LOKAL OLARAK ÜÇ FARKLI DOZDA SMVASTATN UYGULAMASININ KEMK DEFEKT YLEMES ÜZERNE ETKSNN DEERLENDRLMES

Transkript

1 LOKAL OLARAK ÜÇ FARKLI DOZDA SMVASTATN UYGULAMASININ KEMK DEFEKT YLEMES ÜZERNE ETKSNN DEERLENDRLMES EVALUATION OF EFFECTS OF THREE DIFFERENT DOSES OF LOCAL SIMVASTATIN APPLICATION ON HEALING OF BONE DEFECTS lker ÖZEÇ * Erdem KILIÇ ** Cesur GÜMÜ *** Fahrettin GÖZE **** ÖZET Amaç: Lokal olarak üç farkl dozda uygulanan simvastatinin rat mandibula kemik defekti iyilemesi üzerine etkisinin deerlendirilmesi. Gereç ve Yöntem: Çalmada 4 gruptan oluan 24 adet Wistar albino rat kullanlmtr. Ratlarn angulus mandibula bölgesinde 3mm çapnda kritik boyutta kemik defekti oluturulmutur. Deney gruplarnda defekt bölgesine 2.5mg/ml, 5mg/ml ve 7.5mg/ml konsantrasyonlarda hazrlanan simvastatin solüsyonlarndan 0.2 ml transdermal olarak 14 gün boyunca uygulanmtr. Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yaplmamtr. Defekt bölgesi histolojik, radyolojik ve periferal saysal bilgisayarl tomografi ile densitometrik olarak deerlendirilmitir. Bulgular: Histolojik deerlendirmede her üç deney grubunda da kontrol grubuna göre belirgin ekilde fazla olumu yeni kemik varl tespit edildi. Periferal saysal bilgisayarl tomografi ile yaplan deerlendirme sonucunda ikinci ve üçüncü grubun defekt densite deerinin kontrol grubuna göre %337 orannda, birinci grubun densite deerinin ise kontrol grubuna göre %231 orannda daha fazla olduu tespit edildi. Deney gruplar ile kontrol grubu arasndaki farkn istatistiksel olarak anlaml olduu görüldü. Sonuç: Kemik defekt bölgesine transdermal olarak uygulanan simvastatinin kemik defekti iyilemesi üzerine pozitif olarak etki ettii ve simvastatin dozu arttkça görülen enflamasyon bulgularnn da artt belirlendi. Anahtar kelimeler: Simvastatin, kemik defekt iyilemesi, kemik morfogenetik proteini-2, doz, doku mühendislii SUMMARY Purpose: To evaluate the effects of three different doses of local simvastatin application on rat mandibula defect healing. Material and Methods: In this study 24 Wistar albino rats were used, and were divided into four groups. Bone defects of 3 mm diameter were created at angulus mandibula of rats. Simvastatin solution was prepared at 2.5mg/ml, 5mg/ml and 7.5mg/ml concentrations and 0.2ml solution was applied transdermally to defect sites of experimental groups for 14 days. No intervention was done to the control group. The evaluation of defect sites were done histologically, radiologically and with peripheral quantitative computerized tomography for densitometry. Results: Histologically, significantly greater new bone formation was observed in all experimental groups compared with the control group. The evaluation with peripheral quantitative computerized tomography showed 337% more defect site density in the second and third group and 231% more defect site density in the first group in comparison with the control group. Statistical evaluation showed significant difference between the experimental groups and the control group. Conclusion: These results showed that transdermal simvastatin application had positive effects on bone defect healing and it was determined that increasing simvastatin dose increased the clinical inflammation symptoms. Key words: Simvastatin, bone defect healing, bone morphogenetic protein-2, dose, tissue engineering GR Kemik dokusu rejenerasyon özelliine sahiptir ve yaralanan kemik dokusu ekil ve fonksiyonunu yeniden kazanabilmektedir, fakat yaralanma boyutu büyük olduu zaman iyileme snrl kalmaktadr. Kritik boyutta kemik defekti; organizmann hayat boyunca kendiliinden tam olarak kemiksel iyileme ile kapanmas mümkün olmayan defekt olarak tanmlanmaktadr. 1 Kendiliinden kapanmas * Cumhuriyet Üniversitesi, Di Hekimlii Fakültesi, Az, Di, Çene Hastalklar ve Cerrahisi Anabilim Dal, S&VAS. ** Erciyes Üniversitesi, Di Hekimlii Fakültesi, Az, Di, Çene Hastalklar ve Cerrahisi Anabilim Dal, KAYSER&. *** Cumhuriyet Üniversitesi, Tp Fakültesi, Radyodiagnostik Anabilim Dal, S&VAS. **** Cumhuriyet Üniversitesi, Tp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dal, S&VAS. 82 mümkün olmayan defektlerde tedavi için otojen greft uygulanmas altn standart olarak kabul edilmektedir, fakat bu yöntemde baz vakalarda verici alan yetersizlii gibi sorunlarla karlalabilmektedir. Günümüzde aratrmaclar kritik boyutta kemik defekti iyilemesini salamak amacyla, büyüme ve farkllama faktörlerini yaptklar çalmalarda defekt bölgesine lokal olarak uygulam ve bu uygulamalarn defekt iyilemesi üzerinde pozitif etkili olduunu göstermilerdir. 2-4

2 Kemik morfogenetik proteini 1965 ylnda Urist 5 tarafndan tanmlanm ve daha sonra yaplan birçok hayvan deneyi çalmasnda rekombinant insan kemii morfogenetik proteini-2 nin kritik boyutta kemik defekti iyilemesini salad gösterilmitir. 6 Kemik morfogenetik proteini-2 bütün kemik morfogenetik proteinleri arasnda en yüksek osteoindüktif etkiye sahiptir. Yaplan çalmalar sonucunda kemik morfogenetik proteini-2 nin uygulanan dozu ile oluan yeni kemik miktar arasnda iliki olduu ve yüksek dozda kemik morfogenetik proteini-2 uyguland zaman elde edilen yeni kemik miktarnn da fazla olduu tespit edilmitir. 7-9 Statinler, serum kolesterol seviyesini düürmek için kullanlan, 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A redüktaz enzimini inhibe eden ilaçlardr ve yaplan çalmalar ile kemirgenlerde in vivo ve in vitro olarak kemik oluumunu artrdklar tespit edilmitir. 10 Statinlerin kemik oluumu üzerine etkilerinin mekanizmasnn incelenmesi sonucunda, statinlerin kemik hücrelerinden kemik morfogenetik proteini-2 salnmn artrarak kemik oluumunu stimule ettikleri belirlenmitir. 10,11 Maeda ve ark. 12 statinlerin, kemik oluumunda rol alan dier büyüme faktörleri üzerinde etkilerinin olup olmadn aratrmlar ve statinlerin vasküler endotelial büyüme faktörü salnmn da belirgin olarak artrdn tespit etmilerdir. Uygulanan kemik morfogenetik proteini-2 dozu artrlnca, elde edilen kemik miktarnn artt bilinmektedir. Bu çalmada; defekt bölgesine uygulanan simvastatin dozu arttrlrsa, simvastatinin etkisi ile kemik hücrelerinden salnacak olan kemik morfogenetik proteini-2 miktarnn artaca ve buna bal olarak da elde edilen kemik miktarnn daha fazla olaca düünülmütür. Bu amaçla rat mandibulasnda oluturulan kemik defektlerine üç farkl dozda simvastatin solüsyonu transdermal olarak uygulanm ve bu uygulamalarn kemik defekti iyilemesi üzerine etkilerinin deerlendirilmesi amaçlanmtr. GEREÇ ve YÖNTEM Bu çalmada 24 adet yetikin, yaklak 250gr arlnda Wistar albino rat kulanlmtr. Deney hayvanlarna kafesler içerisinde baklm, kat diyet ile beslenmi ve istedikleri kadar suya ulaabilmeleri salanmtr. Çalma protokolü Cumhuriyet Üniversitesi Tp Fakültesi hayvan etik kurulu tarafndan onaylanmtr. Deney hayvanlar 6 rattan oluan 4 gruba ayrlmtr. Üç farkl konstrasyonda (2.5mg/ml, 5mg/ml ve 7.5mg/ml) simvastatin solüsyonu, 10mg lk tablet (Zocor tablet, 10mg, Merck Sharp Dohme, Türkiye) su içerisinde çözündürülerek hazrlanmtr. Cerrahi ilem için kullanlacak aletler otoklav kullanlarak sterilize edilmi ve operasyon steril cerrahi giysi ve steril eldiven kullanlarak gerçekletirilmitir. Deney hayvanlarnn anestezisi intraperitonal olarak 3mg/kg xylazine (Rompun 2%, Bayer, &stanbul, Türkiye) ve 90mg/kg ketamin HCl (Ketalar, Eczacba-Warner Lambert, &stanbul, Türkiye) kullanlarak salanmtr. Mandibulada defekt oluturulacak bölgenin üzerine gelen deri tra edilmi ve betadine kullanlarak dezenfekte edilmitir. Angulus mandibulada, bazis mandibulaya yakn olarak 1cm lik bir insizyon yaplm ve takiben deri alt dokular geçilerek kemik yüzeyi aça çkarlmtr. 3mm çapnda çelik rond frez kullanlarak mandibuler kemikte kritik boyutta, standart tam kat kemik defekti oluturulmutur. Kemik defekti oluturulurken serum fizyolojik ile irrigasyon yaplarak s olumas ve oluacak snn dokulara zarar vermesi engellenmitir. &lem tamamlandktan sonra flep orijinal pozisyonuna 5-0 ipek sütür kullanlarak dikilmi ve primer olarak kapanmas salanmtr. Mandibulada oluturulan defekt üzerine gelen bölge rehber alnarak, insülin enjektörü ile operasyondan sonraki gün balayp 14 gün boyunca, 1. gruba 2.5mg/ml konsantrasyonda, ikinci gruba 5mg/ml konsantrasyonda ve üçüncü gruba 7.5mg/ml konsantrasyonda hazrlanan solüsyondan 0.2ml transdermal olarak defekt bölgesine enjekte edilmitir. Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yaplmamtr. Deney hayvanlar 14. günde yüksek dozda sodyum pentobarbital kullanlarak sakrifiye edilmitir. Deney hayvanlarnn mandibuler kemikleri çevre doku ile birlikte çkarlm, simfiz bölgesinden ayrlm ve %10 formalin ile fikse edilmitir. Bilgisayarl dental radyografi (CDR, Schick Technologies INC.) kullanlarak normal röntgen görüntüleri elde edilmi, takiben defekt bölgesinde rejenere olan kemiin densitesinin deerlendirilmesi amacyla bilgisayarl tomografi (Philips Brilliance Multislice, 16 slice, Holland) ile 0.8mm kalnlnda kesitler ile defekt bölgesi taranm ve periferal saysal bilgisayarl tomografik deerlendirme yaplmtr. Rejenere olan kemiin densitesi Extended Brillance Workspace de bilgisayar ekrannda kesit üzerinde görülen 83

3 defekt alanna bilgisayar tarafndan otomatik olarak 3mm çapnda oluturulan daire yerletirilerek ve Mx View yazlm kullanlarak hesaplanmtr. Histolojik deerlendirme için örnekler dekalsifiye edildikten sonra rutin ilemler yaplarak parafine gömülmü ve k mikroskobunda incelenmek üzere seri kesitler elde edilerek hematoksilen eosin ile boyanmtr. Elde edilen sonuçlar verilerin normal dalma uygunluu test edildikten sonra tek yönlü varyans analizi kullanlarak istatistiksel olarak deerlendirilmitir. Gruplar aras istatistiksel deerlendirme çoklu karlatrma testlerinden Tukey testi kullanlarak yaplmtr. p<0.05 deeri test sonucunun anlaml olduunun göstergesi olarak kabul edilmitir. BULGULAR Çalma boyunca deney hayvanlarnn hareketli olduu, beslenmelerinde problem olmad görüldü. Özellikle ikinci ve üçüncü grupta yer alan deney hayvanlarnda simvastatinin önemli ölçüde doku enflamasyonuna ve büyük boyutlu, çalmann sonuna kadar varln koruyan sert kvamda ödeme neden olduu belirlendi. Baz deney hayvanlarnda özellikle ikinci ve üçüncü grupta defekt bölgesinin üzerine rastlayan bölgede deri bütünlüünün kaybolduu ve yara kabuu olutuu tespit edildi. orantl olduu tespit edildi (Resim 1). Kontrol grubunda oluturulan kemik defektinin fibröz doku ile dolu olduu izlendi ve defekt kenarlarnda çok az miktarda yeni olumu kemik varl gözlendi. Her üç deney grubunda da oluan yeni kemik miktarnn kontrol grubundan belirgin derecede fazla olduu tespit edildi. Radyografik de1erlendirme Normal radyografi ile yaplan deerlendirmede deney gruplarnda defekt bölgesinde kemik oluumunun belirtisi olan radyoopasite bulgusuna rastland. Periferal saysal bilgisayarl tomografi ile yaplan deerlendirme sonucunda deney gruplarnda yeni olumu kemik varl görüldü (Resim 2). Defekt bölgesinin deerlendirilmesi ile elde edilen densite deerlerinin ikinci ve üçüncü grupta benzer olduu, ikinci ve üçüncü grubun defekt densite deerinin kontrol grubuna göre %337 orannda, birinci grubun densite deerinin ise kontrol grubuna göre %231 orannda daha fazla olduu tespit edildi (p<0.001) (Tablo I). Resim 2. Üçüncü grup ve kontrol grubunun üç boyutlu periferal saysal bilgisayarl tomografik görüntüsünün karlatrlmas (siyah ok; yeni oluan kemik) Resim 1. Deney gruplarnda ve kontrol grubunda kemik defekt bölgesinde yeni oluan trabeküler kemik miktarnn karlatrlmas (HE X 25) Histolojik de1erlendirme Bütün deney gruplarnda defekt kenarlarndan balayarak oluan yeni kemik oluumu tespit edildi ve kkrdak doku oluumuna rastlanmad. Yeni oluan kemik miktarnn uygulanan simvastatin dozu ile Tablo I. Periferal saysal bilgisayarl tomografi ile yaplan densitometrik deerlendirme sonuçlar: 1. grup ile kontrol grubu arasnda, 2. grup ile kontrol grubu arasnda ve 3. grup ile kontrol grubu arasnda istatistiksel olarak anlaml fark vardr Kemik Densitometri Deerleri 1. grup ± grup ± GRUPLAR 3. grup ± Kontrol grubu ± p<0.001 TARTIMA Statinler; doal olarak oluan lovastatin, kimyasal olarak modifiye edilmi olan simvastatin, pravastatin, sentetik olarak üretilmi olan atorvastatin, fluvastatin ve serivastatini içermektedir. Simvastatinin yaplan in 84

4 vitro çalmalarda kemik oluumu üzerinde en fazla etkisi olan statin olduu tespit edilmitir, bundan dolay bu çalmada da kritik boyutta kemik defekti iyilemesi üzerine etkisinin deerlendirilmesi için simvastatin seçilmitir. 13 Statinlerin kemik oluumu üzerindeki etkisi kemik morfogenetik protein-2 salnm üzerindeki etkileri ile olumaktadr. Wong ve Rabie 14 yaptklar çalmada simvastatin ile greftlenmi kemik defektlerinde, greftlemeden sonraki 3. günde vasküler endoteliyal büyüme faktörü salndn, 4. günde kemik morfogenetik proteini-2 salndn ve 5. günde de yeni kemik olutuunu tespit etmilerdir. Wong ve Rabie 15 statinler kullanlarak elde edilen iyileme modelinin, direk olarak kemik morfogenetik proteini kullanlarak elde edilen iyileme modeli ile benzer olduunu söylemilerdir. Simvastatin ile kemik morfogenetik proteini-2 arasndaki iliki, kemik morfogenetik proteini antagonisti olan noggin maddesinin kullanld çalmalar ile desteklenmitir. Simvastatin kullanlarak yaplan çalmalarda ortamda noggin bulunduu zaman kemik oluum miktarnn daha az olduu tespit edilmitir. 13 Statinler klinik kullanmda sistemik olarak uygulanmaktadr ve karacierde metabolize olmalarndan dolay, sistemik uygulamada kemie düük konsantrasyonda ulaabilmektedir. Kemik defektlerinin iyilemesinde statinlerin kemik oluumu üzerine etkilerinin artrlabilmesi ve kemie yüksek konsantrasyonlarda ulaabilmesi için lokal olarak uygulama yaplmas daha uygundur. Gutierrez ve ark. 6 lokal olarak uygulanan statinlerin sistemik uygulamaya göre kemik oluumu üzerinde 50 kat daha fazla etkiye sahip olduunu belirlemilerdir. Günümüzde tayc kullanarak büyüme faktörlerinin lokal olarak uygulanmas geçerli bir yöntemdir, fakat tayc ile uygulanan faktör dereceli olarak ortama salnmakta ve bir süre sonra ortamdan tamamen uzaklamaktadr. Bu çalmada defekt bölgesine uygulanan simvastatinin, defekt bölgesinde daha uzun süre yer alabilmesi için simvastatin intradermal olarak enjeksiyon ile 14 gün boyunca mandibula kemik defekti bölgesine uygulanmtr. Salkl kemie, kemik kalnln artrma amaçl yaplan lokal simvastatin uygulamalarnda kemik kalnlnda deiik oranlarda art görülmütür. 17 Simvastatinin kemik defekti iyilemesi üzerine etkisini deerlendirmesi amacyla yaplan çalmada ise, simvastatin kollajen sünger tayc kullanarak kemik defektine uygulanm ve deney grubunda kontrol grubuna göre %308 orannda daha fazla yeni kemik olutuu tespit edilmitir. 18 Bu çalma sonucunda da defekt bölgesine simvastatin uygulanmasnn kemik defekti iyilemesini pozitif olarak etkiledii gösterilmitir. Kemik morfogenetik proteini-2 nin etkisinin doza baml olarak deitii ve yüksek dozda protein kullanld zaman elde edilen kemik miktarnn artt bilinmektedir. 19 Simvastatinin kemik oluumunu üzerindeki etkisi kemik morfogenetik protein-2 ye baldr. Bu çalmada simvastatin dozuna bal olarak defekt bölgesinde oluan kemik miktarnn artt tespit edilmitir. Simvastatinin topikal ve sistemik antienflamatuar etkisi olduu yaplan çalmalar ile gösterilmitir, fakat antienflamatuar özellii ve yeni kemik oluturma özellii uygulanan simvastatin dozuna göre deiiklikler göstermekte, bu iki özellik arasnda bir çeliki bulunmaktadr. Thylin ve ark. 20 salkl kemik yüzeyine 2.2mg simvastatin uygulamlar ve enflamasyonun fazla görüldüü deneklerde enflamasyonun az olduu deneklere göre kemik kalnlnda belirgin art olduunu tespit etmilerdir. Stein ve ark 21 lokal olarak ve 2.2mg dozlarda simvastatini salkl kemik yüzeyine uygulamlar ve sonuç olarak simvastatin dozunu düürünce klinik enflamasyon bulgularnn azaldn, fakat bununla birlikte elde edilen yeni kemik miktarnn da azaldn belirlemilerdir. Bu çalmada da literatür bilgilerine uyumlu olarak, simvastatin dozu artnca enflamasyonda ve oluan ödemde art olduu, ayn zamanda yüksek doz uygulanan ve fazla enflamasyon bulgusu görülen deneklerde daha fazla kemik olutuu tespit edilmitir. SONUÇ Üç farkl dozla kemik defekti bölgesine transdermal olarak insülin enjektörü ile uygulanan simvastatinin, doz artna bal olarak belirli bir noktaya kadar yeni oluan kemik miktarn arttrd ve doz artna bal olarak görülen enflamasyon bulgularnn artt tespit edilmitir. Simvastatinin kemik defekti iyilemesinde daha etkin olarak kullanlabilmesi için maksimum kemik oluumu ile birlikte minimum enflamasyon oluturacak doz 85

5 miktarnn belirlenmesi amacyla baka çalmalarn yaplmas gerekmektedir. KAYNAKLAR 1. Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clin Orthop Relat Res 1986; 205: Srouji S, Rachmiel A, Blumenfeld I, Livne E. Mandibular defect repair by TGF-beta and IGF-1 released from a biodegradable osteoconductive hydrogel. J Craniomaxillofac Surg 2005; 33: Santana RB, Trackman PC. Controlled release of fibroblast growth factor 2 stimulates bone healing in an animal model of diabetes mellitus. Int J Oral Maxillofac Implants 2006; 21: Gomez G, Korkiakoski S, Gonzalez MM, Lansman S, Ella V, Salo T, Kellomaki M, Ashammakhi N, Arnaud E. Effect of FGF and polylactide scaffolds on calvarial bone healing with growth factor on biodegradable polymer scaffolds. J Craniofac Surg 2006; 17: Urist MR. Bone formation by autoinduction. Science 1965; 150: Higuchi T, Kinoshita A, Takahashi K, Oda S, Ishikawa I. Bone regeneration by recombinant human bone morphogenetic protein-2 in rat mandibular defects. An experimental model of defect filling. J Periodontol 1999; 70: Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, Bauduy M, Cordes P, Harada T, Israel DI, Hewick RM, Kerns KM, LaPan P. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: Takuwa Y, Ohse C, Wang EA, Wozney JM, Yamashita K. Bone morphogenetic protein-2 stimulates in cultured osteoblastic cells, MC3T3-E1. Biochem Biophys Res Commun 1991; 174: Fujimura K, Bessho K, Kusumoto K, Ogawa Y, Lizuka T. Experimental studies on bone inducing activity of composites of atelopeptide type I collagen as a carrier for ectopic osteoinduction by rhbmp-2. Biochem Biophys Res Commun 1995; 208: Mundy GR, Garrett IR, Harris SE, Chan J, Chen D, Rossini G, Boyce BF, Zhao M, Gutierrez G. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science 1999; 286: Sugiyama M, Kodama T, Konishi K, Abe K, Asami S, Oikawa S. Compactin and simvastatin, but not pravastatin, induce bone morphogenetic protein-2 in human osteosarcoma cells. Biochem Biophys Res Commun 2000; 19: Maeda T, Kawane T, Horiuchi N. Statins augment vascular endothelial growth factor expression in osteoblastic cells via inhibition of protein prenylation. Endocrinology 2003; 144: Garrett IR, Gutierrez G, Mundy GR. Statins and bone formation. Curr Pharm Design 2001; 7: Wong RW, Rabie AB. Early healing pattern of statin-induced osteogenesis. Br J Oral Maxillofac Surg 2005; 43: Wong RW, Rabie AB. Histologic and ultrastructural study on statin graft in rabbit skulls. J Oral Maxillofac Surg 2005; 63: Gutierrez GE, Lalka D, Garrett IR, Rossini G, Mundy GR. Transdermal application of lovastatin to rats causes profound increases in bone formation and plasma concentrations. Osteoporos Int 2006; 17: Stein D, Lee Y, Schmid MJ, Killpack B, Genrich MA, Narayana N, Marx DB, Cullen DM, Reinhardt RA. Local simvastatin effects on mandibular bone growth and inflammation. J Periodontol 2005; 76: Wong RWK, Rabie ABM. Statin collagen grafts used to repair defects in the parietal bone of rabbits. Br J Oral Maxillofac Surg 2003; 41: Zheng LW, Wong MC, Rabie AB, Cheung LK. Evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in mandibular distraction osteogenesis in rabbits: Effect of dosage and number of doses on formation of bone. Br J Oral Maxillofac Surg 2006; 44: Thylin MR, McConnell JC, Schmid MJ, Reckling RR, Ojha J, Bhattacharyya I, Marx DB, Reinhardt RA. Effects of simvastatin gels on murine calvarial bone. J Periodontol 2002; 73: Stein D, Lee Y, Schmid MJ, Killpack B, Genrich MA, Narayana N, Marx DB, Cullen DM, Reinhardt RA. Local simvastatin effects on mandibular bone growth and inflammation. J Periodontol 2005; 76: Yaz@Ama Adresi: Yard. Doç. Dr. &lker ÖZEÇ Cumhuriyet Üniversitesi Di Hekimlii Fakültesi Az, Di, Çene Hastalklar ve Cerrahisi Anabilim Dal Kampüs / S&VAS Tel: / 2784 Faks: E-posta: iozec@cumhuriyet.edu.tr 86