EVDE BİYOTEKNOLOJİ. Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 6. DERS

Transkript

1 EVDE BİYOTEKNOLOJİ Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 6. DERS

2 BİYOTEKNOLOJİDE BİTKİ HÜCRE DOKU KÜLTÜRLERİ 2

3 Bitki hücre doku kültürleri; yakın yıllarda geleneksel ıslah yöntemlerine ilave edilmiş olan ve bitki ıslahına önemli bir potansiyel kazandırmış en önemli kaynaklardan birisidir. Doku kültürü ve moleküler biyoloji alanında yapılmış olan genetik materyali kullanma sonucunda geliştirilmiş olan bu teknoloji, bitki parçaları, izole edilmiş hücreler, kalluslar, protoplastlar ve embriyogenik dokulardan bitkilerin elde edilmesi için steril bitki hücre ve doku kültürlerinin kullanılmasından ibarettir. 3

4 Bitki doku kültürü: Aseptik şartlarda yapay bir besin ortamında hücre, doku veya organ gibi bitki kısımlarından (eksplant) kontrollü çevre koşullarında yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin üretilmesidir. 4

5 BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİ - Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyasyon oluşturmak - Kaybolmakta olan türlerin korunması - Çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde rutin olarak uygulanmaktadır. 5

6 TOTİPOTENSİ VE TANIMLAMALAR: Bitki rejenerasyonu: Bir bitkinin hücre, doku, organ, meristem veya embriyo gibi çeşitli parçalarından (eksplant) yeni bitki veya bitkiler elde edilmesine bitki rejenerasyonu denmektedir 6

7 Haberlandt (1902) çekirdekli tek bir hücrenin doğrudan veya bir kallus devresinden sonra dolaylı olarak tam bir bitkiye dönüşebileceğini ortaya koymuş 7

8 Steward ve ark. (1958) in vitro şartlarda havuç hücrelerini kültüre alarak tek hücreden yeni bir bitki geliştirmişlerdir Bu olaya TOTİPOTENSİ, böyle hücreye de totipotent hücre denmiştir. 8

9 Hücre ve Doku Kültürü için Gerekli Asgari Şartlar: 1. Sterilizasyonun sağlanacağı bir labaratuvar 2. Kimyasal maddeler 3. Cam Malzemeler 4. Yıkama ünitesi, sıcak hava kabini veya kurutma fırını 5. Uygun kabin ve dolaplar 6. Steril kabin 7. Otoklav ünitesi, filtre sterilizasyon ünitesi, mikrodalga fırın 8. Kültür odası veya iklim dolabı 9. Elektrik, su gaz vs. ile ilgili servis elemanları 10. Saf su cihazı, ph metre, çalkalayıcı vs. 9

10 10

11 11

12 12

13 Hücre ve Doku Kültüründe Başarıyı Etkileyen Faktörler 1. Besin kompozisyonu (mineral tuzlar, enzimler, vitaminler, karbon ve enerji kaynakları ve diğer organik bileşikler) 2. Kültüre alınan bitki materyalinin kaynağı, fizyolojik olgunluğu ve büyüklüğü 3. Besi ortamının aydınlatılmasında kullanılan ışığın süresi, dalga boyu ve yoğunluğu 13

14 4. Besi ortamının bulunduğu ortamın sıcaklığı 5. Kültür ortamının oksijen kapasitesi ve gaz dengesi 6. Alt kültürün niteliği 7. Besi ortamına alınan bitki genotipi 8. Besi ortamına alınan materyalin orijinini alındığı verici bitkinin yetiştirildiği mevsim 14

15 15

16 Bitki doku kültürü aşamaları Uygun bir laboratuvar düzeninin kurulması Kullanılacak bitki parçalarının ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu Kallus veya hücre süspansiyonlarının oluşturulması 16

17 Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun uyarılması Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların oluşturulması Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması 17

18 Hücre-Doku Kültürlerinde Kullanılan Besi Ortamlarının İçerikleri Makro Besin Elementleri Mikro Besin Elementleri Karbonhidrat kaynağı Amino asitler Vitaminler Bitkisel Hormonlar Besi ortamı katılaştırma ajanı Ayrıca önemli C, N, O, H, S, P, Mg; K, Ca B, Mn, Fe, Cu, Co, Zn, Mo Sakkaroz veya şeker Örn. kazeinhydrosilat Tiamin, Pyridoksin, nikotinik asit vs. Oksinler (IAA), Sitokinin (Zeatin) Agar veya Gelrite ph değeri 18

19 Bitki büyüme düzenleyicileri Hormon Genel Etki Oksinler : Fotoperyodizm, köklendirme, apikal dominans, yan sürgünlerin gelişiminin engellenmesi, hücre gelişimi. Sitokininler : Hücre bölünmesi, yeniden farklılaşma, bitki rejenerasyonu, sürgün çoğaltımını etkiler, sürgünlerde köklenmeyi ve embriyogenesisi engeller. Gibberellinler: Meristemlerden bitki rejenerasyonun uyarılması, sürgünlerin boylarının uzatılması, embriyo ve ovül kültürlerinin gelişiminde, kallus gelişimi, organogenesis ve adventif kök oluşumunu engeller Absisik asit: Doku kültüründeki rolü tam olarak bilinmemekle beraber somatik embriyoların olgunlaştırılmasında kullanılmaktadır. Etilen: Köklerin uzamasını engelleyerek enine büyüme ve çoğalmayı arttırmaktadır. 19

20 Kültür Şartları Sıcaklık Işık Nem Kültür odalarında kullanım amacına göre 18±2, 22 ±2 veya 25 ±2 0 C ye ayarlanır. Genellikle serin floresan lambalarıyla sağlanır. Aynı zamanda ışıklama süresi ve zamanlamasıda önemlidir. % arasında bir değere ayarlanır. 20

21 Bitki Doku Kültürlerinde Steril Bitki Eldesi Bu yöntem hücre doku kültürü çalışmalarında gerekli olan bitkiyi steril bir şekilde elde etmek amacıyla sıklıkla uygulanan bir yöntemdir. Bu amaçla yetiştirilecek olan bitkinin tohumları uygun yöntemle steril hale getirilir ve steril kurutma kağıdı bulunan steril petriler içerisinde veya steril besi ortamı içerisinde kültüre alınır. Kültüre alınan bu bitkiler uygun fotoperyoda sahip ışık kaynağı altında gelişmeye bırakılır. Gelişen bitkiler biyoteknolojik çalışmalar için kullanılabilir.

22

23 Evde Hobi Amaçlı Doku Kültürü* 1. Dikkat edilecek en önemli husus temiz (steril) şartlarda bu işlemlerin yapılmasıdır. Bilimsel çalışmalarda genel olarak steril yatay hava akışlı kabin denilen bir ekipman kullanılır. Fakat ev şartlarında bir balık akvaryumu veya 50x40x40 cm ebatlarında silikonla izole edilmiş veya kenarlarından iyice yapıştırılmış, sadece bir cephesi açık cam bir kabin aynı işi görebilir, *Babaoğlu, M. Evde ve Okullarda Hobi Amaçlı Bitki Doku Kültürü

24 2. Alet ve ekipmanları, besin ortamlarını, su, kağıt, havlu vb. diğer kullanılacak malzemeleri steril hale getirmek için basınçlı pişirici (30-40 cm çapında düdüklü tencere),

25 3. Bir litre ölçebilen ölçü kabı, yiyecek kabı ve kapaklı cam kavanozlar ( ml reçel veya konserve kavanozları uygundur. Kapağı ile düdüklü tencerede ısıtıldığında ısıya dayanabilmelidir)

26 4. Keskin ağızlı bıçak (bisturi) ve pens

27 5. Eczanelerden temin edilebilecek enjektör ( ml) ve medikal malzeme satıcılarından elde edilebilecek 0.2 mikrometre delik çapında selüloz nitrattan yapılmış filtreler (Millipore). Bunlar ısı ile bozulabilen maddeleri içeren solüsyonların (örnek: Hindistan cevizi sütü, deniz yosunu özü, bitki ekstraktları vb.) sterilize edilmesinde kullanılacaktır. Kabin içinde steril enjektöre sıvı çekilir, ucuna steril bir filtre takılır ve yine steril kavanoz içine bastırılarak süzülür

28 6. Alüminyum folyo ve 10x10 cm ebadında seramik fayanslar (3-4 adet). Bisturi, pens ve fayanslar folyo içine sarıldıktan sonra tencerede kaynatılarak sterilize edilir. Bitki parçalarını kesme işlemleri ise, folyo kabin içinde açıldıktan sonra fayans üzerinde yapılır,

29 7. Etil alkol içeren ispirto lambası (Metil alkol kullanmaktan sakının, zehirlidir). 8. %70 lik alkol solüsyonu (70 ml alkol 30 ml su ile karıştırılır) içeren sprey şişesi. Transfer kabinin içi ve diğer yüzeyleri temizlemek için kullanılır, 9. Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu için ticari olarak satılan çamaşır suyu (genellikle %50 sodyum hipoklorit içermektedirler ve %10 luk solusyon hazırlamak için 20 ml çamaşır suyu 80 ml su ile karıştırılır) 10. Kauçuk eldivenler ve herhangi bir deri dezenfektanı (Eczanelerden temin edilebilir)

30 BESİ YERİ HAZIRLIĞI* Kullanılacak maddelerin çoğu eczane, market, kimyevi gübre veya medikal malzeme satıcılarından temin edilebilir. Aşağıdakiler yaklaşık 1 litre temel besin ortamını hazırlamada kullanılır: *Babaoğlu M. Evde ve okullarda hobi amaçlı bitki doku kültürü 30

31 İki su bardağı yağmur suyu veya saf su (kaynatılmış ve soğutulmuş su da olabilir) Çeyrek su bardağı toz şeker (yaklaşık 30 g.) Gübre stok solüsyonu (bir yemek kaşığı 15:15:15 NPK gübresi 2 litre suda eritilir ve buradan bir bardak dolusu solüsyon kullanılır), 31

32 Eczanelerden alınabilecek 500 mg lık inositol tabletlerinden yarım tablet ve Thiamin li vitamin tabletlerinden ½ tablet (Multi-vitamin tabletleri de kullanılabilir) Medikal malzeme satıcıların temin edilebilecek ve besin ortamını yarı-katı (jel) hale getiren agardan dört yemek kaşığı (Tohum çimlendirmesi için biz bunun yerine pamuk kullanacağız) Ampisilin içeren antibiyotik tabletleri (250 mg) Sitrik asit (sirke asidi) ve sodyum bikarbonat (Kabartma tozu) 32

33 Ağzı kapanabilen bir kaba önce su ve sonra bütün maddeler ilave edilerek karıştırılır. Besin ortamı ph sı dar alalıkta renk değişimi ile ph yı tahmin etmeye yarayan indikatör kağıtlarla ölçülür ve 5-6 arasına ayarlanır. Eğer ph fazlaysa sitrik asit, düşükse bikarbonat soda kullanılarak ayarlanmalıdır. Daha sonra agar ilave edilerek eriyinceye kadar ocakta sık sık karıştırarak kaynatılır. Daha sonra eriyik kavanozlara ¼ (çeyrek) oranında veya 2 cm kalınlıkta doldurulur. 33

34 Kavanozların kapakları hava giriş çıkışını sağlamak amacıyla delinerek bu kısma temiz bir sünger parçası yerleştirilir. Bu sünger hava giriş çıkışına olanak sağlarken mikroorganizma giriş çıkışını engeller. Basınçlı pişirici içine önce 1/5 oranında su, üzerine ayaklı bir sehpa (metal) konulur, sterilize edilecek malzemeler bu sehpa üzerine konulduktan sonra kapak kapatılır ve ocakta ısıtılmaya başlanır. Tencerede buhar çıkmaya başlamasından itibaren 15 dakika süreyle tutulur. 34

35 Bitkileri çoğaltmak ve köklendirme ortamlarını hazırlamak için yukarıdaki ortama yarım bardak Hindistan cevizi sütü ve malt ilave edilir. Hindistan cevizi sütü yerine yarım bardak yeşil domates püresi veya yarım bardak taze sıkılmış portakal suyu da kullanılırsa ilginç ve farklı sonuçlar ortaya çıkabilir. Ayrıca yarım çay bardağı organik deniz yosunu özü ilave edilebilir (Örnek: Kelpak) 35

36 Kavanozlarda Kültüre alınanacak Tohumların Sterilizasyonu Laboratuvarda yapılan çalışmada keten (Linum usitatissimum) tohumları kullanılacaktır. Bu tohumların sterilizasyonu amacıyla %10 hipoklorit çözeltisinden yararlanılacaktır. Hipoklorit çözeltisi için ise %50 hipoklorit içeren çamaşır suyundan yararlanılacaktır. %10 hipoklorit içeren 100 ml çözelti hazırlamak için 20 ml çamaşır suyu alınıp üzeri steril su veya kaynatılmış su ile 100 ml ye tamamlanır. 36

37 Keten tohumlarının sterilizasyonu amacıyla tohumlar bu çözelti içerisinde 10 dakika bekletilir ve sonrasında steril su ile (kaynayıp soğumuş su da olabilir) 3 kez durulanır. Tohumlar hazırlanmış olan besi ortamına ekilerek 16 saat aydınlık 8 saat karanlık fotoperyoda sahip ortamda çimlenmeye bırakılacaktır. 37

38 Ders ile ilgili iletişim için; Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADÜ; Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Slaytlara Ulaşmak İçin 38