T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ RİBOZİMLER VE TERAPÖTİK UYGULAMA ALANLARI. Hazırlayan Merve MERAL. Danışman Yrd. Doç. Dr.

Transkript

1 1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ RİBOZİMLER VE TERAPÖTİK UYGULAMA ALANLARI Hazırlayan Merve MERAL Danışman Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU Bitirme Ödevi Haziran 2014 KAYSERİ

2 i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu derlemedeki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kural ve davranışların gerektirdiği gibi, bu derlemenin özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Merve MERAL

3 ii Ribozimler ve Terapötik Uygulama Alanları adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Danışman Merve MERAL Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU Biyokimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İlhan DEMİRHAN ONAY: Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır.. /../ Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

4 iii TEŞEKKÜR Bitirme ödevi çalışmalarımın her aşamasında benden bilgi ve deneyimlerini esirgemeyen, değerli danışmanım Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU na, hayatımın her anında maddi ve manevi destekleri ile yanımda olan aileme ve arkadaşlarıma, üzerimde emeği geçen tüm hocalarıma sonsuz saygılarımı ve teşekkürlerimi sunarım. Merve MERAL, Haziran 2014, KAYSERİ

5 iv RİBOZİMLER VE FARMASÖTİK UYGULAMA ALANLARI Merve MERAL Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi, Haziran 2014 Danışmanı: Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU ÖZET 30 yıl öncesinde, ribozim adı verilen RNA (ribonükleik asit) moleküllerinin kimyasal reaksiyonları katalize edebildiğinin keşfi, biyoloji alanında ciddi bir atılım olmuştur. Bu yıllarda ribozimlerin yüksek özgünlüğü, hedef seçiminin geniş aralığı ve protein translasyonu öncesi etkisi ortaya konulmuştur. Yapay ve doğal ribozimlerin her iki sınıfının da yeni terapötik uygulamalar için potansiyel hedef olarak, hastalıklarla ilgili genleri gerektirmesinin yanı sıra gen fonksiyonunun spesifik supresörü olarak kullanılabileceği de iddia edilmiştir. Ribozimler katalitik aktiviteyle donatılmış şaşırtıcı RNA molekülleridir. Spesifik bir sekanstaki mrna moleküllerini katalitik bir şekilde bölme (parçalama) yeteneğine sahiptirler. Ribozimler hedef mrna ile seçici ligasyon için sekanslar içerirler. Bunlar ribozimlere yüksek özgünlük kazandırır. Bu ribozimler ayrıca hedef mrna ile parçalanma reaksiyonu gerçekleştiren sekanslar da içerir. Ribozimler dizileri tanıyan substratın modifikasyonu ile belirli genlerin supresyonu için spesifik olarak uyarılabilirler. Bununla birlikte, ribozimlerin hedef hücreye iletimini sağlayan dağıtım sistemlerindeki yetersizlikler hala ribozim tabanlı klinik tedavinin gelişmesini engellemektedir. Bu derlemede hedefleme ve gen fonksiyonu çalışmalarında ribozimlerin rolleri, katalitik mekanizmaları, tasarımları, dağıtım stratejileri, potansiyel farmasötik uygulamaları ve sınıflandırılması açıklanmış, yenilikçi nükleik asit bazlı enzimler olan ribozimlerin kullanımının giderek arttığına dair kanıtlardan bahsedilmiştir. Anahtar sözcükler: Nükleik asit enzimleri, Ribozimler, Hammerhead ribozim, Hairpin ribozim

6 v RIBOZYMES AND THERAPEUTIC APPLICATIONS Merve MERAL Erciyes University, Faculty of Pharmacy Graduation Project, June 2014 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Ahmet CUMAOĞLU ABSTRACT The discovery over 30 years ago that RNA molecules called ribozymes are able to catalyze chemical reactions was a breakthrough in biology. Because of their high specificity, wide range of target selection and action before protein translation, the different classes of both natural and artificial ribozymes have been claimed to be used as specific suppressors of gene functions with the additional aim of validating diseaserelated genes as potential targets for new therapeutic interventions. Ribozymes are RNA molecules endowed with catalytic activity and capable of cleaving mrna molecules in a sequence specific, catalytic manner. They contain sequences for selective ligation with target mrnas which confers upon them high specificity. They also contain sequences that perform cleavage reactions with the target mrna. By modifying the substrate recognizing sequences, ribozymes can be specifically tailored for the suppression of particular genes. However, the lack of suitable delivery systems in to target cells still hampers the clinical development of ribozyme-based therapeutics. This review briefly summarizes the ever increasing evidence to the use of ribozymes as innovative nucleic acid-based enzymes along with their classifications, their mechanism in initiating catalytic effect, their design, delivery strategies and their potential pharmaceutical applications and their roles in gene function study and in target validation. Keywords: Nucleic acid enzymes, Ribozymes, Hammerhead ribozyme, Hairpin ribozyme.

7 vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... i KABUL ONAY... ii TEŞEKKÜR... iii ÖZET... iv ABSTRACT... v İÇİNDEKİLER... vi KISALTMALAR... viii ŞEKİLLER VE TABLOLAR LİSTESİ... x 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER RİBOZİMLER RİBOZİMLERİN TARİHSEL GELİŞİMİ RİBOZİMLERİN SINIFLANDIRILMASI Grup I İntronlar Grup II İntronlar Ribonükleaz P Hammerhead (Çekiçbaşlı) Ribozim Hairpin Ribozim Hepatit Delta Virüsü ve Varkud Satellit Ribozim Diğer Ribozimler RİBOZİMLERİN KATALİTİK AKTİVİTESİ RİBOZİMLERİN TASARIMI RİBOZİMLERİN MODİFİKASYONU Katalitik Antisens RNA lar Retroviral Nükleokapsid Proteinleri Allosterik Enzimler... 21

8 vii 2.7.RİBOZİMLERİN HÜCRE İÇİNE TRANSFERİ Viral Vektörler Non-Viral Vektörler RİBOZİMLERİN TERAPÖTİK UYGULAMALARI GEN FONKSİYON ÇALIŞMALARINDA BİR ARAÇ OLARAK RİBOZİMLER VE HEDEF DOĞRULAMA RİBOZİM KULLANILMASI İLE SPESİFİK GEN İNHİBİSYONU İLAÇ DİRENCİNİN AŞILMASI DÖNÜŞTÜRÜLMÜŞ FENOTİP AŞILMASI KRONİK MYELOİD LÖSEMİDE BCR-ABL (YABANIL PROTEİNLER) VİRAL HASTALIKLARIN AŞILMASI HAYVAN MODELİ SİSTEMLERİNDE RİBOZİMLER RİBOZİMLERİN DİĞER KULLANIMLARI RİBOZİMLER VE ANTİBİYOTİKLER TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 51

9 viii KISALTMALAR AAV : Adeno-ilişkili viral vektörler AIDS : Acquired Immune Deficiency Syndrome/ Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu CAT : Kloramfenikol asetiltransferaz c-fos : Protoonkogen COS-7 : Cercopithecus aethiops kökenli böbrek dokusu fibroblast hücre hattı ctdna : Kloroplast DNA DNA : Deoksiribonükleik asit G3PDH : Gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz GlmS RİBOZİM : Glucosamine-6-phosphate activated ribozyme- glukosamin-6-fosfat ile aktif olan ribozim HDV : Hepatit delta virüsü HIV : Human Immunodeficiency Virus/İnsan Bağışıklık Yetmezlik Virüsü LTR : Viral uzun terminal tekrar promoter M1 RNA : Ribonükleaz P nin RNA bileşeni MDR-1 : Multidrug resistance protein-çoklu ilaç direnç proteini MOLT-3 : İnsan kaynaklı T lenfoblast tipi hücre hattı mrna : Mesajcı RNA

10 ix NIH3T3 : Mus musculus kökenli embriyo dokusu fibroblast hücre hattı Ph + : Philadelphia kromozomu pol II ve pol III : RNA polimeraz II ve RNA polimeraz III PTN : Fleiyotropin büyüme faktörü RNA : Ribonükleik asit RNaz P : Ribonükleaz P rrna : Ribozomal RNA SCID : Severe Combined Immunodeficiency- Şiddetli kombine immün yetmezlik SELEX : Üslü zenginleştirme teknikleri sirna : Küçük interferans RNA SNP : Tek nükleotid polimorfizmi ß2M : ß-2 mikroglobulin ßAPP : ß-amyloid precursor proteins - ß-amiloid prekürsör proteinler trna : Taşıyıcı RNA UTRs : Transkribe edilen genlerin çevrilmemiş bölgeleri VEGF : Vascular endothelial growth factor- Vasküler endotelyal büyüme faktörü

11 x ŞEKİLLER ve TABLOLAR LİSTESİ Şekil 1. Grup I intronların katalitik etkisinin şematik gösterimi Şekil 2. Grup I intron şematik gösterimi... 8 Şekil 3. Grup II intronun şematik gösterimi... 9 Şekil 4. Ribonükleaz P nin şematik gösterimi Şekil 5. Çekiçbaşlı ribozimin şematik gösterimi Şekil 6. Hairpin ribozimin şematik gösterimi Şekil 7. Hepatit delta virüs ribozimin (HDV) şematik gösterimi Şekil 8. Varkud satellit riboziminin şematik gösterimi Şekil 9. glms ribozim şematik gösterimi Şekil 10. Ribozim aracılı mrna parçalanması Şekil 11: Ribozim teknolojisi Şekil 12. Ribozimlerin eksojen (A) ve endojen (B) tesliminin şematik gösterimi Şekil 13. Anti-HIV ribozimleri kullanılarak gen tedavi yaklaşımları Tablo 1. Doğal olarak meydana gelen ribozimler, reaksiyonları ve elde edildikleri organizmalar Tablo 2. Ribozimler kullanarak yapılan potansiyel gen inhibisyonunun listesi... 33

12 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Ribozimlerin keşfinden önceki yıllarda RNA, yanlızca bütün genetik bilginin deposu olan DNA (deoksiribonükleik asit) ile bütünlük, işlev ve biyolojik yapının belirleyicileri olan proteinler arasında bir köprü olarak görülmekteydi (1). RNA molekülü ve enzimatik özellikleri 1982 yılında Colorado Üniversitesi Thomas Czech Laboratuvarı nda tespit edilmiştir. Bu keşifle beraber RNA molekülünün, genetik kodun çevrilebilir okuyucuya deşifre edilmesi prosesinde rol alan basit bir araç olduğu fikri değişmiştir (1,2). Bir kimyasal reaksiyonu katalize eden, reaksiyon sırasında yapısını koruyan ve sonunda olduğu gibi çıkan bu tür RNA molekülleri ribozim olarak adlandırılmıştır (3). Thomas Czech ve arkadaşları tarafından tanımlanan ilk doğal ribozim etkinliği, Tetrahymena thermophila nın self-splicing grup I intronunda keşfedilmiştir. Bu intron, herhangi bir protein-kofaktörü veya dış bir enerji kaynağı olmaksızın meydana gelerek, kendi eksizyonunu etkileyecek otokatalitik birimleri oluşturmak üzere katlanır (2,4). Kısa bir süre sonra, Yale Üniversitesi'nde, Sidney Altman grubu, Escherichia coli' den elde edilen ribononükleaz P (RNAz P) nin RNA bileşeni olan M1 RNA nın da intronla aynı şekilde herhangi bir protein faktörü gerektirmeksizin transfer RNA (trna) prekürsörlerinin işlenmesinde etkili olduğunu göstermiştir. Thomas Czech ve Sidney Altman bu çalışmalarıyla 1989 yılında Nobel Kimya Ödülünü almışlardır (2,5). Ribozimler belirli bir nükleotid sekansına sahip, viral RNA molekülleri ve hücresel RNA moleküllerinin inaktivasyonunu ve parçalanmasını katalize eden nükleik asit enzimleridir. Ribozimlerin gerçekleştirdiği bu RNA inaktivasyonu geri dönüşümsüzdür aksi halde protein sentezi tekrar gerçekleşebilmektedir (4,6).

13 2 Ribozimler site-spesifik RNA bölünmesi veya ligasyon aktivitelerine sahiptir (7,8). Hücrelerdeki birçok reaksiyonu katalize edebilirler (7,9). Ribozimlerin bu katalitik etkilerinin keşfi araştırmacıları, önemli ölçüde RNA araştırmalarına teşvik etmiştir. Özellikle ribozimlerin, bir intramoleküler (trans) modundaki RNA yı parçalayabilmesi yeteneği büyük ilgi uyandırmıştır. Sahip oldukları bu yetenek ribozimleri, mrna nın sekans spesifik parçalanmasında ve buna bağlı olarak gen fonksiyonu analizi ve gen ekspresyonu inhibisyonunda kullanışlı hale getirmiştir (10). Ribozimler doğal olarak meydana gelmiş enzimlerdir. Aynı zamanda özel dizileri hedefleyebilmek amacıyla cis veya trans durumda tasarlanmış ribozimler de vardır (11). Ribozimlerin deneysel olarak kullanılan farklı türleri var olmasına rağmen, hammerhead ve hairpin ribozimlerin ikisi, yüksek bölünme verimlilikleri ve boyutlarının küçük olması nedeniyle yaygın olarak incelenmiştir(3,12). Özellikle, 40 nükleotid uzunluğunda, katalitik bir alan ve iki substrat bağlayıcı koldan meydana gelen modifiye hammerhead ribozim, terapötik ribozimlerin en yaygın tipidir (12). Diğer antisens terapötik maddeler gibi, ribozimlerde doğuştan metabolik bozukluklar, viral enfeksiyonlar ve kanser gibi kazanılmış hastalıkların birçoğunun tedaviside umut verici bir potansiyel sunmaktadır (9,13). Şu anda, ribozimlerin klinik yollarla AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome/ Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu) ve kanser gibi insan hastalıklarına uygulanmasına dair birkaç örnek bulunmaktadır. İnsan bağışıklık yetmezliği virüsünü hedefleyen bir ribozim olan anti-hiv-1 gag ribozimi kullanılarak yapılan ilk klinik denemede bu ribozimin, mrna (mesajcı RNA) ların transkripsiyonunu ve yeni viral RNA bölünmesi ile HIV (Human Immunodeficiency Virus/İnsan Bağışıklık Yetmezlik Virüsü) replikasyon döngüsündeki post ve pre-entegrasyon olaylarının her ikisi ile intraselüler geçişi engelleyebilir olduğu gösterilmiştir (14,15). Bu ribozimler hedef doğrulamada ve yol aydınlatılmasında bir araç olarak kullanılmaktadır (11).

14 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. RİBOZİMLER Nükleik asitlerin fonksiyonlarının anlaşılması, DNA ve RNA gibi çok yönlü polimerlerin bilim dünyası tarafından keşfedilmesi, anlaşılması ve geliştirilmesinde sonsuz bir kaynak olmuştur. Fonksiyonel nükleik asitlerin, üslü zenginleştirme (SELEX) teknikleri ile ligandların sistemik evrimi ve in vitro seçim yolu ile random nükleik asitlerin havuzlarından izole edilme yoluyla elde edilebilmelerinin yanısıra doğada da bulunabildikleri yaygın olarak bilinmektedir (16). Ribozimlerin, deoksiribozimlerin ve mikro RNA, sirna (küçük interferans RNA), riboswitches, aptamerler gibi yapay ribozimlerin kullanılabilirliği, çeşitli biyolojik ve kimyasal uygulamalar için akıllı moleküllerin geliştirilmesine yeni bir ufuk açmıştır (16,17). 30 yıl önce ilk doğal ribozimin keşfinden bu yana, nükleik asitlerin yalnızca genetik bilginin statik emanetçisi olmadığı açık hale gelmiştir. Aynı zamanda ilginç bir katalik aktiviteye sahip olduğu görülmüştür. Katalik aktiviteye sahip nükleik asitleri tanımlayabilmek adına nükleik asit enzimi terimi kullanılmıştır (16,18). Tasarlanmış nükleik asit enzimleriyle katalize edilen reaksiyonların sayısı sürekli artmaktadır. Bu katalizörlerin çok yönlülüğü, geçmişe ait dünyaca kabul görmüş RNA, proteinlerin keşfinden önce vardı fikrini desteklemektedir. Aynı zamanda nükleik asit enzimlerinin pratik uygulamalarına yönelik birçok çalışma yapılmıştır (16,18,19). Akıllı moleküller arasında, nükleik asit bazlı katalizörler gibi davranan ribozimler, kimyasal reaksiyonların çeşitliliğini katalize edebilen baskın nükleik asit enzimleridir. Literatürde inceleme yapıldığında, doğada bulunan ribozimlerin birçoğunun peptid bağı oluşumunda, fosfodiester bağı parçalanması ve oluşumunda rol oynadığı görülür.

15 4 Ayrıca yapay ribozimler de in vitro seçim veya SELEX teknikleri ile elde edilmiştir (16,17). Nükleik asitler tarafından sunulan kolaylık (stabilite, çeşitli kimyasal modifikasyon, etiketleme, immobilizasyon ve duyarlılık kolaylığı) dünya çapındaki moleküler bilim adamlarını, bu bileşiklerin yenilikçi uygulamalarını bulmak üzere harekete geçirmiştir (20) RİBOZİMLERİN TARİHSEL GELİŞİMİ 1980 lerde enzim gibi davranan bazı RNA moleküllerinin keşfine kadar, tüm enzimlerin protein yapıda olduğu düşünülmekteydi (21). Katalitik RNA molekülleri (veya ribozimler) ilk kez 1982 yılında, Colorado Üniversitesi Thomas Czech Laboratuvarı nda keşfedilmiştir. Czech in araştırma ekibi, bir intron içeren Tetrahymena thermophilla dan ribozomal bir RNA prekürsörü elde etmiştir. Bu prekürsör in vitro ortamda kendi kendini kesme yeteneğine sahiptir ve kodlama sekansı olmaksızın gen kesebilmektedir (2,4). Kısa bir süre sonra, Yale Üniversitesi nde Althman nın grubu, aynı şekilde herhangi bir protein ko-faktörü olmaksızın M1 RNaz P nin RNA kompenenti ile E.coli den trna öncüllerini işlemenin mümkün olduğunu göstermiştir. Czech ve Althman bu çalışmaları için 1989 yılında Kimya Nobel Ödülü nü almışlardır (2) yılında, protozoan Tetrahymena da rrna (ribozomal RNA) prekürsörlerinden, protein ko-faktörü yokluğunda kendi kendini kesebilen bir intron keşfedilmiştir. Bu keşif proteinlerin yanlızca biyolojik katalizörler olarak görev aldığı inancını değiştirmiştir. RNA çalışmalarının yeni bir alanı olarak Enzimoloji ortaya çıkmıştır. Ve katalitik RNA ların spesifik yüzeylere bağlanabilen, RNA zincirlerini bağlayıp kırabilen, karmaşık üç boyutlu yüzeyler oluşturmak üzere katlanma eğilimi gösterebilen moleküller olduğu gözlemlenmiştir (21,22). Böylece RNA katalizinin keşfi, gezegendeki yaşam evriminin iç yüzünü ve bu olayın mekanik kökenini anlamak için biyolojiye bir paradigma kayması sağlamıştır (23).

16 5 Genel olarak eş hücrelerdeki doğal kesici ribozimlerin geniş bir repertuarının keşfi ve bunların reaksiyonlarının önemli olması, nükleik asitlerin orijinal biyokatalistler olduğuna dair spekülasyonları ve RNA dünyasının güvenilirliğini desteklemiştir. Modern protein dünyasında RNA katalizinin, gen ekspresyonunun regülasyonu ve protein sentezindeki görevleri, günümüzde RNA nın hücrelerdeki bütün temel süreçlerde önemli rol oynadığını kanıtlamıştır. Günümüzde doğal kesici ribozimler veya in vitro olarak seçilen ribozimlerin kimyasal, biyolojik, farmasötik ve tıbbi uygulamalar için talep edilen farklı türleri mevcuttur (157) RİBOZİMLERİN SINIFLANDIRILMASI Doğada meydana gelen ribozimlerin hepsi reaksiyon mekanizması ve karakteristik yapıları ile ünlüdür. Bu ribozimler büyüklüklerine ve reaksiyon mekanizmalarına göre genel olarak iki gruba ayrılırlar. 1) Büyüklüklerine göre Büyük ribozimler Küçük ribozimler 2) Mekanizmalarına göre self-splicing ribozimler self-cleaving ribozimler İlk grup self-splicing ribozimler, grup I ve grup II intronların yanı sıra RNaz P nin RNA bileşenini içerirken; ikinci grup hammerhead, hairpin, hepatit delta ribozimleri ve varkud satellit RNA dan oluşmaktadır. Büyük ribozimler birkaç yüz nükleotidten 3000 nükleotide kadar büyüklükte olup serbest bir 3'-hidroksil ve 5'-fosfat grubu ile reaksiyon ürünleri üretirler. Uzunlukları 30 ile 150 nükleotid arasında değişen küçük ribozimler ise bir 2',3'-siklik fosfat ve 5'-hidroksil grubu ile reaksiyon ürünleri üretir (25,26). Fosfat gruplarından yapılan transfer, ribozimler tarafından katalize edilebilirler. Bu katalizde ürünlerdeki farklı kimyasal reaksiyonların iki tipi kullanılır. Bu temelde ribozimler iki farklı grup halinde sınıflandırılabilirler.

17 6 Hammerhead, hairpin, hepatit delta virüsü, varkud satellit ve GlmS ribozimler dahil self-cleaving (kendi kendini kesici) ribozimler. Grup I ve Grup II intron, grup I benzeri kesici ribozimler, dallanma ribozim ve RNaz P gibi self-splicing (kendinden yapıştırma) ribozimler. (24,27) Tüm bunlara ek olarak birçok yapay ribozim çeşitli reaksiyonları katalize ederken bunlardan ancak self-replikasyona uyumlu, uygun kofaktörle katalizi yöneten ve translasyon gibi yolaklara aktive kimyasal ara ürünler sağlayan ribozimler seçilmektedir (24) Grup I İntronlar RNA moleküllerinin katalitik aktivitesiyle ilgili ilk ipucu, geniş subünit rrna Tetrahymena thermophilla nın prekürsöründe bulunan bir grup I intronla ilgilidir (28). Grup I intronlar (Şekil 1), bakteri ve diğer organizmalardaki rrna, mrnave trna ların büyük bir çoğunluğunu kesmek için bulunmuştur (22,29). Bunların tümünde ortak bir ikincil yapı ve splicing yolu vardır. Tetrahymena thermophilla prekürsör rrna sı, kendi eksizyonunu katalize edebilme yeteneğine sahip bir grup I intron içerir. İntronun self-splicingi için Mg +2 yada Mn +2 gibi divalent bir katyon ve bir guanosin kofaktörü gerekir ve self-splicing iki ardışık transesterifikasyon reaksiyonu ile gerçekleşir (30,31). Grup I intronun boyutu birkaç yüz nükleotid ile yaklaşık 3000 nükleotid arasında değişir. Bunlar mantar ve bitki mitokondrisinde fazla bulunur. Aynı zamanda nükleer RNA genleri, kloroplast DNA (ctdna), bakteriofaj ile öbakterilerin trna larında da bulunur. Ancak bunlar omurgalılarda olduğu gibi yüksek ökaryotlarda bulunmazlar (2). Grup I intron, ribozimin RNA-yönelik tedavisinde önemli bir araç olarak karşımıza çıkar. Bunlar özellikle anormal mrna moleküllerini tamir etmek için dizayn edilebilir (28). Bu modifiye Grup I intronların anormal mrna ların düzeltilmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Örneğin: trans-aktif bir Grup I intron γ-globin-3'-ekson ile β-globin RNA nın mutasyona uğramış bölümünün bir kısmını değiştirerek, orak hücreli anemisi olan bir hastanın eritrosit prekürsörlerindeki mutant β-globin RNA yı onarmak için kullanılmıştır. Ayrıca trinükleotid tekrar mutasyonunun neden olduğu Huntington

18 7 hastalığı ve miyotonik distrofi gibi hastalıklarda da bu tip ribozimlerin etkileri gösterilmiştir (25). (A) cis-ekleme reaksiyonu Reaksiyon 5'-splice sitesinde (yukarıda) bir dış guanozin kofaktörünün nükleofilik saldırısı ile başlatılır. Ardından 3'-splice sitesi (ortada) üzerinden yukarı eksonun nükleofilik saldırısı ile eksonlar birleşir. Ve intron ile birleşmiş eksonlar birbirinden ayrılır (aşağıda). (B) transsplicing grup I intron terapötik uygulaması mutant bir ekson içeren tek nükleotid polimorfizmi (SNP) düzeltilmiş benzer eksonlar ile değiştirilmiştir (145,146). Şekil 1. Grup I intronların katalitik etkisinin şematik gösterimi.

19 8 Şekil 2. Grup I intron şematik gösterimi (156) Grup II İntronlar Grup II intron (Şekil 3), bakteriler ve ökaryotik hücrelerin organel genlerinde bulunmuştur. Esas olarak bitki, mantar ve mayaların mitokondri ve kloroplast RNA larında bulunur. Ancak grup II intron, grup I introndan daha az yaygın bulunur. Grup II intronlar, intron hareketlilik reaksiyonları ve RNA self-splicing katalizinde gerekli olan kompakt yapıyı oluşturmak üzere katlanan, büyük katalitik RNA molekülleridir. Bunlar esas olarak mrna larda mevcuttur. Aynı zamanda trna ve rrna da da bulunur (31,32). Grup II intronlar, spliceosom ile katalize edilen iki aşamalı mekanizmaya yakından benzeyerek onların birincil transkribinde, kendi eksizyonlarını katalize eden, multidomain RNA metalloenzimleridir. Etkinlik, yapı ve katalitik aktivitede rol oynayan metal iyonlarının varlığına dayanır ve spesifik uzun

20 9 menzilli etkileşimler oluşur (33). Grup II intronlar, bir guanosin kofaktörü gerektirmeksizin aktif grup I intron modundan mekanik olarak farklı bir şekilde selfsplicing reaksiyonlarını katalize eder. Grup I intronlar hakkında bilinenler, grup II intronlardan çok daha azdır ve bunların uygulama alanlarının daha dar olduğu görülmektedir. Ribozimlerin bu sınıfının bir alt ünitesi, ters transkripsiyon ve ters splicing ile DNA düzeyinde intronların az olduğu allellere kendini ekleyebilir ve bu olay retro homing olarak adlandırılan bir prosestir. Grup II intronların kendi kendilerini, insan hücrelerinde bulunan, tedavi ile ilişkili DNA hedef sitelerinin içine yönlendirebildikleri kanıtlanmıştır (25). Şekil 3. Grup II intronun şematik gösterimi (155)

21 Ribonükleaz P Ribolükneaz P (Şekil 4), yaklaşık 375 nükleotid RNA nın yanı sıra küçük bir polipeptit içeren ribonükleoproteindir. RNA kısmı, olgun trna üretimi için prekürsör trna yı keser (27). Bu RNA kısmı prekürsör RNA ları ve hücre metabolizması için gerekli diğer RNA ları işler (34). Ribolükneaz P, katalitik aktivitesi RNA alt birimi içinde bulunan bir ribolükneoprotein komplekstir. Bu enzim trna ların 5' prosesi için gereklidir. Prokürsor trna 3 ' akseptör kök (amino asit bağlanma bölgesi) ve T-kök içerir. 3' kısmında bulunan akseptör kök yalnızca baz eşleştirme yoluyla prekürsör trna ya bağlanmış ayrı bir molekül gibidir. Farklı çalışmalar, endojen RNaz P kullanılarak neredeyse her RNA bölünmesini sağlayacak dış rehber sekansının kullanılabileceğini göstermiştir (35). Prekürsör trna ların olgun 5' ucunu oluşturmak için bir endonükleaz gibi hareket eden bu enzim her yerde bulunur. Bu enzim bakterilerde, uzun bir RNA kısmı içeren ribonükleoprotein kompleksi olarak mevcuttur. Uzunluğu tipik olarak nükleotid kadardır. Yaklaşık 14 kda luk küçük bir proteindir ve RNA kısmı olgun trna üretmek için prekürsör trna yı keser. Bu enzim doğal olarak meydana gelmiş gerçek bir transbölünme RNA enzimidir. İn vivo koşullarda tam bir enzimatik aktivite için bu enzimin protein kısmı çok önemlidir. İnsan hücrelerinde, RNaz P birçok protein bileşeni içerir ve bu proteinlerin yokluğunda RNA parçasının katalitik olarak inaktif olduğu düşünülmektedir (27,31).

22 11 Şekil 4. Ribonükleaz P nin şematik gösterimi (151) Hammerhead (Çekiçbaşlı) Ribozim Çekiçbaşlı ribozim (Şekil 5) ilk olarak, farklı bitki viroidlerin ve virüsoidlerin RNA genomlarında kendi kendini kesebilen (self-cleaving) domainler olarak keşfedilmiştir (36). Bu küçük RNA molekülleri (çekiçbaşlı ribozimler) bazı bitki viroid patojenlerinin satellit RNA larında ve semenderlerin, mağara cırcır böceklerinin ve şistozomların tekrarlayan DNA dizilerinde bulunurlar (37). Keşfedilen küçük çekiçbaşlı ribozimler, site-spesifik bölme yeteneğine sahip bir fosfodiester bağı ve yaklaşık 30 nükleotidten oluşmuştur (28,38). Çekiçbaşlı ribozim ilk olarak farklı bitki patojen RNA larından katalitik motif olarak keşfedilmiştir. Bu küçük, doğal ribozimler en sık olarak hücresel RNA ların down-regülasyonu nda kullanılmak üzere geliştirilmiştir (39). Çekiçbaşlı ribozimlerin çoğu uzun multimerik transkriplerin içindeki monomer büyüklüğündeki moleküllerin prosesinde etkilidir. Bu RNA ların en az 14 ünün çekiçbaşlı domain tarafından katalize edilen bir self-cleavage reaksiyonu içerdiği bilinmektedir. Ribozimlerin çekiçbaşlı türü, parçalanma için uygun bir trinükleotid içeren herhangi bir RNA nın trans-parçalanmasını katalize edebilir (40). Bitki patojenlerinin, dairesel RNA dönen halka replikasyonu oluşması sırasında oluşan ve linear konkatamerlerin prosesinde de görev alan bu ribozimler (3) doğal olarak

23 12 meydana gelen ribozimlerin en küçüğü ve çalışmalarda ey yaygın kullanılan türüdür. Bu ribozimler in vitro koşullarda birçok hedef RNA nın bölünmesinde kullanılmıştır. Ancak in vivo olarak ribozim aracılı gen inaktivasyonunda sınırlı başarı elde edilmiştir (41). Yüksek katalitik aktivite elde edebilmek için divalent iyonların yüksek konsantrasyonunun gerekliliği, tedavi amaçlı intraselüler çekiçbaşlı ribozim uygulamasını amaçlayan araştırmacıların karşı karşıya kaldığı büyük bir problemdir (25,38). Moleküler modelleme ve kinetik çalışmalarının sonuçlarına göre, çekiçbaşlı kesim reaksiyonları mono veya divalent tuzların varlığında gerçekleşebileceği, divalent metal iyonlarının katalizde esansiyel olmadığı ve buna rağmen aktif ribozimin yapısını stabilize ettiği fikrini desteklemektedir. Çekiçbaşlı ribozimler muhtemelen üzerinde en çok çalışma yapılan ribozimlerdir. Aynı zamanda küçük boyutları ve katalitik verimlilikleri nedeniyle de en yaygın kullanılan ribozimlerdir (3,31). Şekil 5. Çekiçbaşlı ribozimin şematik gösterimi (150)

24 Hairpin Ribozim (U ŞEKLİNDE, SAÇ TOKASI, FİRKETE RİBOZİM) Katalitik RNA ların bir diğeri patojenik bitki virüs uydu RNA larında bulunan hairpin (saç tokası) motifidir. Hairpin ribozim (saç tokası, firkete, U şeklinde), çekiçbaşlı ribozim gibi bitki virüslerinin uydu RNA ları içinde bulunur. Benzer şekildeki küçük ribozimleri ve dönme-daire genom replikasyonu (42) ürününü işlemek için geri dönüşümlü bir self-cleavage reaksiyonu gerçekleştirir. Hairpin ribozimler (Şekil 6), dönme-daire replikasyonu boyunca olgun satellit RNA içindeki konkatamerik prekürsör molekülleri bölerek 2',3'-siklofosfat ve serbest bir 5'-OH terminali oluşturur. Hairpin ribozimin katalitik aktivitesi, hatalı substrat RNA nın ribozime yönelimi ile, katalizde metal iyonları katılımı olmaksızın komşu nükleotidler ile genel asit-baz katalizi sonucu gerçekleşir. Metal iyonlarının gerekliliği, katlanma prosesindeki önemli rolü ile açıklanabilir. Ayrıca bu, hairpin ribozimin katalitik aktivitesinin, ökaryotik hücrelerin majör poliamini olan spermin ile desteklenebileceğini göstermiştir (25,43). Bu ribozimler özellikle antiviral uygulamalar için geliştirilmiştir. İnsan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1) ve RNA üzerindeki farklı hedef bölgelerine karşı bu iki ribozimin (Hairpin ve Hammerhead) bazı hücre kültürü deneylerinde viral replikasyonu inhibe ettiği gösterilmiştir. Hücre içinde ifade edilen ribozimler meydana gelen HIV-1 virüsüne direnç göstermiştir. HIV-1 ile enfekte donörlerde CD4 + lenfositleri bir anti- HIV ribozim vektörüne aktarılmıştır ve sonrasında geliştirilmiştir. Bu işlem sonunda viral replikasyon 2-3 hafta gecikmiştir (25).

25 14 Şekil 6. Hairpin ribozimin şematik gösterimi (150) Hepatit Delta Virüsü ve Varkud Satellit Ribozim Hepatit delta virüsü (HDV) ribozimi, büyük bir insan patojeni olan Hepatit B virüsünün bir uydu virüsünde bulunmuştur (27). Bu ribozim (Şekil 7), genomik ve antigenomik RNA ların içinde yer alan katalitik bir alanın, yakından ilgili versiyonları ile selfcleavage reaksiyonu gerektiren bir ribozimdir. Diğer küçük katalitik RNA lar ortaya atılan yaygın ikincil yapı bakımından bunlardan farklı olsa da, hepatit delta virüs ribozimi ve varkud satellit ribozimi sekans ve yapı olarak benzerdir. HDV ribozim, Hepaptit B virüsünden bir uydu RNA olarak izole edilmiş enfeksiyöz bir ajandır. Bu genom 1700 nükleotidlik tek zincirli dairesel bir RNA dır. HDV katalitik aktivitesi divalent metal iyonu varlığında daha güçlüdür (28,31). Genomik ve antigenomik iplikçiklerin her ikiside dizilişleri farklı olup cis yarılma ribozimlerin ~ 85 nükleotidi içerisinde ifade edilir ve her iki yapı da sekorder yapıya uygun katlanma gösterir. HDV ribozimin katalitik mekanizmasının genel bir asit-baz katalizi gibi, katalitik merkezde yer alan bir sitozin bazının hareketini gerektirdiğine

26 15 dair güçlü kanıtlar vardır. Hepatit delta virüsü formamid ve üre gibi denatüre edici ajanlara karşı yüksek direnç gösterir. Şekil 7. Hepatit delta virüs ribozimin (HDV) şematik gösterimi (150) Varkud satellit ribozimi (Şekil 8), Neurospora nın bazı soylarının mitokondrisinde bulunan plazmidden transkribe edilen, 154 nükleotid uzunluğunda katalitik bir öğe olması nedeniyle önemli başka bir katalizördür (44). Şekil 8. Varkud satellit riboziminin şematik gösterimi (150)

27 16 Tablo 1 de doğada en yaygın olarak bulunan ribozimler, katalitik aktiviteleri ve yaygın olarak bulundukları organizmalar ile birlikte gösterilmiştir (28) Tablo 1. Doğal olarak meydana gelen ribozimler, reaksiyonları ve elde edildikleri organizmalar (28) Katalitik RNA motifi Katalitik Reaksiyonları Oganizmalar Grup I intornlar RNA splicing Tetrahymena Grup II intornlar RNA splicing Bitkiler, mantar, bakteri Hammerhead (çekiçbaşlı) RNA bölünmesi Bitki patojenleri Hairpin (saç tokası ) RNA bölünmesi Bitki patojenleri RNaz P nin M1 subünit RNA bölünmesi Öbakteri Hepatit delta virüs RNA bölünmesi İnsan patojeni Varkud satellit RNA bölünmesi Neurospora Diğer Ribozimler Yukarıda sözü edilen ribozimlerin, daha yakın zamanda incelenmiş ve karakterize edilmiş farklı türleri vardır. Örneğin; son zamanlarda keşfedilen glms ribozimi (Şekil 9) iki açıdan doğal olarak meydana gelen ribozimler arasında nadirdir. Bu özelliklerden ilki, bu ribozimin aynı zamanda bir riboswich ribozim olmasıdır. İkincisi ise, ribozimin düzenleyici efektörü olan glukozamin-6-fosfatın, RNA self-cleavage reaksiyonunun asit-baz katalizine katılan ve ribozimin aktif bölgesine tamamen bağlanan gerçek bir fonksiyonel grup olmasıdır (45). glms ribozim (glukosamin-6-fosfat ile aktive olan ribozim), glms mesajının 50- translasyona uğramamış bölgesinde bulunan bir self-cleavage RNA sekansından türetilmiştir. Kofaktör glukozamin-6-fosfat bağlandığında bu ribozim kendi kendini keser ve mesaj inaktive olur. Böylece birçok gram pozitif bakteride bu ribozim aracılı negatif feedback mekanizması ile glukozamin-6-fosfat üretimi düzenlenir. glms ribozimin yapısı, hem riboswich hemde olağan dışı bir katalitik RNA olması nedeniyle oldukça ilgi çekicidir. Bu ribozimin sadece gram pozitif bakterilerde bulunmaktadır ve aynı zamanda potansiyel bir antibiyotik hedeftir (34,45,46).

28 17 Şekil 9. glms ribozim şematik gösterimi (154) 2.4. RİBOZİMLERİN KATALİTİK AKTİVİTESİ Ribozimler katalitik aktiviteyle donatılmış şaşırtıcı RNA molekülleridir. Spesifik bir sekanstaki mrna moleküllerini katalitik bir şekilde bölme (parçalama) yeteneğine sahiptirler. Ribozimler hedef mrna ile seçici ligasyon için sekanslar içerirler. Bunlar ribozimlere yüksek özgünlük kazandırır. Bu ribozimler ayrıca hedef mrna ile parçalanma reaksiyonu gerçekleştiren sekanslarda içerir. Ribozimler dizileri tanıyan substratın modifikasyonu ile belirli genlerin supresyonu için spesifik olarak uyarılabilirler. Gen ürünlerinin büyük çeşitliliği, bu strateji başarılı bir şekilde kullanılarak elde edilmiştir (13,47). Doğal olarak meydana gelen ribozimlerde bulunan predominant aktivite, bu ribozimlerin sekans spesifik şekilde, RNA moleküllerini parçalanması veya birleştirilmesindeki yeteneğidir. Sekans spesifitesi, hedef RNA nın bölünme bölgesi yakınındaki nükleotidlerle, ribozim sekanslarının bazılarının çiftlenmesinden kaynaklanır. Ribozimler, kendi RNA sekanslarını intramoleküler (cis) reaksiyonlar ile bölme veya birleştirmede görev alırlar. Ayrıca herhangi bir RNA molekülünün bölünmesinde trans olarakta görev alabilirler. Böylelikle ribozimlerin sekans spesifik

29 18 davranışları hedef RNA moleküllerinin ortadan kaldırılmasını sağlar, ribozimlerin bu özelliği tedaviye yönelik bir aracı olduklarını gösterir (157). Özel olarak bir hastalık durumu ile bağlantılı bir protein için kodlanan mrna seçimli olarak kesilebilir (Şekil 10). Bu bölünme olayı protein ekspresyonunu zayıflatır ve mrna yı okunamaz bir hale getirir.(23,48) mrna üzerindeki hedef sekansların inaktivasyonunda etkinliği olan ribozim teknolojisinin esası ise Şekil 11 de gösterilmiştir (152) Şekil 10. Ribozim aracılı mrna parçalanması (153) Şekil 11: Ribozim teknolojisi (152)

30 19 Aynı molekül içinde katalizi gerçekleştirme ve bilgi toplama işlevi RNA nın en ilginç iki özelliğidir. RNA molekülleri nispeten kararsızlıklarına rağmen kendi kendine hareket eden biyokimyasal sistemlerin inşası için en uygun biyopolimerlerdir. Böylece asıl zorluk bağlama yada polimerizasyon aktivitelerine sahip yada moleküler bir anahtar için katalitik fonksiyon bağlanması yeteneğine sahip ribozimlerin geliştirilmesidir. Yapay RNA bazlı ağ sistemlerinin geliştirilmesi bu tür moleküllerin geliştirilmesine katkı sağlamıştır. Küçük peptidler ile RNA moleküllerinden oluşan ribonükleoproteinlerin daha fazla geliştirilmesi, kimyasal reaksiyonların geniş bir aralığının katalizi için daha ümit verici bir yol olarak görülmektedir (21,49,50) RİBOZİMLERİN TASARIMI Hedef gen ekspresyonunun baskılanması (knockdown) yönelik çalışmalarda kullanılan ribozimlerin başarısı, hedef bölge seçimi yanı sıra ribozimlerin gen teslimi, ekspresyonu, stabilitesi ve intramoleküler lokasyonu dahil bir dizi faktöre bağlıdır (8). Hairpin ve hammerhead, ribozimlerin en yaygın kullanılan iki türüdür (12,51). Bu ribozimlerin herbiri kendine ait en az bir hedef sekans gerektirir. Hairpin ribozim bölünme bölgesinde bir GUC sekansı gerektirirken hammerhead ribozim NUH sekansı gerektirir. (N herhangi bir temeli ifade ederken H ; A,U veya C yi ifade etmektedir.) Bütün hedef bölgeleri bölünme için erişilebilir değildir. İkincil yapılar, ilave gizli faktörler, nükleik asitler ve proteinlerin bağlanması ribozimlerin aktivitesini etkileyecektir. Başarı sağlamak için, in vivo bölünmeye en duyarlı siteleri belirlemek için aynı mrna içindeki birkaç farklı ribozim bölgesinin analizi planlanmalıdır. Etkinliği arttırıcı bir strateji olarak kolaylaştırıcı moleküller tasarlanmaktadır: ribozim sitesini kuşatan dizileri tamamlayıcı DNA fragmanları ve kısa RNA lar. Fasilatörün (kolaylaştırıcı) bağlanması ribozimin bağlanmasına izin veren hedef ikincil yapıyı açabilir. Hedefteki en uygun sitenin seçiminde rastgele ribozim kütüphanesinin kullanımı, bazların site seçilimini bir adım daha ileri götürmüştür (11,51). Bir ribozimin tasarımı için, ilk olarak NUX içeren hedef RNA da bir bölge seçilir. N herhangi bir nükleotid anlamına gelir. U üridini temsil eder. X guanosin dışındaki herhangi bir nükleotidi temsil eder.

31 20 Hairpin ribozim tasarımı dışında aynı yaklaşım kullanılır. Bu ribozimde katalitik çekirdek büyüktür (34 nükleotid) ve ribozim hedef alanları daha fazla özgünlük gerektirir. Hairpin ribozimi NNYNGUCNNNNNN sekansını taşır. N herhangi bir nükleotid ve Y ise bir pirimidindir. Altı çizili hedef bazlar (NGUC) ribozim ile temeleşleştirilmiş değildir (27,52). Seçilen RNA hedeflerine karşı tasarlanmış ribozimlerin yeteneği, bunların terapötik potansiyelini genişletmiştir (51). Çekiçbaşlı ribozim, UH içeren herhangi bir hedef RNA ya tamamlayıcı olan, bağlanma kollarını modifiye edebilir (H guanosin dışında herhangi bir nükleotid olduğunda). Bağlanma kollarının uzunluğunun sırasıyla 3'- ve 5'- sonlarında 7/7 nükleotid olduğu görülmektedir (27,53,54) RİBOZİMLERİN MODİFİKASYONU 1980 li yılların başında Czech ve arkadaşlarının cis-yarma RNA yı keşfetmesi ve daha sonraki araştırmalarda oluşturulan trans-yarma, biyolojik araçlar ve terapötiklerin yeni bir sınıfı olarak ribozimlerin geliştirilmesini mümkün kılmıştır. Tüm ribonükleotidleri içeren sentetik ribozimler endo- ve ekzo-nükleaz bozulmaya duyarlıdır. Tüm ribonükleotid ribozimler tarafından sürdürülen stabilite, substrat özgünlüğü ve hücre geçirgenliği sınırlamalarını aşmak için, substrat mrna bölme yeteneği korunurken, ribozimler oldukça fazla bir çaba ile kimyasal modifikasyona uğratılır (55,56). Ayrıca, eksojen olarak hücreye aktarılan ribozimlerin stabilite ve dolayısıyla aktivite çabalarını arttırmak için, ribozim yapılarının kimyasal modifikasyonu üzerinde yoğunlaşılmıştır. 2'-floro veya 2'-amino, 2-O-alil ve 2-O-metil araştırılan modifikasyonların birkaçıdır (133). Yıllar boyunca süren kümülatif araştırmalar ve ribonükleotidlerin omurgalarının uygun modifikasyonu ile ribozimlerin daha iyi katalitik aktivite gösterebilmesi için gerekli bir dizi özellik belirlenmiştir (55). Aşağıda yaygın olarak modifiye edilmiş ribozimlerin bazıları anlatılmıştır Katalitik Antisens RNA lar Ribozim substrat tanıma kolunun uzatılması, ribozim ve substratları arasında uygun bir bağlantı kurmayı amaçlayan ilk modifikasyondur. Bu katalitik antisens RNA lar

32 21 ribozim adlı yeni bir sınıfın ortaya çıkmasına yol açmıştır. Bu genişletilmiş kollar, uzun RNA substratlarda, ribozimlerin hedef sekanslara ulaşmasına yardımcı olur. Kolaylaştırıcıların kullanımına dayalı benzer bir strateji de, ribozimleri değiştirmek zorunda kalmadan aynı amacı sağlar. Bu metod substrat RNA da hedef bölgeyi kuşatan sekansları bağlamak için spesifik olarak tasarlanmış dış oligonükleotidleri kullanır (31) Retroviral Nükleokapsid Proteinleri Proteinler gibi hücresel faktörler ile RNA moleküllerinin etkileşimi veya birleşimi ile ilgili in vitro ve ex vivo deneyler arasında önemli bir fark vardır. Ayrıca, temel biyolojik süreçlere retroviral nükleokapsid protein kompleksleri aracılık eder. Bu oluşumlar RNA stabilitesi ve RNA katalizine ulaşmak için önemlidir. Çeşitli proteinler, çekiçbaşlı ribozimlere bağlanarak bir şaperon gibi davranıp, annealing, nükleik asitte iplik-değişimi, ribozimlerin etki ettiği RNA substratından gevşeme ve ribozimin spesifik hedefi ile kolokalizasyonunu sağlar. Bu metodoloji, spesifite ve turnover sınırlamalarını aşmak için başarılıdır (31) Allosterik Enzimler Allosterik ribozimler katalitik RNA ların modifiye bir türüdür. Aktiviteleri dış faktörler tarafından kontrol edilebilir. Bunların parçalama etkinliği, allosterik bağlanma bölgesine bağlanan bir efektör molekülü ile kontrol edilir. Bu strateji, RNA bölünme etkinliğinin bir dış faktör tarafından düzenlenmesi istenilen durumlarda kullanılır. Enfekte olmuş hücrelerdeki mrna ların veya viral RNA ların bölünmesi bu durumlara örnektir. Aktivitesi hedef mrna daki spesifik bir sekansla düzenlenen maksizim allosterik ribozimler vardır. Sensör dizisi olarak adlandırılan bu sekans fiziksel olarak bölünme bölgesinden farklıdır. Bunlar ilk olarak iki ayrı sitede hedef RNA yı bölen ribozimler olarak geliştirilmiştir. Bunlar yanlızca dimer formda aktif olan iki minizimden oluşmaktadır (31,57,58). Maksizim, farelerde aynı düzeyde çalıştığı görünen, güçlü biyosensör kapasiteli allosterik kontrol ribozimidir. Bu biyosensör fonksiyonlar, normal mrna üzerinde herhangi bir etki yaratmaksızın, sadece ilgili genin sentezlenmesini spesifik olarak önler. Sensör kollarındaki sekansların modülasyonu ile bu maksizimlerin aktivitesini ayarlamak mümkündür (59,60).

33 RİBOZİMLERİN HÜCRE İÇİNE TRANSFERİ Bu enzimlerin terapötik uygulamalarını gerçek hale getirmek için, etkili, güvenli ve doku spesifik formülasyonları ve dağıtım sistemlerinin geliştirilmesi önemli konulardan biridir (13,61). Endozomal parçacıklar ve hedef RNA tarafından salınan, kimyasal olarak sentezlenmiş ribozimler, hücreler tarafından alınır. Ribozimler alternatif olarak plasmidler ile de hücre içine alınabilirler (147,148). Ribozimler hücrelere iki yolla teslim edilebilir (Şekil 12): önceden oluşturulmuş ribozimler (eksojen teslim) veya bir ribozim geni olarak (endojen teslimin bir çeşidi). Transfeksiyon aracı (örneğin: lipofeksiyon ve elektroporasyon) eksojen teslim için önemli iken promoter seçimi (pol II, pol III, viral v.s) ise endojen teslim için önemlidir (135). Şekil 12. Ribozimlerin eksojen (A) ve endojen (B) tesliminin şematik gösterimi. (A)

34 23 Endojen teslim, tekrar mutant mrna lar ve hedef gen ekspresyonunun downregülasyonu için sunulan ribozimler nedeniyle ribozim gen terapisi olarak da adlandırılabilir (136). Endojen teslim, aktin geni (137) veya erken promoter (102) SV40 gibi RNA polimeraz II (pol II) ile transkribe edilen genlerin, çevrilmemiş bölgeleri (UTRs-untranslated regions) içine ribozim sekanslarının sokulması ile elde edilmiştir. U6 küçük nükleer RNA (138) veya bazı trna lardan sentezlenen RNA polimeraz III (pol III) promoterler, ribozimlerin ekspresyonunda başarıyla kullanılmıştır (139). Aynı zamanda, tirozinaz promoter gibi, doku spesifik promoterler de araştırılmıştır (90). Retroviral vektörler ve özellikle son zamanlarda adeno-ilişkili viral vektörler (AAV) yaygın olarak kullanılmaktadır. Ribozim genleri, pol II veya pol III promoterlerden veya viral uzun terminal tekrar promoterlerden (LTR-Long terminal repeat) eksprese edilebilir (149). Yakın zamanda, viral ve non-viral vektörler ribozimlerin hücre içine taşınması için geliştirilmiştir. Bunlar arasında viral bazlı stratejiler, hücre spesifik ribozimlerin hücre içine transferini sağlar (10,13,61) Viral Vektörler Viral bazlı vektörler, sürekli gen terapisi bağlamında incelenir. Aynı hususlar ribozimin teslimi için kullanılan bu tür vektörler içinde geçerlidir. Ribozimleri kodlayan genlerin tesliminde kullanılan viral gen terapi vektörleri, gen ekspresyonunun inhibisyonu için, ribozimlerin hücrelere direkt tesliminde temel bir alternatiftir (9,54,61). En geniş kullanım alanına sahip viral vektörler; retroviral vektörler (10,16), adenovirüs vektörleri (11,62) ve adeno-ilişkili virüs vektörlerdir (9,11,35,61). Viral vektörler, yüksek gen transferi yeteneğini korumak için ve toksisitesini elimine etmek için modifiye edilmişlerdir. Özellikle, terapötik gen ile kısmen veya tamamen değiştirilen viral kodlama dizisi ile replikasyon yetkili veya non-replike virüsler, birçok temel araştırmanın ve klinik çalışmanın odağı olmuştur. Viral vektörler aşı geliştirilmesinin yanısıra gen değişim tedavisinde de yaygın olarak araştırılmıştır (63,64). Viral vektörlerin kullanımı ile yüksek transfeksiyon verimliliğine ulaşılabilmesine rağmen bunların kullanımı, güvenlik kaygıları, hedefleme yeteneğinin ve plazmid boyutunun sınırlı oluşu, taşıma ve üretimindeki zorluklar nedeniyle

35 24 engellenmektedir (65,66). Bu nedenle ribozimlerin hücrelere teslimi için gelişmiş hedefleme yeteneği, azalmış immünojenisite, üretilebilirlik ve basit özelliklere sahip viral vektörler geliştirilmelidir (157) Non-Viral Vektörler Viral vektörlerin toksisitesi ve bağışıklıkla ilgili problemleri araştırmacıları giderek viral vektörlerin kullanıldığı dağıtım sistemlerine alternatif olarak non-viral vektörler üzerinde çalışmaya teşvik etmiştir (67,68). Non-viral vektörler, çoğunlukla ribozimlerin eksojen teslimi için kullanılır (54). Düşük etkinlik önemli bir dezavantajları olmasına rağmen, non-viral vektörler, düşük toksisite ve bağışılık, düşük maliyet ve üretim kolaylığı ile viral vektörlere kıyasla daha avantajlıdır (68). Ayrıca non-viral vektörler, ribozimlerin çeşitli yollarla korunmasını sağlayarak hücre içine güvenli bir şekilde teslim edilmelerini sağlar. Ribozimlerin hedeflenen hücreye ulaşabilmesi ve çok büyük bir etki gösterebilmesi için, renal filtrasyon sistemi, sistemik enzimatik bozunma ve immünolojik proseslerden korunması gerekir (67,69). Şimdiye kadar geliştirilen nonviral vektörlerin çoğu doğada genelde katyoniktir (70). Katyonik lipidler (71,72), katyonik polimerler (73), dendimerler, katyonik peptitler (74) ve katyonik lipozomlar (62, 74,75) ribozimlerin hücrelere eksojen tesliminde bugüne kadar en yaygın olarak kullanılan vektörlerdir. Katyonik non-viral vektörlerin yanısıra, ribozimlerin hücre içine teslimini arttırmak için mikroenjeksiyon (60,62) gibi mekanik araçlar veya elektroporasyon (76) gibi fiziksel potansiyellere geniş bir ilgi duyulmuştur. Özelde mikro-enjeksiyon, ribozimleri hücre içi kompartmanda yönlendirmek için kullanılan, hücre membranı ve/veya hücre çekirdek zarfına nüfuz edebilen, çapı yaklaşık µm olan iğneye sahip mekanik bir araçtır (62).

36 25 3. RİBOZİMLERİN TERAPÖTİK UYGULAMALARI Ribozimler, sekans spesifik katalitik bir şekilde mrna parçalama yeteğine sahip katalitik aktiviteyle donatılmış RNA molekülleridir. Bunlar, kendilerine yüksek spesifite özelliği veren ve hedef mrna ile selektif olarak bağlanan sekanslar içerirler. Aynı zamanda, hedef mrna ile yarılma reaksiyonları gerçekleştiren sekanslar içerir. Ribozimler, sekansları tanıyan substratı değiştirerek, belirli genlerin supresyonunda rol oynarlar. Farklı patolojik durumlarda rol alan gen ürünlerinin büyük bir varyetesine bu strateji kullanılarak başarılı bir şekilde hedefleme yapılmıştır (13,77). Diğer antisens terapötik maddeler gibi, ribozimlerde kanser tedavisi, enfeksiyon hastalıkları ve genetik bozukluklarda umut verici bir potansiyel sunmaktadır (13,67,78-80). Son zamanlarda, AIDS ve kanser gibi insan hastalıklarında klinik yollarla ribozimlerin uygulandığı birkaç örnek bulunmaktadır. İlk klinik denemede insan immünyetmezliği virüsü (HIV-1) i hedefleyen bir ribozim kullanılmıştır. İntraselüler olarak verilen anti-hiv-1 gag riboziminin mrna transkripsiyonuna ve meydana gelen viral RNA nın bölünmesi ile HIV replikasyonunda hem pre-integrasyon hemde postintegrasyona zarar verdiği görülmüştür (14,15). Son zamanlarda hücre proliferasyon mekanizmalarının tanımlanmasına ek olarak, moleküler seviyede insan kanserinin biyolojideki son patlaması, antikanser ribozimlerin keşfi ve geliştirilmesi için farklı moleküler hedeflerin tanımlanması amacıyla sürdürürlen araştırmalara yardımcı olmuştur. Hedeflerin bazıları dikkat çekmiştir. Bunlar sinyal transdüksiyon kaskadına dahil olan MDR-1 (multidrug resistance protein,çoklu ilaç direnç proteini) gibi kanser terapisinde önemli genler, tümör anjiyogenezisinde önemli genler, tümör indüksiyonu ve progressiyonu için genler (örneğin; farklı onkogenler), büyüme faktörleri ve bunlara karşılık gelen reseptörlerin ekspresyonunda rol alan genlerdir (8,31). Kanserle mücadelede kimyasal olarak modifiye edilmiş çekiçbaşlı ribozimin potansiyellerinin değerlendirildiği sadece iki çalışma devam etmektedir. Bunlardan ilki

37 26 ANGIOZYME (Sirnatherapeutics, Inc) dir. Metastatik kolorektal kanser tedavisine yönelik bir faz II çalışmasında VEGF (Vascular endothelial growth factor, Vasküler endotelyal büyüme faktörü) i kodlayan mrna yı hedef alan çekiçbaşlı bir ribozim incelenmektedir (12,25,31,81). Kanserin klinik tedavisindeki diğer ribozim modifiye edilmiş ribozimlerin bir sınıfı olan HERZYME dir. (Zinzymes olarak adlandırılır. ) Bu enzim Mg +2 varlığında fizyolojik koşullarda yüksek katalitik aktiviteye sahiptir. Herzyme enzimi yumurtalık ve meme kanseri olan hastalarda etkinlik ve toksisiteyi belirlemek için yapılan Faz I klinik çalışmalarında, insan epitel büyüme faktörü-2 yi kodlayan mrna yı hedefler (12,82) GEN FONKSİYON ÇALIŞMALARINDA BİR ARAÇ OLARAK RİBOZİMLER VE HEDEF DOĞRULAMA Ribozimler gen ekspresyonu ve gen regülasyonu çalışmalarında kullanılabilir (4). Bunlar gen fonksiyonlarının anlaşılmasında özel araçlardır. Çünkü bunların, hedef gen ekspresyonunun hızlı bir şekilde ablasyonu için hücresel yanıtları değerlendirme izni vardır (83). Ribozimler aynı zamanda, spesifik gen ekspresyonunu da inaktive edebilirler ve böylece fonksiyonel bir kaskatta bir genin rolünün veya bir proteinin fonksiyonunun tanımlanmasına yardımcı olarak kullanılabilirler. Hedef doğrulama için ribozimlerin kullanılması ilaçların keşfi ve geliştirilmesi gibi temel biyolojik araştırmaların her ikisinde de çok önemlidir. Ribozimler, transgenik hayvanların kullanılması gibi hedef doğrulamanın diğer araçları ile karşılaştırıldığında spesifite, tasarım ve kullanım kolaylığı sunar (12,84). Araştırmacılar ribozim teknolojisindeki son gelişmelerin, ribozimin hedef doğrulamadaki etkinliğini kesinlikle geliştireceğine inanmaktadır. Bununla birlikte daha geleneksel ribozim teknolojisinin uygulanması, daha önceki zamanlarda artrit, viral enfeksiyonlar, kanser ve diğer hastalıkların tedavisi için önerilen ilaç hedefleri hakkında önemli bilgiler vermiştir. Örneğin apoptozise neden olan ajanların duyarlılıklarını arttırmak için birkaç grup ribozimden yararlanılmıştır. Diğer gruplar, nude farelerde tümörlerin büyümesi ve hücre proliferasyon oranının her ikisinide azaltmak için ribozimleri kullanmıştır. Özellikle viral enfeksiyonların tedavisinde potansiyel hedefler olarak diğer hücre genlerinin hedeflenmesi, aktif bir araştırma alanıdır (85,86).

38 RİBOZİM KULLANILMASI İLE SPESİFİK GEN İNHİBİSYONU Özgüllük, birçok durumda, hedef mrna veya protein seviyeleri ölçülmeksizin, ilgisiz mrna üzerindeki etkilere ve ribozim parçalanma ürünlerine bakılmaksızın, biyolojik etkilerden yola çıkılarak elde edilmiştir. Ribozimin aktivitesiyle ilgili hücre kültürü çalışmalarında, ribozimin katalitik doğası ve aktivitesinin tespitinde zorluklarla karşılaşılmıştır. Çeşitli gruplar, kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) (102) gibi bir haberci gene başvurmuşlardır. Bu çalışmalarda CAT aktivitesindeki azalma ribozim aktivitesinin göstergesi olarak ele alınmıştır (103). ßAPP (ß-amyloid precursor proteins - ß-amiloid prekürsör proteinler) mrna sı için, ribozim özgünlüğünün, G3PDH (gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz) mrna, α-actin ve kontrol RNA'lar ile kıyaslandığında daha düşük olduğu görülmüştür (104). Bununla birlikte bu son çalışmada, ribozim bölünme bağımlı olmayan COS-7 (Cercopithecus aethiops kökenli böbrek dokusu fibroblast hücre hattı) hücrelerindeki ßAPP mrna'nın ribozim aracılı degredasyonunun bir mutant ribozimin (katalitik olarak inaktif) etki seviyesini düşürdüğü öne sürülmüştür. Ribozim bölünmesi, bölünme ürünleri probu korunan bir RNaz koruma deneyi ile gösterilmiştir (103). Fakat bu tür sonuçların yorumlanmasına özen göstermek gerekir. Son zamanlarda, hücre içerisinde olup, RNA hazırlanması sırasında substratı bölünen bir çekiçbaşlı ribozim not edilmiştir (99,105). Bazı mevcut problemler olmasına rağmen birçok aktif ribozimin terapötik uygulamaları araştırılmaktadır (149) İLAÇ DİRENCİNİN AŞILMASI İlaç direncinin aşılması ribozim teknolojisi için popüler bir hedeftir. Kobayashi ve arkadaşları (87), bir anti-mdr-1 ribozimi kararlı bir şekilde transfekte etmiş ve vinkristine göre yaklaşık 700 kat daha dirençli olan MOLT-3 (insan kökenli T lenfoblast hücre tipi hücre hattı) hücrelerininde aynı ilaca karşı direnci kat düşürdüğü gözlemlenmiştir. Bu ilaç duyarlılığındaki artışın ve MDR-1 mrna seviyelerindeki azalmanın, ribozimin ifade edilen miktarı ile orantılı olduğu görülmüştür. Araştırmacılar, bölünme ürünlerini tespit edememiş olsa da, bölme yeteneği olmayan ribozimlerin, ilaç direnç seviyeleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermişlerdir. İlaca direnci olmayan paranteral hücre hattında bu ribozimler denenmiş ve hiçbir etki bulunamamıştır. Buda ribozimlerin toksik olmadığını göstermiştir.