YERLİ SIĞIR IRKLARINDA MYOSTATİN GENİNE AİT III. EKZON BÖLGESİNİN NT 821(DEL11) POLİMORFİZMİ BAKIMINDAN KARŞILAŞTIRILMASI

Transkript

1 YERLİ SIĞIR IRKLARINDA MYOSTATİN GENİNE AİT III. EKZON BÖLGESİNİN NT 821(DEL11) POLİMORFİZMİ BAKIMINDAN KARŞILAŞTIRILMASI Comparison with Exon III Region of Myostatin Gene of Native Cattle Breeds for Nt 821(del11) Polymorphism Atilla ÖZ Biyoteknoloji Anabilim Dalı Numan ÖZCAN Zootekni Anabilim Dalı ÖZET Belçika Mavisi ve Piedmontese gibi ırkların da içinde yer aldığı bazı etçi sığır ırklarında, II. kromozomda yer alan myostatin geninin III. ekzon (kodlama yapan) bölgesindeki 821. nükleotidden itibaren oluşan 11 bazlık delesyon (del11 mutasyonu) (Belçika Mavisi nde) bu gende mh dominant allelinin oluşmasına ve çift kaslılık denilen %20 et artışı ile yağlanmada %50 azalmalara neden olmaktadır. Bu çalışmada Türkiye deki bütün yerli ırklara ait myostatin geninin ekzon III bölgesi içinde nt821del11 mutasyonu bakımından karakterize edilmiştir. Bulgularda myostatin genine ait ekzon III bölgesinde herhangi bir nt821del11 mutasyonuna rastlanılmamıştır. Bu bulgu, yerli sığır ırklarımızın çift kaslı sığır ırkları ile melezlenmelerine yönelik çalışmalarda melez mh - ve mh + alleli içeren melez döllerin izlenmesini kolaylaştıracaktır. Anahtar kelimeler: Çift kaslılık, Myostatin, Türkiye yerli sığır ırkları, Belçika Mavi ABSTRACT In some beef cattle breeds such as Belgium Blue and Piedmontese, exon III region of myostatin gene of chromosome II is mutated (del11 mutation at 821 nucleotid position for Belgium Blue) to produce mh dominant allel thereby increasing meat yield up to 20% and reducing carcass fat amount up to 50%. Turkish native cattle breeds DNA samples obtained from peripheral bloods were screened for exon III of myostatin gene for nt821del11 mutation. The results revealed the non-existance of such mutations in Turkish native cattle breeds. Key words: Double muscling, Myostatin, Turkish native cattle breeds, Belgium Blue *Yüksek Lisans Tezi-MSc. Thesis Giriş 130

2 GDF-8 (Growth Differentiation Factor-8) olarakta bilinen myostatin (mstn) TGF-B (Transforming Growth Factor-B ) ailesinin bir üyesidir. İskelet kası büyümesinde ve farklılaşmasında rol oynamakla birlikte kas hipertrofisine (mh : musculus hypertrophy) neden olmaktadır. Myostatin geni sığırlarda II kromozomda yer almakta 3 ekzon ile 2 intron dan meydana gelmektedir (Bellinge ve ark., 2005). Normal tip myostatin geni iskelet kası büyümesini, negatif yönde düzenleyici etkisini ilk defa farelerde tespit etmişlerdir (McPherron ve ark., 1997). Belçika Mavisi sığırlarında myostatin geni nükleotidlerinin 821. nükleotid den başlayarak 11 baz çiftinin silinmesi sonucu bu sığırlarda çift kaslılık (double muscling) oluşmuştur (Grobet ve ark., 1997). İtalya kökenli Piedmontese sığırlarında ise 3. ekzon içinde 938. pozisyondaki G A dönüşümü sonucu mutasyon tespit edilmiştir (Kambadur ve ark.,1997). Ayrıca yine İtalya orijinli Marchigiana sığırlarında myostatin geninin 3. ekzon bölgesinde, başlama kodonundan itibaren 871. pozisyonunda meydana gelen G T dönüşümü sonucu, 291. amino asit olan glutamik asiti kodlayan kodonun stop kodona dönüşmesi ile bu sığırlarda çift kaslılık ortaya çıkmıştır (Marchitelli ve ark.,2003). Daha önce tarafımızdan yapılan bir araştırmada yerli sığır ırklarımızın myostatin geni III.ekzon bölgesinde nt871(g T) bir mutasyon olmadığı gösterilmiştir (Özcan ve ark., 2009). Araştırmacıların sınırlı sayıdaki veriler ile yaptığı değerlendirmeler sonucunda nt821(del11) mutasyonu ve nt938 (G A) dönüşümü gibi bazı mutasyonlar bir çok sığır ırkı tarafından paylaşılmıştır (Grobet ve ark., 1998). Bu mutasyonlardan nt821del11; Belgian Blue, Blonde d Aquitaine, Limousine, Parthenaise, Asturiana, ve Rubea Gallega sığır ırklarında görülmüştür. Ayrıca nt938 (G A) mutasyonu ise Gasconne ve Piedmontese sığır türlerinde görülmüştür (Karim ve ark., 2000). Araştırmamızda Bos taurus ve Bos inducus myostatin gen dizileri refarans alınarak (Jeanplong ve ark., 2001; Tantia ve ark., 2006), sığırlarda II. Kromozomda yer alan myostatin genine ait, ekzon-3 bölgesinde görülen nt821(del11) ve mutasyonu, Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı na bağlı bazı enstitülerde koruma altında tutulan yerli sığır ırklarımızdan( Yerli Kara, Kilis, Doğu Anadolu Kırmızısı, Yerli Sarı, Boz Irk ) ve bir kültür ırkı olan Siyah Alaca (kontrol) ırklarındaki varlığı araştırılmıştır. Materyal ve Metot Materyal Araştırmada kullanılan DNA materyali, FAO'nun "Gen Kaynaklarının Korunması" programı kapsamında Tarım ve Köyişleri Bakanlığı na bağlı enstitülerde koruma altında tutulan yerli sığır ırklarından sağlanmıştır. Çalışmada kontrol ırkı olarak kullanılan kültür ırkı Siyah Alaca sığırları ise Ç.Ü. Ziraat Fakültesi'nde bulunan Araştırma ve Uygulama Çiftliği'nden sağlanmıştır. Çalışmada kullanılan kanların ırk bazında temin edildiği Tarım ve Köyişleri Bakanlığı na bağlı enstitüler çizelge.1 de ayrıntılı olarak belirtilmiştir. 131

3 Çizelge 1. Kanların ırk bazında temin edildiği Tarım ve Köyişleri Bakanlığı na bağlı enstitüler. NO Irk Kaynak Örnek Sayısı 1 BI Marmara Tarımsal Araş. Enst./Balıkesir 24 2 YK Lalahan Hayvan Araş. Enst./Anakara 19 3 Ki Çukurova Tar. Araş. Enst./ Adana 25 4 DAK Doğu Anadolu Tar. Araş. Enst./Erzurum 5 YS Urfa/Siverek Köy Sürüleri 18 6 SA Ç.Ü. Büyükbaş Hayvan Yetiştirme Ünitesi/Adana 25 TOPLAM 136 BI:Boz Irk, YK:Yerli Kara, Kİ:Kilis Irkı, DAK:Doğu Anadolu Kırmızısı, YS:Yerli Sarı, SA:Siyah Alaca 25 Metot Sığır kanlarından genomik DNA izolasyonu Salting Out yöntemine (Miller ve ark. 1988) göre yapılmıştır. Myostatin gen dizisi AF ulaşım numarası ile NCBI gen bankasından sağlandı (Jeanplong ve ark., 2001). Ekzon III bölgesi içinde yer alan 141 bç bölgenin amplifikasyonu için primer B kullanıldı (Smith ve ark., 2000)(Çizelge. 2) Çizelge 2. Çalışmada kullanılan primerler Primer Baz Dizisi Sayısı Bölge ForwardB 5 -AGGAGAGATTTTGGGCTTGA-3 20 nt 821del11 ReverseB 5 -TCCAGAGCAGTAATTGGCCT nt 821del11 PCR reaksiyonu; 10x Tris-HCI (ph:8.8) (NH 4 ) 2 SO 4 (5µl), Primer (forward) 20 pmol/µl (1µl), Primer (reverse) 20 pmol/µl (1µl), dntpmix 10 mm (1µl), MgCl 2 25 mm (5µl), Taq Polimeraz 5 IU/µl (1µl), Genomik DNA 40 ng/µl (2µl), distile su (34µl) kullanılarak toplam 50 µl hacim olacak şekilde hazırlanmıştır. PCR aşamaları ise Çizelge.3 de verilmiştir. PCR ürünleri %3 lük agaroz jel elektroforezinde yürütüldü. 132

4 Çizelge 3. PCR reaksiyonuna ait aşamalar Aşamalar Sıcaklık (ºC) Zaman (dk) Döngü sayısı <24 saat 1 48 Nt821(del11) polimorfik bölgenin genotipinin anlaşılması için iki farklı analiz kullanıldı. İlk olarak amplifiye edilen mh + :141bç lik veya mh - :130 bç lik PCR ürününün doğrudan %3 lük agaroz jelde görüntülenmesiyle polimorfik allellerin gözlemlenmesine dayalı yöntem kullanıldı (Smith ve ark., 2000) (Şekil.1). Şekil 1. Nt821(del11) polimorfik bölgeyi de kapsayan 141 bp lik DNA fragmenti 133

5 Bulgular ve Tartışma Bulgular Nt821(del11) polimorfik bölgeye ait Bulgular Beş yerli ve bir kültür sığır ırklarına ait 136 genomik DNA nın myostatin (GDF-8) geni ekzon III bölgesi içinde nt821(del11) polimorfik bölge için mh + :141bç lik veya mh :130bç lik DNA fragmenti PCR ile amplifiye edilerek %3 lük agaroz jelde görüntülendi (Resim.1) Resim 1. Bazı yerli ırklara ait myostatin geni ekzon-3 bölgesi içindeki 141bç lik DNA parçasının %3 lük Agaroz jelde görüntüleri. Beş yerli ve kültür ırkına (kontrol ırk) ait bütün örneklerde nt821(del11) polimorfik bölge mevcut olmadığı için mh alleli bakımından mh+/+ olarak genotiplendirildi. (Çizelge. 4). Çizelge 4. Irklara göre nt821(del11) genotiplerinin ırklara göre dağılımı Tartışma Bu çalışmada, Dünya da bazı sığır ırklarının myostatin geni ekzon-3 bölgesi içinde meydana gelen nt821(del11) çerçeve kayması (frame shift) mutasyonun varlığı Türkiye yerli sığır ırklarında tespit edilmemiştir. Türkiye yerli ırklarında nt821(del11) çerçeve kayması (frame shift) mutasyonu PCR amplifikasyonu ile doğrudan polimorfik allellerin gözlenmesine dayalı olarak araştırılmıştır. Buna göre ırklarımız nt821(del11)( mh - ) polimorfik allel bakımından yabanil tip (wild-type) olduğu gözlenmiştir. Benzer bir çalışmada PCR amplifikasyonu ile doğrudan mutant allelerin belirlenmesi yöntemi kullanılarak 134

6 South Devon sığır ırkına ait 107 örnek üzerinde nt821(del11) polimorfik bölge araştırılmıştır. South Devon sığır ırkına ait bazı örneklerde nt821(del11) polimorfizmi tespit edilmiştir (Smith ve ark., 2000). Dünya da nt821(del11) polimorfizmi; Belgian Blue, South Devon, Blonde d Aquitaine, Limousine, Parthenaise, Asturiana, Rubea Gallega, Red Angus, Polish Red sığır ırklarında görülmüştür (Grobet ve ark.,1997; Kambadur ve ark.,1997; Smith ve ark., 2000; Grobet ve ark., 1998; Karim ve ark., 2000; McPherron ve Lee., 1997; Klauzińka ve ark.,2001). Nadir gözlenen bir durum ise çift kaslılık genotipine sahip hayvanlar bazen çift kaslılık fenotipini göstermemektedir. Polonya Kırmızı (Polish Red) sığırları ile yapılan bir araştırmada nt821(del11) genotipi gözlenmesine rağmen çift kaslılık fenotipine rastlanılmamıştır (Klauzińka ve ark, 2001). Bu durumun yerli ırklarımızda olabileceği ihtimali de göz önüne alınarak yapılan bu çalışmayla yerli ırkların nt821(del11) genotipini taşımadıkları dolayısıyla çift kaslılığın fenotipe yansımaması gibi bir durumun oluşmadığı sonucu ilk kez ortaya konmuştur. McPherron ve Lee, (1997) de bu iki mutasyonun Avrupa da mevcut etçi sığırlar içinde varlığını tespit etmek amacıyla çift kaslı olarak sınıflandırılmayan 16 ayrı sığır türünden(11 Angus, 11 Charolais, 10 Holstein, 10 Brown Swiss, 10 Polled Hereford, 10 Gelbvieh, 9 Simmental, 9 Jersey, 9 Guernsey, 9 Ayrshire, 7 Limousin, 4 Brahman, 4 Polled Shorthorn, 4 Red Angus, 2 Chianina, ve 1 Texas Longhorn ) oluşan 120 adet örnek üzerinden Southern Blot analizleri yardımıyla yaptıkları çalışma sonucunda sadece bir Red Angus sığırının tek ipliğinde nt821del11 mutasyonu bulunduğunu geri kalan çift kaslı olmayan bütün ırklarda her iki (nt821del11 ve nt 938 G A ) mutasyona rastlanmadığı gözlenmiştir Çift kaslılık fenotipini en az 6 farklı mutasyon etkilemektedir. Bu mutasyonlardan nt419 (del7-ins10), nt610 (C T), nt676 (G T) polimorfizmleri II.ekzon bölgesi içinde ve nt821 (del11), nt874 (G T), ve nt938 (G A) polimorfizmleri ise III.ekzon bölgesi içinde yer almaktadır. (Karim ve ark., 2000). Çift kaslılık fenotipi üzerine en az 6 farklı allelin etkilediği bilinmektedir. Yerli ırklar için et verimi en yüksek ırk Doğu Anadolu Kırmızı ırkıdır. Başta Doğu Anadolo Kırmızı ırkı olmak üzere yerli ırkların et veriminin nt821(del11), bölgesinde olmadığı doğrudan PCR dayalı yöntem ile tespit edilmiştir. Bu bölgenin PCR-RFLP ve DNA baz dizilerinin okunması ile teyid edilmesi gereklidir. Ancak yerli ırklarımızın et veriminin çift kaslılığı etkileyen Ekzon-3 bölgesindeki diğer polimorfik allelerden kaynaklanabilir. Bu nedenle myostatin geni Ekzon-3 bölgesinin DNA dizi analiziyle daha kapsamlı araştırılması düşünülmektedir. KAYNAKLAR BELLINGE, R.H.S., LIBERLES, D. A., LASCHI, S.P.A., BRIEN,O.,TAY, G.K Myostatin and its implications on animal breeding:a review. Anim. Genet. 36:

7 GROBET, L., PONCELET, D., ROYO, L. J., BROUWERS, B., PIROTTIN, D., BROUWERS, B., RIQUET, J., SCHOEBERLEIN, A., DUNNER, S., GROBET, L., PONCELET, D., ROYO, L. J., BROUWERS, B., PIROTTIN, D., MICHAUX, C., MÉNISSIER, F., ZANOTTI, M., DUNNER, S., GEORGES, M Molecular definition of an allelic series of mutations disrupting the myostatin function and causing doublemuscling in cattle Mamm. Genome,9: JEANPLONG, F., SHARMA, M.,SOMERS, W.G.,BASS, J.J. ANDKAMBADUR, R Genomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene Mol.Cell.Biochem.220:1-2, KAMBADUR, R., SHARMA, M., SMITH, T. P. L., BASS, J. J Mutations in myostatin (GDF-8) in double muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle. Genome Research, 7: KARIM, L., COPPIETERS, W., GROBET, L., VALENTINI, A., GEORGES, M Convenient genotyping of six myostatin mutations causing double-muscling in cattle using a multiplex oligonucleotide ligation assay. Animal Genetics, 31: KLAUZIŃSKA, M., ZURKOWSKI, M., SIADKOWSKA, E., SZYMANOWSKA, M., GROCHOWSKA, R., ZWIERZCHOWSKI, L., KLEWIEC, J Analysis of genetic structure in Polish Red and Polish Black-and-White cattle using twelve marker loci potentially related to mil kor meat production traits. Anim. Sci. 2: MARCHITELLI, C., SAVARESE, M.C., CRISÀ, A., NARDONE, A., MARSAN, P.A., VALENTINI, A Double muscling in Marchigiana beef breed is caused by a stop codon in the third exon of myostatin gene. Mamm. Genome 14: McPHERRON, A.C., LAWLER, A.M., LEE, S.J Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-B superfamily member. Nature 387 : MÉNISSIER, F., MASSABANDA, J., FRIES, R., HANSET, R., GOERGES, M A deletion in the myostatin gene causes double-muscling in cattle. Natural Genetics, 17:

8 MILLER, S.A.,DYKES, D.D., AND POLESKY,H.F Asimple Salting Out procedure for extracting DNA from Human nucleated cells.nucleic Acids Research,16(3):1215. ÖZCAN, N., ÖZ, A., ÖZCAN, B.D Yerli Sığır Irklarında Myostatin Genine Ait III.Ekzon Bölgesinin G T Polimorfizmi Bakımından Karşılaştırılması, 6.Ulusal Zootekni Bilim Kongresi, 79-84, ERZURUM. SMITH, J.A.,LEWIS, A.M., WIENER, P.,WILLIAMS, J.L Genetic variation in the bovine myostatin gene in UK beef cattle: Allele frequencies and haplotype analysis in the South Devon. Anim.Genet, 31:306-3 TANTIA,M.S., VIJH,R.K., KUMAR,S.T., MISHRA,B. AND REECY, J.M Comparative analysis of GDF 8 (myostatin) in Bos indicus and Bos taurus DNA Seq. 17 (4),