FARKLI MATERYALLERDE OLUŞAN BAKTERIYEL BIYOFILM TABAKASINDAN İZOLE EDILEN AEROBIK HETEROTROFIK BAKTERI DÜZEYLERI

Transkript

1 FARKLI MATERYALLERDE OLUŞAN BAKTERIYEL BIYOFILM TABAKASINDAN İZOLE EDILEN AEROBIK HETEROTROFIK BAKTERI DÜZEYLERI ÖZET Gülşen ALTUĞ 1, Mine ÇARDAK 1, Pelin S. ÇİFTÇİ 1, Sevan GÜRÜN 2 1-İSTANBUL ÜNIVERSITESI, SU ÜRÜNLERI FAKÜLTESI, DENIZ BIYOLOJISI ANABILIM DALI 2-İSTANBUL ÜNIVERSITESI, FEN-EDEBIYAT FAKÜLTESI, BIYOLOJI BÖLÜMÜ galtug@istanbul.edu.tr Deniz ortamında farklı amaçlarla kullanılan materyaller arasından seçilen ahşap, galvaniz, saç, paslanmaz çelik, pamuk halat, cam ve alüminyum materyalleri üzerinde oluşan bakteriyel biyofilm tabakasında bulunan mezofilik aerobik heterotrofik bakteri düzeylerini araştırmak amacı ile bakteriyolojik analizler yapılmıştır. Laboratuar ortamında kurulan cam düzenek deniz suyu ile doldurulmuş, invertöre bağlı olarak havalandırması kontrol edilmiş, ve içine eşit ebatlarda farklı materyaller yerleştirilmiştir. Membran filtrasyon metodu kullanılarak deniz suyunda başlangıçtaki bakteri düzeyi tespit edilmiş ve ölçümler 48 saat arayla test süresince sürdürülmüştür. 12 gün sonunda biyofilm tabakası gözlenmiş, materyaller üzerinden aseptik koşullarda 1 cm 2 lik alandan alınan kazıntı örnekleri homojenize edilerek Marine ve Nutrient Agar a ekilerek mesofilik heterotrofik aerobik bakteri düzeyleri belirlenmiştir. Denemeler 48 saatte bir 29 gün boyunca tekrarlanarak bakteri düzeylerinin materyale bağlı olarak tutunma oranları karşılaştırılmıştır. En yüksek bakteri düzeyi pamuk halat materyalinde gözlenirken bunu ahşap, alüminyum, saç, cam, paslanmaz çelik ve galvaniz takip etmiştir. Materyallerde tespit edilen bakteri düzeyinin deniz suyu ortamından yüksek bulunmuştur. İzole edilen bakteriler antibiyotiklere ve ağır metallere dirençliliklerinin tespiti gibi ileri tetkiklerde kullanılmak üzere stoklanmıştır. Anahtar Kelimeler: Bakteriyel biyofilm, mezofilik aerobik heterotrofik bakteri, pamuk halat, ahşap, galvaniz, saç, paslanmaz çelik, cam, alüminyum LEVELS OF HETEROTROPHIC AEROBIC BACTERIA ISOLATED FROM BACTERIAL BIYOFILM LAYER ON VARIOUS MATERIALS ABSTRACT Bacteriologic analyses were carried out with an aim to investigate the level of heterotrophic aerobic bacteria on several materials such as wooden, galvanizes, sheet iron, stainless steel, cotton rope, glass and aluminum. Chosen materials were put in the mechanism which was filled with natural sea water and attached to invertors for controlling to aeration, formed in the laboratory. Firstly the level of mesophilic heterotrophic aerobic bacteria was tested using by membrane filtration method in the sea water during the 29 days. 1 cm 2 scraped biofilm materials, which were taken aseptically from observed biofilm layer on materials after 12 days, homogenized and inoculated on Nutrient agar and Marine agar in order to examined level of mesophilic heterotrophic aerobic bacteria. Bacteriological measurements were done each 48 hours and attachment rate of bacteria depending on different materials were compared during 29 days. The maximum bacteria levels were found as 7.9 CFU/ 100 ml in the sea water in the seventh days and recorded as 5.9 CFU/100 ml at the end of the tests. Level of bacteria in the ambient water were found lower than the materials due to fact that heavily propensity of bacteria to the particular substrates. Maximum bacteria levels were calculated from cotton rope, aluminum, sheet iron, glass, stainless steel, 561

2 galvanizes respectively. The isolated bacteria were stocked with an aim to use further studies for understand their resistance capability against to some antibiotics or heavy metals. Keywords: Bacterial biofilm, Mesophilic heterotrophic aerobic bacteria, Wooden, Galvanizes, Sheet iron, Stainless steel, Cotton rope, Glass, Aluminum GİRİŞ Mikroorganizmalar gelişimleri için uygun organik ve inorganik maddelerin biriktiği dış yüzeylerde, özellikle gözle görülemeyen çizikler ve aşınmış bölgeler içine yuvalanarak yerleşmekte, birbirlerine ve yüzeylere bağlanarak biyofilm oluşturabilmektedir. Biyofilme tutunmuş bakteriler bu yapının içinde antimikrobiyal ajanlara ve olumsuz çevre koşullarına dirençli hale gelebilmektedirler (Kumar ve ark., 1998, Poulsen, 1999, Arnold ve Silvers, 2000, Türetgen 2004). Islak yüzeylerde oluşan mukuslu yapı gösteren bakterilerin fenotipik olarak planktonik yapılarından farklılıklar gösterdiği tespit edilmiş ve bu mukoid yapılara biyofilm (canlı tabaka) denilmiştir. Bakteriler kıyısal alanlarda, organik madde girdisinin açık denizlerden daha yüksek olması veya partiküle bağlı olarak gelişebilecekleri, biyofilm oluşturabilecekleri ortamları bulabilmeleri nedeni ile daha fazla çoğalabilmektedirler. Biyofilm oluşumu dinamik çok aşamalı bir yapılanmadır. Mikroorganizmalar tarafından oluşturulan, çoğunlukla doğal materyallerde gelişen ve "biyofouling" olarak tanımlanan bu mekanizmanın başlangıcını, basit gram negatif bakterilerin ortama tutunması oluşturmakta, diatom ve protozoalar daha sonra katılmaktadır (Austin 1988). Bakterilerin deniz çevrelerinde herhangi bir yüzeye tutunma istekleri organik maddeleri değerlendirmek içindir. "Attachment bacteria" olarak isimlendirilen partiküle tutunmuş bakteriler yüzey suyunda serbest yaşayan bakterilerden daha yoğun olarak tespit edilmişlerdir (Grossart ve ark. 2003). Kültür edilemeyen formlar adsorbsiyon mekanizması anlaşıldıktan sonra katı cisimlere bakterilerin tutunması sağlanarak ilk kez tatlı su ortamlarından izole edilebilmişlerdir (Austin 1988). Deniz bakterilerinin yüzeylere tutunma eğilimlerine yönelik ilk çalışma Zobell (1943) tarafından yapılmıştır. Böylece bazı bakterilerin bir yüzeye yaklaşarak ekzopolisakkkaritler üretmesi, yapışması ve mikrokoloniler oluşturarak biyofilm oluşumuna yol açması tanımlanmıştır. Bu çalışmada deniz ortamında farklı amaçlarla kullanılan materyallerin, bakterilerin gelişmesi için uygun ortamlar hazırlayarak istenmeyen bakteriyel biyofilm oluşumuna yol açmasının, kültür edilebilir heterotrofik aerobik mezofilik düzeyi yönü ile materyale bağlı olarak karşılaştırmasını yapabilmek amaçlanmıştır. MATERYAL ve YÖNTEM Ahşap, galvaniz, saç, paslanmaz çelik, pamuk halat, cam ve alüminyum olarak seçilen materyaller Palanichamy e (2002) göre analize hazırlanmışlardır. Şekil 1. de görülen düzenek içine sırası ile eşit ebatta her materyal 6 adet kupon tutucu üzerine yerleştirilmiştir. Düzenek çalışma modu orta ayar olarak seçilen invertöre (Hi- RUN/N100) bağlanmış ve deniz suyu ile doldurulmuştur. Pamuk halat düzenek içine serbest yerleştirilmiştir. Deniz suyunda başlangıç mesofilik heterotrofik aerobik bakteri düzeyleri membran filtrasyon (Millipore) tekniği ile belirlenmiştir. Materyaller yerleştirildikten sonra 48 saat 562

3 ara ile su örnekleri ile birlikte analiz edilmiş, 12 gün sonunda gözlenen biyofilm tabakalarından, aseptik koşullarda 1 cm 2 lik alandan alınan kazıntı örnekleri homojenize edilerek Marine ve Nutrient Agar a ekilmiş 37 o C de 18 saat inkübasyon sonucunda mesofilik heterotrofik aerobik bakteri düzeyleri belirlenmiştir (FDA 1998). Denemeler 48 saatte bir olmak üzere 29 gün boyunca tekrarlanmıştır. Şekil 1 Laboratuarda kullanılan düzenek, kupon tutucu ve farklı bakteriyel biyofilm materyalleri Figure 1 The laboratory test system, coupon holder and various bacterial biofilm materials BULGULAR Düzenekte kullanılan deniz suyunda yapılan bakteriyolojik analizler sonucunda bulunan Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeyleri Çizelge 1 de özetlenmiştir. Çizelge 1 Denemelerde Kullanılan Deniz Suyunda Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeyleri (log 10 - CFU/100 ml) Table 1 Level of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria in the sea water were used in the tests. Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeyleri Zaman /Gün Marine Agar Nutrient Agar Ortalama 1 4,7 6, , ,9 6, ,3 7, , ,4 6, ,6 6, , ,7 6, ,6 6, ,7 6, ,4 6, ,4 6, ,9 5, ,9 5,

4 Deniz suyunda başlangıç bakteri düzeyi Marine Agar da 6x10 4 CFU/100 ml, Nutrient Agar da 5x10 6 CFU/100 ml olarak tespit edilmiştir. Şekil 2 Düzenekte Kullanılan Deniz Suyunda Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeylerinin (CFU/100 ml) dağılımları Figure 2 Distribution of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria (CFU/100 ml) in the Sea Water were used in the laboratory Test System Çizelge 2 Denemelerde Kullanılan Farklı Materyallerde Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeyleri (log 10 - CFU/cm 2 ) Table 2 Levels of Heterotrophic Aerobic Bacteria were Isolated from Various Materials in the tests (log 10 - CFU/cm 2 ). Günler M ,5 5,8 7,8 7,8 5,6 6,0 5,3 5,6 5,9 6,1 6,5 6,6 6,9 7,0 7,0 2 6,8 5,1 7,9 7,9 7,0 6,5 6,1 5,6 5,9 6,1 6,1 6,4 6,6 6,6 6,6 3 5,9 5,4 7,6 7,6 6,0 6,4 6,1 5,6 5,9 6,2 6,2 6,3 6,5 6,5 6,5 4 6,2 6,1 7,6 7,6 5,6 6,1 6,7 5,6 5,7 6,1 6,4 6,4 6,5 6,5 6,5 5 6,1 5,8 7,8 7,8 6,0 5,9 5,8 5,6 5,5 6,1 6,1 6,2 6,2 6,4 6,4 6 6,3 5,8 7,4 7,4 6,3 6,2 5,7 5,5 6,1 6,5 6,5 6,6 7,0 7,4 7,4 7 7,0 6,3 7,9 7,9 7,1 6,6 6,5 5,7 6,2 6,6 6,6 6,9 7,1 7,9 7,9 M: Materyal, 1: Saç, 2: Alüminyum, 3: Paslanmaz çelik, 4: Cam, 5: Galvaniz, 6: Ahşap, 7: Pamuk Halat Denemeler süresince en yüksek bakteri düzeyi pamuk halat materyalinde tespit edilmiştir. 564

5 Şekil 3 Denemeler süresince Farklı Materyallerde Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeylerinin Dağılımı (log 10 - CFU/cm 2 ) Figure 3 Distribution of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria were Isolated from Various Materials in the tests (log 10 - CFU/cm 2 ). Şekil 4 Denemeler Sonunda Farklı Materyallerde Mesofilik Heterotrofik Aerobik Bakteri Düzeylerinin Ortalama Dağılımı (log 10 - CFU/cm 2 ) Figure 4 The Average Distribution of Mesophilic Heterotrophic Aerobic Bacteria (log 10 - CFU/cm 2 ) were Isolated from Various Materials at the End of the Tests TARTIŞMA VE SONUÇ Bakterilerin ortamdaki besin elementleri değerlendirmek amacı ile herhangi bir yüzeye tutunarak yaşama eğilimleri serbest yaşama eğilimlerinden fazladır. Bu eğilimleri deniz ortamında farklı yüzeyler üzerinde yerleşerek istenmeyen bakteri topluluklarının bir araya gelmesine zemin hazırlar. Diğer mikroorganizmaların yerleşmesi başlangıç bakterilerinin yoğunluğu ile ilişkili bir süreçtir (Stoodley ve ark. 1999). Materyallere bağlı olarak bakterilerin tutunma oranlarını değerlendiren çalışmalar vardır. Bu konuda yapılan çalışmalar farklı ortam karakterlerinde tutunmanın da farklılıklar göstereceği yönündedir (Donlan 2002, Davey 2000 ). Deniz ekosisteminde bakteriyel gelişmeyi etkileyen bir çok çevresel faktör olduğunu biliyoruz ancak ortamda bakteriyel kullanıma uygun besin elementlerinin özellikleri, partiküler madde miktarı aynı trofik düzeye sahip farklı akuatik alanlarda bakterilerin farklı davranışlar sergilemelerine neden olabilmektedir. Bu farklılıklar bakteri düzeylerinde de değişik sonuçlar almamıza neden olabilmektedir. 565

6 Bu çalışmada laboratuar ortamında bakterilerin farklı materyaller üzerinde tutunma düzeyleri incelenirken kullanılan doğal deniz suyunun başlangıç bakteri düzeyi mesotrofik ortam karakterinde bulunmuştur. Dolayısı ile incelenen materyaller mesotrofik bir ortamda bulunan materyallere bakterilerin yaklaşma düzeyi olarak değerlendirilmiştir. Bu durumda en yüksek bakteri düzeyi pamuk halat materyalinde gözlenirken bunu sırasıyla ahşap, alüminyum, saç, cam, paslanmaz çelik ve galvaniz takip etmiştir. Marine Agar ve Nutrient Agar kullanılarak yapılan analizlerde bakterilerin besiyerini zaman zaman farklı değerlendirdikleri görülmüştür. Bu durumu bakterinin gelişme eğrisi dahilinde geçirdiği dönemin besiyerine yansıması olarak değerlendiriyoruz. İçerdikleri besin elementleri bakımından birbirine yakın olan bu iki besiyerinin ortalama (log 10 ) değerleri Şekil 3 de görülmektedir. Biyofilm tabakası içerisinde yaşayan bakterilerin hayatta kalma şansları daha fazladır. Biyofilmin dış tabakaları hasarı absorbe ederken, iç tabakalarda stres yanıtının başlaması için zaman kazanılmış olur (Costerton 1999). Besin yetersizliğine bağlı değişen mikro çevreye daha çabuk adapte olabilen türler, saldırı sonunda hayatta kalarak yeniden çoğalma işlemine hızla başlayabilirler. Denemelerde deniz suyunda bulunan bakteri miktarı 7. günde 7.9 cfu/ 100 ml olarak en yüksek düzeye ulaşmış, denemenin son günü 5.9 cfu/100 ml olarak kaydedilmiştir. Ortamdaki bakteri düzeyi bu iken materyalde tespit edilen bakteri düzeyi deneme sonunda 6,4-7,9 CFU/cm 2 aralığında değişmiştir. Materyallerde tespit edilen bakteri düzeyinin yüksek olması bakterilerin yüzeylere tutunma eğilimi ve biyofilm içinde yaşama oranının yüksekliği tezini desteklerken, materyallerden izole edilen bakteriler antibiyotiklere ve ağır metallere dirençliliklerinin tespiti de dahil olmak üzere ileri tetkiklerde kullanılmak üzere stoklanmıştır. KAYNAKLAR Arnold, J. W., Silvers, S., 2000, Comparison of poultry processing equipment surfaces for susceptibility to bacterial attachment and biofilm formation, Poultry Science, 79: Austin, B., Bacterial microflora associated with a coastal, marine fish-rearing unit. Journal of the Marine Biological Association UK, 63: Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP., Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections., Science. 284 (5418): Davey, ME., O'toole, G.A., Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4): Donlan, R.M., Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8(9): FDA Bacterial Analytical Manual 8..ed., Revision A. AOAC International WASHİNGTON, D.C. Grossart, H.-P., T. Kiørboe, K. Tang, and H. Ploug Bacterial colonization of particles: growth and interactions. Appl. Environ. Microbial. 69: Kumar, C. G., Anand, S. K., Significance of microbial biofilms in food industry : a review, International Journal of Food Microbiology, 42: Palanichamy, S., Maruthamuthu S, Macickam, S. T., Rajendran, A., Microfouling of manganeseoxidizing bacteria in Tuticorin harbour waters, Current Science 82 7: Poulsen, L. V., Microbial biofilm in food processing : review, Lebensm.-Wiss. u.-technol., 32: Stoodley, P., Z. Lewandowski, J.D. Boyle and H.M. Lappin-Scott The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. J. Environ. Microbiol. 1(5): Türetgen, İ Comparison of free residual chlorine and monochloramine for efficacy against biofilms in model and full scale cooling towers Biofouling 20: Zobell, C. E.,1943. Journal of Bacteriology., 46: