ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Songül BUDAK DİLER ETİL METANSULFONAT (EMS) ve MİTOMİSİN C (MMC) ye İNSAN KROMOZOMLARININ HASSASİYETİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA,2006

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ETHİL METANSULFONAT (EMS) ve MİTOMİSİN C (MMC) YE İNSAN KROMOZOMLARININ HASSASİYETİ Songül BUDAK DİLER DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez / /2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği / Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza İmza... İmza. Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI DANIŞMANI ÜYE ÜYE İmza Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA ÜYE İmza.. Yrd. Doç. Dr. Ahmet KAYRALDIZ ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE 2002 D 117 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, şekil ve fotoğrafların gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ ETİL METANSULFONAT (EMS) ve MİTOMİSİN C (MMC) ye İNSAN KROMOZOMLARININ HASSASİYETİ Songül BUDAK DİLER ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Yıl:2006, Sayfa:74 Jüri :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA Yrd. Doç. Dr. Ahmet KAYRALDIZ Bu çalışmanın amacı, mutajen etil metansulfonat (EMS) ile kanser tedavisinde kullanılan ve muhtemelen kanserojen olan mitomisin C (MMC) nin insan kromozomlarında oluşturdukları kromozom kırıklarını incelemek ve en çok kırılan kromozomları saptamaktır. Bu amaç için hücreler, 5x10-4 M, 10-3 M ve 2x10-3 M konsantrasyonlardaki EMS ve µg/ml, 0.125µg/ml, 0.250µg/ml konsantrasyonlarındaki MMC ile 24 ve 48 saat muamele edilmiştir. Bu çalışmada, 24 ve 48 saat EMS ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kontrolde ve aynı dozda, farklı kromozomlarda görülen kromozom kırılma yüzdeleri bir birleriyle karşılaştırılmış ve aralarındaki farkın istatistik bakımında önemli olduğu bulunmuştur. Ayrıca aynı kromozomun farklı dozlardaki kırılma yüzdeleri kontroldeki kırılma yüzdeleriyle karşılaştırılmış, aradaki farkın önemli olduğu saptanmıştır. Yani EMS ile muamele kromozomlardaki kırılmayı artırmıştır. EMS ile muamele sonucu en fazla kromozom kırılması 1., 2., 6., 4., X, 7., 3., 5., 9., ve 8. kromozomlarda tespit edilmiştir. MMC ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kontrolde ve aynı dozda, farklı kromozomlarda görülen kromozom kırılma yüzdeleri bir birleriyle karşılaştırılmış ve aralarındaki farkın istatistik bakımından önemli olduğu bulunmuştur. Ayrıca aynı kromozomun farklı dozlardaki kırılma yüzdeleri kontroldeki kırılma yüzdeleriyle karşılaştırılmış, aradaki farkın önemli olduğu saptanmıştır. Yani MMC ile muamele kromozomlardaki kırılmayı artırmıştır. MMC ile muamele sonucu en fazla kromozom kırılması, 1., 6., X, 4., 2., 3., 7., 9., 8., 5., 16., 10., 11. ve 13. kromozomlar olarak tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Etil metansulfonat (EMS), Mitomisin C (MMC), Lenfosit kültürü, İnsan kromozomları, Kromozom kırığı. I

4 ABSTRACT PhD THESIS THE SENSITIVITY OF THE HUMAN CHROMOSOMES TO ETHYL METHANESULFONATE (EMS) AND MITOMYCIN C (MMC) Songül BUDAK DİLER DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Year : 2006, Page :74 Jury : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Assoc. Prof. Dr. Eyüp RENCÜZOĞULLARI Asist. Prof. Dr. Hasan Basri İLA Asist. Prof. Dr. Ahmet KAYRALDIZ This study was carried out to examine the chromosome breaks formed within human chromosomes caused by mutagen Ethyl Methanesulfonate (EMS) and carcinogen Mitomycin C (MMC), and to determine the chromosomes experiencing the most breaks. To achieve this aim, the cells were treated with concentrations of 5x10-4 M, 10-3 M and 2x10-3 of EMS and μg/ml, 0.125μg/ml and 0.250μg/ml of MMC for 24 and 48h In the study, the percentages of chromosome breakages which were observed within different chromosomes in human peripheral blood lymphocytes treated with EMS for 24 and 48 hours in both the control and the same dose were compared, and the difference was found to be statistically significant. Moreover, the breakage percentages of the same chromosomes were compared with the percentages of the control; and the difference was found to be significant. That is, treatment with EMS led to more breakages. The most breakages via EMS were seen in the chromosomes of 1, 2, 6, 4, X, 7, 3, 5, 9 and 8. The percentages of chromosome breakages which were also observed within different chromosomes in human peripheral blood lymphocytes treated with MMC for 24 and 48 hours in both the control and the same dose were compared, and the difference was found to be statistically significant. Moreover, the breakage percentages of the same chromosomes were compared with the percentages of the control; and the difference was found to be significant. That is, treatment with MMC led to more breakages. The most breakages via MMC were seen in the chromosomes of 1, 6, X, 4, 2, 3, 7, 9, 8, 5, 16, 10, 11 and 13. Key words: Ethyl methanesulfonate (EMS), Mitomycin C (MMC), Lymphocyte cultures, Human chromosomes, Chromosome break. II

5 TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve çalışmalarım süresince bana rehber olan, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, öğrencisi olmaktan onur ve mutluluk duyduğum Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Genetik laboratuarında beraber çalıştığım ve her türlü yardımlarını gördüğüm Sayın Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI, Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA, Yrd. Doç. Dr. Ahmet KAYRALDIZ, Arş. Gör. Ayşe YAVUZ, Uzm. Biyolog Fatma Funda KAYA, Uzm. Biyolog Arzu YAVUZ a teşekkür ederim. Çalışmamda kullandığım istatistik programında bana yardımlarını esirgemeyen Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU ve Arş. Gör. Soner ÇANKAYA ile karayotip analizi için bana laboratuarlarını açan sayın hocam Prof. Dr. M. Emin ERDAL ve kıymetli arkadaşım Arş. Gör. Ebru DERİCİ ye sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Projemizi maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu Yöneticilerine de teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ......I ABSTRACT......II TEŞEKKÜR....III İÇİNDEKİLER......IV SİMGELER VE KISALTMALAR...VII ÇİZELGELER DİZİNİ...IX ŞEKİLLER DİZİNİ.....X 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Diepoksibutan (DEB) ile Yapılan Çalışmalar Etil karbamat (Uretan) (EK) ile Yapılan Çalışmalar Etil Metansulfonat (EMS) ile Yapılan Çalışmalar Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) ile Yapılan Çalışmalar Mitomisin C (MMC) ile Yapılan Çalışmalar Metil Metansulfonat (MMS) ile Yapılan Çalışmalar İyonize Radyasyon ile Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE METOD Kullanılan Kimyasal Maddeler Etil Methansulfonat (EMS) (Sigma) Etil Methansulfonat (EMS) ın Özellikleri Etil Methansulfonat (EMS) ın Kullanım Alanları Mitomisin C (MMC) (Kyova) Mitomisin C (MMC) nin Özellikleri Mitomisin C (MMC) nin Kullanım Alanları Kullanılan Kimyasal Maddelerin Eriyiklerinin Hazırlanması Etil Methansulfonat (EMS) Eriyiğinin Hazırlanması Mitomisin C (MMC) Eriyiğinin Hazırlanması Sorensen Tamponunun (Sorensen Buffer) Hazırlanması...17 IV

7 Kromozom Medyumu Kolkisin Hipotonik Eriyik Fiksatif Giemsa Entellan Nitrik Asit (HNO 3 ) Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Santrifüj Mikroskop İnkübatör Lamların Temizlenmesi Sterilizasyon Saf Suyun Sterilizasyonu Kromozomal Anormallikleri (KA) (Chromosomal Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması Preparatların Boyanması ve Daimi Preparatların Hazırlanması Mikroskobik İnceleme Kromozom Kırıklarının Saptanması Kayrotip Analizi İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi BULGULAR Etil Metansulfonat (EMS) a İnsan Kromozomlarının Hassasiyeti Saat EMS ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozomların Hassasiyeti Saat EMS ile Muamele Edilen İnsan Periferal V

8 Lenfositlerinde Kromozomların Hassasiyeti Mitomycin C (MMC) ye İnsan Kromozomlarının Hassasiyeti Saat MMC ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozomların Hassasiyeti Saat MMC ile Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozomlarının Hassasiyeti TARTIŞMA Etil Metansulfonat (EMS) a İnsan Kromozomlarının Hassasiyeti Mitomycin C (MMC) ye İnsan Kromozomlarının Hassasiyeti SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ...74 VI

9 SİMGELER VE KISALTMALAR Ara-C: Cytosine Arabinoside AH: Anormal Hücre BLM: Bleomisin CA: Chromosome Aberration CHO: Chinese Hamster Ovary CP: Cyclophosphamide DEB: Diepoksibutan DES: Dietilstilboestrol DMN: N-nitrozadimetilamin der: derive (türemek) DNA: Deoksiribonukleik Asit EMS: Ethyl methanesulfonate EK: Etil Karbamat FA: Fanconi anemi FISH: Fluorescence in Situ Hybridization GF: Griseofulvin GTG: Giemsa (Giemsa- Trypsin- Giemsa) bandlama tekniği γ: Gamma Işını HLA: Human Leukocyte Antigen (İnsan Lokosit Antijeni) HNO 3 : Nitrik Asit H 2 O 2 : Hidrojen Peroksit IARC: International Agency for Research on Cancer (Uluslar Arası Kanser Araştırma Kurumu) i: İzokromozom K: Karbosulfan KA: Kromozomal Anormallik KCl: Potasyum Klorür KD: Kromatid Değişimi KKD: Kardeş Kromatid Değişimi VII

10 LET: Linear Energy Transfer LD 50 : Bir Kimyasalın, Kullanılan Deneklerin Yarısını Öldüren Toksik Dozu LOH: Loss of Heterozygosite MMC: Mitomycin C MMM: Miyeloid Metaplasialı Miyelo MMS: Metil Metansulfonat MN: Mikronukleus M-FISH: Multi-colour Fluorescence in Situ Hybridization NaCl: Sodyum Klorür p: Kromozomun Kısa Kolu PCC: Premature Chromosome Condensation q: Kromozomun Uzun Kolu RI: Replikasyon İndeksi rpm: Round (Rotor) Per Minute SCE: Sister Chromatid Exchange t: Traslokasyon Tk: Timidin Kinaz UV: Ultraviole (Morötesi) VBL: Vinblstin sulfat WTK-1: Aynı Atadan Türeyen İnsan Lenfoblastoit Hücre Hatları VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Farklı Konsantrasyonlarda EMS ile 24 Saat Muamele Edilen, İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozomlar ve Dozlar Arası Kromozom Kırılma Yüzdelerinin Karşılaştırılması...26 Çizelge 4.2. Farklı Konsantrasyonlarda EMS ile 48 Saat Muamele Edilen, İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozomlar ve Dozlar Arası Kromozom Kırılma Yüzdelerinin Karşılaştırılması..34 Çizelge 4.3. Farklı Konsantrasyonlarda MMC ile 24 Saat Muamele Edilen, İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozomlar ve Dozlar Arası Kromozom Kırılma Yüzdelerinin Karşılaştırılması 40 Çizelge 4.4. Farklı Konsantrasyonlarda MMC ile 48 Saat Muamele Edilen, İnsan Periferal Lenfositlerinde Kromozomlar ve Dozlar Arası Kromozom Kırılma Yüzdelerinin Karşılaştırılması 46 IX

12 ŞEKİLLERİN DİZİNİ SAYFA Şekil 4.1. İnsan Kromozomlarından 2. ve 3. Kromozomdaki Kırık, 3. Kromozomda Delesyon ve Karyotipi [5x10-4 M Etil Metansulfonat (EMS), 24 Saatlik Muamele ] Şekil 4.2. İnsan Kromozomlarından 1., 2. ve 10. Kromozomlardaki Kırıklar ve Karyotipi [10-3 M Etil Metansulfonat (EMS), 24 Saatlik Muamele ]...30 Şekil 4.3 İnsan Kromozomlarından 9. ve 13. Kromozomlardaki Kırıklar ile X Kromozomundaki Delesyon ve Karyotipi [2x10-3 M Etil Metansulfonat (EMS), 24 Saatlik Muamele ]...31 Şekil 4.4. İnsan Kromozomlarından 3. ve X Kromozomundaki Kırıklar ve Karyotipi [2x10-3 M Etil Metansulfonat (EMS), 24 Saatlik Muamele ]...32 Şekil 4.5. Farklı Dozlarda Etil Metansulfonat (EMS) ile 24 Saat Muamele Edilmiş İnsan Periferal Lenfositlerinde Anormal Hücre Yüzdesinin Doza Bağlı Artışını Gösteren Regresyon Doğrusu ve Korelasyon Katsayısı (**:p<0,01).33 Şekil 4.6. İnsan Kromozomlarından 7. Kromozomdaki Kırık ve Karyotipi [5x10-4 M Etil Metansulfonat (EMS), 48 Saatlik Muamele ]...36 Şekil 4.7. İnsan Kromozomlarından 1., 2., 8. ve 9. Kromozomlarda Kırıklar, 3. ile 21. Kromozomları Arasında Kromotid Değişimi ve Karyotipi [10-3 M Etil Metansulfonat (EMS), 48 Saatlik Muamele ]...37 Şekil 4.8. İnsan Kromozomlarından 1., 4., 11.ve 16. Kromozomlardaki Kırıklar ve Karyotipi [2x10-3 M Etil Metansulfonat (EMS), 48 Saatlik Muamele ]..38 Şekil 4.9. İnsan Kromozomlarından 1. Kromozomun Sentromer Bölgesindeki Kırık ve Karyotipi [0,125µg/ml Mitomisin C (MMC), 24 Saatlik Muamele ] 42 Şekil İnsanın 1., 2., 3., 6., 8., 15. ve 17. Kromozomlarındaki Kırıklar ve 6.- X

13 19., X-12. ve Kromozomlar Arasındaki Kromatid Değişimi ve Karyotipi [0.125µg/ml Mitomisin C (MMC), 24 Saatlik Muamele ]. 43 Şekil İnsan Kromozomlarından 1. Kromozomdaki Kırık ve Karyotipi [0,250µg/ml Mitomisin C (MMC), 24 Saat Muamele Süresi ].. 44 Şekil İnsan Kromozomlarından 1. ve 2. Kromozomlardaki Kırıklar ve Karyotipi [0.0625µg/ml Mitomisin C (MMC), 48 Saatlik Muamele ] Şekil İnsan Kromozomlarından X Kromozomundaki Kırık ve Karyotipi [0,0625µg/ml Mitomisin C (MMC), 48 Saatlik Muamele ] Şekil İnsan Kromozomlarından 1. ve 6. Kromozomlardaki Kırıklar ve Karyotipi [0,125µg/ml Mitomisin C (MMC), 48 Saatlik Muamele ]..50 Şekil İnsan Kromozomlarından 2. Kromozomdaki Kırık ve Karyotipi [0,125µg/ml Mitomisin C (MMC), 48 Saatlik Muamele ]...51 Şekil İnsan Kromozomlarındaki Kromatid Değişimi (KD) (3. Kromozom İle 14.Kromozom Arasında), 7. Kromozomda Kırık ve Karyotipi [0,125µg/ml Mitomisin C (MMC), 48 Saatlik Muamele ] Şekil İnsan Kromozomlarında Kromatid Değişimi (1.Kromozomun Kısa Kolları Arasında ve 7. Kromozom ile 13. Kromozom Arasında), 9.Kromozomda Kırık ve Karyotipi [0,250µg/ml Mitomisin C (MMC), 48 Saatlik Muamele ] 53 Şekil İnsan Kromozomlarındaki Kromatid Değişimi (KD) ve Karyotipi [0,250µg/ml Mitomisin C (MMC), 24 Saatlik Muamele ] XI

14 1.GİRİŞ Songül BUDAK DİLER 1. GİRİŞ Günümüzde tüm canlıları tehdit eden çevresel tehlikeler değişmekte ve farklı boyutlar kazanmaktadır. İnsanlığın kullanımına sunulmuş 2 milyon çeşitten fazla kimyasal madde mevcut olup, bunlara her yıl ortalama yeni kimyasal madde eklenmekte ve kullanıma sunulmaktadır (Agüloğlu ve Ortakaya 1992). Gelişen teknoloji insanlığa bazı alanlarda rahatlık sağlarken, ayrıca bir çok sorunu da beraberinde getirmektedir. Bu sorunların başında da kullanılan sentetik maddelerin çoğalması ve besinlerle iç içe olması, tarım alanlarında kullanılan zirai ilaçlar ve sanayiye bağlı olarak doğanın kirlenmesidir ( breastcancer. realage.com/content.aspx/topic/ ). Ayrıca nükleer atıkların insan sağlığını etkileyerek, insanlarda genetik yapısının bozulmasına ve kalıtsal hastalıklara neden olduğu bildirilmiştir ( nuke.html ). Özellikle ilaç olarak tedavide kullanılan, doğal (taxol; Pasifik porsuk ağacıdan elde ediliyor, vincristine; Cezayir menekşesinden elde ediliyor) ve sentetik maddelerin etkileri araştırılmış, bunların kontrolsüz ve aşırı düzeyde kullanıldıklarında, insanlar üzerinde genotoksik etkilerinin olduğu belirlenmiştir ( cfm/ new_cancer_treatments/ ). Bu maddelerin yanlış kullanılmalarının, maddeye maruz kalan insanlarda ciddi hastalıkların oluşmasına ve kanser vakalarının artmasına sebep olduğu bilinmektedir. Kanserli hastalar için ilaç olarak tedavide kullanılan, sentetik maddelerin (antibiyotikler; daunomisin, adriamisin, bleomysin, mitomisin C) etkileri daha önceki yapılan çalışmalarla az çok belirlenmiş, bu tür maddelerin yan etkilerinin de olabileceği fark edilerek, konunun bu yönde de incelenmesi gerektiği tartışmaya açılmıştır (Baldev, 1979). Günümüzde kanserli hastaların tedavisinde kullanılan kimyasal ilaçların ve radyoterapi uygulamalarının insan kromozomları üzerindeki etkileri çeşitli teknikler kullanılarak, detaylı bir şekilde incelenmektedir (Bauman ve ark, 2000). 1

15 1.GİRİŞ Songül BUDAK DİLER İnsanlarda kanser tedavisinde kullanılan ilaçların kalıtsal yapıda oluşturabilecekleri mutasyonlar önemlidir. Çünkü bu tür mutasyonlar kromozomların kırılmasına ve dolayısıyla da kanserli hücrelerin sayısının artmasına neden olmaktadır (Rigaud ve ark, 1990). Bu maddeler insanlarda tedavisi mümkün olan geçici rahatsızlıklar yapabildiği gibi, en önemlisi ve en tehlikelisi olan, ayrıca tedavisi de olmayan kalıtsal yapıda oluşturabilecekleri DNA hasarları da ortaya çıkartabilirler. Kişinin DNA sının zarar görmesi, kansere yatkınlığının artması demektir. Kimyasal maddelerin insan kromozomlarında oluşturduğu hasarlar kısa süreli genotoksidite testleri ile belirlenebilmektedir. Kısa süreli genotoksidite testleri olarak bilinen ve kimyasal bir maddenin genotoksik etkiye sahip olup olmadığının belirlenmesinde kullanılan kardeş kromatid değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange = SCE) ve kromozom anormalliği (KA) (Chromosome aberrations = CA) testleri, Perry ve Evans (1975) ın, bilinen mutajen ve kanserojenlerin KKD ve KA oluşumunu artırdığını saptamalarından sonra, mutajen ve kanserojenlerin belirlenmesinde kullanılmaya başlanmıştır. Bu araştırıcılar çeşitli mutajen ve kanserojenlerin Chinese hamster ovary (CHO) hücrelerinde KKD ve KA oluşumunu artırdığını saptamışlardır. Carrano ve ark (1978), mutajen ve kanserojenlerin toksik dozların altında meydana getirdikleri genetik hasarların süratle, hassas ve kantitatif gösterilmesinin KKD ve KA ların analizi ile mümkün olabileceğini, ayrıca bir maddenin mutasyon meydana getirmesi ile KKD oluşumunu arttırması arasında lineer bir ilişkinin olduğunu da belirtmişlerdir. Görüldüğü gibi bir maddenin potansiyel mutajen ve kanserojen olup olmadığının anlaşılması için bu maddenin KKD ve KA yı artırıp artırmadığının belirlenmesi ile de mümkün olabilmektedir. Baldev (1979), kimyasalların karsinojenik ve mutajenik özellikleri arasındaki güçlü korelasyonu inceleyerek, antineoplastik ajanların belirli kanser tiplerini tedavi ederken, diğer bazı kanser tiplerini başlatabileceğini ileri sürmüş ve Daunomisin (daunorubisin), adriamisin, bleomisin, aktinomisin D ve mitomisin C (MMC) gibi bazı antibiyotik antikanserojen ajanların genetik etkilerini yeniden incelemiştir. Bunlardan MMC nin DNA ile kovalent bağlar oluşturduğu ve tek iplik kırıklarına 2

16 1.GİRİŞ Songül BUDAK DİLER neden olduğunu saptamıştır. Bazı durumda kimyasallar ile radyasyon arasında (MMC ye karşı UV ve bleomisin ne karşı X ışını) paralellik bulunmaktadır. Bu kimyasallar düşük konsantrasyonda uygulandıkların zaman sadece hücre döngüsünü tersine çevirirler. Fakat MMC nin alkilleyici özelliğinden dolayı mutajenik olduğu, Drosophila, fare ve insan HLA sistemi ile yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Ayrıca MMC ve bleomisinin memelilerde G 0 kromatinini etkilediği görülmüş ve MMC nin en büyük etkisinin homolog kromozomların özellikle heterokromatin alanlarında quadriradyal figür oluşumlarına neden olduğunu belirlemiştir. MMC ve aktinomisinin meydana getirdiği aberasyonların genellikle kromatid tipi olduğu, diğer antibiyotiklerin ise hem kromatid hem de kromozom tipi aberasyonlar meydana getirdiği ve ayrıca MMC, daunomisin ve adriamisinin KKD ye neden olduğu da gözlenlemiştir. Ishidate ve ark (1984), Salmonella mikrozom testi (Ames testi) ve kromozom aberasayon testi (Chinese hamster fibroblast hücre hattı) ile sentetik ve doğal kaynaklardan elde edilen katkı maddelerini incelemişler ve genotoksik etkiler saptamışlardır. İnsanda bulunan kromozomlardan hangilerinin mutajen ve kanserojenlere karşı daha hassas olduğunu belirleyen çalışmalar son yıllarda yapılmaya başlanmıştır. Örneğin Lefrançois ve ark (1989), düşük dozda γ ışınlarının kromozomlar üzerine yaptığı etkiyi, R-bandlama yöntemi ile incelemişlerdir. γ ışınının insan kromozomlarının 7p14, 7q35, 14q12 ve 14qter bölgelerinde kırığa neden olduğunu saptamışlardır. Ayrıca 7 ci ve 14 üncü kromozomlarda inversiyon ve yine 7.-;14 kromozomlar arasında translokasyona neden olduğunu belirlemişlerdir. Gaddini ve ark (1995), yaygın frajil (kırılgan) bölgeler ile KKD arasındaki ilişkiyi insan lökosit kültüründe incelemişlerdir. Bu çalışmada, kromozomal lezyonların yokluğunda, frajil bölgeleri frajil olmayan KKD bölgeleri gibi zannetmişler, oysa lezyonların varlığında hem frajil hem de frajil olmayan bölgelerde aynı olasılıkla KKD meydana geldiği gözlenmiştir. Ellard ve ark (1996), daunomisin tarafından indüklenen kromozom aberasyonlarını belirlemek için, multi-colour fluorescence in situ hybridization 3

17 1.GİRİŞ Songül BUDAK DİLER (Multicolour FISH) analizi ile homojen olarak giemsa ile boyanmış kromozomların metafaz analizi sonuçlarını karşılaştırmışlardır. Bu maddenin oluşturduğu kromozom aberasyonlarını belirlemede multicolour FISH in homojen giemsa boyamaya göre daha iyi sonuç verdiğini gözlemlemişler, fakat giemsa boyama analizinin, karsinogenez ile direkt ilişkisi olan sitogenetik son nokta çalışmalarında (sitogenetik olarak direk mutasyonu gösteren çalışmalar) faydalı olduğunu da ileri sürmüşlerdir. Surralles ve ark (1997a), 1 nolu insan kromozomunun frajilitesi bilinen 1q12 bölgesinde DNA tamirinin olup olmadığını araştırmışlar ve insandaki 1 nolu kromozomun heterokromatininde düşük düzeyli DNA kesip çıkarma mekanizmasının varlığını göstermişlerdir. Sasiadek ve ark (1998), Diepoksibutan (DEB) nın insan kromozomlarında (1p, 1q, 2p, 2q, 6q, 9q ve 14q bölgelerinde) kromozom kırığı oluşturduğunu, giemsa (GTG) bandlama tekniği ile belirlemişlerdir. Bazı kanser türlerinde özellikle belirli kromozom mutasyonlarına rastlanır. Örneğin kronik miyelotik losemili hastaların %90 nının kan kültürü ve kemik iliği hücrelerinde Fi kromozomu (Ph 1 kromozomu = Philadelphia kromozomu = 22. kromozomun uzun kolundan bir parçanın kopup kaybolması sonucu oluşan delesyonlu kromozom ) görülür. Aynı zamanda 22. kromozomdan kopan parçanın 9.kromozomun uzun koluna translokasyonu da belirlenmiştir (Murken ve Cleve, 1984). Akut lösemili hastalarda da 4. kromozom ile 11.kromozomun uzun kolları arasında resiprokal translokasyonlara sık rastlanır. İnsan kromozomlarında bazı kromozomların belirli bölgelerinin kırılmaya meyilli olduğu ilk defa 1970 yılında Almanya da saptanmıştır. Kırılgan bölge ile kanser arasında bir ilişkinin olduğu da ilk kez Croce ve ark. tarafından rapor edilmiştir (Croce ve ark, 1996: Klug ve Cummings 2000 den). Görüldüğü gibi kromozom mutasyonları ile kanserleşme arasında bir ilişkinin olduğu açıktır. Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan Mitomisin C (MMC), bazı kanser türlerinde (Mide kanseri, anüs ve kalın barsak kanserleri, göğüs kanseri, büyük hücreli akciğer kanseri, baş ve boyun kanserleri, küçük mesane papillomaları, pankreas kanseri, rahim kanseri) tedavi edici ilaç olarak kullanılmaktadır 4

18 1.GİRİŞ Songül BUDAK DİLER ( ). Etil metansulfonat (EMS) ise mutasyon çalışmalarında, mutajen, teratojen ve beyin karsinojeni oluşturmak için deneysel olarak en çok kullanılan mutajen bir maddedir. Ayrıca kimyasal araştırmalarda kullanılabildiği gibi, kimyasal steril edici olarak da kullanılır. Methanesulfonik asidin monoesteri, böcek ve memelilere zarar veren kemosterilantlara dönüştürülebilmekte ve hatta erkeklerde gebeliği önleyici bir madde olarak da kullanılabilmektedir ( profiles/s 088ethy.pdf ). İşte bu çalışmanın amacı, MMC ve EMS ye karşı insan kromozomlarının hassasiyet derecelerini kromozom mutasyon testi ile araştırmaktır. 5

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Songül BUDAK DİLER 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Kimyasallara ve iyonize ışınlara karşı kromozomların hassasiyetini belirleme çalışmalarını aşağıdaki şekilde sıralayabiliriz Diepoksibutan (DEB) ile Yapılan Çalışmalar Sasiadek ve ark (1998), Diepoksibutan (DEB) ın genotoksik etkilerini klasik ve moleküler sitogenetik yöntemleri ile araştırmışlardır. In vitro insan kan lenfositlerinde DEB tarafından indüklenen kromozom anormalliklerinin analizi için 3 metot uygulamışlar, bunlar giemsa boyama, giemsa (GTG) bantlama ve FISH metodlarıdır. Bu maddenin kromozom kırıklarını, gapları, tri ve quadriradial asentrik figür oluşumlarını indükleyerek, aşırı klastojenik olduğunu belirlemişlerdir. Giemsa bantlama (GTG) yöntemi ile insan kromozomlarında kırıkların 1p, 1q, 2p, 2q, 6q, 9q ve 14q bölgelerinde lokalize olduğunu göstermişlerdir. Kook ve ark (1998), DEB ve MMC kullanarak, çocuklardaki Fanconi anemi (FA) hastalığını belirlemişler ve FA lı hastalarda bu iki maddenin kromozom kırıklarını indüklediğini saptamışlardır. Ilgın ve ark (1999), FA lı hastalarda DEB ve MMC nin kromozom kırıklarını indüklediğini tespit etmişlerdir. DEB ve MMC bu hastalardan yapılan lenfosit kültürlerinin son 24 saatine 0,01µg/ml olarak ilave edilmiş ve 48 saat sonra hücreler toplanarak, preparatlar hazırlamış ve bu maddelerin kırıkları artırdığını saptamışlardır Etil karbamat (Uretan) (EK) ile Yapılan Çalışmalar Kültüre edilmiş insan lenfositlerinde uretan ve hidroksiuretan nın kardeş kromatid değişimini indüklediği Csukas ve ark (1979) tarafından bulunmuştur. Csukas ve ark (1981), etil karbamat (10-2 M) ve vinil karbamatın (10-2 M), kültüre edilmiş insan periferal kan lenfositlerinde S9 mix yokluğunda yaptıkları çalışma ile KKD yi artırdığını bildirmişlerdir. 6

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Songül BUDAK DİLER Allen ve ark (1986), etil karbamat ve vinil karbamatın kemirici hücrelerindeki tumoregenik ve genotoksik etkilerine bakmışlar ve bu iki maddenin çeşitli fare soylarının karaciğer hücrelerinde adenomaları ve KKD yi indüklediğini göstermişlerdir. Rencüzoğulları ve Topaktaş (2000), EK (2x10-3, 4x10-3, 8x10-3 ), Karbosulfan (K) (2,5x10-5,5x10-5,10-4 )ve EMS (5x10-4, 10-3, 2x10-3 ) ile yaptıkları çalışmada, EK nın tek kullanıldığı zaman KKD yi artırdığını fakat KA yı çok artırmadığını belirtmişlerdir. Ayrıca EK nın karbonsulfan ile birlikte kullanıldığında KKD oranını kontrole göre önemli derecede artırdığını da göstermişlerdir Etil Metansulfonat (EMS) ile Yapılan Çalışmalar Stetka ve Wolff (1976), EMS yi tavşanların karın zarı içine verdiklerinde periferal lenfositlerde KKD yi artırdığını saptamışlar. Rasko ve ark (1979), EMS nin CHO hücrelerinde KKD frekansını doza bağlı olarak artırdığını saptamışlardır. Skinner ve ark (1983), EMS nin (75-150mg/kg) döllere aktarılabilecek translokasyonlarını dişi sıçan fibroblast kromozomlarında, giemsa kromozom bantlama metodu ile incelemişler ve doza bağlı olarak, bu tür translokasyonların F 1 generasyonunda da bulunduğunu göstermişlerdir. During (1985), EMS nin tüm kan ve sadece lenfosit ihtiva eden kültürlerde KKD i artırdığını saptamıştır. Maddock ve ark (1986), EMS nin balık hücrelerinde KKD ve KA frekansını doza bağlı olarak artırdığını, fakat replikasyon indeksini (RI) etkilemediğini göstermişlerdir. Adhikari ve Grover (1988), EMS nin sıçan kemik iliği hücrelerinde KA oluşumuna neden olduğunu açıklamışlardır. Whittaker ve ark (1990), EMS nin S. cerevisiae da mayoz ve mitozda kromozom artışına neden olduğunu bildirmişlerdir. 7

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Songül BUDAK DİLER Topaktaş ve Speit (1990), EMS nin insan periferal lenfositlerinde KKD frekansını doza bağlı olarak artırdığını, RI yı doza bağlı olmaksızın düşürdüğünü göstermişlerdir. Surralles ve ark (1997b), yüksek gen yoğunluğuna sahip insan kromozomları (1, 19 ve 20) ile daha düşük gen yoğunluğuna sahip (4 ve 18) kromozomların, sitozin arabinoz (Ara-C) ile EMS ye (bu maddeler kombine bir şekilde verildiğinde), hassasiyet ve klastojenitelerini karşılaştırmışlardır. Sonuç olarak yüksek gen yoğunluğu içeren kromozomların, bu iki maddeye hassas olduğunu ve bu hassasiyetin de, DNA kesip çıkarma tamir sisteminin bu kromozomlarda yüksek olduğunun göstergesi olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Harish ve ark. (1998), insan periferal kan lenfositlerini EMS (1,5x10-4 M ve 1,5x10-3 M) ve MMS (1,5x10-5 M ve 1,5x10-4 M) ile muamele etmişler ve bu maddelerin kardeş kromatid değişimini kontrole göre artırdığını bulmuşlardır. Rencüzoğulları ve Topaktaş (2000), yaptıkları çalışmada, EMS nin (5x10-4 M, 10-3 M ve 2x10-3 M) insan periferal kan lenfositlerinde KA artışına neden olduğunu belirlemişlerdir Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) ile Yapılan Çalışmalar Flores ve ark (1996), sığır ve tavşan lenfositleri ile yaptıkları çalışmanın, insan lenfositleri ile yapılan hidrojen peroksidin tek iplikli DNA kırıkları oluşturması ile ilgili çalışmaları destekler nitelikte bulmuşlardır. Araştırıcılar H 2 O 2 in çoğunlukla serbest radikaller meydana getirerek, bu tür kırıklar oluşturduğunu göstermişlerdir. Andreoli ve ark (1999), H 2 O 2 (25-100µM) ve MMS nin ( µM) insan lenfositlerinde (kültürün ilk 16 saatinde) DNA hasarlarını artırdıklarını, alkalin tek hücre jel elektroferezi ve sitogenetik metotlar kullanarak belirlemişlerdir. Donnelly ve ark (1999), H 2 O 2 nin insan sperm ana hücrelerinde DNA hasarlarını indüklediğini, alkalin tek hücre jel elektroforezi testi ile göstermişlerdir. Bu çalışma 15 kişi ile yapılmış ve bir de kontrol kullanılmıştır. 8

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Songül BUDAK DİLER Fenech ve ark (1999), insan lenfositlerinde, sitokinez bloklama mikronukleus testi ile H 2 O 2 nin (0-100µM) mikronukleus oluşumunu artırdığını ve sitotoksik etkisinin olduğunu bulmuşlardır. Zunino ve ark (2001), H 2 O 2 nin muamelesinden sonra Fanconi anemi (FA) hücre hatlarının normal lenfosit kültürüne göre daha hassaslaştığını ve bu hücre hatlarında DNA kırıklarının arttığını tespit etmişlerdir Mitomisin C (MMC) ile Yapılan Çalışmalar Shiraishi ve ark (1979), Mitomisin C (MMC) nin normal ve anormal insan lenfosit hücre hatlarındaki etkisini incelemişler ve MMC nin normal hücre hatlarında kromozom aberasyonlarını (KA) indüklediğini, kardeş kromotid değişimini (KKD) artırdığını gözlemişlerdir. Oysaki kronik lemfositik lenfoma (hat SN 1029 ve SN 1033) ve Burkitt lemfoma (hat B35 M ve HR1K) da KKD çarpıcı bir şekilde artarken, kromozom anormalliklerindeki artışın dikkat çekici olmadığını bulmuşlardır. Surralles ve ark (1995), herbisid arachlor (7,5-20 µg/ml), klastojen MMC (0.6 microm) ve aneojen vinblastin sulfat (VBL) ın insan lenfositlerinde klastojenik aneojenik etkilerini belirlemek için sitokinez bloklama mikronükleus (MN) metodunu uygulamışlardır. MN oluşumlarında kinetekor veya sentromer bölgelerinin olup olmadığını belirlemek için hassas boyalar kullanmışlar ve alachlor ile MMC nin aneojenik özellik göstermediğini, MN oluşumlarında kinetekorların bulunduğunu belirlemişlerdir. VBL de ise MN oluşumlarında hem kinetekor ve hem de sentromerlerin bulunduğunu göstermişlerdir. Liou ve ark (1996), daha önce arseniğe maruz kalmış kişilerde, MMC nin KKD yi indükleyip indüklemediğine ve MMC ye hassasiyeti araştırmışlar ve MMC nin hem arseniğe maruz kalanlarda hem de maruz kalmayanlarda yaklaşık aynı oranda KKD meydana getirdiğini bulmuşlardır. Henderson ve ark (1998), H 2 O 2, 4-nitroquinolin oksid, 9-aminoacridin, EMS, N-nitroso-N-ethilure ve glioksal gibi genotoksik maddelerle, MMC gibi sitotoksik maddelerin genotoksiditesini Comet testi ile incelemişlerdir. Comet testiyle 9

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Songül BUDAK DİLER DNA daki kararsız alkali bölgeleri ile tek iplik kırıkları ve nekrosis veya apoptosisin neden olduğu DNA bozulmaları belirlenebildiği için H 2 O 2, 4-nitroquinolin oksid, 9- aminoacridin, EMS, N-nitroso-N-ethilure ve glioksal ın DNA da yapmış oldukları hasarlar bu testte gösterilmiş, fakat MMC nin oluşturduğu hasarlar gösterilememiştir. Sebebi de MMC nin DNA çapraz bağları oluşturduğunu ve bu anormalliği belirleyebilmek için de bu testin modifiye edilmesi gerektiğini ileri sürmüşlerdir. Dobrzyriska ve Gajewski (1999), X ışınları ve siklofosfamid (cyclophosphamide = CP) ile X ışınları ve MMC yi birlikte kullanarak, fare kemik iliği polikromatik eritrositlerindeki mikronükleus oluşumunun uyarılmasını araştırmışlardır. Bu maddeleri X ışını ile birlikte yüksek (1.00Gy + 100mg/kg siklofosfamid ve 1.00Gy mg/ml MMC) ve düşük (0.25Gy + 25mg/kg siklofosfamid ve 0.25Gy mg/ml MMC) kombinasyonlarda kullanmışlardır. Her iki kimyasalın yüksek ve düşük dozlarının, ışınların sebep olduğu mutajenik etkileri artırdığını belirlemişlerdir. Kusakabe ve ark (1999), klastojenik ajanlar tarafından indüklenen, olası kromozom aberasyonlarını belirlemek için kromozom 9 un aberasyonlarını incelemişlerdir. Kültüre edilmiş insan kan lenfositleri G 0 fazında MMC ye maruz bırakıldıktan sonra, 9p veya 9q nun diğer kromozomlara transloke olduğunu fluoresens in situ hibridizasyon tekniği ile boyayarak tespit etmişlerdir. Nesti ve ark (2000), Griseofulvin (GF) ve MMC ye maruz bırakılan insan karaciğer fibroblastlarını sitokinez bloklama yoluyla mikronükleus oluşum ve FISH metotlarını kullanarak incelemişlerdir. MMC nin doz ve zamana bağlı olarak mikronükleus (MN) oluşumunu indüklediğini, GF nin ise MMC ye göre daha az etkili olduğunu bulmuşlardır. FISH analizi ile MMC nin mikronükleus oluşumunun uyarıldığı hücrelerde tüm kromozomlardan ziyade, genellikle fragmentler içeren MN ler oluştuğunu belirlemişlerdir. Gustafson ve ark (2000), Vanillin (3-methoksi-4-hidroksibenzaldehid) in H 2 O 2, MMC ve N-metil-N-nitrosoguanidin gibi toksik ajanlar tarafından indüklenen mutasyonları engellediğini göstermişler ve Vanillin in mutasyonları engelleme görevini, insanın 11. kromozomu üzerinde bulunan CD59 lokusundaki mutasyon inhibitör geni ile yaptığını ileri sürmüşlerdir. 10

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Songül BUDAK DİLER Fauth ve ark (2000), insan lenfosit kültüründe klastojen MMC (500ng/ml) ile aneojen dietilstilboestrol (DES) ün (80µM) MN indüksiyonu ile metafaz kromozomlarındaki sayısal ve yapısal değişimlerini incelemişlerdir. Bu maddeleri kültür yapmadan 23 saat önce kültüre ilave etmişlerdir. MMC ile muameleden sonra MN oluşumunun 18 kat arttığı ve metafaz kromozomlarında yapısal kromozomal anormallikleri ile hipodiploidiye neden olduğunu göstermişlerdir. İncelenen metafazların yaklaşık %75 inde kromozom 9 ve 1 in perisentrik heterokromatininin az yoğunlaştığını ve MN oluşumunda %62-69 oranında 7.ve 9. kromozomdan, %12 oranında da 1. kromozomdan kopan parçaların rol oynadığını saptamışlardır. DES ile indüklenen MN lerde hemen hemen tüm kromozomlardan parçaların olduğunu FISH analizi ile göstermişlerdir. Nakanishi ve ark (2002), Fanconi anemi (FA) ve Nijmegen kırık sendromu (NBS) nun MMC ye hassas olduğunu ve bu hassasiyetten dolayı, bahsi geçen iki hastalık arasında fonksiyonel bir bağ olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Zhang ve ark (2003), insan lenfosit DNA sı üzerine MMC (DNA çapraz bağları oluşturur), bleomisin (BLM) (radiometrik ajan), MMS (alkilleyici ajan) ve düşük şiddette (2,450 MHz) mikrodalganın kombine etkisini incelemişlerdir. Mikrodalganın DNA hasarlarını direkt olarak indüklemediğini, fakat MMC nin oluşturduğu DNA hasarlarının etkisini artırdığını tespit etmişlerdir. Mikrodalga ile diğer iki kimyasalın ise böyle bir etkisinin olmadığını gözlemlemişlerdir. Krishnaja ve Sharma (2003), Vitamin C (L-askorbik asit) nin (200µg/ml ile 1-2 saat ön muamele) in vitro insan lenfositlerinde MMC nin ( µg/ml) indüklediği kromozomal aberasyonların oluşumu için iyi bir ortam oluşturduğunu belirlemişlerdir Metil Metansulfonat (MMS) ile Yapılan Çalışmalar Kimyasal kanserojenler ile muamele edilen insan periferal kan lenfositlerinin DNA daki kesip çıkarma tamir sisteminin eksikliği Scudiero ve ark (1976), tarafından incelenmiştir. Bu kimyasallardan concanavalin A nın 72 saatlik muamelede DNA hasarlarını tamir için hücreleri daha çok uyardığı 11

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Songül BUDAK DİLER gözlemlemişlerdir. Aynı çalışmada N- asetoksi-2-asetilaminofluoren ve metil metansulfonat (MMS) DNA hasarlarını tamir için hücreleri yaklaşık aynı oranda fakat concanavalin A dan daha az uyardıklarını belirlemişler ve MMS ile muamele edilen lenfositlerde DNA da tek iplik kırıklarının oluşmasının, hücresel DNA nın bozulmasına neden olduğunun bir delili olarak göstermişlerdir. Martelli ve ark (1985), N-nitrozadimetilamin (DMN) ve methil metansulfonat (MMS) ın insan hematosit primer kültüründe, DNA hasarlarını indüklediğini bulmuşlardır. Darroudi ve Natarajan (1989), CHO-K1 in X ışınına hassas iki mutantı genotoksik kimyasal maddelerden olan bleomisin, MMS, EMS, MMC ve DEB ile muamele ederek, kromozom aberasyonu (KA) ve KKD i incelemişler ve bu mutantların daha çok KA ya hassas olduğunu bulmuşlardır. Garcia ve ark (2001), MMS nin (1.3, 2.5 ve 5mM) artan dozlarının, G1 lenfositlerinde (insan periferal kanı) kromozomal fragmentasyonu artırdığını, zamansız kromozom kondenzasyonu (premature chromosome condensation = PCC) tekniği ile belirlemişlerdir İyonize Radyasyon ile Yapılan Çalışmalar Jeggo ve ark (1991), kültüre edilmiş memeli hücre hatlarında iyonize radyasyona (gama ışınlarına) hassas mutantların genetik analizini yapmışlar ve bu mutantlardan en az üç farklı koplementasyon grubunun çift iplikli DNA kırıklarını tekrar birleştirme yeteneklerinin azaldığını belirlemişlerdir. Testard ve ark (1997), kromozomal aberasyonların oluşmasında, yüksek lineer enerji aktarılması (LET) ( keV/mikron) partiküllerinin, seyrek iyonize radyasyondan daha etkili olduğunu saptamışlardır. Tawn ve ark (2000), Sellafield nükleer santralinde radyasyona (>500mSv - <50mSv) maruz kalan işçilerin kromozom analizini yapmışlar ve C grubu kromozomlarda (kromozom uçlarında) fazlalık, F grubu kromozomlarda da (kromozom uçlarında) eksiklik olduğunu göstermişlerdir. 12

26 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER 3. MATERYAL VE METOD Bu çalışmada materyal olarak sigara içmeyen yakın yaşlardaki iki erkek (23 ve 24 yaşlarında), iki bayandan (23 yaşlarında) alınan periferik kan ve test maddesi olarak da Etil metansulfonat (EMS) ve Mitomisin C (MMC) kullanılmıştır Kullanılan Kimyasal Maddeler Etil Methansulfonat (EMS) (Sigma) Etil Methansulfonat (EMS) ın Özellikleri Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan Etil Methansulfonat (EMS), ısıtıldığı zaman toksik sulfur oksid gazı yayan, renksiz sıvı bir maddedir. ( ) Açık formülü : Kapalı formülü :C 3 H 8 O 3 S Molekül ağırlığı : Yoğunluk :1.15 g cm -3 Kaynama noktası :213 o C CAS No : Sigma No : M-0880 Sinonimler : Methanesulfonic acid ethyl ester, EMS, half-myleran, MSC 26805, ENT ( ) 13

27 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER Etil Methansulfonat (EMS) ın Kullanım Alanları Etil methansulfonat, mutajen, teratojen bir madde olup, beyin kanseri oluşturması dolayısıyla deneysel araştırmalarda kullanılmaktadır. Kimyasal steril edici olarak kullanılabilir. Methanesulfonik asidin monoesteri, böcek ve memelilere zarar veren kemosterilantlara dönüştürülebilir ve ayrıca erkeklerde gebeliği önleyici bir madde olarak da kullanılabilir. Etil methansulfonat ABD de ticari olarak üretilmemekte, fakat araştırma amaçlı olarak sınırlı üretilmektedir. Etil methansulfonat a, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Mesleki Maruz Kalma Servisinin tahminlerine göre, 448 bayan olmak üzere toplam 971 kişi maruz kalmaktadır. Mesleki olarak maruz kalanlar sınırlıdır ve bunlar laboratuar çalışanları ile temizlik işleri yapan kişilerdir. Toplumun genelinde maruz kalan ise böcek ve memeli zararlıları ile gebelikten korunan erkekler kabul edilmektedir. EMS nin doğada bulunup bulunmadığı bilinmemektedir ( ) Mitomisin C (MMC) (Kyowa) Mitomisin C (MMC) nin Özellikleri Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan, Mitomisin C (MMC) mavimenekşe renkte, kristal şeklinde ve suda çözünebilen bir maddedir. Suda çözünen (ph=6-9) eriyik, ışıktan korunduğu ve 5 o C altındaki buzdolabında saklandığı zaman yedi gün özelliğini korumaktadır ( ). Mitomisin C 2mg ve 10mg lık şişelerde toz şeklinde bulunur. MMC antinoplastik (urların büyümesini önleyen) ve geniş spekturumlu bir sitostatik (hücre bölünmesini durduran) ajandır. İnsanlara 12-14mg/m 2 ayda bir veya her 35 günde bir damar yolu ile verildiği zaman sitostatik etkisini gösterir. Vitamin B bileşikleri ile verilmesinin daha uygun olduğu öngörülmüştür 14

28 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER ( /mitomyc.html., ). Hayvanlarda kullanılan oral LD 50 dozu, sıçanlarda 30 mg/kg, farelerde ise 23 mg/kg olarak belirlenmiştir ( Mitomycin_ DSDS_GB_ pdf., ). Açık formülü : Kapalı formülü :C 15 H 18 N 4 O 5 Molekül ağırlığı :334.3 Kaynama noktası :360 o C CAS No : Katalog No : Sinonimler :Ametycine, Mitocin C, Mutamycin ( , anced.jsp., ) Mitomisin C (MMC) nin Kullanım Alanları Mitomisin C (MMC), antineoplastik ilaçlar grubuna girmektedir. Bu grupta cyclophosphamide, daunamycin, mitomycin C, streptozotocin ve uracil mustard bulunmaktadır. Bu ilaçlar IARC tarafından kanserojenik özelliklerine göre iki gruba ayrılmışlardır. Grup 1; İnsan için kanserojenik olanlar. Örneğin siklofosfamid. 15

29 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER Grup 2B; MMC nin de içinde bulunduğu insan için muhtemel kanserojenik olanlar. Örneğin urasil mustard ( ). Mitomisin C (MMC) çeşitli kanserlerin tedavisinde kullanılan alkilleyici bir ajandır. MMC nin kullanıldığı kanser türleri aşağıda verilmiştir. Mide kanseri Anüs ve kalın barsak kanserleri Göğüs kanseri Küçük hücreli akciğer kanseri Baş ve boyun kanserleri Küçük mesane papillomaları Pankreas kanseri Rahim kanseri MMC nin günümüzde belirlenmiş olan yaygın yan etkileri aşağıda belirtilmiştir. Myelosuppression (kan hücrelerin sayısının düşmesi) Şiddetli enfeksiyon riskinin artması Anemi Saç dökülmesi Bulantı ve kusma İştahın azalması Yorgunluk ( ) 16

30 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER Kullanılan Kimyasal Maddelerin Eriyiklerinin Hazırlanması Etil Methansulfonat (EMS) Eriyiğinin Hazırlanması %50 lik etil alkolde eritilen EMS nin, 2.5 ml lik kültür ortamına ilave edildiği zaman, son konsantrasyonu 5x10-4 M, 10-3 M, 2x10-3 M olan çözeltileri hazırlanmıştır. İnsan periferal lenfositleri belirtilen konsantrasyonlarda EMS ile 24 ve 48 saat muamele edilmiştir Mitomisin C (MMC) Eriyiğinin Hazırlanması 10 mg mitomisin C bulunan Şişeye 10 ml steril bidistile su ilave edilerek MMC eritilmiştir. Sonra bu eriyikten 2.5 ml lik kültür ortamına ilave edildiği zaman son konsantrasyonu 0,0625µg/ml, 0,125µg/ml, 0,250µg/ml olan çözeltiler hazırlanmıştır. Yukarıda belirtilen konsantrasyonlardaki MMC ile hücreler 24 ve 48 saat muamele edilmiştir Sorensen Tamponunun (Sorensen Buffer) Hazırlanması Sorensen tamponu, tampon A ve tampon B olmak üzere iki stok çözelti halinde hazırlanmış olup bu çözeltiler çalışmanın amacına uygun olarak birbirleriyle değişik miktarlarda karıştırılarak kullanılmıştır. Hazırlanışı: Tampon A: gr KH 2 PO ml saf su içinde eritilmiştir (ph=4.8). Tampon B: gr Na 2 HPO 4.12H 2 O 250 ml saf su içinde eritilmiştir (ph=9.3). Bu tampon %5 lik Giemsa boyasının hazırlanmasında kullanılmıştır. 17

31 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER Kromozom Medyumu Biochrom firmasının ürettiği (Cat. No. F 5023) Chromosome Medyum B, hücre kültürü için kullanılmıştır. Chromosome Medyum B nin her litresinde aşağıdaki bileşikler verilen miktarlarda bulunmaktadır: MEM JOKLIK with Non essential Amino Acids ml Fetal Calf Serum ml Heparin E Penicillin G, Sodium Salt E Streptomycin Sulphate...50 mg Phytohemagglutinin M mg Bu medyum steril şartlarda her tüpte 2.5 ml olacak şekilde paylaştırılmış ve bu miktarlarda kullanılmıştır. Kültür tüpleri steril olarak temin edilmiştir Kolkisin Kromozom preparatlarının hazırlanmasında mitotik zehir olarak Colchicine (Kolşisin = Kolkisin) (Sigma) kullanılmıştır. Kolkisin eriyiği steril saf su içerisinde hazırlanmış ve kromozom medyumunun her ml sinde 0.06 µg olacak şekilde (0.06 µg/ml) 2.5 ml lik kromozom medyumuna ilave edilmiştir. Kolkisin in bazı özellikleri aşağıdadır: Kapalı formülü : C 22 H 25 NO 6 Molekül ağırlığı : Etil asetat içeriği : %3.4 Kloroform içeriği : < %0.1 Sigma no : C

32 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER Hipotonik Eriyik Hipotonik eriyik olarak %0,4 lük KCl (Merck) kullanılmıştır. Eriyik bidestile su içinde stok halinde hazırlanıp ağzı kapalı bir cam kapta buzdolabında (+4 ºC) saklanmıştır. Her preparasyondan yaklaşık 1 saat önce yeterli miktarda alınıp 37ºC deki inkübatörde ısıtılıp kullanılmıştır Fiksatif KA yı incelemek amacıyla yapılacak olan preparatların hazırlanmasında kullanılan fiksatif, 1 kısım glasial asetik asit in 3 kısım metanol (1/3 : glasial asetik asit/metil alkol) ile karıştırılması sonucu hazırlanmıştır. Fiksatif kullanılmadan iki saat önce hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır. Her seferinde preparat yapım işleminden iki saat önce taze olarak hazırlanıp kullanılmıştır Giemsa Giemsa boyası Merck firmasından (Cat. No. 9204) temin edilmiş olup, deneylerimizde Sorensen tamponu içinde hazırlanmış olan %5 lik boya eriyiği kullanılmıştır Entellan Preparat kapatmak için kullanılan yapışkan sıvıdır (Merck, Cat. No. 7961). Preparatlar daimi hale getirilirken kullanılmıştır Nitrik Asit (HNO 3 ) Lamları temizlemek amacıyla 1 N HNO 3 çözeltisi hazırlanmıştır. Temizleme sıvısı plastik şişede saklanarak her defasında tekrar tekrar kullanılmıştır. 19

33 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER 3.2. Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve 0,0001 gr hassasiyetindeki GEC AVERY marka terazi kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır Santrifüj Rotor çapı 21 cm, 4000 rpm e kadar yükselebilen devir hızı, 99 dk. lık zaman ayarlayıcı ve 28 tüp kapasiteli HETTICH UNIVERSAL marka santrifüj çalışmalarda kullanılmıştır Mikroskop Koordinat cetveli ve immersiyon objektifi olan MICROS marka binoküler ışık mikroskobu preparatların incelemeleri sırasında kullanılmıştır İnkübatör Dedeoğlu marka 0 ºC 100 ºC ayarlanabilir inkübatör deneyde hücre kültürünün yapımında ve bazı eriyiklerin 37 ºC ye ısıtılmasında kullanılmıştır Lamların Temizlenmesi Kültür süresinin bitiminden iki gün önce etiketli lamlar şaleye dizilerek üzerlerini iyice örtecek şekilde 1 N Nitrik asit konmuştur. Şalenin ağzı kapatılarak bu şekilde 24 saat bekletilmiştir. Süre bitiminde lamlar yarım saat akan çeşme suyunda iyice yıkanmıştır. 3-4 defa saf sudan geçirdikten sonra şaleyi saf su ile doldurarak lamlar buzdolabında saklanmıştır. 20

34 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER 3.4. Sterilizasyon Saf Suyun Sterilizasyonu Temiz bir erlene saf su doldurularak erlenin ağzı pamukla iyice kapatılmıştır. Sterilizasyon esnasında otoklavdaki buhardan pamuğun ıslanmaması için üzeri alüminyum kâğıdı ile örtülmüştür. Erlendeki saf su otoklav da 1.2 atm. buhar basıncında ve 120 C de 15 dk. steril edilmiştir Kromozom Anormallikleri (KA) (Chromosomal Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması Sağlıklı ve sigara içmeyen yaşları olan iki erkek ile yaşları 23 olan iki bayandan alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş kan örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla (0.2 ml) (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991) ekilmiştir. Hücre kültürü inkübatörde 37±1 C de 72 saat için inkübe edilmiştir. EMS % 50 lik alkolde çözülmüştür. EMS nin insan kromozomları üzerine etkisini incelemek için kültür süresinin bitimine 24 ve 48 saat kala son konsantrasyonu 5x10-4 M, 10-3 M ve 2x10-3 M EMS kültür tüplerine ilave edilmiştir. Ayrıca her deneyin bir kontrolü bir de çözücü kontrolü (%50 alkol) vardır. İkinci deneme maddesi olan MMC steril bidestile suda çözülmüştür. MMC nin insan kromozomları üzerine etkisini incelemek için kültür bitimine 24 ve 48 saat kala son konsantrasyonu 0,0625 µg/ml, 0,125 µg/ml ve 0,250 µg/ml MMC kültür tüplerine ilave edilmiştir. Ayrıca her deneyin bir de kontrolü vardır. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (yani kültürün 70. saatinde) her tüpe hazırlanan kolkisin eriyiğinden 35 µl (0.06 µg kolkisin/ml) ilave edilmiş ve tüpler hafifçe sallanarak iyice karıştırılmıştır. Hücreler 2 saat süresince (37 C de) kolkisin ile ön muameleye tabi tutulmuştur. 21

35 3. MATERYAL ve METOD Songül BUDAK DİLER Kültür süresi olan 72. saatin bitiminde kültür tüpleri, 1200 rpm de (170 g) 15 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri ihtiva eden ml lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, etüvde 37 C de tutulan hipotonik eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırılarak yapılmış olup hücre süspansiyonu pipetaj yapılarak homojen hale getirilmiştir. Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun preparatlar hazırlanamamaktadır. Her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra tüpler, ağzı kapatılarak inkübatöre konmuştur. Hücreler 15 dk. hipotonik eriyikte 37 C de muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 15 dk rpm de (170 g) santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Bu sefer hipotonik eriyik ilavesi gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 5 ml olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm de (170 g) 15 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem 3 kere tekrarlanmıştır. 3. fiksatifle muamelenin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen berraklaştığı görülmüştür. Her fiksatif ilavesinden sonra tüpler santrifüj edilerek üstteki sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte ml sıvı kalacak şekilde süpernatant atıldıktan sonra preparatlar yapılmıştır. Tüpün dibinde toplanan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde bu hücre süspansiyonundan çekilmiştir. Özel olarak hazırlanmış düzeneğe tutturulan pasteur pipetinden daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanan lamın üzerine 75 cm yükseklikten farklı alanlara 1 er damla olmak üzere hücre süspansiyonu damlatılarak (her lama 3 damla) hücrelerin ve dolayısıyla kromozomların lam üzerinde yayılması sağlanmıştır. Hücre süspansiyonunun lamlara damlatılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda sıcaklığında bekletilmiştir. 22