanılacak zarın por çapı çalışılan molekülün geçmesine izin vermeyecek şekilde olmalıdır. NMWC (Nominal Molecular Weight Cut-Off) Zarlara özgü bir değerdir. Zardan geçemeyen bir molekülün ağırlığına eşdeğerdir. Ultrafiltrasyonda kullanılan membran filtrelerin NMWC değerleri genelde arasındadır Bu filtrelerin genellikle iki tabakalı olanları kullanılır; birinci tabaka yüzeyde bulunan, ince ( ɥm) selüloz asetat, naylon veya polivinilidinden yapılmış bir zar, ikinci tabaka daha kalın, inert bir destek tabanıdır. Bu tip filtreler partiküllerin yüzeyde kalmasını sağlar. 35 Ekstraksiyon ve çeşitli saflaştırma aşamalarında elde edilen nükleik asit ve protein çözeltileri daha sonraki aşamalar için genellikle fazla seyreltiktir. Çözücünün yüksek sıcaklıkta uçurulması yoluyla konsantre edilemedikleri için, bu tip çözeltilerin hacimlerini azaltmakta daha nazik ve çok etkili bir yöntem olarak genellikle ultrafiltrasyondan veya liyofilizasyondan yararlanılır. 36 6

7 2. Diyaliz Biyolojik moleküllerin ayırımında kullanılan en eski yöntemlerden biridir. Bu yöntem seyreltik bir çözeltideki moleküllerin boyutlarına göre ayrılması temeline dayanır. Bu yöntemin en genel uygulaması değişik büyüklükteki molekülleri içeren çözeltinin, makromolekülleri geçirmeyen fakat su vb küçük moleküllerin geçişine izin veren, yarı geçirgen bir zardan yapılmış bir diyaliz tüpüne konulup düşük iyonik kuvvette uygun bir tampona (veya saf suya) daldırılması şeklinde gerçekleştirilir Zarların porları genellikle molekül ağırlığı den fazla olan makromoleküllerin geçişine izin vermeyecek kadar küçüktür. Böylece, diyaliz tüpünün içindeki su (ve küçük iyonlar) dışarı çıkarken içeride ayırımı istenen molekülün konsantre bir çözeltisi kalır. Dengeye ulaşıldıktan sonra, eğer dışarıdaki solüsyon taze tamponla değiştirilecek olursa, diyalizin devam etmesiyle tüpün içindeki küçük moleküllerin konsantrasyonundaki azalma devam eder. Böylece istenilen ayırım tamamlanıncaya kadar diyaliz 1-2 gün sürdürülebilir. Küçük moleküllerin çıkışı tüpün içi ile dıştaki tamponun konsantrasyonları eşitleninceye kadar devam eder. Dengeye çalışılan hacme bağlı olarak, genellikle 4-6 saatte ulaşılır. 39 Diyaliz için kullanılan yarı geçirgen zarlar (diyaliz tüpleri) kollodyon, selofan, selüloz gibi çeşitli materyallerden yapılmış, 1-20nm por çapına sahip malzemelerdir. Por çapı zardan geçecek moleküllerin büyüklüğünü belirler. NMWC değeri arasında olan tipleri yaygın olarak kullanılır. 40 Por büyüklüğünün her tarafta eşit olmasını sağlamak ve ağır metallerden ileri gelen kontaminasyonu yok etmek için tüplerin bir ön işlemden geçirilerek hazırlanması gerekir. Ancak böyle bir hazırlığı gerektirmeyen, sadece tampon ile ıslatılarak kullanılan tipleri de vardır. Diyaliz, iyonik olan ve olmayan, tüm küçük molekülleri yok etmek veya çözeltileri konsantre etmek için basit, ucuz ve etkin bir yöntemdir. Genellikle çözeltideki tuzları ve diğer küçük molekülleri ortamdan uzaklaştırmakta kullanılır

8 3. Liyofilizasyon Donmuş durumdaki bir çözücünün vakum altında doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını) sağlayan süblimasyon temeline dayalı bir dondurma tekniğidir. Genellikle yüksek ısıya duyarlı materyallerin kurutulması ya da konsantre edilmesi için en etkin yöntemlerden biridir. Bu yöntemin avantajlarından biri de biyolojik materyallerin saklanma ve taşınmasında sağladığı kolaylıktır. 43 Vakum altında santrifüjleme Bu yöntem bir çok biyolojik örneğin kurutulmasında kullanılabilir. Örnek önce bir organik çözücüde veya suda çözündürülür. Çözücü santrifüjde vakum altında uçurulur ve böylece örneğin tüpün dibinde çökelti halinde kalması sağlanır. Bu yöntem hızlı olması, ön dondurma işlemine gerek olmaması, örneğin tamamının kazanılması ve sudan başka çözücülerin de kullanılabilmesi bakımında liyofilizasyondan daha avantajlıdır Çöktürme Bu yolla ayırma, su veya başka çözücü içeren bir ortamda istenilen ya da istenmeyen moleküllerin çöktürülerek katı halde ayrılması temeline dayanır. Amonyum ve sodyum sülfat proteinleri çöktürmekte kullanılan organik tuzlardır. Nükleik asitler için ise izopropanol ve etanol kullanılır Enzim uygulaması Ayırma işleminde enzim kullanımıyla, örneğin proteinlerin proteazlarla, nükleik asitlerin de nükleazlarla parçalanarak ortamdan uzaklaştırılması mümkündür. 6. Santrifüjleme Bu yöntem santrifüj adı verilen aletler yardımıyla, yüksek hızda döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin davranış temeline dayanır. Makromolekül halindeki bir partikül veya bir hücre organeli yüksek hızda döndürüldüğünde bir santrifüj kuvvetinin etkisinde kalır. Santrifüj kuvveti (F) şu şekilde ifade edilir: F= mω 2 r F=santrifüj kuvveti m= çökelen partikülün kütlesi ω= dönümün açısal hızı (radyan/sn) r= göç eden partiküllerin merkezdeki dönüm eksenine olan uzaklığı (cm)

9 Çökelen bir partikül üzerindeki kuvvet, dönüm hızı ve partikülün dönüm eksenine uzaklığı ile artar. F değerinin, yerçekimi kuvvetiyle (g) ilgili olarak RCF (göreceli yer çekimi kuvveti) kullanılır. RCF= x rpm x r RCF, örneğin dakikadaki dönüm sayısı (rpm) ve çökelen partikülün dönüm eksenine uzaklığı ile değişir. 49 Genellikle ortalama RCF nin hesaplanmasında, santrifüj tüpünün tepesi ile dibi arasındaki uzaklığın ortasındaki değer (rort) kullanılır. RCF, sayısal bağıntı çizelgesinden yararlanılarak hesaplanabilir. RCF değeri x g şeklinde gösterilir (örn: x g) 50 Santrifüjleme biyolojik materyalin hazırlanmasında, moleküllerin izolasyonu ve saflaştırılmasında kullanılan preparatif bir yöntemdir. Bunun yanında saflaştırılmış molekülerin biçim, boyut, yoğunluk gibi özelliklerinin ölçülmesinde de kullanılır Santrifüjler, dönüm sağlayan bir motor ile tüplerin konulduğu bir rotordan oluşur. Düşük devirliden çok karmaşık donanıma sahip ve analitik işlemler yapabilenlere doğru geniş yelpazede çok çeşitli santrifüjler geliştirilmiştir. Düşük hızlı santrifüjler Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde kullanılır. En yüksek hızları dev/dak dır. Genellikle oda sıcaklığında çalışırlar sıcaklık kontrolleri yoktur

10 Yüksek hızlı santrifüjler Daha duyarlı uygulamalar için, yüksek devirli ve ısı kontrollü santrifüjler gereklidir. Sıcaklığı (4 C civarında) ve hızın kontrol altında tutulması, özellikle yüksek sıcaklığa duyarlı biyolojik materyalin santrifüjlenmesi sırasında önemlidir. Yüksek hızda santrifüjlerde başlıca 3 tip rotor kullanılır Sabit açılı Açilan kova Dikey rotorlar Günümüzde rotorlar daha çok karbon-fiber karışımı malzemelerden imal edilmektedir. Bunlar hafif olduklarından hızlanma ve durma süreleri kısadır. Bu santrifüjler içinde en çok kullanılanları orta hızda dönüm yapan mikrosantrifüjlerdir Maksimum hızları genellikle rpm dir ( xg) 57 Biyolojik örneklerin hazırlanmasında orta ya da yüksek hızlı santrifüjlerin kullanımı gereklidir. Bu santrifüjlerle, parçalama sürecinden sonra hücresel atıklar yok edilebildiği gibi hücre organelleri (nukleus, mitokondri,kloroplast gibi) ve kimyasal uygulamalar sonrasında makromoleküller (nükleik asitler, proteinler vb) çöktürülebilir. 58 Ultrasantrifüjler En karmaşık yapılı olan santrifüjlerdir. Ultrasantrifüjlerle çok yüksek devirlere ( rpm) ulaşılabilmesi nedeniyle rotorda yüksek derecede ısı artışı oluşacağından çalışma sırasında cihazın içinin soğutulması ve sürtünmenin engellenmesi için yüksek vakumda tutulması gerekir. Metal rotorların yüksek basınç etkisiyle nadir de olsa parçalanma tehlikesi olduğundan aletin içi çelik tabaka ile kaplidir

11 Ultrasantrifüjler; Santrifüjleme uygulamaları hücre bileşenlerinin ayrılmasında (organel veya moleküllerin) saflaştırılmış moleküllerin analitik ölçümlerinin yapılmasında kullanılır. Örn. saflık derecesi, molekül ağırlığı, yoğunluğu, biçimi, bileşenlerin özellikleri ve oranlarının belirlenmesi gibi. Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi Üzerinde çalışılan örneğin ilk aşamada belli bir süre uygun hızda döndürülmesiyle elde edilen iki ayrı fazda (çökelti ve üst sıvı) preparatif amaçlı olarak daha ileri düzeyde ayırım yapmak üzere hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi kullanılır. Bu santrifüjlemede, kaba çökeltilerden hücre organellerine ve makromoleküllere kadar farklı boyuttaki partiküller birbirinden ayrılır Bu temele dayalı olarak hücre bileşenlerinin daha özgül biçimde ayrılmasını sağlamak üzere farklılığa bağlı (differential) santrifüjleme geliştirilmiştir. Bu yöntemde giderek artan hızlarda ardışık santrifüjleme uygulanır. Santrifüjlemenin başında, tüm partiküller homojen şekilde dağılmıştır. İşlem devam ederken partiküller sedimantasyon derecelerine göre çökerler Diferansiyel santrifüjleme kullanılarak partiküllerin çökelme hızını ifade eden çökelme katsayıları (s) hesaplanabilir. Birimi saniye olan s terimi genellikle standart koşullarda, 20 C de ortam olarak su kullanılarak yapılır. S değeri, biyolojik makromolekülleri ve hücre organellerini sınıflandırmada kullanılan bir özelliktir. Bir molekülün ya da organelin boyutunu (molekül ağırlığı, baz çifti vb) hesaplamakta kullanılır Çökelme katsayıları 1x x10-13 arasında değişir. Sayısal açıdan kolaylık sağlamak için çökelme katsayıları Svedberg birimi (S) ile ifade edilir. 1S= 1x10-13 saniyedir. Yoğunluk derecelenmesi santrifüjleme (density gradient) Örnek yoğunluğu tüpün tepesinden dibine doğru giderek artan akışkan bir ortamda santrifüjlenir. Differansiyel santrifüjlemeden farklı olarak, bu yöntemde değişik boyutttaki partikullerin tek bir santrifüjleme ile ayrılması mümkün olur

12 Bu yöntem biyolojik makromoleküllerin ayrılması ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemle s ölçümü de yapılabilir. Özellikle nükleik asitler bu yöntemlerin kullanımıyla ayrıntılı şekilde araştırılabilmektedir. DNA ve RNA s değerlerine göre sınıflandırılabilir ve DNA nın farklı yapısal biçimleri ayırt edilebilir. Bu yöntem ayrıca, ribozom, mitokondri, kloroplast gibi hücre bileşenlerinin izolasyonu ve saflaştırılmasında da kullanılmaktadır. Yoğunluk derecelenmesinde başlıca 2 yöntem kullanılır: 1. Hız-bölgesel (rate-zonal) santrifüjleme İşlemden önce, otomatik derecelenme karıştırıcısı yardımıyla, sakkaroz veya gliserol gibi küçük molekül ağırlıklı solusyonlarla bir yoğunluk dercelenmesi hazırlanır. Örnek derecelenme tabakasının tepesine yayılır ve tüpler açılan kova tipindeki rotora yerleştirilir. İşlem sırasında partiküller s değerleriyle bağlantılı bir hızda hareket ederler Partiküller bölgeler (zonlar) halinde çökerler ve birbirlerinden ayrılmış olarak kalırlar. İşlem partiküller tüpün dibine ulaşmadan sona erdirilir. Tüpteki değişik bölgeler ayrı ayrı toplanır Eşit yoğunluk (Isopycnic) santrifüjlemesi (denge yoğunluk derecelenmesi-equilibrium-density gradient) Bu yöntemde yoğunluk derecelenmesi işlem sırasında oluşur. Ayırımı yapılacak olan molekülü içeren karışım, Sezyum klorür veya sezyum sülfat gibi ağır metal tuzu çözeltisi içinde çözündürülür. Ultrasantrifüj tüpüne doldurulur ve santrifüjlenir. Santrifüj kuvvetinin etkisi altında, sezyum tuzu tepeden dibe doğru devamlı artan bir yoğunluk derecelenmesi oluşturur. Örnekteki moleküller kendi yoğunluklarına eşdeğer olan yoğunluk bölgelerinde kalırlar. Böylece tüpte bileşenlere ait farklı bölgeler oluşur ve moleküller buradan izole edilip analiz edilebilirler

13 73 13