EPSTEIN BARR VIRUS (VCA) IFA SLIDE

Transkript

1 1 SAKLAMA GEREKLİLİKLERİ: SVCA: insan serumunda indirek immunofloresan testi (IFA) ile Epstein- Barr virus antikorlarının tanısı için slaytlar. GİRİŞ: EPSTEIN BARR VIRUS (VCA) IFA SLIDE Epstein-Barr (EBV) viral capsid antijenlerine karşı antikorlar erken enfeksiyonda bulunmuştur. IFA basitliğine, prekositesine ve çapraz reaksiyon olmamasına göre en çok kullanılan tekniktir. Enfeksiyöz mononukleoz ateş, cervical adenopathies, splenomegali ve pharyngitis ile EBVnin neden olduğu en genel hastalıktır. Bazı olgular cytomegalovirus, Toxoplasma gondii, adenovirus tarafından üretilebilir. EBV immunbaskılı hastalarda proliferatif sendromun orijinidedir. EBV enfeksiyonu Burkitt s lenfoma ve nasopharyngeal karsinoma ile ilişkilidir. TEST PRSİBİ: IFA metodu slayt yüzeye absorbe edilmiş antijenlerin antikorla reaksiyonuna dayanır.bağlanmayan immunglobulinler yıkama adımı ile uzaklaştırılır. Daha sonraki adımda antijen antikor kompleksi floransan etiketli anti-insan globulin ile reaksiyona girer. Immunforasan mikroskopu kullanılarak test edilir. Visible light KİT ÖZELLİKLERİ: UV light FITC Anti-human globulin Slaytlar VIRCELL IFA kit ile ilişkili kolay kullanım için numaralara sahiptir. KİT İÇERİKLERİ: 1 VIRCELL EPSTEIN BARR VIRUS (VCA) SLAYT: 10 kuyucuk içn 10 slayt, P3HR1 hücreleri (ATCC HTB-62) ile kaplıdır, formaldehid muamele edilmiştir, acetone sabitlenmiş ve sadece 10-20% exprese VCA antijenler. 2-8ºC saklayınız ve miadını kontrol ediniz. Human anti-epstein-barr virus antibody Epstein-Barr virus antigen Gerekli materyaller ama sağlanmayanlar: Uygun mikropipetler. Thermostabil inkübator. Distile su. 24x60 mm yapışkan. Fluoresan mikroskope ve kullanıcının tercihine göre uygun filtreler. Nemli hazne. Uygun özgüllükte VIRCELL IFA kit. 2-8ºC de saklayınız. Miadı geçmiş kitleri kullanmayınız. Bu kit 2-8ºC de ağzı kapalı olarak saklanırsa geçerli kalır. AÇILAN REAKTİFLERİN SAKLANMASI: Paketi bir kez açarak kullanınız. STABİLİTE VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: Reaktifleri aseptik durumlarda, mikrobiyolojik kontaminasyondan uzak bir şekilde saklayınız. VIRCELL, S.L.yanlış kullanımdan olan hataların sorumluluğunu kabul etmez. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir.sadece profesyonel kullanım içindir. 2. Sadece VIRCELL IFA kitleri ile ilgili olanları kullanın. 3. Her test basamağında pipet uçlarını temizleyiniz.sadece temiz, tercihen tek kullanımlık materyal kullanınız. 1. Hasar görmüş paketleri kullanmayınız. 4. Asla ağız ile pipetlemeyiniz. 5. Kuyucuklar inaktive Epstein-Barr virus antijen ile kaplıdır. Yine de kullanılan tüm malzemeler potansiyel risk faktörü gibi davranılmalıdır. Atıklar konusunda da bölgesel kanunlara göre davranılmalıdır. 6. Sadece kit ekindeki protokolü uygulayın. Inkubasyon zamanı ve sıcaklıklar farklı olursa yanlış sonuçlar verebilir. 7. Slayt üzerinde hasta örneklerinin çapraz kontaminasyonu hatalı sonuçlara neden olur. Önlemleri dikkate alın. 8. Mikroscope optikleri, ışık kaynağı kondisyonu ve tipi floresan kalitesini etkiler. 9. Gereğinden daha uzun süre oda ısısını değiştirmeyiniz. 10. Herbir slayt sadece bir kez kullanılmalıdır. Kırmayınız ve kuyucukları tekrar tekrar kullanmayınız. 11. Kit içeriğinde bulunan cam elementler kırıldığında fiziksel hasara neden olabilir. Dikkatli kullanın. 12. örneğer sorbent eklenmesinden sonra görünür bir presipitat var mı kontrol edin. NUMUNE TOPLAMA VE SAKLAMA: Kan mikrobiyolojik kontaminasyon dikkate alınarak eğitimli bir personel tarafından, venipunktür tekniği ile eğitimli bir personel tarafından alınmalıdır. Steril ve aseptik teknik kullanımı numunenin yapısını da koruyacaktır. Serum numuneleri (2-8ºC) buzdolabında ya da 7 gün içinde çalışılmayacaksa (-20ºC) de saklanır.numuneler tekrar tekrar dondurulup çözülmemeli.hiperlipemik, hemolizli ya da kontamine olmuş numune kullanmayınız. Partikül içeren numuneler, santrifüj edilerek berrak hale getirilmelidir. TEST PROSEDÜRÜ: Slaytlar uygun özgüllükte VIRCELL IFA kit reaktifleri kullanır. Test prosedüründeki verilen sayı VIRCELL IFA kit uygun olmalıdır. IgG belirlemesi: 1.-kullanmadan önce tüm reaktifleri oda ısısına getirin. Açmadan önce tüm slaytların oda ısısına çıkarın µl PBS e 10 µl örnek ekleyerek 1/10 ve 1/20 dilusyonda serum örnekleri hazırlayın 2 (1/10 dilusyon). 50 µl PBS ile (1/20 dilusyon) çift dilusyon hazırlayın. Kontrol serum 3 ve 4 seyreltilmez µl 1/10 ve 1/20 dilusyon iki slayt kuyucuğuna uygulayın 1. pozitif 3 ve negatif 4 kontrolleri aynı yapın. 4.-Slaytı nemli haznede 37ºC de 30 dakika bekletin. Manufacturer: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre Santa Fé *GRANADA* SPAIN* Tel * Fax

2 2 5.- PBS ile 2 slaytı yıkayın 1 (kuyucuklarda direk PBS den kaçının) ve PBS de 10 dakika batırın.distile su ile slaytlara derin yıkama yapın. 6.-Slaytların hava ile kurumasını sağlayın Herbir kuyucuğa 20 µl anti-human IgG FITC konjugat solusyonu 5G ekleyin. (Dilusyona gerek yok). 8.-Aşama 4, 5 ve 6 tekrar edin. 9.-Herbir kuyucuğa küçük bir damla mounting medium 6 ekleyin ve dikkatlice yapışkanla kaplayın. 10.-slaytları olabildiği kadar çabuk floresan mikroskopta 400x büyütmede okuyun. Eğer bunu yapamıyorsanız, bakana kadar 24 saatten uzun olmayacak şekilde 2-8ºC de karanlıkta saklayın. 11.-eğer dilusyon test ediyorsanız, 1/160 dilusyona kadar analiz edin. IgM belirlemesi: 1.- kullanmadan önce tüm reaktifleri oda ısısına getirin. Açmadan önce tüm slaytların oda ısısına çıkarın µl PBSe 25 µl örnek ekleyerek 1/2 dilusyon serum örnekleri hazırlayın2. Kontrol serum 3 ve 4 seyreltilmez. 3.-Seyreltilmiş serumları anti-human IgG sorbent ile muamele edin 7, 25 µl sorbente 5 µl serum ekleyip karıştırarak. Kontrol serum 3 ve 4 seyreltilmez ve sorbent eklenmez. uygulanan serum direk kullanılır ya da presipitatlar uzaklaşsın diye santrifüj edilir. 4.- Herbir slayt kuyucuğuna 20 µl sorbent-uygulanmış serum eklenir. 1. pozitif 3 ve negatif 4 kontrolleri aynı yapın. 5.- Slaytı nemli haznede 37ºC de 90 dakika bekletin. 6.- PBS ile 2 slaytı yıkayın 1 (kuyucuklarda direk PBS den kaçının) ve PBS de 10 dakika batırın.distile su ile slaytlara derin yıkama yapın. 7.- Slaytların hava ile kurumasını sağlayın Herbir kuyucuğa 20 µl anti-human IgM FITC konjugat solusyonu 5M ekleyin. (Dilusyona gerek yok). 9.- Slaytı nemli haznede 37ºC de 30 dakika bekletin. 10.-Aşama 6 ve 7 yi tekrar edin Herbir kuyucuğa küçük bir damla mounting medium 6 ekleyin ve dikkatlice yapışkanla kaplayın slaytları olabildiği kadar çabuk floresan mikroskopta 400x büyütmede okuyun. Eğer bunu yapamıyorsanız, bakana kadar 24 saatten uzun olmayacak şekilde 2-8ºC de karanlıkta saklayın. İNTERNAL KALİTE KONTROL: Her üretim lotu pazara sürülmeden önce internal (Q.C.) testi yapılır.bu validasyon prosedüründen daha önemlidir. KULLANICILAR İÇİN VALİDASYON PROTOKOLÜ: VIRCELL IFA kite uygun kullanıcılar için validasyon protokolü verilmiştir: Pozitif, negatif ve cut off kontroller her teste çalışılmalıdır.bu kitin ve testin validasyonunu sağlar. Görülen floresan pattern aşağıdaki gibi olmalıdır: Pozitif kontrol: Yeşil elma fluoresan nukleus ve sitoplazmada. Negatif kontrol: Kırmızı hücresel pattern. Mononukleoz enfeksiyonlu olguların %20 sinde görülür, enfeksiyonun ilk fazında yüksek titrede görülür. heterofilik antikorlardan farklı olarak, anti- VCA IgG antikorları tüm hayat boyunca kalır. LİMİTLER: 1.- Bu kit sadece insan serumunda kullanmak içindir. Slaytlar uygun özgüllükteki VIRCELL IFA kiti ile kullanılır. diğer orjine sahip reaktifler kullanılarak yapılan test sonuçlarından VIRCELL sorumlu değildir. 2.- Kitin kullanıcısına, kitin içeriğini iyice okuyarak, anlayıp çalışması önerilir. Güvenilir sonuç elde etmek için, protokole tamamen uymak gerekir. Özellikle, doğru numune ve doğru reaktif pipetleme ve inkübasyon zamanı adımlarına tamamen uymak gereklidir. 3.- Numunelerin sonuçları klinik değerlendirme ve diğer teşhislerle birlikte yorumlanmalıdır. Kesin teşhis ayırma tekniği ile konulmalıdır. 4.- Bu test enfeksiyonun yerini belirtmeyecektir. Ayırım yapma amacı ile kullanılmaz. 5.-Antikor seviyesinin eksikliğinin tespiti enfeksiyon olasılığını içermemesi söz konusu değildir. 6.-Samples collected very early in the course of an infection may not have detectable levels of IgG. In such cases, it is recommended an IgM assay be performed, or a second serum sample be obtained 14 to 21 days later to be tested in parallel with the original sample to determine seroconversion. 7.- Erken alınan numunlerde IgG seviyesi tespit edilmeyebilir.bu durumlarda IgM testi yapılmalıdır.ikinci serum gün sonra alınmalıdır, serokonversiyonun tespiti için ilk alınan numuneyle paralel çalışılmalıdır. 8.-Tek-örnek antikor belirleme sonuçları güncel enfeksiyon tanısı için kullnılamaz. Çiftli örnekler (akut ve nekahat döneminde) toplanmalı ve serokonversiyona bakmak ya da antikor seviyesindeki artışı belirlemek için çalışılmalıdır. 9.-otoimmun hastalıklı serumlar IFA kullanılarak aşırı hücrelerle nonspesifik reaksiyon verebilir. Bu serumlar bu metod ile değerlendirilemez. PERFORMANS DUYARLILIK VE ÖZGÜLLÜK: 89 serum örneği ticari IFA kitlerine karşı EPSTEIN-BARR VIRUS (VCA) IFA IgG ile test edilmiştir. Sonuçlar aşağıdadır: ÖRNEK NO DUYARLILIK ÖZGÜLLÜK IgG % 90.0% 101 serum örneği ticari IFA kitlerine karşı EPSTEIN-BARR VIRUS (VCA) IFA IgM ile test edilmiştir. Sonuçlar aşağıdadır: ÖRNEK NO DUYARLILIK ÖZGÜLLÜK IgM % 100.0% Sera with non-specific reactivity were excluded from final calculations. ÇALIŞMA-İÇİ KESİNLİK: SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Serum titresi bir pozitif reaksiyonda görülen en yüksek dilusyondur. Nukleus ve sitoplazmada elma yeşili floresan görüldüğünde reaksiyon pozitiftir. Kırmızı hücresel pattern görüldüğünde reaksiyon negatiftir. Bazen, serum hücrelerin %50 sinde pozitif floresan vererek reaksiyona girebilir. Bu pattern değerlendirilemez spesifik olmayan reaksiyon ile ilişkilidir. Bu kılavuzdan farklı sonuçlar pozitif olarak değerlendirilemez. IgG ve IgM antikorları primoenfeksiyon ve reenfeksiyon sırasında farklı davranır. primoenfeksiyonda IgG ve IgM hemen tüm hücrelerde görülür (IgM, IgGden önce görülür). reenfeksiyonda IgMantikorları tüm olgularda görülmez, bu nedenle IgG Belirlemesi tanı için tek yararlı metoddur. IgG yüksek titresi hastanın hayatı boyunca bir çok hastalıkta görülür, IgM ise enfeksiyondan 2 ya da 3 ay sonra ölçülebilir ve bu nedenle güncel enfeksiyonlar için geçerli markırdır. Antikorların 1/10 dilusyonda görülmesi enfeksiyona karşı immunite belirler, fakat akut enfeksiyon tanısı içindir, serokonversiyonu gösterebilmek için akut-faz ve nekahat-fazı serumları çalışılmalıdır. 3 serum (2 pozitif ve 1 negatif) 5 grupta aynı koşullarla aynı kişi tarafından test edilmiştir. Bir dilusyondan fazla titre değişimi görülmemiştir.

3 3 ÇALIŞMALAR-ARASI KESİNLİK: 3 serum (2 pozitif ve 1 negatif) 5 grupta aynı koşullarla aynı kişi tarafından test edilmiştir. Bir dilusyondan fazla titre değişimi görülmemiştir. ÇAPRAZ REAKSİYONLAR VE ETKİLEŞİMLER: Taksonomik grubun mikroorganizma ve virusları (citomegalovirus, herpes simplex type 1 ve 2, varicella-zoster) ve benzer grup (Brucella melitensis) için pozitif olduğu bilinen 11 örnek IgG testi ile test edilmiştir. Taksonomik grubun mikroorganizma ve virusları (citomegalovirus, herpes simplex type 1 ve 2, varicella-zoster) ve benzer grup (Brucella melitensis) için pozitif olduğu bilinen 9 örnek IgM testi ile test edilmiştir. Çapraz bir reaksiyon veya etkileşim görülmedi. DİĞER ETKİLEŞİM ÇALIŞMALARI: IFA testi romatoid faktör için pozitif olduğu bilinen 25 serum ile 2 viral ve 2 bakteriyal antijene karşı IgG ve IgM antikorları belirlemesi için test edilmiştir. IFA testinde diğer herbir antijen için belirlenen 2 serum örneği de IgG ve IgM için test edilmiştir. IgM testi için serum anti-igg sorbent ile muamele edilir. Sonuçlar romatoid faktör tarafndan IgM testinde etkileşimleri önlemek için sorbentin etkili olduğunu göstermiştir. Önerilen sorbent test edişmiş ve IgG antikor fazlalığına göre yanlış negatif sonuçları önlediği bulunmuştur. ETİKETTE KULANILAN SEMBOLLER: TEST PROSEDÜRÜNÜN ÖZETİ: Slayt kuyucuklarına serum dilusyon ve kontrolleri ekleyin 1 Nemli hazne 30 dakika 37ºC de IgG testi için Nemli hazne 90 dakika 37ºC de IgM testi için PBSile iki kez yıkayın 2 ve bir kez distile su ile yıkayın Nemli Hazne Kuru hava Fluoresan konjugat ekleyin 5G ya da 5M 30 dakika 37ªC de PBSile iki kez yıkayın 2 ve bir kez distile su ile yıkayın Kuru hava In vitro diyagnostik medikal alet Miadı kadar kullanın (miadı) Küçük bir damla mounting medium 6 2ºC 8ºC 2-8ºC de saklayınız Yapışkan ile kaplayın x Yeteri kadar r <X> test içerir. Slaytı fluoresan mikroskopta okuyun 400x Lot Katalog No Inserte bakınız <X>kuyucuklar

4 4 LITERATÜR: 1. Bruu, A. L., R. Hjetland, E. Holter, L. Mortensen, O. Natas, W. Petterson, A. G. Skar, T. Skarpaas, T. Tjade, and B. Asjo Evaluation of 12 commercial tests for detection of Epstein-Barr virus- specific and heterophile antibodies. Clin Diagn Lab Immunol 7: de Ory, F., J. Antolaya, M. V. Fernández, J. M. Echevarría, and A. de la Loma Comparison of diagnosis criteria for Epstein-Barr virus infection in children. Serodiagn Immunother Infect Dis 6: Henle, W. and G. Henle Epstein-Barr virus-specific serology in immunologically compromised individuals. Cancer Res 41: Niederman, J. C Chronicity of Epstein-Barr virus infection. Ann Intern Med 102: Okano, M., G. M. Thiele, J. R. Davis, H. L. Grierson, and D. T. Purtilo Epstein-Barr virus and human diseases: recent advances in diagnosis. Clin Microbiol Rev 1: Pearson, G. R., L. H. Weiland, H. B. Neel 3rd, W. Taylor, J. Earle, S. E. Mulroney, H. Goepfert, A. Lanier, M. L. Talvot, B. Pilch, M. Goodman, A. Huang, P. H. Levine, V. Hyams, E. Moran, G. Henle, and W. Henle Application of Epstein-Barr virus (EBV) serology to the diagnosis of North American nasopharyngeal carcinoma. Cancer 51: Sumaya, C. V., and H. B. Jenson Epstein-Barr virus. p In N. R. Rose, E. Conway de Macario, J. L. Fahey, H. Friedman, G. M. Penn (ed). Manual of Clinical Laboratory Immunology. American Society for Microbiology. 8. Swanston, W., J. Mahony, B. McLaughlin, and M. Chernesky Assessment of serologic markers for Epstein-Barr virus. Diagn Microbiol Infect Dis 5: For any question please contact customer service: REVISED: October-05

5 5 Manufacturer: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre Santa Fé *GRANADA* SPAIN* Tel * Fax