FLURBİPROFENİN FARMASÖTİK PREPARATLARDA ANALİTİK YÖNTEMLERLE MİKTAR TAYİNİ. Emrah ALKAN. Analitik Kimya Anabilim Dalı

Transkript

1 FLURBİPROFENİN FARMASÖTİK PREPARATLARDA ANALİTİK YÖNTEMLERLE MİKTAR TAYİNİ Emrah ALKAN Analitik Kimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Yrd. Doç. Dr. Bilal YILMAZ Yüksek Lisans Tezi

2 T. C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FLURBİPROFENİN FARMASÖTİK PREPARATLARDA ANALİTİK YÖNTEMLERLE MİKTAR TAYİNİ Emrah ALKAN Analitik Kimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Yrd. Doç. Dr. Bilal YILMAZ ERZURUM 2012

3

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... ÖZET... ABSTRACT... SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... ŞEKİLLER DİZİNİ... TABLOLAR DİZİNİ... V VI VII VIII IX XI 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Flurbiprofen Flurbiprofen ile İlgili Yapılan Çalışmalar Spektroskopik Yöntemler Elektromanyetik Işımanın Genel Özellikleri Işının Absorplanması Atomik Absorpsiyon Spektrumları Moleküler Absorpsiyon Spektrumları Lambert-Beer Kanunundan Sapmalar Ultraviyole-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometreleri UV-Görünür Bölge... Spektrofotometre Cihazının Kullanım Amaçları Kalitatif Analiz ve Molekül Yapısını Aydınlatma Kantitatif Analiz Türev Absorpsiyon Spektrofotometri Yöntemi Türev.. Absorpsiyon Spektrofotometri... Yönteminin Avantajları... ve Türev Absorpsiyon Spektrumlarının.. Değerlendirilmesi I

5 2.4. Kromatografik Yöntemler Kromatografik Yöntemlerinin Sınıflandırılması Kromatografide Temel Olan Fiziksel ve Kimyasal Olaylar Dağılma Kromatografisi Adsorpsiyon Kromatografisi İyon Değiştirme Kromatografisi Boyut-Eleme Kromatografisi Gaz Kromatografisi (GC) Gaz Kromatografisi Cihazı Taşıyıcı Gaz Elektronik Basınç Kontrolü (EPC) Enjeksiyon Bloğu Fırın Kolon Dedektör İdeal bir Dedektörden Beklenen Özellikler Yöntem Geçerlilik Testi (Validasyon) Doğruluk ve Kesinlik Örneklerin Kararlılığı (Stabilite) Doğrusallık ve Kalibrasyon Eğrisi Duyarlılık Tayin Alt Sınırı (LOQ) Gözlenebilme (Teşhis) Sınırı (LOD) Geri Kazanım II

6 3. MATERYAL VE METOT Kimyasal Maddeler ve Malzemeler Kullanılan Cihazlar Yöntemler Spektrofotometrik Yöntem Şartları Spektroflorometrik Yöntem Şartları GC-MS Yöntem Şartları BULGULAR UV-Görünür Bölge ve Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri Yöntemi Standart Çözeltilerin Hazırlanması Yöntemin Geçerlilik Testi (Validasyonu) Doğrusal Aralık ve Kalibrasyon Eğrisi Gözlenebilme Sınırı (LOD) ve Tayin Alt Sınırı (LOQ) Doğruluk ve Kesinlik Kararlılık (Stabilite) Yöntemin Farmasötik Preparatlara Uygulanması Geri Kazanım Spektroflorometri Yöntemi Standart Çözeltilerin Hazırlanması Yöntemin Geçerlilik Testi (Validasyonu) Doğrusal Aralık ve Kalibrasyon Eğrisi Gözlenebilme Sınırı (LOD) ve Tayin Alt Sınırı (LOQ) Doğruluk ve Kesinlik Kararlılık (Stabilite) III

7 4.3. Yöntemin Farmasötik Preparatlara Uygulanması Geri Kazanım Gaz Kromatografisi-Kütle Spektroskopisi (GC-MS) Yöntemi Standart Çözeltilerin Hazırlanması Yöntemin Geçerlilik Testi (Validasyonu) Doğrusal Aralık ve Kalibrasyon Eğrisi Gözlenebilme Sınırı (LOD) ve Tayin Alt Sınırı (LOQ) Doğruluk ve Kesinlik Kararlılık (Stabilite) Yöntemin Farmasötik Preparatlara Uygulanması Geri Kazanım TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR EKLER EK-1. ÖZGEÇMİŞ EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU IV

8 TEŞEKKÜR Yüksek Lisans tezimin planlanmasında, yürütülmesinde ve hazırlanmasında ilgisini, fikirlerini, yardımlarını esirgemeyen ve bu yolda her türlü fedakârlığı yapmaktan kaçınmayan danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Bilal YILMAZ a, Yüksek Lisans tezi olarak sunduğum ve Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi nde gerçekleştirilen bu çalışmanın ortaya çıkmasında Analitik Kimya Laboratuarında çalışma izni veren Temel Eczacılık Bilimleri Bölüm Başkanı sayın Prof. Dr. Yücel KADIOĞLU na, Flurbiprofen miktar tayininin Spektroflorometre ve GC-MS cihazları ile ölçümleri almamda yardımcı olan Yrd. Doç. Dr. Kadem MERAL ve Uzm. Vedat AKBA ya, tez çalışmalarında bana çeşitli konularda destek olan ve bilgisayar çalışmalarında yardım eden değerli arkadaşım Ferit ÇAKIR'a, Laboratuar çalışmalarımı kimyasal madde ve malzeme yönünden 2011/296 BAP proje numarası ile destekleyen Atatürk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne, Bana her zaman güvenen ve inanan eşim Gül Elif ALKAN ile hayatım boyunca maddi ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen annem Sevgi ALKAN ve babam Mustafa ALKAN a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Emrah ALKAN V

9 ÖZET Flurbiprofenin Farmasötik Preparatlarda Analitik Yöntemlerle Miktar Tayini Amaç. Bu çalışmada, flurbiprofenin farmasötik preparatlarda miktar tayini için UV- Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometri, Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri, Spektroflorometri ve GC-MS yöntemleri geliştirildi. Materyal ve Metot. UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometride, flurbiprofen çözeltilerinin absorbans değerleri 198 ve 246 nm de ölçüldü. Birinci derece türev spektrofotometride; absorbans değerleri 213, 233 ve 260 nm de ölçüldü. Spektroflorometride flurbiprofen çözeltilerinin yayma değerleri 308 nm de ölçüldü. GC-MS yöntemi flurbiprofenin MSTFA ile türevlendirilmesi temeline dayanır. Doğrusallık, kesinlik, doğruluk, stabilite, tayin edilebilme sınırı ve miktar belirleme sınırı gibi parametreler ICH Guidelines e göre çalışıldı. Bulgular. UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometri ve Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri yönteminin kalibrasyon eğrileri 1-14 g ml -1 derişim aralığında, Spektroflorometride ng ml -1 derişim aralığında, GC-MS yönteminde g ml -1 derişim aralığında doğrusaldır. Flurbiprofen için gün-içi ve günler arası kesinlik değerleri %4.95 den ve doğruluk (bağıl hata) %3.67 den küçüktür. Sonuç. Geliştirilen bu yöntemler ile flurbiprofen etkin maddesini içeren beş farklı ilaç preparatında (Majezik, Frolix, Maximus, Zero-P ve Fortine) flurbiprofen miktar tayini yapıldı. Elde edilen analiz sonuçları değerlendirildi ve geliştirilen yöntemler istatistiksel olarak karşılaştırıldı. Anahtar Kelimeler: Flurbiprofen, gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi, geçerlilik testi, spektroflorometri, türev-spektrofotometri, UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometri. VI

10 ABSTRACT Quantitation of Flurbiprofen with Analytical Methods in the Pharmaceutical Preparations Aim. In this study, UV-Visible Zone Absorption Spectrophotometry, First Derivative Absorption Spectrophotometry, Spectrofluorometry and GC-MS methods were developed for determination of flurbiprofen in pharmaceutical preparations. Material and Method. In UV-Visible Zone Absorption Spectrophotometry, absorbance values of flurbiprofen solutions were measured at 198 and 246 nm. In first derivative spectrophotometry, absorbance values were measured at 213, 233 and 260 nm. In spectrofluorometry, emission values of flurbiprofen solutions were measured at 308 nm. GC-MS method is based on the derivatization of flurbiprofen with MSTFA. Parameters such as linearity, precision, accuracy, stability, limit of detection and limit of quantification were studied according to the ICH Guidelines. Results. Calibration curves of UV-Visible Zone Absorption Spectrophotometry and First Derivative Absorption Spectrophotometry methods were linear between the concentration range of 1-14 μg ml -1, in spectrofluorometry between the concentration range of ng ml -1, in GC-MS method between the concentration range of μg ml -1. Within- and between-day precision values for flurbiprofen were less than 4.95% and accuracy (relative error) was better than 3.67%. Conclusion. Quantitation of flurbiprofen was performed with these methods which is developed in five different pharmaceutical preparations containing the active ingredient flubiprofen (Majezik, Frolix, Maximus, Zero-P and Fortine). Obtained analysis results were evaluated and the developed methods were compared as statistics. Key Words: Flurbiprofen, gas chromatography-mass spectroscopy, validation test, spectrofluorometry, derivative spectrophotometry, UV-Visible zone absorption spectrophotometry. VII

11 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ GC-MS MSTFA NMR MS HPLC LOD LOQ ICH : Gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi : N-metil N-trimetil silil trifloroasetamit : Nükleer manyetik rezonans : Kütle spektroskopisi : Yüksek performanslı sıvı kromatografisi : Gözlenebilme sınırı : Tayin alt sınırı : International conference on harmonization VIII

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 2.1. Flurbiprofenin kimyasal yapısı... 2 Şekil 2.2. Düzlem-polarlanmış bir ışın Şekil 2.3. Elektromanyetik spektrumun bölgeleri Şekil 2.4. Elektronik yapıların temsili gösterimi Şekil 2.5. Bir molekül için elektronik. titreşimsel ve rotasyonal enerji seviyelerini gösteren enerji diyagramı Şekil 2.6. Absorblayan bir çözeltiye giren P 0 şiddetindeki ışın demetinin P şiddetine düşmüş olarak çıkması Şekil 2.7. Çift ışın yolu spektrofotometrenin temel bileşenleri Şekil 2.8. Absorbans ve türev eğrisi spektrumları Şekil 2.9. Türev absorbsiyon spektrumlarının değerlendirilmesi a) Pikten pike ölçüm, b) Pikten sıfıra ölçüm ve c) Teğet ile ölçüm Şekil Gaz kromatografi cihazının akış şeması Şekil Kütle spektrometresinin parçaları Şekil 4.1. UV-Görünür bölge spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin absorbsiyon spektrumları Şekil 4.2. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin birinci-türev absorbsiyon spektrumları Şekil 4.3. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen kalibrasyon eğrileri Şekil 4.4. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen kalibrasyon eğrileri Şekil 4.5. Majezik farmasötik preparatının UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrumları (6 µg ml -1 ve 12 µg ml -1 ) IX

13 Şekil 4.6. Majezik farmasötik preparatının birinci-türev absorbsiyon spektrumları (6 µg ml -1 ve 12 µg ml -1 ) Şekil 4.7. Spektroflorometrik yöntem çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin uyarma ve yayma spektrumları Şekil 4.8. Spektroflorometrik yöntem kalibrasyon eğrisi Şekil 4.9. Majezik farmasötik preparatının uyarma ve yayma spektrumları (150 ng ml -1 ve 250 ng ml -1 ) Şekil GC-MS çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin kromatogramları (a: türevsiz. b) türevli tarama modu) Şekil Reaksiyon süresi ve sıcaklığın türevlendirme üzerine etkisi Şekil GC-MS çalışmasında flurbiprofen çözeltisinin (1 g ml -1 ) kütle spektrumu (türevli tarama modu) Şekil GC-MS çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin GC-MS kromatogramları (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4 ve 5 g ml -1 ) (SIM modu, m/z 180) Şekil GC-MS yöntem kalibrasyon eğrisi Şekil Majezik farmasötik preparatının GC-MS kromatogramı (2 µg ml -1 ve 5 µg ml -1 ) X

14 TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 3.1. Flurbiprofen için GC-MS çalışmasında uygulanan kromatografik yöntem şartları Tablo 4.1. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofene ait kalibrasyon eğrileri ile ilgili istatistiki değerler Tablo 4.2. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofene ait kalibrasyon eğrilerinin istatistiki değerleri Tablo 4.3. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri Tablo 4.4. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri Tablo 4.5. Flurbiprofenin UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen kararlılık (stabilite) değerleri Tablo 4.6. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri Tablo 4.7. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri Tablo 4.8. Spektroflorometrik çalışmada flurbiprofene ait kalibrasyon eğrisinin istatistiki değerleri Tablo 4.9. Spektroflorometrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri Tablo Flurbiprofenin spektroflorometrik yöntemle belirlenen kararlılık (stabilite) değerleri Tablo Spektroflorometrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri XI

15 Tablo GC-MS çalışmasında flurbiprofene ait kalibrasyon eğrisi ile ilgili istatistiki değerler...58 Tablo GC-MS yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri Tablo Flurbiprofenin GC-MS yöntemle belirlenen kararlılık (stabilite) değerleri...60 Tablo GC-MS yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri XII

16 1. GİRİŞ Non-steroidal antiinflamatuar ilaçlar günümüzde inflamasyonla gelişen hastalıkların tedavisinde en çok tercih edilen ilaçlardan birisidir. Bu nedenle ağrı, ateş ve inflamasyonla seyreden hastalıkların tedavisinde narkotik analjeziklere ve steroid yapıdaki antiinflamatuar ilaçlara göre oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. 1-3 Flurbiprofen, analjezik, antipiretik ve antienflamatuar etkilere sahip fenil alkanoik asit türevi güçlü bir nonsteroidal antiinflamatuar ilaçtır. 4 Flurbiprofen, oral yolla alındıktan sonra hızlı bir şekilde gastrointestinal sistemden absorbsiyona uğrar ve yaklaşık 1.5 saat içinde kan doruk seviyelerine ulaşır. Tavsiye edilen günlük doz; bölünmüş dozlar halinde mg'dır. Semptomların şiddetine göre günlük doz toplam 300 mg'a çıkarılabilir. Çocuklarda etkinliği ve güvenliği kanıtlanmadığı için 15 yaşın altındaki çocuklarda kullanılmamalıdır. Literatür taramasında, flurbiprofenin ticari preparatlarda ve plazmada miktar tayinine yönelik çalışmalara ulaşıldı. Bu araştırmada flurbiprofenin farmasötik preparatlarda miktar tayini için Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri, Spektroflorometri ve Gaz kromatografisi-kütle Spektroskopisi (GC-MS) yöntemi ile ilgili bir çalışmaya ulaşılamadı. Bu çalışmada, standart çözeltilerde flurbiprofenin tayini için UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometri, Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri, Spektroflorometri ve GC-MS yöntemlerinin geliştirilerek, geçerlilik testlerinin yapılması ve bu yöntemlerle flurbiprofen etkin maddesini içeren farklı ilaç preparatlarında flurbiprofen miktar tayininin yapılması amaçlandı. 1

17 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Flurbiprofen Flurbiprofen; romatoid artrit, osteoartrit ve kronik romatizmal hastalıkların tedavisinde kullanılan non-steroidal antiinflamatuar bir ilaçtır. 5,6 Ayrıca bursit ve tendinit gibi yumuşak doku enflamasyon ve yaralanmalarının semptomların giderilmesinde de kullanılmaktadır. Antienflamatuar etkilerinin görülebilmesi için analjezik etki amacıyla kullanılan dozlardan daha yüksek dozlarda verilmesi gerekir. Analjezik etkisi siklooksijenaz enzimini bloke ederek prostaglandin sentezini inhibe etmesine bağlıdır. Aynı zamanda lökosit migrasyonunu da inhibe eder. Diğer benzer ilaçlar gibi bu da Tromboksan A2 yapımını engelleyerek geçici antiagregan etkiler gösterir. İn vitro trombin ve kollajene karşı trombosit yanıtını inhibe eder. Adenozin difosfat ve adrenalinin yaptığı trombosit agregasyonunu ikinci fazda durdurur. Flurbiprofenin ilgi çeken bir özelliği plazma denge derişiminin oldukça altında bile etkili olduğunun gösterilmiş olmasıdır. Flurbiprofenin %99 u plazma proteinlerine bağlanır. 7 Oksidasyon ve konjugasyon yolu ile metabolitlerine dönüşür Flurbiprofenin kimyasal yapısı Şekil 2.1 de verilmiştir. Molekül kütlesi g mol -1, erime noktası 169 C, 4 kapalı formülü C 15 H 13 FO 2 olup asetonitril içinde iyi çözünür. Şekil 2.1. Flurbiprofenin kimyasal yapısı 2

18 2.2. Flurbiprofen ile İlgili Yapılan Çalışmalar Qayyum ve ark. 11 insan plazmasında flurbiprofenin tayini için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemini geliştirmişlerdir. Çalışmada LiChrosper marka C 18 kolonu (10 cm, 4.6 mm, 5 µm), asetonitril 20 mm fosfat tamponu (ph 3.0) (40:60 h/h) mobil fazı, 2.5 ml dak -1 kolon akış hızı, 20 µl enjeksiyon hacmi parametreleri kullanılmıştır. Çalışmada naproksen internal standart olarak kullanılmıştır. Stok flurbiprofen çözeltisi metanolde hazırlanmıştır. Bu çözeltiden µg ml -1 derişim aralığında standart çözeltiler hazırlanarak kromatogramları alınmıştır. Flurbiprofen etkin maddesi çözeltisi kromatogramlarının pik alanı/internal standart pik alanı oranı ile derişimi göz önünde bulundurularak kalibrasyon eğrisi türetilmiştir. Eğrinin regresyon denklemi y=746634x ve korelasyon katsayısı (r) olarak tayin edilmiştir. Çalışmanın miktar tayin sınırı 0.25 µg ml -1 olarak tayin edilmiştir. Kesinlik bağıl standart sapma ile ifade edilmiş olup % BSS % 9.49 dan küçük bulunmuştur. Çalışmada plazmadan flurbiprofen ekstraksiyonu sıvı-sıvı faz yöntemi ile yapılmış olup ortalama geri kazanım % 97.0 olarak bulunmuştur. Geliştirilen seçici ve hassas HPLC yöntemi insan plazmasında flurbiprofenin belirlenmesi için kullanılmıştır. Bunun için 22 insana 100 mg olacak şekilde flurbiprofen tableti (Ansaid) oral yoldan verildikten sonra 0-24 saat aralığında farklı zamanlarda kan örnekleri alınmıştır. Ekstraksiyon sonucu analizler yapılmış ve derişim zaman grafiği çizilmiştir. Sonuç olarak HPLC yöntemi valide edilerek insan plazmasında flurbiprofen tayini başarılı bir şekilde yapılmıştır. Patel ve ark. 12 insan idrarında flurbiprofen ve iki metabolitinin belirlenmesi için doğru basit ve seçici bir yöntem olan UV dedektörlü HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Waters C 18 kolon (3.5 µm, 75 mm x 4.6 mm), asetonitril-su-%0.1 trietilamin içeren sumetanol (60:40 h/h) mobil fazı, 1.0 ml dak -1 kolon akış hızı, 20 µl enjeksiyon hacmi 3

19 kullanılmıştır. Çalışma 254 nm dalga boyuna sahip UV dedektör kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Flurbiprofen ve iki metaboliti 1-(naphthen 1-yl) ethylamine ile kolon öncesi türevlendirme yapılarak analiz gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen ve geçerlilik testi yapılan yöntem flurbiprofen tableti verilen sağlıklı bir insan idrarında flurbiprofen ve iki metabolitinin başarılı bir şekilde belirlenmesi ile sonuçlanmıştır. USP Farmakopesi 13 tablet ve göz damlasında flurbiprofenin tayini için titrimetrik ve HPLC yöntemlerini tavsiye etmiştir. Titrimetrik yöntemde flurbiprofen alkol içinde çözülerek fenolftalein indikatörü eşliğinde 0.1 M sodyum hidroksit ile titre edilerek dönüm noktası tayin edilmiş ve stokiyometrik faktörden yararlanılarak flurbiprofenin miktarı tayini yapılmıştır. Diğer yöntem ise HPLC olup su-asetonitrilasetik asit (60:35:5, h/h) mobil fazı, 1.0 ml dak -1 kolon akış hızı, 20 µl enjeksiyon hacmi ve (3.5 µm, 75 mm x 4.6 mm) özelliklere sahip kolon kullanılmıştır. Sonuç olarak farmakopede tavsiye edilen yöntemlerin farmasötik preparatlarda flurbiprofen etkin maddesinin tayininde başarı ile kullanılabileceği belirtilmiştir. Knadler ve ark. 14 insan plazmasında flurbiprofenin tayini için doğru, basit ve seçici bir yöntem olan UV dedektörlü HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Çalışma ODS kolon (5 µm, 33 mm x 4.6 mm), asetonitril-metanol-su (15:60:25, h/h) içeren mobil fazı, 1.2 ml dak -1 kolon akış hızı, 25 µl enjeksiyon hacmi kullanılarak plazma örneklerinde flurbiprofen miktar analizi yapılmıştır. Plazmadan flurbiprofenin ekstraksiyonu sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen ve geçerlilik testi yapılan HPLC yönteminin insan plazmasında flurbiprofenin için 50 mg flurbiprofen içeren tablet sekiz gönüllüye oral yoldan verildikten sonra farklı zamanlarda kan örnekleri alınmıştır. Elde edilen sonuçlardan flurbiprofen biyoyararlanım parametreleri bulunmuştur. Maksimum zaman, maksimum derişim ve eğri altında kalan alan sırası ile 2.70 saat, 2.40 µg ml -1 ve 12.2 µg ml -1 h olarak 4

20 bulunmuştur. Sonuç olarak geliştirilen HPLC yönteminin insan plazmasında flurbiprofenin tayini başarılı bir şekilde gerçekleştirilerek farmakokinetik çalışma yapılmıştır. Chao ve ark. 15 metanol ve etil alkol içinde flurbiprofen ve 14 dağılma ürününün belirlenmesi için bir GC-MS yöntemi geliştirmişlerdir. GC-MS çalışmasında; Varian 3800 GC/Satürn 2000 ITMS sistemi ve SPB-5 kolon (30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm film kalınlığı) kullanarak 1 ml dak -1 akış hızı, 10 µl enjeksiyon hacmi ve sıcaklık programı 100 C de 2 dakika, 10 C 1 dakikada 250 C ye yükseltilerek 10 dakika bekletilerek uygulanan fırın sıcaklık programıyla analiz gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak geliştirilen GC-MS yönteminin, çözücü içinde bekletilen flurbiprofen ve 14 dağılma ürününün belirlenmesinde başarı ile kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Başka bir çalışmada Hamoudova ve ark. 16 farmasötik preparatlarda flurbiprofen ve ibuprofenin aynı anda tayini için bir kapiler elektroforez yöntemi geliştirmişlerdir. Kapiler elektroforez çalışmasında; PrinCE kapiler elektroforez sistemi, silika kapiler kolon (100 µm, 60 cm), 20 mm N-(2-astamid)-2-aminoetansülfonik asit- 20 mm imidazol içeren tampon sistemi ve 232 nm dedektör dalga boyu çalışma parametreleri kullanılmıştır. Flurbiprofen etkin maddesinin alıkonma zamanı 4.3 dakika civarındadır. Flurbiprofenin 1-60 µg ml -1 derişim aralığında kalibrasyon eğrisi türetilmiştir. Eğrinin regresyon denklemi y=0.2006x ve korelasyon katsayısı (r) olarak tayin edilmiştir. Kesinlik bağıl standart sapma ile ifade edilmiş olup gün içi ve günler arası % BSS % 1.29 dan küçük bulunmuştur. Yöntemde flurbiprofenin gözlenebilme tayin limiti 0.1 µg ml -1 olarak bulunmuştur. Geliştirilen ve geçerlilik testi yapılan kapiler elektroforez yöntemi flurbiprofen içeren bir farmasötik dozaj formuna uygulanmış ve tabletten geri kazanım % 99.7 ile % arasında bulunmuştur. Sonuç olarak 5

21 geliştirilen yöntemin farmasötik preparatlarda flurbiprofen etkin maddesinin tayininde başarı ile kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Tsitsimpikou ve ark. 17 kısrak türü hayvan idrarında flurbiprofen ve metabolitlerinin tayini için bir GC MS yöntemi geliştirmişlerdir. GC MS çalışmasında; Hewlett-Packard 5890 Network GC sistem, 5970 kütle spektroskopisi dedektörü, otomatik örnekleyici ve HP Ultra 2 kolon (12 m x mm ID, film kalınlığı 0.33 μm) kullanılarak 1 ml dak -1 akış hızı, 1 µl enjeksiyon hacmi ve sıcaklık programı C de 1.0 dakika, 15 0 C yükselterek C de 1.0 dakika bekletilerek, sonra dakikada 10 0 C yükselterek C de 5 dakika bekletilerek uygulanan fırın sıcaklık programı ile analiz gerçekleştirilmiştir. İdrardan flurbiprofenin ekstraksiyonu sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Ekstraktlar N-metil N-trimetil silil trifloroasetamit (MSTFA) ile türevlendirme yapılarak duyarlılık arttırılmıştır. Geliştirilen ve geçerlilik testi yapılan GC-MS yönteminin kısrak idrarında flurbiprofenin için 500 mg flurbiprofen içeren tablet iki kısrak hayvanına oral yoldan verildikten sonra 1 ile 84 saat arasındaki farklı zamanlarda idrar örnekleri alınmıştır. Flurbiprofenin idrardaki derişimlerinin en çok olduğu zaman 1-3 saat arasında olup 204 µg ml -1 olarak bulunmuştur. Sonuç olarak geliştirilen GC-MS yöntemi ile kısrak idrarında flurbiprofenin tayini başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Park ve ark. 18 rat plazmasında flurbiprofenin kantitatif tayini için floresans dedektörlü bir HPLC yöntemini geliştirmişlerdir. Çalışmada C 18 ters faz kolonu (25 cm, 4.6 mm, 5 µm), asetonitril-su-fosforik asit (60:39.5:05 h/h) mobil fazı, 1.5 ml dak -1 kolon akış hızı, 20 µl enjeksiyon hacmi, 250 nm eksitasyon (uyarma) 285 nm emisyon (yayma) şiddetine sahip dedektör kullanılmıştır. Stok flurbiprofen çözeltisi metanolde hazırlanmıştır. Bu çözeltiden µg ml -1 derişim aralığında standart çözeltiler hazırlanarak kromatogramları alınmıştır. Flurbiprofen etkin maddesinin 6

22 kromatogramlarının yüksekliğine karşı derişimi göz önünde bulundurularak kalibrasyon eğrisi türetilmiştir. Çalışmanın regresyon denkleminden çıkan korelasyon katsayısı (r) olarak bulunmuştur. Çalışmanın miktar tayin limiti 0.05 µg ml -1 olarak tayin edilmiştir. Kesinlik bağıl standart sapma ile ifade edilmiş olup % BSS 1.37 den küçük bulunmuştur. Çalışmada plazmadan flurbiprofen ekstraksiyonu sıvı-sıvı faz ile yapılmış olup ortalama geri kazanım % 95.1 olarak bulunmuştur. Geliştirilen seçici ve hassas HPLC yöntemi rat plazmasında flurbiprofenin belirlenmesi için kullanılmıştır. Bunun için ratlara 2.5 mg kg -1 olacak şekilde flurbiprofen intravenöz yoldan verildikten sonra saat aralığında farklı zamanlarda kan örnekleri alınmıştır. Ekstraksiyon sonucu elde edilen flurbiprofen derişimleri bulunmuştur. Sonuç olarak HPLC yöntemi valide edilerek rat plazmasında flurbiprofenin tayini başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Sajeev ve ark. 19 farmasötik preparatlarda flurbiprofenin tayini için UV Spektrofotometri ve HPLC yöntemlerini geliştirmişlerdir. Flurbiprofenin stok çözeltisi her iki yöntem içinde 0.1 M fasfat tamponunda (ph 6.4) hazırlandı. Flurbiprofen UV Spektrofotometri yöntem için 2-64 µg ml -1 derişim aralığında; HPLC yöntem için ng ml -1 derişim aralığında çalışma çözeltileri hazırlanmıştır. UV absorbansları 248 nm de ölçülmüştür. HPLC çalışmasında ise C 18 ters faz kolon (5µm, 125 mm x 4.6 mm). metanol-asetonitril-25 mm fosfat tamponu (ph 5.6) (40:20:40; h/h) mobil fazı, 0.75 ml dak -1 kolon akış hızı, 20 µl enjeksiyon hacmi ve 248 nm dedektör dalga boyu çalışma parametreleri kullanılmıştır. Flurbiprofen etkin maddesinin absorbans ve kromatogramlarının pik alanı bulunarak derişimine karşı kalibrasyon eğrisi türetilmiştir. Eğrilerin regresyon denklemi UV için y=7.59x10-2 x+4.62x10-2, HPLC için y=1.26x10 2 x+1.48x10 3 ; korelasyon katsayıları sırası ile ve olarak bulunmuştur. Kesinlik bağıl standart sapma ile ifade edilmiş olup güniçi ve günler arası 7

23 % BSS % 0.49 dan küçük bulunmuştur. Çalışmanın doğruluğu bağıl hata ile verilmiş olup güniçi ve günler arası bağıl hata % 0.47 den küçük bulunmuştur. Geliştirilen ve valide edilen UV Spektrofotometri ve HPLC yöntemleri flurbiprofen içeren bir farmasötik dozaj formuna uygulanmış ve tabletten geri kazanım % 99.5 ile % arasında bulunmuştur. Sonuç olarak geliştirilen yöntemlerin farmasötik preparatlarda flurbiprofen etkin maddesinin tayininde başarı ile kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Başka bir çalışmada da Hutzler ve ark. 20 insan plazmasında flurbiprofenin tayini için doğru, basit ve seçici bir yöntem olan floresans dedektörlü HPLC yöntemi geliştirmişlerdir. Çalışma Spheri 5 C 18 kolon (5 µm, 100 mm x 4.6 mm), asetonitril 20 mm fosfat tamponu (ph 3.0) (40:60. h/h) içeren mobil fazı, 1.0 ml dak -1 kolon akış hızı, 20 µl enjeksiyon hacmi kullanılarak plazma örneklerinde flurbiprofen miktar analizi yapılmıştır µg ml -1 derişim aralığında flurbiprofen çalışma çözeltileri hazırlanmıştır. Çalışmada 2-fluro-4-bifenilasetik asit internal standart olarak kullanılmıştır. Flurbiprofen etkin maddesinin kromatogramlarının pik alanı/internal standart pik alanı oranı ile derişimi göz önünde bulundurularak kalibrasyon eğrisi türetilmiştir. Çalışmanın regresyon denklemi ve korelasyon katsayısı sırasıyla y=1.92x10-3 x+1.40x10-4 ve olarak bulunmuştur. Yöntemde flurbiprofen tayin alt limiti 0.25 µg/ml, kesinlik % BSS ile değerlendirilmiş olup gün içi % 9.5 ve günler arası % 8.3 den küçük olarak bulunmuştur. Çalışmanın plazmadan ortalama geri kazanım % 90.1 olarak bulunmuştur. Ayrıca stabilite çalışmaları yapılmış olup oda sıcaklığı, +4 0 C de 24 saat, C bir ay stabil olduğu gözlenmiştir. Geliştirilen ve valide edilen HPLC yönteminin insan plazmasında flurbiprofenin belirlenmesi için 50 mg flurbiprofen içeren tablet 12 gönüllüye oral yoldan verildikten sonra farklı zamanlarda kan örnekleri alınmıştır. Elde edilen sonuçlardan flurbiprofenin HPLC 8

24 yöntemi ile insan plazmasında başarılı bir şekilde tayininin yapılabileceği gösterilmiştir Spektroskopik Yöntemler Spektroskopik yöntemler; atomik ve moleküler spektroskopiye dayanan geniş bir analitik yöntemler grubudur. İnorganik ve organik bileşiklerin kalitatif ve kantitatif analizlerinde spektroskopik yöntemler sıklıkla kullanılmaktadır. Spektroskopi, çeşitli tipte ışınların madde ile etkileşimini inceleyen bilim dalı için genel bir terimdir. Bir örnekteki atom, molekül veya iyonların bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın ölçülmesi ve yorumlanmasına spektroskopi denir. 21 Atom, molekül veya iyonun elektromanyetik ışıma ile etkileşimi sonucu dönme, titreşim ve elektronik enerji seviyelerinde değişiklikler spektroskopinin temelini oluşturur. 22,23 Eskiden sadece elektromanyetik ışıma ile madde arasındaki etkileşimlerle ilgilenilirdi; ancak bugün için spektroskopinin kapsamı madde ve diğer enerji türleri arasındaki etkileşimleri de içerecek şekilde genişletilmiştir Elektromanyetik Işımanın Genel Özellikleri Işın veya elektromagnetik ışıma uzayda çok büyük bir hızla hareket eden bir enerji şeklidir. Elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışın, radyo dalgaları ve X ışınlarıdır. Işının uzaydaki hareketi dalgalar halinde olur. Gama ışınları, ultraviyole ışınları, mikrodalgalar ve radyo frekansı ışınları varlıkları daha zor anlaşılan ışınlardır. 21 Elektromanyetik ışımanın dalga ve tanecik olarak davrandığı ispatlanmıştır. Işın enerjisinin absorpsiyonu ve emisyonuyla ilgili olayların açıklanmasında dalga modeli başarılı olamamıştır. Bu olayların anlaşılabilmesi için, bir parçacık modeli geliştirilmiştir; bu modelde elektromanyetik ışın, enerjileri ışın frekansıyla orantılı ve 9

25 foton adı verilen parçacıklar veya dalga paketlerinden oluşmuş olarak görülür. Işının bu şekilde parçacıklar ve dalgalar halinde, çift özellikle algılanması, birbirini dışlayan değil, aksine tamamlayan kavramlar olarak alınmalıdır. Gerçekten de dalga-parçacık çift özelliği elektron, proton ve diğer temel parçacıkların davranışlarını açıklamada kullanılmış ve dalga mekaniği tarafından tümüyle kabul görmüştür. 23 Elektromanyetik ışının, dalga boyu, frekans, hız ve genlik gibi parametreleri de içeren birçok özelliği klasik sinüs dalga modeliyle açıklanabilir. Ayrıca elektromanyetik ışının, yayılımı hiçbir destek ortamı gerektirmez ve boşluktan (vakum) kolaylıkla geçebilir. 24 Elektromanyetik ışıma, hem elektrik alan vektörü hemde magnetik alan vektörüne sahiptir. Bu iki alan sinüsoidaldır ve ışının yayılma yönüne ve birbirlerine diktir. Bir ışının maddeyle ilişkisi, bu iki alan vektörü ile olur. Şekil 2.2, düzlempolarlanmış bir ışını gösterir. Düzlem-polarlanmış ifadesi ile elektrik ve manyetik alanların sadece birer düzlemde titreşim yaptığı, diğer doğrultulardaki titreşimlerin sönümlendiği kastedilmektedir. 21 Şekil 2.2. Düzlem-polarlanmış bir ışın Görünür ışık dalgaları, elektromanyetik dalganın sadece çıplak gözle görülebilen kısmına karşılık gelir. Biz bu dalgaları, gökkuşağında oluşan renkler olarak görebiliriz. Buradaki her bir renk farklı bir dalga boyuna karşılık gelir. Kırmızı renge 10

26 karşılık gelen dalga, görünür bölgenin en uzun dalga boyuna karşılık gelirken, mor en kısa dalga boylarına karşılık gelir. Görünür bölgedeki bütün dalgalar birlikte gözlendiği zaman beyaz ışığı oluştururlar. Bunun terside doğrudur. Yani beyaz ışığı bir prizmadan geçirirsek görünür bölgedeki bütün dalgaları gözleriz. Spektroskopi kavramı önceleri görünür bölge ışınının çeşitli dalga boylarına ayrılıp spektrumlarının elde edilmesi için kullanılırken günümüzde ise elektromagnetik ışınların madde ile etkileşimini inceleyen genel bir bilim dalı olarak tanımlanmaktadır. Önceleri sadece elektromanyetik ışıma ile madde arasındaki etkileşimlerle ilgilenilirdi; ancak bugün için spektroskopinin kapsamı madde ve diğer enerji türleri arasındaki etkileşimleri de içerecek şekilde genişletilmiştir. Elektromagnetik ışının madde (atom ya da molekül) tarafından soğrulması veya yayılması inceleniyorsa sırasıyla, soğurma (absorpsiyon) veya yayma (emisyon) spektroskopileri olarak adlandırılır. Işının moleküller tarafından soğrulması moleküldeki atomların türüne, düzenlenmesine, moleküllerin şekline, büyüklüğüne vb. özelliklerine bağlı olduğundan spektroskopik yöntemler maddelerin yapılarının ve stereokimyasal özelliklerinin bulunması, tanınması ve saflık kontrolü gibi çok geniş bir alanda uygulanmaktadır. Spektroskopik çalışmalarda bütün dalga boylarını verecek ve hangi dalga boylarının absorplandığını tespit edecek tek bir cihaz yapmak mümkün olmadığından, belirli dalga boyları arasında çalışan cihazlar geliştirilmiştir. 11

27 Şekil 2.3. Elektromanyetik spektrumun bölgeleri nm dalga boylarındaki ışınlarla çalışan cihazlara ultraviyole ve görünür alan, µm dalga boylarında çalışan cihazlara infrared ve dalga boyları yüzlerce metreye kadar değişen radyo dalgalarıyla çalışan cihazlara da nükleer magnetik rezonans cihazları denir. Bu cihazların geçerli oldukları spektroskopi yöntemleri sırasıyla Ultraviyole-Görünür Bölge (UV-Visible), Infrared (IR titreşim) ve Nükleer Magnetik Rezonans (NMR) spektroskopileri olarak adlandırılır. 24,25 Analitik amaçlar için enerjiye göre elektromagnetik ışıma spektrumunu gösteren diyagram Şekil 2.3 de verilmiştir Işının Absorplanması Çeşitli dalga boylarında ışın içeren bir demet, saydam ve şeffaf bir ortamdan geçirilirse, içinden bazı dalga boylarının kaybolduğu görülür. Buna ışının absorplanması denir. Absorpsiyonla ışın enerjisi, maddenin iyon, atom veya moleküllerine aktarılır. Böylece iyon, atom veya moleküller uyarılmış hale geçerler. Uyarılmış bir atom veya molekül 10-8 saniye kadar yaşayabilir. Sonra absorpladığı ışın 12

28 enerjisini geri vererek tekrar eski veya temel haline döner. Madde tarafından absorplanan ışın enerjisinin geri verilmesi, genellikle ısı şeklinde olur ve madde az çok ısınır. Bazı maddelerde ise absorplanan ışın enerjisi daha uzun dalga boylu ışınlar halinde yayılır. Buna fotolüminesans olayı denir. Bu olayın çok kısa süreli olanına floresans, daha uzun süreli olanına fosforesans adı verilir. Floresans singlet uyarılmış halden fosforesans ise triplet uyarılmış halden singlet temel hale olan elektronik geçişleri temsil eder. Singlet ve triplet uyarılmış haller elektron spini bakımından farklıdır. Singlet uyarılmış halde bulunan elektronun spini singlet temel hale göre aynı yönlüdür. Triplet uyarılmış haldeki elektronun spini ise singlet temel haldeki ile ters yönlüdür. Bu durum şekil 2.4 de gösterilmiştir. Şekil 2.4. Elektronik yapıların temsili gösterimi Bir maddenin temel haliyle uyarılmış halleri arasındaki enerji farkları, başka bir maddeninkinden farklı olduğundan, her maddenin kendine özgü bir absorpsiyon spektrumu vardır. Absorpsiyon spektrumları genel olarak iki kısma ayrılır Atomik Absorpsiyon Spektrumları 2. Moleküler Absorpsiyon Spektrumları 13

29 Atomik Absorpsiyon Spektrumları Polikromatik UV veya görünür bölge ışını civa veya sodyum gazı gibi tek atomlu bir ortamdan geçirilirse demetten bazı ışınların örneğin sodyum buharından sarı ışının kaybolduğu görülür. Bu durum, sodyum atomlarında 3s enerji seviyesinde bulunan bir elektronun sarı ışını absorplayarak 3p enerji seviyesine çıkmasıyla açıklanabilir. Atomlarda, en dış tabaka elektronları ultraviyole-görünür bölge ışınlarıyla, iç tabaka elektronları da X-ışınları ile uyarılır. X-ışınları görünür bölge ışınlarından binlerce daha fazla enerjilidirler. Atomların, en dış tabaka elektronlarının uyarılması üzerine kurulmuş olan spektroskopi dalına atomik absorpsiyon, iç tabaka elektronlarının uyarılması üzerine kurulmuş olan spektroskopi dalına da X-ışınları spektroskopisi denir Moleküler Absorpsiyon Spektrumları Moleküller, UV-görünür bölge ve infrared ışınları ile uyarıldıkları zaman, kuantlaşmış 3 tip geçiş vardır. Bunlar elektronik, titreşim ve dönme geçişleridir. Bir molekülün toplam enerjisi E T ; E T = E elektronik + E titreşim + E dönme dir. Elektronik geçiş enerjisi; molekülün çeşitli dış orbitallerindeki elektronlarla ilişkin enerji, titreşim enerjisi; atomlar arası titreşimlere ilişkin enerji, dönme enerjisi ise molekül ağırlık merkezi etrafında dönmesine ilişkin enerjidir Titreşim ve dönme geçişleri çok atomlu moleküller için geçerlidir (Şekil 2.5). 14

30 Şekil 2.5. Bir molekül için elektronik, titreşimsel ve rotasyonal enerji seviyelerini gösteren enerji diyagramı Elektronik geçişler, dalga boyları nm arasında olan ultraviyole-görünür bölge ışınlarıyla gerçekleşir. Moleküler absorpsiyon spektroskopisinin, atomik absorpsiyon spektroskopisinden ayrılan en önemli yanı; atomik absorpsiyon spektroskopisinde birbirinden farklı dalga boylarında keskin çizgiler meydana gelmesine karşılık, moleküler absorpsiyon spektroskopisinde, birçok dalga boylarını içine alan geniş absorpsiyon bantlarının meydana gelmesidir. Bir molekülün UV- Görünür bölge absorpsiyon spektrumu, molekülün bağ elektronlarından birinin bir foton enerjisini absorplayarak bir üst elektronik seviyeye geçmesi şeklinde açıklanabilir. Bir madde çözeltisinden belirli bir şiddette polikromatik bir ışın demeti geçirildiğinde, demette bulunan bazı ışınlar madde tarafından absorplanır ve bunun sonucunda ışın, şiddeti azalmış olarak çözeltiyi terk eder 24,26 (Şekil 2.6). 15

31 Şekil 2.6. Absorblayan bir çözeltiye giren P 0 şiddetindeki ışın demetinin P şiddetine düşmüş olarak çıkması Fotonlarla ışın absorblayan atom veya moleküller arasındaki etkileşimin sonucu olarak ışının gücü P 0 dan P ye düşmüş olur. Buna göre ışın demetinin ortamdan geçme oranına geçirgenlik (T ) adı verilir T P P o Şeklinde gösterilir. Geçirgenliğin eksi logaritması absorbans (A) olarak adlandırılır ve absorbans A log 10 T log P P 0 şeklinde formüle edilir. Çalışmalarda absorplanan ışın miktarı ya yüzde geçirgenlik ya da absorbans olarak verilir. Yüzde geçirgenlik: % T P P o 100 Bir çözeltinin absorbansı, ışının çözelti içinde aldığı yol (b) ve çözeltide absorpsiyon yapan taneciklerin derişimiyle (C) doğru orantılıdır. Bu ilişki, Lambert- Beer kanunu ile verilmektedir. A= εbc 16

32 Derişim molar olarak alındığında ε, molar absorblama katsayısı veya molar absorptivite olarak adlandırılır Lambert-Beer Kanunundan Sapmalar Lambert-Beer kanunu sadece çok seyreltik çözeltilere uygulanabilen bir kanundur. Bunun nedeni derişik çözeltilerde madde birbiriyle etkileşir ve bu etkileşmeler sonucunda maddenin absorplama kabiliyeti değişir. Bu da derişimle absorbans arasındaki lineer bağıntının bozulmasına neden olur. Absorplayan maddenin derişimi düşük olabilir; fakat çözeltide bulunan diğer maddelerin derişimi yüksek olursa yine sapma gözlenebilir. Sapmalar, Cihazdan gelen sapmalar 2- Kimyasal maddelerden gelen sapmalar 3- Analizci hatasından gelen sapmalar şeklinde üçe ayrılabilir Ultraviyole-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometreleri Ultraviyole-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometre, elektromagnetik ışının dalga boyunun bir fonksiyonu olarak numunenin absorbans ya da geçirgenliğini ölçmek için kullanılan bir cihazdır. Ultraviyole-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometreleri, 110 nm ile 1000 nm arasında değişen dalga boylarında çalışırlar. Ancak 110 nm ile 190 nm dalga boyu aralığında çalışan cihazlar vakum tertibatlı ve oldukça pahalı cihazlardır. Bundan dolayı laboratuvarlarda kullanılan spektrofotometre cihazları 190 nm ile 800 nm dalga boyu aralığında çalışmaktadırlar. Spektrofotometrelerde elektromagnetik ışın kaynağı olarak nm aralığında ışın üretmek için döteryum lambası ve nm arasında ışın üretmek için tungsten lambası kullanılmaktadır Sspektrofotometreler yapılarına göre tek ışınlı spektrofotometreler ve çift ışınlı spektrofotometreler olmak üzere iki kısma ayrılır. 17

33 Şekil 2.7. Çift ışın yolu spektrofotometrenin temel bileşenleri Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, örnekten ve çözücüden geçen ışık demetleri dedektör üzerine yerleştirilmiş dönen bir ışık bölücü yardımıyla ve ardarda gönderilir (Şekil 2.7). Gelen bu ışık demetlerinin oluşturdukları sinyal ise, alternatif yani periyodik türden olur. Işık bölücünün frekansına ayarlı bir elektronik çoğaltıcı yardımı ile bu alternatif sinyal kaydedilir. Her iki ışık yolundan birbiri peşine gelen ışığın şiddetleri eşit ise, dedektörde herhangi bir sinyal oluşmaz. Örnek bölmesinden geçen ışığın absorpsiyon nedeniyle azaldığı zaman ise, dedektöre gelen sinyal alternatif sinyal olarak algılanır. Çift ışık yollu aletlerde, ışık kaynağının şiddetindeki değişmelerden doğan hatalar ortadan kalkar UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometre Cihazının Kullanım Amaçları 1. Kalitatif Analiz 2. Molekül Yapısını Aydınlatma 3. Kantitatif Analiz 18

34 Kalitatif Analiz ve Molekül Yapısını Aydınlatma Bilinmeyen bir madde saflaştırıldıktan sonra UV spektrumu alınır. Bu spektrum, her yönüyle aynı şekilde daha önce alınmış olan spektrumlarla karşılaştırılır. Bilinmeyen maddenin spektrumu daha önceki madde spektrumlarından hangisine uyuyorsa, bilinmeyen madde o maddedir denilebilir. Bilinmeyen madde, bilim dünyası tarafından bilinmeyen yeni bir madde değil, sadece analizi yapan kişi tarafından bilinmeyen maddedir. Bundan başka maddenin ne olduğu biliniyor fakat saf olup olmadığı bilinmiyorsa, maddenin spektrumu alınır. Spektrumda beklenmedik piklerin görünmesi maddenin saf olmadığını gösterir. Ayrıca, ultraviyole ışınlarla yapılan spektrofotometrik ölçümlerde benzer kromofor grupların belirlenmesinde de yararlı olur. Çok karmaşık yapılı organik moleküllerde, fonksiyonel gruplar dışında kalan bazı kısımları, 180 nm den daha uzun dalga boylarına karşı geçirgendir nm aralığında bir veya daha çok pik gözleniyorsa, molekülde doymamış gruplar, kükürt veya halojen gibi hetero atomların varlığını gösterir. Çoğu zaman, çok sayıda kromofor grup içeren ve yapısı bilinen başka bir molekülün spektrumu ile analitin spektrumu karşılaştırılarak, analitteki fonksiyonel grup hakkında da bir fikir edinilebilir. Fakat genel bir kural olarak, analitin kesin yapısını belirlemek için gerekli bilgileri, sadece utraviyole spektrumlarından elde edemeyiz. Bu sebeple ultraviyole spektrumlarından elde edilen veriler NMR, MS gibi başka fiziksel ve kimyasal verilerle, mümkünse çözünürlük, erime noktası ve kaynama noktası gibi bilgilerle de desteklenmelidir. Kalitatif analizde analitin seyreltik çözeltilerini kullanmak gerekir. Eğer madde gaz formuna dönüştürülebiliyorsa gaz halindeki spektrumları alınarak daha ayrıntılı ve dolayısıyla daha yararlı spektrumlar elde edilebilmektedir. Ultraviyole-Görünür bölge spektroskopisinde kullanılacak çözücünün numuneyi çözmesi, ayrıca, çözücü ile absorpsiyon yapan tür arasında bir etkileşmenin olmaması, eğer varsa da bunları 19

35 dikkate almak gerekir. Örneğin, su, alkol, ester ve keton gibi polar çözücüler, spektrumdaki titreşim ayrıntılarını örtme etkisi gösterirler. Polar çözücüler, hem spektrumun titreşimlerinden ileri gelen küçük piklerin kaybolmasına hem de absorpsiyon bandlarının ve dolayısıyla piklerin esas yerlerinden kaymasına neden olurlar Kantitatif Analiz Ultraviyole-Görünür bölge absorpsiyon spektrofotometri, kimyacıların kantitatif analizlerde en çok faydalandıkları tekniklerden biridir. Kantitatif analizde, ilk önce analizi yapılacak maddenin en iyi absorbans yaptığı dalga boyu belirlenir. Belirlenen dalga boyunda artan derişimlerde hazırlanan bir seri çözeltinin spektrumları alınır ve absorbansları okunur. Derişime karşı absorbans grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrisi elde edilir. Sonra bilinmeyen maddenin derişimi kalibrasyon eğrisi yardımıyla tespit edilir Türev Absorbsiyon Spektrofotometri Yöntemi Türev Absorbsiyon Spektrofotometri; dalga boyunun bir fonksiyonu olarak dalga boyuna karşı absorbansın 1, 2, 3..., n türevidir. F (λ) nın fonksiyonu olarak da/dλ, d 2 A/dλ 2, d 3 A/dλ 3,..., d n A/dλ n Aşağıdaki eşitliklerde Lambert-Beer kanununda elde edilen farklılıklar gösterilmektedir. Zero-order Türev : A= ε x b x C Birinci Türev : da/dλ = b x C x dε/d λ İkinci Türev : d 2 A/dλ 2 = b x C x d 2 ε/d λ 2... n. Türev : d n A/dλ n = b x C x d n ε/d λ n 20

36 Türev absorbsiyon spektrofotometri yöntemi oldukça eskiye dayanır. İlk defa 1920 lerde Rutherford tarafından kütle spektrumları yorumlanmasında kullanılmış sonra genel kullanıma 1950 ler de başlanmış ve bu yöntemi kullanmıştır. 27 Daha sonra da büyük öneme sahip olmuştur. Günümüzde mikro işlemlerin yaygın olarak kullanılması bu yöntemin kolaylıkla analizlere uygulanmasına imkan tanımış ve geliştirilen spektrofotometreler bu şekilde donatılmıştır. Son senelerde yayınlanan ilaç analizlerinde araştırmacıların çoğunda bu yöntemle ilgili çalışmalar bulunmaktadır. Türev absorbsiyon spektrofotometri; türev spektrumlarının kullanılması esasına dayalı bir analiz yöntemidir. Türev eğrilerinin hazırlanması matematiksel işlemler gerektirmektedir. Orjinal spektrum herbir noktasındaki türevinin hesaplanması ve bulunan sonuçların grafiğe geçirilerek yani türev eğrilerinin hazırlanması oldukça zordur. Bilgisayar yardımı ile hesaplamalar yapılabilir. Günümüzde 1 den 4 e kadar türev eğrisi çizen cihazlar bulunmaktadır. Yalnız 3. türevden sonra türev spektrumu alınması pek istenmemektedir. Çünkü ana maddenin yapısı her türev alındığında bozulur. Şekil 2.8. Absorbans ve türev eğrisi spektrumları 21

37 1.Türev; Orijinal absorpsiyon bandının her noktasındaki eğimini anlatır. Burada orijinal spektrumun maksimum noktası kaybolur buna karşılık orijinal spektumda absorbansın yükseldiği kısımlar için pozitif azaldığı kısımlar için negatif değerler almaktadır. Orijinal spektrumdaki eğri üzerinde eğimin en büyük olduğu noktada yani eğrinin yarı yüksekliğine karşılık bir maksimum bir minimum göstermekte ve eğimin en düşük olduğu tepe noktasında sıfırdır. Gaus eğrisinin maksimum noktasında (λ max ) birinci türev eğrisine bir kesim noktasına (zero-crossing) karşılık gelmektedir (da/dλ=0). Birinci türev absorbsiyon spektrumunda %53 civarında eliminasyon vardır ve türev eğrilerinin aynı dalga boyu aralığı içerisinde alınması nedeniyle piklerin genişliği azalmaktadır. Bu azalma birinci türevde yarısına eşittir 2.Türev; Aynı şekilde ikinci türev absorbsiyon spektrumu; orijinal eğrinin maksimum noktasına (λ max ) karşılık gelen bir kesim noktası vardır (d 2 A/dλ 2 =0). İkinci türev absorbsiyon spektrumunda % 40 eliminasyon vardır ve pik genişliğindeki azalma %53 civarındadır. 3.Türev; Aynı şekilde üçüncü türev absorbsiyon spektrumu; orijinal eğrinin maksimum noktasına (λ max ) karşılık gelen bir kesim noktası vardır (d 3 A/dλ 3 =0). Üçüncü türev absorbsiyon spektrumunda % 30 eliminasyon vardır ve pik genişliğindeki azalma % 40 civarındadır. 4.Türev; için d 4 A/dλ 4 =0 kesim noktası, n. türev için d n A/dλ n =0 kesim noktası karşılık gelmektedir. Türev absorbsiyon spektrofotometri; absorpsiyon spektrumunun eğimlerindeki herhangi bir değişikliğe karşı son derece hassastır ve üstüste çakışan piklerin olduğu absorbans bantlarının analizinde çok uygun bir metottur. 27 Türev absorbsiyon spektrumlarıyla karışım içerisinde herhangi bir ayırma işlemi gerekmeksizin bazı maddelerin diğerleri yanında miktar tayinlerinin 22

38 yapılabilmesi mümkündür. Bu da özellikle karışım halinde maddeleri; etkin maddeler olarak içeren farmasötik preparatların analizi için yöntemin çok etkili ve kolay bir miktar tayini yöntemi olmasını sağlar. 28, Türev Absorbsiyon Spektrofotometri Yönteminin Avantajları ve Dezavantajları Türev çalışması orijinal spektrumun eğimleri hakkında bilgi verir ve bunun omuz noktaları ile dönüm noktalarının daha belirgin hale gelmesine neden olur. Böylece bir bileşik daha kolay ve kesin olarak tanınabilir. Çoğunlukla orijinal spektrumda elde edilen bu eğriler birçok pikin üst üste gelmesiyle meydana gelmiştir. Türev alma ile bu absorpsiyon eğrileri daha ayrıntılı şekle girer ve böylece bir anda bulunan piklerin tek tek görünmesi sağlanır. Bilindiği gibi spektrofotometride bulanık çözeltiler ile çalışırken çökme hızı tanecik büyüklüğü gibi faktörlere bağlı olarak büyük oranda hata yapılabilir. Türev eğrilerinin hazırlanması ile bulanıklığın oluşturduğu bu olumsuz etki ortadan kaldırılabilir. Birden fazla maddenin karışım halinde bulunduğu ortamlarda ekstraksiyon ve kromatografi ile herhangi bir ayırma işlemine başvurmaksızın tek tek miktarları tayin edilebilir. Reaksiyon ortamından kaynaklanan gürültü piklerinin yok edilmesi sağlanır. Kullanımı çok kolay olmasına karşılık pahalı spektrofotometrelerde bulunur ve oldukça karmaşık bir elektronik yapıya ihtiyaç vardır. Türev spektrumlarında çok sayıda uyduruk piklerde görülür. Bu pikler bir karışım ile çalışırken başka bileşenlerinde varlığına bizi götürür. Türev derecesi arttıkça bu cins piklerin sayısı da artacağı için karışıklık daha da artacaktır Türev Absorbsiyon Spektrumlarının Değerlendirilmesi Absorbansın türevi derişimle doğru orantılıdır. 1, 2 ve 3. derece türev spektrumlarında ordinat değişimleri, orijinal spektrumun ordinat değerinin 23

39 büyüklüğüyle değil, eğim değişimiyle ilgilidir. Bu nedenle türev eğrisinin apsisteki konumu ile dönüm noktalarının birbirine karşı durumları karakteristiktir. Şekil 2.9. Türev absorbsiyon spektrumlarının değerlendirilmesi a) Pikten pike ölçüm, b) Pikten sıfıra ölçüm ve c) Teğet ile ölçüm Türev spektrumlarının değerlendirilmesinde üç yöntem vardır. Bunlar, pikten pike ölçüm, pikten sıfıra ölçüm ve teğet ile ölçümdür 26 (Şekil 2.9) Kromatografik Yöntemler Kromatografi, karışımlarda bulunan birbirine yakın özellik gösteren bileşenlerin ayrılmasında, tanınmasında ve tayininde yaygın olarak kullanılan birçok farklı yöntemi içeren bir analitik yöntemler topluluğudur. 71 Diğer ayırma yöntemlerinden hiçbirisi kromatografik yöntemler kadar etkili olmayıp uygulamada yaygın bir şekilde kullanılmazlar. Bu nedenle de kromatografik yöntemler daha çok araştırma amacıyla kullanılır. Bu sebeple çok geniş ve verimli bir kullanım alanına sahiptir. Kromatografi ilk olarak yirminci yüzyılın başında Rus botanikçi Mikhail Tswett tarafından bulunmuş ve onun tarafından isimlendirilmiştir. Tswett bu tekniği, toz kalsiyum karbonat doldurulmuş bir cam kolondan bitki pigmentleri çözeltisini geçirerek klorofil ve ksantofil gibi birçok bitki pigmentini ayırmada kullanmıştır. 24

40 Ayrılan maddeler kolonda renkli bantlar şeklinde gözüktüğünden, yöntem için kromatografi adı kullanılmıştır. Bütün kromatografik ayırmalarda; numune gaz, sıvı veya süperkritik bir akışkan olan hareketli faz yardımıyla ile sabit bir faz üzerinden taşınır. Taşınma esnasında bileşenlerin farklı göç hızlarına bağlı olarak ayırma işlemi gerçekleşir. Kromatografik ayırmada seçilen sabit faz ile hareketli fazın birbiri ile karışmaması gerekmektedir. Bu bilgiler ışığında kromatografinin genel bir tanımını yapmaya çalışırsak; bir karışımdaki bileşenler sabit bir ortama ilave edilip bunların belirli bir hareketli faz yardımıyla yüzey adsorpsiyonu, dağılma, iyon değiştirme ve boyut eleme özelliklerine bağlı olarak, sabit ortamdan ayrılma yöntemlerine kromatografi denir Kromatografik Yöntemlerinin Sınıflandırılması Kolon kromatografisinde sabit faz dar bir kolona doldurulur ve hareketli faz basınç yardımıyla bu sabit faz içerisinden geçmeye zorlanır. Düzlemsel kromatografide ise, sabit faz düz bir plaka üzerine tutturulur ve hareketli faz sabit fazın üzerinden kapiler ve yer çekimi etkisi yardımıyla hareket eder. Bunun dışında kromatografik yöntemler ayırma işlemlerinin farklılığına göre çok daha değişik şekillerde sınıflandırılabilir Kromatografide Temel Olan Fiziksel ve Kimyasal Olaylar Kromatografik yöntemlerde maddelerin ayrılmasında etkin olan dört ayrı mekanizma mevcuttur. Bunlar aşağıda özetlenmiştir. 24, Dağılma Kromatografisi Dört ayrı tip sıvı kromatografisi içinde en yaygın kullanılanıdır. Dağılma kromatografisinde, maddeler birbiriyle karışmayan sıvı sabit faz ve hareketli faz arasında dağılır. Hareketli faz olarak tek veya karışım halindeki çözücüler kullanılır. En uygun hareketli faz çeşitli çözücü sistemleri denenerek bulunur. Dağılma 25

41 kromatografisi hareketli ve sabit fazların bağıl polarlıklarına bağlı olarak iki kısma ayrılmaktadır. Sabit faz polar ve hareketli fazda apolar ise buna Normal-Faz Kromatografisi, sabit faz apolar (çoğu zaman bir hidrokarbon) hareketli fazda polar (su, asetonitril, metanol) ise buna da Ters-Faz Kromatografisi denir Adsorpsiyon Kromatografisi Bir karışımdaki maddelerin katı destek maddesi üzerinde farklı kuvvetlerde tutunması prensibine göre birbirlerinden ayrıldıkları kromatografi olarak adlandırılır ve ilk keşfedilen kromatografi tekniğidir İyon Değişim Kromatografisi Bir katı destek maddesinin yapısında bulunan iyonlar, temasta bulunduğu çözelti içindeki aynı cinsten yüklü iyonlarla bir dengeye göre yer değiştirmesi özelliğine dayanan bir kromatografi yöntemidir. Bu amaçla kullanılan katı maddeler, çözelti ortamında hiç çözünmeyen büyük moleküllü doğal maddelerdir. Bunlarda organik ve inorganik diye ikiye ayrılır. Organik iyon değiştiriciler (bunlara reçinelerde denir) suda ve birçok organik çözücüde hiç çözünmeyen, yapılarında sayılamayacak kadar çok anyon ve katyon taşıyan büyük moleküllü maddelerdir. Bunlar hem anyon, hem katyon değiştirmede ve hatta selektif iyon değiştirmede kullanılır. İnorganik iyon değiştiricilerde en çok bilineni zeolitlerdir. Bunlar genel olarak; Na 2 Al 2 Si 4 O 12 formülündedir. İyon değiştirme kromatografisi, ilaçlar ve bunların metabolitleri, serum, gıda koruyucu maddeleri, vitamin karışımları ve şekerler gibi birçok farklı organik ve biyokimyasal sistemlere uygulanabilmektedir Boyut Eleme Kromatografisi Jel geçirgenlik veya jel süzme kromatografisi adı da verilen boyut eleme kromatografisi, özellikle yüksek mol kütleli maddelere uygulanabilen bir tekniktir. 26

42 Boyut eleme kromatografisi için dolgu maddeleri, çözünen madde ve çözücü moleküllerinin içine difüzlenebileceği düzgün bir gözenek ağı içeren küçük boyutlu silis veya polimer taneciklerinden meydana gelmiştir. Gözenekler içinde küçük moleküller etkin bir şekilde tutunabilmekte, büyük moleküllerde gözenek dışında kaldığından dolayı hareketli faz akımı ile kolondan kolaylıkla elüe edilebilmekte ve daha sonrada gözeneklerde tutulan küçük moleküllerde hareketli faz akımı ile yüzeyden kolaylıkla uzaklaştırılabilmektedir. Gözenek içinde ortalama kalma süresi, analit molekülünün etkin büyüklüğüne bağlıdır Gaz Kromatografisi (GC) Gaz kromatografisi yöntemi, uçucu olan veya uçucu hale getirilebilen maddelerin belirli bir sıcaklıkta, taşıyıcı bir gaz yardımıyla, sabit faz içinde ayrılmaları esasına dayanır. 24,25,30,31 Hareketli fazın görevi sadece maddeleri taşımaktır. Sabit faz ise bir katı veya bir katı yüzeyine adsorplanmış (katıya emdirilmiş) sıvı olabilir. Buna göre gaz kromatografisi ikiye ayrılır. 1. Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi (GSC) 2. Sabit fazı sıvı olan gaz-sıvı kromatografisi (GLC) Gaz-katı kromatografisinde, maddeler katı faz üzerinde ve belirli sıcaklıklarda adsorpsiyon-desorpsiyon esasına dayanarak ayrılırlar. Bu yöntemle elde edilen pikler genellikle kuyrukludur. Kuyruklu piklerin birbirlerinden ayrılmasıda oldukça güçtür. Bundan dolayı gaz-katı kromatografisi günümüzde az kullanımaktadır. Genellikle daha çok küçük moleküllü maddelerin ayrılmasında kullanılır. Gaz-sıvı kromatografisinde ise, gözenekli inert bir yüzeye sıvı polimer veya siloksan bileşiğinin emdirilerek meydana getirilen sıvı sabit faz ve hareketli fazı gaz olan bir kromatografi türüdür. Günümüzde gaz-sıvı kromatografisi ilaç, gıda maddeleri, 27

43 vitaminler, şekerler ve farklı organik bileşiklerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır Gaz Kromatografisi Cihazı Gaz kromatografisi cihazı genel olarak altı kısımdan meydana gelir (Şekil 2.10). 1. Taşıyıcı gaz sistemi 2. Numune enjekte kısmı 3. Isıtma kısmı 4. Ayırma kolonu 5. Dedektör 6. Çoğaltıcı ve yazıcıdan oluşmaktadır. Şekil Gaz kromatografi cihazının akış şeması Taşıyıcı Gaz Taşıyıcı gaz, enjekte edilen bileşenlerin kolondan taşınmasını ve maddelerin sabit fazla etkileşimini sağlar. Gaz kromatografisinde H 2, He, N 2, Ne ve Ar gibi gazlar taşıyıcı gaz olarak kullanılır. Ancak H 2 gazının patlayıcı özelliğinden dolayı kullanımı 28

44 kısıtlıdır. Bu nedenle çalışmalarda yaygın olarak He ve N 2 taşıyıcı gaz olarak kullanılmaktadır. Kolon verimliliğini etkileyen taşıyıcı gaz; inert olmalı, toksik olmamalı, ucuz olmalı ve kullanılacak dedektöre uygun olmalıdır. 25, Elektronik Basınç Kontrolü (EPC) GC'de gaz akışı, performansı pek çok yönden etkileyeceği için, akışın kesin ve belirgin olarak kontrolü gerekmektedir. Diğer taraftan taşıyıcı gaz akışının kontrol altında olması alıkonma zamanlarındaki kararlılık için de gerekli olup miktar tayinlerini de hem pik şekilleri, hem de dedektör cevabı açısından etkileyebilir. Sabit basınçta çalışma, düşük kolon akış hızlarında iyi bir performans sağlayabilir. Ancak, sıcaklık programlı analizlerde kolon akışları değişecektir. Basıncın tekrarlanabilir şekilde ayarlanması mekanik basınç ayarlayıcıları ile zor olmaktadır. Teknolojideki son gelişmeler, kılcal kolonlu GC için elektronik basınç kontrolü (EPC) sistemlerinin tasarımını sağlamıştır. EPC, basınç ve akış ayarlamalarında mükemmel bir kesinlik ve kararlılık sağlayarak elektronik basınç programlamasına izin verir. Bu yolla taşıyıcı gazın akışı, sıcaklık artışı sırasında sabit tutulabilir veya basınç gerek duyulan ayırımları, analiz sürelerini veya çalışma sıcaklıklarını sağlamak için ek bir yöntem parametresi olarak kullanılabilir. EPC sistemi, kolonların yanı sıra basınç düzenini sağlamak amacıyla dedektörlerde de kullanılmaya başlanmıştır Enjeksiyon Bloğu Enjeksiyon bölmesinde, kolona gidecek madde miktarı belirlenir. Bu belirleme çeşitli enjeksiyon tipleriyle sağlanır. Enjeksiyon bloğundan numune beş şekilde verilmektedir: 1. Bölmeli (split) enjeksiyon 2. Bölmesiz (splitless) enjeksiyon 29

45 3. Kolona enjeksiyon 4. Doğrudan enjeksiyon 5. Sıcaklık programlı buharlaşmalı enjeksiyon Bölmeli enjeksiyon sisteminde, ani bir buharlaştırma gerçekleştirilir. Sıvı örnek, enjeksiyon sonrası sıcak enjeksiyon bloğuna girer ve burada hızlıca buharlaşır. Buharlaşan örneğin küçük bir miktarı kolona girerken, büyük miktarı atık olarak uzaklaştırılır. Bölme oranı, kullanıcı tarafından kolon akışından kontrol edilir. Bölme oranları kolon özellikleri ve kapasitelerine göre ayarlanır. Bölme oranı= Kolon akışı / Kolon giriş akışı Bu teknikte dar piklerin oluşma olasılığı yüksektir. Bölmeli enjeksiyon daha çok yüksek derişimlerde uygulanır. Böylece kolonun kirlenmesi önlenmiş olur. Bölmesiz enjeksiyon sistemi, enjektörün bölme kapakçığının enjeksiyon sırasında kapatılması yoluyla çalışmaktadır. Örnek buharlaşma kısmında buharlaştırılıp hareketli faz akışı ile kolona gönderilmektedir. Bu tip enjeksiyon daha çok eser madde analizlerinde tercih edilmektedir. Kolona enjeksiyon, soğuk enjeksiyon tipidir. Numune kolon içine doğrudan sıvı halinde enjekte edilir. Enjeksiyon sırasında enjekte edilen kısım soğuktur. Fırın sıcaklığı arttıkça kolon girişinde bulunan madde yavaş yavaş buharlaşır. Bu tür enjeksiyon bütün kılcal kolonlara uygulanabilir. 31,32 Doğrudan enjeksiyonda, enjektörün girdiği kısım fırından bağımsız olarak ısıtılır ve bu sıcaklık hızlıca buharlaşmaya neden olur. Bu teknik, yalnızca çok geniş çaplı kolonlarda uygulanabilir. 30

46 Sıcaklık programlı buharlaşmalı enjeksiyonda, numune cam yoğunlaştırıcı içine enjekte edilir. Enjektör bloğu soğuktur ve enjektör çekildikten sonra çözücü ve maddeyi uçurmak için hızlıca ısıtılır. Büyük hacimli enjeksiyonlarda kullanılır Fırın GC'de alıkonma zamanının ayarlanması için kullanılan yöntem. fırın sıcaklığının değiştirilmesidir. Sıcaklıktaki o C lik bir artış alıkonma zamanın 2-3 kat azalmasına neden olur. Piyasada bulunan GC fırınlarının en yüksek sıcaklık sınırı 450 o C olduğundan, sıcaklık tek başına alıkonma zamanını 100 kat kadar değiştirebilecek güçtedir Kolon Enjeksiyonla sisteme verilen bileşenlerin birbirinden ayrıldığı, nitel ve nicel analizin yapıldığı bölümdür. Dolgulu ve kılcal kolon olmak üzere iki tip GC kolonu bulunmaktadır. Dolgulu kolonlar, cam veya metalden yapılmış, iç çapları 2-4 mm, uzunlukları 1-5 m olan kolonlardır. Teorik tabaka sayısı kılcal kolonlardan azdır. Kılcal kolonlarda ise dolgu materyali yerine sıvı faz kendisi veya destek maddesi ile birlikte kolon iç çeperlerine bağlanmıştır. İç çapları mm, uzunlukları m dir. Kılcal kolonların çıkmasıyla dolgulu kolonların kullanımı azalmıştır. 25,34 Eritilmiş silika kılcal kolonların geliştirilmesi ve çok çeşitli materyallerle iç çeperlerinin kaplanabilmesi nedeniyle kılcal kolonların kullanımları hızla artmaktadır. Bu kolonlar saf SiO 2 den yapılmış ve dıştan poliimid polimeri ile kaplanarak güçlü hale getirilmişlerdir. GC kolonlarında 3 önemli özelliğin bulunması gerekmektedir. 1. Sabit faz olabildiğince inert, destek yüzeyini tamamen kaplayan tek düze kalınlıktaki film tabakası ile oluşturulmalıdır. 31

47 2. Kolon film tabakasının yüksek sıcaklıklarda bozunma ve buharlaşmaya karşı ısısal kararlılığı olmalıdır. Bu sabit faz moleküllerini destek materyaline kimyasal veya fiziksel olarak bağlayarak polimere benzeyen bir film tabakası oluşturarak gerçekleştirilir. 3. Geri dönüşümsüz olarak numune bileşenlerinin adsorpsiyonuna neden olan ve metalik elementleri, özgün bileşenlerin bozunması için katalitik kısımlar olarak rol oynayan aktif bölgelerin olmaması gerekmektedir. Kolonlara yeni doldurulmuş sabit fazın, küçük molekül ağırlığına sahip sıvı faz bölümleri ile çözücülerin fazla kısımlarını tutmamaları için kullanmadan önce şartlanması gerekmektedir. Eğer şartlanma yapılmazsa bu ürünler kolondan geçip dedektöre ulaştıktan sonra temel çizgi (baseline) yükselmesi ve fazla piklere neden olacaktır. Eski kolonların da numune veya saf olmayan taşıyıcı gazdan dolayı kolonda tutulabilecek uçucu olmayan maddelerin birikmesini engellemek için aralıklarla şartlanması gerekmektedir. Şartlama sıcaklığının yüksek olması daha kararlı temel çizgilerin elde edilmesini sağlamakla birlikte kolon ömrünü kısaltacağından sıcaklığın dikkatli seçilmesi gerekmektedir. Ayrıca bu seçimde çalışma sıcaklığı da göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca, kolonlar saklanırken sıvı faza difüze olabilecek oksijen veya diğer kirlilikleri engellemek için uçları uygun bir şekilde kapatılmalıdır Dedektör GC dedektörleri, taşıyıcı gaz ile sürüklenerek kolon çıkışına gelen numunelerin elektrik sinyaline çevrilip tanınmasına yardımcı olan elektronik sistemlerdir. Her maddeyi analiz eden dedektörlere evrensel dedektörler denir. Seçici dedektörler element seçici veya yapı/fonksiyonel grup seçici olabilirler. Özgün dedektörler ise, o kadar seçicidirler ki, özel yapıları veya elementleri yüksek duyarlılıkla ayırabilirler. 32

48 Dedektörlerin sinyalleri incelemesine ve değerlendirmesine dedektör performansı denir. Performansı belirleyen özellikler ise hassasiyet ve seçiciliktir. 72,77 En fazla kullanılan GC dedektörleri; alev iyonizasyon dedektörü, termal iletkenlik dedektörü, kütle spektrometresi, azot-fosfor dedektörü ve elektron yakalama dedektörüdür. 25,33, İdeal bir Dedektörden Beklenen Özellikler olmalıdır. 24,25 Gaz kromatografisinde kullanılan ideal dedektörler aşağıdaki özelliklerde 1. İyi bir karalılık ve tekrarlanabilirlik 2. Geniş bir doğrusal çalışma aralığı C ye kadar varan sıcaklık aralığı 4. Akış hızından bağımsız küçük cevap zamanı 5. Yüksek güvenilirlik ve kullanım kolaylığı 6. Her türden analite benzer cevap alınmalı veya belirli sınıf maddelere karşı tahmini kolay ve seçici cevap verme özelliği olmalı 7. Numuneyi parçalamamalı Performansı belirleyen özellikler ise hassasiyet ve seçiciliktir. 24,39 En fazla kullanılan GC dedektörleri; alev iyonizasyon dedektörü, termal iletkenlik dedektörü, azot fosfor dedektörü, elektron yakalama dedektörü ve kütle spektrometresi dedektörleridir. 24,25 Organik moleküllerin ve özellikle ilaç etkin maddelerinin kimyasal yapılarının tayininde kullanılan analiz yöntemleri içinde kütle spektrometresi önemli bir yer tutmaktadır. Kütle spektometresinin parçaları Şekil 2.11 de verilmiştir. 33

49 Şekil Kütle spektrometresinin parçaları Yapı tayininde tek başına kullanılabilecek, yani yapının bir tek yöntemle bulunabileceği spektroskopi çeşidi yoktur. Bu sebeple değişik spektroskopi yöntemlerinden elde edilen bilgiler bir araya getirilmekte ve sonuçta bir organik bileşiğin kimyasal yapısı bulunabilmektedir. Kütle spektroskopisinde bir bileşiğin molekül ağırlığı ve molekülün kütlesel olarak parçalanması sonucunda oluşan küçük moleküllerin molekül ağırlığı bulunabilmekte ve böylece bileşiğin teşhisi yapılmaktadır. Numune, spektrometre içinde buharlaştırılmakta ve kütle/yük (m/z) oranlarına göre ayrılan iyonlar elektriksel olarak algılanmaktadırlar. İyonların hareketlenmesi büyük bir hızla olduğundan bir bilgisayara yüklenmekte ve spektrum elde edilmektedir Yöntem Geçerlilik Testleri (Validasyon) Geçerlilik Testi (Validasyon), ürünlerin değerlendirme prosesinde, kalitatif veya kantitatif analizlerde seçilen yöntem yada yöntemlerin bu analiz işlemlerinde uygulanabilir olduğunu göstermek için yapılan testlerin tümüdür. 40,41 Seçilen analitik yöntemin geçerliliğini göstermek için kullanılan parametreler: 1. Doğruluk 2. Kesinlik 3. Saklanan Örneklerin Kararlılığı (Stabilite) 4. Doğrusallık 34

50 5. Seçicilik 6. Duyarlılık 7. Geri Kazanım Farmasötik preparatlarda ve biyolojik ortamlarda etkin maddelerin miktarlarının belirlenmesinde uygulanan yöntemlerin geçerlilik testlerinin yapılmış olması gerekmektedir Doğruluk ve Kesinlik Doğruluk, bir analitik yöntemde sonuçların gerçek değere veya gerçek olarak kabul edilen değere yakınlığı olarak ifade edilir ve bağıl ya da mutlak hata ile verilir. Kesinlik ise, analitik bir işlemde önceden belirlenmiş koşullar altında aynı homojen örnekten birçok örnekleme yapılır ve bu örneklerin herbirinden alınan bir seri ölçüm sonuçlarının birbirine yakınlığı olarak ifade edilir ve % BSS (bağıl standart sapma) ile verilir. i) Güniçi kesinlik: Bir birinden bağımsız biçimde hazırlanmış numunelerin aynı gün içerisinde tekrarlayan analiz sonuçlarının birbirine yakınlığı (n=6, n:ölçüm sayısı) % BSS değeri ile verilir. ii) Günler arası kesinlik: Bir birinden bağımsız biçimde hazırlanmış numunelerin farklı günler (en az altı gün) içerisinde tekrarlayan analiz (en az n=6) sonuçlarının birbirlerine olan yakınlık ölçüsüdür. Bu çalışmayla elde edilen değerler aynı zamanda yöntemin uygulanabilirliğinin de bir ölçüsüdür Örneklerin Kararlılığı (Stabilite) Saklanan örneklerin analiz süresince bozunmadan sabit kaldığından emin olmak için yapılan testlere kararlılık (stabilite) denilmektedir. Etkin maddeyi içeren kan örneklerinin normal laboratuar koşullarında nem, sıcaklık, hava ve örneklerin dondurulup-eritilmesi (-20 C bekletilmesi) gibi etkilere maruz kaldığında etkin 35

51 maddenin bozunmadan sabit kaldığı süre tespit edilmeli ve aynı zamanda elde edilen bilgilerin literatür bilgileri ile de desteklenmesi gerekmektedir Doğrusallık ve Kalibrasyon Eğrisi En düşük derişimden en yüksek derişime doğru bir seri çözelti hazırlanarak yöntemin doğrusal olduğu aralığın belirlenme işlemine doğrusallık denir. Bu aralık belirlendikten sonra çözeltinin derişimine karşı elde edilen cevaplar grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrisi türetilir. Kalibrasyon eğrisinin regresyon analizi yapılarak standart eğrinin doğru denklemi ve korelasyon katsayısı elde edilir. Kalibrasyon doğrusunun eğimi, doğrusallığın matematiksel bir ölçüsüdür Duyarlılık Analitik yöntemin en düşük derişimdeki analitleri saptayabilmesinin bir ölçüsüdür Tayin Alt Sınırı (LOQ) Belirlenen deney koşulları altında, analitik yöntemin tayin alt sınırı değeri numune içindeki analitin uygun doğruluk ve kesinlik ile tayin edilebildiği en düşük derişimdir. Kromatografik çalışmalarda tayin alt sınırı değeri, pik yüksekliğinin gürültü yüksekliğine oranın 10 olduğu derişim olarak belirlenir Gözlenebilme (Teşhis) Sınırı (LOD) Bir analitik yöntemin gözlenebilme (teşhis) sınırı, bir örnekteki incelenen bileşiğin belirlenebilen en düşük miktarıdır. Ancak burada belirlenen derişim kantitatif tayin için tam olarak kesinlik ifade eden bir değer olamayıp sadece bir sınır değeridir. Kromatografik çalışmalarda gözlenebilme sınırı değeri, pik yüksekliğinin gürültü yüksekliğine oranın 3 olduğu derişim olarak ifade edilir Geri Kazanım Analiz sonucunda bulunan değerin gerçek değere oranı olarak ifade edilir. 36

52 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Kimyasal Maddeler ve Malzemeler Flurbiprofen (Sigma, Almanya) Majezik (Sanovel İlaç Firması, İstanbul, Türkiye) Frolix (Aris İlaç Firması, İstanbul, Türkiye) Zero-P (Deva İlaç Firması, İstanbul, Türkiye) Maximus (Drogsan İlaç Firması, Ankara, Türkiye) Fortine (Bilim İlaç Firması, İstanbul, Türkiye) Asetonitril (HPLC grade, Merck, Almanya) Deiyonize su (Millipore) N-metil N-trimetil silil trifloroasetamit (Sigma, Almanya) Helyum gazı (He) (% 99.9 saflıkta, Ankara, Türkiye) 3.2. Kullanılan Cihazlar Etüv (Memmert) Ultrasonik banyo (Elma LC 30) Terazi (Metler Toledo) Karıştırıcı (Vorteks, IKA) Spektrofotometre Sistemi UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometre (ThermoSpectronic HeλIOS ) UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometre Vision 32 Software Yazıcı (HP LaserJet 1018) Spektroflorometre Sistemi Spektroflorometre (Shimadzu RF-5301 PC) 37

53 GC-MS Sistemi Gaz kromatografisi (Agilent 6890) Kütle spektroskopisi dedektör (MS, 5973, Agilent) Otosampler (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Kapiler kolon HP-5 MS (30 m x 0.25 mm ID, 0.25 m) Autosampler vial kit (Thermoquest 1.8 ml Screw cap) Software (Agilent) 3.3. Yöntemler Spektrofotometrik Yöntem Şartları Spektrofotometrik ölçümlerde nm dalga boyu aralığında Thermospectronic çift ışınlı UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometresi kullanıldı. Çalışma, 1.0 cm kuvartz küvetlerde, 600 nm dak -1 dalga boyu tarama hızı ve 2.0 nm spektral bant genişliği kullanılarak gerçekleştirildi. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrumlar, madde üzerine gönderilen ışığın dalga boylarına karşı absorbans değerlerinin grafiğe geçirilmesiyle elde edildi Spektroflorometrik Yöntem Şartları Spektroflorometrik ölçümlerde nm uyarma (excitation) ve yayma (emission) dalga boyu aralığında Shimadzu RF-5301 PC Spektroflorometresi kullanıldı. Çalışma, 1.0 cm kuvartz küvetler kullanılarak gerçekleştirildi. Yayma (emission) spektrumları madde üzerine gönderilen ışığın dalga boylarına karşı yayma (emission) değerlerinin grafiğe geçirilmesiyle elde edildi GC-MS Yöntem Şartları Flurbiprofen için GC-MS çalışmasında uygulanan kromatografik yöntem şartları Tablo 3.1 de verildi. 38

54 Tablo 3.1. Flurbiprofen için GC-MS çalışmasında uygulanan kromatografik yöntem şartları Kolon HP-5 MS (0.25 μm, 30 mx0.25 mm) Taşıyıcı gaz Helyum, 1 ml dak -1 Enjektör sıcaklığı ( C) 250 Enjeksiyon modu Bölmesiz (splitless) Sıcaklık programı 150 C /1 dak / 30 C/dak / 250 C / 1 dak /10 C / dak 300 C / 1 dak Alıkonma zamanı (dakika) 5.5 Dedektör Kütle İnjeksiyon hacmi (μl) 1 Dedektör sıcaklığı ( C)

55 4. BULGULAR 4.1. UV-Görünür Bölge ve Birinci Türev Absorbsiyon Spektrofotometri Yöntemi Standart Çözeltilerin Hazırlanması Flurbiprofen asetonitril içinde 100 µg ml -1 derişimde stok çözeltisi hazırlandı. Bu stok çözeltiden belirli hacimlerde alınıp asetonitril ile seyreltilerek 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ve 14 µg ml -1 derişimlerde flurbiprofen standart çalışma çözeltileri hazırlandı. 198 nm de ve 246 nm de flurbiprofenin UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrumu, 213 nm, 233 nm ve 260 nm de flurbiprofenin birinci-türev absorbsiyon spektrumu alındı (Şekil 4.1 ve Şekil 4.2) Şekil 4.1. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin absorbsiyon spektrumları 40

56 Şekil 4.2. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin birinci-türev absorbsiyon spektrumları Yöntemin Geçerlilik Testi (Validasyonu) Doğrusal Aralık ve Kalibrasyon Eğrisi 1-14 µg ml -1 derişim aralığında flurbiprofen çözeltilerinin derişimlerine karşı okunan UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbans değerlerinin grafiğe geçirilmesi ile kalibrasyon eğrileri elde edildi (Şekil 4.3 ve Şekil 4.4). Şekil 4.3. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen kalibrasyon eğrileri 41

57 Şekil 4.4. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofen kalibrasyon eğrileri UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemlerle elde edilen kalibrasyon eğrilerinin regresyon eşitliklerinin istatistiksel analiz sonuçları sırasıyla Tablo 4.1 ve Tablo 4.2 de verildi. Tablo 4.1. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofene ait kalibrasyon eğrileri ile ilgili istatistiki değerler Parametreler UV-Görünür Bölge Absorbsiyon Spektrofotometri Dalga boyu ( :nm) Doğrusal aralık ( g ml -1 ) Regresyon doğrusu denklemi A=0.1627x A=0.0944x S a 1.19x x10-2 S b 4.87x x10-3 Korelasyon katsayısı (r) S r 2.27x x10-4 S a : Kaymanın standart sapması, S b : Eğimin standart sapması, S r : Korelasyon katsayısının standart sapması 42

58 Tablo 4.2. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik çalışmasında flurbiprofene ait kalibrasyon eğrilerinin istatistiki değerleri Parametreler Birinci-Türev Absorbsiyon Spektrofotometri Dalga boyu ( : nm) Doğrusal aralık ( g ml -1 ) Regresyon doğrusu D 1 =0.8725x D 1 =0.2547x D 1 =0.2754x denklemi S a 2.68x x x10-2 S b 5.62x x x10-3 Korelasyon katsayısı (r) S r S a : Kaymanın standart sapması, S b : Eğimin standart sapması, S r : Korelasyon katsayısının standart sapması 4.65x x x Gözlenebilme Sınırı (LOD) ve Tayin Alt Sınırı (LOQ) Flurbiprofen için kalibrasyon eğrisinin en küçük değerinden daha küçük derişimlerde bir seri çözelti hazırlandı ve altı kez absorbansları okundu. Okunan değerlerin yüzde bağıl standart sapmaları (% BSS) belirlendi. Yüzde bağıl standart sapma değeri % 20 den küçük olan derişim gözlenebilme sınırı ve % 10 dan küçük olan derişim de tayin alt sınırı değeri olarak belirlendi. UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemlerin gözlenebilme sınırı ve tayin alt sınırı değerleri sırasıyla 0.2 g ml -1 ve 0.5 g ml -1 olarak bulundu Doğruluk ve Kesinlik Yöntemin doğruluğu ve kesinliği güniçi ve günler arası değişkenlerle belirlendi. Flurbiprofenin kalibrasyon eğrileri içine düşen üç farklı derişimde hazırlanan çözeltilerinin aynı gün ve farklı günlerde (en fazla 3 gün içinde) absorbansları altı kez okunarak güniçi ve günler arası çalışma gerçekleştirildi. Okunan değerlerin ortalamaları ve standart sapmaları belirlendi. Yöntemlerin kesinliği yüzde bağıl standart sapma (% BSS) ve doğruluk da bağıl hata ile Tablo 4.3 ve Tablo 4.4 de verildi. 43

59 Tablo 4.3. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri Yöntem UV 198 nm UV 246 nm Eklenen ( g ml -1 ) Güniçi Bulunan±std. sapma % bağıl hata % BSS Bulunan ±std. sapma Günler arası % bağıl hata % BSS ± ± ± ± Tablo 4.4. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik yönteminin güniçi ve günler arası doğruluk ve kesinlik değerleri Güniçi Günler arası Yöntem Eklenen ( g ml -1 ) Bulunan ± std. sapma % bağıl hata % BSS Bulunan ±std. sapma % bağıl hata % BSS 1 D 213 nm D 233 nm D 260 nm ± ± D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm ± ± D 233 nm ± ± D 260 nm ± ± Kararlılık (Stabilite) Flurbiprofen stok ve standart çözeltilerinin çalışma süresince kararlı (stabil) kaldığı süreyi belirlemek amacıyla kararlılık çalışması gerçekleştirildi. Bunun için flurbiprofenin üç farklı derişimde hazırlanan çözeltileri oda sıcaklığı, 4 ve C de 24 ve 72 saat süreyle bekletildi. Bu süreler sonunda çözeltilerin absorbansları ölçüldü ve 44

60 elde edilen değerler standart çözeltilerin hemen okunan değerleri ile kıyaslanarak sonuçlar yüzde geri kazanım ile Tablo 4.5 de verildi. Tablo 4.5. Flurbiprofenin UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen kararlılık (stabilite) değerleri Yöntem UV-Görünür bölge Birinci-Türev Spektrofotometri Eklenen ( g ml -1 ) Oda sıcaklığı 24 saat Oda sıcaklığı 72 saat 4 0 C 72 saat C 72 saat ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Yöntemin Farmasötik Preparatlara Uygulanması Geliştirilen ve geçerlilik testi (validasyonu) yapılan yöntemlerin uygulanabilir olduğunu görmek amacıyla flurbiprofen içeren farmasötik preparatlarda etkin madde miktar analizi yapıldı. Bu çalışma için flurbiprofen içeren Majezik, Frolix, Maximus, Zero-P ve Fortine tabletten sırasıyla 6 µg ml -1 ve 12 µg ml -1 derişimlerde çözeltiler hazırlandı. Çözeltilerin UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbsiyon spektrumları alınıp absorbansları okundu ve elde edilen spektrumlar standart çözeltilerin spektrumları ile karşılaştırıldı. Farmasötik preparatlardan elde edilen spektrumlar Şekil 4.5 ve Şekil 4.6 da verildi. 45

61 Şekil 4.5. Majezik farmasötik preparatının UV - Görünür bölge absorbsiyon spektrumları (6 µg ml -1 ve 12 µg ml -1 ) Şekil 4.6. Majezik farmasötik preparatının birinci-türev absorbsiyon spektrumları (6 µg ml -1 ve 12 µg ml -1 ) 46

62 Geri Kazanım Farmasötik preparattan geri kazanım çalışmaları standart ekleme yöntemi ile yapıldı. Majezik, Frolix, Maximus, Zero-P ve Fortine tablet preparatlarının 2 g ml -1 derişimlerde çözeltileri hazırlanarak UV-Görünür bölge ve birinci türev absorbansları okundu. Sonra bu çözeltiler üzerine flurbiprofenin 3 farklı derişimdeki standart çözeltileri eklendi ve güniçi ve günler arası absorbansları belirlendi. Belirlenen absorbans değerleri aynı derişimdeki standart çözeltilerinin absorbans değerleriyle kıyaslanarak sonuçlar yüzde geri kazanım olarak Tablo 4.6 ve Tablo 4.7 de verildi. Tablo 4.6. UV-Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri Preparat Majezik (2 g ml -1 ) Frolix (2 g ml -1 ) Maximus (2 g ml -1 ) Zero-P (2 g ml -1 ) Fortine (2 g ml -1 ) Eklenen ( g ml -1 ) Güniçi Bulunan±std. sapma % Geri kazanım % BSS Bulunan ±std. sapma Günler arası % Geri kazanım % BSS ± ± ±

63 Tablo 4.7. Birinci-türev absorbsiyon spektrofotometrik yöntemle belirlenen farmasötik preparatların güniçi ve günler arası geri kazanım değerleri Preparat Yöntem Eklenen ( g ml -1 ) Güniçi Bulunan±std. sapma % Geri kazanım % BSS Bulunan±std. sapma Günler arası % Geri kazanım % BSS Majezik (2 g ml -1 ) Frolix (2 g ml -1 ) Maximus (2 g ml -1 ) Zero-P (2 g ml -1 ) Fortine (2 g ml -1 ) 1 D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm D 213 nm D 233 nm D 260 nm

64 4.2. Spektroflorometri Yöntemi Standart Çözeltilerin Hazırlanması Flurbiprofen asetonitril içinde 100 µg ml -1 derişimde stok çözeltileri hazırlandı. Bu stok çözeltilerden belirli hacimlerde alınıp asetonitril ile seyreltilerek 50, 100, 150, 200, 250, 300 ve 350 ng ml -1 derişimlerde flurbiprofen standart çalışma çözeltileri hazırlandı. Flurbiprofenin uyarma (excitation) ve yayma (emission) dalga boylarını belirlemek amacıyla nm dalga boyu aralığında uyarma ve yayma spektrum taraması yapıldı ve flurbiprofenin uyarma dalga boyu 248 nm ve yayma dalga boyu 308 nm olarak belirlendi ve bu dalga boylarında spektrumları alındı (Şekil 4.7). Şekil 4.7. Spektroflorometrik yöntem çalışmasında flurbiprofen çözeltilerinin uyarma ve yayma spektrumları 49