ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Erman Salih İSTİFLİ AMOXICILLIN ANTİBİYOTİĞİNİN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ AMOXICILLIN ANTİBİYOTİĞİNİN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ Erman Salih İSTİFLİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez../../2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/ Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza İmza... İmza Prof.Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof.Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç.Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Tez Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) Yurtiçi Yüksek Lisans Burs Programı Desteği ile yapılmıştır. Proje No: FEF2007YL31 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ AMOXICILLIN ANTİBİYOTİĞİNİN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ Erman Salih İSTİFLİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Yıl : 2009, Sayfa: 100 Jüri : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Bu çalışma, penisillin türevi bir beta-laktam antibiyotik olan amoxicillin in insanlar için genotoksik risk oluşturup oluşturmadığını, insan periferal kan lenfositlerinde eksojen metabolik aktivatör varlığında ve yokluğunda in vitro kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom anormalliği (KA) ve mikronukleus (MN) testleri ile araştırmak amacıyla yürütülmüştür. Hücreler, eksojen metabolik aktivatör yokluğunda, 400, 600, 800, 1000 µg/ml amoxicillin ile 24 ve 48 saat, eksojen metabolik aktivatör varlığında ise 3 saat boyunca 400, 600, 800, 1000 µg/ml amoxicillin ile muamele edilmişlerdir. Amoxicillin, insan periferal kan lenfositlerinde eksojen metabolik aktivatörün varlığında ve yokluğunda KKD yi ve KA yı uyarmamıştır. Amoxicillin 24 ve 48 saatlik muamelede metabolik aktivatörün bulunmadığı ortamda kontrol ve eritici kontrole nazaran PI yı düşürmemiştir. Eksojen metabolik aktivatör yokluğunda 24 saatlik muamele süresinde PI yı doza bağlı olarak önemli derecede düşürmüş, MI ise 24 saatlik muameleli kültürlerde sadece kontrole nazaran genel olarak düşük bulunmuştur. Bu düşüş 48 saatlik muamelede kontrolle karşılaştırıldığında sadece 600 ve 1000 µg/ml konsantrasyonda görülmüştür. Amoxicillin eksojen metabolik aktivatör varlığında PI ve MI yı düşürmemiştir. Eksojen metabolik aktivator varlığında ve yokluğunda amoxicillin insan periferal kan lenfositlerinde MN oluşumunu uyarmamış, NBI yı ise metabolik aktivatörün bulunmadığı ortamda sadece 24 saatlik muamelede kontrole nazaran genel olarak düşürmüştür. Anahtar Kelimeler: Amoxicillin, İnsan Periferal Kan Lenfositi, Kardeş Kromatid Değişimi (KKD), Kromozom Anormalliği (KA), Mikronukleus (MN) I

4 ABSTRACT MSc THESIS IN VITRO GENOTOXIC EFFECTS OF AMOXICILLIN ON HUMAN PERIPHERAL LYMPHOCYTES Erman Salih İSTİFLİ DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Year : 2009, Pages: 100 Jury : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Assoc. Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI The aim of the present study was to investigate the genotoxic effects of amoxicillin, a commonly prescribed β lactam antibiotic for the treatment of bacterial infections, on human peripheral lymphocytes by using sister chromatid exchange (SCE), chromosomal aberration (CA) and micronucleus (MN) tests. Cells were treated with 400, 600, 800, 1000 µg/ml amoxicillin for 24 and 48 hours in the absence of a metabolic activation system and 400, 600, 800, 1000 µg/ml amoxicillin for 3 hours in the presence of a metabolic activation system. In this study, AMO did not induce SCEs or CAs in human peripheral blood lymphocytes both in the presence and absence of the metabolic activator. AMO did not decrease the proliferation index (PI) in comparison with the control and the solvent control for 24- and 48-hr treatment periods. In 24-hr treatment period, AMO concentration-dependently decreased the proliferation index (PI) in the absence of the metabolic activation, and mitotic index (MI) was generally found to have been reduced when compared with the control but not with the solvent control. 48-hr treatment with AMO induced significant decreases in MI at certain concentrations (600 and 1000 µg/ml) when compared to the control. AMO did not decrease the PI and MI in the presence of the metabolic activator. AMO did not induce the formation of MN in human peripheral blood lymphocytes both in the presence and absence of the metabolic activator. In addition, the only statistically significant reduction in the NDI was observed when compared with control for 24-hr treatment in the absence of the metabolic activator. Key words: Amoxicillin, Human Peripheral Blood Lymphocytes, Sister Chromatid Exchange (SCE), Chromosomal Aberration (CA), Micronucleus (MN) II

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım sırasında bana her açıdan destek olan, yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen ve kişisel gelişimimde sonsuz sabır gösteren danışman hocam sayın Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a en içten teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım esnasında, her konuda çok büyük yardımlarını gördüğüm sayın hocam Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI na teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım sırasında yine çok büyük yardımlarını gördüğüm, Doç. Dr. Hasan Basri İLA ya, Arş. Gör. Ayşe Yavuz KOCAMAN a, Arş. Gör. Süleyman BAYRAM a, Biyolog Mehmet BÜYÜKLEYLA ya, Biyolog A. Mine YILDIZ a ve Biyolog Semir CANIMOĞLU na teşekkür ederim. Çalışmalarım sırasında manevi ve maddi açıdan bana her zaman destek olan annem Müjgan İSTİFLİ ye, babam İhsan Sami İSTİFLİ ye ve kardeşim Müge İSTİFLİ ye sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, bu yüksek lisans çalışmasını maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu ile Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) na teşekkürü bir borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ......I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKİLER...IV SİMGELER VE KISALTMALAR...X ÇİZELGELER DİZİNİ...XIII ŞEKİLLER DİZİNİ...XV 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hücre Duvarı Sentezini İnhibe Eden Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Beta-Laktam Grubu Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Amoxicillin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Benzathine penisillin G (BPG) ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Cloxacillin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Lactam 1 ve Lactam 12 ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Piperacillin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Çeşitli Penicillinler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Folat Sentezini İnhibe Eden Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sulfonamidler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sulfamethoxazole Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Trimethoprim ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sitoplazmik Membranın Fonksiyonunu Bozan Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Polyene Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları...13 IV

7 Tetrapol A159 ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Protein Biyosentezini Bloke Eden Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Aminoglukozid Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Neomycin Antibiyotiği ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Chloramphenicol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Macrolide Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Clarithromycin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Spectinomycin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Spiramycin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Tetracycline Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Azithromycin ve Doxycycline ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Oxytetracycline ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Tetracycline Anitibiyotiği ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Nukleik Asit Biyosentezini ve Fonksiyonunu İnhibe Eden Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları DNA Biyosentezi ve Fonksiyonunu İnhibe Eden Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Ciprofloxacin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Lomefloxacin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Ofloxacin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Çeşitli Kinolonlar ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları RNA Biyosentezi ve Fonksiyonunu İnhibe Eden Antibiyotikler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Rifampicin Anitibiyotiği ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları...23 V

8 3. MATERYAL VE METOD Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Kullanılan Kimyasal Maddeler Amoxicillin (1). β-laktamların Genel Özellikleri (2). β-laktam Antibiyotiklerin Etki Mekanizması (3). β-laktam Antibiyotiklerin Yan Etkileri (4). Amoxicillin in Özellikleri (Sigma) Mitomycin C (MMC) (Sigma) Cyclophosphamide monohydrate Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Kromozom Mediumu Kolkisin (Sigma) Hipotonik Eriyik Fiksatif '-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdUrd) (Sigma) Sorensen Tamponu Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği Giemsa (Merck) Entellan (Merck) Nitrik Asit (HNO 3 ) Cytochalasin B (Sigma) Standart S9 mix (Memeli Karaciğer Fraksiyonu [S9]) Sıçan Karaciğer Enzimlerinin İndüklenmesi Karaciğerin Alınması Karaciğer Homojenat S9 Fraksiyonlarının Hazırlanması Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Santrifüj Mikroskop İnkübatör...36 VI

9 Flow Kabin (Steril Kabin) Su Banyosu Lamların Temizlenmesi Sterilizasyon BrdUrd Eriyiğinin Sterilizasyonu Cyclophosphamide monohydrate nin Sterilizasyonu Saf Suyun Sterilizasyonu Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosome Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix li test) Preparatların Boyanması ve Daimi Preparatların Hazırlanması Daimi Preparatlarda Mikroskobik İnceleme KKD Sayısının ve Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması KKD Sayısının Saptanması Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon indeksi=ri) Saptanması Kromozom Anormallikleri (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Mikronukleus (MN) Testi İçin Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması VII

10 (S9 mix li test) Preparatların Boyanması Mikronukleus Testi İçin Hazırlanan Preparatlarda Mikroskobik İnceleme Mikronukleus Sayısı ve Nukleus Bölünme İndeksinin (NBI) Saptanması Mikroskopta Fotoğraf Çekme İstatistiksel Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi BULGULAR Amoxicillin in Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunmayan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri Amoxicillin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in Kromozom Anormalliklerinin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in Eksojen Metabolik Aktivatör (S9 mix) Bulunan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri Amoxicillin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in Kromozom Anormalliklerinin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri...77 VIII

11 5. TARTIŞMA Amoxicillin in Kardeş Kromatid Değişimleri (KKD) ve Kromozom Aberasyonları (KA) Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in Mikronukleus (MN) Oluşumları Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in Hücre Proliferasyonu, Mitoz Bölünme ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri SONUÇ VE ÖNERİLER...88 KAYNAKLAR...89 ÖZGEÇMİŞ IX

12 SİMGELER VE KISALTMALAR ADRs : Adverse Drug Reactions AGS : İnsan Adenokarsinoma Hücreleri ATM : Atmosfer B' : Kromatid Kırığı B'' : Kromozom Kırığı BALB/cJ: Bagg albino/color locus BKÇ : Baz-kesip Çıkarma Onarım Yolu BPG : Benzathine Penisillin G BrdUrd : 5'-bromo-2'-deoxyuridine CA : Chromosome Aberration CBPI : Cytokinesis Block Proliferation Index CFW : Swiss Webster CHO : Chinese Hamster Ovary CHL : Chinese Hamster Lung Cells CPFX : Ciprofloxacin Cyp : Cyclophosphamide monohydrate Cyt-B : Cytochalasin-B DMSO : Dimethyl Sulfoxide DNA : De(z)oksiribonukleik asit DS : Disentrik Kromozom dt : Deoxytimidin du : Deoxyuridine EK : Eritici kontrol ENX : Enoxacin F : Fragment G-6-P : Glukoz-6-fosfat GLP : Good Laboratory Practices GSA : Green Screen Assay IPCS : International Programme on Chemical Safety X

13 i.m : İntramüsküler i.p. : İntraperitonal KA : Kromozomal Anormallik KCl : Potasyum klorür KD : Kromatid Değişimi KKB : Kardeş Kromatid Birleşmesi KKD : Kardeş Kromatid Değişimi MD : Menkes Disease MGA : Minimal Glukoz Agar MgCl 2 : Magnezyum Klorür MI : Mitotik İndeks MMC : Mitomycin C MN : Mikronukleus MNBC : Micronucleated binucleated cell MNBN : Mikronukleuslu binukleer hücre MNPCE : Mikronukleuslu polikromatik eritrosit NA : Nalidixic acid NaCl : Sodyum klorür NADP : Nikotinamid adenin dinukleotid fosfat NAM : N-Asetilmuramik asit NAG : N-Asetilglukozamin NBI : Nukleus Bölünme İndeksi NFLX : Norfloxacin NIH : National Institutes of Health NKÇ : Nukleotid kesip-çıkarma onarım yolu NTP : National Toxicology Program OECD : Organisation for Economic Co-operation and Development OFLX : Ofloxacin P : Poliploidi PA : Piromidic acid PARP : Poly [ADP-riboz] polimeraz XI

14 PBPs : Penicillin-binding proteins PI : Proliferasyon İndeksi PK : Pozitif kontrol PPA : Pipedimic acid PRI : Proliferative Rate Index RI : Replikasyon İndeksi RMP : Rifampicin RPM : Revolutions per minute RPMI : Roswell Park Memorial Institute mediumu ROS : Reactive Oxygen Species S9 mix : Memeli Karaciğer Fraksiyonu [S9] SCD : Sister Chromatid Differentiation SCE : Sister Chromatid Exchange SSB : Single Strand Breaks SSC : Standard Saline Citrate T : Translokasyon UDS : Unscheduled DNA synthesis UV : Ultraviyole WD : Wilson Disease WHO : World Health Organization VC : Vitamin C VE : Vitamin E XII

15 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Değişik Dozlarda Amoxicillin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı...55 Çizelge 4.2. Değişik Dozlarda Amoxicillin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/Hücre...57 Çizelge 4.3. Değişik Dozlarda Amoxicillin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI)...62 Çizelge 4.4. Değişik Dozlarda Amoxicillin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde MN İçeren İki Nukleuslu Hücre % si, MN % si ve NBI...65 Çizelge 4.5. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı...67 Çizelge 4.6. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/Hücre...69 Çizelge 4.7. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI)...77 Çizelge 4.8. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş Olan İnsan XIII

16 Periferal Kan Lenfositlerinde MN İçeren İki Nukleuslu Hücre % si, MN % si ve NBI...78 XIV

17 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Kardeş Kromatid Değişimi nin Olduğu ve Olmadığı Durumun Şematik Olarak Gösterilmesi (Topaktaş ve Speit, 1990)...42 Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (du) in kimyasal yapıları...43 Şekil 3.3. BrdUrd nin DNA Yapısına Girmesi ile Birinci, İkinci ve Üçüncü Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücrelerin Ayırt Edilmesinin Şematik Olarak Açıklanması (During, 1985: Topaktaş ve Speit, 1990 dan)...45 Şekil 3.4. Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000)...46 Şekil 3.5. İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000)...46 Şekil 3.6. Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000)...47 Şekil 3.7. Bir nukleuslu hücre (X1000)...51 Şekil 3.8. İki nukleuslu hücre (X1000)...52 Şekil 3.9. Üç nukleuslu hücre (X1000)...52 Şekil Dört nukleuslu hücre (X1000)...53 Şekil 4.1. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil 4.2. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil 4.3. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil 4.4. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil 4.5. Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil 4.6. Fragment (F) bulunan metafaz plağı XV

18 (600 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil 4.7. Disentrik kromozom (DS) bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin, 24 saatlik muamele, ). X Şekil 4.8. Poliploid hücre (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil 4.9. Farklı Dozlarda Amoxicillin İle 24 saat muamele edilmiş insan periferal kan lenfositlerinde PI nın doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı Şekil Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (600 µg/ml Amoxicillin, 24 saatlik muamele, ). X Şekil İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (600 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X Şekil Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Fragment (F) bulunan metafaz plağı (600 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Fragment (F) bulunan metafaz plağı (600 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Fragment (F) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Kardeş kromatid birleşmesi (KKB) bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X XVI

19 Şekil Kardeş kromatid birleşmesi (KKB) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Kromatid değişimi (KD) bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Translokasyon (T) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Disentrik kromozom (DS) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Şekil Büyük bir mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (600 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X XVII

20 1. GİRİŞ Erman Salih İSTİFLİ 1. GİRİŞ İnsanlarda bakterilerin yol açtığı çeşitli hastalıklaraa karşı kullanılan antibiyotik bileşiklerii 20. yüzyıla kadar izole edilmemiş ve tanımlanmamış olsa da, antibiyotikler ilk olarak 2500 yıl önce eski Çinli ler tarafından kullanılmıştır. Günümüzde ise in üzerinde antibiyotik olduğu bildirilmektedir ve halihazırda milyar dolar düzeyinde bir antibiyotik piyasası her yıl büyümeyee devam etmektedir ( Bu çalışmanınn test maddesi olan amoxicillin bir penisillinn türevi antibiyotik olup, beta-laktam (beta-laktam halkası içeren) grubu antibiyotikler arasında yer almaktadır. Beta-laktam antibiyotiklerin ortaya çıkışı, Alexander Fleming in 1928 de Penicillium mayasından salgılanan bir antibakteriyel ajan olan penisillin i saptaması ile başlamıştır (Fleming, 1929). Beta-laktam antibiyotik sahasının ana gelişimi ise, 1960 lı yılların başında yarısentetik (semisentetik) penisillinler ve bununn hemen ardından gelen yarısentetik (semisentetik) sefalosporinler ve diğer beta-laktamların üretimine dayanır (Rolinson, 1952). Çeşitli çalışmalarda amoxicillin in insan hücrelerindeki genomik DNA ile etkileşime girebilen reaktif oksijen türevlerinin oluşumunuu uyararak DNA hasarına yol açabildiği gösterilmiştir (Quinlan ve Gutteridge, 1988; Quinlan ve Gutteridge, 1991; Arabski ve ark. 2005; Li ve ark. 2007). Amoxicillin in eksojen metabolik aktivatör yokluğunda polimorfik nuklear nötrofillerdeki süperoksit (O ) radikali üretimini artırdığı belirlenmiştir (Reynaert ve ark. 2009). Ancak, tüm bu çalışmalar, moleküler düzeydeki çalışmalar olup, amoxicillin tedavisinin sitogenetik düzeydeki etkilerii araştırılmamıştır. Kromozom mutasyonları ve ilgili genetik değişimler birçok insan genetik hastalıklarının sebebidir ve somatik hücrelerin onkogen ya da tümör supressör genlerinde değişimlere sebep olan kromozom mutasyonları ve ilgili olayların insanlarda ve deney hayvanlarında kanserinn uyarılmasında rol aldığına dair birçok kanıt bulunmaktadır (OECD TG ). Bundan dolayı ilaç ve kimyasalların potansiyel zararlı etkileri göz önüne alındığında, yeni ilaçların yaygın kullanımlarına bağlı olarak genotoksik etkilerinin test edilmesi önem arz etmektedir (Jaju, 1984). 1

21 1. GİRİŞ Erman Salih İSTİFLİ Mutajen ve kanserojenlerin genotoksik risklerini belirlemede kullanılan en hassas yöntemlerden biri, periferal kan lenfositlerindeki kromozom anormalliği (KA) frekansının değerlendirilmesidir (Carrano ve Natarajan, 1988; Anderson, 1988; Hagmar ve ark. 1994). Kromozom anormallikleri DNA düzeyindeki zararın bir sonucu olarak ortaya çıkar. Örneğin, kromozom kırıkları DNA daki onarılmamış çift zincir kırıklarından ve yeni yapıya sahip kromozomların meydana gelmesi de, DNA daki zincir kırıklarının yanlış onarılmasından kaynaklanabilir (Savage, 1993). KA oluşum mekanizmasının farklı dokularda benzer olmasından dolayı, lenfositlerdeki anormallik seviyesinin, kansere eğilimli dokulardaki anormallik seviyesini gösterdiği ve böylece kanser riskinin de göstergesi olduğu düşünülmektedir (Albertini ve ark., 2000; Bonassi ve ark. 2000; 2004; 2005; 2007). Yüksek KA frekansı (gap hariç), KA artışını başlatan sebebe bakmaksızın yüksek kanser riski olduğunu önceden gösterebilir. Hem kromatid tipi hem de kromozom tipi KA ları kanser riskinin göstergesidir. Fakat kromozom tipi KA lerinin kromatid tipi KA lerine göre daha iyi bir belirleyici olduğuna dair kanıtlar vardır (Norppa, 2004; Norppa ve ark. 2006; Boffetta ve ark. 2006). Genotoksik riski belirlemede kullanılan diğer yöntemlerden biri, periferal kan lenfositlerindeki kardeş kromatid değişimi (KKD) frekansının belirlenmesidir (Tucker ve ark. 1993). Kardeş kromatid değişimleri, DNA çift zincir kırıklarının homolog rekombinasyon yoluyla onarılmasını gösteren kardeş kromatidlerin homolog lokusları arasında DNA replikasyon ürünlerinin değişimidir (Sonoda ve ark. 1999; Helleday, 2003). Mutajen ve kanserojen olduğu bilinen maddelere maruz kalan insan ve hayvanların hücrelerinde KKD frekansının arttığı bulunmuştur (Perry ve Evans, 1975; Albertini ve ark. 2000). Ayrıca, tek-gen mutasyonlarının artışı ile KKD frekansı arasında lineer bir ilişki olduğu da saptanmıştır (Carrano ve ark, 1978). Benzer bir ilişkinin KKD nin artışıyla in vivo tümörlerin oluşumu arasında da olduğu Cheng ve ark. (1981) tarafından bildirilmiştir. KA nin aksine KKD tek başına genotoksik riski belirlemede yetersizdir. Fakat, KKD deneysel çalışmalarda indikatör test olarak insanlarda genotoksik etkileri göstermede uygun bir yöntem olarak kullanılmaya devam etmektedir (Norppa ve ark. 2006). 2

22 1. GİRİŞ Erman Salih İSTİFLİ Genotoksisite ve kanserojenitenin belirlenmesinde kullanılan sitogenetik metodlardan bir diğeri ise mikronukleus (MN) testidir (Heddle ve ark. 1991; Fenech, 2002). Bonassi ve ark. (2007) na göre periferal kan lenfositlerindeki yüksek MN frekansı insanlarda kanser riskini göstermektedir. Periferal kan lenfositlerinde kromozom hasarı olarak MN un kullanılması ilk kez 1976 yılında Contryman ve Heddle tarafından öne sürülmüştür (Bonassi ve ark. 2001). Daha sonra sitokinezbloklama mikronukleus metodunun Fenech ve Morley (1985) tarafından geliştirilmesiyle, nukleus bölünmesini tamamlamış hücrelerdeki MN lar incelenmeye başlanmıştır. MN asentrik kromozom ya da kromatid kırıklarından ve tüm kromozomlar ya da kromatidlerin anafazda geri kalmasından dolayı (kalgın kromozom) telofazda oluşan kardeş nukleusun dışında rastlanan küçük nukleuslardır (Surrallés ve ark. 1995). Ayrıca multipolar anafaz ve telofaz da MN oluşumuna sebep olmaktadır (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995). MN oluşumuna neden olabilen kromozom kaybı ya da kromozomların ayrılamaması (non-disjunction) kanser ve yaşlanmada gözlenen önemli olaylardan biridir. Bu durum, muhtemelen iğ iplikçiklerinde, sentromerde bozulma ya da metafazdan önce kromozom yapısının yoğunlaşması sonucu oluşmaktadır (Dellarco ve ark. 1985). Böylece, MN testi ile hem klastojenik hem de anöjenik etkiler belirlenebilmektedir (Kirsch-Volders ve ark. 1997; Norppa ve Falck, 2003). Yapılan çalışmalarda, kanser hastalarından alınan periferal kan lenfositlerindeki MN frekansında belirlenen artış, kanser oluşan hedef dokudaki MN frekansı kadar bulunmuştur (Cheng ve ark. 1996; Duffaud ve ark. 1997). Ayrıca, Fenech ve ark. (1999) nın, uluslararası işbirliği ile yaptıkları insan mikronukleus projesindeki bulguları, MN ile kanser arasındaki ilişkiyi açıkça desteklemiştir. Beta-laktam grubu antibiyotiklerle yapılan genotoksisite çalışmalarının bazıları şunlardır: Smith ve ark. (2002) laktam 1 adlı antibiyotiğin tümör hücrelerinde apoptozu uyarma etkilerini çalışmışlar ve bu yolakta rol alan protein faktörlerini tanımlamışlardır. Bu amaç ile insan lösemi Jurkat T hücrelerini 50 µm laktam 1 ile 2, 4, 6, 8, 12 ve 24 saat boyunca muamele etmişlerdir. 4 saatlik muameleden sonra PARP (poly [ADP-riboz] polimeraz) ın parçalanma ürünü olan p85 belirlenmiş ve 3

23 1. GİRİŞ Erman Salih İSTİFLİ muamele süresi arttıkça bu ürünün miktarı da artmıştır. Bununla bağlantılı olarak, tripan mavisi canlılık testinde (trypan blue exclusion assay) yaşama kabiliyeti düşük olan hücre populasyonlarının muamelenin 4. saatinde % 20 arttığı ve 24 saatlik muamele sonucunda bu artışın % 60 a ulaştığı saptanmıştır. Araştırıcılar laktam 1 tarafından uyarılan apoptoz olayında rol alan kaspazları da tanımlamışlardır. Buna göre sırasıyla kaspaz 8, kaspaz 9 ve kaspaz 3 ün aktive olduğunu saptamışlardır. Ek olarak, kaspaz 3 aktivasyonunda gözlenen artışın PARP parçalanması ile paralel olduğunu da belirlemişlerdir. Bu paralelliğin sebebi olarak PARP parçalanmasından kaspaz 3 ün sorumlu olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar laktam 1 in mitokondriden sitokrom c nin salınımına neden olup olmadığını da araştırmışlardır. Buna göre insan lösemi Jurkat T hücreleri 1 12 saat arasında değişen zamanlarda laktam 1 ile muamele edilmiş ve ardından sitosolik ve mitokondriyal fraksiyonlar izole edilerek sitokrom c düzeyleri ölçülmüştür. Kontrol grubunda yüksek düzeyde mitokondriyal sitokrom c ve düşük düzeyde sitosolik sitokrom c ölçülmüştür. Bununla birlikte, laktam 1 ile 2 ve 4 saat muamele edilen hücrelerde mitokondriyal sitokrom c düzeyi düşüşe geçmiş ve sitosolik sitokrom c düzeyi önemli derecede artış göstermiştir. 6 saatlik muameleden sonra ise mitokondriyal sitokrom c düzeyi daha da düşerken, sitosolik sitokrom c miktarı da azalmaya başlamıştır. Bu gözlem apoptozun ilerleyen basamaklarında sitosolik sitokrom c nin de kaybedildiğini göstermektedir. Araştırıcılar, selektif olarak insan lösemi Jurkat T hücrelerinde apoptozu uyarmasından dolayı, bir kurşunlu bileşik olan laktam 1 in yeni bir antikanser ilacı olabileceğini bildirmişlerdir. Kazi ve ark. (2004) laktam 12 adlı antibiyotiğin insan lösemi Jurkat T hücrelerinde apoptozu daha baskın bir şekilde indüklediğini ve laktam 1 gibi insan prostat kanser hücrelerinde koloni oluşumunu etkili bir şekilde inhibe ettiğini göstermişlerdir. Laktam 12 aynı zamanda insan göğüs, prostat ve kafa-boyun kanser hücrelerinde apoptozu indüklemiş, Jurkat T, simian virüs - 40 tarafından transforme edilmiş fibroblastlar ve transforme edilmemiş kontrol grubu fibroblastlar arasından seçici olarak Jurkat T ve transforme edilmiş fibroblastlarda apoptozu uyarması nedeniyle bu beta-laktam grubu antibiyotiklerin antikanser ilaçları olarak geliştirilebileceği önerilmiştir. 4

24 1. GİRİŞ Erman Salih İSTİFLİ Jaju (1984) tarafından ampicillin ve karbenicillin antibiyotiklerinin insan lenfositleri üzerindeki in vitro genotoksik etkileri araştırılmıştır. Her iki ilaç da plazma konsantrasyonunda ( µg/ml ampicillin, µg/ml carbenicillin) kromozom aberasyonları, satellit birleşmeleri, mitotik indeks ve hücre bölünme hızı (cell turnover rate) frekansını etkilememiştir. Bununla birlikte plazma düzeyinin üzerindeki konsantrasyonlarda tüm bu parametrelerin değiştiği bildirilmiştir. Zavarise ve ark. (1984) cloxacillin in kromozomal değişimler ve KKD (kardeş kromatid değişimi) üzerindeki etkilerini kültüre edilmiş insan lenfositlerinde antibiyotiğin değişik dozlarını kullanarak araştırmışlardır. Araştırıcılar yüksek dozda antibiyotik muamelesinin kromozomal değişimleri uyardığını, bununla birlikte rutin tedavide kullanılan dozların kromozomal değişimleri indüklemediğini bildirmişlerdir. Stemp ve ark. (1989) beta-laktam grubuna giren ampicillin, carbenicillin ve penicillin VK antibiyotiklerinin in vitro ve in vivo klastojenik potansiyellerini kültüre edilmiş insan lenfositleri ve sıçan mikronukleus testi ile araştırmışlardır. Hem ampicillin hem de carbenicillin in vitro koşullarda 10 mg/ml ye kadar, kromozom hasarlarında istatistiksel olarak artışa neden olmamışlardır. Her iki antibiyotik aynı zamanda in vivo sıçan mikronukleus testinde tek ya da çift doz rejimlerinde de negatif sonuç vermişlerdir (ampicillin 5g/kg oral; carbenicillin 500 mg/kg i.m., kemik iliği preparasyonundan 30 saat önce bir defa, ya da kemik iliği preparasyonundan 48 ya da 24 saat önce olmak üzere iki defa). Penicillin VK ise in vitro da kromozom ve kromatid tipi gap ve kırıklarda 1.25 mg/ml ye kadar doza bağlı artışa neden olmuştur. Araştırıcılar yüksek potasyum iyonu konsantrasyonunun hücrelerdeki aberasyon frekansının yükselmesinden kısmen sorumlu olduğunu bildirmişlerdir. Ancak penisillin VK in vivo mikronukleus testinde klastojenik etki göstermemiştir (bir defa oral yoldan 0.3 ya da 0.5 g/kg, preparasyondan 30 saat önce, ya da iki defa 0.5 ya da 0.8 g/kg, preparasyondan 48 ve 24 saat önce). Araştırıcılar penicillin VK nın in vitro deneyde yüksek dozda uyardığı klastojenik etkilerin aynı antibiyotiğin in vivo da tedavi edici dozlarıyla bir bağlantısı olmadığını belirtmişlerdir. 5

25 1. GİRİŞ Erman Salih İSTİFLİ Benzathine penisillin G (BPG) nin genotoksik etkileri insan periferal kan lenfositlerinde KKD testi ile araştırılmıştır (Köseoğlu ve ark. 2004). Dokuz sağlıklı bireyden elde edilen periferal kan lenfositleri 3 gün boyunca kültüre alınmış ve 0.002, 0.02 ve 0.1 µg/ml konsantrasyonlarda BPG ile muamele edilmişlerdir. Tüm muameleli gruplar karşılaştırıldığında KKD frekansları arasında bir değişiklik kaydedilmemiştir. Ayrıca BPG hiçbir muameleli grupta KKD frekansında doza bağlı bir artışa neden olmamıştır (P>0.05). Piperacillin antibiyotiğinin üretim ve depolama aşamalarında meydana gelen başlıca bozunma ürünü piperacillin impurity-a nın genotoksisitesi Ames testi ve kromozomal aberasyon testinde araştırılmıştır (Vijayan ve ark. 2007). Metabolik aktivatör varlığında ve yokluğunda Salmonella typhimurium suşlarının kullanıldığı Ames testinde mutajenik aktivitenin göstergesi olan revertant sayısında artış olmamış, sitotoksisitenin göstergesi olan bakteriyel bölünmede de 5 mg/plak dozda inhibisyon görülmemiştir. Benzer şekilde, Çin hamster i hücrelerinin kullanıldığı kromozomal aberasyon testinde de 5 mg/kültür dozda kontrol ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak önemli bir değişim saptanmamıştır. Elde edilen sonuçlara göre Piperacillin impurity-a Ames ve kromozomal aberasyon testlerinde sırasıyla mutajenik ya da klastojenik bulunmamıştır. Arabski ve ark. (2005) comet testinde, amoxicillin antibiyotiğinin reaktif oksijen türlerinin oluşumu yoluyla insan periferal kan lenfositleri ve mide mukoza hücrelerinde DNA zincir kırıkları ve/veya baz modifikasyonunu indükleyebildiğini ve DNA hasarının indüklenmesinde ilacın hücresel aktivasyonunun gerekli olduğunu bildirmişlerdir. Amoxicillin antibiyotiği kültüre edilmiş insan ve hamster hücrelerine verilmiş, meydana gelen DNA hasarları nuklear ekstrakt inkübasyonlu comet testi ile değerlendirilmiştir (Li ve ark. 2007). 5 mm konsantrasyondaki amoxicillin insan AGS (insan adenokarsinoma hücreleri) hücrelerinde DNA lezyonlarını hızlı bir şekilde uyarmıştır. DNA lezyonlarının düzeyi 1 saat içerisinde maksimuma çıkmış, bunu takiben devamlı düşüşe geçmiş ve ilaç uygulamasından 6 saat sonra hemen hemen kontrol düzeyine inmiştir. Araştırıcılar onarım kinetiği çalışmalarında, hücreleri amoxicillin ile 1 saat muamele etmişler ve izleyen analiz aşamalarından 6

26 1. GİRİŞ Erman Salih İSTİFLİ önce belli bir müddet antibiyotiğin yokluğunda hücreleri inkübe etmeye devam etmişlerdir. Amoxicillin tarafından indüklenen DNA lezyonlarının tamiri temel olarak 4 saat içerisinde tamamlanmıştır. Araştırıcılar bu gibi bir onarımda nukleotid kesip-çıkarma (NKÇ) onarım yolunun bir rolünün olamayabileceğine kanaat getirmişler, nedeninin ise hem NKÇ onarımı yapabilen Chinese hamster CHO-K1 hücrelerinde hem de CHO-K1 hücrelerinin isogenik hattı olan NKÇ yapamayan UV24 hücrelerinde onarımın birbirine benzer kinetikler ile tamamlanması olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılara göre bu onarımda rol alan mekanizma baz-kesip çıkarma (BKÇ) onarım yoludur. Çünkü, BKÇ onarımında rol alan OGG1/2 lerin (BKÇ ile ilgili glikozilazlar) deney ortamından uzaklaştırılması sonucunda nukleus ekstraktı, amoxicillin tarafından uyarılan DNA lezyonlarını kesip çıkarmada başarısız olmuştur. Buna ek olarak, amoxicillin tarafından uyarılan reaktif oksijen türleri (ROS) ile DNA lezyonlarının oluşum hızı arasında bir paralellik bulunmuştur. Amoxicillin in memeli hücrelerinde ROS yolu ile oksidatif DNA hasarına neden olduğu saptanmıştır. Görüldüğü gibi bir penisillin türevi olan ve beta-laktam grubuna giren amoxicillin antibiyotiğinin insan periferal kan lenfositlerinde genotoksik etkisi araştırılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, amoxicillin antibiyotiğinin insan periferal kan lenfositlerinde metabolik aktivatör varlığında ve yokluğunda genotoksik etkiye sahip olup olmadığını in vitro KKD (kardeş kromatid değişimi), KA (kromozomal aberasyon) ve MN (mikronukleus) testleri ile araştırmaktır. 7

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan amoxicilin antibiyotiği betalaktam antibiyotik grubuna girmektedir. Antibiyotiklerle yapılan genotoksisite çalışmaları şu şekilde özetlenebilir Hücre Duvarı Sentezini İnhibe Eden Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Beta-Laktam Grubu Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Amoxicillin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Amoxicillin antibiyotiği kültüre edilmiş insan ve hamster hücrelerine verilmiş, meydana gelen DNA hasarları nuklear ekstrakt inkübasyonlu comet testi ile değerlendirilmiştir (Li ve ark. 2007). 5 mm konsantrasyondaki amoxicillin insan AGS (gastrik adenokarsinom hücreleri) hücrelerinde DNA lezyonlarını hızlı bir şekilde uyarmıştır. DNA lezyonlarının düzeyi 1 saat içerisinde maksimuma çıkmış, bunu takiben devamlı düşüşe geçmiş ve ilaç uygulamasından 6 saat sonra hemen hemen kontrol düzeyine inmiştir. Araştırıcılar onarım kinetiği üzerinde çalışmışlar, bu amaçla hücreleri amoxicillin ile 1 saat muamele etmişler ve izleyen analiz aşamalarından önce belli bir müddet antibiyotiğin yokluğunda hücreleri inkübe etmeye devam etmişlerdir. Amoxicillin tarafından indüklenen DNA lezyonlarının tamiri temel olarak 4 saat içerisinde tamamlanmıştır. Araştırıcılar bu gibi bir onarımda nukleotid kesip-çıkarma onarım yolunun (NKÇ) bir rolünün olamayabileceğine kanaat getirmişler, nedeninin ise hem NKÇ onarımı yapabilen Chinese hamster CHO-K1 hücrelerinde, hem de CHO-K1 hücrelerinin isogenik hattı olan NKÇ yapamayan UV24 hücrelerinde onarımın birbirine benzer kinetikler ile tamamlanması olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılara göre bu onarımda rol alan mekanizma baz-kesip çıkarma onarım yoludur (BKÇ). Çünkü, BKÇ onarımında rol alan OGG1/2 lerin (BKÇ ile ilgili glikozilazlar) deney ortamından uzaklaştırılması 8

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ sonucunda nukleus ekstraktı, amoxicillin tarafından uyarılan DNA lezyonlarını kesip çıkarmada başarısız olmuştur. Buna ek olarak aynı araştırıcılar amoxicillin tarafından uyarılan reaktif oksijen türleri (ROS) ile DNA lezyonlarının oluşum hızı arasında bir paralellik bulunmuştur. Amoxicillin in memeli hücrelerinde ROS yolu ile oksidatif DNA hasarına neden olduğu saptanmıştır. Arabski ve ark. (2005) comet testinde amoxicillin antibiyotiğinin reaktif oksijen türlerinin oluşumu yoluyla insan periferal kan lenfositleri ve mide mukoza hücrelerinde DNA zincir kırıkları ve/veya baz modifikasyonunu indükleyebildiğini ve DNA hasarının indüklenmesinde ilacın hücresel aktivasyonunun gerekli olduğunu bildirmişlerdir Benzathine penisillin G (BPG) İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Benzathine penisillin G (BPG) nin genotoksik etkileri insan periferal kan lenfositlerinde KKD testi ile araştırılmıştır (Köseoğlu ve ark. 2004). Dokuz sağlıklı bireyden elde edilen periferal kan lenfositleri 3 gün boyunca kültüre alınmış ve 0.002, 0.02 ve 0.1 µg/ml konsantrasyonlarda BPG ile muamele edilmişlerdir. Tüm muameleli gruplar karşılaştırıldığında KKD frekansları arasında bir değişiklik kaydedilmemiştir. Ayrıca BPG hiçbir muameleli grupta KKD frekansında doza bağlı bir artışa neden olmamıştır (P>0.05) Cloxacillin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Zavarise ve ark. (1984) cloxacillin in kromozomal değişimler ve KKD (kardeş kromatid değişimi) üzerindeki etkilerini kültüre edilmiş insan lenfositlerinde antibiyotiğin değişik dozlarını kullanarak araştırmışlardır. Araştırıcılar yüksek dozda antibiyotik muamelesinin kromozomal değişimleri uyardığını, bununla birlikte rutin tedavide kullanılan dozların kromozomal değişimleri indüklemediğini bildirmişlerdir. 9

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ Lactam 1 ve Lactam 12 İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Smith ve ark. (2002) laktam 1 adlı antibiyotiğin tümör hücrelerinde apoptozu uyarma etkilerini çalışmışlar ve bu yolakta rol alan protein faktörleri tanımlamışlardır. Bu amaç ile insan lösemi Jurkat T hücrelerini 50 µm laktam 1 ile 2, 4, 6, 8, 12 ve 24 saat boyunca muamele etmişlerdir. 4 saatlik muameleden sonra PARP (poly [ADP-riboz] polimeraz) ın parçalanma ürünü olan p85 belirlenmiş ve muamele süresi arttıkça bu ürünün miktarı da artmıştır. Bununla bağlantılı olarak, tripan mavisi canlılık testinde (trypan blue exclusion assay) yaşama kabiliyeti düşük olan hücre populasyonlarının muamelenin 4. saatinde % 20 arttığı ve 24 saatlik muamele sonucunda bu artışın % 60 a ulaştığı saptanmıştır. Araştırıcılar laktam 1 tarafından uyarılan apoptoz olayında rol alan kaspazları da tanımlamışlardır. Buna göre sırasıyla kaspaz 8, kaspaz 9 ve kaspaz 3 ün aktive olduğunu saptamışlardır. Ek olarak, kaspaz 3 aktivasyonunda gözlenen artışın PARP parçalanması ile paralel olduğunu da saptamışlardır. Bu paralelliğin sebebi olarak PARP parçalanmasından kaspaz 3 ün sorumlu olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar laktam 1 in mitokondriden sitokrom c nin salınımına neden olup olmadığını da araştırmışlardır. Buna göre insan lösemi jurkat T hücreleri 1-12 saat arasında değişen zamanlarda laktam 1 ile muamele edilmiş ve ardından sitosolik ve mitokondriyal fraksiyonlar izole edilerek sitokrom c düzeyleri ölçülmüştür. Kontrol grubunda yüksek düzeyde mitokondriyal sitokrom c ve düşük düzeyde sitosolik sitokrom c ölçülmüştür. Bununla birlikte, laktam 1 ile 2 ve 4 saat muamele edilen hücrelerde mitokondriyal sitokrom c düzeyi düşüşe geçmiş ve sitosolik sitokrom c düzeyi önemli derecede artış göstermiştir. 6 saatlik muameleden sonra ise mitokondriyal sitokrom c düzeyi daha da düşerken, sitosolik sitokrom c miktarı da azalmaya başlamıştır. Bu gözlem de apoptozun ilerleyen basamaklarında sitosolik sitokrom c nin de kaybedildiğini göstermektedir. Araştırıcılar, selektif olarak insan lösemi Jurkat T hücrelerinde apoptozu uyarmasından dolayı, bir kurşunlu bileşik olan laktam 1 in yeni bir antikanser ilacı olabileceğini bildirmişlerdir. Kazi ve ark. (2004) laktam 12 adlı antibiyotiğin insan lösemi Jurkat T hücrelerinde apoptozu daha baskın bir şekilde indüklediğini ve laktam 1 gibi insan 10

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ prostat kanser hücrelerinde koloni oluşumunu etkili bir şekilde inhibe ettiğini göstermişlerdir. Laktam 12 aynı zamanda insan göğüs, prostat ve kafa-boyun kanser hücrelerinde apoptozu indüklemiş, Jurkat T, simian virüs - 40 tarafından transforme edilmiş fibroblastlar ve transforme edilmemiş kontrol grubu fibroblastlar arasından seçici olarak Jurkat T ve transforme edilmiş fibroblastlarda apoptozu uyarması nedeniyle bu beta-laktam grubu antibiyotiklerin antikanser ilaçları olarak geliştirilebileceği önerilmiştir Piperacillin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Piperacillin antibiyotiğinin üretim ve depolama aşamalarında meydana gelen başlıca bozunma ürünü piperacillin impurity-a nın genotoksisitesi Ames testi ve kromozomal aberasyon testinde araştırılmıştır (Vijayan ve ark. 2007). Metabolik aktivatör varlığında ve yokluğunda Salmonella typhimurium suşlarının kullanıldığı Ames testinde mutajenik aktivitenin göstergesi olan revertant sayısında artış olmamış, sitotoksisitenin göstergesi olan bakteriyel bölünmede de 5 mg/plak dozda inhibisyon görülmemiştir. Benzer şekilde, Çin hamster i hücrelerinin kullanıldığı kromozomal aberasyon testinde de 5 mg/ml dozda kontrol ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak önemli bir değişim saptanmamıştır. Elde edilen sonuçlara göre Piperacillin impurity-a Ames ve kromozomal aberasyon testlerinde mutajenik ya da klastojenik bulunmamıştır Çeşitli Penicillinler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Stemp ve ark. (1989) beta-laktam grubuna giren ampicillin, carbenicillin ve penicillin VK antibiyotiklerinin in vitro ve in vivo klastojenik potansiyellerini kültüre edilmiş insan lenfositleri ve sıçan mikronukleus testi ile araştırmışlardır. Ne ampicillin ne de carbenicillin in vitro koşullarda 10 mg/ml ye kadar kromozom hasarlarında istatistiksel olarak artışa neden olmamışlardır. Her iki antibiyotik aynı zamanda in vivo sıçan mikronukleus testinde tek ya da çift doz halinde verildiğinde (ampicillin 5g/kg oral; carbenicillin 500 mg/kg intramüsküler (i.m), kemik iliği 11

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ preparasyonundan 30 saat önce bir defa, ya da kemik iliği preparasyonundan 48 ya da 24 saat önce olmak üzere iki defa) de negatif sonuç vermişlerdir. Penicillin VK ise in vitro da kromozom ve kromatid tipi gap ve kırıklarda 1.25 mg/ml ye kadar doza bağlı artışa neden olmuştur. Araştırıcılar yüksek potasyum iyonu konsantrasyonunun hücrelerdeki aberasyon frekansının yükselmesinden kısmen sorumlu olduğunu bildirmişlerdir. Ancak penisillin VK in vivo mikronukleus testinde klastojenik etki göstermemiştir (bir defa oral yoldan 0.3 ya da 0.5 g/kg, preparasyondan 30 saat önce, ya da iki defa 0.5 ya da 0.8 g/kg, preparasyondan 48 ve 24 saat önce). Araştırıcılar penicillin VK nın in vitro deneyde yüksek dozda uyardığı klastojenik etkilerin aynı antibiyotiğin in vivo da tedavi edici dozlarıyla bir bağlantısı olmadığını belirtmişlerdir. Jaju (1984) tarafından ampicillin ve karbenicillin antibiyotiklerinin insan lenfositleri üzerindeki in vitro genotoksik etkileri araştırılmıştır. Her iki ilaç da plazma konsantrasyonunda ( µg/ml ampicillin, µg/ml carbenicillin) kromozom aberasyonları, satellit birleşmeleri, mitotik indeks ve hücre bölünme hızı (cell turnover rate) frekansını etkilememiştir. Bununla birlikte plazma düzeyinin üzerindeki konsantrasyonlarda tüm bu parametrelerin değiştiği bildirilmiştir Folat Sentezini İnhibe Eden Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sulfonamidler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sulfamethoxazole İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Bir antimikrobiyal ilaç olan sulfamethoxazole un genotoksisitesi kültüre edilmiş insan periferal kan lenfositlerinde araştırılmıştır (Abou-Eisha ve ark. 2004). Nihai karar olarak geniş çaplı primer DNA hasarı, klastojenite ve anöjenite gibi genetik hasarların tespit edilebildiği kardeş kromatid değişimi (KKD) ve mikronukleus (MN) testleri kullanılmıştır. Sonuçlar, sulfamethoxazole un KKD ve 12

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ MN frekanslarını en azından kullanılan en yüksek iki konsantrasyonun birinde zayıf olarak artırdığını göstermiş ve KKD deki bu zayıf artışın istatistiki olarak önemli olduğu saptanmıştır. Buna ek olarak araştırıcılar, sulfamethoxazol un proliferatif oran indeksini (PRI) ve sitokinez-bloklu proliferasyon indeksi (CBPI) ni düşürerek sitotoksik/sitostatik etki gösterdiğini bildirmişlerdir Trimethoprim İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Akbaş (1989) kültüre edilen insan periferal kan lenfositlerinde trimethoprim in 8, 35 ve 60 µg/ml dozlarında 6, 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde yapısal kromozom anormalliğini doza bağlı olarak artırdığını, MI yı ise düşürdüğünü saptamıştır. Abou-Eisha ve ark. (1999) trimethoprim antibiyotiğinin genotoksisitesini insan periferal kan lenfositlerinde µg/ml doz aralıklarında araştırmışlardır. Trimethoprim bu çalışmada kullanılan konsantrayonlarından en az birinde KKD ve MN frekanslarında artışa neden olmuş, genotoksik etki göstermiştir Sitoplazmik Membranın Fonksiyonunu Bozan Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Polyene Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Tetrapol A159 İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Vachkova ve ark. (1997) tetrapol A159 antibiyotiğini nokta mutasyonu (Ames testi), mikronukleus (sıçan kemik iliği hücrelerinde), mitotik rekombinasyon ve aneuploidi (maya sistemi) gibi anormallikleri indükleyebilme potansiyeli bakımından değerlendirmişlerdir. Çalışmada tetrapol A159 antibiyotiği mg/plak arasındaki dozlarda Salmonella nın TA100, TA98, TA1535 ve TA1537 suşlarının hiç birinde histidin revertantı sayısını artırmamış, mg/kg vücut ağırlığı arasındaki dozlarda mikronukleus oluşumunu indüklememiş, ancak 13

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ Aspergillus niger in kullanıldığı maya test sisteminde mg/ml arasında değişen dozlarda mitotik krosover lerin sayısında 3 kat artışa neden olmuştur Protein Biyosentezini Bloke Eden Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Aminoglukozid Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Neomycin Antibiyotiği İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Bu antibiyotik ile yapılan genotoksisite çalışmaları Veteriner Tıbbi Ürünler Komitesi (Committee For Veterinary Medicinal Products) nin 2002 yılındaki raporuna göre maddeler halinde sıralanacak olursa; a) Neomycin antibiyotiği, insan lenfositlerinde in vitro kromozom aberasyon testi ve fare kemik iliği hücrelerinde in vivo kemik iliği testlerinde pozitif sonuç vermiştir. b) Bakteri preinkübasyon mutasyon testinde neomycin antibiyotiği Salmonella typhimurium suşlarında ve E.coli de µg/plak konsantrasyonlarında metabolik aktivatör varlığında ve yokluğunda pozitif sonuç vermemiştir. c) In vivo kromozom aberasyon testinde (CD1 fare kemik iliği hücreleri) neomycin, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, hiçbir test grubunda anormal hücrelerin sayısında önemli derecede artışa neden olmamıştır. Bu testte kullanılan dozların erkek farelerde mg/kg vücut ağırlığı, dişi farelerde ise mg/kg vücut ağırlığı düzeyinde olduğu bildirilmiştir. d) Neomycinin bazı eski ve eksik rapor edilmiş non-glp-compliant mutajenisite testlerinde pozitif sonuçlar verdiği bildirilmiştir. Neomycin GLP şartlarına uyan daha gelişmiş genotoksisite test sistemlerinde de (Salmonella mikrozom testi, AS52/XPRT Çin hamster i ovaryum (CHO) 14

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ hücresi gen mutasyon testi ve CD1 faresi kemik iliği hücresi kromozom aberasyon testi) incelenmiş ve tüm bu testlerin sonucu negatif çıkmıştır Chloramphenicol İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Chloramphenicol ün genotoksisitesi ile ilgili mevcut bilgi bakteriyel sistemlerde negatif, memeli test sistemlerinde ise karışık sonuçlar verdiği şeklindedir. Chloramphenicol ün memeli test sistemlerinde DNA tek iplik kırıklarını indüklediği, kardeş kromatid değişimi ve kromozomal aberasyon frekanslarını artırdığı yönünde sonuçları birbiri ile uyuşan çalışmalar bulunmaktadır. Chloramphenicol genellikle genotoksik olarak değerlendirilmektedir ( Makrolid Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Clarithromycin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Aziza ve El-Sherbeny (2006) tarafından clarithromycin in kromozom aberasyonlarını uyarıcı etkisi fare kemik iliği, splenosit (beyaz kan hücresi [monosit]) hücreleri ve spermatosit hücrelerinde araştırılmıştır. Fareler bir defa olmak üzere 50, 100, 200 ve 300 mg/kg v.a. dozda ve 14 gün boyunca da günde 50 mg/kg clarithromycin ile muamele edilmişler, örnekler de muameleden 24 saat sonra alınmıştır. Clarithromycin hem kemik iliği hem de splenosit hücrelerinde kromozom aberasyonlarını indüklemiş, 200 ve 300 mg/kg v.a. konsantrasyonlarındaki tekli muameleler (P<0.05 ve P<0.01) ve tekrarlayan muameleler (P<0.01) sonucunda meydana gelen kromozom aberasyonlarının yüzdesi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Diakinez-metafaz I safhasındaki spermatositlerde kromozom aberasyonlarının yüzdesi doza bağımlı olarak artmış ve istatistiksel olarak en yüksek iki doz (200, 300 mg/kg) ve 14 gün boyunca sürdürülen tekrarlı muameleden sonra önemli bulunmuştur. Antibiyotiğin uygulanan yüksek dozları kemik iliği hücrelerinde KKD frekansında istatistiksel olarak önemli bir artışa neden olmuştur. 15

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ Bu nedenlerden dolayı clarithromycin in test edilen hücre tipleri üzerinde sitogenetik etkiye sahip olduğu bildirilmiştir Spectinomycin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Spectinomycin ile yılları arasında yapılan genotoksisite çalışmalarının sonuçları aşağıdaki tabloda verilmiştir ( Test Sistemi Test Objesi Konsantrasyon Sonuçlar Referans Ames testi S. typhimurium suşu µg/plak Negatif Mazurek ve Swenson, Ames testi S. typhimurium suşu µg/plak Negatif Mayo, Ames testi S. typhimurium suşu µg/plak Negatif Lawlor, İleri mutasyon testi Çin hamster i µg/ml Negatif Bichet, İleri mutasyon testi Fare lenfoma mg/ml Negatif Cifone, Zamansız DNA sentezi Fare lenfositleri µg/ml Negatif McKeon, Zamansız DNA sentezi Sıçan hepatositleri µg/ml Negatif Harbach ve Filipunas, In vitro sitogenetik CHO hücreleri µg/ml Negatif Murli, In vitro sitogenetik İnsan lenfositleri µg/ml Negatif Brooker et al., In vitro sitogenetik CHO hücreleri µg/ml Negatif Aaron, 1991a. Mikronukleus testi CD-1 fare kemik iliği 0, 625, 1250, 2500 mg/kg v.a. Negatif Aaron, 1991b. Mikronukleus testi Sprague Dawley sıçan 0, 750, 1500, 3000 mg/kg kemik iliği v.a. Negatif Trzos et al., Spiramycin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları İla ve Topaktaş (1999) spiramycin antibiyotiğinin genotoksik etkilerini sıçan kemik iliği hücrelerinde araştırmışlardır. Sıçanlar 100, 200, 400 mg/kg v.a./gün dozlarında 7 gün süre ile muamele edilmiş ve kemik iliği preparatları son muameleden 6 ve 12 saat sonra hazırlanmıştır. Son muameleden 6 saat sonra öldürülen ve 100 mg/kg v.a./gün dozda spiramycin ile muamele edilen farelerde anormal hücreler ve hücre başına düşen kromozom anormallikleri artmıştır. Ancak diğer konsantrasyonlarda (200 ve 400 mg/kg v.a./gün), spiramycin, anormallikleri uyarmamış, mitotik indeksi de düşürmemiştir. Son muameleden 12 saat sonra 16

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ öldürülen sıçanların kemik iliği hücrelerinde ise, spiramycin, ne anormal hücre yüzdesini ne de hücre başına düşen kromozom anormallikleri (KA/hücre) ni artırmamış, fakat mitotik indeksi genel olarak düşürmüştür. Spiramycin bu çalışmada kromozomal gapların oluşumu üzerine etki göstermemiştir. İla ve Topaktaş (2001) tarafından yapılan ve spiramycin antibiyotiğinin potansiyel klastojenik/genotoksik etkisinin araştırıldığı başka bir çalışmada, spiramycin 21 gün boyunca uygulanan tüm konsantrasyonlarında (100, 200, 400 mg/kg v.a./gün oral) kromozom aberasyonlarını uyarmıştır. Ek olarak, kontrol grubu (ayçiçeği tohum yağı) ile karşılaştırıldığında, spiramycin kromozomal aberasyonları (KA) 12 saatlik intraperitonal (i.p) uygulamadan sonra sadece 200 mg/kg v.a. dozunda, 24 saatlik intraperitonal uygulamadan sonra ise sadece 100 ve 400 mg/kg v.a. dozlarında uyarmıştır. Spiramycin 12 saatlik i.p uygulamada mikronukleuslu polikromatik eritrositlerin (MNPCE) sayısını sadece 200 mg/kg v.a. dozunda, 24 saatlik uygulamada ise sadece 100 mg/kg v.a. dozunda uyarmıştır. Bununla birlikte, 12 ve 24 saatlik muamele sürelerinin diğer dozlarında mikronukleus oluşumunda önemli derecede farklılıklara rastlanmamıştır. Spiramycin antibiyotiği ile muamele edilen insan periferal kan lenfositlerinde kromozomal aberasyonlar (KA) ve kardeş kromatid değişimleri (KKD) araştırılmıştır (Rencüzoğulları ve ark. 2002). Spiramycin KA ve KKD yi uyarmamış, mitotik indeksi (MI) de düşürmemiştir. Ancak, spiramycin sadece 48 saatlik muamele süresinde replikasyon indeksini (RI) düşürmüştür Tetrasiklin Grubu Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Azithromycin ve Doxycycline İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Genital Chlamidya trachomatis ile enfekte yetişkin kadınlarda standart dozlarda oral azithromycin ve doxycycline tedavisinin insan periferal kan lenfositlerindeki mikronukleus frekansına etkileri araştırılmıştır (Dimitrijević ve ark. 2006). Hastalar 10 gün süre ile günde mg ve yine 10 gün süre ile günde mg oral doxycycline veya tek doz (1g) oral azithromycin tedavisi almışlardır. 17

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ Doxycycline tedavisi alan hastalarda tedavi sonrası mikronukleus frekansının tedavi öncesi mikronukleus frekansına göre önemli derecede (P<0.001) artış gösterdiği bulunmuştur. Bununla birlikte azithromycin tedavisi alan hastalarda tedavi sonrası mikronukleus frekansı önemli bir artış göstermemiştir (P>0.05) Oxytetracycline İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Oxytetracycline ile yılları arasında yapılan genotoksisite çalışmalarının sonuçları aşağıdaki tabloda verilmiştir ( Test Sistemi Test Objesi Konsantrasyon Sonuçlar (µg/ml) -S9 +S9 -S9 +S9 Sonuçlar (in vivo) Referans Ames testi S. typhimurium suşu 1 µg/plak 1 µg/plak Andrews et al., Ames testi S. typhimurium suşu µg/plak µg/plak NTP, Fare lenfoma ileri L5178Y/TK + / - mutasyon testi hücreleri NTP, Kromozom aberasyon testi CHO hücreleri NTP, Kardeş kromatid 400, 500, CHO hücreleri 60, 70, 80 değişimi testi 700 NTP, Mikronukleus testi Fare 50, 250, 500 mg/kg v.a. + Blitek et al., 1983 Host mediated assay Fare S. typhimurium suşu 100 mg/kg v.a. _ Blitek et al., Tetracycline Antibiyotiği İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Hartmann ve ark. (2002) normal bireyler ile WD (Wilson Hastalığı) ve MD (Menkes Hastalığı) hastalarından izole ettikleri fibroblastlarda tetracycline antibiyotiğinin genotoksik ve sitotoksik etkilerini araştırmışlardır. Tetracycline antibiyotiği hücre gelişimini normal ve MD fibroblastlarında aynı konsantrasyonlarda inhibe ederken, WD fibroblastlarının bu antibiyotiğe karşı daha hassas olduğu görülmüştür. Buna ek olarak, tetracycline antibiyotiği ile muamele 18

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ edilen WD fibroblastlarında normal hücrelere (kontrol) göre DNA sentezi inhibisyonunun daha kuvvetli olduğu ve zamansız DNA sentezi uyarılmasında bir artış olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar bu anormalliklerin sebebi olarak da WD ve MD hücrelerinde bakır miktarının daha yüksek olduğu ve yüksek hücresel bakır konsantrasyonlarında tetracycline antibiyotiğinin DNA üzerindeki zararlı fiziksel etkisindeki artışın oluşan reaktif oksijen türlerinden kaynaklandığını ileri sürmüşlerdir. Tetra (Tetralet) antibiyotiğinin in vivo sıçan kemik iliği hücrelerinde kromozom aberasyonları (KA) üzerindeki etkileri araştırılmıştır (Çakmak ve ark. 2004). Tetra antibiyotiği 12 ve 24 saat boyunca muamele edilen sıçanlarda anormal hücrelerin ve kromozomal aberasyonların yüzdesini sırasıyla 100 ve 200 mg/kg v.a. dozlarında önemli derecede indüklemiştir. Ek olarak, negatif kontrol ve çözücü kontrol ile karşılaştırıldığında anormal hücrelerin yüzdesi ve KA/hücre oranı 12 saatlik muamelede doza bağlı olarak artış, MI ise düşüş göstermiştir. MI indeks 24 saatlik muamelede ise uygulanan antibiyotik dozuna bağlı olarak artış göstermiştir Nukleik Asit Biyosentezini ve Fonksiyonunu İnhibe Eden Antibiyotikler İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları DNA Biyosentezi ve Fonksiyonunu İnhibe Eden Antibiyotiklerle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Ciprofloxacin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Clerch ve ark. (1996) tarafından bir antimikrobiyal ajan olan ciprofloxacin in mutasyonel potansiyeli Salmonella typhimurium un transisyon, transversiyon ve çerçeve kayması mutasyonu taşıyan His - mutantlarında (hisg428, hisg46, hisc9070, hisg1775, hisc3076 ve hisd3052) araştırılmıştır. Çalışmada temel baz çifti değişimi mutasyonu olarak GC TA tipi transisyonlar ve daha düşük düzeyde de GC AT tipi transisyonlar saptanmıştır. Ayrıca, araştırıcılar ciprofloxacin in mutasyonel spesifitesinin genin lokalizasyonuna bağlı olduğunu göstermişlerdir. Buna göre 19

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ hisg428 geni kromozom üzerinde bulunduğu zaman en sık rastlanan mutasyonlar intragenik (gen içi) baz çifti değişimi mutasyonları iken aynı gen plazmid paq1 üzerinde bulunduğunda ise mutasyonlar 3 ya da 6 baz çiftini kapsayan delesyonlar şekline dönüşmektedir. Araştırıcılar aynı zamanda ciprofloxacinin hisc3076 ve hisd3052 çerçeve kayması mutasyonu taşıyan genlerde delesyon ya da insersiyonlara yol açtığını da göstermişlerdir. Ciprofloxacin in genotoksik aktivitesi fare kemik iliği hücrelerinde mikronukleus testi, Çin hamster inde sitogenetik kromozom analizi, erkek farede dominant letal testi ve sıçan ve farenin primer hepatositlerinde in vivo UDS (unscheduled DNA synthesis-zamansız DNA sentezi) testi ile araştırılmıştır (Herbold ve ark. 2001). In vivo testlerde ciprofloxacin genotoksik etki göstermemiş, buna ek olarak, uzun süreli kemirgen biyotestlerinde de non-karsinojenik bulunmuştur. Bu nedenlerden dolayı araştırıcılar ciprofloxacinin tedavi amaçlı kullanımının güvenli olduğunu bildirmişlerdir. İdrar yolları enfeksiyonu olan hastaların periferal kan lenfosit kültürlerinde SCE, MI ve RI testleri kullanılarak ciprofloxacin in genotoksisitesinin araştırıldığı çalışmada SCE frekansı 7 günlük ciprofloxacin uygulamasından sonra önemli derecede artmış (P<0.001), MI ve RI ise düşüş (P<0.001) göstermiştir (İkbal ve ark. 2004). Araştırıcılar klinik ciprofloxacin tedavisinin orta düzeyde potansiyel genotoksik risk taşıdığını bildirmişlerdir Lomefloxacin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Singh ve ark. (2003) tarafından lomefloxacin antibiyotiğinin in vivo genotoksisitesi fare kemik iliği hücrelerinde kromozom aberasyon testi ve germ hücrelerinde dominant letal mutasyon testi ile araştırılmıştır. Uygulanan en yüksek dozda (160 mg/kg v.a.) mitotik indeks önemli derecede (P<0.01) düşmüş, hücre başına düşen kromozomal aberasyonlar (KA/hücre) ve anormal metafazların yüzdesi ise önemli derecede (P<0.01) yükselmiştir. Dominant letal mutasyon testinde dişi başına düşen toplam implant sayısındaki (implant/dişi) önemli istatistiksel düşüş sadece 32 mg/kg v.a. düzeyinde lomefloxacin ile muamele edilen erkek farelerle 20

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ çiftleştirilen dişi farelerde, çiftleşmenin 3. haftasında görülmüştür. Ek olarak, dişi başına düşen canlı implant sayısında ise çiftleşmenin 2. ve 3. haftasında ve her iki dozda da (16 mg/kg v.a., 32 mg/kg v.a.) istatistiksel olarak önemli düzeyde (P<0.05, P<0.01) düşüş kaydedilmiştir. Bununla birlikte, lomefloxacin muamelesinden sonra dişi başına düşen ölü implant sayısında (implant/dişi) önemli derecede bir değişiklik kaydedilmemiştir Ofloxacin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Bir çalışmada (Someya ve ark. 2000) periodontit (diş çevresi zarının akut ya da kronik iltihabı) hastalığında yüzeysel olarak uygulanan ofloxacin antibiyotiğinin sitolojik ve sitogenetik etkileri insan periodontal ligament fibroblastlarında (Pel hücreleri) kromozomal aberasyon testi ile araştırılmıştır. Pel hücrelerinin eksojen metabolik aktivatör (% 5 lik sıçan karaciğeri post-mitokondriyal süpernatant karışımı) varlığında ve yokluğunda, mm ofloxacin ile 6, 24 ve 48 saat muamelesi sonucunda kromozomal aberasyonlarda istatistiksel olarak önemli düzeyde bir artış görülmemiştir Çeşitli Kinolonlar İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Itoh ve ark. (2006) tarafından nalidixic asit [NA], pipedimik asit [PPA], piromidik asit [PA], enoxacin [ENX], ofloxacin [OFLX], norfloxacin [NFLX] ve ciprofloxacin [CPFX] antibiyotiklerinin genotoksik potansiyelleri alkali tek - hücre jel elektroforez yöntemi (komet) ile (ph>13) ve mikronukleus testi ile araştırılmıştır. Bu amaçla WTK-1 hücreleri (insan lenfoma hücre hattı, p53 mutantı) sekiz kinolonun her biriyle µg/ml konsantrasyonlarda 2, 4 ve 20 saat boyunca muamele edilmiştir. NFLX ve CPFX DNA hasarını 4 ve 20 saatlik muamelelerden sonra konsantrasyona bağlı olarak önemli derecede (P<0.05) uyarmış, fakat bu hasarın tamir edilebilir bir özellikte olduğu bildirilmiştir. Diğer altı kinolon ile muamele edilen hücrelerde DNA hasarına rastlanmamıştır. Ayrıca NFLX ve CPFX ile 20 s boyunca muamele edilen hücrelerde meydana gelen DNA göçünün miktarı 21

41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ 10, 12.1 ve 13 üzerindeki ph larda yapılan comet testi ile de kıyaslanmıştır. ph 12.1 ve 13 üzerinde yapılan comet testi artan DNA göçünü göstermiş fakat ph 10 da yapılan komet testinde DNA göçüne dair pozitif cevap bulunamamıştır. In vitro mikronukleus testinde ise WTK-1 hücreleri µg/ml konsantrasyondaki NA, PPA, NFLX ve CPFX kinolonlarıyla 20 s boyunca inkübe edilmiştir. NFLX, hücrelerde mikronukleusları önemli derecede arttırmış, (P<0.05) fakat diğer üç kinolon (NA, PPA, CPFX) ile muamele edilen hücrelerde herhangi bir değişiklik kaydedilmemiştir. Araştırıcılar elde ettikleri sonuçlara dayanarak NFLX ve CPFX in DNA tek iplik kırıklarını (SSB) indüklediğini ve NFLX tarafından uyarılan SSB lerin kromozom aberasyonlarına neden olduğunu bildirmişlerdir. Hayasaki ve ark. (2006) clinafloxacin, sitafloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin, grepafloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, trovafloxacin, enoxacin, lomefloxacin, norfloxacin ve ofloxacin antibiyotiklerinin mutajenik potansiyellerini Escherichia coli WP2uvrA/pKM101 suşunda ng/plak konsantrasyonlarında S9 mix varlığında ve yokluğunda araştırmıştır. Çalışmada test edilen tüm antibiyotikler mutajenik potansiyel göstermişlerdir. Revertant koloni sayısını maksimum düzeyde indükleyen dozların antibiyotiklere göre dağılımının; clinafloxacin ve sitafloxacin için 7.81 ng/plak, ciprofloxacin, gatifloxacin, grepafloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, trovafloxacin için ng/plak, enoxacin, lomefloxacin, norfloxacin ve ofloxacin için ng/plak olduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar WP2uvrA/pKM101 suşunun deneyde kullanılan tüm antibiyotiklere karşı hassas olduğunu bildirmişlerdir. Enoxacin, levofloxacin, nalidixic acid, ofloxacin, pipedimic acid ve N1- siklopropil kinolonların (ciprofloxacin, DU-6859a, DU-6668 ve DV-7287) Çin hamster i akciğer hücrelerindeki ve fare mikronukleus testindeki klastojenik etkileri Shimada (1996) tarafından araştırılmıştır. Bazı N1-siklopropil kinolonların (DU ve DV-7287) CHL (Çin hamster i akciğer hücreleri) hücrelerinde kromozomal aberasyonları kuvvetli bir şekilde indüklediği, hepsi olmamakla birlikte bazılarının (DU-6668 ve DV-7287) fare kemik iliği hücrelerinde mikronukleus oluşumunu indükleme kabiliyetleri açısından pozitif olduğu saptanmıştır. Levofloxacinin ise 22

42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ CHL hücrelerinde zayıf klastojenite gösterdiği, fakat ne fare kemik iliğinde mikronukleusu, ne de sıçan hepatositlerinde zamansız DNA sentezini (UDS) indüklediği bildirilmiştir. DNA girazı inhibe eden ve penicillin bağlayan proteinlere bağlanan kinolonillaktam antibakteriyellerinin mikronukleus oluşumunu indükleme aktivitelerinin kinolon antibakteriyelleri ile karşılaştırıldığı bir çalışmada kinolonil-laktamlara yapısal olarak benzeyen bütün kinolonların sitotoksik bulunduğu ve mm konsantrasyonlar arasında mikronukleuslu binukleer hücrelerin (MNBC) frekansında yüksek düzeyli artışa (P<0.05) neden oldukları bildirilmiştir (Gibson ve ark. 1998). Bununla birlikte, kinolonil-laktamların 1.0 mm a kadar sitotoksik etki göstermediği ve kinolonlarla karşılaştırıldığında yüksek konsantrasyonlarda mikronukleuslu binukleer hücrelerin oluşumunu ya hiç ya da çok düşük frekansta indükledikleri bildirilmiştir RNA Biyosentezi ve Fonksiyonunu İnhibe Eden Antibiyotiklerle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Rifampicin Antibiyotiği İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Aly ve Donya (2002) vitamin C (VC) ve E nin (VE) fare kemik iliği hücrelerinde rifampicin (RMP) tarafından indüklenen kromozom aberasyonları üzerindeki antimutajenik etkilerini araştırmışlardır. Fareler oral yoldan 10, 50, 150 ve 300 mg/kg v.a. RMP ile muamele edilmiş, ayrıca 300 mg/kg RMP ile birlikte 100, 200 ve 400 mg/kg v.a. VC ya da VE uygulaması yapılmıştır. Örnekler 24 saat sonra alınmıştır. Farelere tekrarlayan dozlar şeklinde: (1) RMP nin tedavi edici dozu (10 mg/kg v.a.); (2) RMP + 25, 50 ve 75 mg VC; (3) RMP + 10, 20 ve 40 mg/kg v.a. VE ardarda gelen 30 gün boyunca uygulanmıştır. RMP nin test edilen dozları kromozom aberasyonlarının yüzdesinde istatistiksel olarak önemli bir artışa neden olmuş (P<0.01), fakat RMP nin tedavi edici dozu (10 mg/kg v.a.) ile 30 gün boyunca muamele edilen hayvanlarda kromozom aberasyonları daha düşük seviyede meydana 23

43 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Erman Salih İSTİFLİ gelmiştir. RMP ile kombin olarak uygulanan VC, RMP tarafından uyarılan kromozom aberasyonlarının yüzdesini önemli düzeyde (P<0.01) ve doza bağlı olarak düşürmüştür. VE ise aynı etkiyi gösterememiş, RMP tarafından indüklenen kromozom aberasyonları üzerinde sadece en yüksek dozda (30 40 mg/kg v.a.) istatistiksel olarak indirgen bir etki göstermiştir (P<0.01). Rifampicin antibiyotiğinin genotoksik etkisi fare kemik iliği hücrelerinde kardeş kromatid değişimi, germ hücrelerinde ise yapısal kromozom aberasyonu testleriyle araştırılmıştır (Aboul-Ela, 1995). 160, 240 ve 310 mg/kg v.a. dozlarında uygulanan rifampicin kardeş kromatid değişimini artırmış, fakat 80 mg/kg v.a. rifampicin aynı etkiyi göstermemiştir. Bununla birlikte, 80 mg/kg v.a. rifampicin uygulaması fare spermatositlerindeki kromozomal aberasyonların frekansını 1 günlük uygulamada % 3.5 ten % 14 seviyesine, 7 günlük uygulamadan sonra ise % 34.5 seviyesine yükseltmiştir. 24

44 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ 3. MATERYAL VE METOD Bu çalışmada materyal olarak sağlıklı ve sigara içmeyen aynı yaşlarda bir bayan (24 yaşında) ve bir erkekten (24 yaşında) alınan periferik kan ve test maddesi olarak amoxicillin antibiyotiği kullanılmıştır Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Kullanılan Kimyasal Maddeler Amoxicillin Amoxicillin 1972 yılında Beecham tarafından geliştirilmiştir ve günümüzde GlaxoSmithKline şirketi tarafından Amoxil ticari adı altında kullanıma sunulmaktadır ( Ampicillin antibiyotiğinin bir analoğu olan amoxicillin antibiyotiği birçok gram-pozitif ve gram-negatif bakteri üzerinde bakterisidal etki gösteren geniş spektrumlu, beta-laktam grubu bir antibiyotiktir (GlaxoSmithKline, 2008) (1). β-laktamların Genel Özellikleri β-laktam antibiyotikler moleküler yapılarında bir β-laktam çekirdeği taşıyan geniş bir antibiyotik sınıfıdır. Beta-Laktam Halka Yapısı β-laktam antibiyotikler hassas organizmaların neden olduğu bakteriyel enfeksiyonlardan korunma amaçlı ya da bunların tedavisinde tercih edilmektedirler. Başlangıçta etkileri sadece gram-pozitif organizmalar ile sınırlı iken, çeşitli gram- 25

45 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ negatif bakteriler üzerinde de etkili olabilen geniş spektrumlu β-laktam antibiyotiklerin dizayn edilmesi bu antibiyotiklerin kullanımını artırmıştır (2). β-laktam Antibiyotiklerin Etki Mekanizması Bakterisidal olan beta-laktam antibiyotikler bakteriyel hücre duvarlarının peptidoglikan tabaka sentezini inhibe ederek etki gösterirler. Peptidoglikan tabakası, özellikle gram-pozitif organizmalarda, hücre duvarının yapısal bütünlüğü açısından önemlidir. Peptidoglikan sentezindeki son transpeptidasyon basamağı penisillinbağlayan proteinler (PBPs) olarak da bilinen transpeptidazlar tarafından katalizlenir. β-laktam antibiyotikler D-alanil-D-alanin (olgunlaşmakta olan peptidoglikan tabakasının öncü NAM (N-Asetilmuramik asit) / NAG (N-Asetilglukozamin)-peptid alt ünitelerindeki terminal aminoasitler) in analoğudurlar. β-laktamlar ve D-alanil-Dalanin arasındaki bu yapısal benzerlik β-laktamların penisillin-bağlayan proteinlerin aktif bölgesine bağlanmalarını kolaylaştırır. Molekülün β-laktam çekirdeği PBP nin aktif bölgesindeki Ser 403 ün yan zincirine irreversibl olarak bağlanır. PBP nin bu irreversibl inhibisyonu olgunlaşmakta olan peptidoglikan tabakasındaki son çapraz bağlanma reaksiyonunu (transpeptidasyon) inhibe eder, sonuç olarak hücre duvarı sentezi tamamlanamaz. Normal koşullar altında peptidoglikan öncü maddesi bakteriyel hücre duvarı için bir yeniden yapılanma sinyalidir. Bunun bir sonucu olarak otolitik hücre duvarı hidrolazları aktive edilir. β-laktamlar tarafından çapraz bağlanma reaksiyonunun inhibe edilmesi ortamdaki peptidoglikan öncü maddesinin miktarsal artışına ve yığılmasına neden olur. Böylece, yeni peptidoglikan sentezi olmaksızın, ortamda var olan tüm peptidoglikan öncü maddesinin otolitik hidrolazlar tarafından parçalanması tetiklenir. Tüm bu olaylar, sonuçta, β-laktam antibiyotiklerin bakterisidal etkisini daha da kuvvetlendirir ( (3). β-laktam Antibiyotiklerin Yan Etkileri β-laktam antibiyotikleri kapsayan yaygın ters ilaç etkileşimleri (ADRs: adverse drug reactions) arasında diyare (ishal), mide bulantısı, döküntü, ürtiker 26

46 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ (kurdeşen) ve süperenfeksiyon (bir enfeksiyonun antimikrobiyal tedavisi sırasında ortaya çıkan başka bir enfeksiyon), sık olmamakla beraber ateş, kusma, eritem (deride kızarıklık), dermatit (cilt enflamasyonu), anjioödem (dermis, subkütan doku, mukoza ve submukozal dokularda gerçekleşen ani kabarma reaksiyonu) ve pseudomembranöz kolit (kalın barsağın nekrotizan hastalığı) bildirilmiştir. Buna ilaveten kas dokusu içine enjekte edilen β-laktam antibiyotikler için enjeksiyon bölgesindee yara ve enflamasyona (dokuda ısınma, kızarma ve şişme tepkisi) da rastlanmaktadır (Rossi, 2004). Hastaların % 0.01 inde anafilaksi (insanlarda ve diğer memelilerde görülen akut sistematik ve ağır Tip 1 hipersensitivite allerjik reaksiyonu) görülebilmektedir (Rossi, 2004; Pichichero, 2005) (4) ). Amoxicillin in Özellikleri (Sigma) Kimyasal adı: 7-[2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)-acetyl]amino-3,3-dimethyl- 6-oxo-2-thia-5-azabicyclo[3.2.0]heptane-4-carboxylicc acid Kapalı formülü: C 16 H 19 N 3 O 5 S Açık formülü: Molekül ağırlığı: g/mol Potens: 900µg/mg CAS No: Mitomycin C (MMC) (Sigma) Mitomycin C, bu çalışmanın S9 mix siz bölümünün 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Kimyasal adı: 6-Amino-1,1a,2,8,8a,8b-hexahydro-8-(hydroxymethyl)-8a- 27

47 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ methoxy-5-methyl-azirino[2',3'dione carbamate (ester) Kapalı formülü: C 15 H 18 N 4 O 3,4] pyrrolo[1,2-a]indole-4,7-5 Açık formülü: NH H 2 CH H H 3 N NH H Molekül ağırlığı: g/mol Erime noktası: >360ºC CAS No: Cyclophosphamide monohydrate (Sigma) Cyclophosphamide monohydrate bu çalışmanınn S9 mix lii bölümünde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Kimyasal adı: N,N-bis(2-chloroethyl)-1,3,2-oxazaphosphinan-2-amine 2- oxide Kapalı formülü: C 7 H 15 Cl 2 N 2 O 2 P*H 2 O Açık formülü: 28

48 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Molekül ağırlığı: g/mol Erime noktası: C CAS No: Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma) DMSO, bu çalışmada amoxicillinin eriticisi olarak kullanılmıştır. Kimyasal adı: Dimethyl Sulfoxide Kapalı formülü: C 2 H 6 SO yahut (CH 3 ) 2 SO Açık formülü: Molekül ağırlığı: Yoğunluğu: 1.1 g/cm 3 Kaynama noktası: 189 C Erime noktası: C Saflık düzeyi: %99.9 CAS No: Kromozom Mediumu Biochrom firmasının ürettiği Chromosome Medium B (Cat No. F 5023), hücre kültürü yapmak için kullanılmıştır. Chromosom e Medium B nin her litresinde aşağıdaki bileşikler belirtilen miktarlarda bulunmaktadır: MEM JOKLIKK with Non essential Amino Acids 850 ml Heparin E Penicillin G, Sodium Salt E Streptomycin Sulphate 50 mg Phytohemagglutinin L.2.5 mg 29

49 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Bu medyum her tüpte 2.5 ml olacak şekilde steril kültür tüplerine steril şartlarda paylaştırılmış ve bu şekilde kullanılmıştır. Kültür tüpleri steril olarak temin edilmiştir Kolkisin (Sigma) Kolkisin (Colchicine), preparatların hazırlanmasında mitotik zehir olarak kullanılmıştır. Kolkisin eriyiği steril saf su içerisinde hazırlanmış ve kromozom medyumunun her mililitresinde 0.06 µg olacak şekilde (0.06 µg/ml) 2.5 ml lik kromozom medyumuna ilave edilmiştir. Kolkisine ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Colchicine Kapalı formülü: C 22 H 25 NO 6 Molekül ağırlığı: Etil asetat içeriği: %3.4 Kloroform içeriği: < %0.1 Sigma No: C Hipotonik Eriyik % 0.4 lük KCI (Merck) hipotonik eriyik olarak kullanılmıştır. Eriyik bidistile su içerisinde stok halinde hazırlanıp, ağzı kapalı cam kap içerisinde buzdolabında (+ 4 C) saklanmıştır. Her preparasyondan yaklaşık bir saat önce yeterli miktarda hipotonik eriyik alınmış, 37ºC deki inkübatörde ısıtılarak kullanılmıştır Fiksatif KKD ve KA deneylerinde 1 hacim asetik asit in 3 hacim metanol ile karıştırılması sonucu hazırlanan fiksatif kullanılmıştır. MN deneyleri için birinci fiksatif, 1 hacim glasiyal asetik asit: 5 hacim metanol ve 6 hacim % 0.9 NaCI (1/5/6 glasiyal asetik asit/metanol/% 0.9 luk NaCI) karıştırılarak hazırlanmıştır. Diğer iki fiksatif ise 1 hacim glasiyal asetik asit ve 5 hacim metanol ün (1/5 glasiyal asetik asit/metanol) karıştırılması ile hazırlanmıştır. 30

50 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Fiksatifler, her preparasyonda kullanılmadan iki saat önce hazırlanarak buzdolabında saklanmıştır '-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdUrd) (Sigma) BrdUrd kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını belirleyebilmek amacıyla kullanılmıştır. BrdUrd eriyiği steril saf su içerisinde hazırlanmıştır. Bu eriyikten 50 µl alınarak kültür tüplerine ilave edildiğinde kültür, son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde BrdUrd içermiştir. Kimyasal adı: 5'-Bromo-2'-deoxyuridine Kapalı formülü: C 9 H 11 BrN 2 O 5 Molekül ağırlığı: g/mol Erime noktası: C CAS No: Sigma No: B Sorensen Tamponu Bu eriyik, Sorensen Tampon A ve Sorensen Tampon B olmak üzere iki stok çözelti halinde hazırlanmıştır ve bu çözeltiler çalışmanın amacına uygun olarak birbirleriyle değişik miktarlarda karıştırılarak kullanılmıştır. Hazırlanışı Sorensen Tampon A: gr KH 2 PO ml saf su içerisinde eritilmiştir (ph = 4.8). Sorensen Tampon B: gr Na 2 HPO 4.12H 2 O 250 ml saf su içerisinde eritilmiştir (ph = 9.3). KKD yi incelemek amacıyla preparat yapımı sırasında preparatlar Sorensen tamponu içerisinde UV lambası ile ışınlandırılmıştır. Ayrıca bu tampon % 5 lik Giemsa boyası hazırlanmasında da kullanılmıştır. 31

51 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği gr tri sodyum sitrat (C 6 H 5 Na 3 O 7.2H 2 O) tartılarak bir miktar saf su içerisinde eritilmiştir. Daha sonra 21.9 gr NaCI tartılarak yine saf su içerisinde ancak ayrı bir kapta eritilmiştir. İki eriyik, bir şişeye dökülerek iyice karıştırılmış ve üzerine 500 ml oluncaya kadar saf su ilave edilmiştir. Hazırlanan bu stok eriyik 5 SSC dir ve bu eriyik buzdolabında saklanmıştır. KKD yi incelemek için deney yapılırken bu stoktan 20 ml alınarak üzeri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanmış ve elde edilen 1 SSC eriyiği kullanılmıştır Giemsa (Merck) Giemsa boyası Merck firmasından (Cat. No. 9204) temin edilmiş olup, deneylerimizde Sorensen tamponu içinde hazırlanmış % 5 lik boya eriyiği kromozomları ve MN testinde nukleusları boyamak için kullanılmıştır Entellan (Merck) Hazırlanan preparatları daimi hale getirmek amacıyla lam ile lameli birbirine yapıştırmak için kullanılan şeffaf yapışkan sıvıdır (Cat. No. 7961) Nitrik Asit (HNO 3 ) Lamları temizlemek amacıyla 1N HNO 3 çözeltisi kullanılmıştır. Plastik şişede saklanarak her defasında tekrar takrar kullanılmıştır Cytochalasin B (Sigma) Mikronukleus (MN) testinde, hücre bölünmesi sırasında sitokinezi engellemek ve iki nukleuslu hücreler oluşturmak amacıyla kullanılmıştır. Kimyasal adı: Cytochalasin B Kapalı formülü: C 29 H 37 NO 5 Molekül ağırlığı: g/mol 32

52 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Erime noktası: ºC Kaynama noktası: ºC Saflık düzeyi: %98 CAS No: Açık formülü: Sigma No: C Standart S9 mix (Memeli Karaciğer Fraksiyonu [S9] ) Bu deneyin 2. bölümünde test maddesinin indirekt mutajenik etkiye sahip olup olmadığını belirlemek amacıyla sıçan karaciğerinden elde edilen enzimler ile magnezyum-potasyum tuzları ve sodyum-fosfat tamponunun kombinasyonundan oluşan S9 mix kullanılmıştır Sıçan Karaciğer Enzimlerinin İndüklenmesi 3-Metilkolantren ml ye 64 mg olacak şekilde mısır yağında eritilmiş ve 80 mg/kg vücut ağırlığı olacak şekilde 0.5 ml i.p. olarak erkek sıçanlara uygulanmıştır. Sıçanlar bununla 5 gün boyunca muamele edilmiştir. Bu süre içerisinde sıçanlar normal besin ile beslenmiştir. Öldürülmeden 12 saat önce sıçanlara sadece su verilmiş, yemek verilmemiştir. Süre sonunda sıçanlar boyunları kırılarak öldürülmüştür. Karaciğer enzimleri için diğer türlerin bir çok dokusu kullanılabilmesine rağmen genel olarak enzimlerin aktivasyonu açısından en iyisi sıçan karaciğeridir. Karaciğer enzimlerine S9 adı verilir. Metabolik aktivasyona ihtiyaç duyan (indirekt) 33

53 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ mutajenler ve kanserojenlerin araştırılmasında en etkili yol indüklenmiş hayvanlardan hazırlanacak S9 un kullanılmasıdır. Karaciğer enzimlerini indükleyen maddeler içerisinde en iyisi Aroclor 1254 olmasına rağmen, phenoborbitol ve 3-metilkolantren de bu amaç için rahatlıkla kullanılabilir Karaciğerin Alınması Temiz S9 preparasyonu elde etmek için karaciğer steril şartlarda alınmıştır. Yöntem: Servikal dislokasyon ile öldürülen hayvanların göğüs bölgesi tıraş edilmiştir. Tıraş edilen bölge %70 lik etanol ile silinmiştir. Tüyler kesilmeyecekse göğüs bölgesi iyice steril edilir. Steril aletlerle göğüs bölgesindeki deri açılmış ve iyice gerdirilmiş, tekrar alkol ile temizlendikten sonra göğüs bölgesi steril makas ile açılmıştır. Kontaminasyonu engellemek için göğüs kafesi açılırken özofagus ve bağırsakların yırtılmamasına dikkat edilmiştir. Daha sonra karaciğer alınmıştır Karaciğer Homojenat S9 Fraksiyonlarının Hazırlanması Karaciğer S9 fraksiyonlarının hazırlanması Garner ve ark. nın (1972) metoduna göre yapılmıştır. Çalışmanın bütün aşamaları 0-4ºC de steril ortamda ve steril ekipmanlarla yapılmıştır. Çıkarılan taze karaciğer darası alınmış petri kabına konulmuş, tartılmış ve her bir gramına 1 ml olacak şekilde soğuk 0.15 M KCl ilave edilmiştir. Sıçan karaciğeri yaklaşık g civarındadır. Karaciğer soğuk KCl ile birkaç defa yıkanmıştır. KCl ile yapılan yıkama, steril doku eldesi ve hemoglobinin uzaklaştırılması için gereklidir. Hemoglobin, sitokrom P450 enzimlerinin aktivitelerini yok edebilir. Yıkanan karaciğer, 3 ml/gr olacak şekilde 0.15 M KCl içeren bir kaba aktarılmış, steril makas ile dilimlenmiş ve homojenize edilmiştir. Homojenat 9000 g de 10 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant (S9 fraksiyonu) başka bir tüpe alınmıştır. Steriliteden şüphelenilmesi durumunda sterilite kontrolü yapılabilir. Sterilite kontrolü için histidin-biyotin içeren MGA besiyerine ekim yapılır. 1 ml lik S9 fraksiyonu yaklaşık 250 mg karaciğer mikrozom fraksiyonu 34

54 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ içerir. Bu S9 fraksiyonunun protein miktarı da yaklaşık 40 mg/ml dir. Taze S9 fraksiyonları 1 ml olacak şekilde ependorf tüplerine paylaştırılmıştır. -20ºC de dondurulmuş ve -80ºC de saklanmıştır. Mutajenik çalışmalar için S9 fraksiyonu gerekli olduğunda, donmuş S9 fraksiyonu oda ısısında çözülür ve kuru buz üzerinde korunur. S9 mix ise, S9 çözüldüğü anda hazırlanmalıdır. S9 mix in sterilitesi de denenebilir. Kontaminasyon olması durumunda S9 mix 0.45 µm lik membran filtre ile steril edilebilir. Fakat filtre ile sterilizasyonda enzimlerin kaybolma riski vardır ve zorunlu olmadıkça uygulanmamalıdır. Zaten yukarıda da belirtildiği gibi aseptik şartlarda çalışılması durumunda kontaminasyon olması son derece zayıf bir ihtimaldir. Sıçan karaciğeri dışında sıçanların akciğeri, fare ve hamster karaciğeri ve hatta insan otopsi karaciğeri bile S9 fraksiyonu elde etmek için kullanılabilir. İşlemler yukarıda belirtilen şekilde yapılmasına rağmen akciğer dokusunu homojenize etmek zordur. Çünkü akciğerde bulunan fibröz tabaka onun homojenizasyonunu zorlaştırır. Ayrıca, karaciğer steril olmasına rağmen akciğer bakteri florası içerebilir. Eğer sterilizasyon gerekiyorsa, S9 fraksiyonu mix ile karıştırıldıktan sonra filtre edilmelidir, aksi takdirde filtreyi tıkar. Vakum ile yapılan filtrasyon S9 enzimlerini denatüre edebilmektedir. Bunun yerine, basınç ile filtrasyon daha yararlıdır. Her tüpe 5 ml S9 mix ilave edilir. Standart S9 mix hazırlanması 20 ml için 100 ml için Sıçan karaciğer S9 fraksiyonu...2 ml 10 ml MgCl 2 - KCl tuzları ml 1.25 ml G-6-P g 0.2 g NADP g g 0.2 M fosfat buffer ml ml Steril saf su...20 ml ye 100 ml ye tamamlanır. tamamlanır. 35

55 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve gr hassasiyetindeki GEC AVERY marka terazi kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır Santrifüj Çalışmalarda rotor çapı 18 cm, 4000 rpm e kadar yükselebilen devir hızı, 99 dk. lık zaman ayarlayıcı ve 28 tüp kapasiteli HETTICH UNIVERSAL marka santrifüj kullanılmıştır Mikroskop Koordinat cetveli ve immersiyon objektifi olan OLYMPOS CX21 marka ışık mikroskobu preparatları incelemek için kullanılmıştır İnkübatör Hücre kültürünün yapılmasında ve bazı eriyiklerin 37ºC ye kadar ısıtılmasında DEDEOĞLU marka 0ºC -100ºC ayarlanabilir inkübatör kullanılmıştır Flow Kabin (Steril Kabin) Hücre kültürü tüplerine kromozom mediumu konulması, kan ekiminin yapılması, test eriyikleri ve S9 mix in hazırlanması ve kültür tüplerine ilave edilmesi sırasında steril bir ortam olarak, % 99.9 partikül tutma özellikli filtreye sahip, 1500 m 3 /h emiş kapasiteli, UV ve floresan ampülü olan LABORMED marka flow kabin kullanılmıştır. 36

56 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Su Banyosu Hücre kültürü preparatları hazırlandıktan sonra, kardeş kromatidlerin farklı boyanmasında kullanılan SSC eriyiğinin 58-60ºC de sabit kalmasını sağlamak amacıyla BM 302 NÜVE marka 0-60ºC ayarlanabilir, zaman ayarlı su banyosu kullanılmıştır Lamların Temizlenmesi Kültür süresinin bitiminden iki gün önce, etiketli olan lamlar dik şaleye dizilmiş ve şale, lamların üzeri iyice örtülecek şekilde 1N HNO 3 çözeltisi ile doldurulmuştur. Şalenin ağzı kapatılarak 24 saat bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda lamlar, yarım saat boyunca akan çeşme suyunda iyice yıkanmıştır. 3-4 defa saf sudan geçirildikten sonra şale saf su ile doldurularak buzdolabında saklanmıştır Sterilizasyon BrdUrd Eriyiğinin Sterilizasyonu BrdUrd eriyiği steril bir erlen içinde bulunan ve steril olan saf su içinde 5'- bromo-2'-deoxyuridine maddesinin eritilmesiyle hazırlanmıştır. Bu eriyik Flow kabini sayesinde sağlanan steril şartlarda por çapı 0.2 µm olan bakteri filtresinden (Sartorius, membran filtre) geçirilerek steril edilmiştir. Sonra vida kapaklı steril cam kültür tüplerine konulan bu eriyik, etrafı alüminyum folyo ile kapatılarak buzdolabında saklanmıştır Cyclophosphamide monohydrate nin Sterilizasyonu 270 mg (0.27 g) cyclophosphamide monohydrate, içinde 30 ml destile su bulunan bir beherde eritildikten sonra Millipore sterilizasyon aygıtı kullanılarak por çapı 0.2 µm olan bakteri filtresinden (Sartorius, membran filtre) geçirilerek steril edilmiştir. 37

57 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Saf Suyun Sterilizasyonu Temiz bir vida kapaklı 100 ml lik kültür şişesine saf su doldurularak şişenin ağzı pamukla iyice kapatılmıştır. Sterilizasyon esnasında otoklavdaki buhardan pamuğun ıslanmaması için üzeri alüminyum folyo ile örtülmüştür. Şişedeki saf su otoklavda 1.2 atm buhar basıncında ve 120ºC de 20 dk. steril edilmiştir Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange= SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosome Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) Sağlıklı ve sigara içmeyen bir bayan (24 yaşında) ve bir erkekten (24 yaşında) alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş periferik kan örneklerinden 6 damla (0.2 ml) steril şartlarda 2.5 ml lik kromozom medyumuna ekilmiştir (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991). Yine steril şartlarda daha önceden hazırladığımız BrdUrd eriyiğinden her tüpe son konsantrasyonu 10 µg BrdUrd/ml medium olacak şekilde ilave edilerek iyice karıştırılmış ve hücre kültürü 37±1ºC de 72 saat boyunca inkübe edilmiştir. Amoxicillin in etkisini incelemek amacıyla kültür bitiminden 24 ve 48 saat önce 400, 600, 800, 1000 μg/ml amoxicillin kültür tüplerine ilave edilmiştir. Ayrıca her deneyin bir kontrolü, DMSO ilave edilmiş bir eritici kontrolü ve MMC ilave edilmiş pozitif kontrolü vardır. Eritici kontrolde, kültür tüpüne 9 μl DMSO/ml olacak şekilde DMSO konmuştur. Pozitif kontrolde, kültür tüpüne MMC son konsantrasyonu 0.25 μg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (kültürün 70. saatinde) her tüpe hazırlanan kolkisin eriyiğinden 30 μl (0.06 μg/ml) ilave edilmiş ve tüpler hafifçe sallanarak karıştırılmıştır. 38

58 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Kültür süresinin sonunda (72. saatin bitiminde) kültür tüpleri 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri içeren ml lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, inkübatörde 37ºC ye kadar ısıtılan hipotonik eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırarak yapılmıştır ve hücre süspansiyonu pipetaj yapılarak homojen hale getirilmiştir. Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun preparatlar hazırlanamamaktadır. Her tüpe 10 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra ağzı kapatılan tüpler inkübatöre konmuştur. Hücreler 37ºC de 5 dk. boyunca hipotonik eriyik ile muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 1200 rpm de 10 dk. santrifüj edilmiş ve santrifüj sonunda süpernatant atılmıştır. Daha sonra hipotonik eriyik ilavesinde olduğu gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 10 ml olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm de 10 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem üç kere tekrarlanmıştır. Üçüncü kez fiksatifle muamelenin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen berraklaştığı görülmüştür. Son santrifüjden sonra dipte ml sıvı kalacak şekilde süpernatant atılmış ve preparat yapma işlemine geçilmiştir. Tüpün dibinde kalan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde hücre süspansiyonundan çekilmiştir. Özel olarak hazırlanmış düzeneğe tutturulan pasteur pipetinden daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanan lamın üzerine 50 cm yükseklikten farklı alanlara birer damla olmak üzere hücre süspansiyonu damlatılarak hücrelerin ve dolayısıyla kromozomların lam üzerine yayılması sağlanmıştır. Hücre süspansiyonunun lamlara dağıtılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda sıcaklığında bekletilmiştir. 39

59 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix li test) Amoxicillin in indirekt genotoksik etkisini araştırmak amacıyla kültürün bitiminden 24 saat önce 400, 600, 800 ve 1000 μg/ml amoxicillin 0.5 ml S9 mix ile birlikte tüplere ilave edilmiştir. Yine her deneyin bir kontrolü, DMSO ilave edilmiş bir eritici kontrolü ve S9 mix siz deneyden farklı olarak cyclophosphamide ilave edilmiş bir pozitif kontrolü vardır. Eritici kontrolde, kültür tüpüne 9 μl DMSO/ml olacak şekilde DMSO konmuştur. Pozitif kontrolde, kültür tüpüne cyclophosphamide son konsantrasyonu 28 μg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Kontrol, eritici kontrol ve pozitif kontrol tüplerine de 0.5 ml S9 mix ilave edilmiştir. 3 saat 37ºC de inkübasyonun ardından (hücre kültürünün 51. saati) tüpler 2500 rpm de 4 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmış ve böylece ortamdaki S9 mix in de uzaklaştırılması sağlanmıştır. Daha sonra hücreleri yıkamak için her bir tüpe 2 ml RPMI 1640 medyumu (37ºC) ilave edilmiş ve tüpler 2500 rpm de 4 dk. santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda süpernatant atılmış ve ikinci defa 2 ml RPMI 1640 uygulaması yapılmıştır. Yine 2500 rpm de 4 dk. santrifüjün ardından süpernatant atılmış ve tüplere bu defa 2 ml Chromosome medium B (37ºC) ve son konsantrasyonu 10 µg/ml olan BrdUrd eriyiği ilave edilerek 72. saatin sonuna kadar 37ºC de inkübasyona devam edilmiştir. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (kültürün 70. saatinde) her tüpe hazırlanan kolkisin eriyiğinden 30 μl (0.06 μg/ml) ilave edilmiş ve tüpler hafifçe sallanarak karıştırılmıştır. Bu aşamadan sonra yapılan işlemler deneyin S9 mix siz bölümü ile aynıdır Preparatların Boyanması ve Daimi Preparatların Hazırlanması Bir kromozoma ait kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını (Sister Chromatid Differentiation = SCD) sağlamak amacıyla Speit (1984), Speit ve Haupter in (1985) geliştirdikleri metod modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla bir günlük preparatlar ışınlama kabına konarak üzeri bir film şeklinde Sorensen tamponu ile örtülecek şekilde kapatılmıştır. Işınlama eriyiği 5 ml Sorensen Tampon A, 5 ml Sorensen Tampon B alınıp bu karışımın destile su ile 100 ml ye tamamlanmasıyla 40

60 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ hazırlanmıştır (ph=6.8). Işınlama eriyiğinin az ya da fazla olmasının kardeş kromatidler arasındaki kontrast farkını önemli derecede etkilediği görülmüştür. Bu şekilde ince bir tabaka halinde ışınlama eriyiği ile örtülen preparatlar, karanlıkta 15 cm yükseklikten 30 W lık 254 nm dalga boyunda ışık yayabilen tek ultraviole lambası ile 30 dk. ışınlandırılmıştır. Işınlama bittikten sonra preparatlar 1 SSC eriyiği içerisinde 60ºC (±0,2 ºC) de 60 dk. inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi bitmeden 15 dk. önce % 5 lik Giemsa boya eriyiği hazırlanmıştır. % 5 lik Giemsa boyasının hazırlanması: 4 ml tampon A, 4 ml tampon B ve 4 ml Giemsa karıştırılarak üzerine 80 ml oluncaya kadar saf su ilave edilmiştir (ph=6.72). Sonra bu boya dik bir şale içerisine filtre kâğıdı yardımıyla süzülmüştür. İnkübasyon süresinin sonunda preparatlar 1 SSC eriyiğinden alınarak doğrudan boya içerisine konmuş ve yaklaşık olarak 30 dk. boya içerisinde bekletilmiştir (kardeş kromatidler arasındaki en iyi kontrast farkı bu sürenin sonunda elde edilmiştir). Bu sürenin sonunda preparatlar boyadan çıkarılmış ve üç ayrı kaptaki saf sudan geçirilerek preparatların üzerindeki fazla boyanın akması sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette kurumaya bırakılmıştır. Boyanmış preparatlar kuruduktan sonra entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir Daimi Preparatlarda Mikroskobik İnceleme Hazırlanmış olan daimi preparatlar OLYMPOS CX21 marka ışık mikroskobunda immersiyon objektifi ile incelenmiştir ( = 1000 büyütmede). Bu incelemeler sırasında kardeş kromatid değişimi sayısı (KKD) ve kromozomal anormallikler belirlenmiştir. Aynı preparatlarda birinci, ikinci ve üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin sayısı ve toplam hücre içerisinde mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin sayısı saptanmıştır. Bu incelemeler sonucunda proliferasyon indeksi (PI) ve mitotik indeks (MI) saptanmıştır. 41

61 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ KKD Sayısının ve Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması KKD Sayısının Saptanması KKD sayısı, her kişinin kan kültürüne ait preparatlardan iyi dağılmış ve ikinci mitozu geçiren 25 hücrede (iki kişiden toplam 50 hücre) saptanmıştır. KKD sayısı bir kromozomun açık boyanmış kromatidindeki koyu boyanmış parçaların veya koyu boyanmış kromatidindeki açık boyanmış parçaların sayılmasıyla belirlenmiştir. Ortadan bir parça değişimi olmuş ise bu iki KKD olarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.1.a). Uçtan parça değişimi olmuş ise bu da bir KKD olarak sayılmıştır (Şekil 3.1.b). Ancak bu incelemeler esnasında kromatidlerin primer boğum bölgelerinden dönüm yapıp yapmadıklarına dikkat etmek gerekir. Bu durumda kromozomlarda KKD yoktur (Şekil 3.1.c). Şekil 3.1. Kardeş Kromatid Değişiminin Olduğu ve Olmadığı Durumun Şematik Olarak Gösterilmesi (Topaktaş ve Speit, 1990) Proliferasyon İndeksi (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması Amoxicillin in DNA replikasyonu üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla PI bulunmuştur. Her kişinin kan kültüründen yapılan preparatlardan tesadüfi seçilmiş 42

62 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ 100 hücrenin incelenmesiyle PI belirlenmiştir. Bu incelemeler sırasında gözlenen birinci, ikinci ve üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreler sayılmıştır. Bu verilerden yola çıkılarak her bir kişinin kan kültüründeki PI şu şekilde hesaplanmıştır: M1: Birinci mitozu geçiren hücrelerin sayısı M2: İkinci mitozu geçiren hücrelerin sayısı M3: Üçüncü mitozu geçiren hücrelerin sayısı Birinci, ikinci ve üçüncü metafaz plakları şu şekilde ayırt edilmiştir (Topaktaş ve Speit. 1990): BrdUrd, deoxytimidin (dt) ve deoxyuridin (du) birbirlerinin anoloğu olan bileşiklerdir. BrdUrd, dt ve du arasındaki tek fark taşıdıkları heterosiklik benzen halkasındaki beşinci C atomuna bağlanan grupların farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Beşinci C atomuna bağlanan grup dt de CH 3, BrdUrd de Br ve du de H atomudur (Şekil 3.2). HN O CH 3 HN O Br HN O H O N O N O N HO CH 2 O HO CH 2 O HO CH 2 O OH OH OH Deoxytimidin (dt) Bromodeoxyuridin (BrdUrd) Deoxyuridin (du) Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin(dU) in kimyasal yapıları. 43

63 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ BrdUrd, DNA nın yapısında bulunan timin bazlarının anoloğu olduğundan kültür ortamına BrdUrd eklendiğinde hücreler DNA larını replike ettikleri esnada (birinci S fazında) yeni sentezlenen polinukleotid ipliği içine timinin yerine ortamda bulunan BrdUrd geçecektir. Böyle hücrelerin kromozomları boyandığında bir kromozomun her iki kromatidi de (BrdUrd/dT : dt/brdurd) homojen koyu renkte boyanacaktır. Bu hücreler birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3 A ve Şekil 3.4). Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerden meydana gelen yavru hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd li ortamda ikinci S fazı) timin içeren polinukleotid ipliğine komplementer olarak sentezlenen yeni DNA ipliğinde BrdUrd yer alacaktır. Bu iki polinukleotid ipliği bir kromozomun koyu boyanan kromatidini (BrdUrd/dT) oluşturacaktır. BrdUrd içeren ipliğe komplementer olarak sentezlenen yeni ipliğe de BrdUrd girecektir ve bir kromatidi oluşturan iki polinukleotid ipliği de BrdUrd içereceğinden (BrdUrd/BrdUrd) bu kromatid, aynı kromozomun açık boyanan kromatidini oluşturacaktır. İşte bu hücrenin metafaz devresinde kromozomlar boyandığında tüm kromozomların kromatidlerinden birisi koyu diğeri açık renkte boyanacaktır (BrdUrd/dT : BrdUrd/BrdUrd). Bunlarda ikinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3 B ve Şekil 3.5). Bu hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd li ortamda üçüncü S fazı) ikinci mitozda açık boyanan kromatidden tüm polinukleotid ipliklerine BrdUrd girmiş olan bir kromozom meydana gelecektir ve bu kromozomun her iki kromatidi de açık boyanacaktır (BrdUrd/BrdUrd:BrdUrd/BrdUrd). İkinci mitozda koyu boyanan kromatidden ise, bir kromatidin her iki ipliği BrdUrd li ve diğer kromatidinin bir ipliği BrdUrd li diğer ipliği timinli olan bir kromozom oluşacaktır. Bu kromozom da boyandığında bir kromatidi koyu renkte, diğer kromatidi açık renkte olacaktır. İşte böyle hücrenin metafaz devresinde preparat yapıldığında bazı kromozomların her iki kromatidi açık renkte, bazı kromozomların bir kromatidi açık diğer kromatidi koyu renkte boyanacaktır. Bu hücreler de üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3 C ve Şekil 3.6). İşte bu şekilde birinci, ikinci ve üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreler ayırt edilmiş, 100 hücre içinde bu hücrelerin sayısı saptanmış ve elde edilen veriler kullanılarak yukarıdaki formüle göre PI hesaplanmıştır. 44

64 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Şekil 3.3. BrdUrd nin DNA Yapısına Girmesi ile Birinci, İkinci ve Üçüncü Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücrelerin Ayırt Edilmesinin Şematik Olarak Açıklanması (During, 1985: Topaktaş ve Speit, 1990 dan). 45

65 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil 3.4. Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000). 10 µm Şekil 3.5. İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000). 46

66 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil 3.6. Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000) Kromozom Anormallikleri (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması Her bir kişiden hazırlanan preparatlardan iyi dağılmış kromozomlara sahip toplam 100 hücre (iki kişiden toplam 200 hücre) KA yı saptamak amacıyla incelenmiştir. Bu hücrelerde gözlenen yapı ve sayı anormallikleri kaydedilmiştir. KA lı hücrelerin yüzdelerinin hesaplanmasında sadece yapısal kromozom aberasyonları göz önünde bulundurulmuştur. İncelenen bu 100 hücre içinde anormallik taşıyan hücrelerin yüzdesi ile toplam KA sayısı hesaplanmıştır. Toplam KA sayısı incelenen hücre sayısına bölünerek hücre başına düşen KA sayısı (KA/Hücre) saptanmıştır. Bu çalışmada gap lar anormallik olarak değerlendirilmemiştir (Mace ve ark. 1978). Gap lar ile kromatid ve kromozom tipi kırıkları arasındaki farklar şu şekilde ayırt edilmiştir (Preston, 1987; Kauderer ve ark. 47

67 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ 1991 den): Gap larda, kromatidin birinde (kromatid tipi gap) veya kromatidin her ikisinde (kromozom tipi gap) görülen boyanmamış bölge bir kromatidin genişliğinden daha azdır. Kırıklarda bir kromatiddeki (kromatid tipi kırık) veya her iki kromatiddeki (kromozom tipi kırık) boyanmamış bölge bir kromatidin genişliğinden daha fazladır. İşte bu ölçülere göre gap ve kromatid kırıkları birbirinden ayırt edilmiştir Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Amoxicillin in mitoz bölünme üzerine etkilerini belirlemek amacıyla MI saptanmıştır. MI i belirlemek için her bir kişiye ait preparatlarda toplam 3 bin hücre incelenmiş ve bunlar arasında mitoz bölünme geçiren hücrelerin sayısı kaydedilmiştir. 3 bin hücre içinde mitoz bölünme geçiren hücrelerin oranı yüzde cinsinden hesaplanarak MI saptanmıştır Mikronukleus (MN) Testi İçin Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) In vitro mikronukleus testinde Rothfuss ve ark. (2000) nın geliştirdikleri yöntem modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu yönteme göre, sağlıklı insanlardan alınan periferik kanın 0.2 ml si, 2.5 ml kromozom medyumuna ekilmiş ve hücreler 37±1ºC de 68 saat inkübe edilmiştir. Çalışmada kullanılan antibiyotiğin etkisini belirlemek için 400, 600, 800, 1000 µg/ml konsantrasyonlarındaki amoxicillin kültür ortamına, kültürün başlangıcından 20 ve 44 saat sonra ilave edilmiştir. Ayrıca her deneyin bir kontrolü, DMSO ilave edilmiş bir eritici kontrolü ve bir pozitif kontrolü vardır. İnkübasyonun başlangıcından 44 saat sonra her tüpe konsantrasyonu 6 µg/ml olacak şekilde sitokalasin-b maddesi ilave edilmiş ve böylece bölünen hücrelerde sitokinez engellenmiştir. İnkübasyonun sonunda, kültür tüpleri 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilerek süpernatant atılmış ve hücrelerin bulunduğu tüplere hipotonik eriyik (%0.4 KCI) ilave edildikten sonra tüpler inkübasyon yapmaksızın direkt olarak 48

68 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ santrifüje alınmıştır. Hipotonik eriyik, kültüre yavaş yavaş ve pipetaj yapılarak ilave edilmiştir. Kültür tüpleri 1200 rpm de 10 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atılarak birinci fiksatif (1/5/6=glasiyal asetik asit/metanol/%0.9 NaCI) ilave edilmiş ve hücreler bu fiksatif ile muamele edilmiştir. Birinci fiksatif ile oda sıcaklığında 20 dk. muameleden sonra 1200 rpm de 10 dk. daha santrifüj edilen tüplere iki kez glasiyal asetik asit/ metanol (1/5) ilavesi yapılarak 20 dk. oda sıcaklığında fiksatif muamelesi yapılmıştır. Sonra santrifüj yapılarak süpernatant atılmış ve kültür tüplerinin dibinde toplanmış olan hücreler resüspanse edilmiştir. Daha sonra, hücre süspansiyonu soğuk ve temiz lamlar üzerine 10 cm yükseklikten damlatılarak preparatlar hazırlanmıştır Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix li test) Amoxicillin in indirekt genotoksik etkisininin olup olmadığını araştırmak amacıyla kültürün bitiminden 24 (kültürün başlangıcından 44 saat sonra) saat önce 400, 600, 800 ve 1000 μg/ml amoxicillin 0.5 ml S9 mix ile birlikte tüplere ilave edilmiştir. Yine her deneyin bir kontrolü, DMSO ilave edilmiş bir eritici kontrolü ve S9 mix siz deneyden farklı olarak cyclophosphamide ilave edilmiş bir pozitif kontrolü vardır. Eritici kontrolde, kültür tüpüne 9 μl DMSO/ml olacak şekilde konmuştur. Pozitif kontrolde, kültür tüpüne cyclophosphamide son konsantrasyonu 28 μg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Kontrol, eritici kontrol ve pozitif kontrol tüplerine de 0.5 ml S9 mix ilave edilmiştir. 3 saat 37ºC de inkübasyonun ardından (hücre kültürünün 47. saati) tüpler 2500 rpm de 4 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmış ve böylece ortamdaki S9 mix in de uzaklaştırılması sağlanmıştır. Daha sonra hücreleri yıkamak için her bir tüpe 2 ml RPMI 1640 medyumu (37ºC) ilave edilmiş ve tüpler 2500 rpm de 4 dk. santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda süpernatant atılmış ve ikinci defa 2 ml RPMI 1640 uygulaması yapılmıştır. Yine 2500 rpm de 4 dk. santrifüjün ardından süpernatant atılmış ve tüplere bu defa 2 ml Chromosome medium B (37ºC) ve son konsantrasyonu 6 µg/ml olan sitokalasin- B eriyiği ilave edilerek 68. saatin sonuna kadar 37ºC de inkübasyona devam edilmiştir. Bu aşamadan sonra yapılan işlemler deneyin S9 mix siz bölümü ile aynıdır. 49

69 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Preparatların Boyanması Hazırlanan preparatlar bir gün sonra Sorensen tamponunda hazırlanmış %5 lik Giemsa boyası ile dk. boyanmış ve üç ayrı kapta bulunan saf sudan geçirilerek kurumaya bırakılmıştır. Kuruma işleminden sonra preparatlar entellan ile kapatılarak incelemeye hazır hale getirilmiştir Mikronukleus Testi İçin Hazırlanan Preparatlarda Mikroskobik İnceleme Hazırlanan daimi preparatlar OLYMPOS marka ışık mikroskobunda 10 40=400 büyütmede incelenmiştir Mikronukleus Sayısı ve Nukleus Bölünme İndeksinin (NBI) Saptanması Mikronukleus sayısını belirlemek amacıyla her bir kişiye ait daimi preparatlarda her kişinin, her muamele grubu ve kontrollerinde iki nukleusa sahip (binukleer) toplam 1000 hücre (Şekil 3.8) incelenmiş ve bu binukleer hücreler içerisinden mikronukleuslu olanlar saptanmıştır. Ayrıca incelenen hücrelerde toplam mikronukleus sayısı belirlenmiştir. Mikronukleus taşıyan iki nukleuslu hücrelerin toplam hücre sayısına oranlaması ile mikronukleuslu hücre oranı, toplam mikronukleus sayısının incelenen iki nukleuslu hücre sayısına bölünmesiyle ise hücre başına düşen mikronukleus sayısı (MN/hücre) hesaplanmıştır. Bundan da MN % si belirlenmiştir. Binukleer hücre ve mikronukleus ayırımı Titenko-Holland ve ark. (1997) ve Fenech (2000) e göre yapılmıştır: (1) Hücreler belirgin sitoplazmasıyla yuvarlak ya da oval görünüme sahip olmalıdır; (2) Benzer olarak, nukleuslar belirgin nukleus zarıyla çevrili yuvarlak ya da oval olmalıdır; (3) İçerisinde MN sayılan hücreler sadece bir nukleus bölünmesi geçiren hücrelerdir; (4) MN lar sadece ana nukleusun 1/3 ü ya da daha küçük olduklarında hesaba katılmalıdır; (5) MN lar ana nukleus gibi boyanmalıdır; (6) MN lar ana nukleustan açık bir şekilde ayrılmış olmalıdır. Sitokinez bloklama yönteminin en önemli yararı, bölünen hücre populasyonunda nukleus bölünmesinin ilerleyişini ve çoğalmasını ölçebilmesidir. Bu durum, sitokalasin-b ilavesinin ardından oluşan bir nukleuslu, iki nukleuslu, 50

70 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ multinukleuslu (>2) hücrelerin sayılmasıyla yapılır. Nukleus bölünme indeksi (NBI) Eastmond ve Tucker (1989) tarafından önerilen formüle göre hesaplanmıştır. NBI= (MI + 2 MII + 3 MIII + 4 MIV) / N Formüle göre, MI bir nukleuslu (Şekil 3.7), MII iki nukleuslu (Şekil 3.8), MIII üç nukleuslu (Şekil 3.9), MIV dört nukleuslu (Şekil 3.10) hücrelerin sayısını, N ise toplam hücre sayısını göstermektedir. NBI nin hesaplanması kimyasal veya fiziksel bir maddenin sitotoksik etkisini göstermede önemli bilgiler sağlar (Fenech, 1997). Bu nedenle, MN bakımından incelenen preparatlar daha sonra nukleus bölünme indeksini (NBI) belirlemek için tekrar incelenmiştir. NBI için, her bir kişinin preparatlarından tesadüfi seçilmiş alanlarda toplam 1000 hücre (2 kişi 2000 hücre) incelenmiştir. 10 µm Şekil 3.7. Bir nukleuslu hücre (X1000). 51

71 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil 3.8. İki nukleuslu hücre (X1000). 10 µm Şekil 3.9. Üç nukleuslu hücre (X1000). 52

72 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Dört nukleuslu hücre (X1000) Mikroskopta Fotoğraf Çekme Fotoğraf çekme işlemi OLYMPUS marka trinoküler mikroskoba bağlı dijital fotoğraf makinasında 1000 büyütmede yapılmıştır (Olympus CX31RTSF, 7.1 Megapixel). 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin, sık rastlanan ve ilginç olan KA ların, mikronukleuslu binukleer hücreler ile 1, 2, 3, 4 nukleuslu hücrelerin fotoğrafları çekilmiştir İstatistiksel Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi Mikroskobik inceleme sonucunda elde edilen KA, KKD, MI, PI, MN ve NBI parametrelerine ait veriler için her bir grubun ortalamaları arasındaki farkın önemli olup olmadığı One-Way ANOVA LSD testi ile kontrol edilmiştir. Doz-etki ilişkisini belirlemek amacıyla regresyon denklemi ve korelasyon katsayısı (r) bulunmuş ve regresyon doğrusu çizilmiştir. 53

73 3. MATERYAL VE METOD Erman Salih İSTİFLİ Mikroskobik incelemeler sonucunda elde edilen bulgular çizelge ve grafikler halinde verilmiştir. 54

74 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 4. BULGULAR 4.1. Amoxicillin in Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunmayan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri Amoxicillin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Amoxicillin 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde KKD yi artırmamıştır. (Çizelge 4.1). Amoxicillin ile 24 ve 48 saat muamele edilen kültürlerdeki hücre başına düşen KKD sayısının pozitif kontroldekinden önemli derecede düşük olduğu bulunmuştur (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1. Değişik Dozlarda Amoxicillin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı. Test Maddesi Muamele Süresi (saat) Konsantrasyon (µg/ml) Min-Max KKD KKD/Hücre±SH Kontrol ± 0.92 DMSO (EK) 9µl ± MMC (PK) ± ± 0.14c ± 0.42c 2 Amoxicillin ± 0.42c ± 0.44c 2 DMSO (EK) 9µl ± MMC (PK) ± ± 0.70c ± 0.38c 3 Amoxicillin ± 0.04c ± 0.98c 3 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 c 1 : P 0.05 a 2 b 2 c 2 : P 0.01 a 3 b 3 c 3 : P

75 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Amoxicillin in Kromozom Anormalliklerinin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Amoxicillin hem 24 saat hem de 48 saatlik muamele sürelerinde insan periferal kan lenfositlerinde KA yı genel olarak uyarmamıştır (Çizelge 4.2). Ancak 24 saatlik muamelenin en yüksek iki konsantrasyonunda, 48 saatlik muamelenin en yüksek konsantrasyonunda önemli olmayan bir artış görülmektedir. Ayrıca muameleli kültürlerdeki anormal hücre % si ve hücre başına düşen KA sayısı pozitif kontroldekinden önemli derecede düşüktür (Çizelge 4.2). Amoxicillin ile muamele edilen insan periferal kan lenfositlerinde kromatid kırığı (Şekil 4.1, Şekil 4.2, Şekil 4.3, Şekil 4.4), kromozom kırığı (Şekil 4.5), fragment (Şekil 4.6), disentrik kromozom (Şekil 4.7) ve poliploidi (Şekil 4.8) gibi kromozom anormallikleri gözlenmiştir. 56

76 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Çizelge 4.2. Değişik Dozlarda Amoxicillin İle 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/ Hücre. Test Maddesi Süre (saat) Muamele Kons. (µg/ml) Anormallikler B B F KKB DS T KD P Anormal Hücre ± SH (%) KA/Hücre±SH ±2.00c ±0.01c Kontrol DMSO (çözücü kontrol) 24 9µl ±0.50c ±0.00c3 MMC (pozitif kontrol) ± ±0.01 Amoxicillin ±0.50c ±0.00c3 Amoxicillin ±0.00c ±0.00c3 Amoxicillin ±2.00c ±0.02c3 Amoxicillin ±2.50c3 0.05±0.02c3 DMSO (çözücü kontrol) 48 9µl ±2.00c3 0.04±0.02c3 MMC (pozitif kontrol) ± ±0.11 Amoxicillin ±1.00c3 0.02±0.01c3 Amoxicillin ±0.00c3 0.02±0.01c3 Amoxicillin ±2.00c3 0.03±0.02c3 Amoxicillin ±1.00c ±0.01c3 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile karşılaştırmada fark önemlidir. a1b1c1: P < 0.05 a2b2c2: P < 0.01 a3b3c3: P <

77 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil 4.1. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X µm Şekil 4.2. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X

78 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil 4.3. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X µm Şekil 4.4. Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X

79 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil 4.5. Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X µm Şekil 4.6. Fragment (F) bulunan metafaz plağı (600 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X

80 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil 4.7. Disentrik kromozom (DS) bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin, 24 saatlik muamele, ). X µm Şekil 4.8. Poliploid hücre (1000 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X

81 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Amoxicillin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Proliferasyon indeksi (PI), amoxicillin in DNA replikasyonu üzerine etkisini, mitotik indeks (MI) ise mitoz bölünme üzerine etkisini göstermektedir. 24 saatlik amoxicillin uygulamasında PI de herhangi bir önemli düşüş saptanmamıştır (Çizelge 4.3). Çizelge 4.3. Değişik Dozlarda Amoxicillin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI). Muamele Test Maddesi Süre (saat) Kons. (µg/ml) M1 M2 M3 PI±SH MI±SH Kontrol ± ±0.49 DMSO (EK) MMC (PK) 24 9µl ± ± ± ± ± ±0.05 a 1 Amoxicillin ± ± ±0.09 a ±0.55 a ± ±0.30 a 1 DMSO (EK) MMC (PK) 48 9µl ± ± ± ± ±0.02 c ±0.25 Amoxicillin ±0.21 c ±0.08 c ±0.17 a ± ±0.18 c ±0.38 a 1 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 c 1 : P 0.05 a 2 b 2 c 2 : P 0.01 a 3 b 3 c 3 : P

82 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Ancak 24 saat muamele edilen kültürlerde PI nın doza bağlı olarak düştüğü saptanmıştır (Şekil 4.9). 48 saat muamele edilen kültürlerde PI da herhangi bir düşüş kaydedilmemiştir (Çizelge 4.3). 24 saatlik muameleli kültürlerde MI kontrole nazaran genel olarak düşük bulunmuştur, ancak bu düşüş pozitif kontroldeki kadar olmamıştır (Çizelge 4.3). 48 saatlik muameleli kültürlerde ise MI genel olarak kontrolden düşük, fakat eritici kontroldekinden farklı değildir (Çizelge 4.3). y = x r = * Şekil 4.9. Farklı Dozlarda Amoxicillin İle 24 Saat Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde PI nın Doza Bağlı Azalışını Gösteren Regresyon Doğrusu ve Korelasyon Katsayısı. *: P< Amoxicillin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in 24 saatlik uygulamasında MN içeren iki nukleuslu hücrelerin yüzdesinde (%MNBN) kontrol ve eritici kontrole göre artış saptanmamıştır. 24 saatlik muameleye benzer olarak 48 saatlik uygulamada da amoxicillin, MN içeren iki nukleuslu hücrelerin yüzdesinde herhangi bir artışa neden olmamıştır. 63

83 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Amoxicillin ile muamele edilen kültürlerdeki MN yüzdesinde de herhangi bir artış gözlenmemiştir (Çizelge 4.4). Amoxicillin ile muamele edilen insan periferal kan lenfositlerinde iki nukleuslu hücrelerde farklı sayılarda ve büyüklüklerde mikronukleuslar (Şekil 4.10, Şekil 4.11) gözlenmiştir. Amoxicillin in nukleus bölünmesi üzerindeki etkisi NBI (nukleus bölünme indeksi) bulunarak saptanmıştır (Çizelge 4.4). Amoxicillin ile 24 saat muamele edilen kültürlerde NBI kontrole nazaran önemli derecede düşük bulunmuştur. Fakat eritici kontrolle herhangi bir fark saptanmamıştır. Yani genellikle amoxicillin nukleus bölünmesini etkilememiştir. 24 saatlik muameleli kültürler ile pozitif kontrol arasında da NBI bakımından önemli bir fark bulunmamıştır (Çizelge 4.4) 64

84 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Çizelge 4.4. Değişik Dozlarda Amoxicillin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde MN İçeren İki Nukleuslu Hücre % si, MN % si ve NBI. Test Maddesi Muamele Süre (saat) Kons. (µg/ml) MN Sayısına Göre İki Nukleuslu Hücre Sayısı >3 MN İçeren İki Nukleuslu Hücre % si % MN Nukleus Sayısına Göre Hücrelerin Dağılımı NBI±SH Kontrol ± ± ±0.07 DMSO (EK) MMC (PK) 9µl ± ± ± ± ± ± Amoxicillin ±0.10c3 0.45±0.05c ±0.25c3 0.45±0.25c ±0.45 c3 0.55±0.45c ±0.35 c3 0.50±0.40c ±0.13a ±0.01a ± ±0.12a2 DMSO (EK) MMC (PK) 9µl ± ± ± ± ± ± Amoxicillin ±0.20c3 0.30±0.20c ±0.30c3 0.55±0.35c ±0.25c ±0.45c ±0.10c3 0.40±0.10c ± ± ±0.21a1 1.39±0.05 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a1b1c1: P 0.05 a2b2c2: P 0.01 a3b3c3: P

85 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (600 µg/ml Amoxicillin, 24 saatlik muamele, ). X µm Şekil İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (600 µg/ml Amoxicillin, 48 saatlik muamele, ). X

86 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 4.2. Amoxicillin in Eksojen Metabolik Aktivatör (S9 mix) Bulunan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri Amoxicillin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Amoxicillin metabolik aktivatörün bulunduğu ortamda da KKD yi uyarmamıştır. (Çizelge 4.5). Çizelge 4.5. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı. Test Maddesi Muamele Süresi (saat) Konsantrasyon (µg/ml) Min-Max KKD KKD/Hücre±SH Kontrol + S9 mix ± 0.08 DMSO (EK) + S9 mix 9µl ± Cyp (PK) + S9 mix ± ± 0.62 c 3 Amoxicillin + S9 mix ± 0.20 c ± 0.14 c ± 0.46 c 3 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 c 1 : P 0.05 a 2 b 2 c 2 : P 0.01 a 3 b 3 c 3 : P

87 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Amoxicillin in Kromozom Anormalliklerinin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri İnsan periferal kan lenfositlerinde eksojen metabolik aktivatörün (S9 mix) varlığında en yüksek iki konsantrasyonda kontrollerdekine nazaran KA da önemli olmayan bir artış gözlenmiştir. Çünkü bu konsantrasyonlarda anormal hücre % si ve hücre başına düşen KA sayısı kontrollerdekinden daha yüksektir (Çizelge 4.6). Amoxicillin insan periferal kan lenfositlerinde eksojen metabolik aktivatör varlığında kromatid kırığı (Şekil 4.12, Şekil 4.13, Şekil 4.14), kromozom kırığı (Şekil 4.15, Şekil 4.16), fragment (Şekil 4.17, Şekil 4.18, Şekil 4.19), kardeş kromatid birleşmesi (Şekil 4.20, Şekil 4.21), kromatid değişimi (Şekil 4.22), translokasyon (Şekil 4.23) ve disentrik kromozom (Şekil 4.24) gibi kromozom anormalliklerine neden olmuştur. 68

88 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Çizelge 4.6. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/Hücre. Test Maddesi Süre (saat) Muamele Kons. (µg/ml) Anormallikler B B F KKB DS T KD P Anormal Hücre ± SH (%) KA/Hücre ± SH ± 1.50c1 0.02±0.01c Kontrol DMSO (çözücü kontrol) Cyp (pozitif kontrol) 9µl ± 1.00c ± ±0.01c1 0.10± ± 0.50c1 0.03±0.01c1 600 Amoxicillin ± ± ±0.00c1 0.06± ± ±0.00 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile karşılaştırmada fark önemlidir. a1b1c1: P < 0.05 a2b2c2: P < 0.01 a3b3c3: P <

89 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X µm Şekil Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X

90 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X µm Şekil Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (800 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X

91 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X µm Şekil Fragment (F) bulunan metafaz plağı (600 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X

92 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Fragment (F) bulunan metafaz plağı (600 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X µm Şekil Fragment (F) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X

93 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Kardeş kromatid birleşmesi (KKB) bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X µm Şekil Kardeş kromatid birleşmesi (KKB) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X

94 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Kromatid değişimi (KD) bulunan metafaz plağı (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X µm Şekil Translokasyon (T) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X

95 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil Disentrik kromozom (DS) bulunan metafaz plağı (1000 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X Amoxicillin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Amoxicillin in DNA replikasyonu üzerine etkisi proliferasyon indeksinin (PI), mitoz bölünme üzerinde etkisi ise mitotik indeksin (MI) hesaplanması yoluyla saptanmıştır. Amoxicillin, eksojen metabolik aktivatörün bulunduğu ortamda PI yı ve MI yı kontrol ve eritici kontrole göre önemli derecede düşürmemiştir. (Çizelge 4.7). Pozitif kontrol ile kıyaslandığında da PI ve MI yönünden herhangi bir fark bulunamamıştır. 76

96 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Çizelge 4.7. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI). Test Maddesi Süre (saat) Muamele Kons. (µg/ml) M1 M2 M3 PI±SH MI±SH Kontrol ± ±0.27 DMSO (EK) + S9 mix Cyp (PK) + S9 mix 3 9µl ± ± ± ± ± ±0.14 Amoxicillin + S9 mix ± ± ± ± ± ±0.15 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 c 1 : P 0.05 a 2 b 2 c 2 : P 0.01 a 3 b 3 c 3 : P Amoxicillin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri Amoxicillin, kontrol ve eritici kontrol ile kıyaslandığında mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre yüzdesini (%MNBN) ve MN% sini önemli derecede artırmamıştır (Çizelge 4.8). Amoxicillin 600 µg/ml konsantrasyonda MN içeren iki nukleuslu hücre % sini ve MN% sini pozitif kontrole yakın bir düzeyde uyarmış fakat istatistiki olarak bir önemlilik kaydedilmemiştir. Amoxicillin ile muamele edilen insan periferal kan lenfositlerinde genel olarak farklı sayı ve büyüklükte mikronukleus oluşumları gözlenmiştir (Şekil 4.25, Şekil 4.26). Amoxicillin in nukleus bölünmesi üzerindeki etkisini belirlemek için nukleus bölünme indeksi hesaplanmıştır. Amoxicillin NBI yı kontrol ve eritici kontrole göre istatistiksel olarak önemli düzeyde düşürmemiştir (Çizelge 4.8). 77

97 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ Çizelge 4.8. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Amoxicillin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde MN İçeren İki Nükleuslu Hücre % si, MN % si ve NBI. Test Maddesi Muamele Süre (saat) Kons. (µg/ml) MN Sayısına Göre İki Nukleuslu Hücre Sayısı >3 MN İçeren İki Nukleuslu Hücre % si % MN Nukleus Sayısına Göre Hücrelerin Dağılımı NBI±SH Kontrol + S9 mix ± ± ±0.08 DMSO (EK) + S9 mix Cyp (PK) + S9 mix 25µl ± ± ± ± ± ± ± ± ± Amoxicillin + S9 mix ± ±0.10 c1 0.35±0.15 c1 0.85± ± ± ± ± ±0.11 a: Kontrol ile; b: Eritici Kontrol ile; c: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a1b1c1: P 0.05 a2b2c2: P 0.01 a3b3c3: P

98 4. BULGULAR Erman Salih İSTİFLİ 10 µm Şekil İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (400 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X µm Şekil Büyük bir mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (600 µg/ml Amoxicillin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ). X