Recai KULAKSIZ*, Ali DAŞKIN**

Transkript

1 Veteriner Hekimler Derneği Dergisi BİLİMSEL MAKALELER Teke Spermasının Kısa ve Uzun Süreli Saklanması Recai KULAKSIZ*, Ali DAŞKIN** ÖZET: Keçi yetiştiriciliğinde, özellikle entansif üretim sistemlerinde, dölermenin kontrolü ve süt, et, tiftik üretiminin artırılması, suni tohumlama aracığıyla sağlanabilir. Doğal çiftleşme ile karşılaştırıldığında, suni tohumlama her bir tekeden alınan döl sayısını yükseltir ve uzak mesafelerdeki dişi keçilerin üstün özelliklere sahip teke sperması ile tohumlanmasını sağlar (özellikle dondurulmuş sperma). Suni tohumlama yüksek verim özelliğine sahip genotiplerin hızlı ve geniş şekilde yayılımına ve hastalıkların yayılma riski olmaksızın genotiplerin değişimine de izin verir. Suni tohumlama programlarından tatmin edici fertilite sonuçlarının elde edilmesi için sperma saklama sürecindeki, spermanın alınması, muayenesi, saklanması ve kullanımı gibi her aşamaya özen gösterilmelidir. Anahtar kelimeler: teke, sperma, spermanın saklanması, dölverimi Short and Long Term Preservation of Goat Semen ABSTRACT: Artificial insemination (AI) has a important role in goat breeding, especially in intensive systems of production, to control reproduction and, When it was, to improve the production of milk, hair and meat. Compared with natural mating, AI gives an increase in the numbers of offspring per sire, and allows a spatial and temporal (in the case of frozenthawed) dissociation between collection of spermatozoa and fertilization. AI allows rapid and widespread diffusion of improved genotypes and the exchange of genotypes without transmitting diseases. The success of an AI program depends on using suitable methods that are semen collection, examination, preservation and insemination during preservation. Key words: buck, semen, storage for semen, fertility 1. Giriş Keçilerde sun i tohumlama üzerine yapılan araştırma ve çalışmalar diğer çiftlik hayvanlarına göre daha azdır li yıllardan sonra gerek ülkemizde gerekse dünyada çeşitli bilimsel araştırmalar yapılmış ve halen de yapılmaya devam etmektedir. Ancak keçilerde yapılan suni tohumlama çalışmalarından istenilen düzeyde bir başarı elde edilememiştir. Özelikle de dondurulmuş spermayla yapılan sun i tohumlamalardan elde edilen başarı oranı düşüktür. Ülkemizde keçilerde yapılan suni tohumlama çalışmaları Ankara keçilerinde yoğunlaşmıştır. Dünyada da değişik keçi ırkları üzerinde sun i tohumlama çalışmaları yapılmış ve halen de yapılmaktadır. Ancak dünyada keçide sun i tohumlamanın yaygın olarak yapıldığını söylemek mümkün değildir. Daha çok büyük ticari işletmelerde ve bilimsel amaçlı olarak sun i tohumlama uygulamaları yapılmaktadır. Teke spermanın saklanması, özellikle de dondurulması, spermatozoonlarda, yapısal, biyokimyasal ve fonksiyonel hasara neden olur. Bunun sonucu olarak, motilite ve canlılıkta * Vet. Hekim., Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama AD., Dışkapı-ANKARA. ** Prof. Dr., Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama AD., Dışkapı-ANKARA. 51

2 BİLİMSEL MAKALELER Veteriner Hekimler Derneği Dergisi kayıp görülür. Motilite ve canlılıktaki kayıplar fertilite oranını etkiler. Bu nedenle dondurulmuş spermanın fertilitesi, taze spermanınkinden daha düşüktür. Keçi spermasının saklanmasındaki en önemli problem, spermatozoonların canlılığı üzerine seminal plazmanın zararlı etki göstermesidir. Yumurta sarısı içeren sulandırıcılarla ilişkilendirilen problem, bulbouretral bez sekresyonunda bulunan ve seminal plazmada yer alan, yumurta sarısı koagule edici özellik taşıyan enzime (EYCE) bağlanmıştır (8, 20). EYCE, yumurta sarısı lesitinini yağ asitlerine dönüştüren ve lisolektin hidrolizini katalizleyen fosfolipaz A olarak identifiye edilmiştir. Lisolesitin bileşiği teke spermatozoonları için toksiktir. Seminal plazmadaki fosfolipaz AZ etkinliği yumurta sarısı kullanılarak kanıtlanmıştır. Fakat, yumurta sarısı fosfolipidleri ve trigliseridleri içerir, bu nedenle fosfolipid etkinliği üzerine yapılmış araştırmalar, lipaz aracılığı ile yağ asitlerinin yumurta sarısı trigliseritlerinden ayrılmasının göz ardı edilemeyeceğini de ortaya koymuştur. Bu yüzden, seminal plazmadaki etkin ajanın spesifik fosfolipaz AZ olduğunun doğrulanması amacıyla, EYCE nin yapısal ve enzimatik özelliklerinin incelenmesi sürdürülmektedir (9). Teke seminal plazmasında SBUIII olarak isimlendirilen ve süt bazlı sulandırıcı bileşenleri ile etkileşime giren bir protein fraksiyonunun, in vitro şartlarda spermatozoa canlılığını baskılamaktan sorumlu olduğu saptanmıştır. Pellicer ve ark. (1997), yağsız sütle sulandırılmış spermatozoonların zarar görmesinden sorumlu olan SBUIII bileşenini saflaştırmış, karakterize ve identifiye etmiştir. SBUIII bileşeni kda ağırlığında, heparine afinite gösteren N-glycosyl proteindir (BUSgp60). Bu proteinin, yağsız süt ile sulandırılmış teke epididimal spermatozoonlarının motilitesindeki düşüşü, akrozomal ve hücresel bozulmayı arttırdığı gözlemlenmiştir. 2. Teke Spermasının Kısa Süreli Saklanması Teke sperması 2 ile 15 o C lerdeki sıcaklıklar arasında kısa süreli saklanabilir. 4-5 o C (buzdolabı sıcaklığı) ise tercih edilen ve kısa süreli saklama için en uygun sıcaklıktır. Teke spermasının kısa süreli saklaması amacıyla, ihtiyaç duyulan sulandırıcılarla ilgili olarak sistematik herhangi bir araştırma yürütülmemiş olsa bile, bir çok sulandırıcı fertilite ve laboratuar testlerinden geçirilmiştir. Bu güne kadar teke spermasının kısa süreli saklanmasında kullanılan sulandırıcılar: fizyolojik tuzlu su, sodyum sitrat yumurta sarısı, sodyum sitrat fruktoz yumurta sarısı, yumurta sarılı veya yumurta sarısız yağlı, yağsız veya bileşenleri ayarlanmış süt yanında, ticari olarak Cornell University Extender (CUE), Spermasol, Dilopten, Neoseminan, Illini Variable Temperature (IVT) gibi sulandırıcılarda kullanılmaktadır (10). Farklı sulandırıcıların kullanıldığı kısa süreli (5-72 saat) saklama çalışmalarında in vitro canlılık ve fertilite oranları büyük farklılık göstermektedir (8). Belirtilen sulandırıcıların performanslarındaki büyük farklılık, seminal plazmanın sulandırıcı içindeki yumurta sarısı ve süt bazlı sulandırıcı bileşenleri ile etkileşime girmesi dikkate alındığında şaşırtıcı değildir. Daha önce vurgulandığı gibi, yumurta sarısı içeren sulandırıcılarla elde edilecek başarı iki faktöre bağlanmıştır; (1) mevsimsel ve bireysel (her bir tekeye bağlı) olarak değişen seminal plazmadaki EYCE varlığı, (2) tavukların beslenmesine bağlı olarak değişiklik gösteren yumurta sarısı kompozisyonundaki değişiklikler. Bu konuda, yumurta sarısının eldesi amacıyla ağır tavuk ırklarının yumurtalarının, hafif tavuk ırklarına nazaran tercih edilmesi yönünde bilimsel öneriler bulunmaktadır (10). Kısa süreli saklamada, seminal plazma ile yumurta sarısı arasındaki olumsuz etkileşimin azaltılması için sulandırıcıdaki yumurta sarısı oranının azaltılması da uygun bir çözüm olabilir. Roca ve ark. (1997) teke spermasının kısa süreli saklanmasında, yıkanmamış spermanın kullanıldığı grupta sulandırıcıdaki yumurta sarısının oranını %12 den %2 ye çektiklerinde, yıkanmış sperma ile yıkanmamış sperma arasında gebelik oranları bakımından önemli fark saptayamamışlardır (%70,3, %73,5). Eppleston ve ark. (1994) yapmış oldukları çalışmada, 5 o C tris -fruktoz -yumurta sarısı (%2) içeren sulandırıcıda, en az 8 gün boyunca spermatozoonların fertilizasyon yeteneklerini koruduklarını bildirmişlerdir. 52

3 Veteriner Hekimler Derneği Dergisi BİLİMSEL MAKALELER 3. Teke Spermasının Uzun Süreli Saklanması Teke spermasının ilk kez Smith ve Polge (1950) tarafından dondurulmasından ve Barker (1957) in dondurulmuş çözdürülmüş teke spermasının pratik uygulamalar için yetersiz olduğunu, belirtmesinden bu yana, bir çok araştırmacı teke spermasının dondurulmasına ilişkin araştırmalar yapmıştır. İlk zamanlarda, teke spermasını dondurmak amacıyla çoğunlukla boğalar için geliştirilen sulandırıcılar denenmiştir. Belirtilen fertilizasyon sonuçları ise yetersiz (% 3-15), orta (% 20-48) ve güvenilir (%70) düzeylerde olmuştur. Sonuçların bu kadar farklı olmasının nedeni, ilk çalışmalarda spermanın seminal plazma ayrılmadan dondurulmasıdır. Fakat 1950 lerin sonlarına doğru teke seminal plazmasının spermatozoonlar üzerine saklama sırasında zararlı olduğu bulunmuştur. Corteel (1977) ejakulasyondan hemen sonra seminal plazmanın uzaklaştırılmasının spermatozoanın canlılığını devam ettirmesi açısından yararlı olduğunu saptamış ve spermanın yıkanmasını önermiştir. Bir çok araştırmacı ise sperma yıkama yöntemini geliştirmiştir. Etkili bir şekilde seminal plazmanın uzaklaştırılması, yıkama solusyonu sperma oranına ve yıkama sayısı gibi yıkama yönteminin yoğunluğuna bağlıdır. 1:5 veya 1:10 sulandırıldıktan sonra iki kere yıkama işleminin gerçekleştirilmesinin bir kere yapılmasına göre çok daha etkili olduğu belirtilmektedir. Yüksek sulandırma oranları ile her iki yöntemin etkinliği arttırılabilir. Bu nedenle, tek yıkama işleminden önce yüksek oranlarda spermanın sulandırılması (1:20) ile yıkama sayısı azaltılabilir (14). Corteel in yönteminde (1981) yıkanmış spermatozoa gliserol içermeyen sulandırıcılarla, son hücre yoğunluğunun yarısına ulaşacak şekilde sulandırılır ve 30 o C den 4 o C ye 1 saatte soğutulur. Daha sonra gliserol içeren sulandırıcı (%14) son hücre yoğunluğu milyon olacak şekilde eklenir, böylece final gliserol konsantrasyonunun %7 olması sağlanmış olur. Bu işlemlerden sonra, 4 o C de 1-3 saat arasında tutularak alışım işlemi tamamlanmış olur. Sperma seminal plazma ayrılmadan dondurulacaksa taze sperma 30 o C de gliserol içeren sulandırıcı ile sulandırıldıktan ve saatte 4-5 o C ye kadar soğutulduktan sonra ekilibrasyon yapılmaksızın dondurulabilir (15,16). Bu yönteme alternatif olarak, yıkanmamış spermanın dondurulması iki aşamada yapılabilir. Alınmış olan sperma önce gliserolsüz sulandırıcı ile sulandırılır, saatte 4-5 o C ye kadar soğutulduktan sonra ikinci basamak olarak gliserol içeren sulandırıcı ile sulandırılır ve 1.5 saat ekilibrasyonda tutulduktan sonra dondurulur. İki basamaklı yöntemin, tek basamaklı yöntemle karşılaştırıldığında çözdürme sonrası canlılık bakımından her hangi bir avantaja sahip olduğu belirlenememiştir (14) Teke Spermasının Dondurulmasında Kullanılan Sulandırıcılar ve Kryoprotektanlar Teke spermasının kısa veya uzun süreli saklanmasında en yaygın olarak kullanılan sulandırıcılar arasında, yağsız inek sütü-0,5 M glukoz, Tris-sitrik asit-glukoz- yumurta sarısı ve Na-sitrat-glukoz-yumurta sarısı sulandırıcıları sayılabilir. Çözdürme sonrası canlılık ve fertilite oranlarının değerlendirilmesi sonucunda sulandırıcılar arasında önemli farklar belirlenememiştir (3, 6, 13, 16, 21). Teke spermasının dondurulmasında bir çok internal (hücreye penetrasyon özelliğine sahip olanlar) özellikli kryoprotektan (gliserol, dimetilsülfoksit, etilen glikol, propilen glikol ve bunların kombinasyonları) denenmiş, fakat en fazla kullanılanı çözüm sonu en iyi koruma ve iyileşmeyi sağlamasından dolayı gliserol olmuştur. Sulandırıcıdaki gliserol oranları ise %4-7 arasında değişim göstermektedir (10,13). Corteel (1981) e göre yağsız süt içeren sulandırıcıya gliserol final yoğunluğu %7 olacak şekilde ve 4 o C de üç basamakta eklenmektedir. Ritar ve Salamon (1982) un yönteminde ise gliserollü tris bazlı sulandırıcı yıkanmamış spermaya 30 o C de tek basamakta eklenir. Gliserol ve yumurta sarısı konsantrasyonları sırasıyla %4 ve %2 olacak şekilde ayarlanmıştır. 4 o C de gliserolün eklenmesinin 30 o C de eklenmesine göre her hangi bir avantaja sahip olmadığı bildirilmiştir (23). 53

4 BİLİMSEL MAKALELER Veteriner Hekimler Derneği Dergisi 3.2. Teke Spermasının Dondurulmasında Başarıyı Etkileyen Faktörler Teke spermasının dondurulmasında bir çok faktör etkili olmaktadır. Bunlar şöyle sıralanabilir: 1- Spermasının dondurulmasında infertil ya da damızlık değeri olmayan erkeklerin kullanılması, 2- Seminal plazmanın ayrılmış olup olmadığı, yıkama yöntemi, yıkamada kullanılan yıkama solüsyonunun içeriği, yıkamanın yoğunluğu (sulandırma oranı ve santrifüj sayısı), 3- Dondurmada kullanılan sulandırıcının içeriği ve yumurta sarısının olup olmaması, 4- Sulandırmanın yöntemi, gliserolün eklenmesi ve konsantrasyonu, 5- Dondurmadan önce, ekilibrasyonun uygulanıp uygulanmaması ve süresi, 6- Mini (0.25ml) veya orta boy (0.50ml) payet veya pelet yöntemi ile dondurma teknikleri, 7- Dondurulmuş spermanın çözdürülmesi Teke Spermasını Dondurma Yöntemleri Sulandırılmış teke sperması 4-5 o C de ekilibrasyona bırakıldıktan sonra, payet veya pelet şeklinde dondurma işlemi gerçekleştirilir. Normal koşullarda, sperma içeren payetler yatay olarak sıvı azotun 4-5 cm üzerinde, sıvı azot buharında 7-8 dakika tutulur ve bu sürenin sonunda sıvı azota daldırılır. Fransa da, payetlerin önce sıvı azotun 16 cm üstünde 2 dakika sonra ise 4 cm üzerinde 3 dakika tutulması önerilmektedir. Donma hızı payetlerin sıvı azot seviyesinden uzaklığı ve payetlerin hacimlerine göre değişebilir (10). Pelet yönteminde ise, dondurma kuru buzda (-79 o C de) gerçekleştirildikten sonra peletler sıvı azota aktarılır. 79 o C de dondurmanın hızı peletlerin hacmine bağlı olarak değişebilir. Spermanın payet veya peletteki hacmi dondurma hızı üzerine önemli etkiye sahiptir. Fakat, dondurma çözdürme sonrası canlılık oranı üzerine etkisi görülmemiştir. Payetlerin önceden soğutulmuş ağ veya delikler açılmış metal yüzey üzerinde dondurulmasının, sadece iki noktadan temas sağlayan yönteme göre daha iyi sonuç verdiği belirtilmektedir. Bu durumun, çok noktadan teması sağlayan rafın ani donmayı engelleyerek veya en aza indirerek sıcaklık dalgalanmasının önüne geçmesinden kaynaklandığı belirtilmektedir (16). Çözdürme sonrası canlılık ve fertilite oranlarına bakıldığında pelet yönteminin payete göre daha iyi sonuçlar vermesine (16, 18) ve payet yönteminin daha fazla zaman almasına rağmen (4), tercih edilen yöntem payet şeklinde dondurmadır. Çünkü bu yöntem sperma miktarının en doğru şekilde belirlenmesini sağlamaktadır Teke Spermanın Çözdürülmesi Çözdürme sonrası en iyi motilite ve fertiliteyi elde etmek amacıyla, çeşitli çözdürme sıcaklıkları ve süreleri önerilmektedir. Payet veya pelet şeklinde dondurulmuş spermanın 37 o C de çözdürülmesi kabul edilebilir fertilite sonuçları vermiştir (3, 21). Deka ve Rao (1987) da, yaptıkları çalışmada, en iyi sonucu 37 o C de almışlardır. Andersen ise (1969) 75 o C de 10 saniyede çözmenin 37 o C de 30 saniyede çözmekten daha iyi sonuç verdiğini belirtmiştir. Tuli ve ark., (1991) Boer keçilerinin kullanıldığı çalışmada, payetlerin 70 o C de 7 saniyede çözülmesinin hem 37 o C de 2 dakikada hem de 40 o C de 20 saniyede çözmekten üstün olduğunu bulmuşlardır. Fakat, saha koşullarında yapılan suni tohumlamada 37 o C de 30 saniyede çözmenin daha uygun olduğuna dikkat edilmelidir. Böylece çözülmüş spermanın aşırı ısınmasının önüne geçilmiş olur. Pelet şeklinde dondurulmuş sperma, çözdürme solüsyonu içeren deney tüplerinde 37 o C de 30 saniyede çözdürülür. 54

5 Veteriner Hekimler Derneği Dergisi BİLİMSEL MAKALELER 4. Sonuç Suni tohumlamadan kabul edilebilir fertilite oranlarının elde edilmesi için sperma saklama sürecindeki her adıma özen gösterilmelidir. Kısa ve uzun süreli saklama amacıyla spermanın alındığı tekenin özenli yetiştiriciliği ilk adımı oluşturmaktadır. İkinci önemli nokta ise, spermatozoonların saklanmasında hangi yöntemin (kısa veya uzun) kullanılacağıdır. Üçüncü olarak göz önünde bulundurulması gereken nokta ise, sınırlı ovulasyon zamanında gerçekleştirilmesi gereken suni tohumlamanın organizasyonudur. Östrusun kontrolü ve doğru tespiti, tatmin edici fertilizasyon oranlarına ulaşılması için gereklidir. Spermanın kısa ve uzun süreli saklanmasında izlenen yolun spermatozoonlar üzerindeki olumsuz etkileri ortadan kaldırmak için daha fazla çalışmaya gerek duyulmaktadır. Ekonomik ve pratik nedenlerden dolayı, kısa süreli saklama için daha etkin bir yöntem geliştirilmesi istenebilir. Çünkü teke spermasının uzun süreli saklanmasına bir alternatif olarak, yaygın seleksiyon programlarında veya ekstansif üretim sistemlerinde kısa süreli saklanmış sperma kullanılmasının açık şekilde avantajlara sahip oldu görülmektedir. Teke spermasının uzun süreli (dondurularak) saklanmasının olumsuz etkilerini en aza indirgemek ve spermatozoonların fertilizasyon kapasitelerini uzatmak amacıyla daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyulduğu açıktır. Diğer evcil hayvanlarda olduğu gibi keçi sun i tohumlamasında amaç en yi erkek damızlıkların geniş bir populasyonda kullanılmasını sağlamaktır. Özellikle dondurulmuş teke spermasıyla başarı elde edildiğinde sürülerin ıslahı kolaylaşacağı gibi verimlerin de istenilen düzeye getirilmesi mümkün olabilecektir. Kaynaklar 1. Andersen, K. (1969). Insemination with frozen semen in Goats, In: European Ass. Animal Prod. Meeting, Helsinki, vol. 2: Barker, C.A. (1957). Some aspects of artificial insemination in swine and goats. In: Proc. 10th Ann. Conv. National Assoc. Artif. Breeder, Toronto, pp Corteel, J.M. (1977). Production, storage and artificial insemination of goat semen. In: Management of Reproduction in sheep and Goats Symposium, Madison, July 24-25, pp Corteel, J.M. (1981). Collection, proceeding and artificial insemination of goat semen. In: Gall, C. (Editör), Goat Production. Academic Press, London, pp Deka, B.C., Rao, A.R. (1987). Effect of extenders and thawing methods on post-thawing preservation of goat semen. Indian Vet. J, 64: Evans, G., Maxwell, W.M.C. (1987). Salamon s Artificial Insemination of Sheep and Goats. Sidney: Butterworths, pp. 8-21, Eppleston, J., Pomares, C.C., Stojanov, T., Maxwell, W.M.C. (1994). In vitro fertility of liquid stored goat spermatozoa. Proc. Aust. Soc. Rep. Biol, 26: Iritani, A, Nishikawa, Y., Rukuhara, R. (1961). Studies on the egg-yolk coagulating factor in goat sperm: I. Localization of coagulating factors and decline of ph following coagulating. In: Proc. Silver Jubilee Lab. Anim. Husbandry, Kyoto University, pp Iritani, A, Nishikawa, Y. (1963). Studies on the egg-coagulating enzyme in goat semen: IV. On the position of yolk constituents attacked by the coagulating enzyme. Japan J. Anim. Reprod, 8.(4): Leboeuf, B., Restall, B., Salomon, S. (2000). Production and storage of goat semen for artificial insemination. Anim. Reprod. Sci, 62: Pellicer, M.T. (1996). Conservation del semen caprino. Internaccion entre la secrecion bulbouretraly el accion de los componentes implicados en el deterioro espermatico. These Doctorat, Universitad de Murcia. 12. Pellicer, M.T.R., Magallon, T., Combarnous, Y. (1997). Deterioration of goat sperm viability in milk extenders is due to a bulbourethral 60-kilodalton glycoprotein with triglyceride lipase activity. Biol. Reprod, 5,

6 BİLİMSEL MAKALELER Veteriner Hekimler Derneği Dergisi 13. Purdy, P.H. (2006). A review on goat sperm cryopreservation. Small Rumin. Res, 63, Ritar, A.J., Salamon, S. (1982). Effects of seminal plasma and its removal and of egg yolk in the diluent on the survival of fresh and frozen-thawed spermatozoa of the Angora goat. Aust. J. Biol. Sci, 35, Ritar, A.J., Salamon, S. (1983). Fertility of fresh and Frozen-thawed semen of the Angora goat. Aust. J. Biol. Sci, 35: Ritar, A.J., Ball, P.D., O may, P.J. (1990). Examination of methods for the deep freezing of goat semen. Reprod. Fertil. Dev, 2, Ritar, A.J., Salamon, S. (1991). Effect of month of collection, method of processing, concentration of egg yolk and duration of frozen storage on viability of Angora goat spermatozoa. Small Rumin Res, 4: Ritar, A.J., Ball, P.D. (1993). The effect of freeze thawing of goat and sheep semen at a high density of spermatozoa on cell viability and fertility after insemination. Anim. Reprod. Sci, 31, Roca, J., Carrizosa, J.A., Campos, I., Lafuente, A., Vazquez, J.M., Martinez E. (1997). Viability and fertility of unwashed Murciano-Granadia goat spermatozoa diluted in tris egg yolk extender and stored at 5 0 C, Small Rumin. Res, 25: Roy, A. (1957). Egg-yolk coagulating enzyme in the semen and cowper s gland of the goat. Nature, 179: Salamon, S., Ritar, A.J. (1982). Deep freezing of Angora goat semen: effects of diluent composition and method and rate of dilution on survival of spermatozoa. Aust. J. Biol. Sci, 35: Smith, A.H., Polge, C. (1950). Survival of spermatozoa at low temperatures. Nature, 166: Tuli, R.K., Scmidt-Baulain, R., Holtz, W. (1991). Influence of thawing temperature on viability and release of glutamic oxaloacetic transaminase in frozen semen from Boer goats. Anim. Reprod. Sci, 25: