Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Çevre Mühendisliği Bölümü Çevre Mikrobiyolojisi Laboratuarı

Transkript

1 T.C. NEVŞEHİR HACI BEKTAŞ VELİ ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK-MİMARLIK FAKÜLTESİ ÇEVRE MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ LABORATUARI DENEYİ (Raporu hazırlayanın/hazırlayanların numarası, adı ve soyadı, grup no)... Dersin Sorumlusu NEVŞEHİR 2014

2 DENEY SONUÇ RAPORLARININ YAZIM TEKNİĞİ Deney raporunu yazarken dikkat etmeniz gereken önemli noktalar aşağıda açıklanmıştır. Öncelikle deney sonuç raporunda aşağıdaki başlıklar bulunmalıdır 1. Kapak Sayfası 2. Deneyin Amacı 3. Teori (literatür çalışması) 4. Deney Yöntemi 5. Veri Analizi 6. Sonuç ve Tartışma (yorum) 7. Kaynaklar 1. KAPAK SAYFASI: Hazırlanan raporu tanıtan bir kapak sayfası hazırlanmalıdır. Kapak sayfasında deneyin adı, sorumlu öğretim görevlilerinin adları ve raporu hazırlayan öğrencilerin bilgileri yer almalıdır. Bir sonraki sayfada örnek bir kapak sayfası görülmektedir. 2. DENEYİN AMACI: Bu başlık altında yapılan deneyin hangi amaç ve/veya amaçlar için yapıldığı öğrencinin kendi cümleleri ile belirtilmelidir. 3. TEORİ (LİTERATÜR ÇALIŞMASI): Bu başlık altında yapılan deney hakkında teorik bilgi verilecektir. Teorik bilgi kaynak göstermek şartı ile her türlü Türkçe ve yabancı kaynak kullanılarak verilebilir. Kaynağını belirtmek suretiyle internetten bulunan bilgilerde teorik bilgiler arasında verilebilir. İnternetten alınan bilgilerin hiçbir şekilde düzenleme yapılmadan kopyala/yapıştır yapılmamasına dikkat edilmelidir. Metin İçinde Kaynak Gösterimi: Yazılan rapor içinde kaynakların gösteriminde soyadı ve tarih sistemi kullanılır. i. Bu sistemde metin içerisinde atıf yapılan kaynaklar Yazar(lar)ın Soyad(lar)ı ve Yıl sistemine göre yapılır. Kaynak eserin yazarının soyadı (ilk harfi büyük, diğerleri küçük harf olarak) ve eserin yayın tarihi yazılmalı, yazar soyadından sonra virgül konulmalıdır. Aynı satırda birkaç yazar adı yer alacaksa tarihlerden sonra noktalı virgül konulmalı, bunlar en eski yayından en yeni yayına doğru sıralanmalıdır.

3 4. DENEY YÖNTEMİ: Bir deney için birden fazla analiz yöntemi bulunabilmektedir. Laboratuvarda yapılan deney hangi analiz yöntemi ile gerçekleştirilmişse bu başlık altında bu bilgiler verilerek deneyin nasıl yapıldığı maddeler halinde anlatılmalıdır. 5. VERİ ANALİZİ: Bu başlık altında deney yapılırken elde edilen veriler yazılmalı ve analiz sonucu ile ilgili hesaplamalar yapılmalıdır. 6. SONUÇ VE TARTIŞMA (YORUM): Bu başlık altında deney sonucunda elde edilen verilerin ne ifade ettiğini, deneyin sonucunda elde ettiğiniz verilerin sizin açınızdan öneminin ne olduğunu kendi cümleleriniz ile açıklamanız gerekmektedir. 7. KAYNAKLAR: Bu bölümün hazırlanmasında, değinilen bir belgeye okur tarafından kolaylıkla ulaşılabilmesi için, gereken bilgilerin eksiksiz verilmesinin temel ilke olduğu unutulmamalıdır. Metin içinde değinilmeyen bir belgeye kaynaklar listesinde yer verilmemelidir.

4 DEĞERLENDİRME ESASLARI: 1. Öğrenciler Laboratuar dersinde deneyden önce Kuiz sınavına gireceklerdir. Genel notlandırmada Kuizlerin ağırlığı %10 oranında olacaktır. 2. Her bir öğrenci yukarıdaki formata göre hazırlayacakları raporu ilgili deney bitiminden en geç 1 hafta sonra deneyi yaptıran ilgili öğretim elemanına teslim edeceklerdir. Genel notlandırmada Raporların ağırlığı %10 oranında olacaktır.

5 EĞİTİM ÖĞRETİM YILI ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ DERSİ LABORATUAR DENEY TARİHLERİ MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN MALZEME VE CİHAZLAR CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON MİKROSKOP KULLANIMI BESİYERİ HAZIRLAMA ÇEVREMİZDEKi MiKROORGANiZMALAR VE KATI VASATTA (STANDART PLATE AGAR) TESPİTLERİ MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: BASİT BOYAMA MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: GRAM BOYAMA MİKROSKOPTA MANTAR VE BAKTERİ MORFOLOJİLERİNİN İNCELENMESİ MİKROSKOPTA ALG VE PROTOZOA MORFOLOJİLERİNİN İNCELENMESİ MİKROSKOPTA ALG VE PROTOZOA MORFOLOJİLERİNİN İNCELENMESİ

6 DENEYSEL ÇALIŞMALAR ESNASINDA LABORATUARDA DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN HUSUSLAR Laboratuarda yapılan çalışmalar sonucunda elde edilen sonuçların güvenilirliği, kullanılan deney metotlarının hassaslığı yanında, çalışanların dikkat ve titizliğine de bağlıdır. Bu nedenle çalışmalar esnasında aşağıdaki kurallara uyulması çalışanların kendisi ve çevresindeki arkadaşları için ve yapılan deneyin hassasiyeti bakımından da son derece önemlidir. Bu nedenle laboratuar deneyleri esnasında aşağıdaki kurallara uyulmasına azami derecede dikkat edilmelidir. 1. KİŞİSEL TEDBİRLER a) Her türlü laboratuar çalışması esnasında mutlaka beyaz ve temiz bir önlük giyilmelidir. Böylece çalışma esnasında olabilecek herhangi bir kimyasal çözeltinin sıçrama ve bulaşmalardan giyilen elbiselerin zarar görmesi engellenmiş olacaktır. Laboratuar önlüğü olmayanlar laboratuar çalışmalarına kesinlikle alınmayacaklardır. b) Laboratuar çalışmaları sırasında ve laboratuara giriş çıkış esnasında koridorlarda son derece sessiz olunmalıdır, etrafı rahatsız edecek şekilde gürültü ve aşırı hareketlerden kesinlikle kaçınılmalıdır. c) Palto, pardösü, ceket, şapka gibi giyim eşyaları ile çanta ve kitaplar laboratuar çalışması yapılan masaların üzerine bırakılmamalı, bunlar için ayrılan yerlere konulmalıdır. d) Laboratuarda yiyecek yenmeyeceği gibi sigara içmek, sakız çiğnemek kesinlikle yasaktır. Gereksiz hareket ve davranışlardan kaçınılmalıdır. e) Laboratuara gelmeden önce o gün yapılacak deney föyü iyice okunmalı, föyden anlaşılmayan noktalar farklı kaynaklardan da araştırılarak deneye hazırlıklı gelinmelidir. Öğrenci, ilgili deneye hazırlıklı gelmelidir. 2. ÇALIŞMA ESNASINDA a) Çalışma esnasında düzen ve temizliğe azami derecede dikkat edilmelidir. Deney esnasında kullanılan malzemelerin üzerine gerekiyorsa etiket yapıştırılarak ne oldukları, hangi gruba ait oldukları ve deney günü yazılmalıdır. b) Deneyde kullanılacak cam v.s. malzemeler deneyden önce sorumlular tarafından masalarda hazır bulundurulacaktır. İlave olarak gerekecek alet ve malzemeler sorumlulardan istenilmeli, masa ve dolaplar karıştırılmamalıdır. Yerlerinden alınan malzeme ve reaktif şişeleri kullanıldıktan sonra sorumlulara teslim edilmelidir c) Seyreltme yaparken özellikle asitler su üzerine ilave edilmelidir. Kesinlikle asit üzerine su ilave edilmemelidir. Aksi takdirde ani sıçrama ve patlamalara neden olunabilir. d) Herhangi bir kimyasal madde koklanacaksa elle yelpazelenerek koklanmalıdır. Direkt burna yaklaştırılarak koklanmamalıdır.

7 e) Yüze veya gözlere herhangi bir kimyasal madde sıçrayacak olursa hemen bol suyla yıkanmalıdır. Hatta mümkünse bütün yüz musluğun altına sokularak uzun süre yıkanmalı ve bu arada hemen deney sorumlularına haber verilmelidir. f) Deneyde kullanılan cam eşyalar masaların uç ve kenar kısımlarına konulmamalıdır. g) Kuvvetli asit ve bazlar pipetle çekilirken ağızla emilmez. Aksi halde ağza kaçan bu gibi maddeler büyük zararlar verebilirler. Buna benzer bir durumda ağız bol su ile çalkalanarak uzun süre yıkanmalı ve laboratuar sorumlularına haber verilmelidir. Bu gibi maddeler pipetle çekilirken laboratuar görevlilerinden yardım istenilmelidir. h) Deneysel çalışma sırasında laboratuar içinde gezinmek, aletleri kurcalamak yasaktır. Deney sorumlularından izin alınmaksızın deney yapılan kısmın dışına çıkılmamalıdır. 3. CİHAZLARLA ÇALIŞIRKEN a) Çalışma şekli bilinmeyen hiçbir elektrikli cihaz kullanılmamalıdır. b) Çalışmakta olan bir cihazın kontrol ve ayar düğmeleri ile kesinlikle oynanmamalıdır. c) Gaz tüplerine çok dikkat edilmeli ve deney sorumlularından habersiz dokunulmamalıdır. 4. ÇALIŞMA BİTTİĞİNDE a) Deneysel çalışma bittiğinde deneyde kullanılan bütün malzemeler önce deterjanla yıkanmalı, sonra birkaç kez su ile çalkalanmalıdır. Daha sonra distile (saf) su ile durulanmalı ve kurumaları için eski yerlerine konulmalıdır. b) Çalışma yapılan masalar, ait olduğu grup tarafından temiz bir bezle silinerek bir sonraki çalıģmaya hazır halde bırakılmalıdır. Çalışma masalarının ıslak bırakılmamasına dikkat edilmelidir. c) Deney sonunda eller sabunla iyice yıkanmalıdır. d) Deney bittikten sonra laboratuarda kesinlikle önlük bırakılmayacaktır. e) Yapılan deney, föydeki bilgilere ilaveten laboratuarda anlatılanlarla birlikte deney rapor yazım planına uygun olarak deney sonuç raporu yazılacak ve bir hafta sonraki laboratuar saatinden önce ilgili deney sorumlularına teslim edilecektir. f) Söz konusu deney raporları kontrol edilip değerlendirilecek ve eğer varsa eksiklikler belirtilecektir. Öğrencinin, deney sonuç raporunu hazırlarken, mümkün olduğunca farklı kaynaklara baģvurması tavsiye edilmektedir. Sonraki haftalarda yazdığınız raporlarda aynı hataları yapmamanız için gerekli uyarılar yapılacaktır. Laboratuar Çalışmalarında Öğrencinin Temin Etmesi Gereken Malzemeler; 1. Laboratuar önlüğü ve ilgili deney föyü 2. Küçük not defteri (Ajanda kullanılması önerilir)

8 DENEY 1- MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN MALZEME VE CİHAZLAR 1. İnkübatör (Bakteriyolojik Etüv) Mikroorganizmalar ortamlarına ekildikten sonra çoğalmalarını temini için, muayyen bir ısı derecesinde tutulmaları gerekir. Bu gaye için kullanılan aletlere inkübatör veya etüv denir. İnkübatör içinde sabit sıcaklık, bütün zamanlarda ve her yerde aynı olmalı veya en az ±0,5 ºC lik bir farktan büyük olmamalıdır. Sahip olduğu bir regülatör sayesinde devamlı aynı dereceyi muhafaza eder. Isı kontrolü için sabit bir termometreleri vardır. Etüvde kullanma alanı maksimuma çıkması halinde bile sıcaklık değişimi yukarıdaki değer arasında kalmalıdır. 2. Otoklav Otoklav, doymuş basınçlı su buharı ile100 ºC nin üstünde çalışan bir sterilizasyon aletidir. Genellikle yüksek ısıya dayanıklı maddelerin sterilizasyonunda kullanılır. Yani, çözeltiler, besi yerleri, boş şişe ve pipet gibi cam malzeme ile bez eşyaların sterilizasyonu otoklavla yapılır. Otoklav içerisindeki su, kapalı bir yerde basınç altında kaynadığı zaman, meydana gelen buharın oluşturduğu sıcaklık 100 ºC nin üstüne çıkar. Otoklavlar silindir veya dikdörtgen şeklinde paslanmaz çelikten yapılmıştır. Silindir veya dikdörtgenin bir tarafında kapağı vardır. Kapak vidalarla gövdeye bağlanır. İçerisinde ızgara şeklinde raflar bulunur ve sterilize edilecek eşyalar bunun üstüne yerleştirilir. Kazanda, ızgaraların altında su konacak bir haznesi vardır. Otoklavın kapağında veya üst kısmında buharın çıkmasına yarayan bir musluk, içindeki sıcaklığı kontrol etmek için bir termometre, basıncı kontrol etmek için bir manometre bulunmaktadır. Ayrıca aleti patlamadan koruyabilen bir emniyet supabı mevcuttur. Otoklav içindeki hava çok önemlidir. Hava bulunması istenmez. Çünkü otoklavda hava bulunmasının muhtelif mahzurları vardır. Bu mahzurlar; 1. Hava ile karışık su buharının sıcaklığı düşüktür. 2. Hava, buharın küçük alanlara girmesine engel olur. 3. Hava buhardan daha ağır olduğundan, otoklavın alt kısmında toplanarak daha soğuk bir tabakanın oluşmasına sebep olur. Bu kısımdaki eşya istenen sıcaklığa kadar ısınmaz. Örneğin, üst kısımda sıcaklık 115 ºC nin iken, alt kısımda 80 ºC olur. 3. Pasteur Fırını Altındaki ısıtıcılarla içinde yüksek ısıda kuru sıcak hava meydana getirilir. Yeterli hacimde ve sterilizasyon sıcaklığının her tarafta eşit ve üniform verecek şekilde yapılmış olmalıdır. 170 ± 10 ºC Kuru sıcak hava ile çalışır. Uygun bir yerde termometresi olmalıdır. Pipet, tüp, petri kutusu, porselen süzgeçler, milipor süzme takımı gibi her türlü cam ve madeni malzemenin sterilizasyonu için kullanılır. Sterilize edilecek malzeme temizlenmiş ve kurutulmuş olarak sterilizatöre yerleştirilir. Malzemeler yaş olarak konulmaz ve alet soğumadan, kapağı açılmaz. Her iki durumda da aletin içindeki

9 cam malzemenin çatlama tehlikesi mevcuttur. 4. Teraziler Laboratuarlarda gerekli tartım işlerinde kullanılır. Ayrıca santrifüj tüplerinin karşılıklı dengelenmesinde kullanılan teraziler de vardır. Laboratuarda kullanılan terazilerin kaba, hassas tipleri vardır. Hassas Terazi: 0,001-0,0001 g hassasiyete sahip olan örneklerin hassas tartımı için kullanılan elektronik tartılardır. 5. Mikroskop Bakteriler çok küçük olduklarından çıplak gözle görülmezler. Görülebilmeleri için, çok fazla büyütülmeleri lazımdır. Bu büyütmeyi bize temin eden mikroskop, bakteriyoloji çalışmalarında en çok kullanılan bir aletidir. Genel anlamda mikroskop, küçük cisimleri büyüterek görünmelerini temin eden, merceklerden yapılmış bir alet olarak tarif edilebilir. Sözcük olarak latince; MİCROS (=küçük) ve SKOPEIN (=Müşahade etme) kelimelerinin birleştirilmesinden meydana gelmiştir yılında tek mercekli basit bir mikroskobu Anton van Leeuwenhoek bulmuş, günümüze kadar geliştirilerek ulaşa gelmiştir. Mikroskoplar, büyütmeleri kıstas olarak ele alındığında; a- Işık ( optik ) Mikroskobu b- Elektron Mikroskobu olarak iki kategoride toplanırlar. 6. Dereceli Pipet ve Pipet Kapları Pipetler, üzerinde hacim taksimatı bulunan özel olarak yapılmış cam borulardan ibarettir. 0,1 ml'den 50 ml'ye kadar değişen çeşitli boylarda pipetler mevcuttur. Laboratuarda kültür vasatlarının tüplere taksim olunmasında, çeşitli deneylerin yapılmasında farklı gayeler için kullanılır. Alüminyum veya paslanmaz çelikten yapılmış, takriben 40 cm uzunluğunda 5 ila 7,5 cm çapında silindir veya dikdörtgen kutulardır. Ambalaj kağıdı veya toksik olmayan kağıtlar da pipetlerin muhafazası için kullanılabilir. Pipet kapları olarak bakır ve bakirli bileşiklerden oluşan kaplar, sülfatı kağıtlar kullanılmaz. 7. Petri Kutuları İç içe geçen yuvarlak cam kapaktan ibarettir. Çeşitli büyüklükte olanları vardır. Yükseklikleri fazla değildir, özellikle katı kültür ortamları petri kutularına konarak daha geniş bir yüzey elde edilir. Böylece mikroorganizmaların izole edilmelerinde veya koloni şekillerinin taksim edilmesinde kullanılır. Ayrıca membran filtre tekniği için gevşek kapaklı 60x15 mm ebadında petri kutuları veya sıkı kapaklı 50x12 mm ebadında plastik petri kutuları kullanılır. Sterilize işlemleri ambalaj kağıdı, paslanmaz çelik veya alüminyum kaplar da gerçekleştirilir ve saklanır.

10 8. Deney Tüpleri Mikrobiyoloji laboratuarlarında gerek mikrop kültürlerinin hazırlanmalarında vegerekse çeşitli testlerin yapılmalarında değişik büyüklüklerde tüpler kullanılır. Bunlar ısıya dayanıklı camdan yapılmıştır. Laboratuarda tüpler daima temizlenmiş, ağızları pamukla kapatılmış ve steril edilmiş olarak muhafaza olunur ve ihtiyaç duyuldukça steril olarak kullanılır. Durheim Tüpü: Çok küçük özel tüplerdir. Karbonhidratlı ortamlarda gaz çıkıp çıkmadığını kontrol etmek için kullanılır. 9. İğne, Öze Mikroorganizmaları kültür ortamlarına ekme veya onların lam üzerindeki preperasyonlarını hazırlamak için, mikrop naklinde kullanılan, ince platin veya nikel alaşımlı telden yapılmış küçük aletlerdir. Uç kısmında üç milimetre çapında daire olana öze, düz olana da iğne ismi verilir. Öze ve iğne kullanmadan evvel ve sonra alevde kızıl dereceye kadar tutulmak suretiyle sterilize edilmelidir. 10. Cam Malzemeler Numune Şişeleri: Numune alma şişesi olarak 100 ml, 250 mi veya 500 ml'lik renkli cam kapaklı, borosilikat veya ısıya dayanıklı camdan yapılmış olanlar kullanılır. Kuru sıcak hava ile sterilize edilir Balonlar: Vücudu küre şeklindeki altı düz olan, dar silindir şeklinde boynu olan cam kaplardır. 50 ml den 10 lt. kadar hacmi olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin saklanmasında kullanılır. Erlenmayerler: Vücudu koni şeklinde ve tabanı düz olan kısa silindir şeklinde bir boynu olan cam kaptır. Balonların kullanıldığı yerlerde kullanılır. Balon joje (Volumetrik balon, dereceli balon): Çözelti hazırlanmasında kullanılır. Beherler: Çözelti ve sıvıların hazırlanmasında ve titrasyon için kullanılır. Mezür (Dereceli silindir): Silindir şeklinde dereceli cam malzemedir. Sıvıların ölçülmesinde kullanılır. 11. Lam-Lamel Mikroskopta objeyi incelerken kullanılan cam malzemelerdir.

11 DENEY 2- CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON 1 Bir mikroorganizmanın teşhisi ancak saf kültür halinde üretilmesi ile mümkündür. Bu da, besi yeri cam eşya ve diğer aletlerle aseptik şartlarda çalışarak diğer mikroorganizmaların karışmasını önlemekle olur. Steril bir ortam veya malzeme hiçbir canlı varlık ihtiva etmez. Bu amaçla sterilizasyon işlemi; mikrobiyoloji laboratuar tekniğinin temel taşlarından birisidir. Uygun bir sterilizasyon yapmadan mikrobiyolojik çalışmalar yapılamaz. Mikroorganizma kontrolünü gerektiren temel sebepleri özetle, 1. Hastalık yapıcı ( patojen) mikroorganizmalarının bulaşmasını önlemek. 2.İstenmeyen mikroorganizmaların büyümesini ve çevreye yayılıp bulaşma ve zarar vermesini önlemek. 3. Mikroorganizmaların saf kültürlerini elde etmek 4. Mikroorganizmalarca materyallerin çürüme ve bozunmasını engellemek. sıralayabiliriz. Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Canlı organizmaların tümünün kendine has bir yaşama şekli mevcuttur. Tabiattaki en küçük canlı grubunu oluşturan mikroorganizmalar, hayatlarını idame ettirebilmeleri için diğer bazı canlıların yok olmalarına sebep olurlar. Bundan dolayı mikroorganizmaların kontrol altına alınması gerekir. Sterilizasyon, mikroorganizmaların vejetatif ve spor şekillerinin öldürülmesi olayıdır. Diğer bir ifadeyle, mikrobiyal yaşamın tüm formlarının yok edilmesidir. "Hemen hemen steril" gibi bir ifade söylemez. Zira tek bir canlı organizma bile içeren bir obje veya çevre steril değildir. Dış ortamlardan istenmeyen mikroorganizmaların bulaşmasının önlenmesinde ve laboratuar çalışmaları esnasında enfekte olan araç ve gereçlerin yeniden kullanılır hale getirilmesinde sterilizasyon işlemleri büyük önem taşır. Dezenfeksiyon ise, bir ortamdaki patojen mikroorganizmaları öldürmek veya zararsız hale getirmek için yapılan işleme denir. Dezenfeksiyon esnasında diğer zararsız mikroorganizmalar da ölebilir. Fakat bu işlemin gayesi, hastalık yapıcı mikroorganizmaların zararsız hale getirilmesidir. Dezenfeksiyon için kullanılan maddelere "dezenfekten madde " ismi verilir. Dezenfektan maddelerin fazla sulandırarak, insan ve hayvan vücuduna uygulanmasına antisepsi, bu işlemde kullanılan maddelere antiseptik madde adı verilir. Yani mikroorganizmaları öldürebilen veya üremelerini durdurabilen maddelere "antiseptik" denir. Bakteriyosid, mikrobiyosid, bakteriyosidal, mikrobiyosidal, antibakterial, antimikrobial kelimelerinin hepsi aşağı yukarı aynı manayı taşıyıp, mikrop öldürücü anlamına gelmektedir. Bakteriostatik, mikrobiostatik kelimeleri ise, mikroorganizmaların üremelerini durdurucu tesir anlamında kullanılmaktadır. Bundan başka fungusid, virusid, sporosid terimleri, sırası ile funguslar, virüsler, sporlar üzerine etkiye sahip manalarına gelmektedirler. Mikroorganizmaların çeşitli etkenlere karşı dayanırlıklarına rezistans ve hassasiyetlerine de dispozisyon denir.

12 Sterilizasyon Çeşitleri Mikroorganizmaların kontrol altına alınmasının çeşitli şekilleri mevcuttur. Bu metotlar; sterilize edilecek malzemenin farklılıklarından, kullanılan fiziksel etkenlerden ve kimyasal maddelerden kaynaklanmaktadır. Ayrıca kontrol altına alınacak mikroorganizma türlerinin sayısı, cinsi, ve bulunduğu ortamlar bu çeşitliliği artırmaktadır. Sterilize edilen eşyanın, mikroplar ile tekrar kirlenmemesi için, dış ortamla ilgisinin kesilmesi gerekir. Steril eşya açık kalırsa, havadan gelen tozların üzerindeki bakterilerle tekrar kontamine olur. Tüp, balon gibi cam eşyaların ağzı sterilize işleminden önce pamuklanır. Bu işte kullanılan pamuk uzun elyaflı ve tozlu olmamalıdır. Bunun için yağı alınmış pamuk kullanılır. Pipetlerin, ağız kısmı pamuklanır ve teker teker yada birkaçı bir arada kağıtlara sarılarak sterilize edilebilir. Genellikle pipetler, cam yada madenden yapılmış silindir şeklindeki kutulara konur ve kutuların ağzı pamuk veya madeni bir kapakla kapatılarak sterilize edilir. Sterilizasyon işlemi, genel olarak, fiziksel ve kimyasal olmak üzere iki yolla yapılır. 1. Fiziksel Metotlarla Sterilizasyon Fiziksel metotla yapılan sterilizasyon işlemi genelde, üç grup altında toplamak mümkündür. Bunlar; 1. Isı ile sterilizasyon 2. İyonize eden ışınlarla yapılan sterilizasyon 3. Mekanik olarak yapılan sterilizasyon'dur Isı İle Sterilizasyon Yapılması kolay ve ucuz olduğundan ve iyi sonuç verdiğinden sterilizasyon da en çok ısı kullanılır. Yalnız, sterilize edilecek malzemenin ısıya dayanıklı olması lazımdır. Bu husus daima göz önünde bulundurulmalıdır Kuru Sıcak Sterilizasyon İşlemleri a. Kızıl Dereceye Isıtma Alevde tutulduğunda bozulmayan, iğne öze ve benzeri madeni aletleri, alevde kızıl dereceye gelinceye kadar ısıtılması işlemidir. Bu tür aletler soğuduktan sonra kullanılır. b. Kuru Sıcak Hava Fırını ( Pasteur Fırını ) Kuru sıcak hava ile sterilizasyonda özel yapılmış fırınlar kullanılır. Cam, balon, petri kutusu, pipet ve cam şişeler gibi cam eşyanın sterilizasyonu için en uygun metottur. Bu yolla sterilizasyon, 180 ºC de 1 saat veya 160 ºC de 2-2,5 saat fırını çalıştırmak suretiyle yapılır Nemli Isı İle Sterilizasyon İşlemleri a. Kaynatma 100 ºC de 5-10 dakika kaynatmakla bakterilerin vegetatif şekilleri ve bazı bakterilerin spor

13 şekilleri ölürler. Fakat kaynatma işlemi, her zaman iyi bir sterilizasyon temin etmez. Genellikle cam eşya, pens makas ve benzeri madeni eşya, cam ve madeni kısımları olan şırıngalar kaynatılarak sterilize edilmesinde uygun metottur. b. Buharla Sterilizasyon İyi bir sterilizasyon için su baharı sıcak havadan daha elverişlidir. Zira buharın öldürücü etkisi daha fazladır ve eşyayı daha çabuk ısıtır. Ayrıca su buharının pamuk, yün, kumaş, kağıt ve diğer kirli maddelere nüfusu daha kolaydır. Buharla sterilizasyon işlemi, bilhassa besi yerleri ve çözeltiler için çok uygundur. Ortam yeteri kadar buharlı olduğundan ısınma esnasında sterilize edilecek sıvılardan buharlaşma ile su kaybı da olamaz. Buharla sterilizasyon için en çok kullanılan alet otoklav'dır. Otoklavla sterilizasyon işlemi için 120 ºC 'de dakika yeterlidir. c. Tindalizasyon Yüksek sıcaklık derecelerinde bozulan maddeler için kullanılan bir metottur. Bu metotla, birkaç gün arka arkaya ºC sıcaklıkla ısıtmakla sterilizasyon işlemi yapılır. Isıtma süresi günde bir saat olmak üzere en az üç gündür. Bazı sporlu bakteriler için 8 gündür. Çok az kirli çözeltiler için iyi sonuç verir İyonize Eden Işınlarla Sterilizasyon Suyun ve mikrobiyoloji de kullanılan bazı maddelerin sterilizasyonu için, iyonize eden ışınların etkisinden faydalanılır. Genellikle iyonize eden ışınların sterilizasyon işlemi mikropların haricinde ortama da etkilidir. İyonize ışınlarla sterilizasyon sentetik, polietilen gibi maddelerden yapılmış alet ve malzemelerin sterilizasyonunda yaygın olarak kullanılır. Her canlı hücrenin dış ortama karşı gösterdikleri hassasiyet farklıdır. Radyasyonla sterilizasyon işleminde her hücre için farklı dozajlara ihtiyaç vardır. Farklı dozaj uygulanması bu metodun dezavantajını oluşturur. Dolayısıyla kullanılışı sınırlıdır. Ultraviyole ışının dalga boyu x ışınlarınkinden daha uzun olup, nm arasındadır nm dalga boyundaki ültraviyole ışınları orta derecede öldürücü etkiye sahiptir. Güneş ışığı da bu dalga boyundaki ültraviyole ışınlarına sahiptir. Ancak atmosferde tutuldukları için etkili olamazlar. Şayet 290 nm nin altındaki ültraviyole ışınları atmosferde tutulmamış olsaydı yeryüzünde hayat olmazdı. İyonize eden ışınlar elektromanyetik ve partiküler ışınlar olarak ikiye ayrılır. A) Elektromanyetik Işınlar Ultraviyole Işınları X Işınları Gama Işınları B) Partiküler Işınlar Beta (katod) Işınları

14 1.3. Mekanik Olarak Yapılan Sterilizasyon Mekanik yolla yapılan sterilizasyon, sterilize edilecek sıvıların değişik özelliklerdeki filtrelerden süzülmesi işlemidir. Özellikle ısıtılınca bozulan maddelerin ve serumların sterilizasyonu filtrasyon ile yapılmaktadır. Bu filtreler, filtrenin cinsine göre sınıflandırılırlar. Bunlar; 1. Diyatome toprağı filtreler 2. Porselen filtreler 3. Asbest süzgeçli filtreler 4. Cam tozu filtreler 5. Kollodyum zarlı filtrelerdir. Çevre Mikrobiyolojisi laboratuarında ise, yaygın olarak membran filtreler kullanılır.

15 DENEY 3- CAM MALZEMELERİN TEMİZLENMESİ VE STERİLİZASYON 2 1. Kimyasal Metotlarla Yapılan Sterilizasyon Muhtelif kimyasal maddeler kullanılarak gerçekleştirilir. Daha çok patojen mikroorganizmaların kontrol altına alınması için yapılan işlemdir. Dezenfektan ve antiseptik olarak kullanılan bazı kimyasal maddeler, kullanım alanları ve özellikleri Tablo 1 de verilmiştir. Tablo 1. Dezenfektan ve Antiseptik Olarak Kullamlan Bazı Kimyasal Maddeler, Kullanım Alanları ve özellikleri Etil Alkol Fenol Lizol Kullanılacak Materyaller Pasteur Fırını Otoklav İspirto Ocağı Kalaycı Pamuğu

16 Metot Alüminyum Folyo Pipet Kutusu Balon, mezür, pipet, deney tüpleri İğne, öze, petri kabı, spor Etil Alkol, Saf su, Sabun Tüm tezgah ve yüzeyler sabunlu su ile yıkandıktan sonra etil alkol ile silinir. Tüp, balon gibi cam eşyaların ağzı sterilize işleminden önce kalaycı pamuğu ile kapatılır ve alüminyum folyo ile sarılır. Pipetler, paslanmaz çelikten silindir şeklindeki pipet kutulara konur ve kutuların ağzı pamuk veya madeni bir kapakla kapatılarak sterilize işlemine hazırlanır. İğne ve öze bek alevinde kızdırılarak strelize edilir. Otoklavın Kullanılması: Kazanın içine yeterli miktarda su konur. Sterilize edilecek eşyalar, otoklav içerisine uygun bir şekilde yerleştirilir. Otoklavın kapağı vidaları karşılıklı sıkıştırılarak İyice kapatılır. Buhar musluğu açık tutularak alet ısıtılmaya başlanır. Otoklavdaki su ısınınca buhar çıkmaya başlar. Suyun kaynamasına paralel olarak çıkan buhar miktarı da artar. Bir müddet buhar hava ile karışık olarak musluktan çıkar. Otoklavdan hava tamamen çıkığında buhar musluğu kapatılır. Havanın tamamen çıktığı buhar musluğuna takılan lastik bir hortumun soğuk suya daldırılması sırasında kabarcık çıkmasıyla anlaşılır. Otoklav içinde oluşan buhar, çıkacak yer bulamadığından aletin içinde basınç meydana getirir manometre ibresi yükselir. İbre 1 atmosfer basıncı gösterdiği zaman, otoklavın içindeki sıcaklık 120 ºC dir. Bu basınç ve sıcaklığa ulaştıktan sonra dk beklemek suretiyle istenen sterilizasyon işlemi tamamlanır. Isıtıcı kapatılarak aletin soğuması beklenir. Basınç 0 (sıfır)'a düştüğü zaman, hemen buhar musluğu yavaşça açılır. Buhar çıkışı durduğunda otoklavın iç basınç ile dış basıncı eşit olur ve hemen kapak açılır. Basınç yüksek iken buhar musluğu açılırsa, basınç süratle düşer ve otoklav içindeki sterilize edilmek istenen sıvılar kaynamaya başlar. Netice de bulundukları kaplardan taşarlar. Aynı şekilde basınç sıfır da iken, otoklavın buhar musluğu açılmazsa, soğumakta olan otoklavdaki su buharı süratle yoğunlaşır. Bunun sonucu otoklav iç basıncı dış atmosfer basıncından daha aşağıya düşer. Bu esnada fazla miktarda yoğunlaşan su buharı otoklavdaki eşyayı ıslatır. Pasteur Fırının Kullanılması: 180 ºC de 1 saat veya 160 ºC de 2-2,5 saat fırını çalıştırmak suretiyle yapılır.

17 DENEY 4- MİKROSKOP KULLANIMI 1. MİKROSKOP Bakteriler çok küçük olduklarından çıplak gözle görülmezler. Görülebilmeleri için, çok fazla büyütülmeleri lazımdır. Bu büyütmeyi bize temin eden mikroskop, bakteriyoloji çalışmalarında en çok kullanılan bir aletidir. Genel anlamda mikroskop, küçük cisimleri büyüterek görünmelerini temin eden, merceklerden yapılmış bir alet olarak tarif edilebilir. Sözcük olarak latince; MİCROS ( =küçük ) ve SKOPEIN (= Müşahade etme ) kelimelerinin birleştirilmesinden meydana gelmiştir yılında tek mercekli basit bir mikroskobu Anton van Leeuwenhoek bulmuş, günümüze kadar geliştirilerek ulaşa gelmiştir. Mikroskoplar, büyütmeleri kıstas olarak ele alındığında; a- Işık ( optik ) Mikroskobu b- Elektron Mikroskobu olarak iki kategoride toplanırlar. Işık mikroskobunda büyütme optik mercekler sistemi ile elde edilir. Başlıca çeşitleri şunlardır. 1- Aydınlık Saha Mikroskobu (Adi Işık Mikroskobu) 2- Karanlık Saha Mikroskobu 3- Ultroviole Mikroskobu 4- Flouresans Mikroskobu 5- Faz Kontrast Mikroskobu. 6- Stero Mikroskobu Elektron mikroskobu, isminden de anlaşılacağı üzere, büyütme ışık dalgaları yerine elektron şuaları ile sağlanır. Elektron mikroskopları; 1- Transmission Elektron Mikroskobu ( TEM ) 2- Scanning Elektron Mikroskobu ( SEM ) olarak iki çeşidi yaygın olarak kullanılır. Tablo.1. de bazı mikroskop çeşitleri ve özellikleri gösterilmiştir. Tablo.1 Bazı Mikroskop Çeşitleri ve Özellikleri ( Pelczar ve ark.) Mikroskop Tipi Maksimum Büyütme İncelenen Örneğin Özelliği Adi Işık Mikroskobu Boyamış veya boyanmamış örnekler Karanlık Alan Mikroskobu Faz-kontrast Mikroskobu Mikrobiyolojide Kullanım Alanı Bakteri, Mantar, Alg ve Protozoa nın kabaca morfolojik özelliklerinin incelenmesi Boyanmamış örnekler Özelleşmiş morfoloji gösteren mikroorganizmaların canlı olarak incelenmesi Boyanmamış örnekler Hücrelerdeki (mikroorgazma) canlı yapıların incelenmesi Elektron Mikroskobu Cansız yapılar incelenir. İncelemeden önce örnekler özel bir işleme tabi tutulur. Virüslerin ayrıca mikroorganizma ince yapısının incelenmesi

18 Işık Mikroskobu Öğrenci tatbikatlarında laboratuarlarda mikroorganizmaların incelenmesinde devamlı olarak kullanılan ve özel bir ışıklandırma sistemine ihtiyaç göstermeyen, yani güneş ışığı veya elektrik ışığı ile çalışan mikroskoplardır. 2. MİKROSKOP PARÇALARI Mikroskobik çalışmalarda en iyi sonucu alabilmek için, mikroskop özellikleri, kullanım ve bakımını iyi bilmek gerekir, Genel olarak ışık mikroskobu Şekil 1 de görüleceği üzere, mekanik, aydınlatma ve optik olmak üzere üç ana kısımdan oluşur. Mekanik Kısım Bu kısım tüp, kol, tabla ve ayaklardan meydana gelir. Aydınlatma ve optik kısmın taşıyıcısıdır. tüp silindir şeklinde bir parça olup, üst ucunda oküleri alt ucunda objektifleri taşır. Kol mikroskobu tutmaya, tüp ile ayakları birbirine birleştirmeye ve tablayı tutmaya yarar. Tabla dört köşe veya yuvarlak olup ortası deliktir İncelenecek preperasyonlar tablaya konur ve delik kısım ışık kaynağından gelen ışınları geçirmeye yarar. Mikroskobun ayağı genelde U ve V şeklinde yapılmış olup, ağırdır. Şekil 1. Işık Mikroskobunun Şematik Çizimi ve Kısımları Aydınlatma : Teferruatlı bir inceleme ve hassas bir çalışma için elektrik lambası ışığı iyi bir sonuç verir. Preparatı aydınlatmak ve iyi bir ışık ayarı için kondansatör kullanılır Kondansör: Işığı obje üzerinde odaklar ve yoğunlaştırır, ışığın dağılarak görüntünün bozulmasını önler ve rezolüsyon arttırır, sıcak lambayı optik bölümlerden ve kullanıcıdan uzak tutar. Diyafram: Işık kaynağından gelen ışık demetinin çapını kontrol etmek için kullanılır, ışık kaynağının üstünde ya da kondansörün altında yerleşiktir. Işığın şiddetini azaltmak için değil, en iyi kontrast ve rezolüsyon elde edilecek ışık çapını ayarlamak için kullanılır. Optik Kısım: Optik kısmı oküler ve objektifler oluşturur; a-okuler; Tüp içinde objektif tarafından oluşturulan görüntüyü büyütür. Zahiri görüntüyü hazırlar. Objektifin ışık kusurlarını düzeltir. oküler genel olarak 10x büyütmeli olurlar. 5, 7, 15 ve 20x tipleri de vardır.

19 b-objektifler; Mikroskopta ilk büyütmeyi yapan optik kısımdır. Çok sayıda merceğin uygun düzende bir araya getirilmesi ile oluşur. Objeden gelen ışık demetlerini toplamak ve büyümüş gerçek görüntü oluşturmaktır. Laboratuarımızdaki mikroskoplarda obje/ görüntü oranı 4, 10, 40 ve 100 X olan 4 adet objektif bulunmaktadır. 10x objektifi, küçük büyütmeli objektif; 40x orta büyütmeli objektif, 100x ise; immersiyon objektifi olarak adlandırılır. 3. MİKROSKOP KULLANILIŞI Mikroskobik inceleme ilk küçük büyütmeli ( 10x ) ojektif ile başlar. Küçük büyütmeli objektif gözetleme pozisyonuna getirilir, ve preparatın üzerine indirilir. Makro ayar düğmesi İle objektifler yükseltilerek görüntü odaklanır. Mikro ayar düğmesi ile de görüntü netleştirilir. Diyafram vasıtasıyla ışık şiddeti kontrol edilir. Küçük büyütmeli objektiften rovelverin döndürülmesi ile mikroskoptaki görüntü orta büyütmeli objektifte odaklanır. Şayet görüntü tam olarak görünmüyorsa, makro ayar ile objektifleri biraz aşağıya indirerek veya mikro ayar düğmesi ile oynayarak görüntünün netleşmesi sağlanır. Orta büyütmeli objektif lama kesinlikle dokundurulmaz. Mikroskopta görüntü işlemi net değilse, bu durum ayar düğmelerinin hızlı kullanılmasından kaynaklanmış olabilir. Baştaki işlemler tekrar edilerek net görüntü sağlanır. İmmersiyon Objektifi (100x) kullanarak görüntüyü netleştirme işlemi, orta büyütmeli objektif ile yapılan işlemlerin tekrarıdır. Boyalı preperatların incelenmesi esnasında, rezolusyonu artırmak için preperat ile objektif arasına immersiyon yağı konur. İmmersiyon objektifi ile incelemede ilk önce objektif lamın üzerinde 1 cm kadar yükseltilir. İmmersiyon objektifini pozisyona getirmek için rovelver döndürülür. Preperatın merkezine bir damla immersiyon yağı damlatılır. Objektif yağ ile temas edinceye kadar yavaşça indirilir. İmmersiyon objektiflerinin çalışma aralığı son derece küçük olduğundan ilk başlarda görüntünün netleştirilmesinde güçlük çekilebilir Görüntü bulunduğunda optimum ışıklandırma için diyafram aralığı ayarlanır. 4. MİKROSKOP TEMİZLENMESİ VE MUHAFAZASI Oküler ve objektifler özel mercek kağıtları ile temizlenir. Mikroskop kullanılmadan önce ve kullanıldıktan sonra temizlenmelidir. Bilhassa immersiyon objektifi üzerindeki yağ kalıntıları ve tabla üzerindeki döküntüleri temizlemek için % 30 Ksilen + % 70 Etil alkol çözeltisi kullanılır. Mikroskop temizlendikten sonra rovelver küçük büyütmeli objektif yerine getirilir. Üzeri örtüsü ile örtülerek muhafazası içine yerleştirilir. KULLANILACAK MALZEMELER Işık Mikroskobu Lam Lamel Temizleme Çözeltisi ve Bezi İğne, Öze

20 METOT Mikrobiyolojide çalışılan neredeyse tüm organizmalar çıplak gözle görülemeyip, tespitleri için mikroskoba ihtiyaç duyulmaktadır. Mikroorganizma çalışmalarının iyi bir şekilde yürütülebilmesi için iyi derecede mikroskop kullanımı becerisi gerekmektedir. Bu laboratuar uygulamasında mikroskobun nasıl çalıştığı ve materyalin mikroskopta nasıl inceleneceği öğrenilecektir. Mikroskopta inceleme adımları; 1- Preparatı (lam ve lameli) nesne tablasının üzerindeki sıkıştırma klipslerinin altına yerleştir. (Lamel olan tarafın daima yukarıda olacaktır) 2- Her zaman için en küçük objektif (10X) ile çalışmaya başla. 3- Kaba ayar düğmesi (Macro Vida) ile nesne tablasını en üst seviyeye çıkartıncaya kadar tablanın kenarına bak. 4- Okülere bakarak preparattaki görüntü belirinceye kadar kaba ayar düğmesini (Macro Vida) aşağıya doğru çevir. 5- Kaba ayar yapıldıktan sonra ince ayar düğmesi (Micro Vida) ile keskin bir görüntü alıncaya kadar ayar yap. 6- Gözlem yaparken gözünüzü okülere yapıştırma. 7- Büyütmeyi arttırmak için hareketli revolveri saat yönünde çevir ve her objektif değişikliğinde sadece ince ayar düğmesini (Micro Vida) ayarlayarak görüntüyü odakla. Not 1: Objektif değiştirirken tablayı aşağı indirmeyi unutma!!! Not 2: Her büyütmede ışığa gereksinim artacağından diyafram daha fazla açılmalıdır. 8- İnceleme işlemi bittikten sonra, objektifi tüpteki oküler ile birlikte en düşük büyütme seviyesine (10X) getirip bırak. 9- Aydınlatma sistemini kapat. 10-Mikroskop sadece gövde kolu üzerinden tutulmalı ve taşınmalıdır. 11- Toz, mikroskop ve optik aksamın en kötü düşmanıdır. Bu nedenle mikroskobun hassas iç bölümlerine tozun girmesini engellemek için herhangi bir objektifi veya oküleri kesinlikle mikroskop üzerinden çıkartma. 12- Eğer mikroskobun gövdesi ve tablası tozlu ise, tozun silinmesi için yumuşak pamuklu bez parçası kulan. 13-Tüm bu işlemlerden sonra artık mikroskobu koruma örtüsüyle ört.

21 DENEY 5- BESİYERİ HAZIRLAMA Herhangi bir mikroorganizma ile çalışmak için ilk olarak, o organizmanın saf kültürünün yapılması gerekir. Bir besiyerinde üretilmiş mikroorganizmaların tümüne kültür adı verilir. Bu sebeple ilk önce besiyeriler hazırlanır. Besiyeri (besi ortamı, ortam, vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) içerisinde mikroorganizmaların büyümeleri için gerekli olan, farklı sayı ve miktardaki maddeleri ihtiva eden, steril edilmiş ortamlardır. Besiyeri, mikroorganizma geliştirilmesi, izolasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, su ve çevre kontrolü ve biyolojik ürünlerin elde edilmesi gibi farklı amaçlara yönelik olabilir. Herhangi bir mikroorganizma ile çalışmak için ilk olarak, o organizmanın saf kültürünün yapılması gerekir. Bir besiyerinde üretilmiş mikroorganizmaların tümüne kültür adı verilir. Bu sebeple ilk önce besiyeriler hazırlanır. Besiyeri (besi ortamı, ortam, vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) içerisinde mikroorganizmaların büyümeleri için gerekli olan, farklı sayı ve miktardaki maddeleri ihtiva eden, steril edilmiş ortamlardır. Besiyeri, mikroorganizma geliştirilmesi, izolasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, su ve çevre kontrolü ve biyolojik ürünlerin elde edilmesi gibi farklı amaçlara yönelik o Besiyeriler kullanım amacına göre değişik şekillerde gruplandırılabilirler: 1. Genel Besiyerler: Herhangi bir inhibitör madde içermeyen, besin maddelerince yeterli, herhangi bir organizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor gelişen mikroorganizmaların da dahil olduğu çok sayıda bakterinin gelişmesini sağlayan besiyerilerdir. Genel besiyeriler başlıca, çeşitli örneklerdeki toplam mezofil ve psikrofil aerobik bakteri sayımı ve bozulma veya hastalık etmenlerinin öz izolasyonu amaçları için kullanılır. Tüm bakterilerin gelişebileceği nitelikte bir genel besiyeri henüz mevcut değildir. Genel besiyeriler, zor gelişen bakterilerin sadece bir bölümünün gelişmesini sağlayabilir. İnkübasyon şartlarının değiştirilmesiyle psikrofillerin, mikroaerofillerin, aerotolerantların ve özel inkübasyon koşullarının sağlanmasıyla da kısmen anaerobların kültüvasyonunda kullanılır. Tryptic soy agar (TSA) ve tryptic soy broth (TSB) en çok kullanılan besiyerilerindendir. 2. Seçici Besiyerler: Seçici besiyeriler, karışık bir mikrobiyal floradan, gelişmesi istenmeyenleri baskılamak, ancak gelişmesi istenenler için herhangi bir olumsuz etki yapmamak üzere formüle edilen besiyerilerdir. Bu nedenle bu tür besiyeriler, çeşitli inhibitörler veya geliştirilmesi istenilen mikroorganizmaların kullanabileceği, ancak refakatçi flora üyeleri tarafından kullanılmayan çeşitli besin maddeleri ihtiva ederler. Örneğin, NaCl miktarı yüksek olan bir besiyeri, sadece yüksek tuz konsantrasyonuna dayanıklı bakterilerin büyümelerini sağlar. Pseudomonas izolasyon agar (PIA), sadece Pseudomonas cinsi üyelerin büyümesini sağlar. MacConkey (MC) besiyeri de en çok kullanılan seçici besiyerilerden olup, gram olumlu bakterilerin büyümelerini engellerken, enterik (gram olumsuz) bakterilerin büyümelerine imkan verir. 3. Ayırt Edici Besiyeriler: İnhibitörlerin, gelişmesi istenen mikroorganizmalara az da olsa zarar verebilmesi sebebiyle, inhibitör kullanımıyla istenmeyen mikroorganizmaların inhibisyonunun her zaman mümkün olmaması, bazı inhibitörlerin insan sağlığına zararlı olması gibi nedenlerden dolayı, seçici besiyeriler her zaman istenilen sonucu vermemektedir. Seçici besiyeriler yerine ayırt edici besiyerilerin kullanılması daha tatmin edici sonuçlar vermektedir. Ayırt edici besiyerilerinde, gelişmesi için istenen mikroorganizmaların yanında diğerleri de gelişebilir. Ancak, başta koloni

22 morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır. Ayırt edici besiyeri koloni özelliği, çeşitli ph indikatörleri, boya maddeleri, indirgeyiciler ve diğer indikatörler gibi maddelerin besiyeriye ilave edilmeleriyle yapılır. En basit olarak, besiyeri bünyesine, ayırt edilmek istenen mikroorganizmaların kullanabileceği, ancak ortamda bulunan diğer bakterilerin yararlanamayacağı bir karbonhidrat ilave edilir. Mikroorganizmaların bu karbonhidratı kullanması da çeşitli indikatörlerle belirlenir. Örneğin, koliform grubu bakteriler için laktozdan gaz oluşturulması tipik bir ayırt edici özelliktir. Çoğu mikroorganizmalar belirli karbonhidratları kullanırken asit oluşturur ve bu asitlik ph indikatörü ile rahatlıkla belirlenir. Kan agar kullanılan kullanılan ayırt edici besiyerilerden biridir. 4. Zenginleştirilmiş Besiyerler: Karışık bir mikrobiyal flora içinde hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek ve sayısını arttırmak için kullanılan besiyerilerdir. 5. Tanımlayıcı Besiyeriler: Bir mikroroganizma izolatının tanımlanması için kullanılan besiyerilerdir. Bunlar, mikroorganizmaların belirli bir besin maddesini kullanıp/ kullanamadığının tespit edilmesi, belirli bir besin maddesinden metabolizma sonucunda tayin edilebilecek metabolitlerin oluşturup/ oluşturmadığının belirlenmesi gibi amaçlar için kullanılırlar. Bakterilerin hareketli olup olmadığının belirlenmesi amacıyla kullanılan yarı katı besiyeriler de tanımlama besiyerileri sınıfına girer. 6. Diğer Besiyeriler: Antimikrobiyal duyarlılık testlerinde kullanılan agar disk difüzyon besiyerileriyle minimal inhibisyon konsantrasyon testlerinde, vitamin ve amino asitlerin mikrobiyal yolla belirlenmesinde ve saf kültürlerin korunması amacıyla kullanılan besiyeriler gibi özel amaçlara yönelik olarak hazırlanan ve kullanılan besiyeriler de vardır. Besiyeri hazırlanırken formülasyonuna giren maddeler ayrı ayrı dikkatlice tartılarak deiyonize su içinde çözülürler veya hazır dehidre besiyeri doğrudan tartılarak yine deiyonize su içinde çözülür. Örneğin, nitrüent broth besiyerinin bileşimi litrede 5 g pepton ve 3 g et ekstratı şeklindedir. Laboratuarda hazır dehidre nitrüent broth besiyeri varsa bundan 8 g tartılarak 1 litre suda çözülür. Çalışmalarda hazır besiyerilerin kullanılması daha uygundur. Besiyerinin Sahip Olması Gereken Özellikler Uygun miktarlarda su ile su aktivitesi yüksek olmalı, Mikroorganizma ihtiyaçlarını karşılayabilecek kolayca kullanılabilir besin maddeleri içermeli, Uygun asit-baz dengesine (ph) sahip olmalı, Berraklık, katılık gibi fiziksel özellikleri elverişli olmalı, Osmotik basıncı, oksidasyon/ redüksiyon (indirme/ yükseltgenme) potansiyeli mikroorganizmalara uygun olmalı, Steril olmalı, sterilizasyon kontrolü yapılmalı, Ekim öncesi sterilizasyon hazırlığı ve sterilizasyon uygulaması titizlikle uygulanmalı, Dış ortamdan mikroorganizma kontaminasyonunun önlenmesi için özel kaplarda hazırlanmalı ve saklanmalı. B. BESİYERİ ÇEŞİTLERİ Fiziksel özelliklerine göre laboratuar ortamında kullanılan besiyerleri katı,sıvı ve özel olmak üzere 3 e ayrılırlar. I. Sıvı Besiyeri: Bazı besiyerleri sıvıdır. Sıvı besiyerinde bulunan bir bakteri çoğalma özelliğine girer ve ortam şartlarına bağlı olarak uzunca bir zaman ölmeden kalırlar. Sıvı besiyerinde üreyen bir bakteri buradaki lüzumlu maddeleri kullanır. Ortama metabolizma ürünlerini bırakır.

23 Besiyerinde daha önce bulunmayan bu ürünlerin gösterilmesi bakterinin teşhisine yarar ( indol, H2S teşkili, karbonhidratlardan gaz ve asit teşkili gibi). Bakteri sıvı besiyerinde homojen bir bulanıklık meydana getirerek üreyebileceği gibi dipte çöküntü veya yüzeyde zar teşkil ederek de üreyebilir. Sıvı besiyerlerine Buyyonlu Besiyerleri adı da verilir. II. Katı Besiyeri: Katı besiyerine ekilen bakteri ancak ekildiği yerde ürer ve koloni teşkil eder. Meydana gelen koloniler, bakterinin türüne göre özellik gösterirler. Katı besiyerine yaymak suretiyle bakteri hücrelerine ayırmak ve meydana getirdikleri kolonileri ayrı ayrı elde etmek ( yani saf kültürlerini ) mümkündür. Katı besiyerine besin kıymetini değiştirmeyen bir madde ilavesiyle elde edilir. Bunun için en fazla jeloz (agar) kullanılır. Bundan dolayı katı besiyerlerine jelozlu besiyerleri de denir. Agar, " Agar agar " adındaki bir deniz yosunundan elde edilir. Jelatin ilavesi ile de katı besiyeri elde edilir. III. Özel Besiyeri: Mikrobiyoloji laboratuar çalışmalarında kullanılan bir çok besiyeri vardır. Bazen benzer deneyler için bile farklı besiyerleri kullanılmaktadır. Çoğunlukla özel amaçlar için hazırlanıp kullanılan besiyerlerine özel besiyerleri adını veriyoruz. Mesela zenginleştirilmiş, tecrit, ettirici besiyerleri gibi. C. BESİYERİ HAZIRLAMA Besiyerleri hazırlanırken aşağıdaki adımlara ve işlemlere dikkat edilir. a) Kullanılan Suyun Özellikleri Kültür ortamlarının ve çözeltilerin hazırlanmasında yalnızca distile veya deiyonize su kullanılır. Distile sudaki toksite florür, fenol v.b.den meydana gelebilir. Toksitenin diğer kaynakları gümüş, kurşun ve muhtelif tanımlanmamış organik komplekslerdir. Bakiye klor ve kloraminler dahi, klorlu sudan temin edilmiş distile suda bulunabilir. Distile suda klor bileşikleri bulunduğu zaman, aynı eşdeğer oranda sodyum sülfit veya sodyum tiyosülfat ilavesiyle nötralize edilmelidir. Distile su nütrient bulaşmalarından uzak olmalıdır. Şayet bu tür bulaşma varsa, distilasyon esnasında organiklerin tutulmasını temin eden karbon filtre kolonlarının değiştirilmesi gerekir. Distile suyu, alglerin büyümesini önlemek için direkt güneş ışığından ve nütrient bulaşmasını engelleyecek şekilde plastik kaplarda saklama yapılır.

24 b) Reaksiyon Uyumu Kültür ortamının reaksiyonu, ph olarak ifade edilen hidrojen iyonu konsantrasyonu teriminde belirlenir. Sterilizasyon esnasında (ph'da) hidrojen iyonu konsatrasyonundaki artma veya azalma, sterilizasyonu yapan ferde bağlı olabilir. ph daki azalma 0,1 ile 0,2 bazen çift kuvvetli ortamlardan 0,3 olarak büyük olabilir. Fosfat gibi tamponlama tuzları hazırlanan ortamda mevcut olduğu zaman, ph değerlerindeki azalma ihmal edilebilir. Hazırlanan besiyerlerinin ihtiyaç duyulan ph ayarlamaları ph metre ile yapılır. Uygulamada standart ph ölçümleri kullanılır. İstenilen ph'a ayarlamak için, NaOH çözeltisi kullanılır. Bilinen hacimdeki besiyerine, NaOH ile ph ayarlaması yapılır. Daha sonra tüm karışımın ph kontrol edilir ve uygun ph' a kadar ayarlama uzatılır. Ticari hazır besi maddelerinin herbirinin, hazırlanırken ihtiyaç duyulan son ph değerleri verilmiştir. Bu tür besiyerleri hassas tartım ve prosedürüne uygun hazırlandığı zaman ph ayarı gerekmeyebilir. c) Besiyerlerinin Sterilizasyonu Besiyerleri hazırlandıktan sonra, derhal kültür kaplarına (tüp ve şişelere ) dağıtılır ve iki saat içinde sterilize edilir. Sterilize edilmemiş besi maddeleri saklanmaz. Bütün besi maddeleri, özelliklerine göre bazıları (MF Koliform broth vb. gibi) hariç tutulursa otoklavda 121oC de 15 dakika sıcaklıkta 1 atmosfer basınç altında tutularak sterilize edilir. Basınç sıfıra düştüğü zaman otoklavdan ortamları hemen uzaklaştırmak ve çabucak soğutmak gerekir. Besiyerlerinin ısınmaya maruz kalması vasıtasıyla bozulmasını önlenmelidir. Küçük kaplarda az miktarlardaki besi maddeleri sterilizasyon esnasında üniform ısınmayı ve çabuk soğumayı temin eder. Şekerli besi maddeleri 121 oc de 12 ila 15 dakika için sterilize edilmelidir. Şekerli besi maddelerinin sterilizasyon esnasında maruz kaldıkları maksimum zaman 45 dakikayı geçmemelidir. Otoklavın açma-kapama zaman aralığı da çok kısa olmalıdır. İhtiyaç duyulan toplam ısınma zamanını 45 dakikayı geçmemesi için besiyerlerinin sterilizasyonunda ön ısınmalı çift duvarlı otoklav kullanılması tercih edilmelidir.

25 DENEY 6 ÇEVREMiZDEKi MiKROORGANiZMALAR VE KATI VASATTA (STANDART PLATE AGAR) TESPİTLERİ 1. ÇEVREMİZDEKİ MİKROORGANİZMALAR Çevremizdeki mikroorganizmaları 4 genel grupta inceleyebilir. Bunlar; bakteriler, protozoalar, mantarlar ve alglerdir. Bakteriler Bakterilerin çoğunun çapı bir milimetrenin binde birinden daha büyük değildir. Bu nedenle de burada ölçüm birimleri olarak mikrometre veya nanometre kullanılır (1 mm=10-3 mm) ve (1nm=10-6 mm). Sekillerine göre bakteriler dört grubta toplanabilir: 1. Bilya seklinde ve küresel olanlar (*Koklar) 2. Silindirik ve düz olanlar, çubuksular (Bacıllus, Pseudomonas) 3. Kıvrımlı çubuksular, virgül seklinde olanlar (Vibriolar) 4. Vida seklinde olanlar (Spiraller) *Koklar; diplokok, streptokok ve stafilokoklar olarak ayrılmaktadır. Saprofit ( zararsız ) Olan Bakteriler: 1. Koliform Bakteriler a) Escherichia sp. b) Citrobacter sp. c) Klebsiella sp. d) Enterobacter sp. 2. Proteus sp. 3. Pseudomonas sp. 4. Alcaligenes sp. Patojen Olan Bakteriler: 1. Salmonella sp. 2. Shigella sp. Mantarımsı Bakteriyal Koloniler Bakterilerin koloni oluşumu, bir nevi fiziksel kümeleşme olayıdır. Burada büyüme mekanizması başlangıçta eksponansiyel, daha sonraları ortamın özelliklerine bağlı olarak karmaşık bir hal almaktadır. Arıtma sistemlerinin kenar yüzeylerinde görülür. En çok damlatmalı filtrelerde, havuzların kenar yüzeylerinde ve bilhassa kanalizasyon borularının kenarlarında rastlanır. İki boyutlu olarak hareketli bir biçimde çoğalma söz konusudur. Bu tür koloniler, sümüksü, müsülajlı bir yapı gösterirler. Bakteriyal kolonilere benzerler. Ancak mantarımsı bakteriyal koloniler ile bakteriyal koloniler aralarındaki fark, mantarımsı bakteriyal kolonilerinin amorf yapı özelliği göstermelerinden dolayı hareket etmeleri ve hücreler arası bağlantıya sahip olmalarıdır.

26 Koliform Bakteri Grubu Şekil: 10,000 kez büyütülmüs bir Escherichia coli bakteri kolonisi Bu organizmalar patojen olmayıp suda mevcut olmaları dışkı ile bir kirlenmeyi ve buna bağlı olarak potansiyel bir tehlikeyi işaret eder. Tifo, dizanteri, kolera gibi hastalıklar bir bağırsak enfeksiyonu olduğundan, koliform bakterilerinin herhangi bir suda bulunması, yukarıdaki hastalıklara sebep olan bakterilerin o suda var olacağı ihtimalini gösterir. Yani bu bakteriler böylesi bir tehlikenin indikatörüdürler. Bu sebepten bunların suda olmayışları patojen bakterilerin olmayışının bir göstergesidir. Dışkının 1 gramında civarında bakteri mevcuttur ve bunların % 95 'i koliform grubu bakteriler teşkil etmektedir. Sularda koliform bakterilerinin aranmasının sebebi; bunların patojen olan bakterilere oranla daha kolay daha ucuz ve daha kısa sürede tesbit edilebilmeleridir. Koliform grubunu oluşturan bakteriler; tamamı aerobik veya fakültatif anaerobik olan, gram-negatif, spor oluşturmayan, çomak şeklinde, laktozdan 35 0C de 48 saat içerisinde gaz ve asit oluşturan bakteriler olarak tarif edilir. Koliform grubu bakterilerin önemli bir türü olan Escherichia coli, 2-4 μm boyunda 0,4-0,7 μm eninde, düz, uçları yuvarlak çomak biçiminde bakterilerdir. Hareketleri tifo basiline (Salmonella typhi ) göre daha yavaştır. Escheria coli fakültatif anaeroptur. Optimal üremesi 35 ºC dir. Normal besiyerinde kolay ve bol ürerler. Sıvı besiyerinde homojen olarak ürerler ve kültürleri feçes (dışkı) kokusundadır. Koliform bakterilerin asıl kaynağını insan ve hayvanların (sıcak kanlı hayvanların) dışkıları oluşturmaktadır. Dolayısıyla, yerleşim merkezlerindeki; kanalizasyon suları ile bunlarla kirletilmiş olan sıvı atıklar ve katı atık sızıntı suları önemli koliform kaynaklarıdır. Protozoalar Şekil: Paramecium sp. (terliksi) Şekil: Amip, Terliksi, Kamçılı

27 Protozoa ya da bir hücreliler; genellikle mikroskobik, bir hücreli ve ökaryotik canlıları içeren bir Protista alt alemidir. Tek hücreli olmalarına rağmen, çok hücrelilerde görülen yaşamsal işlevlerin bir çoğunu yapabilirler. Bu nedenle eski zamanlarda vücut maddesi hücrelere ayrılmamış hayvanlar olarak kabul edilmiş ve "Hücresizler" adıyla anılmıştır. Sitoplazmalarında bulunan özelleşmis yapılara "organel" denilmekte, hareket, sindirim, boşaltım gibi hayatsal faaliyetlerini bunlarla sağlamaktadırlar. Çoğu bir çekirdekli, (Monoenergid), bir kısmı da her zaman çok çekirdek taşıyan (Polienergid) canlılardır. Bazıları ise yaşamlarının belli bir kısmıda çok çekirdek taşırlar. Organel olarak; çekirdek, endoplazmik retikulum, ribozom, golgi aygıtı, mitokondri, lizozom, peroksizom, mikrotubuluslar ve filamentler bulundururlar. Hareket organelleri olarak yalancı ayaklar, kamçılar, siller, sirler ve tentaküller görülür. Beslenme şekillerinde ototrof, saprozoyik, parazitik, kommensal, miksotrof ya da heterotrof beslenme görülür. Boşaltımda en belirgin özelliklerinden biri; ritmik olarak sisen ve küçülen vurgan (kontraktil) kofulların bulunmasıdır. Birçok denizel türde ve parazitlerde bu vurgan kofullar görülmez. Çoğalmalarında; eşeysiz olarak; boyuna bölünme, çoğa bölünme, enine bölünme, zırh oluşturduktan sonra ikiye bölünme, hücre dışı tomurcuk oluşturma ve hücre içi tomurcuk oluşturma görülür. Eşeyli çoğalmalarında; kaynaşma (hologami), merogami ve konjugasyon görülür. Tek olarak ya da koloni seklinde yasayan tek hücreli canlılardır. Bugüne kadar kadar türü tanımlanmış ve bunların yaklaşık 1/4'ü parazit olarak bilinir. Mantarlar Şekil: Mantarlar Mantarlar kök, gövde, yaprak, çiçek ve klorofile sahip olmayan ökaryotik, heterotrofik çok hücreli organizmalardır. Klorofilin bulunmaması nedeniyle fotosentez olayına rastlanamaz. Çok hücreli ve büyük olmaları, üreme tarzları, yasam siklusları, çekirdek etrafında bir zarın bulunması, çok kromozoma sahip olması, nukleolus içermeleri ve hücre içi organellerin (mitokondrium, golgi aparatı, endoplasmik retikulum, vesikül, vakuol, vs) bulunmaları gibi nedenlerle prokaryotiklerden ayrılırlar. Mantarlar dogada (kara ve sularda) çok yaygın bir yaşam spektrumu gösterirler. Büyük bir çogunlugu saprofitik bir yaşantıya sahip olup kendilerine gerekli gıda maddelerini cansız materyallerden ve basit organiklerden temin ederler. Bir kısım mantarlar da, insan ve hayvanların yanı sıra, bitki, balık, kerevit, algler, insektler vs. canlılar üzerinde parazitik, sembiyotik veya komensal bir yasam içinde bulunurlar. Şimdiye dek ' den fazla mantar türü (bunun 30000' den fazlası Basidiomycetes, den fazlası Deuteromycetes, den fazlası Ascomycetes sınıflarına aittir) saptanmış olup bazılarının da karakterleri henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Çok doğaldır ki bu kadar fazla ve aynı zamanda çeşitlilik gösteren türlerin bütün özelliklerini ayrıntıları ile saptamak, açıklamak oldukça güç, zaman alıcı olup bazılarının biyokimyasal, sitolojik, fizyolojik ve genetik özellikleri de hala tam bir açıklığa kavuşturulamamıştır.

28 Mantar Koloniler Mantar kolonileri tamamıyla misel seklinde dallanma gösteren ve büyüme yönleri tek bir yöne doğru olan koloni seklidir. Bu tür koloniler genellikle koenotik hücre tipine sahiptirler. Mantar kolonileri dallı bir yapı gösterirler ve çok hücreli bölünme tipine sahiptirler. Mantar kolonileri özellikle düşük ph ve nütrient eksikliğine sahip atık suların arıtıldığı arıtma sistemlerinde büyüyüp gelişebiliyorlar. Biyolojik arıtma sistemlerinde çökelme problemine neden oldukları için bulunmaları istenmez. Mantar kolonilerini oluşturan hücrelerde birbirine bağımlı yasama sekli mevcuttur. Algler Şekil: Algler Algler, gerek yapısal olarak gerekse dış görünüşleri bakımından oldukça farklı görünümdedirler. Yapısal olarak; eukaryotik (gelişmiş hücre tipi) ve prokaryotik (basit yapılı hücre tipi) olmak üzere iki büyük gruba ayrılırlar. Buna göre Mavi-Yeşil algler göstermiş oldukları hücre organizasyonları bakımından prokaryot hücre özelliği taşımaktadırlar. Algler su ortamında primer üretici canlılardır. Yapılarındaki pigmentleri sayesinde Karbondioksit ve suyu, ışığın etkisi ile karbonhidratlara çevirirler böylece su ortamındaki besin degerinin ve çözünmüş oksijen oranının artmasını sağlarlar. Sonuçta kendi gelişimlerini sağlayarak besin zincirinin ilk halkasını oluştururlar. Bu şekilde üretime olan katkıları ve üst basamaktaki canlılarla olan ilişkileri açısından önem taşımaktadırlar. Alglerin üretimleri çevresel faktörlerle sınırlanmıştır. Bunlar ışık, sıcaklık ve besindir. Bu sınırlayıcı faktörler iyileştirilirse, üretim düzeyi artar. Üretim artısının belli bir düzeyi asmasının doğal bir sonucu olarak da çevresel denge bozulur ve bu gelişime eutrofikasyon adı verilir. Eutrofikasyonun sonuçlarından birisi de aşırı alg patlamalarının görülmesidir. Bunun anlamı, fitoplankton (alglerin serbest yüzen formları) populasyonlarının suyun rengini, kokusunu ve ekolojik dengesini bozacak yeterli yogunluga ulaşmasıdır. Bunun yanı sıra alglerin aşırı gelişmesi, sucul ortamdaki bir çok canlı için toksik etkilere neden olduğu için ölümler görülebilmektedir. Örneğin, Dinoflagellatlardan Gymnodinium ve Gonyanlax'a ait türler aşırı çoğalma sonucu, hayvanların sinir sistemlerini etkileyen, yüksek oranda suda çözünebilen toksik madde üretirler. Diğer patlamalara ise Mavi-Yeşil alglerden Microcystis, Anabaena, Nostoc,Aphanizomenon, Gloeotrichia ve Oscillatoria, Chrysophyte'den Prymnesium parvum neden olmaktadır.

29 Çevremizdeki Mikroorganizmaların Tespiti Deney 1 Gerekli Malzemeler Katı besiyeri (Standart Plate Agar) Distile su Otoklav Steril baget veya ekübuyyon çubuğu Steril petri kutuları İsporto Ocagı Etil alkol İnkübatör Koloni Sayacı Mikroskop Deneyin Yapılısı Standart plate agar katı besiyeri hazırlanır (22.5 g/l). 2 saat içerisinde otoklavda steril edilir (120 ºC sıcaklık,1 atm basınçta 15 dk). Steril olarak hazırlanmıs katı besiyerleri otoklavdan çıktıgında sıvı haldedir ve bu sekilde steril petri kutularına ispirto ocagı çevresinde aseptik şartlarda dökülerek sogutulur. Daha sonra incelenecek ortamda petri kutusunun kapağı açılarak 10 dakika beklenir (tuvaletler, kantinler, yemekhane, derslikler ve laburatuvarlar çevresel ortam olarak seçilebilir). Daha sonra kapak kapatılır. Steril baget veya ekübuyyon çubuğu steril su ile ıslanır ve incelenecek yüzeye sürülerek numune alınır, Petri kutusundaki katı vasat üzerine ekim yapılarak kapak kapatılır. Ekim yapılan petri kutuları etiketlenip ters olarak etüve konarak, 20±2 0C sıcaklıkta inkübasyona tabi tutulur. 24 ve 48 saat sonra oluşan koloniler gözlenir. Sonuçlar Oluşan koloniler sayılır. Mikroskopta koloni tipi ve renk farklılıklarından, türler tespit edilir. Deney 2 Prokaryotik organizmalardan Mavi-Yesil Alglerin mikroskobik incelenmesi ve morfolojik yapılarını kabaca gözlemlenmesi. Gerekli Malzemeler Mavi-yesil alg kültürü Steril 1 ml lik pipet Lam ve Lamel Mikroskop

30 Deneyin Yapılısı Temiz bir lam alınır. Üzerine steril 1 ml lik pipet yardımıyla bir damla Mavi-yeşil alg kültürü konur. Numunenin üzerine lamel kapatılır. Mikroskopta 10x olarak, düşük büyütmeli objektiften başlayarak incelenir. Sonuçlar Mikroskopta Mavi-yeşil alg hücreleri taşıdıkları renk pigmentleri vasıtasıyla morfolojik olarak teşhis edilir. Deney 3 Ökaryotik organizmalardan Alglerin, Protozoaların ve Mantarların mikroskobik incelenmesi ve morfolojik yapılarını kabaca gözlenmek. Gerekli Malzemeler Alg, Protoza ve Mantar Kültürleri Steril 1 ml lik pipet Lam ve Lamel Mikroskop Deneyin Yapılısı Temiz bir lam alınır. Üzerine steril 1 ml lik pipet yardımıyla incelenecek kültürden bir damla konur. Numunenin üzerine lamel kapatılır. Mikroskopta 10x olarak, düşük büyütmeli objektiften başlayarak incelenir. Sonuçlar Mikroskopta; Alg hücreleri taşıdıkları renk pigmentleri vasıtasıyla tek hücreli veya çok hücreli ipliksi olarak morfolojik olarak teşhis edilir. Protoza türleri, terliksi hayvan, paramesium, amipler ve çan hayvancığı morfolojik olarak gözlenir. Mantar hücrelerinden maya hücreleri gözlenir.

31 DENEY 7 MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: BASİT BOYAMA 1. GİRİŞ Mikroorganizmaları tanımlama yollarından birisi, onları boyayarak incelemektir. Boyama, kimyasal bir olaydır. Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile görünmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta görünür hâle getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyanmaları işlemine mikroorganizmaların boyanması denir. 2-MİKROORGANİZMALARI BOYAMA YÖNTEMLERİ Kullanılan kimyasal boyaların ana amacı boyanan biyolojik kısımların daha net bir şekilde mikroskobik incelemelerinin gerçekleştirilebilmesidir. Mikroorganizmaların boyanabilmesi için mikroorganizma içeren sıvının lam üzerine bir öze yardımıyla yayılması (smear) ve fiksasyon işleminin yapılması gereklidir. Mikroorganizmaları boyamanın başlıca avantajları şunlardır: Mikroorganizmalar ve zemin arasında kontrast oluşturarak onları daha kolay incelemek Bakterinin hücre duvarı, vakuolleri gibi yapılarını daha kolay incelemek Değişik morfolojik tipler arasındaki farklılığı ortaya çıkarmak Boyama işleminde çeşitli boyalar kullanılır. Bunlar doğal ve sentetik boyalar olarak ikiye ayrılmaktadır. a) Doğal boyalar: Doğal boyalar bitkisel ve hayvansal orijinli olabilirler. Bunlardan bitkisel orijinli olanlara hematoksilen ve orcein, hayvansal orijinli olanlara ise carmen örnek gösterilebilir. Doğal boyalar daha ziyade histolojide kullanılmaktadır. b) Sentetik boyalar: Bunların sayıları oldukça çoktur. Eosin, asit fuksin, asit pikrik, oranj gelb, eritrosin, kongo kırmızısı, light green, metilen mavisi, toluidin mavisi, bazik fuksin, jansiyan viyole, azocarmen, safranin gibi birçok boya sentetik boyalara örnek gösterilebilir. Sentetik boyalar; Ehrlich tarafından bazik, asid ve nötr boyalar diye üç gruba ayrılmıştır. Serbest asid ve bazlar suda çok az eridiklerinden sentetik boyalar daima nötr tuzlar halinde kullanılırlar. Nötr tuzlar hem asit köke (anion) hem de bazik köke (kation) sahiptirler. i. Bazik boyalar: Bazik boyaların kromofor grubu pozitif yüke sahiptir. Yani, yukardaki açıklamanın ışığında, bu nötr tuzu meydana getiren bazik kısım (kation, +) renkli buna karşın asid kısım (anion, -) ise renksizdir. Bu tür boyalara katyonik boyalar da denir. (Örneğin; metilen mavisi bazik bir boyadır ve terkibi tetramethhyl-thionin-chlorhydrate tır. Bu terkipte tetramethyl-thionin baz ı hidroklorik asit ile nötr bir tuz meydana getirecek şekilde birleşmiştir. Tetramethyl-thionin bazı renklidir ve metilen mavisi boyasına rengini verir, anion kökü olan hidroklorik asit ise renksizdir.) Bismarck brown y, crystal violet, methyl green, pararosanilin ( basic fuchsin), resorcin blue diğer bazik boyalara örnek verilebilir. Bir doğal boya olan hematoksilen de bazik boya tarzında davranır. Bakterilerin yüzeyi negatif olduğu için ayrıca DNA da bulunan fosfatların da negatif yüklü olması nedeniyle katyonik özelliğe sahip olan bazik boyalarla boyanırlar.

32 ii. Asit boyalar: Asit boyaların boyayıcı kısımları negatif elektriksel yüke sahiptir. Yani burada tuzun baz kısmı renksiz asid kısmı ise renklidir. Bu tür boyalara anyonik boyalar da denir. Asitik boyalar zemini boyamak için kullanılmaktadır. Örneğin; sodium eozinat da eozinat negatif yüklü olup kromofor özelliktedir. Diğer asidik boyalara acid fuchsin, anilin blue, kongo red, fast green, light green, erytrosin, orange G, acid pikrik, Phyloxine, alizarin red S, çini mürekkebi, nigrosin, malaşit yeşili gibi boyalar örnek gösterilebilir. iii. Nötr boyalar: Nötr boyalar iyonik olmayan boyalardır. Bunlar suda çözünen renkli organik bileşiklerdir. Burada nötr tuzu meydana getiren asid ve bazın her ikiside renklidir. Hematoloji ve mikrobiyolojide sık kullanılan bu boyalara Giemsa boyası en güzel örnektir.bu boyalar parazitlerin incelenmesinde, rikettsiya ve klamidyaların boyanmasında kullanılmaktadırlar.wright ve Leisman boyalarıda bu tip boyalara örnektir. Boyama işlemi basit boyama veya komplex boyama yöntemleri kullanılarak yapılır. Bu uygulama dersinde basit boyama teknikleri kullanılacaktır. 3 - BASİT BOYAMA YÖNTEMLERİ Bu yöntemlerde genellikle tek bir boya eriyiği kullanılarak boyama yapılır. Mikroorganizmaların morfolojisinin incelenmesi amaçlanır. Basit boyalar genellikle birçok amaç ve biyolojik materyal için kullanılabilir. Tuzla birlikte boya veren bir pozitif iyondan meydana gelirler. Birçok basit boya negatif yüklü hücre zarlarının boyanmasını sağlar. Fazla boya yıkanarak atıldıktan sonra mikroskop ile inceleme gerçekleştirilebilir. a) Negatif Boyama: Bu yöntemde asidik boya kullanılarak zeminin boyanması amaçlanır. Bu preparatta mikroorganizma boya almaz. Mikroorganizmanın büyüklüğü ve morfolojisi hakkında bilgi edinmek ve spiroketler gibi zor boyanan bakterilerin gözlenmesi amacıyla kullanılır. Çini mürekkebi ya da Nigrosin eriyiği kullanılır. Bir damla çini mürekkebi lamın bir kenarına konur. Bir damla bakteri süspansiyonu ile homojenize edilir ve lama yayılır. Preparat iyice kurutulur. Tespit işlemi yapılmaz ve immersiyonla mikroskopta incelenir. b) Löfflerin Metilen Mavisi kullanılarak yapılan basit boyamada Corynebacterium diphtheriae da daha koyu boyanan metakromatik cisimcikler gözlenebilir. Herhangi bir bazik boya kullanılarak yapılan basit boyamada bakterin morfolojisi ve büyüklüğü hakkında bilgi edinmek yanında özellikle direkt materyalden hazırlanan preparatın incelenmesiyle materyalin uygun alınıp alınmaması hakkında da fikir edinilir. Bol epitel hücresi varlığı materyalin uygun olmadığını gösterir. Gram boyama kadar etkili olmasa da mikroorganizmaların morfolojisi ve mikroskop sahasındaki dizilimi göz önüne alınarak hangi besiyerine ekim yapılacağı hakkında bilgi edinilir. 4. TEMEL BAKTERİ ŞEKİLLERİ Kok: Küresel şekilli hücrelerdir. Basil (Çubuksu): Çubuk şekilli bakterilerdir. Kırılgan görünümlü silindir şeklinde hücrelerdir. Virgül: Virgül şekilli bakterilerdir. Çubuksu bakterilere benzerler ama yarım daire kadar kıvrılmışlardır. Spiral: Spiral şekilli bakterilerdir. Çubuksu fakat kıvrımlı ve dönüşleri olan bakterilerdir.

33 Bu bakterilerin haricinde farklı veya ara formlarda görülebilir. (coccobacillus, Spirochete) Aynı zamanda kok bakterilerinin çoğul formları da farklı isimler alabilir. Örneğin ip gibi yan yana dizilen kok şekilli bakterilere streptokok denirken, kümelenen üzümsü koklara stafilokok adı verilir. İki tane kok bakterisinin bir arada görülmesi diplokok olarak adlandırılır. Kok şekilli bakterilere örnek olarak Neisseria ve Branhamella cinslerinin yanı sıra (diplokok), Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Enterecoccus ve Lactobacilluslar verilebilir. Şekilsel olarak farklı kok formlarının bulunması bölünme planı ile ilişkilendirilmektedir. İki farklı planda bölünen hücreler dörtlü sayıda tetrad adını alırken, 8 li sayıda sarcinae olarak adlandırılmaktadır. Çubuksu bakteriler incelendiği zaman, ikili formları diplobacilli, ya da uc uca eklenen tipleri streptobacilli ya da yan yana gelenleri palisade olarak adlandırılır. Diphteroids, deri ve üst solunum yolları florasında sıklıkla görülen Corynebacterium ların morfolojik şeklidir. Esasen basit streptobacilli şeklindedirler ancak bir araya gelerek kümeler meydana getirirler ve palisade tipli formları meydana getirirler. Virgül ve spiral şekilli bakteriler genellikle tek bulunan hücrelerdir. Morfolojik farklılıklar genellikle yapmış oldukları kıvrımlardan ötürüdür. Klinik mikrobiyoloji de sık görülen türlerdendirler. UYGULAMA Materyal: Metot: Lam Lamel Pastör pipeti, Öze İğne Fizyolojik Serum Metilen mavisi Lamların hazırlanması: Lamı hazırlamadan önce temiz olduklarından emin olun. Temizlemek için sabun ve su ile bolca yıkayıp toz kalmayacak şekilde silerek kurutabilirsiniz. Etil alkol sıkıp daha sonra kuruması için beklenen lamlar kullanım için uygundur. Lamın üzerine cama yazar kalem ile üç tane daire çizin. Smear hazırlanması: Her bir daire içerisine bir damla bakteri örneği aktarın. Aktardığınız damlanın küçük olmasına dikkat edin. Eğer yatık agardan örnek alıyorsanız bir damla su veya serum fizyolojik içerisine örnek aktarılabilir. Havada örnek kurutulur. Ateşten birkaç kez geçirilen lamın üzerindeki bakteriler cama sabitlenir. Örneklerinin boyanması: Boyama için bir tepsi veya kutu kullanılmalıdır. Her bir boya 1 dk boyunca lamlara uygulanır. Daha sonrasında soğuk su ile yıkanan örnekler havada kurutulur. Sırasıyla 4x, 10x ve 40x büyütme oranlarında mikroskopta incelenir. Gerekli görülen örnekleri immersiyon yağı ile 100x te incelenir. Sonuçlar rapora kaydedilir.

34 DENEY 8 MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: GRAM BOYAMA 1. GİRİŞ Komplex boyama; iki farklı renkteki boyanın aynı preparat üzerinde belli tekniklerle ve art arda uygulanması ile gerçekleştirilen bir boyama şeklidir. Komplex boyama tekniklerinde, hücreler birinci boyayla belli bir renge boyanır. Kullanılan bu ilk boyaya primer boya adı verilir. Bu işlemin fonksiyonu, rengi tüm hücreye dağıtmaktır. Birinci boyamayı takiben preparata genellikle bir renk giderme (dekolorizasyon) işlemi uygulanmaktadır. Dekolorizasyon işlemini takiben uygulanan boyalara genel olarak karşıt boya adı verilmektedir. Dekolorize olmuş hücreler karşıt boya ile ilk boyanın renginden farklı bir renge boyanır. Boyanmış hücreden boyayı uzaklaştıran etil alkol gibi maddelere renk giderici ajan (dekolorize edici madde ) denilmektedir. Bazı hücreler diğerlerine göre daha kolay dekolorize olur. Gram boyama ve diğer komplex boyamalarda bakterilerin birbirinden ayırt edilmesinde dekolorizasyon özelliğinden yararlanılmaktadır. Komplex boyamaya; gram boyama yöntemi, spor boyama yöntemleri, flegella boyama yöntemleri, negatif diferansiyel boyama yöntemi (kapsül boyama), yağ boyama yöntemi gibi yöntemler örnek gösterilebilir. Bu laboratuar dersinde, gram boyama yöntemi uygulanacaktır. 2. GRAM BOYAMA Gram boyama, bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki büyük gruba (Gram-pozitif, Gram-negatif) ayırmak için kullanılan empirik bir yöntemdir. Bu metodu bulan kişi, Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram'dır. Bu metodu, 1884 yılında, pnömokoklar (Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae bakterilerini ayırt edebilmek için geliştirmiştir Gram Boyamasında Etkili Olan Mekanizmalar Mikroorganizmaların gram boyamasında, bakteri kültürünün yaşı ve bakteri hücre yapısı ile igili mekanizmalar etkilidir. I. Bakteri hücre yapısı Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde Gram negatiflere kıyasla oldukça kalın peptidoglikan tabaka mevcuttur. Bu nedenle, aldıkları boyayı alkolle dekolarizasyonda gram negatiflere nazaran daha geç bırakırlar. Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde karbonhidratlar, gram negatiflerde lipidler fazladır. Karbonhidratlar alkolle dekolarizasyon esnasında dehidratasyona (su molekülü açığa çıkar) uğrar. Porlar iyice büzüşür, daralır ve boya dışarı çıkamaz. Lipitler için ise alkol çözücüdür ve hücre çeperinde olan porlar daha çok açılacaktır. Gram pozitif hücre çeperinde bulunan teikoik asit, bazik boyalarla daha kuvvetli birleşik oluşmasını sağlar. Gram pozitif hücre çeperinde bulunan magnezyum ribonucleatın gram boyanmada önemli fonksiyonları vardır. Bakteri protoplazmasının ph sıda önemlidir. Gram pozitiflerdeki protoplazmanın ph sı daha asidiktir. II. Bakteri kültürünün yaşı Genel olarak yaşlanmış kültürden elde edilen preparat gramla negatif boyanma eğilimindedir. Gram boyamada kullanılan değişik boya çözeltileri vardır. Bu boyaların hazırlandığı çözeltiye göre boyama süresi değişir. (Toz boya distile su içinde hazırlanırsa Kristal Viole ile boyama 1 dakika iken, amonyum oxalat kullanıldığında kristal viole ile boyamada 30 saniye yeterli olmaktadır.)

35 2.2. Gram Boyama Yönteminin Yararları Mikroorganizmaları gram pozitif ve gram negatif diye iki ana gruba ayırır. Mikroorganizmaların morfolojisi ve dizilimi esas alınarak ön tanı konur. Buna dayanarak izolasyon için uygun besiyeri seçimi yapılır. Örneğin usulüne uygun olup olmadığı hakkında bilgi verir. Anaerobik mikroorganizma olup olmadığı hakkında bilgi verir. Aeroplarda üreme yok; fakat mikroskopta polimikrobiyal özellik gözleniyorsa anaerop olduğu anlaşılır. 3. GRAM POZİTİF VE GRAM NEGATİF BAKTERİLER Hem gram-pozitif bakterilerin hem de gram-neagit bakterilerin S-tabakası denen ayrı bir zarları daha vardır. Gram-negatiflerde s-katmanı, dış zara yapışıktır. Gram-pozitiflerde ise s-katmanı, peptidoglikan tabakasına yapışıktır. Gram-pozitiflerin kendilerine has bir özellikleri hücre duvarlarında teyikoik asit bulundurmalarıdır. Lipoteyikoik asit denen, özel teyikoik asit türünün lipid kısmı, peptidoglikan tabakasının hücreye demirlenmesine yardımcı olur. Şekil 1- Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteri hücre yapısının karşılaştırılması. Gram Pozitifler Gram-pozitif gram boyama prosedüründen geçtikten sonra, mikroskop altında mavi-siyah, mor renk alan bakterilerdir. Bu rengin sebebi gram-pozitif bakterilerin hücre duvarlarının kristal viyole/iyot karışımını tutmasıdır. 80 nm hücre duvarı M protein lipoteikoik asit Yoğun çapraz bağlar Çapraz bağlar dekolorizasyona dirençli Gram-Pozitif bakterilere Actinobakteria Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, ve Clostridium familyaları örnek verilebilir. Gram Negatifler Gram-negatif bakteriler, Gram boyama prosedürü sırasında kristal viyole boyasını tutmayan bakterilerdir. Gram-negatif bakteriler dekolorizasyon işleminden sonra mavi rengi kaybederler ve ikinci boyanın rengini alarak kırmızı-pembe renge boyanırlar. Gram-negatif bakterilerin pek çoğu patojendir. Yani, insanlarda hastalık yapma yetisine sahiplerdir. Bu hastalık yapma yetisi, Gramnegatif hücre duvarının bazı özelliklerinden, isim vermek gerekirse LPS (lipopolisakkarit) içeriğinden kaynaklanmaktadır. LPS'ler endotoksinlerdir.