ÇEŞİTLİ KLİNİK ÖRNEKLERDEN İZOLE EDİLEN PSEUDOMONAS,

Transkript

1 ÇEŞİTLİ KLİNİK ÖRNEKLERDEN İZOLE EDİLEN PSEUDOMONAS, KLEBSIELLA, STAPHYLOCCUCCUS VE CANDIDA CİNSİ MİKROORGANİZMALARDA BİYOFİLM VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI Derya ÜNAL YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ŞUBAT 2011 ANKARA

2 Derya ÜNAL tarafından hazırlanan ÇEġĠTLĠ KLĠNĠK ÖRNEKLERDEN ĠZOLE EDĠLEN PSEUDOMONAS, KLEBSIELLA, STAPHYLOCCUCCUS VE CANDIDA CĠNSĠ MĠKROORGANĠZMALARDA BĠYOFĠLM VARLIĞININ ARAġTIRILMASI adlı bu tezin Yüksek Lisans Tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Güven Uraz Tez DanıĢmanı, Biyoloji Anabilim Dalı Bu çalıģma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiģtir. Prof. Dr. Nedim Sultan Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, G.Ü. Prof. Dr. Güven Uraz Biyoloji Anabilim Dalı, G.Ü. Doç. Dr. Barbaros Balabanlı Biyoloji Anabilim Dalı, G.Ü Tarih: Bu tez ile Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onaylamıģtır. Prof. Dr. Bilal Toklu Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü....

3 TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Derya ÜNAL

4 iv ÇEŞİTLİ KLİNİK ÖRNEKLERDEN İZOLE EDİLEN PSEUDOMONAS, KLEBSIELLA, STAPHYLOCCUCCUS VE CANDIDA CİNSİ MİKROORGANİZMALARDA BİYOFİLM VARLIĞININ ARAŞTIRILMASI (Yüksek Lisans Tezi) Derya ÜNAL GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ŞUBAT 2011 ÖZET Biyofilm, bir yüzeye yapışarak, birlikte yaşayan ve birbirleriyle haberleşen bakterilerin oluşturduğu bir organizasyondur. Biyofilm bakterileri çevre koşullarına, serbest bulunan planktonik bakterilerde daha dirençlidir. Biyofilmler cansız veya canlı yüzeylere yapışabilirler. Bu yüzeyler arasında canlı dokular, medikal implantlar, endüstriyel veya içme suyu sistemlerinin boruları veya doğal akuatik sistemler yer alır. Yabancı cisimlerdeki biyofilmler, Gram pozitif veya Gram negatif bakterilerden ya da mayalardan oluşabilir. izole edilen bakteriler Gram pozitiflerden, Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermidis; Gram negatiflerden Klebsiella pneumoniae, ve Pseudomonas aeruginosa yı, mantarlardan ise Candida türlerini içerir. Biyofilmler, kullanılan araca ve hastada kalma süresine bağlı olarak tek tür ya da çok türden oluşabilir. Çalışmamızda klinik örneklerden izole edilen 10 Pseudomonas, 20 Klebsiella, 55 Staphylococcus ve 15 Candida kökeninde biyofilm varlığı ve slime faktör oluumu araştırılmıştır.

5 v Araştırmamızda, kristal viyole kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında, 24 saatlik ölçümlerde; 7 Pseudomonas, 8 Klebsiella, 52 Staphylococcus ve 12 Candida da; 48 saatlik ölçümlerde; 6 Pseudomonas, 7 Klebsiella, 42 Staphylococcus ve 12 Candida izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Safranin kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında; 24 saatlik ölçümlerde 10 Pseudomonas, 7 Klebsiella, 17 Staphylococcus ve 12 Candida da, 48 saatlik yapılan ölçümlerde; 8 Pseudomonas, 16 Klebsiella, 39 Staphylococcus ve 11Candida izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Slime faktör varlığı araştırması Standart Cam Tüp Yöntemi ve Kongo Kırmızılı Agar Yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Her iki yöntemde de; Pseudomonas izolatlarında slime faktör varlığı tespit edilememiştir. Klebsiella izolatlarının hepsinde Slime Faktör varlığı tespit edilmiştir. Toplam 55 Staphylococcus izolatının 33 ünde ve toplam 15 Candida izolatının 12 sinde Slime Faktör varlığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, farklı klinik örneklerden izole edilen farklı mikroorganizmalarda biyofilm varlığı oranı yüksek bulunmuşken, slime faktör varlığı formation, mikroorganizma cinsine göre değişiklik göstermektedir. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus, Candida, biyofilm, Sayfa Adedi : 307 TezYöneticisi : Prof.Dr.Güven URAZ

6 vi THE RESEARCH OF BIOFILM IN PSEUDOMONAS, KLEBSIELLA, STAPHYLOCOCCUS AND CANDIDA SPECIES ISOLATED FROM SOME CLINICAL SAMPLES (M. Sc. Thesis) Derya ÜNAL GAZI UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY FEBRUARY 2011 ABSTRACT Biofilm is an organisation formed by bacteria which lived together and communicated each other. Bacteria of biofilm is more resistant to environmental condition then plantonic bacteria. Biofilms can adhere to organic and inorganic surfaces. Organic tissues, medical implants, pipes of industrial or drinking water systems or natural water systems are into these systems. Biofilms in exterior substance can be formed by Gram positive bacterias or Gram negative bacterias or yeasts. isolated bacterias include Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis from Gram positives; Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa from Gram negatives, Candida species from fungi. Biofilms have formed one spescies or many species depend on using substance and duration in the patient. In our study, researched formationof biofilm and slime factor in 10 Pseudomonas, 20 Klebsiella, 55 Staphylococcus and 15 Candida isolated clinical samples. In this research, used crystal violet and safranine. Biofilm study that used crystal violet, after 24 hours, biofilm formation was determined in 7 Pseudomonas, 8 Klebsiella, 52 Staphylococcus and 12 Candida.

7 vii After 48 hours, biofilm formation was determined in 6 Pseudomonas, 7 Klebsiella, 42 Staphylococcus and 12 Candida. Biofilm study that used srafranine, after 24 hours, biofilm formation was determined in 10 Pseudomonas, 7 Klebsiella, 17 Staphylococcus and 12 Candida. After 48 hours, biofilm formation was determined in 8 Pseudomonas, 16 Klebsiella, 39 Staphylococcus and 11 Candida. Study of slime factor formation was in used Standart Glass Tube Method and Kongo Red Agar method. In the both of two methods, there wasn t determinate slime factor formation in Pseudomonas isolates. There was determinate slime factor all of Klebsiella isolates, 33 of 55 Staphylococcus and 12 of 15 Candida isolates. As a result, there was high level biofilm formation in different microorganisms isolated different clinical samples, slime factor formation was changed with respect microorganism genus. Science code : Key Words : Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus, Candida, biofilm Page Number : 307 Adviser : Prof. Dr. Güven URAZ

8 viii TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren, her türlü bilgi ve desteğini benden esirgemeyen sayın hocam Prof. Dr. Güven Uraz a, yine çalışmalarımda katkıda bulunan T.C. Sağlık Bakanlığı Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı klinik şefi Uzm. Mikrobiyolog Dr. Neriman Balaban a, Hacettepe Üniversitesi İhsan Doğramacı Çocuk Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı nda görevli Biyolog Ayfer Koşar a, araştırma görevlisi hocam Dr. Ebru Yılmaz a, canım arkadaşım Pınar Aytop a ve tüm laboratuvar arkadaşlarıma, maddi ve manevi destekleriyle beni yalnız bırakmayan annem Şükran Ünal a ve babam Yaşar Ünal a, her zaman yanımda olan Seçkin Andiç e katkılarından dolayı teşekkür ederim.

9 ix İÇİNDEKİLERİN LİSTESİ Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... vi TEŞEKKÜR...viii İÇİNDEKİLER... ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ... xvi ŞEKİLLERİN LİSTESİ... xxiv RESİMLERİN LİSTESİ... xiv 1. GİRİŞ KAYNAK ARAŞTIRMASI Biyofilm Nedir Biyofilmin Tarihçesi Biyofilmin Yapısı Mikroorganizmalar Neden Biyofilm Oluşturur Savunma Adezyon ve kolonizasyon Yaşanabilir çevre geliştirmek Topluluk oluşturmak Biyofilm Oluşum Aşamaları Mikroorganizmanın adheransı Biyofilm Hücresi - Planktonik Hücre Karşılaştırılması Doğada Biyofilm Faydalı Biyofilmler... 12

10 x Sayfa 2.9. Tıbbi Enfeksiyonlar ve Biyofilm İlişkisi Biyofilm Enfeksiyonlarının Ortak Özellikleri Biyofilmler Neden Antimikrobiyallere Karşı Dirençlidir Biyofilm İncelenmesi ve Ölçümü Biyofilmle İlgili İnsan Enfeksiyonları Enfektif endokardit Otitis media Kronik bakteriyel prostatit Kistik fibrozis Periodontit Biyofilm Oluşumunu Engelleme Stratejileri Pseudomonas Cinsi Sistematik Genel özellikler Görünüm ve boyanma özellikleri Doğal ortamlar Biyokimyasal özellikler Virülans faktörleri Epidemiyoloji ve bulaş Pseudomonasların neden olduğu enfeksiyonlar Pseudomonaslarda biyofilm yapısı Klebsiella Cinsi... 37

11 xi Sayfa Sistematik Genel özellikler Görünüm ve boyanma özellikleri Doğal ortamlar Biyokimyasal özellikler Virülans faktörler Klinik önemi Klebsiellalarda biyofilm yapısı Staphylococcus Cinsi Sistamatik Genel özellikler Görünüm ve boyanma özellikleri Doğal ortamlar Biyokimyasal özellikleri Virülans faktörleri İnsanlarda ve diğer primatlarda bulunan stafilokoklar Klinik önemi Stafilokokların neden olduğu enfeksiyonlar Klinik materyalden stafilokokların izolasyonu Staphylococcus enfeksiyonlarının önlenmesi Stafilokoklarda biyofilm yapısı Candida Cinsi... 65

12 xii Sayfa Sistematik Genel özellikleri Görünüm ve boyanma özellikleri Doğal ortamlar Biyokimyasal özellikleri Virülans faktörleri Candida türleri ile oluşan hastalıklar Kandidalarda biyofilm yapısı MATERYAL METOT Materyal Materyal örnekleri Örneklerin toplanması Metot Klinik Örneklerin, Çalışılmak Üzere Laboratuvara Getirilmesi Klinik Kültür Materyallerinden Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus ve Candida ların İzolasyonu Klinik Örneklerden İzole Edilen Mikroorganizmaların İdentifikasyonu Pseudomonas şüpheli kolonilere uygulanan identifikasyon testleri Pseudomonas İzolatlarının Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması İzole Edilen Pseudomonas Bakterilerin Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) Uygulanması Klebsiella Şüpheli Kolonilere Uygulanan İdentifikasyon Testleri... 87

13 xiii Sayfa 3.9. Klebsiella izolatlarının Microbact 24E Gram-Negative İdentification System(Oxoid MB 1131) Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması İzole Edilen Klebsiella Bakterilerin Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) Uygulanması Staphylococcus Şüpheli Kolonilere Uygulanan İdentifikasyon Testleri Staphylococcus izolatlarının BBL Crystal Identification System Gram- Positive ID Kit Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması Staphylococcus Bakterilerinin Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin BBL Crystal Gram-Positive ID Kit Uygulanması Candida Şüpheli Kolonilere Uygulanan İdentifikasyon Testleri Candida İzolatlarının RapID YEAST PLUS System Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması Candida ların Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin RapID YEAST PLUS System Uygulanması Mikroorganizmaların Temini İçin Kullanılan Besiyerleri ve İçerikleri Mikroorganizmaların İdentifikasyonu İçin Uygulanan Biyokimyasal Testler Gram boyama Metilen mavisi ile boyama Katalaz testi Arjinin dekarboksilaz testi Lizin dekarboksilaz testi Üreaz testi İndol testi Nitrat redüksiyon testi

14 xiv Sayfa O C de üreme O C de üreme Pigment oluşumu Ornitin dekarboksilaz testi Jelatin hidrolizi Oksidasyon / fermentasyon testi Sitrat testi Metil red testi Voges proskauer testi Malonat kullanımı testi Hidrojen sülfit oluşumu testi Hareket testi % 6,5 NaCl de üreme testi Koagülaz testi Isıya dirençli nükleaz testi Hemoliz testi Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile Novobiocin antibiyo tiğine duyarlılık testi Yalancı veya gerçek hif oluşumu Germ tüp oluşumu testi Karbonhidrat asimilasyon testi İzole Edilen Bakterilerde Biyofilm Oluşumunun Belirlenmesi İzole Edilen Mayalarda Biyofilm Oluşumunu Belirlenmesi

15 xv Sayfa İzole Edilen Bakterilerde Slime Oluşumunun Belirlenmesi İzole edilen bakterilerde kongo kırmızılı agar kullanılarak slime varlığının tespit edilmesi İzole edilen mayalarda kongo kırmızılı agar kullanılarak slime varlığının tespit edilmesi İzole edilen bakterilerde standart cam tüp yöntemi kullanılarak slime varlığının tespit edilmesi İzole edilen mayalarda standart cam tüp yöntemi kullanıla rak slime varlığının tespit edilmesi Mikroorganizmalarda Slime Varlığının Tespit Edilmesinde Kullanılan besiyerleri ve İçerikleri Kongo kırmızılı agar Mikroorganizmalarda Biyofilm Varlığının Tespit Edilmesinde Kulanı lanbesiyerleri ve İçerikleri Luria Bertani (Miller) Broth (Difco ) BULGULAR Biyofilm Çalışması Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışma Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışma Slime Faktör Çalışması Kongo kırmızılı agar yöntemi Standart cam tüp yöntemi TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ

16 xvi ÇİZELGELER Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Mantarların kliniğe yönelik olarak sınıflandırılması Çizelge 3.1. Ankara da bulunan çeşitli hastanelerden toplanan örneklerin dağılımı Çizelge 3.2. Bazı Pseudomonas türlerinin non-fermetatif ve oksidaz pozitif bakteriler den ayrımı (Murray 2003) Çizelge 3.3. İzole edilen Pseudomonas türlerine uygulanan biyokimyasal testler Çizelge 3.4. Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) içerdiği testlerin prensipleri Çizelge 3.5. İzole edilen Klebsiella ssp. türleri ve diğer Enterobacteriaceae familyası üyelerin ayrımı için uygulanan testler Çizelge 3.6. İzole edilen Klebsiella türlerine uygulanan biyokimyasal testler Çizelge 3.7. İzole edilen Staphylococcus türlerine uygulanan biyokimyasal testler Çizelge 3.8. BBL İdentifikasyon sisteminin içerdiği testlerin prensipleri Çizelge 3.9.İzole edilen Candida türlerine uygulanan biyokimyasal testler Çizelge RapID YEAST PLUS System İdentifikasyon Testlerinin Prensipleri Çizelge İzole edilen Pseudomonas ssp. türlerinin pigment oluşturma özelliği Çizelge 4.1. Klinik örneklerden izole edilen mikroorganizmaların, hasta mater yallerine göre dağılımı Çizelge 4.2. İzole edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyal lerine göre dağılımı Çizelge 4.3. İzole edilen Klebsiella türlerinin izole edildikleri klinik kültür materyallerine göre dağılımı Çizelge 4.4. İzole edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı

17 xvii Çizelge Sayfa Çizelge 4.5. İzole edilen Candida türlerinin, izole edildiği kültür materyallerine göre dağılımı Çizelge 4.6. Klinik örneklerden izole edilen mikroorganizmaların biyofilm varlığı Çizelge 4.7. Biyofilm sonuçlarının, temin edilen hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge 4.8. Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalış masında 24 saat süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge 4.9. İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonun da elde edilen sonuçlar Çizelge Kristal viyole kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saatlik oku mada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge Kristal viyole kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saatlik oku ma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyo le boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. Dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilenspektrofotometrikdeğerler Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm.dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiel la türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyallerine göre dağılımı154

18 xviii Çizelge Sayfa Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kris tal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge Byofilm pozitif staphylococcus türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyo le boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Çizelge İzole edilen Candida türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 54 nm dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılım Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge Kristal viyole ile yapılan çalışmada 48 saat sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar

19 xix Çizelge Sayfa Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudo monas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Çizelge Staphylococcus izolatlarının kristal viyole kullanılarak 24 saat sonra spektrofotometrede elde edilen değerler Çizelge Biyofilm pozitif Staphylococcus türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler

20 xx Çizelge Sayfa Çizelge İzole edilen Candida türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen candi datürlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen candi da türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasın da 24 saat süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının safra nin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerinde, safranin kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudo monas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga bo yunda spek trofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spekt rofotometrik değerler Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiel la türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı Çizelge Biyofilm negatif tespit edilen Klebsiella türleri

21 xxi Çizelge Sayfa Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının saf ranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm.dal ga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının safranin bo yar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyun da spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Çizelge İzole edilen Candida türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen candi da türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen candi da türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasın da 48 saat süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının safra nin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Çizelge (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Pseudomonas türleri Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudo monas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı

22 xxii Çizelge Sayfa Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spekt rofotometre cihazında yapılan okutulması sonu cu elde edilen spekt rofotometrik değerler Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiel la türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının safra nin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Çizelge Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyelleri Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Çizelge İzole edilen Candida türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı

23 xxiii Çizelge Sayfa Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edi len candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge Klinik örneklerden izole edilen mikroorganizmaların Slime fak tö dağılımı Çizelge Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı araştırılan mikroor ga nizmaların izole edildiği hasta materyalleri Çizelge Slime varlığı araştırılan mikroorganizmaların hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge İzole edilen mikroorganizmaların biyofilm araştırması sonuçları Çizelge İzole edilen tüm mikroorganizmaların slime faktör varlığı araştırmasının sonuçları

24 xxiv ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 3.1. Staphylococcus ların, rutin çalışmalarda klinik örneklerden sıklık la izole edilen diğer Gr(+) koklardan ayrımı için uygulanan testler Şekil 4.1. Çalışılan hasta materyallerinin dağılımı Şekil 4.2. İzole edilen mikroorganizmaların cins seviyesinde dağılımı Şekil 4.3. İzole edilen Pseudomonasların hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.4. İzole edilen Klebsiellaların hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.5. İzole edilen Staphylococcus ların hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.6. İzole edilen Candida ların hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.7. İzole edilen Pseudomonas türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.8. İzole edilen Klebsiella türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.9. İzole edilen Staphylococcus türlerinin hasta materyallerine göre dağılımı Şekil İzole edilen Candida türlerinin hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Klinik örneklerden izole edilip biyofilm pozitif olarak tespit edilen mikroorganzmaların dağılımı Şekil Biyofilm negatif izolatların cins seviyesinde dağılımı Şekil Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışma sında 24 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının % oranı Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Pseudomonas türlerinde kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saat sonunda biyofilm varlığı

25 xxv Şekil Sayfa Şekil Kristal viyole kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saat sonun da kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas türleri Şekil Klebsiella izolatlarında, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 540 nm.dalga boyunda 24 saat sonra yapılan spektrofotometrik okumada biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı Şekil Kristal viyole kullanılarak, 540 nm dalga boyunda, 24 saat süre sonunda yapılan biyofilm değerlendirmesinde zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella türleri Şekil Staphylococus izolatlarında kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda 24 saatlik spektrofotometrk değerlendirmede biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Biyofilm varlığı sonuçlarının, Staphylococcus türlerine göre dağılımı Şekil İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı Şekil 4.26.S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.warneri izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.hominis izolatlarında biyofilm varlığı Şekil 4.31.S.intermedius izolatında biyofilm varlığı Şekil 4.32.S.lugdunensis izolatında biyofilm varlığı Şekil S.cohnii izolatlarında biyofilm varlığı

26 xxvi Şekil Sayfa Şekil Kuvvetli pozitif (+++), Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus türleri Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Şekil Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre Dağılımı Şekil Candida türlerinde biyofilm varlığı Şekil Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışma sında 48 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Pseudomonas türlerinde biyofilm varlığı Şekil Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen pseudomonas türleri Şekil Klebsiella izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre Dağılımı Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı Şekil (+++), (++) ve (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella türleri Şekil Staphylococus izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Staphylococcus türlerinde biyofilm dağılımı Şekil 4.50.İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı Şekil S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı

27 xxvii Şekil Sayfa Şekil S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil 4.54.S.warneri izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.capitis izolatında biyofilm varlığı Şekil S.cohnii izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.intermedius izolatında biyofilm varlığı Şekil S.vitulus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil Kuvvetli pozitif (+++), Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyo film varlığı tespit edilen Staphylococcus türleri Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Şekil Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.62.Candida türlerinde biyofilm varlığı Şekil Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 24 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Pseudomonas türlerinde biyofilm varlığı Şekil Kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas türleri Şekil Klebsiella izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre Dağılımı Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı211

28 xxviii Şekil Sayfa Şekil (+++), (++) ve (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella Türleri Şekil Staphylococus izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Staphylococcus izolatlarında biyofilm varlığının tür derecesinde dağılımı Şekil 4.75.İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı Şekil S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.vitulus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil 4.79.S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.capitis izolatında biyofilm varlığı Şekil S.warneri izolatında biyofilm varlığı Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Şekil Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Candida türlerinde biyofilm varlığı Şekil Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 48 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Pseudomonas türlerinde biyofilm varlığı Şekil Kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyo film varlığı tespit edilen Pseudomonas türleri

29 xxix Şekil Sayfa Şekil Klebsiella izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı Şekil (+++), (++) ve (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella Türleri Şekil Staphylococus izolatlarında biyofilm varlığının oranı Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Biyofilm pozitif ve negatif saptanan Staphylococcus türlerinin Dağılımı Şekil İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı Şekil S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.warneri izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.cohnii izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.lugdunensis izolatlarında biyofilm varlığı Şekil S.vitulus izolatlarında biyofilm varlığı Şekil Kuvvetli pozitif (+++), Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus türleri Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Şekil Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil Candida türlerinde biyofilm varlığı

30 xxx Şekil Sayfa Şekil Kongo kırmızılı agar yöntemi ve Standart cam tüp yöntemi kullanılarak slime varlığı tespit edilen mikroorganizmaların dağılımı Şekil Araştırmada Kongo kırmızılı agar yöntemi ile Slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%) Şekil Çalışılan kan örneklerinde Kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan yara örneklerinde Kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan idrar örneklerinde Kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan trakeal aspirat örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan konjunktival sürüntü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan kateter içi kan örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan doku kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan burun sürüntü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan püy kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan abse kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan periton sıvısı kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan derin trakeal aspirat kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agaryöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan derin balgam kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%)

31 xxxi Şekil Sayfa Şekil Çalışılan göğüs tüpü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yönte mi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan cilt sürüntü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yönte mi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan göz sürüntü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yönte mi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan vajen sıvısı kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yönte mi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan toplam 55 Staphylococcus bakterisinde hiçbirinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen toplam 33 Stahphylococcus bakterisinin izole edildiği hasta materyalle rinin dağılımı (%) Şekil Slime pozitif tespit edilen Staphylococcus türlerinin dağılımı Şekil Araştırmada Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%) Şekil Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen toplam 12 candida nın izole edildiği hasta materyallerinin dağılımı (%) Şekil Slime pozitif tespit edilen Candida türlerinin dağılımı Şekil Araştırmada standart cam tüp yöntemi ile slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%) Şekil Çalışılan kan örneklerinde standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan yara örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan idrar örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan trakeal aspirat örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%)

32 xxxii Şekil Sayfa Şekil Çalışılan konjunktival sürüntü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan kateter içi kan örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan doku kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan burun sürüntü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan püy kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan abse kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan periton sıvısı kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan derin trakeal aspirat kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan derin balgam kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan göğüs tüpü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yönte mi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan cilt sürüntü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yönte mi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan göz sürüntü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yönte mi ile slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan vajen sıvısı kültürü örneklerinde Standart cam tüp yönte mi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Çalışılan toplam 55 Staphylococcus bakterisinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Şekil Standart cam tüp yöntemi ile Slime varlığı tespit edilen toplam 33 Stahphylococcus bakterisinin izole edildiği hasta materyalleri nin dağılımı (%)

33 xxxiii Şekil Sayfa Şekil Slime pozitif Staphylococcus türlerinin dağılımı Şekil Araştırmada Standart cam tüp yöntemi ile Slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%) Şekil Standart cam tüp yöntemi ile Slime varlığı tespit edilen toplam 12 Candida nın izole edildiği hasta materyallerinin dağılımı (%) Şekil Slime pozitif Candida türlerinin dağılımı

34 xxxiv RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 3.1. Pseudomonas bakterisinin Pseudomonas Agar ( Oxoid CM0559) da görünümü (A) Normal ışık altında görünümü (B) UV ışık altında görünümü Resim 3.2. Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) da Klebsiella ko loni lerinin görünümü (Suş no. 4) Resim 3.3. Koyun Kanlı Agar da Staphylococcus kolonilerinin görünümü (Suş No. 7) Resim 3.4. Candida türlerinin Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) da görünümü (Suş No. 4) Resim 3.5. Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) panelin görünümü Resim 3.6. BBL Crystal Identification System Gram-Positive ID Kit pane lin görünümü (A) Panel viewer görünümü, (B) normal ı şık görünümü Resim 3.7. RapID YEAST PLUS System test panelinin görünümü Resim 3.8. Gram boyama sonucunda Pseudomonasların mikroskop inceleme sinde görünümü (Suş no. P3) Resim 3.9. Gram boyama sonucunda Klebsiellaların mikroskop incelemesin de görünümü Resim Gram boyama sonucu Stafilokokların mikroskop incelemesinde görünümü Resim Katalaz Testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif reaksiyon Resim Lizin Dekarboksilaz Testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif reaksiyon Resim Üreaz testi (A) Pozitif reaksiyon (B)Negatif Reaksiyon (C) değişken reaksiyon Resim İndol Testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif reaksiyon

35 xxxv Resim Sayfa Resim Ornitin dekarboksilaz testi (A) Negatif reaksiyon (B)Pozitif Reaksiyon Resim Sitrat testi (A)Negatif reaksiyon (B)Pozitif reaksiyon Resim Metil Red Testi (A) Pozitif reaksiyon (B) Negatif reaksiyon Resim Voges proskauer testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif Reaksiyon Resim Koagülaz Testi (A) Pozitif reaksiyon (B) Negatif reaksiyon Resim Cornmeal-Tweein 80 agar da yalancı hif oluşumunun görünümü Resim Germ Tüp oluşumunun mikroskobik incelemede görünümü Resim Kristal viyole ile boyama sonucu mikroplate kuyucuklarının Görünümü Resim Safranin ile boyama sonucu mikroplate kuyucuklarının görünümü Resim Slime pozitif ve negatif izolatların Kongo kırmızılı agarda görü nümü Resim Slime pozitif ve negatif izolatların cam tüp yöntemi ile görü Nümü

36 1 1.GİRİŞ Mikroorganizmalar bir süre öncesine kadar, hızlı çoğalan ve tek başlarına hareket ederek serbestçe dolaşan canlılar olarak görülmekteydi. Araştırmacılar bu yüzden bu güne kadar, planktonik olarak da adlandırılan ve diğer bakterilerden bağımsız olarak, tek başlarına dolaşan mikrobiyal hücrelerin davranışlarını incelemiş ve araştırmalarını bu yönde geliştirmişlerdir. Bununla beraber, bakterilerin planktonik formdan çok, bir yüzeye tutunarak ve biyofilm adı verilen bir yapı oluşturarak hayatlarını devam ettirdiğine dair kanıtların ortaya konduğu birçok çalışma gerçekleştirilmiştir.

37 2 2.KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Biyofilm Nedir? Biyofilm, bir yüzeye yapışarak, belirli bir yapısal bütünlük içerisinde toplu halde yaşayan ve birbirleriyle haberleşerek varlıklarının devamı için gerekli işlevlerin yerine getirilmesini sağlayan bakterilerin oluşturduğu karmaşık bir organizasyondur [Çiftçi, 2005]. Bakteriler ekstraselüler polimerik maddeler olarak da bilinen ve bir dizi polisakkarid, nükleik asit ve protein içeren çamur veya balçık benzeri bir matriks içerisinde gömülü olarak bulunurlar. Fosil kayıtlarından edinilen bilgiler prokaryotların 3 milyar yıldan daha uzun bir süreden beri biyofilmler içerisinde yaşadıklarını ortaya çıkarmışlardır [Donlan, 2002]. Biyofilmler inert veya canlı yüzeylerde oluşabilirler. Bu yüzeyler arasında canlı dokular, medikal implantlar, endüstriyel veya içme suyu sistemlerinin boruları veya doğal akuatik sistemler yer alır. Bakteriler bir yüzeye yapıştıktan ve biyofilm oluşturduktan sonra o yüzeyden, hafif durulama ile uzaklaştırılamazlar. Biyofilm matrikslerinin içerisinde hücresel olmayan mineral kristalleri, korozyon partikülleri, kil veya çamur parçaları ya da kan bileşenleri bulunabilir [Donlan, 2002]. Yapılan araştırmalar, biyofilmlerin sadece yüzeye yapışmış durumda bulunan ve içerisinde mikroorganizmaların bulunduğu homojen bir tabakadan ibaret olmadığını, bakterilerin belirli bir yapıya sahip, koordinasyon yeteneği bulunan fonksiyonel toplulukların oluşturduğu biyolojik sistemler olduğunu ortaya koymuştur. Biyofilmler, matriksleri içerisinde yaşamlarını sürdüren hücrelere esansiyel besinlerin ve oksijenin taşınmasına imkân tanıyan 'su kanallarına' sahip, çok tabakalı heterojen bir yapıya sahiptirler. Tam hidrate ve canlı biyofilm volümlerinin %15 hücre, % 85 matriks materyali tarafından oluşturulduğu ve hücrelerin matrikslerinin çevrelediği farklı yüksekliklerdeki 'kuleler' veya 'mantarlar' içerisinde bulundukları anlaşılmıştır [Donlan ve Casterton, 2002].

38 3 Biyofilm içerisinde yaşayan mikroorganizmalar tarafından sentezlenen polisakkaridler biyofilmin ana ekstraselüler komponentini oluşturur. İçerisinde yaşayan organizmaya bağlı olarak biyofilm matriksi farklı özellikler taşıyabilir. Gram negatif bakterilerin nötral veya polianyonik biyofilmler oluşturduğu ve Gram pozitif bakterilerin katyonik matriksler oluşturduğu bilinmektedir [Çiftçi, 2005]. Biyofilm bakterileri çevre koşullarına, serbest bulunan planktonik bakterilerde daha dirençlidir. Biyofilm yapısı, inhibitör etkisi olan antibiyotik, dezenfektan ve ısıya karşı koruyucu özellik gösterir fakat bu direncin mekanizması ortaya konamamıştır [Çiftçi, 2005]. Donlan ve Casterton biyofilm tanımını biraz daha geliştirmiş ve biyofilmleri aşağıdaki özelliklere sahip mikrobiyal hücrelerden oluşan hareketsiz bir topluluk olarak tanımamışlardır: 1) Hücreler irreversibl olarak bir substrata, ara yüzeye veya birbirlerine tutunmuşlardır. 2) Hücreler kendi ürettikleri ekstrasellüler polimerik maddeden oluşan bir matriks içerisinde gömülüdürler. 3) Büyüme hızları ve gen transkripsiyonları açısından serbest dolaşan türdeşleri ile aralarında farklılıkları vardır. Bu tanım çok önemlidir çünkü bir yüzeyde koloniler halinde tutunarak yaşayan bazı mikroorganizmaların oluşturduğu her tabakaya biyofilm denilmemelidir. Gerçekte biyofilm olmayan bu topluluklar, bulundukları yüzeyde planktonik hücre davranışı sergilemeye devam ederler. Hiçbirinde biyofilm içerisindeki bakterilerde izlenen direnç ve irreversible yapışma gibi özellikler izlenmez. Bununla beraber, biyofilm içerisindeki hücrelerin zamanla matriksten koparak ayrıldıkları ve dolaşıma geçtikleri unutulmamalıdır. Dolaşıma geçen bu hücreler, planktonik formda olmalarına karşın, ayrıldıkları topluluğun tüm rezistans karakterilerini taşımaktadır [Çiftçi, 2005].

39 4 Biyofilmin plaktonik bakterilerden üstünlükleri Donlan tarafından dört madde altında toplanmıştır. Bunlar sırasıyla: EPS, çevreden besin maddelerini konsantre ederek bakterilerin kullanımına sunar. Biyofilm oluşumunda bulunan bakteriler, antimikrobiyal maddeler, yüzey gerilimini değiştiren ajanlar, sıcaklık, konakçıya ait fagositler ve oksijen radikalleri, proteazlar gibi çeşitli koşullara ve maddelere direnç gösterir. Bu direnç, gelişimin durdurulup canlılığın korunmasında, genetik düzenleme ile yukarı ya da aşağıya doğru düzenleme ile modifikasyona kadar değişen reaksiyonlar halinde gözlemlenir. Tabakalı dizilim sonucu yüzeyde bulunan çeşitli bakteriler mekanik kalkan etkilerinin yanı sıra, katalaz, peroksidaz, proteaz ve lipaz inhibitörleri salgılayarak antimikrobiyallere karşı, iç yüzeyde bulunan bakterileri korur. Biyofilm parçaları koparak yeni yüzeylere yayılır ve planktonik bir hücrenin tutunmasında daha uygun bir yüzey oluşturur [Donlan, 2002] Biyofilmin Tarihçesi Günümüze kadar Biyofilmin tanımı birçok bilim adamın tarafından farklı olarak tanımlanmıştır. İlk olarak Heukelekson ve Heller, suda yaşayan mikroorganizmalarda 'şişe etkisi'ni izlemişlerdir. Bu organizmalar, tutunabilecek bir yüzey bulmaları halinde, artmış aktivite ve büyüme hızları sergilemekteydi. Deniz suyu içerisinde yaşayan mikroorganizmaları inceleyen Zobell de, yüzeylerde bulunan bakteri sayısının, su içerisinde serbest dolaşan bakteri sayısından çok daha fazla olduğunu ortaya koymuştur [Donlan, 2002].

40 5 Bir atık su işleme ünitesindeki filtreleri inceleyen Jones ve ark., filtreler üzerinde tutunmuş halde bulunan hücrelerin morfolojilerine bakarak, farklı mikroorganizmaların bir arada bulunduklarını tesbit etmiştir. Rutenyum kırmızısı adı verilen spesifik bir polisakkarid boyası kullanılarak, bu topluluklar içerisindeki hücreleri çevreleyen matriks materyalinin polisakkarid olduğu belirlenmiştir yılında Caracklis, endüstriyel su sistemlerindeki mikrobiyal toplulukları incelemiş ve bunların sadece yüzeye kuvvetle tutunmadıklarını, aynı zamanda klor gibi dezenfektanlara karşı çok dirençli olduklarını da göstermiştir [Donlan, 2002]. Characklis ve Marshall da, 1990 yılında uzaysal veya zamansal heterojenisite ve inorganik ya da abiyotik maddelerin biyofilmin yapısındaki rolleri gibi, biyofilmin diğer tanımlayıcı özelliklerini açığa çıkararak bu teorinin doğruluğunu desteklemişlerdir. Biyofilmler aslında ilk olarak 17. yüzyılda Anton von Leeuwenhoek tarafından tanımlanmışlardır. Bununla beraber o dönemde dişinin üzerindeki plaktan aldığı sürüntüyü inceleyen ve mikroskop altında mikrobiyal kümelerin varlığını izleyen Leeuwenhoek, baktığı şeyin biyofilm olduğunun farkında değildi li yılların başında Costerton, dağlardaki akarsuların içerisinde yaşayan bakterileri incelerken bakterilerin %99,99 unun bir yüzeye yapışarak, balçık benzeri bir yapı içerisinde yaşadıklarını ortaya koymuştur. Daha önce yapılan çalışmaların da ışığında, 1978 yılında bu toplulukları tanımlamak amacıyla Costerton ilk defa biyofilm terimini kullanmıştır [Sakarya, 2005] Biyofilmin Yapısı 3 boyutlu perspektiften bakıldığında Biyofilm, bakterinin yüzeyinde düzensiz bir şekilde dağılmış polisakkarit doğasında bir matrikstir. Yapılan çalışmalarda matriksin yoğunluğu ve genişliği sadece hücresel ve hücresel olmayan yapılar

41 6 arasında değil aynı zamanda mikroorganizmaların türleri arasında da değişmektedir. Tüm biyofilmlerin büyük bölümü (%73 98) hidrate şeklindedir. Mikroskobik olarak incelendiğinde biyofilm, arasından kanalların geçtiği mercan kayalıklar üzerindeki, piramit veya mantar şekilli uzantılardan oluşan bir oluşum görünümündedir [Sakarya, 2005]. Biyofilmin mercan kayalık görünümlü yoğun ve kopmleks yapısı, ortamdaki organik ve inorganik moleküllerin ekstrasellüler yapısında toplanmasıyla oluşur. Biyofilmin gelişme potansiyeli yakın çevredeki besinlerin kullanımı ve hücre içine alımı, atıkların uzaklaştırılması ile yakın ilişkili olup, bunların dışında besin kısıtlanması sonucu eksprese olan Quorum-sensing moleküllerinin salınımı, ortam ph ı, O 2 perfüzyonu, karbon kaynağı ve ozmolarite de gelişimde çok etkilidir. Son yıllarda bazı ökaryot ve prokaryot hücreler tarafından salınan ve hücreler arası sinyal iletimini sağlayarak bakterinin gen ekspresyonunu düzenleyen moleküller aracılığı ile biyofilm yapımının düzenlenebileceğinin gösterilmesi biyofilmin patojenite ve çevreye adaptasyonunda önemini artırmıştır [Sakarya, 2005] Mikroorganizmalar Neden Biyofilm Oluşturur? Mikroorganizmaların biyofilm oluşturan formları ile serbest yaşayan formları arasında ciddi farklılıklar görülmesine ve mikroorganizmanın biyofilm oluşturmasını gerektiren durumlar ile ilgili farklı görüşler olmasına karşın, biyofilm oluşumunun nedenlerini şu başlıklar altında toplamak uygun olacaktır: Savunma Strese cevap olarak gelişir. Biyofilmin kan akımı ve tükürüğün yıkama gücü gibi birçok fiziksel güce karşı dayanıklılığı vardır. Biyofilm içindeki mikroorganizmalar besin yokluğu, ph değişiklikleri, oksijen radikalleri, dezenfektanlar, fagositoz ve antibiyotiklere karşı, serbest yaşayan hücrelerden daha dirençlidir. Biyofilmin büyük

42 7 bir bölümünü oluşturan ekzopolisakkaritler (EPS) savunmada önemli rol oynayan moleküllerdir. EPS, bulunduğu mikroorganizmayı elektriksel çekim alanından uzaklaştırarak, inflamatuvar hücrelerin fagositozundan, antibiyotik etkisinden korur [Öztürk ve ark., 2008] Adezyon ve kolonizasyon İnsan ve hayvanlar, mikroorganizmaların süreğen bir şekilde vücutlarında bulunmaları sayesinde, bilinen karmaşık immün sistemlerini geliştirirler. Vücudun en azından bir bölümü bakterinin yaşama ve gelişmesi için besinden zengin ve su içeriği, O 2 olanağı ve ısı gibi ortamda devamlı bulunan bir takım faktörlerle sabit bir yapı oluşturur. Tüm bunların sonucu vücudun immün sistemi ile bakteri arasında, bakterinin vücudu istila etmesine karşı amansız bir yarış sürmektedir. Bazı durumda uzlaşma olarak belli bölgelerde büyük miktarlarda ve bu bakterilerin yaşamasına izin verilmektedir ve bu bakterilerin çoğu biyofilm oluşturmaktadır. Vücut, bilindiği gibi bakterilerin yaşaması için çekici bir ortam olup, bakterilerin bu bölgede biyofilm oluşturarak yaşaması için primer bir motivasyon oluşturmaktadır. Mikroorganizmaların vücudun herhangi bir bölgesinde sabit kalabilmeyi sağlaması için birtakım stratejisi vardır. Mikroorganizma yüzey proteinleri, konakçının fibronektin, fibrinojen, vitronektin, elastin gibi ekstraselüler maktiks proteinlerine yapışır [Öztürk ve ark., 2008] Yaşanabilir çevre geliştirmek Özellikle ortamdaki glikozun bakteri tarafından kullanılabilir olmasının pseudomonas, vibrio cholerae, escherichia coli ve stafilokokları EPS ekspresyonu ve biyofilm oluşturmalarını belirgin şekilde artırdığı gösterilmiştir [Öztürk ve ark., 2008].

43 Topluluk oluşturmak Mikroorganizmanın ortama adaptasyonundaki beraberlik biyofilm oluşturmada sıklıkla görülmektedir. Tüm mikroorganizmaların çevre faktörlerine aynı yanıtı vermiş olması ve fenotipik değişiklikler sergilemesi toplu halde yaşamalarının en önemli göstergesidir [Öztürk ve ark., 2008] Biyofilm Oluşum Aşamaları Biyofilm oluşumu mikroorganizmaların bir yüzeye tutunmaları ile başlayan dinamik bir prosestir. Bu tutunma sonucu biyofilm fenotipinin ortaya çıkmasına neden olan bir dizi genetik işlem başlatılır. Mikroorganizmaların bir yüzeye tutunabilmesi için, kendinin bir yüzey ile ne zaman temas kurduğunu anlaması gerekir. Mikroorganizmalar bu çevresel stimusları fenotipik değişikliklere çevirebilmek amacıyla, bir verici ve bir alıcıdan oluşan düzenleyici bir sisteme sahiptir. Tutunma işleminden sonra biyofilm oluşturmak yönünde farklılaşma işleminin başlaması, quorum-sensing sistemi denilen başka bir haberleşme sisteminden gelen yanıta bağlıdır. Bu sistem ile mikroorganizmalar çevresindeki mikroorganizma populasyonunun yoğunluğunu belirler. Bir yüzeye tutunan her mikroorganizma, ortama ben buradayım mesajı veren bir molekül sağlar. Yüzeye tutunan mikroorganizma sayısı arttıkça, bir sinyalin lokal konsantrasyonları artmaktadır. Bir sinyal molekülünün konsantrasyonundaki artış ile birlikte, biyofilm oluşumuna yönelik bir dizi işlem başlatılmış olur. Yani biyofilm içerisindeki mikroorganizmalar intrasellüler, düşük molekül ağırlıklarına sahip haberciler aracılığıyla haberleşmektedir. İkinci basamak ise mikroorganizmaları yüzeye yapışma veya kuvvetli bir şekilde tutunma işlemidir. Üçüncü evrede ise mikroorganizmalar mikrokoloniler haline dönüşür. Dördüncü evrede ise mikrokoloniler büyür ve kompleks, mantar şeklinde yapılara veya kulelere dönüşür. Çeşitli yükseklikte kuleler oluşturan mikrolokonilerin aralarında, besinlerin ulaştırılması ve metabolik atık ürünlerin

44 9 uzaklaştırılması için primitif bir dolaşım sistemi olarak görev yapan su kanalları bulunmaktadır. Biyofilm gelişiminin beşinci evresi ise kopma veya ayrılma evresidir. Bu evrede tek bir mikroorganizma veya mikroorganizma kümeleri biyofilm tabakasından koparak artama yayılır. Bu ayrılma işlemi dış kuvvetlerin etkisiyle olabileceği gibi, biyofilm oluşum prosesinin bir parçası olarak tek bir hücrenin veya multipleks hücrelerin emboli şeklinde kopmasının bir sonucudur [Öztürk, 2005]. Yapılan çalışmalar sonucu yapısal olarak planktonik hücreden köken alan biyofilmin oluşum aşamaları belirlenmiştir. Bunlar: Tutunma yüzeyinin oluşumu Öncü mikroorganizmanın tutunması Slime (mukoz) tabakanın oluşumu Sekonder kolonizasyon Olgun biyofilm [Koluman, 2006] Mikroorganizmanın adheransı Mikroorganizma adheransı iki aşamadan oluşmaktadır: Pimer adezyon Birçok fizikokimyasal değişkenin rol oynadığı bu bağlanma, geri dönüşümlü ve gevşek bir bağlanma olup, mikroorganizma ile cansız yüzeyler arasında oluşmaktadır. Bu adezyonun oluşması için öncelikle mikroorganizma ile yüzey yeterli yakınlığa ( 1 nm) ulaşmalıdır. Bundan sonra adezyon, her iki yüzeyin çekim ve itme gücüne bağlı olarak gelişmektedir. Bu güç; elektrostatik ve hidrofobik ilişki, van der Waals gücü, ısı ve hidrodinamik güç şeklinde olmaktadır. Mikroorganizmaların hemen hepsi ve cansız yüzeyler, negatif elektrik yüzüne sahip

45 10 olup, birbiri için itme gücü oluşturur. Mikroorganizma ile yüzey arası primer aderansta en önemli etkinin hidrofobik ilişki olduğu bilinmektedir [Öztürk, 2008]. Sekonder adezyon Aderansın, mikroorganizma yüzeyindeki piluslar, fimbriyalar veya fibriller gibi ligandların, ökaryot hücrelerdeki sekonder ligandlara bağlanması ile oluşan spesifik ve geri dönüşümsüz aşamadır. Biofilmin olgunlaşması bu aşamadan sonra başlar. Biyofilm geliştikçe, mikroorganizmanın aderans ve motilite faktörlerinin salgılanmasında bir baskılama olmaktadır. Ancak birçok türde biyofilm anyonik yapıda olup, esansiyel mineraller ve besinlerin çevreden yakalanarak konsantre edilmesini sağlayan bir sistem oluşturmaktadır. Esas olarak biyofilm, üç boyutlu bir çekim gücü oluşturup, bulunduğu mikroorganizmayı çevreleyerek mikroorganizmanın korunmasını ve aderansını sağlar [Öztürk, 2008]. Yüzeye organik ve/veya inorganik maddelerin yapışmasını takiben mikroorganizmalar bu yüzeye geri dönüşür özellikte tutunur. Mikroorganizmanın hareketi veya yüzeyi ile tutunulan yüzey arasındaki elektrostatik veya fiziksel etkileşimler, bu evrede rol oynamaktadır. Yüzeye tutunan mikroorganizmalar, hücre zarındaki proteinlerin uyarılması sonucunda ekzopolisakkarit yapıda maddeler sentezlemeye başlar ve bu da hücrelerin birbirlerine ve yüzeye tutunmasını sağlar. Kistik fibroz olgularında sık görülen Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerinde bu materyal aljinat yapıdadır. Ekzopolisakkarit aynı zamanda mikroorganizmanın olumsuz çevre koşullarından korunmasını da sağlamaktadır [Çiftçi, 2005]. Yüzeye tutunan mikroorganizmalar bölünüp çoğalarak biyofilmin en küçük organizasyon birimi olan mikrokolonileri oluşturur. Bu mikrokoloniler üzerine ortamdaki planktonik mikroorganizmalar da yapışarak kolonizasyonu sağlar. Biyofilmin üst kısımlarından kopan hücreler yeni odaklarda biyofilm oluşturabilir. Biyofilm oluştuktan sonra mikroorganizmada genetik düzenlenme sonrasında hareketi sağlayacak olan flajeller sentezlenir, üst tabakadan kopmalar gerçekleşir ve

46 11 kopan planktonik hücreler yeni biyofilm odaklarını oluşturmak üzere ayrılır. Bu sürek bir dengeye oturunca süreklileşir [Çiftçi, 2005] Biyofilm Hücresi - Planktonik Hücre Karşılaştırılması Biyofilm içerisinde yaşayan hücrelerin, planktonik hücrelerle karşılaştırıldıklar zaman farklı gen ekspresyon paternleri olduğu izlenir. Gen ekspresyonundaki bu farklılık planktonik benzerlerinden fenotipik olarak farklı özelliklere sahip hücrelerin ortaya çıkmasına neden olur [Çiftçi, 2005]. Klinik olarak çok önemli olan diğer bir avantaj da, biyofilm içerindeki hücreleri antibiyotiklere karşı, planktonik benzerlerinden binlerce kat daha dirençli oluşudur. İlk başlarda ekzoplisakkarid matriksin antimikrobiyal maddeyi absorbe ettiği veya diffüzyonunu kısıtladığı düşünülmüş olsa da, artık birçok antibiyotiğin biyofilm tabakasını kolayca penetre ettiği bilinmektedir. Bunun en olası açıklaması, biyofilm bakterisinin geçirdiği fenotipik değişikliklerin kendisi için koruyucu bazı özellikler kazandırmış olmasıdır. Başka bir deyişle, birçok antibiyotik hızla bölünen hücreleri hedeflediği için, özellikle biyofilmin derin tabakalarında bulunan ve azalmış metabolik bölünme hızları sergileyen hücrelere etkili olamamaktadır. Antibiyotiklerle tedavi edilmiş olan biyofimlerin yüzey kısımlarında mikrobisidal etki izlenirken, daha derin kısımlarında yaşayan hücreler hayatta kalmakta ve yeniden enfeksiyon gelişiminde bir nidus teşkil etmektedir. Mikrobiyal hücrelerden salgılanan ekzopolisakkaridler hem fiziksel hem de kimyasal özellikler açısından farklılıklar gösterir. Polisakkaridler uzun, ince moleküler zincirlerdir ve 0,5-2,0 x 106 Daltonluk bir moleküler yapıya sahiptirler. Biofilm preparatlarında polisakkaridler bakteriyel hücre yüzeyine tutunmuş olan ince şeritler halinde ve hücrenin etrafında kompleks bir ağ oluşturmuş şekilde izlenir [Çiftçi, 2005].

47 Doğada Biyofilm Doğal bir ortamda, tek bir tür bakteri izole bir kültür içerisinde yaşayamaz. Bakteriler her zaman diğer bakteri türleri ile bir alış veriş arayışı içerisindedir. Bu alış veriş esnasında birbirlerinin atıklarını kullanırlar ve hatta birbirlerine genetik paketler gönderirler. Henrici ve Zobell gibi araştırmacılar neredeyse 70 yıl önce yüzeye yapışmış bakterilerin varlığını tanımladıkları ve inceledikleri halde, biyofilm topluluklarının anlamı daha yeni yeni anlaşılabilmektedir. Bunun da ötesinde, bakterilerin multisellüler davranış perspektifinde görülmeye başlanması ile mikrobiyolojiye bakış açımız değişmiştir. Tek başlarına biyofilm oluşturabilen veya diğer mikroorganizmalarla ortak biofilm oluşturmak için iletişime geçebilen sayısız bakteri ve üretilebilecek sayısız polisakkarid türü var olduğu düşünüldüğünde, elde edilebilecek farklı türdeki biyofilm sayısı sonsuza yaklaşmaktadır. Bu nedenle, doğada tek bir türün oluşturduğu biyofilmler çok nadir olup, daha çok birden fazla organizmanın oluşturduğu biyofilmler izlenir [Çiftçi, 2005] Faydalı Biyofilmler Bazı durumlarda bakterilerin biyofilm oluşturmaları sayesinde, doğada bulunan ve insan sağlığına zararlı birçok madde elimine edilebilmektedir. Bu durumlara örnek olarak, yer altı su kaynaklarının kontaminasyonunun engellenmesi, kullanılmayan ve çevreye zararlı olabilecek petrol yataklarının çevrelenmesi ve maden yataklarından çevreye yayılan sülfür ve benzeri yan ürünlerin detoksifikasyonu gösterilebilir. Kontamine bölgelerde yer altı su kaynaklarına ucuz karbon kaynaklarının pompalanması ile oluşturulan biyofilmler hem oluşturdukları bariyerle su kaynakları ve çevre kirleticileri arasındaki geçişleri engelleyecek hem de biyofilm içerisindeki azot veya sülfür tüketici bakteriler sayesinde ortamdaki istenmeyen miktardaki inorganik madde yükü azaltılabilecektir [Çiftçi, 2005].

48 Tıbbi Enfeksiyonlar ve Biyofilm İlişkisi Mikrobiyal biyofilmlerin insan sağlığı üzerinde önemli etkileri vardır. Amerika Birleşik Devletleri ndeki Ulusal Sağlık Enstitüleri (The National Institutes of Health), enfeksiyonların %80 inden fazlasına biyofilmlerin neden olduğunu tahmin etmektedir [Çiftçi, 2005]. Donlan, birçok idrar yolu enfeksiyonundan katater veya implantlar üzerinde oluşanbiyofilmlerin sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Bunlara ek olarak ABD de gerçekleştirilen plastik cerrahi operasyonlarının %2 sinde biyofilm enfeksiyonların edeniyle protezin değiştirilmesi gerekmektedir. Bu da yılda yaklaşık 900 milyon Amerikan dolarının bu değiştirme operasyonları için harcanması anlamına gelmektedir [Çiftçi, 2005]. Biyofilm ile ilişkili organizmaların insanda hangi mekanizmalarla hastalığa yol açtığı hala tam olarak anlaşılabilmiş değildir. Öne sürülen mekanizmalar arasında; 1) Medikal cihazlar (implantlar) üzerindeki biyofilmden kopan hücre veya hücre kümelerinin kanda veya üriner sistemde enfeksiyona neden olmaları 2) Endotoksin üretimi 3) Konak bağışıklık sistemine karşı yapısal direnç göstererek varlığını sürdürme 4) Biyofilm içerisinde dirençli plazmid değişimi yapmak aracılığıyla, antimikrobiyal madde direnci kazanarak varlığını sürdürme bulunmaktadır. Bilimsel gelişmelerin sonucu olarak, birçok akut enfeksiyon antibiyotiklerle etkin bir şekilde tedavi edilebilmektedir. Bununla beraber bu durumun iki istisnası vardır. Bunlardan ilki antibiyotiğe duyarlılığı olmayan bakteri varlığıdır. İkinci istisnai durum ise biyofilm içerisinde yaşayan bakteri varlığıdır. Biyofilm bakterilerinin,

49 14 planktonik yaşayan aynı türdeki bakteriler oranla antibiyotik tedavisine 100 kat daha dirençli olabildiği bildirilmiştir [Çiftçi, 2005]. Stafilokok ve pseudomonas gibi bazı bakterilerin yapıları, antibiyotik lerinpenetrasyonun arezistan bir glikoprotein tabakasına sahip bir biofilm oluşturmayamüsaittir. İmplant materyalleri üzerinde böyle bir biyofilm oluşumu, implantların üzerinde kalıcı bir enfeksiyon kaynağı oluşturarak, implantın çıkarılmasını gerektirebilir. Eklem replasman protezleri, pacemakerlar, kalp kapakçıkları, vasküler stentler ve oftalmik implantlar gibi çeşitli implantlar üzerinde biofilm oluşumu izlendiğine dair birçok yayın bulunmaktadır. Medikal protezler ya teflon, plastik, lateks ve silikon gibi hidrofobik materyallerden veya cam ya da çeşitli metaller gibi hidrofilik materyallerden yapılmaktadır. Genelde yüzeyi daha kaba ve daha düzensiz olan ve daha hidrofobik olan materyallerde biyofilm daha hızlı bir şekilde gelişmektedir [Çiftçi, 2005] Biyofilm Enfeksiyonlarının Ortak Özellikleri 1) Biyofilmler tercihen inert yüzeylerde veya ölü bir doku üzerinde yerleşirler ve genelde medikal aygıtlar ve kemik sekestrasyonları gibi ölü doku fragmanları üzerinde oluşurlar. Endokardit olayında olduğu gibi canlı dokularda da yerleşebilirler. 2) Biyofilmler yavaş büyüme özelliğine sahiptirler ve biyofilm enfeksiyonları sıklıkla belirgin klinik semptom vermeden gelişirler. Hareketsiz bakteriyel hücreler antijen salgılayarak antikor üretimin stimüle ederler fakat antikorların biofilm içerisindeki bakterileri öldürebilme yeteneği yoktur. Biyofilmler bu yolla çevreleyen dokularda immün kompleks hasarına yol açabilirler. Mükemmel hücresel ve hümöral immün yanıtları olan bireylerde bile, konak savunma mekanizmaları biyofilm enfeksiyonlarını sonlandıramamaktadırlar. Antibiyotik tedavisi biyofilmden ayrılmış olan planktonik hücrelerin neden olduğu

50 15 semptomları ortadan kaldırır fakat biyofilmi yok edemez. Bu nedenle biyofilm infeksiyonları, dönem dönem kullanılan antibiyoterapiye rağmen semptomlar göstermeye devam ederler. Bu durum biyofilm populasyonunun cerrahi olarak vücuttan uzaklaştırılmasına kadar devam eder. 3) Planktonik bakteriyel hücreler biyofilmlerden salınmaktadır ve biyofilmden kopma işleminin doğal olarak programlanmış bir olay olduğu görüşünü destekleyen kanıtlar vardır. Bu nedenle, biyofilmler akut enfeksiyon için bir 'nidus' görevi görerek, salınan planktonik hücrelerin konak savunma mekanizmalarının başarısız kaldığı durumlarda akut enfeksiyon gelişimine neden olabilmektedirler [Çiftçi, 2005] Biyofilmler Neden Antimikrobiyallere Karşı Dirençlidir? Doğal ve endüstriyel çevrelerde büyüyen biyofilmlerin bakteriyofaj, amipler ve çeşitli kimyasal biyosidlere karşı duyarlı oldukları bilinmektedir. Tıbbi alanda ise, hareketsiz bakteriyel hücreler konak savunma mekanizmalarına karşı koyabilmekte ve planktonik formda olan bakterilere oranla, antibiyotiklere çok daha fazla dirençli olabilmektedirler. Biyofilmlerin bu dirence multipl mekanizmalar aracılığıyla sahip oldukları düşünülmektedir: 1. Antimikrobiyal ajanın biyofilmin tüm tabakaları boyunca penetrasyon göstermemesi. Biyofilm matriksi içerisindeki polimerik maddelerin antibiyotik diffüzyonunu güçleştirdiği bilinmektedir. Bu durum yeterli antibiyotik konsantrasyonuna asla ulaşılamaması anlamına gelmektedir. 2. Biyofilm içerisindeki hücrelerden en azından bir kısmı besin yetersizliği yaşamakta ve bu nedenle yavaş büyüme fazına girmek zorunda kalmaktadırlar. 3. Yavaş büyüyen veya büyüme göstermeyen hücreler birçok antimikrobiyal maddeye karşı duyarlı değildirler ve birçoğu hayatta kalabilmektedirler. 4. Biyofilm içerisindeki bakteriler arasında direnç genlerinin değişimi söz konusudur [Çiftçi, 2005].

51 Biyofilm İncelenmesi ve Ölçümü Biyofilm hakkındaki bilgiler, biyofilm inceleme yöntemlerinin geliştirilmesi ile artmıştır. Biyofilmle ilgili ilk çalışmalarda Scanning Elektron Mikroskobu (SEM) kullanılmıştır. Bu yöntemde spesimen, inceleme öncesinde alkol, aseton ve ksilen gibi solventler kullanılarak dehidrate edilmektedir. Bu dehidratasyon işlemi de bir kısım artefaktların oluşmasına neden olabilmektedir. Transmisyon Elektron Mikrosikobu (TEM) ve Ruthenyum kırmızısı gibi bazı polisakkarit boyaların kullanılmasından sonra biyofilm içerisindeki ekstrasellüler matriks yapısı ve bunun hücrelerle olan ilişkisi daha iyi anlaşılmıştır. Daha donra TEM ve SEM kullanılarak tıbbi cihazlar ve bazı insan enfeksiyonlarında biyofilm oluşumu incelenmiştir [Çiftçi, 2005] lerde Confokal Lazer Scanning Mikroskobun (CLSM) keşfinden sonra biyofilm araştırmalarında büyük ilerlemeler olmuştur. CLSM ve epifloresan mikroskopinin kullanılmasından sonra biyofilm içindeki mikroorganizmalar bazı floresan boyalarla boyanmaya başlanmış; spesifik hücre fonksiyonları için spesifik dalga boyunda floresan boyalar dizayn edilmiş, böylelikle bazı hücre fonksiyonlarının da değerlendirilmesi mümkün olmuştur. Bununla birlikte, biyofilm oluşturan bakterilere karşı kullanılacak olan antibakteriyel tedavinin etkinliğinin ölçülmesi de önemli bir konudur. Klasik minimal inhibition concentration (MIC) ölçüm yöntemleriyle biyofilm oluşturan bakterilerin antibiyotik duyarlılıklarının analiz edilmesi doğru sonuç vermeyecektir. Bilindiği üzere biyofilm oluşturan bakteriler, planktonik bakterilere göre daha dirençlidir. Biyofilm oluşturan bakterilerin antibiyotik duyarlılıklarını tespit etmek amacıyla Modifiye Robbins Cihazı ve Calgary biyofilm cihazı gibi cihazlar geliştirilmiştir [Çiftçi, 2005]. Ayrıca biyofilm ölçümleri için spektrofotometrik yöntemler de geliştirilmiştir. Bu yöntemler temelde, bakteriler tarafından oluşturulan biyofilm yapısının kristal viyole, safranin gibi boyar maddelerle boyanarak gösterilmesinden ibarettir. Bu testlerde

52 17 tutunma yüzeyi olarak plastik veya cam malzemeler kullanılmaktadır [Moskowitz ve ark., 2005; Yıldırım, 2006] Biyofilmle İlgili İnsan Enfeksiyonları Kulak, burun, boğaz alanında olduğu kadar diğer bölümlerle ilgili enfeksiyonlara da rastlanmaktadır. Otitis media, kronik rinosinüzit, adenoit bildirilen diğer enfeksiyon hastalıklarıdır [Akyıldız, 2008] Enfektif endokardit Mitral, aortik, triküspid ve pulmoner kapakçıkların vasküler endoteline, dolaşımda bulunan bakteri veya mantarların yerleşmesi sonucu oluşan bir durumdur. Normalde intakt endotelde kan akımı laminar olduğu için bakterilerin yapışma olasılığı düşüktür. Ancak hasarlı endotelde türbülan akım oluşur ve bu nedenle bakterilerin endotele tutunması kolaylaşır. Endotel hasarı olan yerde trombüs oluşumu meydana gelir ve bu duruma non-bakteriyel trombotik endokardit denir. Kapakçık endotelinde hasar olan ve türbülan akım olan hastalarda cerrahi işlemler neticesinde geçici bakteriyemiler oluşur. Bu bakteriyemiler sırasında bakteri hasarlı endotele tutunur ve burada mikroorganizma ve pıhtıdan oluşan bir kitle meydana gelir. Bu kitle içindeki bakteriler hızla çoğalıp çevrelerindeki fibrin matriks sayesinde konakçı savunma mekanizmalarından etkilenmeden üremeye devam eder. Vejetasyon olarak adlandırılan bu yapı, esasında bir biyofilm oluşumudur [Akyıldız, 2008] Otitis media Otitis mediaya neden olabilecek pek çok bakteri vardır. Bunlar arasında Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, grup A beya-hemolitik Streptokoklar, enterik bakteriler, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa sayılabilir.

53 18 Timpanostomi tüplerinde biyofilm oluşumu gösterilmiştir. Yapılan bir çalışmada 24 adet Kronik efüzyonlu otitis media (KEOM) olan çocuğa tüp takılması sırasında alınan biyopsilerin hepsinde etken mikroorganizmalar saptanmıştır. Ancak bu çocuklardan yapılan kültürlerin ise yalnız 6 tanesinde üreme saptanmıştır. Ayrıca yapılan diğer çalışmalarda CLSM ile inceleme sonucunda hem KOEM hem de akut otitis media lı kulaklarda biyofilm oluşumu saptanmıştır [Akyıldız, 2008] Kronik bakteriyel prostatit Kronik bakteriyel prostatitte (KBP) biyofilm oluşumunu gösteren pek çok yayın bulunmaktadır. Domingue ve Hellstrom KBP de tedavide başarısızlığın en büyük nedeni olarak KBP ile ilişkili mikroorganizmaların biyofilm oluşturmasını göstermiştir. KBP de biyofilm oluşumunun etkisi çok açıktır ve uygulanacak tedavide bu durum mutlaka göz önünde bulundurulmalıdır [Akyıldız, 2008] Kistik fibrozis Yapılan çalışmalarda P.aeruginosa kolonizasyonu saptanan Kistik Fibrozisli hastlarda 2-3 katı mortalite riski bildirilmektedir. P. aeruginosa CFTR (-) olan akciğerlerde daha rahat kolonize olmaktadır. p.aeruginosanın salgıladığı piyosiyanin adlı maddenin CFTR ekspresyonunu azalttığı ve kolonizasyona, dolayısıyla biyofilm oluşumuna yardım ettiği bildirilmiştir. Kistik fibrozisli hastaların viskoz mukuslarının içinde P.aeruginosa mukoid forma dönüşerek biyofilm formuna döner. Bakteriler biyofilm oluşumunu quorum sensing denen bir mekanizma ile birbirleri ile haberleşerek yaparlar [Akyıldız, 2008] Periodontit Oral kavitede biyofilm oluşturan bakteriler polimikrobiyaldir. S.mutans, S.gordionii. P.gingivalis, S. cristatus, F. Nucleatum, Peptostreptococcus micros, Eubacterium timitum, Eubakterium brachy, Lactobacillus, Actinomyces neaeslndii, Pseudomonas anaerobius, Bacteroides pneumosintes ve Haemophhilus aphrophilus bu bakteriler

54 19 arasındadır. Bazı yayınlarda da periodontitten sorumlu primer ajanın Porphyromonas gingivalis olduğu bildirilmiştir. Amerikan toplumunun %15 i dental biyofilm oluşumunu etkilemektedir ve tedavi edilmediği takdirde diş kaybı ve sistemik problemler neden olabilmektedir. Bu mikroorganizmalar diş çevresinde uygun vasatı bulduklarında birbirlerine ve diş yüzeyine yapışmakta ve biyofilm oluşumu başlamaktadır. Ortalama 2-3 haftada gelişen bu biyofilm yapısına dental plak ismi verilmektedir. Kalsiyum ve fosfat ile mineralize olan bu plak yapısı tartar ismini alır. Bu plağın dişin iç katmanlarına doğru ilerlemesiyle, plak içindeki mikroorganizmalar tükürük salgısının koruyucu etkilerinden kolaylıkla kurtulur ve sonuçta diş çürükleri ve gingival enfeksiyonlar kolaylıkla meydana gelir [Akyıldız, 2008] Biyofilm Oluşumunu Engelleme Stratejileri Biyofilm, basitçe yıkamakla dağıtılmayacak şekilde geri dönüşümsüz olarak inert veya yaşayan bir yüzeye yapışmış olan ve mikroorganizmaların kendi ürettikleri polimerik polisakkarit matriks içinde oluşturdukları karmaşık bir düzendir. Bu oluşumda oksijen ve besin ihtiyacı azalmakta, atıklar su kanallarıyla atılmakta ve antibiyotiklere direnç sağlanmaktadır. Biyofilm oluşturan bakterilerin, antimikrobiyal ajanlara direnç göstermesinde en önemli faktör, bu ajanların içeriye invazyonuna engel olan polisakkarit matrikstir. Bu matriksin sadece kendisiyle reaksiyona giren antimikrobiyal moleküllerin geçişini engellediği anlalışmıştır. Biyofilm oluşumunu engellemeye yönelik endüstri alanında yapılan birçok çalışma sonuçsuz kalmıştır. Tıbbi cihazlarda da, şu anki teknik olanaklarla biyofilm oluşumunu engelleyecek çok fazla seçenek bulunmamaktadır. Endüstri sahasında biyofilmle mücadelede, mekanik temizlik ve oksidatif biyosidler ise biyofilm matriksi eritip içindeki sesil mikroorganizmaları öldürmeye yöneliktir. Tıbbi cihazlardaki biyofilmle mücadelede uygulanabilecek bazı stratejiler arasında, tıbbi cihazların kontaminasyonunun engellenmesi, mikroorganizmaların bu cihazlara yapışmasının önlenmesi, biyofilm matriksinden penetre olabilecek antimikrobiyal ajanların geliştirilmesi sayılabilir.

55 20 Illingworth ve arkadaşları, gümüş ile kaplı prostetik kalp kapakçıkları kullanılarak bakteri yapışması ve kolonizasyonunun engellenebileceğini hayvan modeli kullanarak göstermiştir. Daha sonra yapılan çalışmalarda ise bu yöntemin in vitro başarılır olabileceği fakat klinik olarak çok faydasının olmadığı gösterilmiştir. SVK ler üzerinde biyofilm oluşumunu engellemek için bazı yöntemler önerilmiştir. Bunlar arasında topikal antimikrobiyal ajanların kullanılması, kateter uzunluğunun azaltılması, lümen içinin antimikrobiyal ajanlarla kaplanması sayılabilir. Maki ve Band, topikal antimikrobiyal ajanların sınırlı bir koruyucu etkisinin olduğunu ve etkisinin en çok 4 gün sürdüğünü bildirmiştir. Veenstra, klorheksidin ve gümüş sülfadiazin kaplı kateterlerin bakteri kolonizasyonunu ve bununla ilişkili kateter enfeksiyonlarını anlamlı bir şekilde azalttığını bildirmişlerdir. Huang ise ultrasonun P.aeruginosa biyofilmleri üzerine etkili olduğunu, aynı zamanda gentamisinin biyofilm üzerinde etkisini artırdığını göstermiştir. Biyofilmler, hücreler ve bunları çevreleyen ekstrasellüler polimerik bir matriksten oluştuğundan, tedavide bu matriksi eriten veya penetre eden moleküllerin etkili olabileceği düşünülmüştür. Johansen ve ark, laboratuvarda oluşturulan biyofimlere, çeşitli enzimlerden oluşan bir karışımın etkili olduğunu bulmuşlardır. Genç biyofilmler olgunlara göre antibiyotiklere daha duyarlıdır. Bu nedenle erken biyofilm oluşumunu saptayacak non-invaziv yöntemlerin geliştirilmesi, biyofilmle ilişkili hastalıklarla mücadelede tedavinin etkinliğini artıracaktır [Akyıldız, 2008] Pseudomonas Cinsi Sistematik Pseuodomonas cinsi üyeleri, Pseudomonales takımı içinde Pseudomoaceae familyasına aittir. Cins içinde 55 tür bulunur:

56 21 Pseudomonas abietaniphila, P. agarici, P. agarolyticus, P. alcaliphila, P. alginovora, P. andersonii, P. antarctica, P. asplenii, P. azelaica, P. batumici, P. borealis, P. brassicacearum, P. chloritidismutans, P. cremoricolorata, P. diterpeniphila, P. filiscindens, P. frederiksbergensis, P. gingeri, P. graminis, P. grimontii, P. halodenitrificans, P. halophila, P. hibiscicola, P. hydrogenovora, P. indica, P. japonica, P. jessenii, P. kilonensis, P. koreensis, P. lini, P. lurida, P. lutea, P. marginata, P. meridiana, P. mesoacidophila, P. pachastrellae, P. palleroniana, P. parafulva, P. pavonanceae, P. proteolyica, P. psychrophila, P. psychrotoleran, P. pudica, P. rathonis, P. reactans, P. rhizosphaerae, P. salmononii, P.thermaerum, P. thermocarboxydovorans, P. thermotolerans, P. thivervalensis, P. umsongensis, P. vancouverensis, P. wisconsinensis, P. xanthomarina, P. xiamenensis, P. sp. P. aeruginosa grup P. aeruginosa; P. alcaligenes; P. anguilliseptica; P. citronellolis; P. flavescens; P. jinjuensis; P. mendocina; P. nitroreducens; P. oleovorans; P. pseudoalcaligenes; P. resinovorans; P. straminae P. chloroaphis grup P. aurantiaca; P. chlororaphis; P.s fragi; P. lundensis; P. taetrolens P. fluorescens grup P. azotoformans; P. brenneri; P. cedrina; P. congelans; P. corrugata; P. costantinii; P. extremorientalis; P. fluorescens; P. fulgida; P. gessardii; P. libanensis; P. mandelii; P. marginalis; P. mediterranea; P. migulae; P. mucidolens; P. orientalis; P. poae; P. rhodesiae; P. synxantha; P. tolaasii; P. trivialis; P. veronii P. pertucinogena grup P. denitrificans; P. pertucinogena

57 22 P. putida grup P. fulva; P. monteilii; P. mosselii; P. oryzihabitans; P. plecoglossicida; P. Putida P. stutzeri grup: P. balearica; P. luteola; P. stutzeri P. syringae group: P. avellanae; P. cannabina; P. caricapapyae; P. cichorii; P. coronafaciens; P. fuscovaginae; P. tremae; P. viridiflava Genel özellikler Pseudomonas cinsi üyeleri, aerob, sporsuz, düz veya hafif kıvrımlı, 0,5 1,0 µm e 1,5 5,0 µm boyutlarında, Gram negatif çomaklardır [Murray, 2009]. Bazen çift çift ve bazen de kısa zincirler halinde görülen bu bakteriler kapsül oluşturmaz. Çoğu kez bir uçlarında tek, nadiren iki-üç adet kirpiği vardır ve çok hareketlidir [Bilgehan, 2000]. Son elektron alıcısının oksijen olduğu zorunlu aerobik solunuma dayalı bir metabolizmaları olmakla birlikte, bazı durumlarda nitratın, son elektron alıcısı olarak kullanılmasına bağlı olarak anaerobik olarak da üreyebilir [Murray, 2009]. Eski kültürlerinde ve antiseptik maddelerin bulunduğu ortamlarda kısa veya çok uzun deforme şekilleri hareketsiz ve pigmentsiz olanları, R tipinde üreyenleri tarif edilmiştir. Guanin + Sitozinin DNA daki oranı % 67,2 dir [Çetin ve ark. 2009]. Genel kullanım besiyerlerinde kolaylıkla optimal O C de ve hafif alkali ortamda bol olarak ürer. 42 O C de üreyebilme yeteneği P.aeruginosa için önemli bir özellik olup, arka arkaya üç pasajda 42 O C de üreyebilme özelliği P. fluorescensden ayırt edici bir özelliktir. Aerob olmakla beraber denitrifikasyon özelliğinde olduklarında anaerob üreyebilen türlerine de rastlanır. Sıvı besiyerinde yüzeyde zar

58 23 oluşturmak üzere bol ve homojen üreme gösterir ve zarın hemen altında mavi-yeşil pigment ile ayırt edilir. Eski kültürler zamanla alkali özellik gösterdiğinden bakteriler, litik fermentelerde erir ve sıvı besiyeri berraklaşır [Çetin ve ark. 2009]. Katı besiyerinde kolonileri yuvarlak, yumuşak, yassı, ortası kabarık beyaz renktedir. Bunlara Tip 1 koloni denir ve daha çok klinik materyalden izole edildiklerinde görülür. Floresan özelliği olan ve besiyerinin her tarafında yayılmış bulunan yeşilmavimsi pigmentler göze çarpar. Ayrıca, kabarık, küçük ve koliform kolonilerine benzeyen Serovar 2 ve R koloniler (Serovar 3) vardır. Bazı kolonileri mukoid görünümdedir. Bu özellik gösterenler pigment üretmez. Pseudomonas bakterileri, kültürlerde tatlımsı, aromatik meyve, üzüm ya da trimetil amin kokusuna benzer bir koku oluşturur. Koyun kanlı besiyerinde hemoliz oluşturur. Sütü 3-4 günde pıhtılaştırır ve süte sarı-yeşil bir renk verir [Çetin ve ark. 2009] Görünüm ve boyanma özellikleri Pseudomonas bakterileri, Gram negatiftir. İzolasyonun yapıldığı besiyerinde koloni şekli, rutinde sadece Pseudomonas bakterisi için anımsatıcı özellik gösterebilir. Çünkü aynı saf kültürden yapılan diğer boyamalarda bile değişik mikroskobik görünümlere rastlanabilir. Silme üreme olan bir bölgede görülebilen metalik leke, p. aeruginosayı düşündürebilir [Çetin ve ark. 2009]. İzolasyonun yapıldığı besiyerindeki koloniler eğer pigmentli ise tanıda iki önemli ipucu verir. Pseudomonas suşlarının piyosiyanin ve piyoverdin pigmentlerini oluşturnası için de çeşitli besiyerleri bildirilmiştir. Bu besiyerlerinin çoğu King ve arkadaşlarının A ve B besiyerine dayanır. Ayrıca Piyosiyanin için Pseudomonas F

59 24 Agar (Difco BD ) ve Pseudomonas P Agar (Difco BD ) besiyerleri de ticari olarak mevcuttur. Bu pigmentler besiyerine yayılır. Kloroformda eriyebilen piyosiyanin, P. aeruginosa için tanı koydurucudur. Hata idrar veya yara gibi klinik materyale kloroform eklenmesi ile kloroformun mavi renge boyanması, kültür yapmadan klinik materyalde p.aeruginosanın varlığı için kesin kanıt olarak alınabilir. Piyoverdin olarak adlandırılan floresan pigmenti, insandan izole edilen P. aeruginosa, P.fluorescens ve P. putida tarafından oluşturulur [Çetin ve ark. 2009]. Floresan pigment oluşumu kolonilerin veya besiyerindeki saf kültürün 254 nanometre dalga boyunda UV ışık altında incelenmesi ile araştırılmalıdır. Floresanın rengi sarı yeşil, sarı kahverengi veya renksiz olabilir. P.cepacia ve P. gladioli floresan vermeyen besiyerine yayılan pigmentler, P. vesicularis, P.maltophilia, P.mesophilica ve P. paucimobilis besiyerine yayılmayan floresan vermeyen pigmentler oluşturur. [Çetin ve ark. 2009] Doğal ortamlar Pseudomonas türlerinin çoğu farklı çevresel yerleşimler gösterebilir. Isı gereksinimler 4 36 O C de arasında değiştiğinden ve çok farklı türde besin maddelerini kullabildiklerinden nemli ortamlar başta olmak üzere doğada yaygın olarak bulunur. Örneğin P.putida toprakta, suda, bitkilerde ve lavabolarda, yer döşemeleri gibi hastane ortamlarında sıklıkla bulunur. İnsan izolatlarının klinik önemi genellikle belirsizdir. Fırsatçı doğaları gereği bazı Pseudomonas türleri, örneğin P.veronii kaynak sularında bulunup immün sistemi baskılanmış hastalarda enfeksiyona yol açabilen nadir izolatlardan olabilir [Çetin ve ark. 2009] Biyokimyasal özellikler Floresan Pseudomonad grubu üyeleri piyoverdin (floresan) olarak isimlendirilen, suda çözünmeyen, sarı-yeşil veya sarı-kahverengi, UV ışık altında floresan veren bir pigment üretir. Pek çok P.aeruginosa suşu mavi bir pigment olan piyosiyanin üretir. Piyoverdin, suda çözünen mavi renki bir fenotiazin pigmenti olan piyosiyaninle

60 25 birleştiğinde p.aeruginosa için karakteristik olan parlak yeşil rengi oluşturur [Çetin ve ark. 2009] Virülans faktörleri Pseudomonas türleri içinde klinik materyallerden en sık izole edilen ve ilk tanımlanan tür P.aeruginosa olduğu için, virülans faktörleri ile ilgili olarak da en çok bu tür çalışılmıştır. Pseudomonas larla enfeksiyonun, konağın savunma gücü yanında, bakterinin birçok faktörünün toplu etkisi sonucu ortaya çıktığı, tek bir faktörün patogenezi etkileme konusunda yeterli olmadığı anlaşılmaktadır [Çetin ve ark. 2009]. Bakteri hücre yüzeyi ile ilgili virülans faktörler Kirpik P.aeruginosanın yüzme şeklindeki hareketinden sorumlu yapıdır. Epitel hücresi membranı bileşeni olan asialo-gm1 e bağlanarak bakterinin adezyonunu sağlar. Kirpik Toll-benzeri reseptörler ile etkileşerek NFIB bağımlı inflamatuvar yanıtı uyarır ve kalsiyum bağımlı kinaz yolağının aktivasyonu ile interlökin-8 sentezinin başlatılmasına neden olur. Kirpiğin güçlü immünojen olması sebebiyle, kronik P.aeruginosa enfeksiyonlarında konak bağışık yanıtından kaçmak için kirpiksiz mutantlar seçilmelidir [Ceyhan, 2009]. Pili (Fimbriae) Bakterinin kısa, filamentöz yüzey yapılarıdır. Genelde prokaryot hücrelerde pili, hareketten sorumlu değilken p.aeruginosada pili seğirme (twiching) şeklinde hareketten sorumludur. Hava yollarında hızla yayılmaya ve kolonizasyona yardımcı olur. Kirpik gibi pilus da kolonizasyonun adezyon fazında epitel hücre

61 26 membranlarının asial-gm1 bölgesine bağlanarak patogenezde kritik önem taşır [Ceyhan, N. 2009]. Lipopolisakkarit (LPS) Bakteri duvarı dış membranın dış yüzeyinde yer alan LPS, fosfolipid ikili-katman içine yerleşen lipid A ve buna bağlı kor polisakkaridi ve O-özgül polisakkaridi içeren hidrofilik kuyruktan oluşur. P.aeruginosa serotiplerinin antijenik özelliklerine dayanılarak tanımlanmasınsa O-özgül polisakkarit zincirleri tanısal özelliktedir. LPS nin lipid A bileşeni, birçok inflamatuvar öncü hücreyi aktive eder ve asialo- GM1 e bağlanarak adezyonda etkin rol oynar. Kistik fibroz hastalarında p.aeruginosanın farklı lipid A mutantları bulunur ve bunlardan bazıları konağın antimikrobiyal peptidlerine karşı direnç gösterir [Ceyhan, 2009]. Aljinat Aljinat, mannuronik ve glukoronik asidin tekrarlayan polimerlerinden meydana gelen bir ekzoplisakkarittir. Her ne kadar aljinat, hücre dışına salınan bir ekzopolisakkarit olsa da, hücre ile ilişkili kalması sebebiyle hücre yüzeyi ile ilişkili virülans faktörler arasında incelenmektedir. P.aeruginosanın neden olduğu solunum yolu enfeksiyonlarında aljinat üretimi çok önemli rol oynar. Aljinat üretimi olmayan kökenlerin, sıçan akciğerine verildiğinde, aljinat üreten kökenlere hızla dönüşmesi bunun göstergesidir [Ceyhan, 2009]. Aljinat da bakterinin adezyonunda rol oynar ve bakteriyi kolonize ettiği solunum yolu epiteli üzerine sabitler. Kistik fibroz hastalarının solunum yollarında gözlenen kökenler genellikle aljinat aşırı üretimine bağlı mukoid fenotipte kökenlerdir. Ortamda nitrojen miktarının azalması ve yüksek ozmolarite aljinat üretimini tetikleyen faktörlerdir. Mukoid fenotipten mukoid olmayan fenotipe dönüşümün LPS yapısı üzerine de etkileri bulunmaktadır. Aljinat aşırı üretimi, bakteriyi fagositozdan ve antibiyotiklerden koruduğu gibi konağın bakteriye karşı yanıtını da zayıflatır. Her ne kadar kistik fibroz hastalarındaki biyofilm yapısında yer aldığı kabul edilse de

62 27 yakın tarihli çalışmalarda aljinatın biyofilm gelişimi için şart olmadığı gösterilmiştir [Ceyhan, 2009]. Hücre Dışına Salınan Virülans Faktörler Elastaz Elastin, akciğerlerin genişleyip daralmasına olanak sağlayan bir proteindir ve akciğerlerde bulunan proteinin yaklaşık % 30 u elastindir. P.aeruginosanın elastolitik etkisinden LasA proteaz ve LasB elastaz sorumludur. Enzimler sinerjik etki göstererek elastini parçalar. Hücre dışına 2 tip salgı sistemi ile salgılanan elastaz enfeksiyonun başlangıç fazında akciğerde hasara yol açarak, kompleman bileşenlerini ve serum alfa-1-proteinaz inhibitörünü parçalayarak patogenezde önemli rol oynar. Damar duvar yapısında da bol miktarda elastin bulunduğundan, elastinin parçalanması hemorajilere neden olur. IgG yi, fibrini, kolajeni, sürfaktan proteinleri A ve D yi parçalar. Ayrıca solunum yol epitellerindeki sıkı bağlantıları epitel geçirgenliğini artırır ve enfeksiyon bölgesinde nötrofilm sayısının çoğalmasına yol açar [Ceyhan, 2009]. Alkali Proteaz P.aeruginosanın fibrinoliz etkili metalloproteazıdır. Bu enzim en iyi alkali ph değerlerinde etkinlik gösterir. Akut akciğer hasarında erken dönemde alveoller içinde oluşan yoğun fibrinin alkali proteaz ile eritilmesinin enfeksiyonun ilerlemesine yol açtığı gösterilmiştir. Alkali proteazın doku invazyonu ve sistematik enfeksiyonlarındaki rolü tam olarak bilinmemekle birlikte, kornea enfeksiyonlarının patogenezinde önemli rolü olduğu gösterilmiştir [Ceyhan, 2009]. Piyosiyanin P.aeruginosanın mavi pigment özelliğidir. P.eruginosa enfeksiyonları birçok virülans faktörünü içeren çok etkenli süreçler olduğu için akciğer enfeksiyonlarında tek

63 28 başına piyosiyaninin etkilerinin saptanabilmesi için saflaştırılmış piyosiyanin ile in vitro hücre kültürü çalışmaları yapılmıştır. Çalışmalar sonucunda, piyosiyaninin hücre solunumunu inhibe ettiği, siliyer fonksiyonları bozduğu, epidermis çoğalmasını durdurduğu, prostasiklin salınımına yol açtığı, kalsiyum homeostazını bozduğu saptanmıştır. Piyosiyanin ayrıca proteaz-antiproteaz dengesini bozar ve akciğerlerde hasara sebep olur. Hem doğrudan etkiyle katalaz aktivitesini engeller, hem de katalazı kodlayan genin transkripsiyonunu azaltır. Piyosiyanin, oksitlenmiş glutatyon seviyesini artırır, nötrofillerde apopitozisi uyarır [Ceyhan, 2009]. Piyoverdin Bir siderofordur. Çevredeki demiri bağlayarak p.aeruginosanın metabolizması için demir sağlar. Ekzotoksin A nın üretimini düzenlediği gibi kendi üretimini de düzenleyerek virülansta rol oynar [Ceyhan, 2009]. Proteaz IV Yakın zamana kadar özellikle P.aeruginosa keratiti patogenezindeki rolüyle bilinirken, son çalışmalarla proteaz IV ün sürfaktan proteinleri A, D ve B yi yıktığı ve akciğer enfeksiyonları patogenezinde rol oynadığı gösterilmiştir [Ceyhan, 2009]. Fosfolipaz C Hemolitik aktiviteleriyle ayrılan iki tipte fosfolipaz C vardır. Hemolitik fosfolipaz C, fosfatidilkolin ve sfingomyelini hemolize eder. Hemolitik olmayan fosfolipaz C ise fosfatidilkolin ve fosfatidilserini hidrolize eder. Fosfolipaz C, hücre dışına tip 2 salgı sistemi ile salınır. Ökaryot hücre membranı bileşeni olan fosfolipidleri hedef alarak akut akciğer hasarı patogenezinde rol oynar. Elastazda olduğu gibi patojenik etkisinin bir kısmını sürfaktan inaktivasyonuna borçludur. Ek olarak konağın nötrofil oksidatif yanıtını baskılar [Ceyhan, 2009]. Ramnolipid

64 29 Hemolitik etkisi olan hemolizindir. Yapısındaki ramnoz içeren glikolipid sayesinde biyosürfaktan etki gösterir. Deterjan benzeri etkisiyle akciğer sürfaktanı fosfolipidlerini çözünür hale getirerek fosfolipaz C nin etki etmesine yardımcı olur. Ayrıca mukolisiyer taşınımı ve silya fonksiyonlarını inhibe eder [Ceyhan, 2009]. Ekzotoksin A (ExoA) Enfeksiyon etkeni çoğu P.aeruginosa kökeni ekzotoksin A sentezler. Hücre dışına tip 2 salgı sistemi ile salgılanan bir toksindir. ExoA p.aeruginosanın virülansında önemli rol oynar. Etkisini difteri toksinine benzer şekilde protein sentezini inhibe edip hücre ölümüne yol açarak gösterir. İnvazyon ve bölgesel doku hasarından sorumludur. Konak yanıtını baskılayıcı özelliği de gösterilmiştir. ExoA üretimi olmayan mutant ile vahşi tip P.aeruginosa kökeninin karşılaştırıldığı bir çalışmada toksin üretmeyen kökenin 20 kat daha az virülan olduğu hayvan deneyi ile gösterilmiştir. Çeşitli suşların oluşturduğu ekzotoksin A miktarı çok farklıdır ve suşların optimum üreme koşulları ile en çok toksin oluşturacağı koşullar birbirinden farklıdır. Demir iyonları bakterinin üremesini tetiklerken toksin oluşturmasını ihnibe etmektedir. Gliserol ve glutamat içeren fakat nükleik asit içermeyen besiyerlerinin toksin oluşumu için uygun olduğu, ancak suştan suşa en uygun besiyerinin farklı olabildiği de belirlenmiştir. Ekzotoksin A, mol ağırlığında tek bir polipeptid içeren proteindir. Salgılandığında proenzim halindedir. Proteolitik klevaj veya denatürasyon ve redüksiyon sonucu aktif ADP-ribosil transferaz haline geçer. Bu nedenle ekzoenzim A olarak da adlandırılır [Ceyhan, 2009]. Ekzoenzim S Ekzotoksin A ya benzeyen fakat ondan farklı bir P.aeruginosa toksini de ekzoenzim S dir. Ekzoenzim S nin aktivitesi ekzotoksin A dakinden farklı bir mekanizma ile

65 30 ökaryot hücrede bir veya daha fazla proteini modifiye etmesiyle ortaya çıkar [Ceyhan, 2009]. Sözü edilenler dışında P.aeruginosanın virülansı ile ilgili olabilecek çeşitli faktörler bildirilmiştir. Örneğin daltonluk, enzim aktivitesi olmayan asidik sitotoksik bir proteinin hücre membranlarını etkilediği, sepsis ve akciğer enfeksiyonlarında bu proteinin oluşturduğu mikrovasküler lezyonların önemli olabileceği ileri sürülmüştür. P.aeruginosanın insan trakeası epitel hücrelerinin titrek tüylerine selektif olarak yapışma kabiliyetinin akciğer enfeksiyonlarında rol oynadığı gösterilmiştir. Kapsüllü suşların oluşturduğu glikokaliks olarak da adlandırılan kapsül maddesi özellikle akciğer enfeksiyonlarında fagositozu önleyerek patogeneze katkıda bulunur [Ceyhan, 2009] Epidemiyoloji ve bulaş P.aeruginosa hidrofilik olan lavabolar, sebzeler, nehir suları hatta antiseptik solüsyonlar gibi nemli ortamlardan kolaylıkla ayrıştırılabilir. P.aeruginosanın çiğ sebzeleri kolonize etmeye olan yatkınlığı, immün sistemi baskılanmış (özellikle nötropenik) hastalar için risk oluşturabilir. Ancak bu çevresel kaynaklardan hiçbiri, çoğu kişi için büyük bir risk oluşturmaz ve besinler aracılığıyla tüketimleri, antibiyotik tedavisi sonucu normal bakteriyel flora değişmedikçe gastrointestinal bir kolonizasyona yol açmaz [Murray, 2009]. Pseudomonas türleri, özellikle de insan patojeni olan P.aeruginosa, nadiren sağlıklı kişileri kolonize eder. Sağlıklı kişilerin boğaz, sağlam deri ve dışkıları yoğun olarak normal flora ile kolonize olup, bu kolonizayon Pseudomonas türlerini içermez. Gerçekte P.aeruginosa (özellikle de mukoid varyantı) sağlıklı kişilerin boğaz kültürlerinden izole edildiğinde bunun nedeni mutlaka araştırılmalıdır. Sağlıklı kişilerin ve farelerin gastrointestinal yolları P.aeruginosaya karşı kolonizasyon direnci gösteren diğer türde bakterilerle yoğun olarak kolonizedir [Murray, 2009].

66 31 Sık antibiyotik tedavisi gören kişiler (örneğin nötropenik kanser hastaları) P.aeruginosa ile gastrointestinal kolonizasyon açısından risk altındadır ve P.aeruginosa septisemi riski bu kaynaktan köken almaktadır. Bu şekilde gelişen otoenfeksiyon, sepsis gelişmeden önce nötropenik konağın dışkı örneğinden izole edilen suşun, sepsise yol açan suşla aynı olduğunun gösterilmesiyle kanıtlanmıştır. P.aeruginosa sık yüzen çocukların dış kulak yolları veya mekanik ventilasyon altındaki hastaların endotrakeal tüpleri gibi nemli olan vücut bölgelerinden izole edilebilir. Nedeni henüz tam açıklanamamakla birlikte P.aeruginosa, yoğun bakım ünitelerindeki hastaların üst solunum yollarını da kolonize edebilir. Mekanik ventilasyon altındaki erişkinler veya nötropenik hastalar, özellikle geniş spektrumlu antibiyotik tedavisi sırasında veya sonrasında p.aeruginosaya bağlı ventilatör-kaynaklı veya diğer pnömoniler açısından büyük risk altındadır. En yüksek risk altındaki hastalar, kanser nedeniyle kemoterapi alan veya kemik iliği transplantasyonu nedeniyle kemik ablasyonu yapılan erişkinler olup, aynı koşullardaki çocuklar P.aeruginosa bakteriyemisi açısından daha düşük risk altındadır. P.aeruginosa kistik fibrozis hastalarının solunum yollarında en sık saptanan patojendir ancak ne şekilde kazanıldığı tam olarak açıklanamamıştır [Murray, 2009]. Çıragil ve ark., yaptıkları çalışmada 60 kistik fibrozisli ve 59 alt solunum yolu enfeksiyonu olan hastalardan toplam 119 P.aeruginosa izole ettiklerini bildirmiştir [Çıragil ve ark., 2002]. Çoban ve ark., yaptıkları araştırmada, kistik fibrosizli hastalardan 60 adet P.aeruginosa izole ettiklerini bildirmişlerdir [Çoban ve ark., 2009] Hoffman ve ark., yaptıkları araştırmada Kistik Fibrozisli 58 hastadan 166 P.aeruginosa izole ettiklerini bildirmiştir [Hoffman ve ark., 2009].

67 Pseudomonasların neden olduğu enfeksiyonlar Endokardit P.aeruginosa intravenöz ilaç kullananların doğal kalp kapaklarında ve protez kapaklarında, infektif endokardite neden olur [Ustaçelebi, 1999]. Solunum Sistemi Enfeksiyonları P. aeruginosa ile alt solunum yolu enfeksiyonları daha çok, konağın lokal solunum ve sistenik savunmasında defekt olduğunda görülür. Kronik akciğer Pseudomonas enfeksiyonları anormal solunum yolları sekresyonunun olduğu genetik bir hastalık olan kistik fibrozisli hastalarda er ya da geç görülür [Ustaçelebi, 1999]. Hastaların çoğu balgam çıkarır ve bu balgam alt solunum yolları kolonizasyonunu yansıtır. Hastalığı hafif seyredenlerde, küçük çocuklarda ve bebeklerde mikrobiyolojik tanı için boğaz sürüntüsü kullanılır. Hastaların başlangıçta P.aeruginosa ile kolonizasyonunun mekanisması tam olarak anlaşılamamış olmakla birlikte, kolonizasyon mümkün olduğunca erken dönemde tedavi edilerek, geç dönemde eradikasyonun güç olduğu kronik mukoid P.aeruginosa, enfeksiyona gidiş önlemeye çalışılmalıdır. Kronik olarak P.aeruginosa ile enfekte hastalarda, antibiyotik tedavisi hastaların klinik durumu ve balgam kültüründe üreyen mikroorganizma göz önünde bulundurularak düzenlenir [Akalın, 2007]. Tanıda balgam da kullanılabilir ancak, kistik fibrozisli hastaların balgamında pseudomonasların görülmesi her zaman enfeksiyonu işaret etmez. Kolonizasyon devamlı buhar ve geniş spektrumlu antibiyotik kullanımıyla ilgilidir. Kistik fibrozisli hastaların balgamı daima mukoid p.aeruginosayı barındırır. Sepitisemi oranı düşüktür. Akciğer enfeksiyonu kroniktir. Bronşit, bronşiyolit ve bronşektazi görülebilir. Lokal nekrotizan pnömoni oluşabilir [Öneş, 1989].

68 33 Bakteriyemi P.aeruginosa bakteriyemileri oldukça ağır ve özellikle bağışıklığı kırılmış hastalarda mortalitesi yüksek enfeksiyonlardır. P.aeruginosa enfeksiyonunun tedavisi sırasında direnç gelişmesi yatış süresi ve mortalite oranını artırmaktadır. Pseudomonas aeruginosa bakteriyemisinde, yakın zamanda anti-psödomonal bir antibiyotiğe maruz kalanlarda, kalmayanlara göre bu antibiyotie diernçli bir izolat ile karşılaşma riski yüksek bulunmuştur [Akalın, 2007]. Merkezi Sinir Sistemi Enfeksiyonları P.aeruginosa menenjit ve beyin abselerine yol açabilir. P.aeruginosa, kanserlilerde listeria monocytogenesten sonra ikinci sırada menenjit etkeni ve e.coliden sonra ikinci sıklıkta beyin absesi etkeni olarak bulunmuştur [Ustaçelebi, 1999]. Kulak Enfeksiyonları P.aeruginosa, çok nadir olarak sağlıklı görünen bireyin kulağında bulunabilir. Fakat zedelenme, inflamasyon veya basit olarak nemlilik yaratan durumlarda dış kulak yoluna yerleşir. Dış kulak yolu enfeksiyonlarında etkin bir bakteridir. Sıklıkla yüzücülerde görülür. Yaşamın ilk altı hastasındaki orta kulak enfeksiyonuna, sıklıkla aralarında Pseudomonasların da bulunduğu Gr (-) bakteriler neden olur [Ustaçelebi, 1999]. Göz Enfeksiyonları P.aeruginosa, bakteriyel kornea ülseri, keratit ve enfofalmite sık neden olan etkenlerdir [Ustaçelebi, 1999].

69 34 Kemik ve Eklem Enfeksiyonları Enfeksiyon doğrudan kemik ve eklemlerde başlar ya da kan yoluyla yayılım olur. Kan kaynaklı enfeksiyonlar ilaç bağımlılarında sıktır. Üriner ve pelvik enfeksiyonlarla ilişkilidir. Bunun dışında delici travma, cerrahi uygulamalar ve yumuşak doku enfeksiyonları sonucunda da, sıklıkla P.aeruginosa kemik ve eklem enfeksiyonları gelişir [Ustaçelebi, 1999]. Üriner Enfeksiyonlar Genellikle hastanede kazanılır. Üriner kateterizasyon, instrumentasyon, cerrahi ve böbrek transplantasyonu ile ilişkilidir. Hastanede kazanılmış üriner yol enfeksiyonlarının % 11,7 inde etken p.aeruginosadır. E.coli ve Enterokoklardan sonra üçüncü sıradadır [Ustaçelebi, 1999]. Gastrointestinal Enfeksiyonlar P.aeruginosa gastrointestinal yolun herhangi bir yerinde enfeksiyon yapabilir. Pseudomonas çocuklarda orta şiddette diyare yapabilir. Bebeklerde daha ağır tablolara, öldürücü nekrozlu endokardite neden olabilir [Ustaçelebi, 1999]. Deri ve Yumuşak Doku Enfeksiyonları Pseudomonas bakteriyemisi sırasında tipik olarak ektima gangrenosum denilen deri lezyonları gelişebilir. Ayrıca, bakteriyemi sırasında deri altı nodülleri, derin abseler, sellülit, veziküler veya püstüler lezyonlar, büller görülebilir. Pseudomonaslara bağlı deri enfeksiyonları lokal veya yaygın olabilir. Yatkınlık yaratan durumlar, yanık, travma, dekubit ülserleri ve dermatitlerdir. Perineal bölge, yüzücü kulakları ve jakuzi kullananların derileri gibi nemli bölgelerde de Pseudomonas enfeksiyonlarına yatkınlık oluşabilir. Pseudomonas için tanı koydurucu mavi-yeşil püy ve ekşi meyve kokusu gelişebilir [Ustaçelebi, 1999].

70 35 Toplum Kökenli Pnömoni P.aeruginosa nadir olarak toplum kökenli pnömoni etkenidir. Bu olguların çoğunda malignite, kistik fibroz, aplastik anemi, kronik obstruktif akciğer hastaları ve bronşektazi gibi altta yatan bir hastalık mevcuttur. Yoğun bakım ihtiyacı gösteren olgulardaki insidansı daha yüksektir. Yapılan çalışmalarda yoğun bakım ihtiyacı gösteren toplum kökenli pnömoni olgularında etkenler içerisinde ilk 3 sıra içinde yer aldığı gösterilmiştir. Bu bakteri önceden sağlıklı kişilerde ise oldukça nadir olarak pnömoniye neden olabilir. Hızla ilerleyen toplum kökenli pnömoni olgularında da p.aeruginosa mutlaka olası etkenler içerisinde düşünülmelidir. Yapısal akciğer hastalığı olan bir hastada alt solunum yolu örneğinde P.aeruginosa üremesinin kolonizasyon-enfeksiyon ayrımının yapılması kolay olmayabilir [Akalın, 2007]. Yanık Yarası Enfeksiyonları Yanık yaralarından en sık izole edilen mikroorganizmalar P.aeruginosa, S.aureus, S.pyogenes ve diğer enterik Gram (-) basillerdir. Küçük yaralarda S.aureus gibi Gram (+) bakteriler sık enfeksiyon etkeni olmasına karşın, daha geniş yaralarda S.aureus ve P.aeruginosanın her ikisi de etken olarak karşımıza çıkmaktadır. Yanık yarasından alınan yüzeyel kültürler etken mikroorganizmayı tanımlamada yardımcı olsa da kolonizasyon ya da invaziv yanık yarası enfeksiyonunun ayrımında çok yardımcı olmamaktadır. Kantitatif yüzey kültürleri de bu ayrımı yapamaz. Her ne kadar kantitatif incelemede düşük sayı yanık yarası enfeksiyonu olmadığının bir göstergesi ise de mikroorganizma/gram doku veya daha fazla bakteri yoğunluğunun invaziv yanık yarası enfeksiyonu doğru tanıma oranı %50 den azdır. Bu nedenle invaziv yanık yarası enfeksiyonunun tanısı esas olarak histopatolojik inceleme ile konur [Akalın, 2007].

71 Pseudomonaslarda biyofilm yapısı Pseudomonasların biyofilm oluşturması ve hayat siklusu aşağıdaki gibi özetlenebilir: 1) Yapışma ve Kolonizasyonu Bakteri, yapışacağı yüzeye yaklaşır ve geçici olarak bağlantı kurar, kendi için uygun yeri bulduğunda yüzeyle olan bağlantısını kuvvetlendirmeye başlar. Yapışan bakteriyi diğer pseudomonaslar izler ve yapışma yüzeyinde tek tabakalı bir yapı oluşturur. Bu aşamada rol alan organeller flagella ve tip 4 piluslardır. Bu pilus adezinleri mannoz spesifik, nonspeksifik ve abiyotik yüzeylere bağlanabilme özelliğindendir. Flagellalar ilk yapışmada, pililer ise mikrokoloni oluşumunda rol oynar. Bunlardan herhangi birinin eksikliğinde yapışma engellenmektedir. Bunlara ek olarak, hücre yüzeyinde bulunan lipopolisakarit yapısında olan değişiklikler de yapışmayı etkilemektedir. Bu yapışma olayı EPS yapımı için algt genlerini uyarır ve EPS sentezi başlar. AlgT de meydana gelen artış flagella sentezini sağlayan genleri baskılar ve Tip 4 piluslar ile bakteri kayma hareketi yaparak mikrokolonileri oluşturur. Bu işlerin yapılmasını koordine eden gen ise, karbon metabolizamasını düzenleyen CDC genidir. Bu gende olan değişiklikler, planktonik organizmaların biyofilm oluşturma özelliğini engeller [Ünal, 2005]. 2) Farklılaşmış biyofilm içinde bakterilerin olgunlaşması Pseudomonaslarda ekzopolisakkarit aljinattan oluşmaktadır. Aljinat ise üronik asit ve glukronatın birleşimidir. Aljinatın sentezlenmesine alg T geni aracılık eder. Biyofilm gelişmesi için hassas sinyal moleküllerinin sentezine gereksinim vardır. Bu moleküller asil-hsls dir. Bu enzimin salınımını Ias I geni kodlar. Bu gende meydana gelen mutasyonlar yüzeye yapışma üzerinde etkili olmayıp pseudomonasın oluşturduğu biyofilm yapısını etkiler. Mutantların meydana getirdiği biyofilm içinde çok sayıda bakteri vardır. Sinyalizasyon sistemi ile biyofilmi oluşturan bakterilerin sayısı sınırlanmaktadır [Ünal, 2005].

72 37 3) Biyofilmden planktonik hücre ayrılması ve yayılması Yapışkan biyofilm toplulukları içindeki bakteriler akım sırasında kopar ve yeni yüzeylere yapışır. Bakterinin bu son haline plankton adı verilmektedir. Yapışkan bakteri hücreleri antijenik karakterdedir ve antikor üretimini artırır. Meydana gelen antikorlar, biyofilmli bakteriyi öldüremediği gibi, çevre dokularda da immün kompleks hasara neden olmaktadır. Bireyleri humoral ve hücresel immün yanıtı nadiren biyofilm enfeksiyonlarını yok etmede başarılıdır. Planktonik bakteriler, antikor, fagositoz ve antibiyotiklerle temizlenirken, biyofilmde bulunan hücreler bu etkenlere dirençlidir. Bu nedenle fagositoz olayı gerçekleşmezken, fagositik hücrelerin enzimlerini salgılamaları nedeniyle, biyofilm çevresindeki dokular oluşan immün kompleksten zarar görür. Bu sırada biyofilmden ayrılan bakteriler serbest kalır ve dokularda akut enfeksiyonlara neden olur [Ünal, 2005] Klebsiella Cinsi Sistematik Klebsiella cinsi üyeleri, Enterobacteriales takımı içinde Enterobacteriaceae familyasına aittir. Cins içinde 7 tür bulunur. K.pneumoniae, K.granulomatis, K. pneumoniae subsp. ozaena, K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis, K.oxytoca, K.variicola, K.singaporensis Genel özellikler Klebsiella cinsi adını, 19. Yüzyıl sonlarında yaşamış Alman mikrobiyolog Edwin Klebs ten almıştır. Klebsiella cinsi üyeleri, hareketsiz, sporsuz, genellikle kapsüllü, Gram negatif, ikişer ikişer bazen kısa zincir oluşturan 0,7 1,5 x 2,0 5,0 µm boyutlarında, aerob ve fakültatif anaerob çomakçıklardır. Gram boyamada geniş görüntü oluşturur. Bu özelliği ve katı besiyerindeki büyük mukoid koloniler yapması

73 38 polisakkarid kapsülüne bağlıdır. 37 O C de ve ph 7 de iyi ürerler [Anğ-Küçüker, 2006] Görünüm ve boyanma özellikleri Klebsiella pneumoniae kısa, uçları yuvarlak, 1-2 µm boy ve 0,5-0,8 µm eninde, hareketsiz, sporsuz bir bakteridir. Genellikle uç uca ikişer ikişer kısa zincirler şeklinde ve tek tek bulunurlar. Çevrelerinde polisakkarit yapıda geniş bir kapsül bulunur. Bazen çok küçük koklara benzer şekilleri yanında özellikle eski uzun flaman ve çok yönlü şekilleri gösteren kökenleri vardır. Gram negatif olup, bakteriyolojik boyalarla iyi boyanır. Kapsül, organizmadan yeni ayrılan ve hastalık materyali içindeki klebsiellalarda açık seçik ve geniş olarak görülür. Kanlı, serumlu besiyerlerinde kapsüllerini saklı tutar. En iyi glikozlu besiyerinde kapsüllenir. Pasajlarla ve özellikle safranlı besiyerlerinde kapsülsüzleşir. Deney hayvanlarında yeniden kapsül oluşturur. MacConkey Agar da koloniler tipik olarak büyük, mukoid ve kırmızıdır. Agar çevresinde difüze olan kırmızı pigment laktoz fermentasyonunu ve asit üretimini gösterir. Klebsiella bakterileri ısıya dayanıksız olup nemli ortamda 55 O C de 30 dakikada ölür, oda sıcaklığında tutulan kültürler haftalarca, + 4 O C de aylarca canlı kalır. Kuruluğa oldukça dirençlidir. Özellikle organik maddelerde kurutulursa aylarca canlı kalabilir. Üremek için kan, serum, asit sıvısı, glikoz gibi özel maddelere gereksinim duymaz [Anğ-Küçüker, 2006] Doğal ortamlar Bu cins bakteriler, insan ve hayvanların bağırsak ve üst solunum yolları ile toprak ve sularda bulunur. K.pneunmoniae bakterileri normal insanların % 5 inin bağırsak ve üst solunum florasında bulunur [Anğ-Küçüker, 2006] Biyokimyasal özellikler Klebsiella, tüm bağırsak bakterileri gibi genel kullanım besiyerlerinde ürer. Optimal 37 O C de ve ph 7 de iyi ürer. Sıvı besiyerinde heterojen bir bulanıklık ve dipte

74 39 mukoz bir çöküntü yaparak ürer. Üredikleri ortamda bol miktarda kapsül maddesi salar. Katı besiyerindeki kolonileri tipik mukoid nitelikte büyük, sarımtırak gri renkte ve akıcı kolonilerdir. Uygunsuz koşullarda R ve S kolonilerine dönüşebilir. Yatık jelözdeki birikme sıvısı gri-beyaz mukoid bir kitle şeklindedir. Sıvı besiyerinde birkaç günlük kültürlerde bir kıvamlaşma oluşarak besiyeri eritilmiş jelatin kıvamında bir görünüm alır. Klebsiella cinsi üyeleri, birçok şekeri fermente etmekle beraber bu konuda kökenler arasında farklılık gözlenir. K.pneuminiae kökenlerinin çoğu hemen bütün şekerleri asit ve gaz oluşturarak parçalar. Özellikle nişastayı en geç 4 gün içinde parçalayarak gaz yapması, bu türü diğer bağırsak bakterilerinden ayırt etmek için kullanılır. Jelatini hidrolize etmez. Başta glikoz olmak üzere mannitol, salisin, adonitol, inositol ve sorbitol den ve çoğu kez laktoz ve sükrozdan gaz oluşturur. H 2 S oluşturmaz. Potasyum siyanürlü besiyerinde ürer. Ancak solunum sisteminden izole edilen bazı kökenler değişik biyokimyasal reaksiyonlar verebilir. Benzer morfolojide ancak daha çok su ve toprak ortamlarından izole edilen kökenler 10 O C de ürer ve 44,4 O C de laktozdan gaz oluşturabilir [Anğ-Küçüker, 2006] Virülans faktörler Kapsül Klebsiella cinsi bakterilerde polisakkarit yapısındaki kapsül önemli bir virülans faktördür. Günümüze kadar 82 değişik kapsül antijeni bildirilmiş, ancak belirli bölgelerdeki enfeksiyon ile bazı kapsül tipleri arasında ilişki olabileceği gösterilmiştir [Anğ-Küçüker, 2006]. Klebsiellalarda polisakkarit kapsül yapısında O ve K antijenleri bulunmakta olup bu bakterilerin serolojik tiplendirilmesi bu antijenlere göre yapılmıştır. Çeşitli araştırmacıların çalışmaları ile desteklenmiş olan bu serolojik tiplendirmede kolaylık sağlamak ve var oldukları durumda O antijenlerinin tepkimelerini engellemeleri yüzünden bugün K antijenine bağlı tiplendirme uygulanmaktadır [Bilgehan, 2002]. Bu antijen tiplerinden bazıları Pnömokok ve Haemophilus influenza kapsülleri ile çapraz reaksiyon vermektedir

75 40 [Ustaçelebi, 1999]. Bu antijenlere karşı elde edilmiş antiserumlarla lam ve tüp aglütinasyon, kültür süzüntüsü ile presipitasyon ve Neufeld in Kapsül Şişme reaksiyonları ile Klebsiellalar tiplendirilebilir [Bilgehan, 2002]. Klebsiellaların K antijenleri, O antiserumlarıyla aglütinasyonu önler. Klebsiellalarda 12 farklı O antijen yapı vardır. Ancak O tipleri serotiplendirmede kullanılmaz. Klebsiellanın geniş polisakkarit kapsülü, bakteri hücresini fagositozdan koruyan önemli bir virülans faktördür. Ayrıca, enfekte bölgeye lökosit göçünü de geciktirir [Ustaçelebi, 1999]. Siderofor Klebsiella türlerinin patojenitelerinde etkili olabilen diğer önemli özellik ise siderofor üretimidir. Kısıtlı demir içeriği ile üriner sistem, bakteriyel patojenlerin ancak demir bağlayan bileşikleri olarak bilinen siderofor üreterek yaşamını sürdürebildiği bir bölgedir [Anğ-Küçüker, 2006]. Sideroforlar, demir bağlama yeteneği olan düşük molekül ağırlıklı bileşiklerdir. Bağırsak bakterilerinde enterobaktin (fenolat) ve aerobaktin (hidroksamat) olmak üzerer iki tip siderofor tanımlanmıştır. Klebsiella türlerinin her iki tip sideroforu da sentezledikleri gösterilmiştir. Serum Direnci Klebsiella türlerinin diğer virulans özellikleri yanında serumun bakterisidal etkisine direnç göstermeleri de enfeksiyon gelişiminde önemlidir. Bu direnç mekanizmasında hangi faktörlerin rol oynadığı tam olarak bilinmemektedir [Kaleli, 2006]. Ayrıca adezyon yeteneği de virülansla ilgilidir. Fimbriaların yapışmasından sorumlu en önemli yüzey adezinleri ya da ligandlarıdır. Fimbrialar genellikle Gram (-) bakterilerde bulunur fakat bazı Gram (+) bakterilerde de bulunabilir. Çevre şartları

76 41 fimbria oluşumunu etkiler. Oksijen, sıcaklık, ph ve bakterinin içinde bulunduğu ortam bunların arasındadır [Akman 2008] Klinik önemi Sağlıklı bireylerin solunum yolunda ve dışkıda % 5 10 oranında K.pneumoniae bulunmaktadır. Nadir olarak normak kişilerin orofarinkslerinde bulunur (taşıyıcı oranı %1-6). Doğada da çok yaygın olarak bulunmaktadır. K. Pneumoniae tipik lober pnömoni oluşturur. Hem hastane ortamından hem de toplumdan kazanılan bir hastalık olmasına karşın fırsatçı bir enfeksiyon etkeni olarak değerlendirilebilir. Çünkü K.pneumoniae solunum yolları savunma sistemi bozuk olan alkolizm, diabetes mellitus, kronik tıkayıcı akciğer hastalığı gibi ağır bir problemi olan kişilerde görülür. Sinsi başlar. Bazı olgularda bronkopnömoni ve bronşit şeklinde gelişir. Tipik olarak ağır ve akciğerlerde destrüktif değişikliklerle seyreder. Nekrotik inflamasyon ve hemorajiler oluşturur. Balgam kalın, mukoid ve kiremit kırmızısı renkte veya ince ve jel gibi olabilir. Abse oluşumu, ampiyem, pleure sıvısı oluşma ihtimali yüksektir. Bu hastalarda ölüm oranı da yüksektir [Ustaçelebi, 1999]. K. pneumoniae pnömoniden başka üriner yol enfeksiyonlarına, yara enfeksiyonlarına ve bakteriyemiye yol açar. Pnömoni yapan K tipleri üriner yol enfeksiyonlarından da izole edilmektedir. Yenidoğan ünitelerinde plazmid ile yönetilen çoklu dirençli klebsiellalara bağlı hastane enfeksiyonları görülür. Enfeksiyonlar pnömoni, üriner yol enfeksiyonları ve bakteriyemiler şeklindedir [Ustaçelebi, 1999]. klebsiellalar hastane enfeksiyonlarının %8 inden sorumlu tutulmaktadır. Bu enfeksyonlar içinde en sık rastlanan odak üriner yol, alt solunum yolları, safra kesesi, cerrahi kesi yeri ve diğer bölgelerdir.

77 42 Yapılan bir araştırmada hastanede yatan kişilerdeki üriner enfeksiyonların % 9 undan ve bütün primer bakteriyemilerin %14 ünden Klebsiellalar izole edilmiştir [Ustaçelebi, 1999]. Klebsiellaların diğer tipleri daha az oranda hastane enfeksiyonu etkenidir. K. ozaenae bir çeşit kronik atrofik rinit olan ve ozaena denen duruma yol açar ve nazal mukozal membranların pürülan enfeksiyonu ile ilişkilidir. k. ozaenaenın sebep olduğu korneal abse vakası bildirilmiştir. k.ozaenanın kandan, idrardan ve yumuşak dokulardan izolasyonunun rapor edilmesi, bu organizma tarafından oluşturulan hastalığın dağılımının önceden düşünülenden çok daha yaygın ve yoğun olduğunu gösterir. Dışkıdan izolasyonu çok sıktır, çok nadir olarak pnömonilerle ilşkili bulunmaktadır [Akman, 2008] Klebsiellalarda biyofilm yapısı Klebsiellalarda biyofilm yapısı doku enfeksiyonlarında patojenitede çok önemlidir. Özellikle piyojenik karaciğer abselerinde k.pneumoniaenin biyofilm yapısının etki mekanizması net değildir [Wu, 2010] Vahşi tip K. pneumoniae tarafından oluşturulan biyofilm yapısının Ampicillin ve Ciprofloxacin e duyarlı olarak tespit edilmiştir [Andrel, 2000] Çeşitli bakteri türleri tarafından oluşturulan fibrialar, biyofilm oluşumunu kolaylaştırdığı, çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Fakat Tip 3 Fimbria, biyofilm oluşumu için gerekli değildir [Jahnow ve Clegg, 2003]. Bir çalışmada biyofilm oluşturan Klebsiella pneumoniae nın torbamisin antibiyotiği ile birlikte 1 ma elektrik uygulanmasıyla bakteri düzeyin de 8 log luk bir azalma meydana geldiği bildirilmiştir [Ünal, 2010].

78 Staphylococcus Cinsi Sistamatik Staphylococcus cinsi üyeleri, Bacillales takımı içinde Staphyloccaceae familyasına aittir. Cins içinde 43 tür bulunur. S. arlettae, S. aureus, S. auricularis, S. capitis, S. caprae, S. carnosus, S. chromogenes, S. cohnii, S. condimenti, S. croceolyticus, S. delphini, S. epidermidis, S. equorum, S. faecalis, S. felis, S. fleuretti, S. gallinarum, S. haemolyticus, S. hominis, S. hycius, S. intermedius, S. kloosi, S. lentus, S. lugdunensis, S. lutare, S. lyticans, S. muscae, S. nepalensis, S. pasteuri, S. pettenkoferi, S. pisticifermentans, S. pseudointernedius, S. roseus, S. saccharolyticus, S. saprophyticus, S. schleirei, S. sciuri, S. simia, S. simulans, S. succinus, S. vitulinus, S. warneri, S. xylosus Genel özellikler Staphylococcus cinsi üyeleri, düzensiz, üzüm benzeri kümeler, daha az sıklıkla tek ve çift tetratlar ve 3 4 hücreli kısa zincirler oluşturan, Gram pozitif, 0,5 1,5 µm çapında koklardır. Hareketsiz, sporsuz ve katalaz pozitiftir. Tipik kapsül oluşturmaz veya laboratuvar şartlarında sınırlı kapsül oluşturur. Staphylococcuslar, karbonhidratlardan gaz oluşturmaz. S.saccharolyticus ve başlangıçta anaerobik edilebilen Staphylococcus türlerinin çoğu 24 saat içinde 1 3 mm çapında ve türlere bağlı olmak üzere O C de havada 3 günlük inkübasyon sonrası 3 8 mm çapında koloniler oluşturur. Koloni morfolojisi türlerin tanımlanmasında ek karakteristik olarak kullanılabilir. Diğer taraftan, izole edilen kolonilerde gözlenen türler arası morfolojik farklılıkların gelişmesi için O C de birkaç güne daha gerek vardır. Tipik S.aureus kolonileri 24 saatte pigment ( krem rengi, sarı portakal rengi ), düzgün, bütün, hafif kabarık ve rutin kanlı agarda hemoliz oluşturur. Belirgin kapsül

79 44 oluşturan nadir suşlar, parlak ve ıslak görünüme sahip olabilir. Koloniler 3 günlük inkübasyon sonunda 6 8 mm çapına ulaşır [Murray, 2009]. Tipik Koagülaz Negatif Staphylococcus (KNS) kolonisi, pigmentsiz, düzgün, bütün, parlak, hafif konveks, kabarık ve opaktır. Kuvvetli slime tabakası oluşturan koloniler mukoid koloni morfolojisi gösterir [Murray, 2009] Görünüm ve boyanma özellikleri Teker teker izole edildikleri zaman Staphylococcus hücreleri diğer koklara göre daha çok olmak üzere tam yuvarlağa yakın şekildedir. Ayrıca gerek aynı gerekse çeşitli kültürlerden elde edilen staphylococcuslar, hücre görünümü bakımından ayrım göstermez. Üreme sırasında bölünme sonucu meydana gelen hücreler birbirlerinden ayrılmadıkları ve birden fazla düzlemde bölünme gösterdikleri için üzüm salkımına benzer. Katı besiyerinde daha açık olarak meydana gelen kümeler, lam - lamel arasında ve sulu ortamda incelenirse üç boyutlu, kurutulup boyandıktan sonra incelenirse iki boyutlu üzüm salkımı şeklinde görülür. Staphylococcuslar çeşitli bakteriyolojik boyalarla kolay boyanır ve Gram pozitiftir. Eski kültürlerde bazı koklar çabuk renksizleşir ve Gram negatif gibi görünebilir. [Murray, 2009] Doğal ortamlar Staphylococcuslar doğada yaygın olmakla beraber en çok memelilerin ve kuşların cildinde ve mukoz membranlarında bulunur. Konakta, ağız, meme bezleri ve intestinal, ürogenital ve alt solunum sistemlerinde bulunabilir. Staphylococcuslar, genelde bulundukları yerde konakla simbiyotik bir ilişkiye sahiptir, ancak kutanöz bariyerdeki travma, iğne ve inokülasyon veya medikal aletlerde direk implantasyon yoluyla dokuya girmesi sonucu patojen olabilir. [Çelik, 2005].

80 Biyokimyasal özellikleri Staphylococcusların Micrococcaceae familyasında yer alan diğer cinslerden ayrımını sağlayan özellikler lizostafin ve furazolidin duyarlılığı, anaerob koşullarda glikozdan ve eritromisin varlığında gliserolden asit oluşturabilme, oksidaz negatif ve Bacitracin e dirençli olmasıdır [Ustaçelebi, 1999] Staphylococcuslar başta glikoz olmak üzere birçok karbonhidratı parçalar ve son ürün olarak laktik asit oluşturur fakat gaz oluşturmaz. Ancak şekerlerden mannitol üzerine olan etkiler önem taşımaktadır ve bu karbonhidratı yalnız Koagülaz pozitif Staphylococcuslar (KPS) parçalar. Bu nedenle mannitole etki, bir patojenik deney olarak, Koagülaz Pozitif tek tür olan s.aureusu diğer Staphylococcus türlerinde ayırt etmek için kullanılır. Ayrıca staphylococcuslar %1 Glikoz içerek besiyerinde üretilince belirgin olarak katalaz pozitif, oksidaz negatiftir [Coşkun ve Ulaş, 1999] Virülans faktörleri Staphylococcuslar organizmaya girdikleri yerde lokal olarak üremek ve süpürasyonlara neden olarak enfeksiyon yapabildikleri gibi dokular arasında ve kana yayılarak buralara çeşitli ekstraselüler maddeler oluşturarak da değişik klinik tablolara neden olabilir. Patojenitede etkili olan çeşitli maddeler şunlardır: Enzimler Koagülaz Plazmayı pıhtılaştırma yeteneği, insan ve hayvanlarda S. aureus, hayvanlarda S.intermedius ve S.hyicus gibi akut enfeksiyonlara neden olan Staphylococcusların tanımlanması için yaygın olarak kullanılan bir kriterdir. Patojenitedeki rolü tam olarak bilinmemekle birlikte Staphylococcusların abselerin çevresinde bir fibrin tabakası oluşturarak hastalığı lokalize ettiği ve mikroorganizmanın fagositozdan

81 46 korunmasını sağladığı düşünülmektedir [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Protein bileşiminde ve özel bir antijen yapısındadır [Yıldırım, 2008]. 2 ayrı koagülaz vardır: Bağlı Koagülaz; fibrinojeni doğrudan fibrin haline çevirir. staphylococcusların küme yapmalarını sağlar. Serbest Koagülaz; aynı etkiyi Coagulase Reaction factor aracılığıyla gösterir. Bağlı olanına Clumbing Factor denir. Bakterinin hücre duvarında bulunur. Fibrinojene tutunur, fibrine dönüştürür ve staphylococcusların birbirine tutunmasını sağlar. Serbest olan ise ortama salgılanır ve trombin ile birleşerek Stafilotrobin i oluşturur. Fibrinojenin fibrine dönüşmesini sağlar [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Isıya Dirençli Nükleaz ( Termonükleaz) Endo- ve Eksonükleolitik özelliklte ve DNA veya RNA yı parçalayabilen ısıya dirençli Staphylococcal Nükleaz ( Termonükleaz TNaz ) S. aureus, S. schkeiferi, S.intermedius ve s. hyicusun birçok suşu tarafından üretilir. Bazı S. epidermidis, S. simulans ve S. carnosus suşları da zayıf TNaz aktivitesi gösterebilir. Katalaz Tüm Staphylococcuslar tarafındn salgılanan bu enzim, hidrojen peroksidi su ve oksijene katalize ederek hidrojen peroksidin mikroorganizmaya toksik etkisini önler [Coşkun ve Ulaş, 1999].

82 47 Hyaluronidaz Patojen Staphylococcuslarda bulunan bir enzimatik aktivitedir [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Staphylococcus suşlarının % 90 ı tarafından sentezlenir. Bağ dokusunun yapısında bulunan hyaluronik asidin depolimerizasyonunu ve bu sayede Staphylococcus hücrelerinin doku içerisinde yayılmasını sağlar. Antijen özelliği olan bir maddedir [Coşkun ve Ulaş, 1999] Stafilokinaz Streptococcuslarda olduğu gibi Staphylococcuslarda da fibrinolitik bir etki vardır. Burada bakteriler tarafında salınan kinazlar, plazmada bulunan plazminojen veya profibrinolizin isimli maddeyi aktive ederek plazmin ( fibrinolizin ) oluşturur. Fibrinolitik etki bu madde aracılığıyla oluşur [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Slime Bazı Koagülaz Negatif Staphylococcus suşları tarafından salgılanır. Bu suşlar kateter ve sentetik yapılara kolayca yapışır. Bunlara prostetik kapaklar örnektir. Slime salgılayan staphylococcuslar, vücut dışında bulunan staphylococcuslardan daha patojendir. Slime, hücresel immün cevabı, kemotaksiyi ve polimorf çekirdekli lökositlerin fagositozunu önler [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Patojen staphylococcusların bir kısmı enterotoksin oluştururken bir kısmı ekstrasellüler toksin oluşturarak septisemi, abse gibi patolojilere sebep olur [Coşkun ve Ulaş, 1999] Çeşitli klinik örneklerden izole ettikleri Koagülaz Negatif staphylococcuslarda Slime varlığını incelemişler ve %84 oranında Slime üretimi saptamışlardır [Yıldırım ve ark, 2008].

83 48 Hastane enfeksiyonu etkeni olarak izole ettikleri 50 adet Koagülaz Negatif staphylococcusta Slime oluşumunu incelemişler ve bu izolatların 27 sinde Slime varlığını tespit etmişlerdir [Çelik ve ark, 2005]. Farklı klinik örneklerden izole ettikleri 126 Staphylococcus epidermidis türünde Slime varlığını araştırmış ve %83 oranında Slime pozitiflik saptamışlardır [Nayak ve ark, 2000]. Çeşitli klinik örneklerden toplam 51 Koagülaz negatif Staphylococcus izole etmiş ve bu izolatların 15 tanesinde Slime pozitifliği tespit ettiklerini bildirmişlerdi [Ay ve ark, 2002]. Psoriazis tanısı alan 47, sağlıklı 31 bireyden aldıkları burun sürüntüsü örneklerinin tümünden Staphylococcus izole etmişler ve bu izolatların 17 tanesinde Slime pozitiflik saptadıklarını bildirmişlerdir [Başak ve ark, 2001]. Toksinler ( Hemolizinler) Bilinen 8 çeşit toksini vardır. Hemolizin de denen toksinler Alfa, Beta, Delta, Gama toksinler ve lökosidindir. Bunlar sitolitik etki yapar. Abse oluşumundan sorumlu en önemli toksin alfa ve beta toksindir [Müştak ve Esendal, 2008]. Alfa Toksin (Alfa Hemolizin) S. aureus suşlarının çoğu bu toksini üretir [Müştak ve Esendal, 2008]. Protein yapıdadır. Hücre membranının bütünlüğünü bozarak sitolitik etki oluşturur. Özellikle tavşan eritrositlerinde görülen bu etki, lökosit trombosit, fibroblast, hepatosit be bazı kanser hücreleri için bile söz konusudur. [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Dermonekrotik ve nörotoksik tkileri bulunmaktadır. Alfa toksinin belirleyici özelliği, eritrositleri lize etme yeteneğidir. Özellikle tavşan eritrositleri alfa toksin ile hemolize, diğer memeli eritrositlerinden yüz kat, insan eritrositlerinden bin kat daha duyarlı hücrelerdir [Müştak ve Esendal, 2008].

84 49 Beta Toksin (Sfingomyelinaz C, Beta Hemolizin) Staphylococcus aureusun Beta-hemolizini 1935 yılında bulunmuş olup toksinin hemolitik aktivitesinin 37 O C de muamele ve 10 O C de inkübasyondan sonra daha çok arttığı anlaşılmış ve buna bağlı olarak toksin sıcak-soğuk Hemolizin olarak adlandırılmıştır te beta-hemolizinin fosfolipaz C aktivitesine sahip olduğu bulunmuştur. Eritrositlerin toksin duyarlılığındaki farkların eritrositlerdeki sifingomyelin içeriği ile ilişkili olduğu düşünülmektedir [Müştak ve Esendal, 2008]. Katalaz enzimi ile birlikte hücre membran fosfolipidlerini parçalayarak eritrosit, lökosit gibi hücrelerde lizise neden olur. Karakteristik Staphylococcus absesinden alfa toksinle beraber sorumlu olduğu düşünülmektedir [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Delta Toksin (Delta Lizin, Delta - Toksin) Çeşitli memeli hücrelerinde membran hasarına yol açan delta-toksin, 26 aminoasitten oluşmuştur. Delta hemolizinin % 97 si S.aureus suşları tarafından üretilmektedir. Toksinin yüksek oranda sitolitik etkisi olmasına karşın, hastalıkların etiyolojisindeki önemi hala tam olarak bilinmemektedir. Toksinin yüksek konsantrasyonlarıyla yapılan deneysel çalışmalarda, toksinin dermonekrotik ve letal aktivitesinin varlığı da ortaya konmuştur [Müştak ve Esendal, 2008]. Gama toksin ve Panton Valentin Lökosidin (PV lökosidin) Gama hemolizin neredeyse S. aureusun bütün suşları tarafından üretilebilmektedir ancak PV lökosidin, suşların yalnızca % 2-3 ü tarafından üretilebilir. Her iki toksin de iki komponentten oluşmuştur. Bu komponentler S ve F komponentleri olarak bilinir ve birbirleriyle ilişkisi olmayan salgısal protein olarak üretilir. Üç farklı S komponenti ve iki farklı F komponenti aralarında birleşerek altı farklı gama hemolizin PV lökosidin toksinlerini oluşturur. Bütün olası altı kompozisyon lökositleri lize etme yeteneğine sahiptir [Müştak ve Esendal, 2008]. İnsan, tavşan,

85 50 koyun eritrositlerinin yanında insan lenfoblastlarını da lizise uğratır. [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Bu iki komponentli toksinlerin yangısal olaylardaki rolleri de incelenmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda S alt ünitesinin F alt ünitesine göre immün yanıtın şekillenmesinde önemli olduğu anlaşılmıştır [Müştak ve Esendal, 2008]. Lökosidin Kültür süzüntülerinden elde edilen bir madde olup çeşitli hayvan türlerine ait lökositler üzerine letal etki yapar. Özel antijen yapısındadır. Patojenitedeki rolü kesinlikle bilinmemektedir. Lökosidin üreten Staphylococcuslar diğer Staphylococcusların aksine lökositler tarafından fagosite edilseler bile hücre içinde üremeye devam ederler [Yıldırım, 2008]. Toksik Şok Sendromu Toksini Pirojenik Toksin-C ya da Enterotoksin-F olarak da adlandırılmıştır. Esas olarak S.aurusun toksinidir. Alerjik etkisi vardır ve bu etkisi ile vücutta ateş meydana getirir. Ateş ve alerjik etkilerini genel olarak İnterlökin 1 seviyesini artırarak göstermektedir. Bunun için bu toksine süper antijen denmektedir [Coşkun ve Ulaş, 1999]. Eksotoksinler Sıvı besiyerinde üretilmiş staphylococcusların kültür süzüntülerinde eksotoksin niteliğinde maddelerin bulunduğu anlaşılmıştır. Patojen staphylococcuslar tarafından meydana getirilen bu eksotoksinler, hayvanlar için öldürücü ve deride nekroz meydana getiren, yapısında çeşitli hemolizinler bulunan termolabil bir karışımdır. İntradermal olarak enjekte edildiğinde 0,001 0,005 ml. miktarda bile nekrotik ve damara verildiğinde ise letal etkilidir. Toksinin toksik etkisi, doku kültürlerinde de

86 51 saptanmış, ayrıca trombositlere olan etkisiyle kanın pıhtılaşmasına engel olmadığı halde pıhtının büzüşmesini engellediği ortaya konmuştur. PTSAg Ekzotoksin Ailesi PTSAg ler, S. aureus ve Streptococcus pyogenes tarafından salgılanan ekzotoksin grubudur. PTSAg ailesi birçok stafilokokkal enterotoksini (SEA, SEB, SEC, SED, SEE ve SEH) ve birçok streptokokkal pyojenik ekzotoksini içermektedir. Bu ekzotoksinlerin her biri en az üç biyolojik özellik göstermektedir: pirojenite, süperantijenite ve endoktoksin letalitesinin kuvvetlendirilmesi [Müştak ve Esendal, 2008]. Stafilokokkal Enterotoksinler Stafilokokkal enterotoksin (SE) ler 5 temel serolojik tipten oluşan (SEA, SEB, SEC, SED, SEE), ısıya dayanıklı enterotoksinlerin oluşturduğu bir gruptur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda Stafilokokkal enterotoksinlerin yeni tiplerinin de var olduğu ( SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN ve SEO) bildirilmiştir. SE ler higroskobik özellik göstererek su ve tuzlu solüsyonlarda çözünebilme özelliğine sahiptir. Enterotoksinler ph < 2 de pepsin hariç insan intestinal sisteminin proteolitik enzimlerine dirençlidir. Ancak bazı bakteriler (laktik asit bakterileri) tarafından üretilen proteazlar SE leri parçalayabilir. SE ler kuvvetli gastrointestinal toksin olmalarının yanında kuvvetli süperantijenik özellikleri ile de non-spesifik olarak T-hücre roliferasyonunu stimüle eder. KPS kökenleri tarafından üretilen, suda eriyebilen, termostabil ve özel antijen yapısında bir maddedir. Özellikle yüksek CO 2 li koşullarda karbonhidratlı ve proteinli besin maddeleri içeren ortamlarda üreyen Stafilokoklar tarafından meydana getirilir ve bu besinlerin yenmesiyle gastrointestinal bulgularla seyreden zehirlenme tablosu ortaya çıkarır [Yıldırım, 2008]. 100 O C de 30 dakika yaşayabilir. Soyutlanan

87 52 patojen Staphylococcus ların % 50 sinin bu toksini üretebildiği görülmüştür [ Coşkun ve Ulaş, 1999]. Stafilokokkal Enterotoksin A (SEA): SEA; Stafilokokkal gıda zehirlenmelerine sebep olan en önemli toksindir. Stafilokokkal Enterotoksin B (SEB): S. aureus un gıda zehirlenmelerinden sorumlu olan klinik izolatlarında entb geni kromozomal yapıdayken, diğer bakteri suşlarında genin 750 kb lık bir plazmid tarafından taşınmaktadır. Staphylococcal Enterotoksin C (SEC): Antijenik olarak SEC nin SEC1, SEC2 ve SEC3 olmak üzere üç farklı alt tipi bulunmaktadır. Stafilokokkal Enterotoksin D (SED): SED nin gıda zehirlenmelerinde karşılaşılan diğer bir önemli toksin olduğu bildirilmiştir. Stafilokokkal Enterotoksin E (SEE): Sekans analizleri SEE, SED ve SEA nın birbiriyle yakın ilişkili olduğunu göstermiştir (S11). Eksfoliatif Toksin Önceleri esas olarak faj litik grup II S. aureusların eksfoliatif toksin üretiminden sorumlu oldukları düşünülmekteydi ancak günümüzde bütün faj gruplarının eksfoliatif toksin üretebileceği anlaşılmıştır. Eksfoliatif toksinler, genil geniş eksfoliasyonlardan ufak su kabarcıklarına kadar çok geniş bir yelpazede hastalık oluşturabilmektedir. Bunlardan dermatitis eksfoliativa, pemfigus neonatorum, LYell hastalığı ve Ritter hastalığı en iyi bilinenlerdir. Eksfoliatif toksinin yapmış olduğu en yaygınhastalık Stafilokokkal Scalded Skin Syndrome (Stafilokokkal Haşlanmış Deri Sendromu) adı ile bilinen hastalık tablosudur. S.aureus antijenik olarak bilinen birbirinden farklı dört adet toksin serotipi üretmektedir. Bunlardan eksfoliatif toksin A (ETA) ve B (ETB) insanlarda görülen

88 53 Stafilokoksik Haşlanmış Deri Sendromu vakalarından sorumlu toksin serotipleridir [Müştak ve Esendal, 2008] İnsanlarda ve diğer primatlarda bulunan Stafilokoklar İnsanlarda ve diğer primatlarda bulunan Staphylococcus türleri S. aureus, S. epidermidis, S.capitis, S. caprae, S. saccharolyticus,s. warneri,s. pastauri, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. auricularis, S. saprophyticus, S.cohnii, S.xylosus ve s.simulanstır. Bu türlerin çoğu insan kalıcı florasında bulunmakla birlikte S.xylosus ve S.simulans daha çok evcil hayvanlar ve onların ürünleri ile bulaşarak geçici olarak bulunabilir. Bazı Staphylococcus türleri, özgül konaklarda belirli bölgeleri tercih eder. Örneğin, S.capitis subsp. capitis erişkin insanların büyük kısmında baş bölgesinde, özellikle de yağ bezlerinin çok yoğun olduğu ve iyi gelişip kafa derisi ve alın bölgesinde bulunur. S. auricularis dış kulak yolunda bulunabilir. S.hominis ve S.haemolyticus genellikle apokrin bezlerin yoğun olduğu aksiler ve pubikal deri bölgelerinde daha yoğundur. S. aureus doğal ortam olarak daha çok ön burun deliklerini tercih eder. Novobiocin e dirençli staphylococcuslar özellikle S.cohnii, toplumun geniş kesiminde ayak florasında yoğun olarak yer alır. S.saprophyticus, kadın ürogenital sisteminde yoğun olarak görülür. Artan ve Çürük, sağlık problemi bulunmaya 85 kişiden burun sürüntüsü örneği almış ve bu materyallerde Staphylococcus kolonizasyonunu araştırmıştır. Bu kişilerin 5 inde Staphylococcus aureus burun taşıyıcılığı olduğunu belirlemişlerdir [Artan, 2005]. Yetkin ve ark., hasta ve hastane personelinden oluşan toplam 200 kişiden aldıkları burun,aksilla ve el örneklerinden 71 adet Staphylococcus aureus izole ettiklerini bildirmişlerdir [Yetkin, 2006].

89 54 Kurutepe ve ark., klinik ve preklinik hasta personeli üzerinde yaptıkları çalışmada 483 burun sürüntü örneğinden 28 adet Metisiline dirençli Staphylococcus aureus saptamışlardır [Kurutepe, 2005] Klinik önemi Toplum kökenli sepsislerin en önemli nedeni ve en önemli nozokomiyal patojen S.aureustur. Hastalık, kendini geniş yelpazede toksin bağımlı hastalıklar (besin zehirlenmesi, haşlanmış deri sendromu ve toksik şok sendromu vb.), cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları (fronkülit, sellülit ve impetigo vb. ), derin enfeksiyonlar (kemik, eklem, kalp kapağı, dalak ve karaciğer vb.), akciğer ve üriner sistem infeksiyonları olarak görülebilir. Diğer klinik tablolar ise, cerrahi yara enfeksiyonu, ventilatör ile ilişkili pnömoni, intravenöz kateter nedenli bakteriyemi ve serebrospinal sıvı şantları, prostetik eklemler, vasküler greftler gibi proteze bağlı infeksiyonlar şeklinde görülen hastane enfeksiyonlarıdır. Koagülaz Negatif Stafilokokların (KNS) özellikle de S.epidermidisin nozokomiyal patojen olarak rolü son yirmi yılda daha iyi tanımlanmıştır. KNS infeksiyonlarındaki artış, prostetik ve kalıcı cihazların kullanımındaki artış ve hastanelerdeki immmünpkompromize hastaların sayısındaki artışla paralel seyretmektedir. Diğer KNS ler çeşitli infeksiyonlara neden olabilir [Çiğdem, 2005]. Staphylococcus taşıyıcılığı insanlar arasında %15 30 civarındadır. Çiğ ve arkadaşları., akne vulgarisli 85 hastadan 77 S.epidermidis izole ettiklerini bildirmişlerdir [Çiğdem, 2005]. Gülbandılar, gıda sektöründe çalışan ve halkla temas eden çeşitli meslek gruplarında çalışan 3048 kişinin burun kültürlerinde 217 adet Staphylococcus aureus izole etmiştir [Gülbandılar, 2005].

90 55 Özgüven ve ark, toplam 2015 öğrencinin metisiline dirençli Staphylooccus aureus nazal taşıyıcığını araştırdıkları çalışmalarında, Metisiline dirençli Staphylococcus aureus taşıyıcılığı saptanamamışken 296 öğrencide metisiline duyarlı Staphylococcus aureus taşıyıcılığı bulunduğunu bildirmişlerdir [Özgüven, 2008]. Kantarcıoğlu ve Yücel, 62 refakatçi ve 78 hasta ziyaretçisi olan toplam 140 kişinin el ve burunlarında Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus taşıyıcılığı oranını toplam 49 örnekte Staphylococcus aureus taşıyıcılığı, bunların 8 tanesinin Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus taşıyıcısı olduğunu tespit etmişlerdir [Kantarcıoğlu, 2002]. Kaya ve ark., 1067 çocuk hastadan aldıkları kan örneklerinde tespit ettikleri 84 Gram pozitif bakterinin 61 i Staphylococcus olarak izole etmişlerdir [Kaya, 2007]. Yurtsever ve ark., toplam 2175 yara örneğinden izole ettikleri 245 Gram pozitif bakterinin 203 tanesinin Staphylococcus aureus, 12 tanesinin Koagülaz negatif Staphylococcus olduğunu bildirmişlerdir [Yurtseven, 2009]. Kurtoğlu ve arkadaşları, toplam 310 sağlık personelinden alınan burun sürüntüsü örneklerinde 27 Staphylococcus aureus izole etmişlerdir [Kurtoğlu, 2009]. Özkaya-Artan ve ark., hastane personeli olan 136 kişide Staphylococcus aureus burun taşıyıcılığı oranını %13, 2 olarak tespit etmişlerdir [Özkaya-Artan, 2008]. Gündüz ve arkadaşları., Vernal Konjunktivitli 30 hastadan alınan konjunktival sürüntü örneğinde 8 adet S.aureus, 12 adet koagülaz negatif Staphylococcus ve 4 tanesinde de hem S.aureus hem koagülaz negatif staphylococcus izole etmişlerdir [Gündüz, 2007]. Başak ve arkadaşları., psoriazis tanısı konmuş 47 hasta ve 31 sağlıklı bireyinden aldıkları burun sürüntü örneklerinin hepsinde Staphylococcus izole etmişlerdir. Bu

91 56 izolatların 21 tanesini S.aureus, 57 tanesini koagülaz negatif Staphylococcus olarak tespit etmişlerdir [Başak, 2001] Stafilokokların neden olduğu enfeksiyonlar Stafilokoksik İmpetigo Püy Stafilokoksik olarak devam eder. S. aureus grup 2 tip 71, çoğunlukla enfeksiyona sebep olur. Exfoliatif toksin salgılanır. Staphylococcuslar boğaz enfeksiyonu, otitis media, konjunktivit etkenidir ve buralardan salgıladıkları toksinlerle enfeksiyona sebep olur. Elementer lezyon büldür. Bazen birleşerek 2 8 cm. e ulaşabilir. Gevşek büllerdir. İçi berraktır fakat zamanla bulanıklaşır. Yüzeyeldir, tavanı kalkınca krut oluşur. Bölgesel adenopati, genel bozukluk, ateş yoktur. Kendini sınırlar. Septik artrit, pnömoni, osteomyelit komplikasyonlardır. Scalded skin sendromunun lokalize formudur. Büllöz impetigo daha ileri yaşlarda ortaya çıkar. Lokalizedir ve vücuda yayılmaz. Büllerin çevresinde eritem yoktur. Büllöz impetigoda nikolski fenomeni (-) tir ve alınan sıvıdan kültür yapıldığı zaman S.aureus üretilebilmektedir. Skar bakımından iyileşirler [Bilgehan, 2000]. Folliküllit Yüzeyel foliküllit, kıl kökünün üst kısımlarındadır. Derin foliküllit, inflamasyon kıl folikülünü tam derinliği boyunca veya folikül çevresi ile birlikte tatar. Ağrılıdır. Yüzeyel folliküllitin en sık formu Yüzeyel Püstüler Folliküllit (Boccart İmpetigosu) tir. Çocuklarda biraz daha sık görülür. Saçlı deri, ekstremitelere en sık yerleşir. Erişkinlerde de görülebilir. Cerrahi yaralar ve drene olan abselerin çevresinde görülebilir. Yüzeyel püstüler lezyonlar meydana gelir, ateş ve diğer sistemik semptomlar yoktur [Bilgehan, 2000].

92 57 Stafilokoksik besin zehirlenmesi Kuluçka süresinin kısa sürmesi ile diğer zehirlenmelerden ayrılır. Toksinler ısıya ve mide asidine dirençlidir. Toksinler İL1 i artırır. camp yi stimüle eder. Stafilokoksik besin zehirlenmesinin kaynakları genellikle kaymak veya pasta gibi ürünlerdir. Toksinler zaten besin üzerinde daha önceden, bakteri tarafından üretilmiş haldedir. Bu yüzden enfekte yemekler alındıktan kısa bir süre sonra semptomlar meydana gelir. Kuluçka süresinin ardından bulantı, kusma gelişir ve ateş olmaksızın hızla iyileşme olur [Bilgehan, 2000]. Staphylococcus pnömonisi Etken s. aureustur. Yenidoğan solunum enfeksiyonları içinde mortalitesi en yüksek olanıdır. Radyolojisinde yamalı konsolidasyonlar görülür. Pleura tutulumu ve ampiyem sıktır. Vakaların yarısında ilk hafta içinde pnömatosöller oluşur. Çocuklarda yetişkinden farklı olarak %50 60 oranında çift taraflı tutulum vardır. Pleura tutulumu daha az ama abse oluşumu sıktır. Akciğerlerdeki lezyonlarla beraber osteomyelit görülmesi Staphylococcus enfeksiyonunu düşündürür. Pnömonilere bağlı olarak gözlenen ampiyemilerin en sık sebebi S. aureus pnömonisi ampiyemidir. Staphylococcus pnömonisinin en sık görülme şekli İnfluenza A, ÜSYE sinin arkasına olmasıdır. En sık süt çocukluğu döneminde gözlenir. % 70 kadarı 1 yaşın altındadır. İntravenöz ilaç kullananlarda ve hemodiyaliz hastalarında pnömoninin en sık etkeni s. aureustur. Çocuklarda kistik fibrozis varsa pnömoninin en sık etkeni S. aureus iken yetişkinlerde ise ikinci en sık etken s.aureustur [Bilgehan, 2000]. S.aureus, pnömoninlerin en sık etkeni olan Staphylococcus türüdür. Hemorajik nekroz ve kavitasyon Staphylococcus bronkopnömonilerinin karakteristik özelliğidir. Enfeksiyon bölgesi etrafında ve pleura bölgesinde birçok abse Staphylococcus pnömonisinin karakteristiklerindendir. Klinik olarak solunum yetmezliklerinin bütün bulguları vardır.

93 58 Staphylococcuslar nazofarinkste taşınır ve bulaştırılır. Pnömoni genelde bronkopnömoni şeklindedir. Ayrıca Staphylococcus pnömonisi en sık rastlanan Gram (+) nasokomiyal pnömoni etkenidir [Bilgehan, 2000]. Sevinç ve arkadaşları., 173 klinik örnek üzerinde yaptıkları çalışmada 31 Staphylococcus aureus izole ettiklerini bildirmişlerdir [Sevinç, 2007]. Kaynar ve arkadaşları., toplam 38 pnömoni hastası ile yaptıkları çalışmada 17 Staphylococcus izole etmişlerdir [Kaynar, 2004]. Toksik şok sendromu Stafilokoklara bağlı olarak ortaya çıkan, tampon kullanan kadınlarda görülen, multiorgan yetmezliği belirtileri ile seyreden klinik bir tablodur. Kliniğinde, birden yükselen ateş, bulantı, kusma, baş ve karın ağrıları, diyare, nonpürülan konjunktivit, hipotansiyon görülür. Ardından kalp, böbrek, karaciğer, koagülasyon bozuklukları, letarji, avuç ve ayak tabanında lokalize maküler döküntü ve deskuamasyon görülür. Erken tanı durumunda 8 10 günde iyileşme olur [Bilgehan, 2000]. S. aureus tarafından üretilen toksinlere bağlı olarak gelişir yaş arası menstrual olgunluğa erişmiş kadınlarda görülür. Bulaşma şekli, tamponun vajene yerleştirilirken labia majustan sürtünmeyle mikroorganizmaların vajene taşınmasıdır. Salgılanan toksinler epidermiste eksfoliasyona sebep olduğundan eksfoliatin adını alır. Ayrıca diyafram kullanımı, cerrahi girişimlerden sonra doku absesi veya osteomyelitlerde görülmüştür. Ortamda Mg ++ iyonu konsantrasyonu azalır ve bol miktarda toksin salgılanabilir hale gelir. Salgılanan toksin PMNL ve diğer fagositik hücrelerden İL, prostaglandin ve α- TNF salgılanmasına sebep olur ve böylelikle sistemik bulgular ortaya çıkar [Bilgehan, 2000]. Toksik şok sendromunu S.aureusun yaptığı TŞS toksin 1, Stafilokokkal enterotoksin F ya da pirojenik toksin C olarak adlandırılır. Muayenede ateş, taşikardi, kan basıncında düşme, özellikle abdominal kaslarda hassasiyet, kırmızı mukoz

94 59 membranlarda çilek görünümü, prülan ve ödem, vajinal eritem ve ödem özellikle TSŞ de ortaya çıkar. Karakteristik olarak 1. ve 2. haftalarda ağız ülserasyonları, jeneralize ince kül rengi deskuamasyon, el ve ayak pamakları uçlarında, el ve ayak ayasının derisinin soyulması tipiktir. Ani olarak başlar ve hastayı şoka sokan bir tablo gelişir. Aniden ateş, soğuk algınlığı, myalji, baş ağrısı, bulantı ve diyare şeklinde başlar. 48 saat içinde kan basıncı yavaş yavaş düşerek hasta şok tablosuna girer. Hastaların % 30 kadarında özellikle ilk 3 menstrüel periyotta nüks gelişir. Mortalite oranı % 10 u bulabilir [Bilgehan, 2000]. Sycosis Barbae / Simplex Sakal bölgesindeki kılların staphylococcuslar tarafından oluşturulan enfeksiyonudur. Çoğunlukla etken staphylococcuslar burun ya da boğaz boşluğunda lokalize olmuştur. Sycosis barba çoğunlukla üst dudakta başlayarak dağılır ve kronik bir seyir gösterir. Yüzeysel papül ve püstüller başlar. Lupoid sycosis denen, derine ilerleyen ve scatrix ile iyileşen formu vardır [Bilgehan, 2000]. Fronkül Tamamen sağlıklı bireylerde görülebilir. Predispozisyon yapan durumları vardır. Akut seyirlidir. 1 hafta 10 gün içinde oluşur. Açılır, ülsere olur ve iyileşir. Predispozisyon varsa olay kronik seyirlidir. Bir fronkül iyileşirken bir diğeri çıkar [Bilgehan, 2000]. Kabonkül Derin bir folliküllittir. Saçlı deri, ense, sırt, gluteal bölge, çene gibi yerlerde fronkülün lateral olarak çevreye yayılması ile oluşur. Birden fazla kıl folikülü tutulur.

95 60 Ateş yoktur. Septik komplikasyon olabilir. Yüzün üst kısmından vena oftalmica ve vana angularis ile sinüs kavernosus enfekte olabilir [Bilgehan, 2000]. Haşlanmış deri sendromu Daha çok yenidoğanda ve erişkinlerde de böbrek yetmezliği olanlarda sıktır. Etken Staphylococcus, bebeklerde nazofaringeal enfeksiyon, ootit etkeni olarak bulunur. Eksfoliatif toksin ile bu tabloya yol açar. Deride yaygın mukopapüler bir döküntü ve daha sonra hızlı büller oluşur. Büller açılır ve gövdede bir deskuamasyon göze çarpar. Yüzeyeldir. Yenidoğan ve erişkinde enfeksiyonun seyri kötüdür. Protein kaybı, sekonder enfeksiyon, pnömoni, septisemi nedeni olabilir. Mukozal tutulumu yoktur [Bilgehan, 2000]. Paronişi Tırnak çevresindeki deri kıvrımının enfeksiyonudur. Deri kıvrımı bütünlüğünü koruduğu süreceolmaz. Aşırı manikür, pedikür, şeytan tırnağının koparılması durumlarında ve çamaşırcılarda sık görülür. Şişlik, eritem, ağrı, kızarıklık olur [Bilgehan, 2000]. Endokardit ve meningokoksemi benzeri tablo Stafilokoklar intravenöz eroin, ilaç ve Tip I triküspit kapağı tutarak akut endokardit yapar. Ayrıca Stafilokoklar komplemanı ve pıhtılaşma faktörlerini aktive ederek Dissemine İntravasküler Koagülasyon gelişmesine sebep olabilir. Bu triküspit kapağındaki endokardit oluşabilmesi için romatizmal kapak hastalığı olmak zorunda değildir. En sık olarak akciğerlere tromboembolik olaylar gözlenmektedir. Prostetik kapaklarda ise en sık olarak endokardit etkeni ise s.epidermidistir. S. aureus ise 2. sırada yer almaktadır.

96 61 Akut infektif endokardit en sık olarak triküspit kapakta gözlenir. Bunun gözlenmesi için herhangi bir risk faktörüne ya da kardiyak bir patolojiye gerek yoktur. En sık etken S. aureustur. Subakut infektif endokarditler akut infektif endokarditlere nazaran daha sık olarak gözlenir. Ventrikülo-peritoneal şantı olanlarda en sık infektif endokardit etkeni s. epidermidistir [Bilgehan, 2000]. Septik artrit Septik artrit, sinoviyal sıvıda pürülan eksudasyon, intraartiküler basınç ve eklemde destrüksiyon ile giden inflamatuar hastalıktır. En sık olarak 1. sırada kalça eklemi tutuluken, 2. sırada diz, bundan sonra sırasıyla ayak bileği, dirsek, el bileği ve omuz eklemi tutulur [Bilgehan, 2000]. Osteomyelitis Çocuklarda en sık sekonder yani hematojen yolla olan myelit gözlenir. Sekonder hematojen osteomyelit de en sık dize yakın uzun kemiklerin metafizleri tutulur. En sık 0 2 ve yaşları arasında gözlenir. Primer osteomyelit, direkt olarak ayaklarda, sarkumda ve tüberculum majusunda yaraları olan yatalak hastalarda gözlenir. Soğuk abse vardır ve bu absenin en önemli özelliği anatomik yolla yayılıyor olmasıdır. Buna Pott Hastalığı denir. Prostetik kapakları olanlarda septik artritin en sık etkeni s. epidermidistir. Yara enfeksiyonu, pürülan akıntının olması ya da yarada bakteri izole edilmesi olarak tanımlanabilir. Yara enfeksiyonlarının en sık olarak etiyolojik ajanı S. aureustur. Nekrotizan fasciitis, ölüme yol açabilir. Yüzeyel fasciada geniş nekroz vardır. Çevre dokuya yayılım olur. Fascia boyunca, en sık karın duvarında olur. Ameliyat ve

97 62 travma sonrası görülebilir. Fournier Gangreni nde perine tutulur [Coşkun ve Ulaş, 1999] Klinik materyalden stafilokokların izolasyonu Süpüratif enfeksiyonlarda lezyonlar, yüzeysel ise deri hafif bir antiseptik ile silindikten sonra ponksiyon ile ya da kesmek suretiyle açıldıktan sonra pamuklu silgiç ile irin alınır. Menenjit olgularında BOS, sepsis olgularında kan incelenir. Pnömoni ve akciğer enfeksiyonlarında balgamdan çok trakeal aspirasyon sıvısı incelenmelidir. Besin zehirlenmelerinde besin artığı aranırsa da olayın sorumlusu enterotoksinler olduğu için ve staphylococcuslar çoğu kez ölmüş olacaklarından üretilemezler. Staphylococcus enteritlerinde dışkı incelenir [Bilgehan, 2002]. Kan dışındaki muayene maddelerinden yapılan preparatların boyanmasında, lökositlerle birlikte üçlü, beşli gruplar şeklinde Gram (+) Staphylococcus görünümündeki koklar görülür [Bilgehan, 2002] Staphylococcus aureusun cüce kolonili şekillerinin saptanması Kronik S.aureus enfeksiyonu olan ve antibiyotik kullanan kişilerde materyalden yapılan Gram boyamalı preparatlarda Staphylococcus görüldüğü halde bazen kültürlerde üretilemedikleri veya ancak büyüteç ile görülebilen koloniler oluşturdukları görülür [Bilgehan, 2002] Staphylococcus enfeksiyonlarının önlenmesi Staphylococcus hastalıklarını önlemek için lisanslı mevcut bir aşı yoktur. Şu ana kadar yüksek risk gruplarında Staphylococcus enfeksiyonlarını önlemek için hiperimmün antistafilokokkal immünoglobülin kullanılarak yapılan pasif aşılamanın etkinliği ile ilgili yayın yoktur. Nozokomiyal enfeksiyonların önlenmesinin temeli hastane kontrol önlemleridir. Nozokomiyal MRSA ile bulaşının önlenmesi için kılavuzlar mevcuttur. MRSA enfekte veya kontamine hastalarla temasın önlenmesi

98 63 önerilmektedir, fakat hastanelerin aynı zamanda hastaneye kabul zamanında MRSA taşıyıcılığı için yüksek risk taşıyan muhtemel rezervuarları tanımlamak için aktif sürveyans kültür programı uygulanması önerilmektedir. S. aureus nazal taşıyıcılığı enfeksiyon gelimesinde bir risk faktörü olarak ileri sürülmektedir. Enfeksiyon oranları taşıyıcılarda, taşıyıcı olmayanlara göre daha yüksektir ve S. aureus sepsisli hastalar sıklıkla kendi suşları ile enfekte olmaktadır. S. aureus taşıyıcılığının geçici eradikasyonunu saptamaya yönelik birçok çalışma yapılmıştır. Çoğu çalışma diyaliz hastaları ile yapılmıştır. Birkaç çalışmada hemodiyaliz uygulanan hastalarda S. aureus enfeksiyon oranında azalma görülmüştür. Nazal ve ekstranazal MRSA taşıyıcılığında topikal ve sistemik antimikrobiyal ajanların etkinliğinin yol gösterici derlemeler, yan etkiler ve tekrarlayan MRSA enfeksiyon insidansı, nazal ve ekstranazal MRSA eradikasyonu için topikal ve sistemik antimikrobiyal tedavinin desteklenmesinde yetersiz kanıtlar olmuştur. Yani, nazal MRSA taşıyıcılığının engellenmesinin etkisiyle güçlü kanıtlarrenal diyaliz hastaları ile alınmıştır, diğer hasta gruplarında nazal dekolonizasyonun optimal kullanımı daha az etkili olarak tanımlanmıştır. Rektal taşıyıcılık, karaciğer transplant alıcıları ve yoğun bakım ünitelerindeki hastalarda S. aureus için rezervuar olabilir, nazal dekolonizasyonun barsak veya rektal taşıyıcılığı engelleyip engellemediği belirsizdir [Murray, 2009] Stafilokoklarda biyofilm yapısı Son 20 yılda, başta S.epidermidis olmak üzere özellikle Staphylococcus türlerinde Biyofilm oluşumundan söz edilmiştir. S.epidermidis, kronik polimerle ilişkili enfeksiyon olarak tanımlanan yeni bir enfeksiyona neden olmakta ve günümüzde fırsatçı patojen olarak değerlendirilmektedir. Genellikle kateter gibi biyomalzemelere zarar verdiği bilinmektedir. İlk çalışmalarda, elektron mikroskobu incelemeleri, polimer bir yüzeyde S.epidermidis bakterilerinin birçok hücre tabakası oluşturduğunu göstermektedir ve bu tabaka, hücreleri saran ve amorf bir yapıda bulunan yapışkan bir madde ile korunmaktadır. Bu yapışkan madde, gerçek bir kapsül gibi değildir ve gevşek bir yapı halinde Staphylococcus hücresine bağlıdır. Doğal ortamlarında bir biyofilmin yapısında çok sayıda türden oluşan mikrobiyal bir topluluk bulunur. Buna

99 64 karşın biyomateryallerle ilişkili enfeksiyonlarda hücrelerin yaklaşık %80 i s. epidermidistir [Murray, 2009]. Mikroskop incelemelerinde, biyofilm oluşumunun 2 adımda gerçekleştiği görülmektedir. Önce, primer bir yüzeye bakteri hücreleri, çok katmanlı hücre kümeleri oluşturmak için yapışkan bir matriks ile çevrilir. Bu yapışkan maddenin, polimer madde ile ilişkili enfeksiyonlarda çok önemli rol oynadığı bilinmektedir. Stafilokoklarda biyofilm oluşumu birden çok faktöre bağlıdır. Biyofilm oluşumu, bazı antibiyotiklerin subletal konsantrasyonlarında veya diğer stres durumlarında, O veya Fe iyonları sınırlı miktarda bulunduğu durumlarda bir bakteri için hayatta kalma stratejisi olarak kullanılır. Çeşitli çevre koşullarında biyofilm oluşumu ile enfeksiyona elverişli bir ortam oluşturulabilir. Genel olarak, bir biyofilm veya mikrokolonilerde bulunan Staphylococcus hücreleri, daha çok sayıda antibiyotiğe, planktonik hücrelerden çok daha fazla dirençlidir. Birçok hastada, kronik bir polimerle ilişkili Staphylococcus enfeksiyonlarında çeşitli antibiyotiklerle tedavi imkansızdır. Staphylococcus kronik polimer ile ilişkili enfeksiyonlarının tedavisinde birçok antibiyotiğin başarısız olduğu bilinmektedir ve biyofilmlere etkili antibiyotiklere büyük ihtiyaç vardır. Stafilokoklar tarafından kronik polimer ile ilişkili enfeksiyonlar için ön koşullardan biri bakterinin polimer bir yüzeye yapışmasıdır. Pratikte, S. epidermidisin klinik koşullarda tutunması için sentetik polimer veya biyouyumlu materyal bulunmalıdır [Murray, 2009]. Jensen ve ark., stafilokokların yapışma ve biyofilm oluşum özelliği üzerine polimerik malzemelerin değişik etkisini araştırmıştır. Bu amaçla, birçok antibiyotiklerin dahil edildiği kateterler üretilmiştir. Bu malzemeler, kateterlerle ilişkili bazı enfeksiyonların önlenmesinde olumlu etki yapan malzemelerdir. Örneğin, rifampin

100 65 ve trimetrotrim adlandırılan bağlı silikon bir kateter, in vitro koşullarda S. aureus kolonizasyonunun azaltılmasında yardımcı olur. Ayrıca, gümüş kateter olarak gümüş emdirilmiş kateterlerin de Staphylococcus kolonizasyonunu veya enfeksiyondaki etkiyi azalttığı belirlenmiştir. Diğer bir olumlu sonuç da jelatin kullanıldığı durumlarda elde edilmiştir. Örneğin, jelatin emdirilmiş polyester greft in Koagülaz Negatif stafilokoklarda biyofilm enfeksiyonlarındaki azaltıcı etkisi gösterilmiştir. Ancak, implant malzemesi gümüş veya diğer antimikrobiyal malzemelerle kaplı bileşiklerin in vivo yararı konusuna uzun vadeli araştırmalar yapılmalıdır. Örneğin, in vitro yapılan bir çalışmaya göre s.epidermidis, gümüş kaplamalı kelepçelere, gümüş kaplamalı olmayanlara göre daha iyi tutunmaktadır. Bu çalışma, gümüşün enfeksiyon önleyici etkinliği üzerine şüphe uyandırmaktadır. Ayrıca gümüş iyonları veya rutin kateterlerde antibiyotik kullanımı, kesinlikle bu maddelere dirençli suşlar oluşumuna neden olacaktır. Yani, klinik olarak uygulanabilirlik konusunda uygulanabilir malzemede alternatifler henüz araştırılmamıştır [Murray, 2009] Candida Cinsi Sistematik Mantarlar ilk önce bitkiler içinde sınıflandırılmıştır ancak daha sonra hücre yapılarına göre canlıların beşinci alemi olarak kabul edilmiş ve üreme biçimleri, yapıları, yaşam döngüleri ve bazı fizyolojik özelliklerine göre sınıflandırılmıştır. Mantarların isimlendirilmesi İnternational Code of Botanical Nomenclature tarafından yürütülmektedir. Eşeyli üremesi saptanamayan mantarların tümü Deuteromycota (Fungi imperfecti) sınıfında incelenirken, eşeyli üremeleri saptanan mantarlar da Zygomycota, Ascomycota ve Basidiomycota sınıflarında incelenirler.

101 66 Filogenetik sınıflamaya uygun ve klinisyenlere yönelik bir başka sınıflama şekli daha vardır. Bu sınıflama klinik mikoloji laboratuvarlarında hastalık etkeni olarak en sık soyutlanan mantarları içermektedir [Yıldız, 2008]. Çizelge 2.1. Mantarların kliniğe yönelik olarak sınıflandırılması Candida türleri insanları etkileyen en yaygın fungal patojenlerdir. İnsan deri ve mukozasında normal florada bulunur. Doğum sırasında veya doğumdan kısa bir süre sonra yenidoğana bulaşarak söz konusu flora içerisindeki yerlerini alırlar. Normal bireylerin % sinin ağzında ve gastrointestinal kanalda yer alır. Bu organizmalar, bazı hazırlayıcı faktörlerin varlığında invaziv olmayan yüzeyel ve / veya derin dokuları tutan enfeksiyonlara neden olur [Yıldız, 2008]. Kandidalar, Deuteromycota da Blastomycetes sınıfının Crytococcales takımında Cryptococcaceae familyasında sınıflandırılan, blostosporlarla çoğalan, yalancı hif

102 67 yapan ve eşeyli şekilleri Hemiascomycetes sınıfında bulunan bir grup maya formunda mantarlardır. Eşeyli ve eşeysiz sporları aracılığıyla ürer ve üreme şekilleri baz alınarak sınıflandırılır. Bugün için kabul edilmiş 200 kadar türü bulunmaktadır. Candida cinsinin içinde bulunduğu türlerin taksonomik ilişkileri tam tanımlanmamıştır. Bu cins içerisinde en sık karşılaşılan patojen tür c.albicanstır. diğer en sık etkenler C.tropicalis, C.glabrata, C.parapsilopsis, C.krusei ve c.guillermondiidir. diğer hastalık etkeni olan başlıca türler; C.cutenula, C. Cifererrii, C.haemulonii, C.pelliculosa, C.pulcherrima, C.rugosa, C.utilis, C.viswanathii ve c.zeylanoidestir. bu sayı ve sıralama gün geçtikçe değişebilir. Eşeyli spor oluşturan Candida türlerinin bazıları Claispora, Debaryomyces, Issatchenka, Kuyveromyces, Pichia gibi farklı türler olarak tanımlanmaktadır. C.stellatoidea, C.claussenii ve C.langeronii türleri C.albicans içinde sınıflandırılmıştır [Yıldız, 2008] Genel özellikleri Candida türleri tek hücreli, hücre duvarında kitin ve /veya selüloz içeren ökaryotik kemoheterotrop organizmalardır. Tomucuklanma (blastospor) veya ortadan ikiye bölünme ile çoğalılar. Candida türleri genellikle çapları 4 6 µm arasında değişen yuvarlak veya yuvarlağımsı tomurcuklanan maya mantarlarıdır. Candida türlerinde oluşan blaktokonidiyumlar ana hücreden ayrılmadan peşi sıra uzayarak yalancı hif (pseudohif), hücre duvarları birbirine paralel gerçek hif ve bir hifin ucunda veya arada bulunan tek hücreli, kalın duvarlı, oval geniş yapı olan konidiospor, germ tüp oluşumu ve askospor oluşumu tür tanımında önemlidir. Gram ile boyandıklarında tüm Candida türleri Gram pozitiftir. Maya elemanlarının örnekler içinde aranmasında Potasyum hidroksit kalkofor beyazı floresan boyama kullanılır. Maya hücre duvarındaki kitin ve selülozlka nonspesifik bağlann kalkoflor bayazı floresan boyası yeşilden maviye değişen renklerde floresan verir. [Yıldız, 2008].

103 Görünüm ve boyanma özellikleri Candida türlerinin blastokonidium yapıları yuvarlak, oval veya uzamış şekildedir. Ender olarak bazı kökenler, özellikle antimikrobiyal ilaç kullanan hastalardan izole edilenler, ilk izolasyonlarında ileri derecede pleomorfik olabilir. Eşeysiz üreme multilateral tomurcuklanma yoluyla olur ve gerçek miçel de bulunabilir. Eğer eşeyli üreme olursa, mayalar teleomorfik durumlarına göre sınıflandırılır. Yalancı görünümlü ve bunlara blastokonidiumların bağlanma şekli, Candida türlerinin identifikasyonunda gözlenecek önemli özelliklerdir. Germ tüp ve klamidosporların görülmesi Candida albicans indentifikasyonunda yardımcı olur [Özcan, 2007]. Bu mikroorganizmaların izolasyonu oldukça kolaydır. İçerisinde antifungal bulunmayan neredeyse her besiyerinde üreyebilir. Sabouraud Agar da, mısır unlu agarda, patatesli nişastalı dekstroz agarda en iyi üremeyi gösterir. Mantar besiyerlerinde üreme 24 saat gibi erken bir sürede saptanabilmekle birlikte koloniler genellikle saatte görünür hale gelir, ancak pasajları yapılmış ve laboratuvara adapte olmuş kökenler daha hızlı üreyebilir. Koloniler beyazdan kreme kadar değişen renklerde veya açık kahverengidir; başlangıçta krema görünümünde olup zamanla zarımsı veya girintili çıkıntılı bir hal alır. Bazen Candida albicans kolonileri Sabouraud Glikoz Agar daki ilk izolasyonlarında buruşuk veya pürüzlü olabilse de daha sonraki pasajlarında düzgün kolonilere dönüşür. Bir klinik örnekte mayadan kuşkulanılan bir izolasyon olduğunda, ilk yapılacak şey koloniden bir direk preparat hazırlayıp incelemek olmalıdır. İnceleme yapılırken mayanın şekli, yalancı hif, gerçek hif veya artrokonidiumların bulunup bulunmadığı gözlenir. Böyle bir preparatta yalancı hifi nadir veya hiç olmayan, yuvarlak-hafif oval şekilli tomurcuklanan bir maya görülürse, kapsül varlığı yönünden de ileri bir inceleme yapılmalıdır. İlk mikroskobik inceleme için hazırlanan aynı preparat, çini mürekkebi ile inceleme için kullanılabilir. Preparat daha sonra kapsüllü mayaların varlığı yönünden incelenebilir. Kültürlerinden alınan koloni materyali Gram pozitif boyanır ve 3 4 µm çapında oval maya hücreleri şeklinde görülür. Buyyonda 3 günlük kültürden hazırlanan preparatlarda 4 6 x 6 10 µm boyutlarında ovoid maya hücreleri görülür. [Özcan, 2007].

104 69 İnokulumda hif/yalancı hif hücrelerinin bulunması nedeniyle bu koloniler germ tüp testinde kullanılmamalıdır. Candida türlerinin çoğu, aerobik koşullarda O C de iyi üreme gösterir, birçoğu da 37 O C ve üstündeki sıcaklıklarda üreyebilir. Mayaların 37 O C de üreyebilmeleri çok önemli bir özelliktir. Patojen türlerin çoğu 25 ve 37 O C de ürerken, saprofit olanlar yüksek ısıda genelde üreyemezler. Türleri ayırt etmek için karbon asimilasyon ve ender olarak fermentasyon testlerine ihtiyaç duyulur, ancak günümüzde belirli türler için hızlı doğrulama testleri de geliştirilmiştir. Klinik örneklerden genel olarak izole edilen Candida türleri arasında, Candida guillermondi dulsitolü (galaktitolü), Candida kefyr ise laktozu asimile eden tek türdür. Candida parapsilopsis, arabinozu kolaylıkla asimile ederken Candida tropicalis kükenlerinin çoğu etmez. Candida türleri genellikle üreaz oluşturmaz ve KNO 3 asimilasyonu yapmazken Candida krusei in bazı türleri üreaz pozitiftir [Özcan, 2007]. Kandida albikansın hızlı ön identifikasyonu için kullanılan en değerli ve basit testlerden biri germ tüp testidir. Test ön identifikasyonu sağlar, çünkü tüm Candida kökenleri germ tüp pozitif değildir. Candida dubliniensis izolatlarının çoğu ticari sentetik besiyerlerinde germ tüp oluşturmamalarına karşın, Candida dubliniensis de germ tüp pozitiftir. Germ tüp preparatlarının mikroskobik incelemesinde, Candida albicansın oluşturduğu kısa hiflerin baş tarafının, blastokonidiyum ile germ tüpün kesiştiği yerde boğumlanma oluşmadığı görülür. Sıklıkla, çok sayıdaki Candida albicans blastokonidiyumunun germ tüp oluşturduğu ve inkübasyonun 3 saatten fazla sürdüğü durumlarda, germ tüplerin birbirlerine dolanarak kümeler oluşturduğu görülür. Candida tropicalis de hif çıkıntıları oluşturur, fakat blastokonidiyumları candida albicansınkilerden daha büyük olup blastokonidiyum ile hif çıkıntısı bileşiminde belirgin bir boğumlanma vardır. Bilinen bir Candida albicans kültürünün pozitif kontrol olarak kullanılmasının yanı sıra, C.tropicalis ve C.glabratanın kullanıldığı negatif kontroller de testte yer almalıdır.

105 70 Hızlı trealoz testi ile C.glabratanın ön identifikasyonu 3 saat içinde yapılabilir [ Bilgehan, 2002] Doğal ortamlar Candida türleri yaygın görülen mayalar olup birçok bitki üzerinde, memelilerin sindirim kanalı normal florasında ve insanın mukoza ve derisinde bulunur. İnsan gastrointestinal kanalının her yerinde Candida bulunabilir. İnsan gastrointestinal kanalından en sık izole edilen tür C.albicans olup bunu C.tropicalis ve C.glabrata izler [Bilgehan, 2002]. Kandida glabratanın insanla simbiyotik ilişki içinde olduğu kabul edilir; insanların çoğunun ağız boşluğu, genitoüriner yol, gastrointestinal kanal ve solunum yollarından rutin olarak izole edilebilir. Candida türleri, klinik örneklerde çevreden kontaminasyon veya kolonizasyon nedeniyle ya da gerçek hastalık etkeni olarak bulunur. Normal florada bulunan Candida türleri, bir hastalık veya tedavi girişimleri nedeniyle bağışıklık savunması bozulmuş hastalarda, dokuları istila ederek yaşamı tehdit eden patojenilere yol açabilir. Candida albicans, hemen hemen tüm kandidoz formlarından en sık izole edilen türdür. Hastalık etkeni olarak sık görülme nedeni, normal florada yüksek prevalans göstermesidir [ Bilgehan, 2002] Biyokimyasal özellikleri Mayaların karbon kaynağı olarak spesifik bir karbonhidratı oksijen varlığında kullanma yetenekleri karbonhidrat asimilasyon testi ile ortaya konur. Bu test Wickerman ve Burton gibi rutinde pek kullanılmayan metotlarla yapılabileceği gibi, çeşitli otomatize ve yarı otomatize ticari sistemler kullanılarak da uygulanabilir. Candida türlerinin hepsi glikozu asimile ederken, inositolü asimile edemez. Diğer karbonhidratlarla yapılan asimilasyon testlerinin sonuçları kökenler göre değişiklik göstermektedir. Karbonhidrat asimilasyon testine benzer şekilde mayaların nitrojen

106 71 kaynağı olarak nitratı kullanma yeteneklerini belirlemek için nitrat asimilasyon testi uygulanır. Candida türlerininin hiçbiri KNO 3 ü karbon kaynağı olarak kullanmaz. Fermentatif mayalar karbondioksit ve alkol oluşturur. Gaz oluşumu ve ph ta değişiklik olmaması fermentasyonu gösterir. Karbonhidrat fermentasyon testi değişik Candida türlerini Cryptococcus ve Rhodotorula türlerinden ayırt etmek için kullanılır. Üreaz tesi ile mantarların üreaz enzimi üretebilme yetenekleri gösterilir. Uygun substrat varlığında üre, üreazla parçalanarak amonyak oluşturulur. Oluşan amonyak ph ı yükseltir ve fenol red indikatörü ph artışına bağlı olarak kehribar renginden pembemsi bir renge dönüşür. Candida krusei ve Candida lipolytica türleri hariç diğer Candida türlerinde üreaz enzimi bulunmaz [Yıldız, 2008]. Candida türlerinin identifikasyonunda ilk adım germ tüp testidir. C.albicans ve C.dulbiniensis dışındaki Candida türlerinde germ tüp oluşumu gözlenmez. Candida türlerinin hif, psödohif, blastspor ve klamidospor üretme özellikleri mikroskobik olarak değerlendirilir. Bunun için pirinç unu-tween 80, mısır unu(cornmeal) Tween 80, Wolin Bevis agar, Oxgall agar veya Czapek Dox- Tweein 80 agar besiyerşeri kullanılabilir. C.albicans kökenlerinin %60 ı klamidospor oluşturur. Bu test C.albicans ve C.dubliniensis türlerinin identifikasyonunda hızlı bir ön tanı basamağıdır. Candida türleri yalancı hif (psödohif) oluşturur. Yalancı hif arka arkaya tomurcuklanan blastokonidiyumların birbirinden ayrılmayıp uzayarak ve aralarında boğumlar oluşturarak yaptıkları bir hücreler zinciridir. Candida türleri arasında C.albicans blastokonidiyum ve yalancı hif yanında gerçek hifler de oluşturarak dimorfik özellik gösterir [Yıldız, 2008] Virülans faktörleri Candida türlerinin virülans faktörleri; çimlenme borusu oluşturması, slime faktörü, ekstraselller matriks proteinlerine adezyonu sağlayan yüzey integrin benzeri

107 72 moleküller, sideoforları kullanabilme özelliği, proteaz, fosfolipaz, hyaluronidaz, kondroidin fosfataz, kitinaz, esteraz ve lipaz enzimleri, endotoksin benzeri aktivite, morfolojik dimorfizm, antijenik çeşitlilik, fenotipik değişim ve hücre duvar bileşenleridir. Bu virülans faktörleri Candida enfeksiyonlarının oluşmasında önemlidir. Ancak fırsatçı mantar enfeksiyonlarında konağa ait faktörler daha ön plana çıkmaktadır. Kandidaların oral ve vajinal epitel hücrelerine, fibronektine, endotele, trombost fibrin pıhtılarına ve plastik materyale adezyonu patogenezde önemlidir. Adezyon, hücrelerin yüzey özellikleri ile ilişkilidir ve mukokutanöz kandidozun bu yapışma ile başladığı kabul edilmektedir. Kandidaların mukoza epitel ve endotek hücrelerine yapışması kolonizasyonun ilk aşamasıdır. Kandidalar içerisinde en sık görülen tür olan c.albicansın önemli özelliklerinin başında da mukoza yüzeylerine yapışmayı sağlayan adezyon yeteneği gelir [Yıldız, 2008]. Slime faktörü candidaların katetere bağlı enfeksiyonlarında önemlidir. Damar içi kateter ve protez enfeksiyonlarında slime faktörü önemli rol oynar. Bu yabancı cisimler organizmada fibronektin, fibrinojen ve laminin ile kaplanır ve yüzeye yapışan, çoğunlukla polisakkarit yapıda bir biyofilm tabakası oluşturur. Biyofilm tabakası oluşturarak enfeksiyonlara neden olan Candida türleri C.albicans ve C.parapsilopsistir. diğer patojenik faktörlerin yanı sıra C.albicans ve C.albicans dışı kökenlerde, biyofilmlerin önemli bir virülans faktör olduğu öne sürülmüşse de son günlerde yapılan araştırmalarda musin, fibronektin ve mannan bağlayan protein gibi, tükürük veya serum proteinlerinin Candida türlerinin biyofilm oluşturmasını kolaylaştırmadığı, akrilik yüzeylerde Candida biyofilmi oluşmasının karmaşık bir olay olduğu bildirilmiştir [Yıldız, 2008]. Dokularda yayılmayı kolaylaştıran bir diğer enzim olan fosfolipaz, konak hücre zarındaki fosfolipidleri hidrolize ederek hücreye zarar verir. Fosfolipaz aktivitesi en çok K.albikans ta görülmekle birlikte, C.glabrata, C.parapsiopsis, C.tropicalis, C.lusitaniae ve C.krusei türlerinde de saptanmıştır.

108 73 Enfekte dokularda K.albikansın hem maya hem de miçelli şekli bulunsa da, hif şeklinin aktif semptomlu enfeksiyonlarla ilişkili olduğu, saprofit K.albikansın hemen daima maya şeklinde olduğu, çimlenmekte olan miçelli hücrelerin daha virülan oldukları da belirtilmiştir. Çimlenme borusu oluşturan hücrelerin dokuya blastosporlardan 50 kez daha fazla yapıştıkları gösterilmiştir [Yıldız, 2008] Candida türleri ile oluşan hastalıklar Kandidalar normal koşullarda, özellikle gastrointestinal olmak üzere, normal florada bulunduklarından enfeksiyonları çoğu kez endojen kaynaklıdır. Genellikle enfeksiyondan önce florada bulunan mantar sayıca artış gösterir ve bu kolonizasyonu enfeksiyon izler. Kandidozlar, yüzeyel ve derin enfeksiyonlar olmak üzere iki grupta incelenir. Yüzeyel kandidozlar deri ve mukozların, derin kandidozlar ise iç organ ve sistemlerin enfeksiyonlarıdır [Yıldız, 2008]. Yüzeyel kandidozlar ağız kandidozu (pamukçuk), genital kandidoz, deri kandidozu, onikomikoz ve kronik mokukutanoz kandidiazis şeklinde görülür. Derin ve sistematik kabdidoz kandidemiyi izler. Konak savunmasının normal olduğu durumlarda, kandidemi geçici olup vücut kısa sürede mantarı kandan uzaklaştırır. Buna karşın, yetersiz fagositik etkinlik durumlarında Candida kandan uzaklaştırılamaz ve kanda çoğalıp herhangi bir organ veya sisteme yerleşerek enfeksiyon odaları oluşturur. En sık tutulan organlar; böbrekler, deri, göz, kalp, karaciğer, dalak ve beyin zarıdır [Yıldız, 2008]. Bazı Candida türleri, bazı klinik sendromlar ile ilişkili bulunmuştur. Örneğin C.albicans ve C.tropicalisin lösemili, C.krusei ve K.lusitaniaenin kemik iliği transplantasyonlu hastalarda daha sık enfeksiyon oluşturduğu gösterilmiştir. Son yıllarda, C.albicans dışındaki diğer Candida türlerinin hastalık etkeni olarak giderek artan sayıda saptandıkları (%46) ve izolatların %25 i C.tropicalis, %8 i C.glabrata, %7 si C.parapsilopsis ve %42 si C.krusei olarak belirlenmiştir. C.lusitaniaenin amfoterisin B ye dirençli ve genellikle düşük virülanslı olduğu belirlenmiştir.

109 74 C.albicans dışındaki Candida türlerinin son 10 yılda artan insidabsının geniş etki alanlı antibiyotik, steroid ve antikarsinojen ilaçların yaygın kullanımı, immunsupressif hasta gruplarının artması, organ transplantasyonları, protez cihazların implantasyonu, kateterizasyon ve fazla flukonazol kullanımı ile ilişkili olduğu belirtilmiştir [Yıldız, 2008] Kandidalarda biyofilm yapısı Tıbbi gereçlerin fungal enfeksiyonları çoğunlukla patojenik Candida türleri, özellikle Candida albicans, Candida tropicalis ve Candida parapsilosis ile olmaktadır. Enfeksiyon patogenezinden Candida ların virülans faktörlerinden biri olan tıbbi gereçlerin yüzeyinde biyofilm olusturması sorumlu tutulmaktadır. Candida biyofilm yapısı yüksek oranda biyofilmin olustuğu ortamın sartlarına (yüzey yapısı, ortamdaki glukoz miktarı gibi), Candida morfogenezine ve Candida türüne bağlıdır. Nonalbicans Candida türleri K. albikansa kıyasla daha az biyofilm olustururlar. Candida biyofilminin antifungal direnç göstermesi enfeksiyonların patogenezi açısından önemli bir özelliktir. Direnç gelisiminin muhtemel mekanizmaları: Ekstrasellüler matriks miktarı, yavas üreme hızı ve besin kısıtlanması, membran lokalize atılım pompalarının fazla ekspresyonu (MDR1, CDR1 ve CDR2 genleri) ve biyofilmdeki sterol miktarı olarak belirlenmistir. Candida biyofilminin saptandığı ve enfeksiyonlara yol açabildiği baslıca tıbbi gereçler: Santral venöz kataterler, üriner kataterler, eklem protezleri, arteriyovenöz fistül veya greftler, periton diyaliz kataterleri, yapay kalp kapakçıkları, pacemaker, kardiyoverter defibrilatörler, ventrikül yardımcı aygıt ve ventriküloperitoneal şanttır. C. albicans biyofilm olusumunu incelemek için bazı model sistemler gelistirilmistir. Bu sistemlerde organizmaların önce kateter veya protez materyali gibi yüzeylere adezyonu sağlanmış sonra besiyerinde inkübe edilmislerdir. Bu sekilde oluşturulan C. albicans biyofilmleri tipik olarak yüzeye adhere maya formundaki hücrelerin katmanından ve bunun üzerinde genis bir ekzopolimerik matriks ile çevrili hifal formdaki filamentöz hücre katmanından oluşmaktadır. C. albicans biyofilm matriksi izole edilip, içeriği serbest (planktonik) hücreler tarafından olusturulan ekstrasellüler

110 75 matriks (ESM) ile karsılastırılmıstır. Her ikisinin de karbonhidrat, protein, fosfor ve hekzosamin içermekte olduğu fakat matriksin daha az karbonhidrat (%41) ve protein (%5) içerdiği saptanmıstır. Ayrıca mannozdan daha fazla glukoz (%16) ve galaktoz içerdiği de saptanmıstır. C. albicans biyofilmlerinin ayırıcı özelliği farklı morfolojik formların bir arada bulunmasıdır. C. albicans biyofilm olusumu 3 safhada gerçeklesmektedir: Erken faz (0-11 saat), ara faz (12-30 saat) ve olgun faz (38-72 saat). Biyofilmdeki karbonhidrat miktarının erken fazdan olgun faza doğru arttığı ve olgun fazda karbonhidrattan zengin bir ESM olduğu saptanmıstır. Daha detaylı incelemede, kateter materyalinden hazırlanan intravasküler disklerin yüzeyinde deneysel biyofilm olusturulmus ve scanning elektron mikroskobunda maya hücrelerinin adezyonunun 3-6 saat sonrasında germ tüp oluşumu ve 48 saatlik inkübasyon sonrası ise yoğun maya, hif ve yalancı hif ağından olusan tam olgun biyofilm olusumu gözlenmistir. Organizmanın aynı besiyerinin sıvı veya agar formunda (glikozlu yeast nitrojen base) üretildiğinde hifal formları olusturmaması, morfogenezin plastik polivinilklorid (PVC) yüzeylere temas ile indüklendiğini ve bazal hücre katmanının biyofilm yapısmasında önemli rol oynadığını göstermektedir. Biyofilm olusumunda rol oynayan faktörlerden biri de Candida morfogenezidir. Bir çalısmada, ilginç olarak morfogenetik sinyal yolunda rol alan Efg1p ve Cph1p transkripsiyon faktörlerini içermeyen ve filamentöz forma geçiste defekti olan C. albicans mutantlarının poliüretan kateterlerde daha zayıf kolonize oldukları gösterilmistir. Aynı sekilde, Efg1 geni eksik filamentasyon mutantlarının in vitro plastik yüzeylerde sadece tek katlı gevsek bir maya hücresi tabakası olusturduğu gösterilmistir. Bu sonuçlar, biyofilm oluşumunda Efg1p sinyal yolunun önemini göstermektedir. Biyofilm olusumunda morfogenezin rolünü inceleyen baska bir çalısmada, wild-type (sokak susu) mutantının iki katmanlı biyofilm, hif-negatif mutantın sadece bir bazal tabaka, maya-negatif mutantın kateter diskinden kolayca ayrılabilen sadece dıs katmanı olusturduğu gözlenmiştir. Bu sonuçlar, biyofilm olusumunda ve yapılanmasında dimorfizmin gerekli olabileceğini ve C. albicans ın patojenik potansiyelinde önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Yüzeyin kimyasal yapısının biyofilm oluşum hızını etkilemektedir; PVC ye kıyasla lateks yüzeylerde daha fazla, poliüretan ve %100 silikonda ise azalmıs olarak saptanmıştır. Selüloz filtrelerde olusan Candida biyofilm yapısı kateter disklerinden farklıdır. Bu

111 76 da yüzey temasıyla indüklenen gen ekspresyonunu akla getirmektedir. Yüzeyin hidrofobisitesi de biyofilm oluşumunu pozitif etkilemektedir. Silikon elastomer veya PVC disklerinin hidrofobik yüzeylerinde bifazik yapıda; bazal tabakada maya hücreleri ve bu tabaka üzerinde ESM içerisinde hifal elementlerin sıralandığı, buna rağmen düzensiz veya pürüzlü polymethylmethacrylate yüzeylerde olgun biyofilmin sadece maya hücreleri ve ESM den olustuğu gözlenmiştir. Ortamdaki artmıs glukoz miktarı da biyofilm olusumunu hızlandırır. Fungal biyofilmin yapısı Candida türüne göre de farklılık gösterebilmektedir. C. parapsilosis, C. kefyr, C. glabratanın PVC disklerinde, K. albikansın patojenik türlerine göre daha az biyofilm olusturduğu gözlenmiştir [Özcan, 2007].

112 77 3. MATERYAL METOT 3.1. Materyal Materyal örnekleri Araştırmada Eylül 2008 Şubat 2009 tarihleri arasında Ankara daki çeşitli hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından, yatan veya muayene edilen, yetişkin ve çocuk hastaların kültür örnekleri temin edilmiştir. İdrar, kan, balgam, pü, yara, trakeal aspirat, doku kültürü, konjunktival sürüntü, kateter içi kan, burun sürüntüsü, abse ve periton sıvısı olmak üzere toplam 100 adet klinik örnek kültüründen Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus ve Candida türleri izole edilmiştir. Pseudomonas bakterilerinin genel toplamı 10 tane, Klebsiella bakterilerinin genel toplamı 20, Staphylococcus bakterilerinin genel toplamı 55 tanedir. Candida izolatlarının genel toplamı ise 15 tanedir. Pseudomonas izolatları ve Klebsiella izolatları biyokimyasal testler ve Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) ile tiplendirilmiştir. Staphylococcus izolatları biyokimyasal testler ve BBL Crystal Gram-Positive ID Kit ile tiplendirilmiştir. Candida izolatları ise biyokimyasal testler ve RapID YEAST PLUS System ile tiplendirilmiştir Örneklerin toplanması Araştırmada A, B, C ve D hastanelerinin mikrobiyoloji laboratuvarlarından toplam 100 adet hasta kültür materyali temin edilmiştir. 31 kan kültürü, 16 yara kültürü, 28 idrar kültürü, 4 trakeal aspirat kültürü, 3 konjunktival sürüntü kültürü, 1 kateter içi kan kültürü, 1 doku kültürü, 1 burun sürüntü kültürü, 4 püy kültürü, 1 abse kültürü, 1 periton sıvısı kültürü, 3 derin trakeal aspirat kültürü, 2 balgam kültürü, 1 kist sıvısı kültürü, 1 göğüs tüpü kültürü, 1 vajen kültürü,1 cilt sürüntüsü ve 1 göz sürüntü kültürü temin edilmiştir. Bu kültürlerin temin edildiği hastanelere göre dağılımı Çizelge 3.1 de gösterilmiştir.

113 78 Çizelge 3.1. Ankara da bulunan çeşitli hastanelerden toplanan örneklerin dağılımı Klinik kültür materyali klinik izolatların toplandığı hastane toplam A B C D kan yara idrar trakeal aspirat konjunktival sürüntü kateter içi kan doku kültürü burun sürüntüsü püy abse periton sıvısı derin trakeal aspirat balgam kist sıvısı göğüs tüpü vajen sıvısı göz cilt sürüntüsü toplam Metot Çalışma, Ankara da bulunan çeşitli hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından temin edilen kültür örneklerinden izole edilen Pseudomonas cinsine ait Pseudomonas aeruginosa ve Pseudomonas fluorescens suşları, Klebsiella cinsine ait Klebsiela pneumonia ve Klebsiella ozaena şuşları, Staphylococcus cinsine ait Staphylococcus aeureus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus vitulus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus warneri, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus hominis ve Staphylococcus lugdunensis izolatları ve Candida cinsine ait Candida albicans, Candida tropicalis ve Candida glabrata izolatları ile yürütülmüştür. Mikroorganizmaların izolasyonu ve identifikasyonu Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Anabilim Dalı bünyesindeki Mikrobiyoloji Laboratuvarında

114 79 yapılmıştır. İzole edilen mikroorganizmaların Slime Faktör varlığı ve Biyofilm oluşturma özellikleri araştırılmıştır Klinik Örneklerin, Çalışılmak Üzere Laboratuvara Getirilmesi Çalışmada, hastaneden örneklerin temini sırasında Pseudomonas bakterileri için Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve MacConkey Agar Base (Oxoid CM 0007) kullanılmıştır. Klebsiella bakterilerinin hastaneden temini için Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve MacConkey Agar Base (Oxoid CM 0007) kullanılmıştır. Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve MacConkey Agar Base (Oxoid CM 0007) besiyerinin kullanılmasının sebebi, bu besiyerinin Gr (-) bakterilerin izolasyonu ve üretilmesi için selektif özellik taşımasıdır. Staphylococcus bakterilerinin temini için Nutrient Agar(Oxoid CM0003) ve Koyun Kanlı Agar kullanılmıştır. Nutrient Agar(Oxoid CM0003) besiyerinin kullanımının sebebi, bu besiyerinde üreyen Staphylococcus bakterilerin pigment oluşturma özelliklerin değerlendirilebilmesidir. Koyun Kanlı Agar kullanımının sebebi ise Staphylococcus bakterilerinin hemolitik aktivitelerinin varlığını değerlendirmek içindir. Mayaların temini için Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) kullanılmıştır. Bu besiyerinin kullanım sebebi, besiyeri bileşimindeki Siklohegzimid ve Kloramfenikol sayesinde kontamine materyalden maya ve benzeri mikrooganizmaların seçilmesini sağlamaktır. Örnekler, steril koşullarda Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji ABD bünyesindeki Mikrobiyoloji Laboratuvarına getirilmiştir.

115 80 Toplam 100 hasta kültür materyalinden 10 Pseudomonas, 20 Klebsiella, 55 Staphylococcus ve 15 Candida izole edilmiştir. İzolatların adlandırılması için biyokimyasal testler ve ticari kullanımda olan hızlı identifikasyon sistemleri kullanılmıştır. Tür seviyesinde adlandırılması yapılan bu izolatlarda Biyofilm varlığı ve Slime Faktör oluşturma özelliği araştırılmıştır Klinik Kültür Materyallerinden Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus ve Candida ların İzolasyonu Hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından steril koşullarda laboratuvara getirilen Pseudomonas bakterileri Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve MacConkey Agar Base (Oxoid CM 0007) da 37 o C de 24 saat süre boyunca inkübasyona bırakılmıştır. Bu besiyerlerinde Pseudomonas olduğu düşünülen koloniler Pseudomonas Agar Base ( Oxoid CM0559) besiyerine tek koloni ekim yapılmış ve 37 o C de 24 saat süre boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda Pseudomonas Agar ( Oxoid CM0559) da parlak yeşil kolonilerin Pseudomonas olarak değerlendirilmiştir ( Resim 3.1. ). Bu kolonilere Gram boyama ve identifikasyon testleri yapılmıştır. Resim 3.1. Pseudomonas bakterisinin Pseudomonas Agar ( Oxoid CM0559) da görünümü (A) Normal ışık altında görünümü (B) UV ışık altında görünümü. Hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından steril şartlarda laboratuvara getirilen Klebsiella bakterileri,eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve MacConkey

116 81 Agar Base (Oxoid CM 0007) de 37 o C de 24 saat süre boyunca inkübasyona bırakılmıştır. Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve MacConkey Agar Base (Oxoid CM 0007) besiyerlerinde büyük, akıcı, mukoid, S tipindeki koloniler Klebsiella olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.2.). Gram boyama yapıldıktan sonra identifikasyon testlerine alınmıştır. Resim 3.2. Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) da Klebsiella koloni lerinin görünümü (Suş no. 4) Hastaneden temin edilip steril şartlarda laboratuvara getirilen Staphylococcus bakterileri Nutrient Agar (Oxoid CM0003) ve Koyun Kanlı Agar da 37 o C de saat süre boyunca inkübasyona bırakılmıştır. Koyun Kanlı Agar da krem-kahverengi, beyaz, sarı-portakal rengi pigmentli veya pigmentsiz, düzgün, parlak, hafif konveks, kabarık ve opak görünümlü kolonilerin Staphylococcus olduğu düşünülmüştür (Resim 3.3.) Bu kolonilere tekrar Gram boyama yapılmış ve identifikasyon testleri uygulanmıştır.

117 82 Resim 3.3. Koyun Kanlı Agar da Staphylococcus kolonilerinin görünümü (Suş No. 7) Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) kullanılarak steril koşullarda laboratuvara getirilen Candida lar ise 25 O C de saat süre boyunca inkübasyona bırakılmıştır Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) da krem rengi, beyaz, yuvarlak, düzgün kenarlı koloniler, Candida olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.4.). Bu kolonilere metilen mavisi ile boyama ve Gram boyama yapılmış, sonuçlar doğrultusunda identifikasyon testlerine alınmıştır. Resim 3.4. Candida türlerinin Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) da görünümü (Suş No. 4)

118 Klinik Örneklerden İzole Edilen Mikroorganizmaların İdentifikasyonu Pseudomonas şüpheli kolonilere uygulanan identifikasyon testleri Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve Pseudomonas Agar ( Oxoid CM0559) da üretilen Pseudomonas bakterilerinin, rutin klinik çalışmalarda sıklıkla izole edilen diğer non-fermentatif, oksidaz pozitif bakterilerden (Alcaligenes xylosus, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei) ayrımı için biyokimyasal testler yapılmıştır. Bu amaçla, kolonilere katalaz, arjinin dekarboksilaz, lizin dekarboksilaz, üreaz, indol ve nitrat redüksiyonu testleri uygulanmıştır. Test sonuçlarının değerlendirilmesi Tablo 3 e göre yapılmıştır. Çizelge 3.2. Bazı Pseudomonas türlerinin non-fermetatif ve oksidaz pozitif bakteriler den ayrımı (Murray 2003) nitrat Organizma katalaz arjinin dekarboksilaz lizin dekarboksilaz üreaz indol redüksiyonu Alcaligenes xylosus (+) (-) (-) (-) (-) v Pseudomonas aeruginosa (+) (+) (-) v (-) (+) Pseudomonas fluorescens (+) (+) (-) v (-) v Burkholderia cepacia (+) (-) (-) v (-) v Burkholderia pseudomallei (+) (+) (-) v (-) (+) Biyokimyasal testlerin sonuçlarından elde edilen veriler doğrultusunda Pseudomonas cinsine ait olduğu düşünülen bakterilere, oksidaz, 42 O C de üreme, +4 O C de üreme, jelatin hidrolizi, nitrattan gaz oluşumu, pigment oluşumu, ornitin dekarboksilaz, sitrat ve oksidasyon/fermentasyon testleri uygulanmıştır. Bu testlerin yanı sıra Gram boyama yapılmış ve katı besiyerinde koloni morfolojileri de değerlendirilmiştir. Ayrıca Pseudomonas F Agar (Difco ) ve Pseudomonas P Agar (Difco ) besiyerlerinde kolonilerin pigment oluşturma özellikleri de değerlendirmeye alınmıştır.

119 84 Çizelge 3.3. İzole edilen Pseudomonas türlerine uygulanan biyokimyasal testler Test P.aeruginosa P.fluorescens Oksidaz + + Üreme 42 0 C C - + Nitrattan gaz oluşumu + - Pyoverdin + + Ornitin dekarboksilaz - - Hidroliz: Jelatin + + Asit Oluşumu Glukoz + + Fruktoz Vy. Vy Ksiloz + + Laktoz - - Sukroz - - Maltoz - - Mannitol + + Sitrat + + Yapılan biyokimyasal testler doğrultusunda elde edilen verilere dayanarak izole edilen türlerin Pseudomonas aeruginosa ve Pseudomonas florescens olduğu düşünülmüştür. İdentifikasyon işlemine Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) ticari kiti kullanılarak devam edilmiştir Pseudomonas İzolatlarının Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması Biyokimyasal testlerle adlandırılması yapılan Pseudomonas izolatlarının tür seviyesinde adlandırılması için 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) kullanılmıştır. Bu kit, Lizin dekarboksilaz, ornitin dekarboksilaz, H 2 S oluşumu, karbonhidrat fermentasyonu (Glukoz, mannitol, ksiloz, inositol, sorbitol, sorbitol, ramnoz, sükroz, laktoz, arabinoz, adonitol, rafinoz, salisin, arjinin), o- nitrofenil-β-d-galaktopiranosid (ONPG) hidrolizi, indol, üreaz, voges proskauer, sitrat, triptofan deaminaz (TDA) üretimi, jelatin hidrolizi, malonat inhibisyonu ve nitrat redüksiyonu testlerinde oluşmuştur. Bu test sisteminin içeriği Tablo 5 te gösterilmiştir.

120 85 Çizelge 3.4. Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) içerdiği testlerin prensipleri reaksiyon renkleri kuyu no isim reaksiyon prensibi negatif pozitif 1 Lizin lizin dekarboksilaz sarı mavi-yeşil 2 Ornitin ornitin dekarboksilaz yeşil-sarı mavi-yeşil saman 3 H2S H2S oluşumu sarısı siyah 4 Glokuz glukoz fermentasyonu mavi-yeşil sarı 5 Manitol mannitol fermentasyonu mavi-yeşil sarı 6 Ksiloz ksiloz fermentasyonu mavi-yeşil sarı 7 ONPG o-nitrofenil-β-galaktopranoz hidrolizi renksiz sarı 8 İndol triptofandan indol üretimi renksiz pembekırmızı 9 Üreaz üre hidrolizi saman sarısı pembekırmızı 10 VP Asetoin üretimi(voges proskauer) saman sarısı pembekırmızı 11 Sitrat tek karbon kaynağı olarak sitrat kullanımı yeşil mavi triptofan deaminasyonu ile indol pirüvat saman vişne 12 TDA üretimi sarısı kırmızısı 13 Jelatin jelatin likafaksiyonu renksiz siyah 14 Malonat malonat inhibisyonu yeşil mavi 15 İnositol İnositol fermentasyonu mavi-yeşil sarı 16 Sorbitol sorbitol fermentasyonu mavi-yeşil sarı 17 Ramnoz ramnoz fermentasyonu mavi-yeşil sarı 18 Sükroz sükroz fermentasyonu mavi-yeşil sarı 19 Laktoz laktoz fermentasyonu mavi-yeşil sarı 20 Arabinoz arabinoz fermentasyonu mavi-yeşil sarı 21 Adonitol adonitol fermentasyonu mavi-yeşil sarı 22 Rafinoz rafinoz fermentasyonu mavi-yeşil sarı 23 Salisin salisin fermentasyonu mavi-yeşil sarı 24 Arjinin arjinin dihidrolaz 24 saat sarı mavi-yeşil 48saat sarı-yeşil mavi

121 86 Resim 3.5. Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) panelin görünümü 3.7. İzole Edilen Pseudomonas Bakterilerin Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) Uygulanması Bu test için, saatlik Pseudomonas kültürleri kullanılmıştır. Mikroorganizmalardaki oksidaz enzimi varlığının tespiti için kit içinden çıkan Oksidaz Test Strip ler kullanıldı. İzolatlardan 1-3 koloni seçilip 5 ml steril tuzlu su solüsyonu içine inoküle edilmiş ve vortex yardımıyla homojenize edilip McFarland 0,5 bulanıklığa ayarlanmıştır. Bakteri süspansiyonundan, identifikasyon paneli üzerindeki kuyucuklara 100µl konur ve 35 O C de 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda test panelleri inkübatörden çıkarılmıştır. İndol testi kuyucuğuna 2 damla Kovac s ayracı damlatılmış ve 2 dakika içinde sonuç okunmuştur. Kuyucukta pembe-kırmızı halka oluşumunun gözlenmesi pozitif olarak değerlendirilmiştir. Voges-proskauer testi kuyucuğuna 1 damla VPI ve VPII ayraçlarından damlatılmıştır dakika içinde sonuçlar okunmuştur. Pembe-kırmızı renk oluşumu pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir. Renk değişimi olmaması ise negatif sonuç olarak değerlendirilmiştir.

122 87 Triptofan deaminaz üretimi testi kuyucuğuna 1 damla TDA ayracı damlatılmış ve sonuç okunmuştur. Arjinin testi için, 48 saatlik inkübasyon sonunda mavi renk oluşumu pozitif olarak, sarı-yeşil renk olarak oluşumunu gözlenmesi ise negatif sonuç olarak değerlendirilmiştir. Nitrat redüksiyon testi ONPG test sonucu okunduktan sonra aynı kuyucuğa 1 damla Nitrat A ve 1 damla Nitrat B ayraçları damlatılarak yapılmıştır. Kırmızı renk oluşumu nitratta nitrit oluşumunun göstergesi olarak değerlendirilmiştir. Bir miktar toz çinkonun bu kuyucuğa eklenmesi ile yeşil renk oluşumunun gözlenmesi nitrojen gazı üretiminin göstergesi olarak değerlendirilmiştir Klebsiella Şüpheli Kolonilere Uygulanan İdentifikasyon Testleri Eosine Methylene Blue Agar (Oxoid CM0069) ve MacConkey Agar Base (Oxoid CM 0007) de üretilen Klebsiella bakterilerinin, rutin çalışmalarda klinik örneklerden sıklıkla izole edilen diğer Enterobacteriaceae familyası üyelerinden ayrımı için biyokimyasal testler yapılmıştır. Bu amaçla, indol, metil-red, voges-proskauer, sitrat ve üreaz testleri uygulanmıştır. Test sonuçlarının değerlendirilmesi Çizelge 3.7 de göre yapılmıştır. Çizelge 3.5. İzole edilen Klebsiella ssp. türleri ve diğer Enterobacteriaceae familyası üyelerin ayrımı için uygulanan testler Türler Testler indol metil-red voges proskauer sitrat üreaz Citrobacter freundii d d (-) d d Enterobacter aerogenes (-) (-) (+) (+) (-) Enterobacter cloacae (-) (-) (+) (+) d Escherihia coli (+) (+) (-) (-) (-) Klebsiella pneumonia (-) d (+) (+) (+) Klebsiella ozaena (-) (+) (-) (-) (-) Proteus mirabilis (-) (+) d d (+) Proteus vulgaris (+) (+) (-) d (+) Salmonella ssp. (-) (+) (-) (+) (-) Shigella sonnei (-) (+) (-) (-) (-)

123 88 Biyokimyasal testlerin sonuçlarından elde edilen veriler doğrultusunda Klebsiella cinsine ait olduğu düşünülen bakterilere, indol, metil red, voges proskauer, sitrat, üreaz, malonat kullanımı, hidrojen sülfit oluşumu, lizin dekarboksilaz, ornitin dekarboksilaz, arjinin dihidrolaz, hareket, jelatin, karbonhirat fermentasyonu testleri uygulanmıştır. Bu testlerin yanı sıra Gram boyama yapılmış ve katı besiyerinde koloni morfolojileri de değerlendirilmiştir. Çizelge 3.6. İzole edilen Klebsiella türlerine uygulanan biyokimyasal testler Testler K.pneumoniae K.ozaena indol - - metil red - + voges proskauer + - sitrat + - üreaz + - malonat kullanımı + - hidrojen sülfit oluşumu - - lizin dekarboksilaz + - ornitin dekarboksilaz - - arjinin dihidrolaz - - hareket - - jelatin hidrolizi - - karbonhidrat fermentasyonu D-glukozdan asit + + D-glukozdan gaz + + laktoz + - sükroz + - Yapılan biyokimyasal testler doğrultusunda elde edilen verilere dayanarak izole edilen türlerin Klebsiella pneumoniae ve Klebsiella ozaena olduğu düşünülmüştür. İdentifikasyon işlemine Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) ticari kiti kullanılarak devam edilmiştir Klebsiella izolatlarının Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması Biyokimyasal testlerle adlandırılması yapılan Klebsiella izolatlarının tür seviyesinde adlandırılması için 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) kullanıldı. Bu kit, Lizin dekarboksilaz, ornitin dekarboksilaz, H 2 S oluşumu,

124 89 karbonhidrat fermentasyonu (Glukoz, mannitol, ksiloz, inositol, sorbitol, sorbitol, ramnoz, sükroz, laktoz, arabinoz, adonitol, rafinoz, salisin, arjinin), o-nitrofenil-β-dgalaktopiranosid (ONPG) hidrolizi, indol, üreaz, voges proskauer, sitrat, triptofan deaminaz (TDA) üretimi, jelatin hidrolizi, malonat inhibisyonu ve nitrat redüksiyonu testlerinde oluşmuştur. Bu test sisteminin içeriği Tablo 3.6 da gösterilmiştir İzole Edilen Klebsiella Bakterilerin Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) Uygulanması Bu test için, saatlik Klebsiella kültürleri kullanılmıştır. Mikroorganizmalardaki oksidaz enzimi varlığının tespiti için kit içinden çıkan Oksidaz Test Strip ler kullanıldı. İzolatlardan 1-3 koloni seçilip 5 ml steril tuzlu su solüsyonu içine inoküle edilmiş ve vortex yardımıyla homojenize edilip McFarland 0,5 bulanıklığa ayarlanmıştır. Bakteri süspansiyonundan, identifikasyon paneli üzerindeki kuyucuklara 100µl konur ve 35 O C de 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda test panelleri inkübatörden çıkarılmıştır. İndol testi kuyucuğuna 2 damla Kovac s ayracı damlatılmış ve 2 dakika içinde sonuç okunmuştur. Kuyucukta pembe-kırmızı halka oluşumunun gözlenmesi pozitif olarak değerlendirilmiştir. Voges-proskauer testi kuyucuğuna 1 damla VPI ve VPII ayraçlarından damlatılmıştır dakika içinde sonuçlar okunmuştur. Pembe-kırmızı renk oluşumu pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir. Renk değişimi olmaması ise negatif sonuç olarak değerlendirilmiştir. Triptofan deaminaz üretimi testi kuyucuğuna 1 damla TDA ayracı damlatılmış ve sonuç okunmuştur. Arjinin testi için, 48 saatlik inkübasyon sonunda mavi renk oluşumu pozitif olarak, sarı-yeşil renk olarak oluşumunu gözlenmesi ise negatif sonuç olarak değerlendirilmiştir.

125 90 Nitrat redüksiyon testi ONPG test sonucu okunduktan sonra aynı kuyucuğa 1 damla Nitrat A ve 1 damla Nitrat B ayraçları damlatılarak yapılmıştır. Kırmızı renk oluşumu nitratta nitrit oluşumunun göstergesi olarak değerlendirilmiştir. Bir miktar toz çinkonun bu kuyucuğa eklenmesi ile yeşil renk oluşumunun gözlenmesi nitrojen gazı üretiminin göstergesi olarak değerlendirilmiştir Staphylococcus Şüpheli Kolonilere Uygulanan İdentifikasyon Testleri Koyun Kanlı Agar ve Nutrient Agar (Oxoid CM0003) da üretilen Staphylococcus olduğu düşünülen kolonilere Gram boyama yapılmıştır. Gram boyama sonucu yapılan mikroskobik incelemede Gr(+) kok morfolojisinde görülen bakterileri, rutin çalışmalarda klinik örneklerden sıklıkla izole edilen Gr(+) kok morfolojisindeki diğer bakterilerden (Enterococcus, Streptococcus ve Micrococcus) ayırt etmek için Katalaz testi uygulanmıştır. Katalaz pozitif özelliğindeki kolonilerin Staphylococcus veya Micrococcus olabileceği düşünülüp ayrım testlerine bu yönde devam edilmiştir. Öncelikle bu kolonilere oksidaz testi uygulanmıştır. Oksidaz negatif olan koloniler seçilmiş ve %6,5 NaCl içeren Nurtient Agar a ekim yapılmıştır. %6,5 NaCl içeren Nutrient Agar (Oxoid CM0003) da üreyebilen kolonilerin Staphylococcus olduğu düşünülerek identifikasyon testlerine bu yönde devam edilmiştir.

126 91 Gram Boyama Gram (+) Kok Katalaz (+) (-) Staphylococcus Micrococcus Streptococcus Enterococcus Oksidaz (-) (+) %6,5 NaCl de üreme %6,5 NaCl de üreme (+) (-) Staphylococccus Micrococcus Şekil 3.1. Staphylococcus ların, rutin çalışmalarda klinik örneklerden sıklıkla izole edilen diğer Gr(+) koklardan ayrımı için uygulanan testler Biyokimyasal testlerin sonuçlarından elde edilen veriler doğrultusunda Staphylococcus cinsine ait olduğu düşünülen bakterilere koloni pigmentasyonu, koagülaz, ısıya dirençli nükleaz, hemolizin, oksidaz, ornitin dekarboksilaz, üreaz, nitrat redüksiyonu, novobiocin direnci, polimiksin B direnci, karbonhidratlardan asit üretimi testleri uygulanmıştır. Bu testlerin yanı sıra Gram boyama yapılmış ve katı besiyerinde koloni morfolojileri de değerlendirilmiştir. Çizelge 3.7. İzole edilen Staphylococcus türlerine uygulanan biyokimyasal testler türler koloni pimentasyonu kolagülaz ısıya dirençli nükleaz S.aureus subsp.aureus d S.epidermidis d - (d) S.capitis subsp.capitis (d) d - - S.warneri d - - (d) d - - S.hominis subsp.hominis d d - - S.lugdunensis d - - (+) - + d + - d S.saprophyticus d hemolizin oksidaz ornitin dekarboksilaz üreaz nitrat redüksiyonu novobiosin direnci polimiksin B direnci

127 92 Çizelge 3.7. (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerine uygulanan biyokimyasal testler S.cohnii subsp.cohnii (d) S.cohnii subsp. urealyticus d - - (d) S.intermedius d S.vitulus ND Yapılan biyokimyasal testler doğrultusunda elde edilen verilere dayanarak izole edilen türlerin Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus intermedius ve Staphylococcus vitulus olduğu düşünülmüştür. İdentifikasyon işlemine Microbact 24E Gram-Negative İdentification System (Oxoid MB 1131) ticari kiti kullanılarak devam edilmiştir Staphylococcus izolatlarının BBL Crystal Identification System Gram- Positive ID Kit Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması Biyokimyasal testlerle adlandırılması yapılan Staphylococcus izolatlarının tür seviyesinde adlandırılması BBL Crystal Identification System Gram-Positive ID Kit kullanıldı (Resim 3.6). Bu kit, mikroorganizmaların çeşitli enzimatik hidroliz aktiviteleri, trealoz, laktoz, sükroz, mannitol, maltotrioz, arabinoz, fruktoz karbonhidratlarını kullanımı, üreaz enzimi varlığını, eskülin hidrolizini, arjinin kullanımı ve beta-galaktozidaz enzim varlığını belirleyen testlerden oluşan bir identifikasyon sistemidir. Çizelge 3.8. BBL İdentifikasyon Sisteminin İçerdiği Testlerin Prensipleri panel konumu substrat kod pozitif negatif 4A floresans negatif kontrol FCT n/a n/a 2A 4MU-α-D-glukozid FGC mavi floresans mavi floresans 1A L-valin FVA mavi floresans mavi floresans 4B L-fenilalanin FPH mavi floresans mavi floresans 2B 4MU-α-D-glukozid FGS mavi floresans mavi floresans

128 93 Çizelge 3.8. (Devam) BBL İdentifikasyon Sisteminin İçerdiği Testlerin Prensipleri 1B L-pyroglutamik asit AMC FPY mavi floresans mavi floresans 4C L-triptofan FTR mavi floresans mavi floresans 2C L-arjinin FAR mavi floresans mavi floresans 1C 4MU-N-asetil-β-D-glukozamid FGA mavi floresans mavi floresans 4D 4MU-fosfat FHO mavi floresans mavi floresans 2D 4MU-β-D-glukuronid FGN mavi floresans mavi floresans 1D L-izolösin FIS mavi floresans mavi floresans 4E Trealoz TRE altın-sarı turuncu-sarı 2E Laktoz LAC altın-sarı turuncu-sarı 1E metil-α & β glukozid MAB altın-sarı turuncu-sarı 4F Sükroz SUC altın-sarı turuncu-sarı 2F Mannitol MNT altın-sarı turuncu-sarı 4G Arabinoz ARA altın-sarı turuncu-sarı 1F Maltotrioz MTT altın-sarı turuncu-sarı 2G Gliserol GLR altın-sarı turuncu-sarı 1G Fruktoz FRU altın-sarı turuncu-sarı 4H p-nitrofenil-β-d-glukozid BGL sarı renksiz 2H p-nitrofenil-β-d-sellobiyoz PCE sarı renksiz 1H prolin&lösin-p-nitroanilid PLN sarı renksiz 4I p-nitrofenil-fosfat PHO sarı renksiz 2I p-nitrofenil-α-d-maltotroz PAM sarı renksiz 1I o-nitrofenil-β-d-galaktozid(onpg) PGO sarı renksiz 4J Üre URE mavi sarı-yeşil 2J Eskülin ESC kahve-bordo bronz-parlak 1J Arjinin ARG mor-eflatun sarı-gri

129 94 A Resim 3.6. BBL Crystal Identification System Gram-Positive ID Kit panelin görünümü (A) Panel viewer görünümü, (B) normal ışık görünümü B Staphylococcus Bakterilerinin Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin BBL Crystal Gram-Positive ID Kit Uygulanması Bu test için Staphylococcus izolatları BBL Typticase Soy Agar with %5 Sheep Blood (BD BBL ) besiyerinde üretilmiştir. Typticase Soy Agar with %5 Sheep Blood Bileşimi g/l Pancreatic Digest of Gelatin 14,5 Papaic Digest of Soybean Meal 5,0 Sodium Chloride 5,0 Agar 14,0 Growth Factors 1,5 Defibrinated Sheep Blood % saatlik kültürler kullanıldı. Bu kültürlerden alınan koloniler İnoculum Broth içine imoküle edilip 0,5 McFarland bulanıklık olacak şekilde ayarlanmıştır. Vortex

130 95 yardımıyla iyice homojenize edilen süspansiyonlar, BBL Crstal Base paneline boşaltılmış ve tüm kuyucukların süspansiyonla dolması sağlanmıştır. BBL Crystal GP ID Panel kapakları kapatılmıştır. Paneller ters çevrilerek O C de saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda paneller BBL Crystal Panel Viewer cihazı kullanılarak ve BBL Crystal Gram-Positive Identification Color Chart tablosu yardımıyla okunmuş ve sonuçlar değerlendirilmiştir. Değerlendirme sonuçları bilgisayar ortamında, BBL Crystal Identication System programına aktarılarak tür tanımlaması yapılmıştır Candida Şüpheli Kolonilere Uygulanan İdentifikasyon Testleri Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) da üretilen Candida olduğu düşünülen kolonilere Gram boyama ve metilen mavisi ile boyama yapılmıştır. Gram boyama sonucu yapılan mikroskobik incelemede Gr(+)görülen ve metilen mavisi ile boyamada koyu mavi-lacivert renkte görünen maya hücrelerine germ tüp oluşumu testi, cornmeal-tween 80 agar da klamidospor oluşumunun değerlendirilmesi, karbonhidrat fermentasyon testi, karbonhidrat asimilasyon testi, üreaz testi, nitrat testi, askospor testi, cornmeal-tween 80 agar da hif yapısının değerlendirilmesi testleri yapılmıştır. Çizelge 3.9.İzole edilen Candida türlerine uygulanan biyokimyasal testler Türler Yalancı ve ya gerçek hif Klamidospor Germ tüpleri Glikoz Şeker Asimilasyonu Maltoz Sükroz Laktoz Galaktoz Ksiloz Rafinoz Glikoz Fermentasyon Maltoz Sükroz Laktoz Galaktoz Üreaz Askospor C. albicans C.glabrata C.tropicalis

131 96 Yapılan biyokimyasal testler doğrultusunda elde edilen verilere dayanarak izole edilen türlerin Candida albicans, Candida glabrata ve Candida tropicalis olduğu düşünülmüştür. İdentifikasyon işlemine RapID YEAST PLUS System ticari kiti kullanılarak devam edilmiştir Candida İzolatlarının RapID YEAST PLUS System Kullanılarak Tür Seviyesinde Adlandırılması Biyokimyasal testlerle cins seviyesinde adlandırılması yapılan Candida izolatlarının tür seviyesinde adlandırılması için RapID YEAST PLUS System kullanılmıştır (Resim 3.7.) Bu hızlı identifikasyon sistemi, Karbonhidrat kullanımı testleri (Glukoz, Maltoz, Sükroz, Trealoz, Raffinoz), Yağ asidi esteri hidrolizi testi, p-nitrofenil-nasetil-β,d-galaktozamid; p-nitrofenil-α,d-glukozid; p-nitrofenil-β,d-glukozid; o- nitrofenil-β,d-galaktozid, p-nitrofenil-α,d-galaktozid, p-nitrofenil- β,d-fukozid, p- nitrofenil fosfat, p-nitrofenil fosforilkolin, üre, prolin β-naftilamid, histidin β- naftilamid ve lösilglisil β-naftilamid kullanımı testlerini içeren 18 testten oluşan bir identifikasyon sistemidir. Resim 3.7. RapID YEAST PLUS System test panelinin görünümü

132 97 Çizelge RapID YEAST PLUS System İdentifikasyon Testlerinin Prensipleri Panel Konumu Substrat Kod Pozitif Reaksiyon 1 glukoz GLU sarı 2 Maltoz MAL Sarı 3 Sükroz SUC Sarı 4 Trealoz TRE sarı 5 Rafinoz RAF sarı 6 Lipaz LIP sarı 7 p-nitrofenil-n-asetil-β,d-galaktozamid NAGA sarı 8 p-nitrofenil-α,d-glukozid αglu sarı 9 p-nitrofenil-β,d-glukozid βglu sarı 10 o-nitrofenil-β,d-galaktozid ONPG sarı 11 p-nitrofenil-α,d-galaktozid αgal sarı 12 p-nitrofenil- β,d-fukozid βfuc sarı 13 p-nitrofenil fosfat PHS sarı 14 p-nitrofenil fosforilkolin PCHO Sarı 15 Üre URE 16 prolin β-naftilamid PRO 17 Histidin β-naftilamid HIST 18 lösilglisil β-naftilamid LGY kırmızı-koyu kırmızı-turuncu mor-kırmızı-koyu pembe mor-kırmızı-koyu pembe mor-kırmızı-koyu pembe Candida ların Tür Düzeyinde Adlandırılması İçin RapID YEAST PLUS System Uygulanması Bu test için Sabouraud Dextrose Agar da 30 O C de 48 saat inkübe edilen taze Candida kolonileri kullanılmıştır. Koloniler RapID İnoculation Fluid içine McFarland No.3 bulanıklık olacak şekilde inoküle edilmiştir. Vortex yardımıyla iyice homojenize edilen süspansiyonlar panel kuyucukları üzerine boşaltılarak tüm kuyucukların süspansiyon ile dolması sağlanmıştır. Paneller, ağızları kapatılarak 30 O C de saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu süre sonunda değerlendirmeye alınmıştır. 1. ile 6. kuyucuk arasındaki kuyucuklar ile 15 nolu kuyucuk ayraç damlatmadan değerlendirilen

133 98 testleri içermektedir. Glukoz (1), Maltoz (2), Sükroz (3), Trealoz (4), Rafinoz (5) ve Lipaz (6) testlerini içeren kuyucuklarda sarı renk gözlenmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir. 15 nolu kuyucukta kırmızı ya da koyu kırmızı turuncu renk oluşumunun gözlenmesi ise Üreaz pozitif olarak değerlendirilmiştir. 7. ve 14. kuyucuklar arasında testlerin değerlendirmesi ise RapID Yeast Plus Reagent A ayracının damlatılmasını takip eden saniyelik süre içinde yapılmıştır. Bu kuyucuklarda sarı renk oluşumunun gözlenmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir. 16. ve 18. kuyucuklar arasındaki testlerin değerlendirilmesi RapID Yeast Plus Reagent B ayracının damlatılmasını takip eden saniyelik süre içinde yapılmıştır. Bu kuyucuklarda mor-kırmızı ya da koyu pembe renk oluşumunun gözlenmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir. Değerlendirme sonuçları bilgisayar ortamında RapID YEAST PLUS System değerlendirme programına aktarılarak tür tanımlaması yapılmıştır Mikroorganizmaların Temini İçin Kullanılan Besiyerleri ve İçerikleri Eosine Methylene Blue Agar (EMB) Bileşimi g/l Peptone 10,0 Lactose 10,0 Dipotasssium hydrogene phosphate 2,0 Eosin Y 0,4 Methylene blue 0,065 Agar 15,0

134 99 ph: 6,8 ± 0,2 Hazırlanışı: Besiyerinden 37,5 g. tartılıp 1 L distile su içinde çözdürülür. Kaynayana kadar karıştırılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Klebsiella cinsine ait bakteriler EMB Agar da mavi-mor renkli, koyu merkezli, mukoid koloniler oluşturur. Pseudomonas cinsine ait bakteriler EMB Agar da düzensiz, renksiz koloniler oluşturarak ürer. Nutrient Agar (Oxoid CM 0003) Bileşimi g/l Lab-Lemco Powder 1,0 Yeast Extract 2,0 Peptone 5,0 Sodium chloride 5,0 Agar 15,0 ph: 7,4± 0.2 Hazırlanışı: Besiyerinden 28 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür ve kaynayana kadar ısıtılır. Otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilerek steril petri plaklarına dökülerek +4 o C de muhafaza edilir. Staphylococcus türleri Nutrient Agar da saman sarısı-beyaz koloniler oluşturarak ürer. Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) Bileşimi g/l

135 100 Mycological peptone 10,0 Glucose (Dextrose) 40,0 Agar 15,0 ph: 5,6 ±0,2 Hazırlanışı: Besiyerinden 65 g. tartılıp 1 L. Distile su içine çözdürülür. Kaynayana kadar ısıtılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Candida türleri, Sabouraud Dextrose Agar da oluşturarak ürer. krem rengi,beyaz koloniler Pseudomonas Agar Base (Oxoid CM 0559) Bileşimi g/l Gelatin Peptone 16,0 Casein Hydrolysate 10,0 Potassium Sulphate 10,0 Magnesium Chloride 1,4 Agar 11,0 ph : 7,1 ± 0,2 Hazırlanışı: Besiyerinden 24,2 gram tartılıp 500 ml distile su içinde çözdürülür. Kaynayana kadar ısıtılır ve otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. 50 O C ye soğutulur ve 1 vial Pseudomonas CN Selective Supplement ( Oxoid SR 0102) ve 1 vial Pseudomonas CFC Selective Supplement ( Oxoid SR 0103) eklenerek homojenize edilir. Petri plaklarına dökülerek +4 o C de muhafaza edilir. Pseudomonas türleri Pseudomonas selective agar da yeşil pigmentli saman rengi koloniler oluşturarak ürer.

136 101 MacConkey Agar Base (Oxoid CM 0007) Bileşimi g/l Peptone 20,0 Lactose 10,0 Bile Salts 5,0 Sodium Chloride 5,0 Neutral red 0,075 Agar 12,0 PH: 7,2± 0,2 Hazırlanışı: Besiyerinden 52 gram tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür ve kaynayana kadar ısıtılır. Otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilerek steril petri plaklarına dökülerek +4 o C de muhafaza edilir. MacConkey Agar da Klebsiella cinsi bakteriler, büyük, mukoid ve kırmızı koloniler oluşturarak ürer. Koyun Kanlı Agar Brain Heart Infusion Agar (CM1136) Bileşimi g/l Brain infusion solids 12,5 Beef heart infusion solids 5,0 Proteose peptone 10,0 Sodium chloride 5,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 47 g. tartılıp 1 L distile su içinde çözdürülür. Kaynayana kadar ısıtılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Koyun kanlı agar

137 102 hazırlamak için, steril edilen besiyeri 50 O C ye soğutulur ve içine %10 oranında steril koyun kanı eklenir. Staphylococcus cinsine ait bakteriler Koyun kanlı agar da geniş, düzgün kenarlı, krem rengi-sarı veya turuncu pigmentli ya da pigmentsiz, hemoliz yapabilen koloniler oluşturur Mikroorganizmaların İdentifikasyonu İçin Uygulanan Biyokimyasal Testler Gram boyama Ilk olarak Hans Christian Joachim Gram tarafından uygulanmıştır. Klasik Gram boyama metodundaki Kristal viyole, Lügol, Alkol ve Bazik fuksin kullanılarak Gram boyama yapılmıştır. Mikroskopta 100x büyütmede, immersiyon yağı kullanılarak inceleme yapılmıştır. Resim 3.8. Gram boyama sonucunda Pseudomonasların mikroskop incelemesinde görünümü (Suş no. P3)

138 103 Resim 3.9. Gram boyama sonucunda Klebsiellaların mikroskop incelemesinde görünümü Resim Gram boyama sonucu Stafilokokların mikroskop incelemesinde görünümü Metilen mavisi ile boyama Metilen Mavisi Çözeltisi 125 mg. Metilen mavisi 100mL alkol içinde çözdürülür. İyice çözdürüldükten sonra 250 ml ye kadar distile su eklenir (

139 104 Preparat hazırlanıp kurutulduktan sonra üzerine Metilen Mavisi çözeltisi damlatılıp dakika bekletilmiştir. Bu süre sonunda preparat distile su ile yıkanmış ve immersiyon yağı damlatılarak 100x büyütmede mikroskopta incelenmiştir ( Katalaz testi Bu test, mikroorganizmalar tarafından sentezlenen katalaz (Hidrojen peroksit oksidoredüktaz) enzimini saptamak amacıyla yapılır. Katı besiyerinde üremiş taze kültürden öze yardımıyla alınan koloniler temiz bir lam üzerine yayılmıştır. Üzerine % 30 luk hidrojen peroksit damlatılmıştır. Hirojen peroksit damlatılmasından sonra kabarcık oluşumunun gözlenmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.11). Resim Katalaz Testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif reaksiyon Arjinin dekarboksilaz testi Bu test, mikroorganizmların lizin dekarboksilaz enzimi meydana getirebilme yeteneğini değerlendirmek için kullanılır BBL Moeller Decarboxylase Broth Base (Difco ) Bileşimi g/l

140 105 Peptic digest of animal tissue 5,0 Beef extract 5,0 Dextrose 0,5 Bromcresol purple 0,01 Cresol red 5,0 Pyridoxal 5,0 Hazrlanışı: Besiyerinden 10,5 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Karışıma % 1 oranında L-arjinin eklenir. Isıtılarak çözünmesi sağlanır. Tüplere 5 er ml dağıtılarak 121 O C de otoklavda 15 dakika steril edilir. Bakteri taze kültürlerinden öze yardımıyla tüpteki besiyeri içine daldırma ekim yapılmıştır. 37 O C de 4 güne kadar inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda besiyerinin orijinal gri rengi mavi-mor renge dönüşmesi pozitif reaksiyon olarak kabul edilmiştir. Besiyerinin orijinal kırmızı - pembe renginin sarıya dönmesi pozitif reaksiyon olarak kabul edilmiştir Lizin dekarboksilaz testi Bu test, mikroorganizmların lizin dekarboksilaz enzimi meydana getirebilme yeteneğini değerlendirmek için kullanılır. MIL Medium (Difco ) Bileşimi g/l Peptone 10,0 Pancreatic digest of casein 10,0 Yeast extract 3,0 L-Lysine HCl 10,0 Dextrose 1,0

141 106 Ferric ammonium citrate 0,5 Brom cresol purple 0,02 Agar 2,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 36,5 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tamamen çözünmesini sağlamak amacıyla 1 dakika süre boyunca kaynatılır. Tüplere 5 er ml dağıtılarak 121 O C de otoklavda 15 dakika steril edilir. Bakteri taze kültürlerinden öze yardımıyla tüpteki besiyeri içine daldırma ekim yapılmıştır. 37 O C de 4 güne kadar inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda besiyerinin orijinal gri rengi mavi-mor renge dönüşmesi pozitif reaksiyon olarak kabul edilmiştir (Resim 3.12) Resim Lizin Dekarboksilaz Testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif reaksiyon Üreaz testi Bu test, mikroorganizmaların üreyi hidrolize eden üreaz enzimi üretimini saptamak amacıyla uygulanmaktadır.

142 107 Urea Agar Base (Christensen) (Oxoid CM0053) Bileşimi g/l Peptone 1,0 Glucose 1,0 Sodium chloride 5,0 Disodium phosphate 1,2 Potassium dihydrogen phosphate 0,8 Phenol red 0,012 Agar 15,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 2,4 g. tartılıp 95 ml distile su içinde çözdürülür. Otoklavda 115 O C de 20 dakika steril edilir. 50 O C ye soğutulan besiyeri içine %40 lık üre solüsyonu, şırınga ucu filtreden geçilirip steril edildikten sonra eklenir. Tüplere dağıtıldıktan sonra 2-8 O C de muhafaza edilebilir. Mikrooganizmanın taze üretilmiş kültüründen iğne öze yardımıyla 1-2 koloni alınmış ve tüpteki üreli besiyeri içine batırılarak ekim yapılmıştır. 37 O C de 1-5 gün inkübasyona bırakılmıştır. Bu süre sonunda besiyerinin sarı renginin pembe-kırmızı renge dönüşmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir. Renk değişimi olmaması negatif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.13). Resim Üreaz testi (A) Pozitif reaksiyon (B)Negatif Reaksiyon (C) Değişken reaksiyon C

143 İndol testi Bu test, mikroorganizmaların triptofan aminoasidini ayrıştırarak indol oluşturma yeteneğini belirlemek için kullanılır. Trypton Water (Oxoid CM0087) Bileşim g/l Tryptone 10,0 Sodium chloride 5,0 ph: 7,5 ±0,2 Hazırlanışı: Besiyerinden 15 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tüplere 5 er ml dağıtılarak otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Tüpteki besiyeri içine mikroorganizma kültüründen inoküle edildikten sonra 37 O C de 1-5 gün inkübasyona bırakılmıştır. Bu süre sonunda kültürler üzerine 0,5mL Kovac s ayracı damlatılmıştır. Tüplerin üst kısmında 2 dakika içinde kırmızı halkanın oluşması pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.14). Resim İndol Testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif reaksiyon

144 Nitrat redüksiyon testi Bu test, mikroorganizmaların nitrati redükte edebilme yeteneklerini belirlemek için kullanılır. Nitrate Broth Base (Difco ) Bileşimi g/l Beef extract 3,0 Peptone 4,0 Proteose peptone no.3 1,0 Potassium nitrate 1,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 9 g. tartılarak 1L distile su içinde çözdürülür. Çözünmüş besiyeri tüplere 5 er ml olacak şekilde dağıtılır ve her tüpe Durhaim tüpü konur. 121 O C de 15 dakika otoklavda steril edilir. Mikroorganizma kültüründen nitratli sıvı besiyerine ekim yapıldıktan sonra tüpler 37 O C de 1-5 gün inkübasyona bırakılır. Durhaim tüpleri içinde gaz oluşumu N 2 denitrifikasyonunu gösterir. Bu tüplere Griess- Iilosvay ayraçlarından ( %0,5 alfa naftilamin-%0,8 sülfanilik asit) 5 er damla damlatılır ve hafifçe çalkalanır. 1-2 dakika içinde kırmızı rengin meydana gelmesi nitratın nitrine redükte olduğunun göstergesidir ve pozitif kabul edilmiştir O C de üreme Pseudomonas Agar Base besiyerine ekimi yapılan izolatlar 42 O C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda üreme görülen petri plakları değerlendirilmeye alınmıştır.

145 O C de üreme Pseudomonas Agar Base besiyerine ekimi yapılan izolatlar +4 O C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda üreme görülen petri plakları değerlendirilmeye alınmıştır Pigment oluşumu Pseudomonas F Agar (Difco ) Bileşimi g/l Pancreatic digest of casein 10,0 Proteose peptone no.3 1,5 Dipotassium phosphate 1,5 Magnesium sulfate 1,5 Agar 15 Hazırlanışı: Besiyerinden 38 g. tartılarak 1 litre distile su içinde çözdürülür. 10 ml gliserol eklenir. Tamamen çözünmesini sağlamak amacıyla 1 dakika süresince kaynatılır. 121 O C de 15 dakika otoklavda steril edilir. Pseudomonas P Agar (Difco ) Bileşimi g/l Pancreatic digest of gelatin 20,0 Magnesium chloride 1,4 Potassium sulfate 10,0 Agar 15,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 46,4 g. tartılarak 1 litre distile su içinde çözdürülür. 10 ml gliserol eklenir. Tamamen çözünmesini sağlamak amacıyla 1 dakika süresince kaynatılır. 121 O C de 15 dakika otoklavda steril edilir.

146 111 Pseudomonas P. ve F. Besiyerleri Pseudomonas lar için pigment oluşumunu destekleyen besiyerleridir. Özellikle piyosiyanin pigmenti veren Pseudomonas türleri Pseudomonas P besiyerinde, piyoverdin ve ve floresan pigmenti veren Pseudomonas türleri ise Pseudomonas F besiyerinde değerlendirilmiştir. Deneyde, bu besiyerlerinde floresan pigment veren suşlar, ultraviyole ışıkta belirlenrerek; diğer pigmentler ise renk ve yapılarına göre kaydedilmiştir. İzole edilen Pseudomonas ssp. suşlarının pigment oluşturma özelliği Tablo 12 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Pseudomonas ssp. türlerinin pigment oluşturma özelliği Türler P.Agar F. Agar P.aeruginosa Piyosiyanin Piyosiyanin P.fluorescens Piyoverdin Fluorescein Ornitin dekarboksilaz testi Bu test, mikroorganizmaların ornitin dekarboksilaz enzimini meydana getirebilme yeteneğini değerlendirmek için kullanılır. MIO Medium (Difco ) Bileşimi g/l Yeast extract 3,0 Peptone 10,0 Tryptone 10,0 L-Ornithine HCl 5,0 Dextrose 1,0 Agar 2,0 Bromcresol Purple 0,02 Hazırlanışı: Besiyerinden 31 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tamamen çözünmesi için 1 dakika süre boyunca kaynatılır. Tüplere 5 er ml dağıtılarak 121

147 112 O C de otoklavda 15 dakika steril edilir. Besiyerinin orijinal mor-koyu mavi renginin sarıya dönmesi pozitif reaksiyon olarak kabul edilmiştir (Resim 3.15) Resim Ornitin dekarboksilaz testi (A) Negatif reaksiyon (B)Pozitif reaksiyon Jelatin hidrolizi Bu test, mikroorganizmalarda, jelatini hidrolize eden jelatinaz enziminin varlığını ortaya koymak için kullanılır. Jelatin Hidroliz Testi Besiyeri Nutrient Broth Base (Oxoid CM 0001) Bileşimi g/l Lab-lemco Powder 1,0 Yeast Extract 2,0 Peptone 5,0 Sodium chloride 5,0 ph 7,4 ±0,2 Hazırlanışı: Besiyerinden 13 g. tartılarak 1 L distile su içinde çözdürülür. Jelatin hidrolizi testi için besiyeri içine % 10 oranında jelatin eklenir. 5 er ml. Tüplere dağıtılır ve otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. +4 O C de saklanabilir.

148 113 Mikroorganizma kültürüne değdirilmiş iğne uçlu öze, dik olarak jelatinli besiyerine daldırılır. Tüpler 37 O C de 15 güne kadar inkübe edilebilir. Bu süre sonunda besiyerleri +4 O C de 1-2 saat bekletilir. Jelatinin hidrolize edildiği durumlarda, +4 O C den çıkarılınca jelatinli besiyerinin sıvı halinde ve katılaşmadığı görülür. Bu durumda jelatin hidrolizasyonu pozitif olarak değerlendirilmiştir. Negatif durumda ise tüplerdeki sıvı besiyerinin katılaştığı gözlenmiştir Oksidasyon / fermentasyon testi Bu test, mikroorganizmaların karbonhidratları (özellikle, glikozu) ayrıştırmada oksidatif veya fermentatif metabolik yolu kullanma durumlarını saptamada işe yarar ve ayrıca bakterilerin identifikasyonununda da yararlanılır. OF Basal Medium (BD ) Bileşimi g/l Pancreatic digest of casein 2,0 Sodium chloride 5,0 Potassium phosphate 0,3 Bromthymol blue 0,08 Agar 2,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 9,4 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tamamen çözünmesini sağlamak amacıyla 1 dakika süresince kaynatılır. Tüplere 5 er ml olacak şekilde dağıtılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Taze kültürden iğne öze yardımıyla 1-2 koloni alınarak tüpteki besiyerine daldırma şeklinde elim yapılmıştır. Tüpler 37 O C de 15 güne kadar inkübe edilmiştir. bu süre sonunda besiyerinin orijinal mavi-yeşil renginin sarı renge dönmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir.

149 Sitrat testi Bu test, mikroorganizmaların, besi yerlerine katılan sitratı karbon kaynağı ve amonyum tuzlarını da nitrojen kaynağı olarak kullanabilme yeteneğini saptamada, bakteri cins ve türlerini identifikasyonda kullanılır. Simmons Citrate Agar (BD ) Bileşimi g/l Ammonium dihydrogene phosphate 1,0 Dippassium phosphate 1,0 Sodium chloride 5,0 Sodium citrate 2,0 Magnesium sulfate 0,2 Agar 15,0 Bromthymol blue 0,08 Hazırlanışı: Besiyerinden 24,2 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tamamen çözünmesini sağlamak amacıyla 1 dakika süresince kaynatılır. Tüplere 5 er ml olacak şekilde dağıtılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Tüpteki yatık besiyeri yüzeyine, taze kültürden öze yardımıyla alınan 1-2 koloni ekilmiştir. Kültürler 37 O C de 2-7 gün arasında inkübe edilmiştir. besiyerinin orijinal yeşil renginin mavi renge dönüşmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.16).

150 115 Resim Sitrat testi (A)Negatif reaksiyon (B)Pozitif reaksiyon Metil red testi Bu test, glukozun fermentatif metabolize olması sonucu besiyerinde organik asitlerin meydana geldiğini ve ph ın düştüğünü ortaya koymak için yapılır. MRVP Medium (Oxoid CM 0043) Bileşimi g/l Peptone 7,0 Glukoz 5,0 Phosphate buffer 5,0 ph: 6,9 ±0,2 Hazırlanışı: Besiyerinden 17 g. tartılıp 1 L distile su içinde çözdürülür. Tüplere 5 ml dağıtılıp 121 O C de otoklavda 15 dakika steril edilir.

151 116 Mikroorganizma kültüründen tüpteki besiyer içine ekim yapılmış ve 37 O C de 2-7 gün inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra kültürler içine Metil Red solüsyonundan 4-5 damla damlatılarak ve iyice karıştırılmıştır. Besiyer yüzeyinde kırmızı bir halkanın meydana gelmesi pozitif olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.17) Resim Metil Red Testi (A) Pozitif reaksiyon (B) Negatif reaksiyon Voges proskauer testi Bu test, bazı mikroorganizmaların glukozu fermente ederek nötral bir ürün asetilmetilkarbinol u (asetoin) meydana getirebilme yeteneğini değerlendirmek için kullanılır. Hazırlanan MRVP besiyeri içine, mikroorganizma kültüründen ekim yapıldı. 37 O C de 2-7 gün inkübasyona bırakılmıştır. Bu süre sonunda kültürlere O Meara veya Barzit VP ayracından 1 ml damlatılır ve hafifçe çalkalanmıştır. 37 O C de su banyosunda 4 saat bekletilmiştir. Besiyerinin üzerinde 2-5 dakika içinde pembe renk oluşumu pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.18)

152 117 Resim Voges proskauer testi (A) Negatif reaksiyon (B) Pozitif reaksiyon Malonat kullanımı testi Bu test, mikroorganizmaların besi yerlerine konan malonat'tan karbon kaynağı olarak yararlanabilme yeteneğini ölçmede kullanılır. Malonate Broth (BD ) Bileşimi g/l Yeast extract 1,0 Ammonium sulfate 2,0 Dipotassium sulfate 0,6 Monopotassium phosphate 0,4 Sodium chloride 2,0 Sodium malonate 3,0 Dextrose 0,25 Bromthymol blue 25,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 9,3 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tüplere 5 er ml olacak şekilde dağıtılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir.

153 118 Taze kültürlerden öze yardımıyla 1-2 koloni alınıp tüpteki sıvı besiyeri içine inoküle edilmiştir. Kültürler 37 O C de 2-3 gün inkübe edilmiştir. bu süre sonunda besiyerinin orijinal yeşil renginin mavi renge dönüşmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir Hidrojen sülfit oluşumu testi Bu test, mikroorganizmaların, sülfür içeren bazı aminoasitleri (sistin, sistein, metionin, glutation) veya bileşikler (sülfatları) ayrıştırarak hidrojen sülfür meydana getirebilme durumlarını saptamak için yapılır. SIM Medium (BD ) Bileşimi g/l Pancreatic digest of casein 20,0 Peptic digest of animal tissue 6,1 Ferrous ammonium sulfate 0,2 Sodium thiosulfate 0,2 Agar 3,5 Hazırlanışı: Besiyerinden 30 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tamamen çözünmesi için 1 dakika süresince kaynatılır. 5 er ml olacak şekilde tüplere dağıtılır. 121 O C de 15 dakika otoklavda steril edilir. Tüpteki besiyerine, taze kültürden iğne öze yardımıyla 1-2 koloni alınarak dik bir şekilde ekim yapılmıştır. Sıvı besiyeri üzerine ince şeritler halinde, kurşun asetat emdirilmiş kağıtlar sarkıtılmıştır. Kültürler 37 OC de 2-7 gün arası inkübe edilmiştir. kağıdın uç kısımlarının kararması pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir.

154 Hareket testi Bu testin değerlendirilmesi, hidrojen sülfit oluşumu testi ile beraber SIM Medium (BD ) besiyerinde yapılmıştır. Besiyerine ekim hattından yanlara doğru yayılmanın görülmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir % 6,5 NaCl de üreme testi Bu test, Staphylococcus cinsine ait bakteriler ile Micrococcus cinsine ait bakterileri birbirinden ayırmak için kullanılmıştır. Nutrien Broth (Oxoid CM 0001) Bileşimi g/l Lab-Lemco powder 1,0 Yeast extract 2.0 Peptone 5.0 Sodium chloride 5.0 ph: 7.4 ± 0.2 Hazırlanışı: Besiyerinden 13 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. 121 O C de otoklavda 15 dakika steril edilir. % 6,5 NaCl de üreme testi için Nutrient Agar da üretilmiş taze kültürler kullanılmıştır. % 6,5 NaCl içeren Nutrient Broth besiyeri içine 1-2 koloni inoküle edilmiş ve 37 O C de saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda tüplerde bulanıklık görülmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir.

155 Koagülaz testi Bu test, Stafilokoklarda bulunan ve kan plazmasını pıhtılaştıran koagülaz (staphylocoagulase) enziminin varlığını ortaya koymak amacıyla uygulanmaktadır. Tüpte veya lam üzerinde yapılmaktadır. İzole edilen Stafilokokların koagülaz varlığının araştırılması için uygulanan bu test, lam üzerinde yapıldı. Bunun için temiz bir lam üzerine 1 damla steril fizyolojik su kondu. Üzerine taze Staphylococcus kültüründen 1-2 koloni konarak iyice homojen hale getirildi. Süspansiyon üzerine 1 damla steril taze plazma kondu ve homojenize edilmiştir. 3-5 saniye içinde kümeleşme gözlenmesi pozitif sonuç olarak kabul edilmiştir. Hiçbir değişiklik olmaması negatif sonuç olarak değerlendirilmiştir ( Resim 3.19) Resim Koagülaz Testi (A) Pozitif reaksiyon (B) Negatif reaksiyon Isıya dirençli nükleaz testi Bu test, mikroorganizmaların ısıya dayanıklı olan deoksiribonuklease (DNase) enzimini sentezleyebilme yeteneklerini ölçmede kullanılır. DNase Test Agar With Toluidine Blue (BD ) Bileşimi g/l Pancreatic digest of casein 15,0

156 121 Papaic digest of soybean meal 5,0 Sodium chloride 5,0 Deoxyribonucleic acid 2,0 Agar 15,0 Toluidine blue O 0,1 Hazırlanışı: Besiyerinden 42 g. tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Tamamen çözünmesi için 1 dakika süresince kaynatılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Taze kültürden, bir öze yardımıyla alınan 1-2 koloni, katı besiyeri üzerine çizgi ekimi yapılmıştır. Kültür, 37 OC de 2-3 gün inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda ekim yapılan hattın çevresinde pembe bir zon oluşması pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir Hemoliz testi Bu test, mikroorganizmaların hemolitik aktivitelerini belirlemek amacıyla kullanılır. Hazırlanan Koyun Kanlı Agar a mikroorganizmalardan alınan 1-2 koloni, tek koloni ekimi yapılarak 37 O C de saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda koloniler çevresinde hemoliz bölgeleri değerlendirilmiştir. Koloniler çevresinde saydam renkli hemoliz bölgesinin oluşması Beta hemolitik, sarı renkli hemoliz bölgesi oluşması Alfa hemolitik, hemoliz bölgesi oluşmaması ise Gama hemolitik veya nonhemolitik olarak değerlendirilmiştir Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile Novobiocin antibiyotiğine duyarlılık testi Mueller-Hinton Agar Base (Oxoid CM0337) Bileşimi g/l Beef, dehydrated infusion from 300,0

157 122 Casein hydrolysate 17,5 Starch 1,5 Agar 17,0 ph: 7,3 ±0,1 Hazırlanışı: Besiyerinden 38 g. tartılarak 1 L. Distile su içinde çözdürülür. Karışım kaynayana kadar ısıtılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Daha önceden Mueller-Hinton Agar besiyerinde üretilmiş mikroorganizmanın taze kültüründen, bulanıklığı 0,5 McFarland olacak şekilde steril tuzlu çözeltisine alındı. Oluşan süspansiyon iyice homojenize edilmiştir. Süspansiyondan, steril bir swab yardımıyla alındı ve Mueller-Hinton petri plaklarına, her sürme işleminden sonra plak 60 O döndürülerek üç yönde ekim yapıldı. Ekim yapılmış plak üzerindeki inokulum, 5 dakika, kapağı kapalı olarak kurumaya bırakıldı. Üzerine BD BBL Novobiocin Taxo Discs (5µg) antibiyotik diskleri yerleştirildi ve 37 O C de 24 saat inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda petri plakları üzerinde oluşan inhibisyon zon çapları ölçüldü. Sonuçlar NCCLS yönergesine göre değerlendirildi. Bu yönergeye göre, inhibisyon zon çapı 16 mm. ye eşit veya daha küçük olan kültürler Novobiocin antibiyotiğine dirençli kabul edilirken 16 mm. den büyük inhibisyon zon çapı oluşturarak üreyen kültürler duyarlı kabul edilmiştir Yalancı veya gerçek hif oluşumu Candida şüpheli kolonilerin yalancı ve gerçek hif oluşumunu tespit etmek için Corn Meal Agar with Polysorbate 80 kullanılmıştır. Corn Meal Agar with Polysorbate 80 (Tween 80) (BD ) Bileşimi g/l Corn Meal İnfusion from(solids) 2,0 Agar 15,0

158 123 Hazırlanışı: Besiyerinden 17 g. tartılarak 1 L. Distile su içinde çözdürülür. % 1 oranında Polysorbate 80 eklenir. Sık sık karıştırılır ve tamamen çözünmesi için 1 dakika kaynatılır. Otoklavda 121 O C de 15 dakika steril edilir. Petri plaklarına hazırlanan besiyeri yüzeyine, Sabouraud Dextrose Agar besiyerinde üretilmiş taze kültürde 1-2 koloni alınarak çizgi ekim yapılmıştır. 25 ± 2 O C de 48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda kültürler üzerine lamel kapatılarak mikroskopta 40x büyütmede incelenip ve yalancı veya gerçek hif oluşumu değerlendirilmiştir (Resim 3.20). Resim Cornmeal-Tweein 80 agar da yalancı hif oluşumunun görünümü Germ tüp oluşumu testi Candida albicans ın hızlı ön identifikasyonu için kullanılan en değerli ve basit testlerden biridir. Test ön identifikasyonu sağlar çünkü, tüm Candida kökenleri germ tüp pozitif değildir. Ayrıca C.tropicalis ile yalancı pozitif sonuçlar alınabilmektedir. Candida dubliniensis izolatlarının çoğunun, ticari sentetik germinasyon besiyerinde germ tüp oluşturmamasına karşın, germ tüp pozitif olduğu bilinmektedir. C. abicans ın oluşturduğu kısa hiflerin baş tarafının, blastokonidyum ile ger tüpün kesiştiği yerde boğumlanma oluşturmadığı görülür. C.tropicalis de hif çıkıntıları oluşturur, fakat blastokonidyumları C. albicans ınkinden daha büyük olup blastokonidyum ile hif çıkıntısı bileşiminde belirgin bir boğumlanma vardır.

159 124 Germ tüp oluşumu testi için, testi uygulamadan önce bir öze ile, Sabouraud Dextrose Agar besiyerinde 30 O C de saat inkübe edilmiş kültürlerdeki 1-2 koloniye hafifçe dokunarak ince bir film halinde alınmıştır. Bu, içinde fetal sığır serumu bulunan tüp içine aktarılmıştır. 37 O C de 3 saat inkübe edilmiştir. 3 saat sonunda tüpteki inokulumdan bir öze dolusu alınarak, mikroskopta lam-lamel arasında incelenerek germ tüp oluşumu değerlendirilmiştir (Resim 3.21). Resim Germ Tüp oluşumunun mikroskobik incelemede görünümü Karbonhidrat asimilasyon testi Mayaların tür düzeyine kadar olan identifikasyonda esas dayanak noktası karbonhidrat asimilasyon testidir. Bu test, mayaların oksijen varlığında belirli bir karbonhidratı tek karbon kaynağı olarak kullanabilme yeteneğini ölçer. Karbonhidrat Asimilasyon Besiyeri ( Modified Wickerham Medium Stans) Bazal Ortam Bileşimi Bacto brom creasol purple ( %1,6) 0,2 g 1/10 Normal Sodium hydroxide 1,0 ml

160 125 Noble Agar (BD ) 2,0 g Hazırlanışı: Maddeler, 90 ml distile su ile karıştırılmış ve homojen hale gelene kadar ısıtılmıştır. Stok Karbonhidrat Solüsyonu Bileşimi Carbonhydrates 1,00 g. Yeast nitrogen base 0,67 g. Hazırlanışı: Maddeler, 10,00 ml distile su ile karıştırılmış ve homojen hale gelmesi için ısıtılmıştır. Karbonhidrat asimilasyon besiyerinin hazırlanışı Stok karbonhidrat solüsyonu, erimişi agar ortamına eklenmiştir. İyice karıştırılarak ph: 7,0 ye ayarlanmıştır. Tüplere 5 er ml olacak şekilde dağıtılmış ve otoklavda 121 O C de 10 dakika steril edilmiştir. Bir öze dolusu saf maya kültürü, 9 ml distile suda süspanse edilmiştir. Süspansiyonun 0,2 ml si, karbonhidrat asimilasyon besiyerine inoküle edilmiştir. Besiyeri rek değişimi yönünden değerlendirilmiştir İzole Edilen Bakterilerde Biyofilm Oluşumunun Belirlenmesi Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus izolatlarında biyofilm varlığının oluşumu mikroplate kullanılarak araştırılmıştır. Pseudomonas, Klebsiella ve Staphylococcus bakterileri Nutrient Agar da saat inkübe edilmiştir. Taze kültürlerden, % 1 Glukoz içeren Luria Bertani (Miller) Broth ( BD Difco ), içeren tüplere McFarland 0,5 bulanıklık olacak şekilde inoküle edilmiştir.

161 126 Tüplerdeki bu süspansiyonlardan, mikroplate kuyucuklarına, her bir süspansiyondan 2 şer kuyucuğa olacak şekilde 200 er ml. dağıtılmıştır. Aynı işlem 4 farklı mikroplate için yapılmıştır. Mikroplatelerden 2 tanesi 37 O C de 24 saat, diğer 2 si 37 O C de 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Mikroplatelerin 2 şer kuyucuğuna bakteri süspanse edilmemiş %1 oranında glukoz içeren Luria Bertani besiyerinden 200 er ml. eklenmiş ve kontrol için kullanılmıştır. Mikroplateler, 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda 3 kez distile su ile yıkanmıştır. Mikroplatelerden bir tanesinin kuyucuklarına % 0,1 lik hazırlanan kistal viyole solüsyonundan 200 er ml. dağıtılmıştır. Diğer mikroplate in kuyucuklarına % 0,1 lik hazırlanan safranin solüsyonundan 200 er ml. dağıtılmıştır. Her iki mikroplate 15 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. Sonra, yeniden 3 kez distile su ile yıkanmış ve kurutma kağıdı üzerine ters çevrilerek kurumaya bırakılmıştır. %0,1 lik Kristal viyole solüsyonu eklenen mikroplate in kuyucuklarına %95 lik Etanol çözeltisinden 200 er ml. eklenmiş ve 10 dakika bekletilmiştir. Spektrofotometre cihazında 540 nm. dalga boyunda okutulmuştur. % 0,1 lik Safranin solüsyonu eklenen mikroplate in kuyucuklarına % 50 lik Asetik Asit solüsyonundan 200 er ml. eklenmiş ve 10 dakika bekletilmiştir. Spektrofotometre cihazında 470 nm. dakga boyunda okutulmuştur. Aynı işlemler 48 saat inkübe edilen mikroplateler için uygulanmıştır. Sonuçlar, kontrol için kullanılan mikroplate kuyucuklarının spektrofotometre cihazında okutulması ile elde edilen değerlere göre 1 pozitif, (+), 2 pozitif (++), 3 pozitif (+++) ve negatif (-) olarak değerlendirilmiştir.

162 İzole Edilen Mayalarda Biyofilm Oluşumunu Belirlenmesi Maya izolatlarında biyofilm varlığının oluşumu mikroplate kullanılarak araştırılmıştır. Maya izolatları Sabouraud Dextrose Agar (Oxoid CM0041) da saat inkübe edilmiştir. Taze kültürlerden, % 1 Glukoz içeren Luria Bertani (Miller) Broth ( BD Difco ), içeren tüplere McFarland 0,5 bulanıklık olacak şekilde inoküle edilmiştir. Tüplerdeki bu süspansiyonlardan, mikroplate kuyucuklarına, her bir süspansiyondan 2 şer kuyucuğa olacak şekilde 200 er ml. dağıtılmıştır. Aynı işlem 4 farklı mikroplate için yapılmıştır. Mikroplatelerden 2 tanesi 37 O C de 24 saat, diğer 2 si 37 O C de 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Mikroplatelerin 2 şer kuyucuğuna bakteri süspanse edilmemiş %1 oranında glukoz içeren Luria Bertani besiyerinden 200 er ml. eklenmiş ve kontrol için kullanılmıştır. Mikroplateler, 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda 3 kez distile su ile yıkanmıştır. Mikroplatelerden bir tanesinin kuyucuklarına % 0,1 lik hazırlanan kistal viyole solüsyonundan 200 er ml. dağıtılmıştır. Diğer mikroplate in kuyucuklarına % 0,1 lik hazırlanan safranin solüsyonundan 200 er ml. dağıtılmıştır. Her iki mikroplate 15 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. Sonra, yeniden 3 kez distile su ile yıkanmış ve kurutma kağıdı üzerine ters çevrilerek kurumaya bırakılmıştır. %0,1 lik Kristal viyole solüsyonu eklenen mikroplate in kuyucuklarına %95 lik Etanol çözeltisinden 200 er ml. eklenmiş ve 10 dakika bekletilmiştir. Spektrofotometre cihazında 540 nm. dalga boyunda okutulmuştur. % 0,1 lik Safranin solüsyonu eklenen mikroplate in kuyucuklarına % 50 lik Asetik Asit solüsyonundan 200 er ml. eklenmiş ve 10 dakika bekletilmiştir. Spektrofotometre cihazında 470 nm. dakga boyunda okutulmuştur.

163 128 Aynı işlemler 48 saat inkübe edilen mikroplateler için uygulanmıştır. Sonuçlar, kontrol için kullanılan mikroplate kuyucuklarının spektrofotometre cihazında okutulması ile elde edilen değerlere göre 1 pozitif, (+), 2 pozitif (++), 3 pozitif (+++) ve negatif (-) olarak değerlendirilmiştir. Resim Kristal viyole ile boyama sonucu mikroplate kuyucuklarının görünümü Resim Safranin ile boyama sonucu mikroplate kuyucuklarının görünümü İzole Edilen Bakterilerde Slime Oluşumunun Belirlenmesi Mikroorganizmaların Slime oluşturma özelliklerinin belirlenmesi amacıyla Kongo Kırmızılı Agar Yöntemi ve Standart Cam Tüp Yöntemi kullanılmıştır.

164 İzole edilen bakterilerde kongo kırmızılı agar kullanılarak slime var lığının tespit edilmesi Pseudomonas, Klebsiella ve Staphylococcus izolatlarının Nutrient Agar a ekimleri yapılmıştır. 37 O C de 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda kültürlerden 1-2 koloni alınarak %1 oranında Kongo Kırmızısı eklenerek hazırlanmış besiyerine tek koloni ekimleri yapılmıştır. 35 O C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Pseudomonas, Klebsiella ve Staphylococcus koloni ekimlerinin yapıldığı Kongo Kırmızılı besiyerinde siyah kolonilerin görülmesi Slime pozitif olarak, pembe kolonilerin görülmesi Slime negatif olarak değerlendirilmiştir. Candida kolonilerinin ekimlerinin yapıldığı Kongo Kırmızılı besiyerinde koyu kırmızı kolonilerin görülmesi Slime pozitif, pembe kolonilerin görülmesi Slime negatif olarak değerlendirilmiştir İzole edilen mayalarda kongo kırmızılı agar kullanılarak slime varlığının tespit edilmesi Candida izolatlarının Sabouraud Dextrose Agar a ekimi yapılmıştır. 25 O C de saat süre boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda kültürlerden 1-2 koloni alınarak %1 oranında Kongo Kırmızısı eklenerek hazırlanmış besiyerine tek koloni ekimleri yapılmıştır. 35 O C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Candida kolonilerinin ekimlerinin yapıldığı Kongo Kırmızılı besiyerinde koyu kırmızı kolonilerin görülmesi Slime pozitif, pembe kolonilerin görülmesi Slime negatif olarak değerlendirilmiştir.

165 130 Resim Slime pozitif ve negatif izolatların Kongo kırmızılı agarda görünümü İzole edilen bakterilerde standart cam tüp yöntemi kullanılarak slime varlığının tespit edilmesi Nutrient Agar da üretilen bakteri izolatları, içinde 5 er ml. Nutrient Broth besiyeri içeren tüplere McFarland 0,5 bulanıklık olacak şekilde inoküle edilmiştir. Tüpler, 37 O C de saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda tüp içerikleri boşaltılarak içlerine Metilen Mavisi çözeltisi konur ve 1 dakika süre boyunca bekletilmiştir. Tüp içerikleri tekrar boşaltılmıştır. Bir kurutma kağıdı üzerine ters çevrilerek bekletilmiştir. Tüp yüzeyinde boyalı bir film tabakası ve halka oluşması Slime pozitif olarak değerlendirilmiştir İzole Edilen Mayalarda Standart Cam Tüp Yöntemi Kullanılarak Slime varlığının Tespit Edilmesi Sabouraud Dextrose Agar da üretilen maya izolatları, içinde %8 lik glukoz içeren Sabouraud Dextrose Broth içeren tüplere McFarland 0,5 bulanıklık olacak şekilde inoküle edilmiştir. Tüpler, 37 O C de 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda tüp içerikleri boşaltılmıştır. Tüplerin içeriği boşaltıldıktan sonra her

166 131 tüpün içine %0,25 lik safranin çözeltisi konarak çalkalanmıştır. Tüp içerikleri tekrar boşaltılmıştır. Bir kurutma kağıdı üzerine ters çevrilerek bekletilmiştir. Tüp yüzeyinde pembe-kırmızı renkli bir tabaka ve halka oluşumunun gözlenmesi Slime pozitif olarak değerlendirilmiştir. Resim Slime pozitif ve negatif izolatların cam tüp yöntemi ile görünümü Mikroorganizmalarda Slime Varlığının Tespit Edilmesinde Kullanılan Besiyerleri ve İçerikleri Kongo Kırmızılı Agar Brain Heart Infusion Agar (Oxoid CM 1136) Bileşimi g/l Brain infuion solids 12,5 Beef heart infusion solids 5,0 Proteose peptone 10,0 Sodium chloride 5,0 Glucose 2,0 Disodium phosphate 2,5 Agar 10,0

167 132 ph: 7.4 ± 0.2 Hazırlanışı: Besiyerinden 47 g tartılarak 1 litre distile su içinde çözdürülür. 80 g glukoz ve 0.8 g Kongo Kırmızısı eklenerek homojen hale gelene kadar karıştırılır. 121 O C de otoklavda 15 dakika steril edilir Mikroorganizmalarda Biyofilm Varlığının Tespit Edilmesinde Kullanılan Besiyerleri ve İçerikleri Luria Bertani (Miller) Broth (Difco ) Bileşimi g/l Tryptone 10,0 Yeast Extract 5,0 Sodium chloride 10,0 Hazırlanışı: Besiyerinden 25 g tartılıp 1 litre distile su içinde çözdürülür. Homojenize olması için 1 dakika süre boyunca kaynatılır. 5 er ml olacak şekilde tüplere dağıtılır ve 121 O C de otoklavda 15 dakika steril edilir.

168 BULGULAR Araştırmada Eylül 2008 Şubat 2009 tarihleri arasında Ankara daki çeşitli hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından, yatan veya muayene edilen, yetişkin ve çocuk hastalardan toplam 100 hasta kültür materyali toplanmıştır. Bu kültür materyalleri; 31 kan, 16 yara, 28 idrar, 4 trakeal aspirat, 3 konjunktival sürüntü, 1 kateter içi kan, 1 doku, 1 burun sürüntü, 4 püy, 1 abse, 1 periton sıvısı, 3 derin trakeal aspirat, 2 balgam, 1 kist sıvısı, 1 göğüs tüpü, 1 vajen sıvısı, 1 cilt ve 1 adet göz sürüntüsü kültürülerinden oluşmaktadır (Şekil 4.1) Şekil 4.1. Çalışılan hasta materyallerinin dağılımı Temini yapılan kültür materyallerinden Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus ve Candida izolasyonu yapılmıştır. İzolasyonu yapılan mikrooganizmaların temin edilen hasta kültür materyaline göre dağılımı Çizelge 4.1 de gösterilmiştir.

169 134 Çizelge 4.1. Klinik örneklerden izole edilen mikroorganizmaların, hasta mater yallerine göre dağılımı İzole edilen mikroorganizma Hasta materyalinin dağılımı Pseudomonas Klebsiella Staphylococcus Candida Toplam Kan Yara Balgam İdrar trakeal aspirat konjunktival sürüntü kateter içi kan doku kültürü burun sürüntüsü püy abse periton sıvısı derin trakeal aspirat kist sıvısı göğüs tüpü vajen sıvısı göz sürüntüsü cilt Toplam Çizelge 4.1 de gösterildiği üzere, araştırmada hastanelerden temin edilen 100 adet klinik kültür materyalinden, 10 (%10) Pseudomonas, 20 (%20) Klebsiella, 55 (%55) Staphylococcus ve 15 (%15) Candida izole edilmiştir (Şekil 4.2) Şekil 4.2. İzole edilen mikroorganizmaların cins seviyesinde dağılımı

170 135 Toplam 10 Pseudomonas izolarının 1 i (%10) yara kültürü, 1 i (%10) balgam kültürü, 6 sı (%60) idrar kültürü, 1 i (%10) trakeal aspirat kültürü ve 1 i (%10) kist sıvısı kültüründen izole edilmiştir (Şekil 4.3.). Şekil 4.3. İzole edilen Pseudomonasların hasta materyallerine göre dağılımı Toplam 20 Klebsiella izolatının 4 ü (%20) kan kültürü, 2 si (%10) yara kültürü, 1 i (%5) balgam kültürü, 11 i (%55) idrar kültürü ve 2 si (%10) derin trakeal aspirat kültüründen izole edilmiştir (Şekil 4.4.). Şekil 4.4. İzole edilen Klebsiellaların hasta materyallerine göre dağılımı

171 136 Toplam 55 Staphylococcus izolatının 27 si (%49,09) kan kültürü, 13 ü (%23,6) yara kültürü, 2 si (%3,64) idrar kültürü, 3 ü (%5,45) konjunktival sürüntü kültürü, 1 i (%1,82) trakeal aspirat kültürü, 1 i (%1,82) doku kültürü, 3 ü (%5,45) burun sürüntüsü kültürü, 3 ü (%5,45) püy kültürü, 1 i (%1,82) abse kültürü, 1 i (%1,82) periton sıvısı ve 1 i (%1,82) göz sürüntüsü kültüründen izole edilmiştir (Şekil 4.5.). Şekil 4.5. İzole edilen Staphylococcus ların hasta materyallerine göre dağılımı Toplam 15 Candida izolatının 9 u (%60) idrar kültürü, 1 i (6,67) kateter içi kan kültürü, 1 i (%6,67) püy kültürü, 1 i (%6,67) derin trakeal aspirat kültürü, 1 i (%6,67) göğüs tüpü kültürü, 1 i (%6,67) vajen sıvısı kültürü ve 1 i (%6,67) cilt sürüntü kültüründen izole edilmiştir (Şekil 4.6.)

172 137 67% 6,67% Candida 'ların hasta materyallerine göre dağılımı 7% % 6,67% 6,67% 60% İdrar (9) Kateter içi kan (1) Püy (1) Derin trakeal aspirat (1) Göğü tü ü (1) Şekil 4.6. İzole edilen Candida ların hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen 10 Pseudomonas bakterisinin 8 i (%80) Pseudomonas aeruginosa ve 2 si (%20) Pseudomonas fluorescens olarak tanımlanmıştır. İzole edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği klinik kültür materyaline göre dağılımı Çizelge 4.2 de gösterilmiştir. Çizelge 4.2. İzole edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Pseudomonas fluorescens Pseudomonas aeruginosa Toplam Hasta materyali İdrar Balgam 1-1 Yara 1-1 Kist sıvısı Trakeal aspirat Toplam

173 138 Şekil 4.7. İzole edilen Pseudomonas türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen 20 Klebsiella bakterisinin 17 i (% 85) Klebsiella pnemoniae ve 3 si (% 15) Klebsiella ozaenae olarak tanımlanmıştır. İzole edilen Klebsiella türlerinin izole edildikleri klinik kültür materyallerine göre dağılımı Çizelge 4.3 te gösterilmiştir., Çizelge 4.3. İzole edilen Klebsiella türlerinin izole edildikleri klinik kültür materyallerine göre dağılımı Hasta materyali Klebsiella pneumoniae Klebsiella ozaenae Toplam İdrar Kan Balgam Yara Derin trakeal aspirat Toplam

174 139 Şekil 4.8. İzole edilen Klebsiella türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen 55 Staphylococcus bakterisinin 23 ü (% 41,8) Staphylococcus aureus, 11 i ( %20) Staphylococcus epidermidis, 6 sı (%10,9) Staphylococcus haemolyticus, 5 i (%9,1) Staphylococcus saprophyticus, 2 si (%3,64) Staphylococcus warneri, 2 si (%3,64) Staphylococcus vitulus, 2 si (%3,64) Staphylococcus cohnii (Bunların 1 i Staphylococcus cohnii ssp. cohnii,1 i Staphylococcus cohnii ssp.urealyticum), 1 i (% 1,82) Staphylococcus capitis, 1 i (% 1,82) Staphylococcus hominis, 1 i (% 1,82) Staphylococcus intermedius, 1 i (% 1,82) Staphylococcus lugdunensis olarak tanımlanmıştır. İzole edilen Staphylococcus türlerinin, izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı Çizelge 4.4 te gösterilmiştir. Çizelge 4.4. İzole edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı Hasta Mat. İdrar Trk asp. Yara Kan Prt. Svı. Göz sür. D. klt. Konj. Srnt. Kat.i çi kan Brn sür. Püy Abse T. S aureus S epidermidis S haemolyticus

175 140 Çizelge 4.4. (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı S saprophytic us S warneri S vitulus S cohnii S capitis S hominis S intermedius S lugunensis Toplam Hasta mat: Hasta materyali ; Trk. Asp. Trakeal aspirat; Prt. Svı: Periton sıvısı; Göz. Sür.; Göz sürüntüsü; D.Klt: Doku kültürü; Konj. Srnt: Konjunktival sürüntü; Brn.Sür.: Burun sürüntüsü;.

176 141 Şekil 4.9. İzole edilen Staphylococcus türlerinin hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen 15 Candida nın 11 i (%73,3) Candida albicans, 3 ü (%20) Candida tropicalis ve 1 i (%6,7) Candida glabrata olarak tanımlanmıştır. İzole edilen Candida türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı Çizelge 4.5. te gösterilmiştir. Çizelge 4.5. İzole edilen Candida türlerinin, izole edildiği kültür materyallerine göre dağılımı Hasta materyali C.albicans C.tropicalis C.glabrata Toplam İdrar Kateter içi kan Vajen sıvısı Cilt Göğüs tüpü Püy Derin trakeal aspirat Toplam

177 142 Şekil İzole edilen Candida türlerinin hasta materyallerine göre dağılımı 4.1.Biyofilm Çalışması Çalışmada, Ankara daki çeşitli hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından temin edilen klinik kültür materyallerinden Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus ve Candida türleri izole edilmiştir. izolasyonu yapılan bu mikroorganizmalarda biyofilm varlığı araştırılmıştır. Biyofilm varlığı Kristal Viyole boyar maddesi kullanılarak, 24. ve 48. saatler sonunda, 540 nm.dalga boyunda spektrofotometre cihazında okutularak değerlendirilmiştir. Yine biyofilm varlığı, Safranin boyar maddesi kullanılarak, 24. ve 48. Saatler sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında okutularak değerlendirilmiştir. İzolatların biyofilm varlığı çalışmasından elde edilen sonuçlar Çizelge 4.6. da gösterilmiştir.

178 143 Çizelge 4.6. Klinik örneklerden izole edilen mikroorganizmaların biyofilm varlığı Biyofilm Kristal viyole Safranin 24 saat 48 saat 24 saat 48 saat İzolat pozitif negatif pozitif negatif pozitif negatif pozitif negatif Pseudomonas Klebsiella Staphylococcus Candida Toplam Çizelge 4.6 da gösterilen verilere göre, Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışmada 24 saat sonraki değerlendirmede toplam 100 mikroorganizmanın 79 u (%79) biyofilm pozitif, 21 i (%21) biyofilm negatif olarak bulunmuştur. Yine kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışmada 48 saat sonraki değerlendirmede toplam 100 izolatın 67 si (%67) biyofilm pozitif, 33 ü (%33) biyofilm negatif olarak bulunmuştur. Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında, 24 saat sonra yapılan değerlendirmede, toplam 100 izolatın 46 sında (%46) biyofilm varlığı tespit edilirken, 54 ünde (%54) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Yine safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında, 48 saat sonra yapılan değerlendirmede toplam 100 izolatın 74 ünde (%74) biyofilm varlığı tespit edilirken, 26 sında (%26) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Şekil Klinik örneklerden izole edilip biyofilm pozitif olarak tespit edilen mikroorganzmaların dağılımı

179 144 Şekil Biyofilm negatif izolatların cins seviyesinde dağılımı Çalışmada elde edilen biyofilm sonuçlarının, temin edilen hasta materyallerine göre dağılımı Çizelge 4.7 de gösterilmiştir. Çizelge 4.7. Biyofilm sonuçlarının, temin edilen hasta materyallerine göre dağılımı Kristal viyole Biyofilm Safranin 24 saat 48 saat 24 saat 48 saat Hasta materyali pozitif negatif pozitif negatif pozitif negatif pozitif negatif İdrar Kan Yara Trakeal aspirat Konjunktival sürüntü Kist sıvısı Doku kültürü Kateter içi kan Burun sürüntüsü Püy Abse Periton sıvısı Göz sürüntüsü Derin trakeal aspirat Balgam Göğüs tüpü Vajen sıvısı Cilt Toplam

180 Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışma 24 saatlik değerlendirme sonuçları Araştırmada, Ankara daki çeşitli hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından temin edilen toplam 100 hasta materyalinden izole edilen 10 Pseudomonas, 20 Klebsiella, 55 Staphylococcus ve 15 Candida izolatında biyofilm varlığı araştırılmıştır. Bu amaçla yapılan çalışmada Kristal viyole ve Safranin boyar maddeleri kullanılmıştır. Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışmada 24 saat sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge 4.8 de gösterilmiştir. Çizelge 4.8. Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 24 saat süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm Kristal viyole 24 saat İzolat pozitif negatif Pseudomonas 7 3 Klebsiella 8 12 Staphylococcus 52 3 Candida 12 3 Toplam Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında, 24 saatlik süre sonunda yapılan Spektrofotometrik değerlendirmede toplam 100 izolatın 79 unda (%79) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm varlığı tespit edilen bu 79 izolatın 7 si (%8,9) Pseudomonas, 8 i (%10,1) Klebsiella, 52 si (%65,8) Staphylococcus ve 12 si (%15,2) Candida izolatıdır ( Şekil 4.13.)

181 146 Şekil Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 24 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Biyofilm varlığı araştırmasında, kristal viyole kullanılarak, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 10 Pseudomonas cinsi bakterinin 7 si (%70) Biyofilm pozitif, 3 ü (%30) biyofilm negatif olarak bulunmuştur (Şekil 4.14.). Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının % oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas ların izole edildiği toplam 7 hasta materyalinin 1 i (%14,3) balgam, 1 i (%14,3) kist sıvısı ve 5 i (%71,4) idrar kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.15 te gösterilmiştir.

182 147 Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Pseudomonas bakterilerinde biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Pseudomonas türlerine göre dağılımı Çizelge 4.9 da gösterilmiştir. Çizelge 4.9. İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler İzolat no P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Spektrofotometre de elde edilen değerler İzole edilen Pseudomonas türü 24 saat Pseudomonas fluorescens 1,010 Pseudomonas fluorescens 0,119 Pseudomonas aeruginosa 0,189 Pseudomonas aeruginosa 0,245 Pseudomonas aeruginosa 0,286 Pseudomonas aeruginosa 0,506 Pseudomonas aeruginosa 1,670 Pseudomonas aeruginosa 0,131 Pseudomonas aeruginosa 0,465 Pseudomonas aeruginosa 0,108 Kontrol değeri 0,133

183 148 Çizelge 4.9 da gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 24 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,133 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,133 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,133 0,473 aralığında elde edilen değerler (+), 0,474 0,946 aralığındaki değerler (++) ve 0,946 1,892 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.10 da gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas ların 2 si (%28,57) kuvvetli pozitif (+++), 1 i (%14,29) pozitif (++) ve 4 ü (%57,14) zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Pseudomonas türleri Şekil 4.16 da gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar İzolat no P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 İzole edilen Pseudomonas türü Biyofilm varlığı kristal viyole 24 saat 540 nm. Pseudomonas fluorescens (+++) Pseudomonas fluorescens (-) Pseudomonas aeruginosa (+) Pseudomonas aeruginosa (+) Pseudomonas aeruginosa (+) Pseudomonas aeruginosa (++) Pseudomonas aeruginosa (+++) Pseudomonas aeruginosa (-) Pseudomonas aeruginosa (+) Pseudomonas aeruginosa (-) Kontrol değeri 0,133 Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 10 Pseudomonas izolatının 8 ini oluşturan P.aeruginosa türünün 6 sı biyofilm pozitif, 2 si biyofilm

184 149 negatif olarak tespit edilmiştir. İzole edilen 2 P.fluorescens türünün ise 1 i biyofilm pozitif olarak tespit edilirken, 1 i biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.16.). Şekil Pseudomonas türlerinde kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saat sonunda biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 8 Pseudomonas aeruginosa türünün 6 sında (%75kristal viole kullanılarak 24 saat sonunda 540 nm. dalga boyunda biyofilm varlığı tespit edilirken 2 sinde (%25) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. 2 P.fluorescens izolatının 1 inde (%50) biyofilm varlığı gösterilirkeni 1 nde (%50) biyofilm varlığı gösterilememiştir.biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Pseudomonas türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.11 de gösterilmiştir. Çizelge Kristal viyole kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Hasta materyali İzole edilen tür Biyofilm varlığı balgam Pseudomonas fluorescens (+++) idrar Pseudomonas aeruginosa (+) kist sıvısı Pseudomonas aeruginosa (+) idrar Pseudomonas aeruginosa (+) idrar Pseudomonas aeruginosa (++) idrar Pseudomonas aeruginosa (+++) idrar Pseudomonas aeruginosa (+) Toplam 7

185 150 Çizelge 4.11 de gösterilen sonuçlara göre, kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilen 2 Pseudomonas izolatı (1 Pseudomonas aeruginosa ve 1 Pseudomonas fluorescens) balgam ve idrar kültürlerinden izole edilmiştir. Şekil Kristal viyole kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saat sonunda kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas türleri Çizelge Kristal viyole kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Hasta materyali İzole edilen tür Biyofilm varlığı yara Pseudomonas fluorescens (-) trakeal aspirat Pseudomonas aeruginosa (-) idrar Pseudomonas aeruginosa (-) Toplam 3 Biyofilm varlığı araştırmasında, kristal viyole kullanılarak, 24 saatli süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, klinik kültür materyallerinden izole edilen toplam 20 Klebsiella cinsi bakterinin 8 i (%40) Biyofilm pozitif, 12 si (%60) biyofilm negatif olarak bulunmuştur (Şekil 4.18.).

186 151 Şekil Klebsiella izolatlarında, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 540 nm.dalga boyunda 24 saat sonra yapılan spektrofotometrik okumada biyofilm varlığının oranı Kristal viyole kullanılarak, 540 nm dalga boyunda 24 saat sonra biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella ların izole edildiği toplam 8 hasta materyalinin 3 ü (%37,5) idrar, 2 si (%25) kan, 2 si (%25) derin trakeal aspirat ve 1 i (%12,5) yara kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.19 da gösterilmiştir. Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Klebsiella bakterilerinde biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Klebsiella türlerine göre dağılımı Çizelge 4.13 de gösterilmiştir.

187 152 Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrikdeğerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen tür 24 saat K1 Klebsiella pneumoniae 0,095 K2 Klebsiella pneumoniae 0,072 K3 Klebsiella pneumoniae 0,329 K4 Klebsiella ozaenae 0,148 K5 Klebsiella pneumoniae 0,156 K6 Klebsiella pneumoniae 0,096 K7 Klebsiella pneumoniae 0,354 K8 Klebsiella pneumoniae 0,068 K9 Klebsiella ozaenae 0,084 K10 Klebsiella pneumoniae 0,090 K11 Klebsiella pneumoniae 0,077 K12 Klebsiella pneumoniae 0,109 K13 Klebsiella pneumoniae 0,182 K14 Klebsiella pneumoniae 0,201 K15 Klebsiella pneumoniae 0,080 K16 Klebsiella pneumoniae 0,096 K17 Klebsiella pneumoniae 0,103 K18 Klebsiella pneumoniae 0,075 K19 Klebsiella pneumoniae 0,176 K20 Klebsiella ozaenae 0,182 Kontrol değeri Çizelge 4.13 te gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 24 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,133 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar çok kuvvetli pozitif (+++), kuvvetli pozitif (++), pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,133 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,133 0,473 aralığında elde edilen değerler (+), 0,474 0,946 aralığındaki değerler (++) ve 0,946 1,892 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde

188 153 edilen verilerin kuvvetli pozitif, pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.14 te gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre, toplam 20 Klebsiella izolatının 17 sini oluşturan Klebsiella pneuminiae türünün 6 sı biyofilm pozitif, 11 i biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir (Şekil ) Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar İzolat no İzole edilen tür Biyofilm varlığı-kristal viyole 24 saat-540 nm. K1 Klebsiella pneumoniae (-) K2 Klebsiella pneumoniae (-) K3 Klebsiella pneumoniae (+) K4 Klebsiella ozaenae (+) K5 Klebsiella pneumoniae (+) K6 Klebsiella pneumoniae (-) K7 Klebsiella pneumoniae (+) K8 Klebsiella pneumoniae (-) K9 Klebsiella ozaenae (-) K10 Klebsiella pneumoniae (-) K11 Klebsiella pneumoniae (-) K12 Klebsiella pneumoniae (-)

189 154 Çizelge 4.14.(Devam) İzole edilen Klebsiella türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar K13 Klebsiella pneumoniae (+) K14 Klebsiella pneumoniae (+) K15 Klebsiella pneumoniae (-) K16 Klebsiella pneumoniae (-) K17 Klebsiella pneumoniae (-) K18 Klebsiella pneumoniae (-) K19 Klebsiella pneumoniae (+) K20 Klebsiella ozaenae (+) Toplam 20 Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Klebsiella ların hepsi zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. Bu Klebsiella türleri Şekil 4.21 de gösterilmiştir. Şekil Kristal viyole kullanılarak, 540 nm dalga boyunda, 24 saat süre sonunda yapılan biyofilm değerlendirmesinde zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella türleri Kristal viyole kullanılarak 540 nm. dalga boyunda 24 saat sonra yapılan biyofilm değerlendirmesinde, hasta materyallerinden izole edilen 17 Klebsiella pneumoniae türünün 6 sında (%3,.3) biyofilm varlığı tespit edilirken 11 inde (%64,7) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.15 te gösterilmiştir.

190 155 Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı-kristal viyole Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat-540 nm. idrar Klebsiella pneumoniae (+) idrar Klebsiella ozaenae (+) kan Klebsiella pneumoniae (+) kan Klebsiella pneumoniae (+) derin trakeal aspirat Klebsiella pneumoniae (+) derin trakeal aspirat Klebsiella pneumoniae (+) idrar Klebsiella pneumoniae (+) yara Klebsiella ozaenae (+) Toplam 8 Çizelge 4.15 te gösterilen sonuçlara göre, zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen 6 Klebsiella pneumoniae izolatının 2 si idrar, 2 si kan ve 2 si derin trakeal aspirat kültürlerinden izole edilmiştir. Zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen 2 Klebsiella ozaenae izolatının 1 i idrar, 1 i yara kültüründen izole edilmiştir.biyofilm negatif (-) olarak tespit edilen Klebsiella izolatının 8 i idrar, 1 i balgam, 2 si kan ve 1 i yara kültüründen izole edilmiştir (Çizelge ) Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat idrar Klebsiella pneumoniae (-) idrar Klebsiella pneumoniae (-) balgam Klebsiella pneumoniae (-) kan Klebsiella pneumoniae (-) yara Klebsiella ozaenae (-) kan Klebsiella pneumoniae (-)

191 156 Çizelge (Devamı) 24 saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyallerine göre dağılımı idrar Klebsiella pneumoniae (-) idrar Klebsiella pneumoniae (-) idrar Klebsiella pneumoniae (-) idrar Klebsiella pneumoniae (-) idrar Klebsiella pneumoniae (-) idrar Klebsiella pneumoniae (-) Toplam 12 Biyofilm varlığı araştırnasında, kristal viyole kullanılarak, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 55 Staphylococcus cinsi bakterinin 52 sinde (%94,5) Biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%5,5) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.22 ) Şekil Staphylococus izolatlarında kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda 24 saatlik spektrofotometrk değerlendirmede biyofilm varlığının oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus ların izole edildiği toplam 52 hasta materyalinin 25 i (%48,1) kan, 12 si (%21,8) yara, 3 ü (%5,5) konjunktival sürüntü, 3 ü (%5,5) püy, 2 si (%3,6) idrar, 1 i (%1,8) trakeal aspirat, 1 i (%1,8) doku, 1 i (%1,8) kateter içi kan, 1 i (%1,8) burun sürüntüsü, 1 i (%1,8) abse, 1 i (%1,8) periton sıvısı ve 1 i (%1,8) i göz sürüntüsü kültürleridir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.23 te gösterilmiştir.

192 Hasta materyal miktarı Kan Yara Konjunktival sürüntü Püy İdrar Trakeal aspirat Doku Kateter içi kan Burun sürüntüsü Abse Periton sıvısı Göz sürüntüsü Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Staphylococcus bakterilerilerinde biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 540 nm. daşga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile edile edilen sonuçların, Staphylococcus türlerine göre dağılımı Çizelge 4.17 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 24 saat S1 Staphylococcus vitulus 0,383 S2 Staphylococcus saprophyticus S3 Staphylococcus aureus 0,182 S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum 0,089 S5 Staphylococcus aureus 0,226 S6 Staphylococcus aureus 0,578 S7 Staphylococcus aureus 0,425 S8 Staphylococcus aureus 0,329

193 158 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S8 Staphylococcus capitis 0,111 S10 Staphylococcus aureus 0,240 S11 Staphylococcus aureus 0,437 S12 Staphylococcus aureus 0,202 S13 Staphylococcus aureus 0,430 S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii S15 Staphylococcus saprophyticus 0,276 S16 Staphylococcus aureus 0,895 S17 Staphylococcus aureus 0,572 S18 Staphylococcus epidermidis S19 Staphylococcus aureus 0,456 S20 Staphylococcus aureus 0,377 S21 Staphylococcus aureus 0,811 S22 Staphylococcus aureus 0,706 S23 Staphylococcus aureus 0,721 S24 Staphylococcus aureus 0,986 S25 Staphylococcus hominis 0,14 S26 Staphylococcus aureus 0,290 S27 Staphylococcus epidermidis 0,305 S28 Staphylococcus epidermidis S29 Staphylococcus aureus 0,958 S30 Staphylococcus epidermidis S31 Staphylococcus aureus 0,586 S32 Staphylococcus warneri S33 Staphylococcus epidermidis 0,913 S34 Staphylococcus epidermidis S35 Staphylococcus epidermidis 0,823 S36 Staphylococcus saprophyticus 0,151 S37 Staphylococcus epidermidis S38 Staphylococcus saprophyticus 0,508 S39 Staphylococcus epidermidis S40 Staphylococcus warneri 0,393 S41 Staphylococcus intermedius 0,356 S42 Staphylococcus epidermidis 0,092 S43 Staphylococcus haemolyticus 0,405 S44 Staphylococcus aureus 0,717

194 159 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S45 Staphylococcus haemolyticus 0,428 S46 Staphylococcus haemolyticus 0,444 S47 Staphylococcus haemolyticus 0,407 S48 Staphylococcus epidermidis 0,273 S48 Staphylococcus haemolyticus 0,749 S50 Staphylococcus saprophyticus 0,160 S51 Staphylococcus vitulus 0,147 S52 staphylococcus lugdunensis 0,310 S53 Staphylococcus aureus 0,895 S54 Staphylococcus aureus 0,470 S55 Staphylococcus haemolyticus 0,109 Kontrol değeri Çizelge de gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. bu çalışma sırasıbda, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,124 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,124 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,124 0,372 aralığında elde edilen değerler (+), 0,373 0,746 aralığında elde edilen değerler (++) olarak sınıflandırılmıştır. 0,747 1,497 değerleri aralığında ve 1, 497 değerinden yüksek elde edilen değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge de gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Staphylococcus ların 16 sı (%30,8) kuvvetli pozitif (+++), 19 u (%36,5) pozitif (++) ve 15 i (%23,1) zayıf pozitif olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Staphylococcus türleri Çizelge 4.18 de gösterilmiştir.

195 160 Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm varlığı İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 24 saat S1 Staphylococcus vitulus(s.pulvereri,s.vitulinus) (++) S2 Staphylococcus saprophyticus (+++) S3 Staphylococcus aureus (+) S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum (-) S5 Staphylococcus aureus (+) S6 Staphylococcus aureus (++) S7 Staphylococcus aureus (++) S8 Staphylococcus aureus (+) S8 Staphylococcus capitis (-) S10 Staphylococcus aureus (+) S11 Staphylococcus aureus (++) S12 Staphylococcus aureus (+) S13 Staphylococcus aureus (++) S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (+++) S15 Staphylococcus saprophyticus (+) S16 Staphylococcus aureus (+++) S17 Staphylococcus aureus (++) S18 Staphylococcus epidermidis (+++) S19 Staphylococcus aureus (++) S20 Staphylococcus aureus (++) S21 Staphylococcus aureus (++) S22 Staphylococcus aureus (++) S23 Staphylococcus aureus (++) S24 Staphylococcus aureus (+++) S25 Staphylococcus hominis (+) S26 Staphylococcus aureus (+) S27 Staphylococcus epidermidis (+) S28 Staphylococcus epidermidis (+++) S29 Staphylococcus aureus (+++) S30 Staphylococcus epidermidis (+++) S31 Staphylococcus aureus (++) S32 Staphylococcus warneri (+++) S33 Staphylococcus epidermidis (+++) S34 Staphylococcus epidermidis (+++)

196 161 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerinde, kristal viyole kullanı larak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatliksüre sonunda elde edilen sonuçlar S35 Staphylococcus epidermidis (+++) S36 Staphylococcus saprophyticus (+) S37 Staphylococcus epidermidis (+++) S38 Staphylococcus saprophyticus (++) S39 Staphylococcus epidermidis (+++) S40 Staphylococcus warneri (++) S41 Staphylococcus intermedius (+) S42 Staphylococcus epidermidis (-) S43 Staphylococcus haemolyticus (++) S44 Staphylococcus aureus (++) S45 Staphylococcus haemolyticus (++) S46 Staphylococcus haemolyticus (++) S47 Staphylococcus haemolyticus (++) S48 Staphylococcus epidermidis (+) S48 Staphylococcus haemolyticus (+++) S50 Staphylococcus saprophyticus (+) S51 Staphylococcus vitulus(s.pulvereri,s.vitulinus) (+) S52 staphylococcus lugdunensis (+) S53 Staphylococcus aureus (+++) S54 Staphylococcus aureus (++) S55 Staphylococcus haemolyticus (-) Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 55 Staphylococcus izolatının 52 sinde (% 94,5) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm pozitif bu 52 Staphylococcus izolatının 23 ü S.aureus, 10 u S.epidermidis, 5 i S.saprophyticus,5 i S. haemolyticus, 2 si S.warneri, 2 si S.vitulus, 1 i S.intermedius, 1 i S.lugdunensis, 1.S.cohnii ssp. cohnii ve 1 i S. hominis tir ( Şekil 4. 24)

197 162 Şekil Biyofilm varlığı sonuçlarının, Staphylococcus türlerine göre dağılımı Hasta materyallerinden izole edilen toplam 23 S.aureus türünün hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.25 ) Şekil İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı İzole edilen toplam 11 S.epidermidis türünün 10 unda (%90,9) biyofilm varlığı tespit edilirken, 1 inde (%9,9) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.26 )

198 163 Şekil S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 6 S.haemolyticus izolatının 5 inde (%83,3) biyofilm varlığı tespit edilirken, 1 inde (%16,7) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.27) Şekil S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 5 S.saprophyticus izolatının hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4. 28) Şekil 4.28.S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı

199 164 Toplam 2 S.waneri izolatının hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.29) Şekil S.warneri izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 2 S.hominis izolatının hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.30) Şekil S.hominis izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 1 S.intermedius izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.31) Şekil S.intermedius izolatında biyofilm varlığı Toplam 1 S.lugdunensis izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.32)

200 165 Şekil 4.32.S.lugdunensis izolatında biyofilm varlığı Toplam 2 S.cohnii izolatının 1 inde (%50) Biyofilm varlığı tespit edilirken, 1 inde (%50) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. (Şekil 4.33) Şekil S.cohnii izolatlarında biyofilm varlığı Biyofilm pozitif olarak tespit edilen S.cohnii alttürü S.cohnii ssp. cohnii olarak belirlenmiştir. Biyofilm negatif olarak tespit edilen S.cohnii alttürü S.cohnii ssp. urealyticum olarak belirlenmiştir. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.19 da gösterilmiştir. Çizelge Byofilm pozitif staphylococcus türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Hasta materyali İzole edilen Staphylococcus türü Biyofilm varlığı 24 saat İdrar Staphylococcus vitulus (++) Trakeal aspirat Staphylococcus saprophyticus (+++)

201 166 Çizelge (Devam)Byofilm pozitif staphylococcus türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Yara Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (++) Kan Staphylococcus aureus (++) Doku Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (++) Konjunktival sürüntü Staphylococcus aureus (+) Kateter içi kan Staphylococcus aureus (++) Yara Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (+++) Yara Staphylococcus saprophyticus (+) Kan Staphylococcus aureus (+++) Yara Staphylococcus aureus (++) Kan Staphylococcus epidermidis (+++) Yara Staphylococcus aureus (++) Kan Staphylococcus aureus (++) Kan Staphylococcus aureus (++) Yara Staphylococcus aureus (++) Yara Staphylococcus aureus (++) Kan Staphylococcus aureus (+++) Kan Staphylococcus hominis (+) Yara Staphylococcus aureus (+) Burun sürüntüsü Staphylococcus epidermidis (+) Yara Staphylococcus epidermidis (+++) Konjunktival sürüntü Staphylococcus aureus (+++) Kan Staphylococcus epidermidis (+++) Kan Staphylococcus aureus (++) Yara Staphylococcus warneri (+++) Kan Staphylococcus epidermidis (+++) Konjunktival sürüntü Staphylococcus epidermidis (+++) Kan Staphylococcus epidermidis (+++) Kan Staphylococcus saprophyticus (+) Püy Staphylococcus epidermidis (+++) Kan Staphylococcus saprophyticus (++) Abse Staphylococcus epidermidis (+++) Püy Staphylococcus warneri (++) Püy Staphylococcus intermedius (+) Kan Staphylococcus haemolyticus (++)

202 167 Çizelge (Devam)Byofilm pozitif staphylococcus türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Kan Staphylococcus aureus (++) Periton sıvısı Staphylococcus haemolyticus (++) İdrar Staphylococcus haemolyticus (++) Kan Staphylococcus haemolyticus (++) Kan Staphylococcus epidermidis (+) Kan Staphylococcus haemolyticus (+++) Kan Staphylococcus saprophyticus (+) Kan Staphylococcus vitulus (+) Yara Staphylococcus lugdunensis (+) Kan Staphylococcus aureus (+++) Göz Staphylococcus aureus (++) Çalışmada elde edilen sonuçların kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak sınıflandırılması ile elde edilen verilerin, izole edilen Staphylococcus türlerine göre dağılımı Şekil 4.34 de gösterilmiştir. 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, (+++) (++) (+) Şekil Kuvvetli pozitif (+++), Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus türleri

203 168 Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Spektrofotometrede elde edilen değer Hasta materyali İzole edilen Staphylococcus türü 24 saat Staphylococcus cohnii ssp. Kan urealyticum (-) Yara Staphylococcus capitis (-) Kan Staphylococcus epidermidis (-) Kan Staphylococcus haemolyticus (-) Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm araştırmasında, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik değerlendirmede, hasta materyallerindenizole edilmiş olan toplam 15 Candida cinsi mayanın 12 sinde (%80) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%20) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.35) Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Biyofilm varlığı tespit edilen Candida ların izole edildiği toplam 12 hasta materyalinin 7 si (%58,3) idrar, 1 i (%8,3) vajen sıvısı, 1 i (%8,3) cilt, 1 i (%8,3) püy, 1 i (%8,3) derin trakeal aspirat ve 1 i (%8,3) göğüs tüpü kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil de gösterilmiştir.

204 169 Şekil 4.36 Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Candida larda biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile edilde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Candida türlerine göre dağılımı Çizelge de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler İzolat no İzole edilen Candida türü 24 saat C1 C.tropicalis 0,128 C2 C.tropicalis 0,13 C3 C.glabrata 0,147 C4 C.albicans 0,087 C5 C.albicans 0,149 C6 C.albicans 0,179 C7 C.albicans 0,09 C8 C.albicans 0,133 C9 C.albicans 0,145 C10 C.albicans 0,138 C11 C.albicans 0,129 C12 C.albicans 0,127 Spektrofotometrede elde edilen değerler

205 170 Çizelge (Devam) İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler C13 C.albicans 0,139 C14 C.tropicalis 0,129 C15 C.albicans 0,12 Kontrol değeri Çizelge 4.21 de gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. bu çalışma sırasıbda, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,124 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,124 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,124 0,372 aralığında elde edilen değerler (+), 0,373 0,746 aralığında elde edilen değerler (++) olarak sınıflandırılmıştır. 0,747 1,497 değerleri aralığında ve değerinden yüksek elde edilen değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.22 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Candida türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar İzolat no İzole edilen Candida türü Biyofilm varlığı 24 saat C1 C.tropicalis (+) C2 C.tropicalis (+) C3 C.glabrata (+) C4 C.albicans (-) C5 C.albicans (+) C6 C.albicans (+) C7 C.albicans (-) C8 C.albicans (+)

206 171 Çizelge (Devam) İzole edilen Candida türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonun da elde edilen sonuçlar C9 C.albicans (+) C10 C.albicans (+) C11 C.albicans (+) C12 C.albicans (+) C13 C.albicans (+) C14 C.tropicalis (+) C15 C.albicans (-) Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida ların hepsi zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. İzole edilen toplam 15 Candida nın 11 ini oluşturan C. albicans türünün 8 i biyofilm pozitif, 3 ü biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir. İzole edilen 3 C. tropicalis türünün hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir.toplam 1 C.glabrata izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir(şekil 4.37.). Şekil Candida türlerinde biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 11 C.albicans türünün 8 inde (%72,7) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%27,3) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Toplam 3 C.izolatının izolatının hepsinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Toplam 1 C.tropicalis izolatında %100 oranında biyofilm oluşumuna rastlanmıştır. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Candida türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.23 te gösterilmiştir.

207 172 Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılım Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat idrar C.tropicalis (+) idrar C.tropicalis (+) idrar C.glabrata (+) vajen C.albicans (+) idrar C.albicans (+) cilt C.albicans (+) idrar C.albicans (+) göğüs tüpü C.albicans (+) idrar C.albicans (+) püy C.albicans (+) dta C.albicans (+) idrar C.tropicalis (+) Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat kateter C.albicans (-) idrar C.albicans (-) idrar C.albicans (-) 48 saatlik değerlendirme sonuçları Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışmada 48 saat sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge 4.25 te gösterilmiştir.

208 173 Çizelge Kristal viyole ile yapılan çalışmada 48 saat sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm Kristal viyole 48 saat İzolat pozitif negatif Pseudomonas 6 4 Klebsiella 7 13 Staphylococcus Candida 12 3 Toplam Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında, 48 saatlik süre sonunda yapılan Spektrofotometrik değerlendirmede toplam 100 izolatın 67 sinde (%67) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm varlığı tespit edilen bu 79 izolatın 6 sı (%8,96) Pseudomonas, 7 si (%10,45) Klebsiella, 42 si (%62,69) Staphylococcus ve 12 si (%15,2) Candida izolatıdır ( Şekil 4.38) Şekil Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 48 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Biyofilm varlığı araştırmasında, kristal viyole kullanılarak, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 10 Pseudomonas cinsi bakterinin 6 sı (%60) Biyofilm pozitif, 4 ü (%40) biyofilm negatif olarak bulunmuştur (Şekil 4.39).

209 174 Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas ların izole edildiği toplam 6 hasta materyalinin 4 ü (%66,7) idrar, 1 i (%16,7) kist sıvısı ve 1 i (%16,7) trakeal aspirat kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.40 ta gösterilmiştir. Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Pseudomonas bakterilerinde biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Pseudomonas türlerine göre dağılımı Çizelge da gösterilmiştir.

210 175 Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Spektrofotometre de elde edilen değerler İzolat no İzole edilen Pseudomonas türü 48 saat P1 Pseudomonas fluorescens 0,132 P2 Pseudomonas fluorescens 0,159 P3 Pseudomonas aeruginosa 0,201 P4 Pseudomonas aeruginosa 0,249 P5 Pseudomonas aeruginosa 0,192 P6 Pseudomonas aeruginosa 0,129 P7 Pseudomonas aeruginosa 0,111 P8 Pseudomonas aeruginosa 0,347 P9 Pseudomonas aeruginosa 0,546 P10 Pseudomonas aeruginosa 0,218 Kontrol değeri 0,184 Çizelge 4.26 da gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 48 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,184 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,184 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,184 0,368 aralığında elde edilen değerler (+), 0,369 0,554 aralığındaki değerler (++) ve 0,555 0,736 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.27 de gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas ların 2 si (%28,57) kuvvetli pozitif (+++), 1 i (%14,29) pozitif (++) ve 4 ü (%5,14) zayıf

211 176 pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Pseudomonas türleri Şekil 4.41 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm varlığı İzolat İzole edilen Pseudomonas türü 48 saat no P1 Pseudomonas fluorescens (-) P2 Pseudomonas fluorescens (-) P3 Pseudomonas aeruginosa (+) P4 Pseudomonas aeruginosa (+) P5 Pseudomonas aeruginosa (+) P6 Pseudomonas aeruginosa (-) P7 Pseudomonas aeruginosa (-) P8 Pseudomonas aeruginosa (+) P9 Pseudomonas aeruginosa (++) P10 Pseudomonas aeruginosa (+) Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 10 Pseudomonas izolatının 8 ini oluşturan P.aeruginosa türünün 6 sı biyofilm pozitif, 2 si biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir. İzole edilen 2 P.fluorescens türünün ise, 2 si biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.41).

212 177 Şekil Pseudomonas türlerinde biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 8 Pseudomonas aeruginosa türünün 6 sında (%75) biyofilm varlığı tespit edilirken 2 sinde (%25) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. 2 P.fluorescens izolatının hiçbirinde (%0) biyofilm varlığı gösterilememiştir. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Pseudomonas türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.28 de gösterilmiştir. Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen Pseudomonas türü 48 saat idrar Pseudomonas aeruginosa (+) kist sıvısı Pseudomonas aeruginosa (+) idrar Pseudomonas aeruginosa (+) trakeal aspirat Pseudomonas aeruginosa (+) idrar Pseudomonas aeruginosa (++) idrar Pseudomonas aeruginosa (+) Çizelge 4.28 de gösterilen sonuçlara göre, pozitif (++) olarak tespit edilen 1 Pseudomonas izolatı idrar kültüründen izole edilmiştir.

213 178 Şekil Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas türleri Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Hasta materyali İzole edilen Pseudomonas türü Biyofilm varlığı 48 saat Balgam Pseudomonas fluorescens (-) Yara Pseudomonas fluorescens (-) İdrar Pseudomonas aeruginosa (-) İdrar Pseudomonas aeruginosa (-) Biyofilm varlığı araştırmasında, kristal viyole kullanılarak, 48 saatli süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, klinik kültür materyallerinden izole edilen toplam 20 Klebsiella cinsi bakterinin 7 si (%35) Biyofilm pozitif, 13 si (%65) biyofilm negatif olarak bulunmuştur (Şekil 4.43).

214 179 Şekil Klebsiella izolatlarında biyofilm varlığının oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella ların izole edildiği toplam 7 hasta materyalinin 2 si (%28,6) kan, 2 si (%28,6) yara, 1 i (%14,3) idrar, 1 i (%14,3) balgam ve 1 i (%14,3) derin trakeal aspirat kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.44 te gösterilmiştir Hasta materyali Kan Yara İdrar Balgam derin trakeal aspirat Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Klebsiella bakterilerinde biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Klebsiella türlerine göre dağılımı Çizelge 4.30 da gösterilmiştir.

215 180 Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen tür 48 saat Klebsiella pneumoniae K1 Klebsiella pneumoniae 0,144 K2 Klebsiella pneumoniae 0,130 K3 Klebsiella ozaenae 0,125 K4 Klebsiella pneumoniae 0,132 K5 Klebsiella pneumoniae 0,257 K6 Klebsiella pneumoniae 0,199 K7 Klebsiella pneumoniae 0,306 K8 Klebsiella ozaenae 0,198 K9 Klebsiella pneumoniae 0,129 K10 Klebsiella pneumoniae 0,161 K11 Klebsiella pneumoniae 0,156 K12 Klebsiella pneumoniae 0,372 K13 Klebsiella pneumoniae 0,146 K14 Klebsiella pneumoniae 0,148 K15 Klebsiella pneumoniae 0,102 K16 Klebsiella pneumoniae 0,123 K17 Klebsiella pneumoniae 0,117 K18 Klebsiella pneumoniae 0,149 K19 Klebsiella ozaenae 0,619 K20 Kontrol değeri 0,184

216 181 Çizelge 4.30 da gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 48 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,184 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,184 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,184 0,368 aralığında elde edilen değerler (+), 0,369 0,552 aralığındaki değerler (++) ve 0,553 1,104 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.31 de gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella ların 2 si (%28,57) kuvvetli pozitif (+++), 1 i (%14,29) pozitif (++) ve 4 ü (%57,14) zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Klebsiella türleri Şekil 4.45 te gösterilmiştir. Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı Biyofilm varlığının toplam 20 Klebsiella izolatının 17 sini oluşturan Klebsiella pneuminiae türünün 5 i biyofilm pozitif, 12 si biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir.

217 182 Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar İzolat no K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K20 Biyofilm İzole edilen tür varlığı 48 saat Klebsiella pneumoniae (+++) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella ozaenae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella ozaenae (+) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (++) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella ozaenae (+++) Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen 5 K. pneumonia izolatının 1 i kuvvetli pozitif (+++), 1 i pozitif (++) ve 3 ü zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. 3 K.ozaenae

218 183 izolatının 1 i kuvvetli pozitif (+++) ve 1 i zayıf pozitif (+) olarak değerlendirilmiştir. Bu Klebsiella türlerinin dağılımı Şekil 4.46 da gösterilmiştir. Şekil (+++), (++) ve (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella türleri Hasta materyalinden izole edilen 17 Klebsiella pneumoniae türünün 5 inde (%29,4) biyofilm varlığı tespit edilirken 12 inde (%70,6) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.32 de gösterilmiştir. Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat idrar Klebsiella pneumoniae (+++) balgam Klebsiella ozaenae (+) kan Klebsiella pneumoniae (+) kan Klebsiella pneumoniae (+) yara Klebsiella ozaenae (+) derin trakeal aspirat Klebsiella pneumoniae (+) yara Klebsiella ozaenae (+++)

219 184 Çizelge 4.32 de gösterilen sonuçlara göre, kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilen 1 Klebsiella pneumoniae izolatının idrar kültüründen, zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen 3 K.pneumoniae izolatının 1 i derin trakeal aspirat, 2 si kan kültürlerinden izole edilmiştir. Kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilen 1 K.ozaenae izolatı yara kültüründen, zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen 1 K.ozaenae izolatı balgam kültüründen izole edilmiştir. Biyofilm negatif (-) olarak tespit edilen 13 Klebsiella izolatının 10 u idrar, 2 si kan, 1 i derin trakeal aspirat kültürlerinden izole edilmiştir (Çizelge 4.33.) Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali idrar idrar idrar kan kan idrar idrar derin trakeal aspirat idrar idrar idrar idrar idrar İzole edilen tür 48 saat Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella ozaenae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-)

220 185 Biyofilm varlığı araştırnasında, kristal viyole kullanılarak, 48 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 55 Staphylococcus cinsi bakterinin 42 sinde (%76,4) Biyofilm varlığı tespit edilirken, 13 ünde (%23,6) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil ) Şekil Staphylococus izolatlarında biyofilm varlığının oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus ların izole edildiği toplam 42 hasta materyalinin 21 i (%50) kan, 9 u (%21,4) yara, 2 si (%4,76) konjunktival sürüntü, 2 si (%4,76) püy, 1 i (%2,38) idrar, 1 i (%2,38) trakeal aspirat, 1 i (%2,38) doku, 1 i (%2,38) kateter içi kan, 1 i (%2,38) burun sürüntüsü, 1 i (%2,38) abse, 1 i (%2,38) periton sıvısı ve 1 i (%2,38) göz sürüntüsü kültürleridir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.48 de gösterilmiştir.

221 186 Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Staphylococcus bakterilerilerinde biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 540 nm. daşga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile edile edilen sonuçların, Staphylococcus türlerine göre dağılımı Çizelge 4.34 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 48 saat S1 Staphylococcus vitulus 0,820 S2 Staphylococcus saprophyticus 0,296 S3 Staphylococcus aureus S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum 0,251

222 187 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S5 Staphylococcus aureus 0,098 S6 Staphylococcus aureus 0,123 S7 Staphylococcus aureus 0,163 S8 Staphylococcus aureus 0,185 S8 Staphylococcus capitis 0,358 S10 Staphylococcus aureus 0,269 S11 Staphylococcus aureus 0,255 S12 Staphylococcus aureus 0,407 S13 Staphylococcus aureus 0,544 S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii 0,093 S15 Staphylococcus saprophyticus 0,162 S16 Staphylococcus aureus 0,228 S17 Staphylococcus aureus 0,141 S18 Staphylococcus epidermidis 0,179 S19 Staphylococcus aureus 0,239 S20 Staphylococcus aureus 0,218 S21 Staphylococcus aureus 0,185 S22 Staphylococcus aureus 0,197 S23 Staphylococcus aureus 0,213 S24 Staphylococcus aureus 0,188 S25 Staphylococcus hominis 0,137 S26 Staphylococcus aureus 0,801 S27 Staphylococcus epidermidis 0,229

223 188 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S28 Staphylococcus epidermidis 0,347 S29 Staphylococcus aureus 0,165 S30 Staphylococcus epidermidis 0,420 S31 Staphylococcus aureus 0,445 S32 Staphylococcus warneri 0,241 S33 Staphylococcus epidermidis 0,957 S34 Staphylococcus epidermidis 0,274 S35 Staphylococcus epidermidis S36 Staphylococcus saprophyticus 0,587 S37 Staphylococcus epidermidis S38 Staphylococcus saprophyticus 0,217 S39 Staphylococcus epidermidis 0,174 S40 Staphylococcus warneri 0,084 S41 Staphylococcus intermedius 0,279 S42 Staphylococcus epidermidis 0,222 S43 Staphylococcus haemolyticus 0,249 S44 Staphylococcus aureus 0,593 S45 Staphylococcus haemolyticus 0,322 S46 Staphylococcus haemolyticus 0,167 S47 Staphylococcus haemolyticus 0,147 S48 Staphylococcus epidermidis 0,310 S48 Staphylococcus haemolyticus 0,286 S50 Staphylococcus saprophyticus 0,091

224 189 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S51 Staphylococcus vitulus 0,270 S52 staphylococcus lugdunensis 0,164 S53 Staphylococcus aureus S54 Staphylococcus aureus 0,613 S55 Staphylococcus haemolyticus Kontrol değeri Çizelge 4.34 te gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,171 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,171 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,171 0,342 aralığında elde edilen değerler (+), 0,343 0,684 aralığında elde edilen değerler (++) olarak sınıflandırılmıştır. 0, değerleri aralığında ve değerinden yüksek elde edilen değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.35 te gösterilmiştir. Çizelge Staphylococcus izolatlarının kristal viyole kullanılarak 24 saat sonra spektrofotometrede elde edilen değerler Biyofilm varlığı İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 24 saat S1 Staphylococcus vitulus(s.pulvereri,s.vitulinus) 48 saat S2 Staphylococcus saprophyticus (+++) S3 Staphylococcus aureus (+)

225 190 Çizelge 4.35.(Devam) Staphylococcus izolatlarının kristal viyole kullanılarak 24 saat sonra spektrofotometrede elde edilen değerler S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum (+++) S5 Staphylococcus aureus (+) S6 Staphylococcus aureus (-) S7 Staphylococcus aureus (-) S8 Staphylococcus aureus (-) S8 Staphylococcus capitis (+) S10 Staphylococcus aureus (++) S11 Staphylococcus aureus (+) S12 Staphylococcus aureus (+) S13 Staphylococcus aureus (++) S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (++) S15 Staphylococcus saprophyticus (-) S16 Staphylococcus aureus (-) S17 Staphylococcus aureus (+) S18 Staphylococcus epidermidis (-) S19 Staphylococcus aureus (+) S20 Staphylococcus aureus (+) S21 Staphylococcus aureus (+) S22 Staphylococcus aureus (+) S23 Staphylococcus aureus (+) S24 Staphylococcus aureus (+) S25 Staphylococcus hominis (+) S26 Staphylococcus aureus (-) S27 Staphylococcus epidermidis (+++) S28 Staphylococcus epidermidis (+) S29 Staphylococcus aureus (++)

226 191 Çizelge 4.35.(Devam) Staphylococcus izolatlarının kristal viyole kullanılarak 24 saat sonra spektrofotometrede elde edilen değerler S30 Staphylococcus epidermidis (-) S31 Staphylococcus aureus (++) S32 Staphylococcus warneri (++) S33 Staphylococcus epidermidis (+) S34 Staphylococcus epidermidis (+++) S35 Staphylococcus epidermidis (+) S36 Staphylococcus saprophyticus (+++) S37 Staphylococcus epidermidis (++) S38 Staphylococcus saprophyticus (+++) S39 Staphylococcus epidermidis (+) S40 Staphylococcus warneri (+) S41 Staphylococcus intermedius (-) S42 Staphylococcus epidermidis (+) S43 Staphylococcus haemolyticus (+) S44 Staphylococcus aureus (+) S45 Staphylococcus haemolyticus (++) S46 Staphylococcus haemolyticus (+) S47 Staphylococcus haemolyticus (-) S48 Staphylococcus epidermidis (-) S48 Staphylococcus haemolyticus (+) S50 Staphylococcus saprophyticus (+) S51 Staphylococcus vitulus(s.pulvereri,s.vitulinus) (-) S52 staphylococcus lugdunensis (+) S53 Staphylococcus aureus (-) S54 Staphylococcus aureus (+++) S55 Staphylococcus haemolyticus (++)

227 192 Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 55 Staphylococcus izolatının 42 sinde (%76,4) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm pozitif bu 42 Staphylococcus izolatının 18 i S.aureus, 11 i S.epidermidis, 3 ü S.saprophyticus, 4 ü S. haemolyticus, 1 i S.warneri, 2 si S.vitulus, 1 i S.intermedius, 1.S.cohnii ssp. urealyticum ve 1 i S. capitis tir Biyofilm pozitif Biyofilm negatif S.aureus S.epidermidis S.saprophyticus S.haemolyticus S.warneri S.vitulus S.intermedius S.cohni ssp. urealyticum S.capitis S.lugdunensis S.cohnii ssp. cohnii Şekil Staphylococcus türlerinde biyofilm dağılımı Hasta materyallerinden izole edilen toplam 23 S.aureus türünün 18 sinde (%78,3) biyofilm varlığı tespit edilmiş, 5 inde (%21.7) tespit edilememiştir (Şekil 4.50). Şekil 4.50.İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı İzole edilen toplam 11 S.epidermidis türünün hepsinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.51 )

228 193 Şekil S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 6 S.haemolyticus izolatının 4 ünde (%66,7) biyofilm varlığı tespit edilirken, 2 sinde (%33,3) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.52) Şekil S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 5 S.saprophyticus izolatının 3 ünde (%60) biyofilm varlığı tespit edilirken, 2 sinde (%40) tespit edilememiştir (Şekil 4.53.) Şekil S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 2 S.warneri izolatının 1 inde (%50) biyofilm varlığı tespit edilirken, 1 inde (%50) tespit edilememiştir (Şekil 4.54)

229 194 Şekil 4.54.S.warneri izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 1 S.capitis izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.55 ) Şekil 4.55 S.capitis izolatında biyofilm varlığı Toplam 2 S.cohnii izolatının 1 inde (%50) Biyofilm varlığı tespit edilirken, 1 inde (%50) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. (Şekil 4.56) Şekil S.cohnii izolatlarında biyofilm varlığı Biyofilm pozitif olarak tespit edilen S.cohnii alttürü S.cohnii ssp. urealyticum olarak belirlenmiştir. Biyofilm negatif olarak tespit edilen S.cohnii alttürü S.cohnii ssp. cohnii olarak belirlenmiştir.

230 195 Toplam 1 S.intermedius izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.57.) Şekil S.intermedius izolatında biyofilm varlığı Toplam 2 S.vitulus izolatının hepsinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.58.) Şekil S.vitulus izolatlarında biyofilm varlığı Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge da gösterilmiştir.

231 196 Çizelge Biyofilm pozitif Staphylococcus türlerinin, hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı İzolat no Hasta materyali İzole edilen Tür 48 saat S1 İdrar Staphylococcus vitulus (+++) S2 Trakeal aspirat Staphylococcus saprophyticus (+) S3 Yara Staphylococcus aureus (+++) S4 Kan Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum (+) S8 Doku kültürü Staphylococcus aureus (+) S8 Yara Staphylococcus capitis (++) S10 Kan Staphylococcus aureus (+) S11 Kan Staphylococcus aureus (+) S12 Konjunktival sürüntü Staphylococcus aureus (++) S13 Kateter içi kan Staphylococcus aureus (++) S16 Kan Staphylococcus aureus (+) S18 Kan Staphylococcus epidermidis (+) S19 Yara Staphylococcus aureus (+) S20 Kan Staphylococcus aureus (+) S21 Kan Staphylococcus aureus (+) S22 Yara Staphylococcus aureus (+) S23 Yara Staphylococcus aureus (+) S24 Kan Staphylococcus aureus (+) S26 Yara Staphylococcus aureus (+++) S27 Burun sürüntüsü Staphylococcus epidermidis (+) S28 Yara Staphylococcus epidermidis (++) S30 Kan Staphylococcus epidermidis (++) S31 Kan Staphylococcus aureus (++) S32 Yara Staphylococcus warneri (+) S33 Kan Staphylococcus epidermidis (+++) S34 Konjunktival sürüntü Staphylococcus epidermidis (+) S35 Kan Staphylococcus epidermidis (+++) S36 Kan Staphylococcus saprophyticus (++) S37 Püy Staphylococcus epidermidis (+++) S38 Kan Staphylococcus saprophyticus (+) S39 Abse Staphylococcus epidermidis (+) S41 Püy Staphylococcus intermedius (+) S42 Kan Staphylococcus epidermidis (+) S43 Kan Staphylococcus haemolyticus (+) S44 Kan Staphylococcus aureus (++) S45 Periton sıvsı Staphylococcus haemolyticus (+)

232 197 Çizelge 4.36.(Devam) Biyofilm pozitif Staphylococcus türlerinin, hasta mater yallerine göredağılımı S48 Kan Staphylococcus epidermidis (+) S48 Kan Staphylococcus haemolyticus (+) S51 Yara Staphylococcus vitulus (+) S53 Kan Staphylococcus aureus (+++) S54 Göz sürüntüsü Staphylococcus aureus (++) Çalışmada elde edilen sonuçların kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak sınıflandırılması ile elde edilen verilerin, izole edilen Staphylococcus türlerine göre dağılımı Şekil 4.59 da gösterilmiştir. Şekil Kuvvetli pozitif (+++), Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus türleri Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı İzolat no Hasta materyali İzole edilen tür 48 saat S5 Kan Staphylococcus aureus (-) S6 Kan Staphylococcus aureus (-) S7 Kan Staphylococcus aureus (-) S14 Yara Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (-) S15 Yara Staphylococcus saprophyticus (-)

233 198 Çizelge 4.37.(Devam) 24 saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı S17 Yara Staphylococcus aureus (-) S25 Kan Staphylococcus hominis (-) S29 Konjunktival sürüntü Staphylococcus aureus (-) S40 Püy Staphylococcus warneri (-) S46 İdrar Staphylococcus haemolyticus (-) S47 Kan Staphylococcus haemolyticus (-) S50 Kan Staphylococcus saprophyticus (-) S52 Yara staphylococcus lugdunensis (-) Kristal viyole boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm araştırmasında, 48 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik değerlendirmede, hasta materyallerinden izole edilmiş olan toplam 15 Candida cinsi mayanın 12 sinde (%80) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%20) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.60.) Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Biyofilm varlığı tespit edilen Kandidaların izole edildiği toplam 12 hasta materyalinin 8 i (%66,7) idrar, 1 i (%8,3) vajen sıvısı, 1 i (%8,3) göğüs tüpü, 1 i (%8,3) püy ve 1 i (%8,3) derin trakeal aspirat kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.61 de gösterilmiştir.

234 199 Şekil Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Candida larda biyofilm varlığının, kristal viyole boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile edilde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Candida türlerine göre dağılımı Çizelge 4.38 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Spektrofotometrede elde edilen değerler İzolat no İzole edilen Candida türü 48 saat C1 C.tropicalis 0,13 C2 C.tropicalis 0,149 C3 C.glabrata 0,133 C4 C.albicans 0,096 C5 C.albicans 0,156 C6 C.albicans 0,167 C7 C.albicans 0,87

235 200 Çizelge (Devam) İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının kristal viyole boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler C8 C.albicans 0,123 C9 C.albicans 0,167 C10 C.albicans 0,19 C11 C.albicans 0,137 C12 C.albicans 0,198 C13 C.albicans 0,198 C14 C.tropicalis 0,178 C15 C.albicans 0,098 Kontrol değeri Çizelge 4.38 de gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. bu çalışma sırasıbda, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,124 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,124 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,124 0,372 aralığında elde edilen değerler (+), 0,373 0,746 aralığında elde edilen değerler (++) olarak sınıflandırılmıştır. 0,747 1,497 değerleri aralığında ve değerinden yüksek elde edilen değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.39 de gösterilmiştir.

236 201 Çizelge İzole edilen Candida türlerinde, kristal viyole kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar İzolat no İzole edilen Candida türü Biyofilm varlığı 48 saat C1 C.tropicalis (+) C2 C.tropicalis (+) C3 C.glabrata (+) C4 C.albicans (-) C5 C.albicans (+) C6 C.albicans (+) C7 C.albicans (+++) C8 C.albicans (-) C9 C.albicans (+) C10 C.albicans (+) C11 C.albicans (+) C12 C.albicans (+) C13 C.albicans (+) C14 C.tropicalis (+) C15 C.albicans (-) Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida izolatlarının 11 i zayıf pozitif (+), 1 i kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilirken, 3 Candida izolatında biyofilm varlığı tespit edilememiştir. İzole edilen toplam 15 Candida nın 11 ini oluşturan C. albicans türünün 8 i biyofilm pozitif, 3 ü biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir. İzole edilen toplam 3 C. tropicalis türünün hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Toplam 1 C.glabrata izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir(şekil 4.62 )

237 202 Şekil 4.62.Candida türlerinde biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 11 C.albicans türünün 8 inde (%72,7) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%27,3) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Toplam 3 C.izolatının izolatının hepsinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Toplam 1 C.tropicalis izolatında %100 oranında biyofilm oluşumuna rastlanmıştır. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Candida türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.40 da gösterilmiştir. Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilencandi datürlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat idrar C.tropicalis (+) idrar C.tropicalis (+) idrar C.glabrata (+) vajen C.albicans (+) idrar C.albicans (+) idrar C.albicans (+) idrar C.albicans (+) göğüs tüpü C.albicans (+) idrar C.albicans (+) püy C.albicans (+) dta C.albicans (+) idrar C.tropicalis (+)

238 203 Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilencandi da türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 48 saat kateter C.albicans (-) cilt C.albicans (-) idrar C.albicans (-) Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışma 24 saatlik değerlendirme sonuçları Araştırmada, Ankara daki çeşitli hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından temin edilen toplam 100 hasta materyalinden izole edilen 10 Pseudomonas, 20 Klebsiella, 55 Staphylococcus ve 15 Candida izolatında biyofilm varlığı araştırılmıştır. Bu amaçla yapılan çalışmada Kristal viyole ve Safranin boyar maddeleri kullanılmıştır. Srafranin boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışmada 24 saat sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge 4.42 de gösterilmiştir. Çizelge Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 24 saat süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm Safranin 24 saat İzolat pozitif negatif Pseudomonas 10 0 Klebsiella 7 13 Staphylococcus Candida 12 3 Toplam Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında, 24 saatlik süre sonunda yapılan Spektrofotometrik değerlendirmede toplam 100 izolatın 46 sında (%46) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm varlığı tespit edilen bu 46 izolatın

239 u (%21,7), Pseudomonas, 7 si (%15,2) Klebsiella, 17 si (%36,9)) Staphylococcus ve 12 si (%26,1) Candida izolatıdır ( Şekil 4.63.) Şekil Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 24 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Biyofilm varlığı araştırmasında, safranin kullanılarak, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 10 Pseudomonas cinsi bakterinin 10 u (%100) Biyofilm pozitif olarak bulunmuştur (Şekil 4.64). Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas ların izole edildiği toplam 10 hasta materyalinin 6 sı (%60) idrar, 1 i (%10) yara, 1 i (%10) balgam, 1 i (%10) kist sıvısı ve 1 i (%10) trakeal aspirat kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.65 te gösterilmiştir.

240 Hasta materyalleri İdrar Yara Balgam Kist sıvısı Trakeal aspirat Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Pseudomonas bakterilerinde biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Pseudomonas türlerine göre dağılımı Çizelge 4.43 te gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Spektrofotometre de elde edilen değerler İzolat no İzole edilen Pseudomonas türü 24 saat P1 Pseudomonas fluorescens 0,175 P2 Pseudomonas fluorescens 0,181 P3 Pseudomonas aeruginosa 0,104 P4 Pseudomonas aeruginosa 0,130 P5 Pseudomonas aeruginosa 0,185 P6 Pseudomonas aeruginosa 0,621 P7 Pseudomonas aeruginosa 0,246 P8 Pseudomonas aeruginosa 0,523 P9 Pseudomonas aeruginosa 0,625 P10 Pseudomonas aeruginosa 0,161 Kontrol değeri 0.097

241 206 Çizelge 4.43 te gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 24 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,097 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,097 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,097 0,194 aralığında elde edilen değerler (+), 0,195 0,388 aralığındaki değerler (++) ve 0,389 0,776 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.44 te gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas ların 3 ü (%30) kuvvetli pozitif (+++), 1 i (%10) pozitif (++) ve 6 sı (%60) zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Pseudomonas türleri Çizelge 4.44 te gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerinde, safranin kullanılarak, 540 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm varlığı İzolat no İzole edilen Pseudomonas türü 24 saat P1 Pseudomonas fluorescens (+) P2 Pseudomonas fluorescens (+) P3 Pseudomonas aeruginosa (+) P4 Pseudomonas aeruginosa (+) P5 Pseudomonas aeruginosa (+) P6 Pseudomonas aeruginosa (+++) P7 Pseudomonas aeruginosa (++) P8 Pseudomonas aeruginosa (+++) P9 Pseudomonas aeruginosa (+++) P10 Pseudomonas aeruginosa (+) Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 10 Pseudomonas izolatının 8 ini oluşturan P.aeruginosa türünün 8 i biyofilm pozitif olarak tespit

242 207 edilmiştir. İzole edilen 2 P.fluorescens türünün ise 2 si biyofilm pozitif olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.66.). Şekil Pseudomonas türlerinde biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 8 Pseudomonas aeruginosa türünün 8 inde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. 2 P.fluorescens izolatının 2 sinde (%100) biyofilm varlığı gösterilmiştir. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Pseudomonas türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.45 te gösterilmiştir. Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen Pseudomonas türü 24 saat balgam Pseudomonas fluorescens (+) yara Pseudomonas fluorescens (+) idrar Pseudomonas aeruginosa (+) kist sıvısı Pseudomonas aeruginosa (+) idrar Pseudomonas aeruginosa (+) idrar Pseudomonas aeruginosa (+++) idrar Pseudomonas aeruginosa (++) trakeal aspirat Pseudomonas aeruginosa (+++) idrar Pseudomonas aeruginosa (+++) idrar Pseudomonas aeruginosa (+)

243 208 Çizelge 4.45 te gösterilen sonuçlara göre, kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilen 3 Pseudomonas aeruginosa izolatı 2 idrar ve 1 trakeal aspirat kültürlerinden izole edilmiştir. Şekil Kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas türleri Biyofilm varlığı araştırmasında, safranin kullanılarak, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, klinik kültür materyallerinden izole edilen toplam 20 Klebsiella cinsi bakterinin 7 si (%35) Biyofilm pozitif, 13 ü (%65) biyofilm negatif olarak bulunmuştur (Şekil 4.68.). Şekil Klebsiella izolatlarında biyofilm varlığının oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella ların izole edildiği toplam 7 hasta materyalinin 3 ü (%42,9) idrar, 2 si (%28,6) kan, 1 i (%14,3) balgam ve 1 i (%14,3) yara kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.69 da gösterilmiştir.

244 209 Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Klebsiella bakterilerinde biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Klebsiella türlerine göre dağılımı Çizelge da gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spek trofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spekt rofotometrik değerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen tür 24 saat K1 Klebsiella pneumoniae 0,089 K2 Klebsiella pneumoniae 0,123 K3 Klebsiella pneumoniae 0,087 K4 Klebsiella ozaenae 0,283 K5 Klebsiella pneumoniae 0,170 K6 Klebsiella pneumoniae 0,135 K7 Klebsiella pneumoniae 0,144 K8 Klebsiella pneumoniae 0,093 K9 Klebsiella ozaenae 0,123 K10 Klebsiella pneumoniae 0,086 K11 Klebsiella pneumoniae 0,082 K12 Klebsiella pneumoniae 0,092

245 210 Çizelge (Devam) İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının safra nin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm.dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler K13 Klebsiella pneumoniae 0,123 K14 Klebsiella pneumoniae 0,102 K15 Klebsiella pneumoniae 0,094 K16 Klebsiella pneumoniae 0,106 K17 Klebsiella pneumoniae 0,085 K18 Klebsiella pneumoniae 0,127 K19 Klebsiella pneumoniae 0,270 K20 Klebsiella ozaenae 0,221 Kontrol değeri Çizelge da gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 24 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,125 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar çok kuvvetli pozitif (+++), kuvvetli pozitif (++), pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,125 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,125 0,250 aralığında elde edilen değerler (+), 0,251 0,375 aralığındaki değerler (++) ve 0,376 0,500 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde edilen verilerin kuvvetli pozitif, pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge de gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre, toplam 20 Klebsiella izolatının 17 sini oluşturan Klebsiella pneuminiae türünün 5 i biyofilm pozitif, 12 si biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.70.) Toplam 3 K.ozaenae izolatının 2 si biyofilm pozitif, 1 i biyofilm negatif tespit edilmiştir.

246 K.pneumoniae 3 1 K.ozaenae Biyofilm pozitif Biyofilm negatif Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar İzolat no İzole edilen tür Biyofilm varlığı 24 saat K1 Klebsiella pneumoniae (-) K2 Klebsiella pneumoniae (-) K3 Klebsiella pneumoniae (-) K4 Klebsiella ozaenae (+++) K5 Klebsiella pneumoniae (+) K6 Klebsiella pneumoniae (+) K7 Klebsiella pneumoniae (+) K8 Klebsiella pneumoniae (-) K9 Klebsiella ozaenae (-) K10 Klebsiella pneumoniae (-) K11 Klebsiella pneumoniae (-) K12 Klebsiella pneumoniae (-) K13 Klebsiella pneumoniae (-) K14 Klebsiella pneumoniae (-) K15 Klebsiella pneumoniae (-) K16 Klebsiella pneumoniae (-)

247 212 Çizelge (Devam) İzole edilen Klebsiella türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm.dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonun da elde edilen sonuçlar K17 Klebsiella pneumoniae (-) K18 Klebsiella pneumoniae (+) K19 Klebsiella pneumoniae (++) K20 Klebsiella ozaenae (+) Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Klebsiella izolatlarının 1 i kuvvetli pozitif (+++), 1 i pozitif (++) ve 3 ü zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. Negatif (-) olarak tespit edilen Klebsiella izolatlarının sayısı 13 tür. Bu Klebsiella türleri Şekil 4.71 de gösterilmiştir. Şekil (+++), (++) ve (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella türleri Hasta materyalinden izole edilen 17 Klebsiella pneumoniae türünün 5 inde (%29,4) biyofilm varlığı tespit edilirken 12 sinde (%70,6) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Toplam 3 K.ozaeanae izolatının 2 sinde (%66,7) biyofilm varlığı tespit edilirken 1 inde (%33,3) biyofilm varlığı tespit edilememiştir.

248 213 Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.48 de gösterilmiştir. Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin izole edildiği klinik kültür materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat idrar Klebsiella ozaenae (+++) kan Klebsiella pneumoniae (+) balgam Klebsiella pneumoniae (+) kan Klebsiella pneumoniae (+) idrar Klebsiella pneumoniae (+) idrar Klebsiella pneumoniae (++) yara Klebsiella ozaenae (+) Çizelge de gösterilen sonuçlara göre, pozitif (++) olarak tespit edilen 1 Klebsiella pneumoniae izolatı yara kültüründen, zayıf pozitif (+) olarak izole edilen 5 K.pneumoniae izolatı nın 2 si kan, 2 si idrar ve 1 i balgam kültürlerinden izole edilmiştir. Kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilen 1 Klebsiella ozaenae izolatı idrar kültüründen, zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen 1 K.ozaenae izolatı yara kültüründen izole edilmiştir. Biyofilm negatif (-) olarak tespit edilen 12 Klebsiella pneumoniae izolatının 8 i idrar, 2 si kan ve 2 si derin trakeal aspirat ve kültüründen izole edilmiştir. Biyofilm negatif (-) olarak tespit edilen 1 K.ozaeanae izolatı yara kültüründen izole edilmiştir (Çizelge )

249 214 Çizelge Biyofilm negatif tespit edilen Klebsiella türleri İzolat no İzole edilen tür Biyofilm varlığı 24 saat K1 Klebsiella pneumoniae (-) K2 Klebsiella pneumoniae (-) K3 Klebsiella pneumoniae (-) K8 Klebsiella pneumoniae (-) K9 Klebsiella ozaenae (-) K10 Klebsiella pneumoniae (-) K11 Klebsiella pneumoniae (-) K12 Klebsiella pneumoniae (-) K13 Klebsiella pneumoniae (-) K14 Klebsiella pneumoniae (-) K15 Klebsiella pneumoniae (-) K16 Klebsiella pneumoniae (-) K17 Klebsiella pneumoniae (-) Biyofilm varlığı araştırnasında, safranin kullanılarak, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 55 Staphylococcus cinsi bakterinin 17 sinde (%30,9) Biyofilm varlığı tespit edilirken, 38 inde (%69,1) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil )

250 215 Şekil Staphylococus izolatlarında biyofilm varlığının oranı Biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus ların izole edildiği toplam 17 hasta materyalinin 8 i (%47,1) kan, 3 ü (%17,6) yara, 2 si (%11,8) konjunktival sürüntü, 1 i (%5,9) idrar, 1 i (%5,9) trakeal aspirat, 1 i (%5,9) abse ve 1 i (%5,9) periton sıvısı kültürleridir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil te gösterilmiştir. Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Staphylococcus bakterilerilerinde biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre

251 216 cihazında yapılan okutulması ile edile edilen sonuçların, Staphylococcus türlerine göre dağılımı Çizelge 4.50 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 24 saat S1 Staphylococcus vitulus 0,176 S2 Staphylococcus saprophyticus 0,572 S3 Staphylococcus aureus 0,133 S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum 0,148 S5 Staphylococcus aureus 0,156 S6 Staphylococcus aureus 0,132 S7 Staphylococcus aureus 0,182 S8 Staphylococcus aureus 0,144 S8 Staphylococcus capitis 0,312 S10 Staphylococcus aureus 0,221 S11 Staphylococcus aureus 0,145 S12 Staphylococcus aureus 0,139 S13 Staphylococcus aureus 0,098 S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii 0,088 S15 Staphylococcus saprophyticus 0,129 S16 Staphylococcus aureus 0,166 S17 Staphylococcus aureus 0,154 S18 Staphylococcus epidermidis 0,134 S19 Staphylococcus aureus 0,092

252 217 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S20 Staphylococcus aureus 0,165 S21 Staphylococcus aureus 0,116 S22 Staphylococcus aureus 0,107 S23 Staphylococcus aureus 0,115 S24 Staphylococcus aureus 0,134 S25 Staphylococcus hominis 0,104 S26 Staphylococcus aureus 0,099 S27 Staphylococcus epidermidis 0,136 S28 Staphylococcus epidermidis 0,120 S29 Staphylococcus aureus 0,187 S30 Staphylococcus epidermidis 0,190 S31 Staphylococcus aureus 0,194 S32 Staphylococcus warneri 0,185 S33 Staphylococcus epidermidis 0,242 S34 Staphylococcus epidermidis 0,426 S35 Staphylococcus epidermidis 0,206 S36 Staphylococcus saprophyticus 0,129 S37 Staphylococcus epidermidis 0,129 S38 Staphylococcus saprophyticus 0,119 S39 Staphylococcus epidermidis 0,242 S40 Staphylococcus warneri 0,115 S41 Staphylococcus intermedius 0,150 S42 Staphylococcus epidermidis 0,098

253 218 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S43 Staphylococcus haemolyticus 0,188 S44 Staphylococcus aureus 0,184 S45 Staphylococcus haemolyticus 0,183 S46 Staphylococcus haemolyticus 0,120 S47 Staphylococcus haemolyticus 0,117 S48 Staphylococcus epidermidis 0,087 S48 Staphylococcus haemolyticus 0,124 S50 Staphylococcus saprophyticus 0,113 S51 Staphylococcus vitulus 0,192 S52 Staphylococcus lugdunensis 0,131 S53 Staphylococcus aureus 0,157 S54 Staphylococcus aureus 0,121 S55 Staphylococcus haemolyticus 0,085 Kontrol değeri 0,169 Çizelge 4.50 de gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. bu çalışma sırasıbda, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,169 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,169 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,169 0,338 aralığında elde edilen değerler (+), 0,339 0,507 aralığında elde edilen değerler (++) ve 0, aralığındaki değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.51 de gösterilmiştir.

254 219 Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Staphylococcus ların 1 i (%5,9) kuvvetli pozitif (+++), 1 i (%5,9) pozitif (++) ve 15 i (%88,2) zayıf pozitif olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Staphylococcus türleri Şekil 4.73 te gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm varlığı İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 24 saat S1 Staphylococcus vitulus (+) S2 Staphylococcus saprophyticus (+++) S3 Staphylococcus aureus (-) S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum (-) S5 Staphylococcus aureus (-) S6 Staphylococcus aureus (-) S7 Staphylococcus aureus (+) S8 Staphylococcus aureus (-) S8 Staphylococcus capitis (+) S10 Staphylococcus aureus (+) S11 Staphylococcus aureus (-) S12 Staphylococcus aureus (-) S13 Staphylococcus aureus (-) S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (-) S15 Staphylococcus saprophyticus (-) S16 Staphylococcus aureus (-) S17 Staphylococcus aureus (-) S18 Staphylococcus epidermidis (-)

255 220 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süresonunda elde edilen sonuçlar S19 Staphylococcus aureus (-) S20 Staphylococcus aureus (-) S21 Staphylococcus aureus (-) S22 Staphylococcus aureus (-) S23 Staphylococcus aureus (-) S24 Staphylococcus aureus (-) S25 Staphylococcus hominis (-) S26 Staphylococcus aureus (-) S27 Staphylococcus epidermidis (-) S28 Staphylococcus epidermidis (-) S29 Staphylococcus aureus (+) S30 Staphylococcus epidermidis (+) S31 Staphylococcus aureus (+) S32 Staphylococcus warneri (+) S33 Staphylococcus epidermidis (+) S34 Staphylococcus epidermidis (++) S35 Staphylococcus epidermidis (+) S36 Staphylococcus saprophyticus (-) S37 Staphylococcus epidermidis (-) S38 Staphylococcus saprophyticus (-) S39 Staphylococcus epidermidis (+) S40 Staphylococcus warneri (-) S41 Staphylococcus intermedius (-) S42 Staphylococcus epidermidis (-) S43 Staphylococcus haemolyticus (+)

256 221 Çizelge (Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süresonunda elde edilen sonuçlar S44 Staphylococcus aureus (+) S45 Staphylococcus haemolyticus (+) S46 Staphylococcus haemolyticus (-) S47 Staphylococcus haemolyticus (-) S48 Staphylococcus epidermidis (-) S48 Staphylococcus haemolyticus (-) S50 Staphylococcus saprophyticus (-) S51 Staphylococcus vitulus (+) S52 staphylococcus lugdunensis (-) S53 Staphylococcus aureus (-) S54 Staphylococcus aureus (-) S55 Staphylococcus haemolyticus (-) Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 55 Staphylococcus izolatının 17 sinde (%30,9) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm pozitif bu 17 Staphylococcus izolatının 6 sı S.aureus, 5 i S.epidermidis, 1 i S.saprophyticus, 2 si S. haemolyticus, 1 i S.warneri, 2 si S.vitulus ve 1 i S.capitis tir ( Şekil 4.74). Şekil Staphylococcus izolatlarında biyofilm varlığının tür derecesinde dağılımı

257 222 Hasta materyallerinden izole edilen toplam 23 S.aureus türünün 6 sında (%26,1) biyofilm varlığı tespit edilmiş, 17 inde (%73,9) tespit edilememiştir (Şekil 4.75). Şekil 4.75.İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı İzole edilen toplam 11 S.epidermidis türünün 5 inde (%45,5) biyofilm varlığı tespit edilirken, 6 sında (%54,5) tespit edilememiştir (Şekil 4.76 ) Şekil S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 6 S.haemolyticus izolatının 2 sinde (%33,3) biyofilm varlığı tespit edilirken, 4 ünde (%66,7) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.77)

258 223 Şekil S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 2 S.vitulus izolatının 2Sinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.78.) Şekil S.vitulus izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 5 S.saprophyticus izolatının 1 inde (%20) biyofilm varlığı tespit edilirken, 4 sinde (%80) tespit edilememiştir (Şekil 4.79.) Şekil 4.79.S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı

259 224 Toplam 1 S.capitis izolatının 1 inde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.80.) Şekil 4.80 S.capitis izolatında biyofilm varlığı Toplam 1 S.warneri izolatının 1 inde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil ) Şekil S.warneri izolatında biyofilm varlığı Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge de gösterilmiştir. Çizelge Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat İdrar Staphylococcus vitulus (+) Trakeal aspirat Staphylococcus saprophyticus (+++)

260 225 Çizelge (Devam) Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türleri nin, izoleedildikleri hasta materyalleri Kan Staphylococcus aureus (+) Yara Staphylococcus capitis (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Konjunktival sürüntü Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus epidermidis (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Yara Staphylococcus warneri (+) Kan Staphylococcus epidermidis (+) Konjunktival sürüntü Staphylococcus epidermidis (++) Kan Staphylococcus epidermidis (+) Abse Staphylococcus epidermidis (+) Kan Staphylococcus haemolyticus (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Periton sıvısı Staphylococcus haemolyticus (+) Yara Staphylococcus vitulus (+) Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat Yara Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Doku kültürü Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Konjukntival sürüntü Staphylococcus aureus (-) Kateter içi kan Staphylococcus aureus (-) Yara Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (-) Yara Staphylococcus saprophyticus (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Yara Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus epidermidis (-) Yara Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Yara Staphylococcus aureus (-) Yara Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus hominis (-) Yara Staphylococcus aureus (-)

261 226 Çizelge (Devam) Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türleri nin, izoleedildikleri hasta materyalleri Burun sürüntüsü Staphylococcus epidermidis (-) Yara Staphylococcus epidermidis (-) Kan Staphylococcus saprophyticus (-) Püy Staphylococcus epidermidis (-) Kan Staphylococcus saprophyticus (-) Püy Staphylococcus warneri (-) Püy Staphylococcus intermedius (-) Kan Staphylococcus epidermidis (-) İdrar Staphylococcus haemolyticus (-) Kan Staphylococcus haemolyticus (-) Kan Staphylococcus epidermidis (-) Kan Staphylococcus haemolyticus (-) Kan Staphylococcus saprophyticus (-) Yara staphylococcus lugdunensis (-) Kan Staphylococcus aureus (-) Göz sürüntüsü Staphylococcus aureus (-) Kan Staphylococcus haemolyticus (-) Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm araştırmasında, 24 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik değerlendirmede, hasta materyallerinden izole edilmiş olan toplam 15 Candida cinsi mayanın 12 sinde (%80) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%20) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.82 ) Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Biyofilm varlığı tespit edilen Candida ların izole edildiği toplam 12 hasta materyalinin 7 si (%58,3) idrar, 1 i (%8,3) vajen sıvısı, 1 i (%8,3) göğüs tüpü, 1 i

262 227 (%8,3) püy, 1 i (%8,3) cilt sürüntüsü ve 1 i (%8,3) derin trakeal aspirat kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.83 te gösterilmiştir. Şekil Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Kandidalarda biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile edilde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Candida türlerine göre dağılımı Çizelge 4.53 te gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler İzolat no İzole edilen Candida türü Spektrofotometrede elde edilen değerler 24 saat C1 C.tropicalis 0,42 C2 C.tropicalis 0,56 C3 C.glabrata 0,432 C4 C.albicans 0,103 C5 C.albicans 0,342 C6 C.albicans 0,243 C7 C.albicans 0,109 C8 C.albicans 0,345 C9 C.albicans 0,675 C10 C.albicans 0,561

263 228 Çizelge (Devam) İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 24 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulmasısonucu elde edilen değerler C11 C.albicans 0,56 C12 C.albicans 0,421 C13 C.albicans 0,45 C14 C.tropicalis 0,564 C15 C.albicans 0,086 Kontrol değeri 0,132 Çizelge 4.53 de gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,132 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,132 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,132 0,264 aralığında elde edilen değerler (+), 0,265 0,528 aralığında elde edilen değerler (++) ve 0,528 1,056 aralığındaki değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.54 te gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Candida türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm varlığı İzolat İzole edilen Candida 24 saat no türü C1 C.tropicalis (++) C2 C.tropicalis (+++) C3 C.glabrata (++)

264 229 Çizelge (Devam) İzole edilen Candida türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm dalga boyunda spektrofotometrede 24 saatlik süre sonundaelde edilen sonuçlar C4 C.albicans (-) C5 C.albicans (++) C6 C.albicans (+) C7 C.albicans (-) C8 C.albicans (++) C9 C.albicans (+++) C10 C.albicans (+++) C11 C.albicans (+++) C12 C.albicans (++) C13 C.albicans (++) C14 C.tropicalis (+++) C15 C.albicans (-) Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida izolatlarının 1 i zayıf pozitif (+), 6 sı pozitif (++) ve 5 i kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilirken, 3 Candida izolatında biyofilm varlığı tespit edilememiştir. İzole edilen toplam 15 Candida nın 11 ini oluşturan C. albicans türünün 8 i biyofilm pozitif, 3 ü biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir. İzole edilen toplam 3 C. tropicalis türünün hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Toplam 1 C.glabrata izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil )

265 C.albicans C.tropicalis C.glabrata Biyofilm pozitif Biyofilm negatif Şekil Candida türlerinde biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 11 C.albicans türünün 8 inde (%72,7) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%27,3) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Toplam 3 C.izolatının izolatının hepsinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Toplam 1 C.tropicalis izolatında %100 oranında biyofilm oluşumuna rastlanmıştır. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Candida türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.55 te gösterilmiştir. Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candi da türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta İzole edilen Candida 24 saat materyali türü İdrar C.tropicalis (++) İdrar C.tropicalis (+++) İdrar C.glabrata (++) Vajen C.albicans (++) İdrar C.albicans (+) Cilt C.albicans (++)

266 231 Çizelge 4.55.(Devam) 24 saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespitedi lencandi da türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göreda ğılımı İdrar C.albicans (+++) Göğüs tüpü C.albicans (+++) İdrar C.albicans (+++) Püy C.albicans (++) Derin C.albicans trakeal (++) aspirat İdrar C.tropicalis (+++) Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilencandi da türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat Kateter C.albicans (-) İdrar C.albicans (-) idrar C.albicans (-) 48 saatlik değerlendirme sonuçları Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan çalışmada 48 saat sonunda elde edilen sonuçlar Çizelge 4.57 de gösterilmiştir. Çizelge Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 48 saat süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm Safranin 48 saat İzolat pozitif pozitif Pseudomonas 8 2 Klebsiella 18 2 Staphylococcus Candida 11 4 Toplam 74 26

267 232 Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında, 48 saatlik süre sonunda yapılan Spektrofotometrik değerlendirmede toplam 100 izolatın 74 ünde (%74) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm varlığı tespit edilen bu 79 izolatın 8 i (%10,8) Pseudomonas, 18 i (%24,3) Klebsiella, 39 u (%52,7) Staphylococcus ve 1 i (%14,9) Candida izolatıdır ( Şekil 4.85.) Şekil Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm çalışmasında 48 saatlik süre sonunda spektrofotometrik değerlendirme ile elde edilen sonuçların, izolatlara göre dağılımı Biyofilm varlığı araştırmasında, safranin kullanılarak, 48 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 10 Pseudomonas cinsi bakterinin 8 i (%80) Biyofilm pozitif, 2 si (%20) biyofilm negatif olarak bulunmuştur (Şekil 4.86.). Şekil Pseudomonas izolatlarında biyofilm varlığının oranı

268 233 Biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas ların izole edildiği toplam 8 hasta materyalinin 4 ü (%50) idrar, 1 i (%12,5) kist sıvısı, 1 i (%12,5) balgam, 1 i (%12,5) yara ve 1 i (%12,5) trakeal aspirat kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.87 de gösterilmiştir. Şekil Biyofilm pozitif Pseudomonas izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Pseudomonas bakterilerinde biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Pseudomonas türlerine göre dağılımı Çizelge 4.58 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Spektrofotometre de elde edilen değerler İzolat no İzole edilen Pseudomonas türü 48 saat P1 Pseudomonas fluorescens 0,158

269 234 Çizelge 4.58.(Devam) İzole edilen Pseudomonas türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nmdalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler P2 Pseudomonas fluorescens 0,437 P3 Pseudomonas aeruginosa 0,148 P4 Pseudomonas aeruginosa 0,192 P5 Pseudomonas aeruginosa 0,107 P6 Pseudomonas aeruginosa 0,221 P7 Pseudomonas aeruginosa 0,526 P8 Pseudomonas aeruginosa P9 Pseudomonas aeruginosa 0,270 P10 Pseudomonas aeruginosa 0,108 Kontrol değeri 0,125 Çizelge 4.58 de gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 48 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,125 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,125 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,125 0,250 aralığında elde edilen değerler (+), 0,251 0,500 aralığındaki değerler (++) olarak kabul edilmiştir. 0,500 1,000 aralığında ve 1,000 den büyük değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.59 da gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas ların 2 si (%28,57) kuvvetli pozitif (+++), 1 i (%14,29) pozitif (++) ve 4 ü (%57,14) zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Pseudomonas türleri çizelge 4.59 da gösterilmiştir.

270 235 Çizelge (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Pseudomonas türleri İzolat no İzole edilen Pseudomonas türü Biyofilm varlığı 48 saat P1 Pseudomonas fluorescens (+) P2 Pseudomonas fluorescens (++) P3 Pseudomonas aeruginosa (+) P4 Pseudomonas aeruginosa (+) P5 Pseudomonas aeruginosa (-) P6 Pseudomonas aeruginosa (+) P7 Pseudomonas aeruginosa (+++) P8 Pseudomonas aeruginosa (+++) P9 Pseudomonas aeruginosa (++) P10 Pseudomonas aeruginosa (-) Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 10 Pseudomonas izolatının 8 ini oluşturan P.aeruginosa türünün 6 sı biyofilm pozitif, 2 si biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir. İzole edilen 2 P.fluorescens türünün ise, 2 si biyofilm pozitif olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.88.) Şekil Pseudomonas türlerinde biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 8 Pseudomonas aeruginosa türünün 6 sında (%75) biyofilm varlığı tespit edilirken 2 sinde (%25) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. 2 P.fluorescens izolatının 2 sinde (%100) biyofilm varlığı gösterilememiştir.

271 236 Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Pseudomonas türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.60 ta gösterilmiştir. Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Pseudomonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta İzole edilen Pseudomonas türü 48 saat materyali Balgam Pseudomonas fluorescens (+) Yara Pseudomonas fluorescens (++) İdrar Pseudomonas aeruginosa (+) Kist sıvısı Pseudomonas aeruginosa (+) İdrar Pseudomonas aeruginosa (+) İdrar Pseudomonas aeruginosa (+++) Trakeal Pseudomonas aeruginosa (+++) aspirat İdrar Pseudomonas aeruginosa (++) Çizelge 4.60 ta gösterilen sonuçlara göre, kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilen 2 Pseudomonas aeruginosa izolatları, 1 idrar ve 1 trakeal aspirat kültürlerinden,pozitif (++) olarak tespit edilen Pseudomonas aeruginosa izolatı idrar kültüründen, zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen P.aeruginosa izolatları 2 idrar ve 1 kist sıvısı kültürlerinden izole edilmiştir. Pozitif (++) olarak tespit edilen P.fluorescens izolatı yara kültüründen, zayıf pozitif (+) olarak izole edilen P.fluorescens izolatı ise balgam kültüründen izole edilmiştir.

272 237 Şekil Kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Pseudomonas türleri Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Pseu domonas türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen Pseudomonas türü 48 saat İdrar Pseudomonas feruginosa (-) Trakeal aspirat Pseudomonas aeruginosa (-) İdrar Pseudomonas aeruginosa (-) Biyofilm varlığı araştırmasında, safranin kullanılarak, 48 saatli süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, klinik kültür materyallerinden izole edilen toplam 20 Klebsiella cinsi bakterinin 18 i (%90) Biyofilm pozitif, 2 si (%10) biyofilm negatif olarak bulunmuştur (Şekil 4.90.) Şekil Klebsiella izolatlarında biyofilm varlığının oranı

273 238 Biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella ların izole edildiği toplam 18 hasta materyalinin 9 u (%50) idrar, 4 ü (%22,2) kan, 2 si (%1,1) derin trakeal aspirat, 2 si (%11,1) yara ve 1 i (%5,5) balgam kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.91 de gösterilmiştir Hasta materyali İdrar Kan derin trakeal aspirat Yara Balgam Şekil Biyofilm pozitif Klebsiella izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Klebsiella bakterilerinde biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile elde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Klebsiella türlerine göre dağılımı Çizelge 4.62 de gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spekt rofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spekt rofotometrik değerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen tür 48 saat Klebsiella pneumoniae 0,102 K1 Klebsiella pneumoniae 0,108 K2 Klebsiella pneumoniae 0,074 K3 Klebsiella ozaenae 0,226 K4

274 239 Çizelge 4.62.(Devam) İzole edilen Klebsiella türlerindeki biyofilm varlığının safra nin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyundaspektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonu cuelde edilen spektrofotometrik değerler K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K20 Klebsiella pneumoniae 0,164 Klebsiella pneumoniae 0,158 Klebsiella pneumoniae 0,328 Klebsiella pneumoniae 0,097 Klebsiella ozaenae 0,179 Klebsiella pneumoniae 0,583 Klebsiella pneumoniae 0,104 Klebsiella pneumoniae 0,123 Klebsiella pneumoniae 0,175 Klebsiella pneumoniae 0,156 Klebsiella pneumoniae 0,091 Klebsiella pneumoniae 0,139 Klebsiella pneumoniae 0,123 Klebsiella pneumoniae 0,161 Klebsiella pneumoniae 0,172 Klebsiella ozaenae 0,152 Kontrol değeri 0,097 Çizelge de gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri 48 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların, spektrofotometre ile elde edilen sonuçlarının ortalaması 0,097 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için 0,097 kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,097 0,194 aralığında elde edilen değerler (+), 0,195 0,388 aralığındaki değerler (++) ve 0,339 0,776 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak kabul edilmiştir. Elde

275 240 edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.63 te gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella ların 1 i (%5,6) kuvvetli pozitif (+++), 2 si (%11,1) pozitif (++) ve 15 i (%83,3) zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. (+), (++) ve (+++) olarak tespit edilen Klebsiella türleri Şekil 4.92 de gösterilmiştir Biyofilm pozitif K.pneumoniae 3 0 K.ozaenae Biyofilm negatif Şekil Klebsiella türlerinde biyofilm varlığı Biyofilm varlığının toplam 20 Klebsiella izolatının 17 sini oluşturan Klebsiella pneuminiae türünün 15 i biyofilm pozitif, 2 si biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir. 3 K.ozaenae izolatının 3 ünde biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Çizelge İzole edilen Klebsiella türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar Biyofilm varlığı İzolat no İzole edilen tür 48 saat Klebsiella pneumoniae (+) K1 Klebsiella pneumoniae (+) K2 Klebsiella pneumoniae (-) K3 Klebsiella ozaenae (++) K4

276 241 Çizelge 4.63.(Devam) İzole edilen Klebsiella türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süresonunda elde edilen sonuçlar K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K20 Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (++) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella ozaenae (+) Klebsiella pneumoniae (+++) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella pneumoniae (+) Klebsiella ozaenae (+) Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen 5 K. pneumonia izolatının 1 i kuvvetli pozitif (+++), 1 i pozitif (++) ve 3 ü zayıf pozitif (+) olarak tespit edilmiştir. 3 K.ozaenae izolatının 1 i kuvvetli pozitif (+++) ve 1 i zayıf pozitif (+) olarak değerlendirilmiştir. Bu Klebsiella türlerinin dağılımı Şekil 4.93 te gösterilmiştir K.pneumoniae K.ozaenae 2 (+++) (++) (+) Şekil (+++), (++) ve (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Klebsiella türleri

277 242 Hasta materyalinden izole edilen 17 Klebsiella pneumoniae türünün 15 inde (%88,2) biyofilm varlığı tespit edilirken 2 sinde (%11,8) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.64 te gösterilmiştir. Çizelge saatlik okumada Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Klebsiella türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 48 saat Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella ozaenae (++) İdrar Klebsiella pneumoniae (+) Kan Klebsiella pneumoniae (+) Balgam Klebsiella pneumoniae (++) Kan Klebsiella pneumoniae (+) Kan Klebsiella ozaenae (+) Yara Klebsiella pneumoniae (+++) Kan Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella pneumoniae (+) Derin trakeal aspirat Klebsiella pneumoniae (+) Derin trakeal aspirat Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella pneumoniae (+) İdrar Klebsiella ozaenae (+) Yara

278 243 Çizelge 4.64 te gösterilen sonuçlara göre, kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilen 1 Klebsiella pneumoniae izolatı 1 kan kültüründen, pozitif (++) olarak tespit edilen 1 K.pneuminia izolatı kan kültüründen, zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen 13 K.pneumoniae izolatının 8 i idrar, 2 si kan, 2 si derin trakeal aspirat ve 1 i balgam kültürlerinden izole edilmiştir. Pozitif (++) olarak tespit edilen 2 K.ozaenae izolatı idrar kültürlerinden, zayıf pozitif (+) olarak tespit edilen 1 K.ozaenae izolatı yara kültüründen izole edilmiştir. Biyofilm negatif (-) olarak tespit edilen 2 Klebsiella pneuminae izolatının idrar kültürlerinden izole edilmiştir (Çizelge 4.65 ) Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen klebsiella türlerinin, izole edildikleri hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali idrar idrar İzole edilen tür 48 saat Klebsiella pneumoniae (-) Klebsiella pneumoniae (-) Biyofilm varlığı araştırnasında, safranin kullanılarak, 48 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik okumada, hasta materyallerinden izole edilen toplam 55 Staphylococcus cinsi bakterinin 38 inde (%69,1) Biyofilm varlığı tespit edilirken, 17 sında (%30,9) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil ) Staphylococcus izolatları 69,10% 30,90% Biyofilm pozitif Biyofilm negatif Şekil Staphylococus izolatlarında biyofilm varlığının oranı

279 244 Biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus ların izole edildiği toplam 38 hasta materyalinin 17 si (%40,5) kan, 8 i (%21,1) yara, 3 ü (%7,9) konjunktival sürüntü, 2 si (%5,3) püy, 2 si (%5,3) idrar, 1 i (%2,6) trakeal aspirat, 1 i (%2,6) kateter içi kan, 1 i (%2,6) burun sürüntüsü, 1 i (%2,6) abse, 1 i (%2,6) periton sıvısı ve 1 i (%2,6) göz sürüntüsü kültürleridir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil 4.95 te gösterilmiştir. Şekil Biyofilm pozitif Staphylococcus izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı İzole edilen Staphylococcus bakterilerilerinde biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 470 nm. daşga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile edile edilen sonuçların, Staphylococcus türlerine göre dağılımı Çizelge 4.66 da gösterilmiştir.

280 245 Çizelge İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler Spektrofotometrede elde edilen değer İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 48 saat S1 Staphylococcus vitulus 0,139 S2 Staphylococcus saprophyticus 0,409 S3 Staphylococcus aureus 0,091 S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum 0,115 S5 Staphylococcus aureus 0,159 S6 Staphylococcus aureus 0,105 S7 Staphylococcus aureus 0,109 S8 Staphylococcus aureus 0,079 S8 Staphylococcus capitis 0,209 S10 Staphylococcus aureus 0,201 S11 Staphylococcus aureus 0,146 S12 Staphylococcus aureus 0,124 S13 Staphylococcus aureus 0,188 S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii 0,227 S15 Staphylococcus saprophyticus 0,101 S16 Staphylococcus aureus 0,187 S17 Staphylococcus aureus 0,182 S18 Staphylococcus epidermidis 0,182 S19 Staphylococcus aureus 0,100 S20 Staphylococcus aureus 0,092

281 246 Çizelge 4.66.(Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S21 Staphylococcus aureus 0,145 S22 Staphylococcus aureus 0,117 S23 Staphylococcus aureus 0,115 S24 Staphylococcus aureus 0,178 S25 Staphylococcus hominis 0,091 S26 Staphylococcus aureus 0,096 S27 Staphylococcus epidermidis 0,177 S28 Staphylococcus epidermidis 0,138 S29 Staphylococcus aureus 0,187 S30 Staphylococcus epidermidis 0,153 S31 Staphylococcus aureus 0,262 S32 Staphylococcus warneri 0,207 S33 Staphylococcus epidermidis 0,144 S34 Staphylococcus epidermidis 0,186 S35 Staphylococcus epidermidis 0,133 S36 Staphylococcus saprophyticus 0,104 S37 Staphylococcus epidermidis 0,162 S38 Staphylococcus saprophyticus 0,133 S39 Staphylococcus epidermidis 0,124 S40 Staphylococcus warneri 0,128 S41 Staphylococcus intermedius 0,107 S42 Staphylococcus epidermidis 0,105

282 247 Çizelge 4.66.(Devam) İzole edilen Staphylococcus türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen spektrofotometrik değerler S43 Staphylococcus haemolyticus 0,226 S44 Staphylococcus aureus 0,093 S45 Staphylococcus haemolyticus 0,108 S46 Staphylococcus haemolyticus 0,122 S47 Staphylococcus haemolyticus 0,094 S48 Staphylococcus epidermidis 0,089 S48 Staphylococcus haemolyticus 0,148 S50 Staphylococcus saprophyticus 0,097 S51 Staphylococcus vitulus 0,112 S52 staphylococcus lugdunensis 0,149 S53 Staphylococcus aureus 0,204 S54 Staphylococcus aureus 0,13 S55 Staphylococcus haemolyticus 0,09 Kontrol değeri Çizelge 4.66 da gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. bu çalışma sırasıbda, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,108 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,108 0,216 aralığında elde edilen değerler (+), 0, aralığında elde edilen değerler (++), 0,325 0,432 aralığında elde edilen değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak

283 248 sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.67 de gösterilmiştir. Çizelge Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Biyofilm varlığı İzolat no İzole edilen Staphylococcus türü 48 saat S1 Staphylococcus vitulus (+) S2 Staphylococcus saprophyticus (+++) S3 Staphylococcus aureus (-) S4 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum (+) S5 Staphylococcus aureus (+) S6 Staphylococcus aureus (-) S7 Staphylococcus aureus (+) S8 Staphylococcus aureus (-) S8 Staphylococcus capitis (-) S10 Staphylococcus aureus (+) S11 Staphylococcus aureus (+) S12 Staphylococcus aureus (+) S13 Staphylococcus aureus (+) S14 Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (++) S15 Staphylococcus saprophyticus (-) S16 Staphylococcus aureus (+) S17 Staphylococcus aureus (+) S18 Staphylococcus epidermidis (+) S19 Staphylococcus aureus (-) S20 Staphylococcus aureus (-) S21 Staphylococcus aureus (+)

284 249 Çizelge (Devam) Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları S22 Staphylococcus aureus (+) S23 Staphylococcus aureus (+) S24 Staphylococcus aureus (+) S25 Staphylococcus hominis (-) S26 Staphylococcus aureus (-) S27 Staphylococcus epidermidis (+) S28 Staphylococcus epidermidis (+) S29 Staphylococcus aureus (+) S30 Staphylococcus epidermidis (+) S31 Staphylococcus aureus (++) S32 Staphylococcus warneri (+) S33 Staphylococcus epidermidis (+) S34 Staphylococcus epidermidis (+) S35 Staphylococcus epidermidis (+) S36 Staphylococcus saprophyticus (-) S37 Staphylococcus epidermidis (+) S38 Staphylococcus saprophyticus (+) S39 Staphylococcus epidermidis (+) S40 Staphylococcus warneri (+) S41 Staphylococcus intermedius (-) S42 Staphylococcus epidermidis (-) S43 Staphylococcus haemolyticus (++) S44 Staphylococcus aureus (-) S45 Staphylococcus haemolyticus (+) S46 Staphylococcus haemolyticus (+)

285 250 Çizelge (Devam) Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları 47 Staphylococcus haemolyticus (-) S48 Staphylococcus epidermidis (-) S48 Staphylococcus haemolyticus (+) S50 Staphylococcus saprophyticus (-) S51 Staphylococcus vitulus (+) S52 staphylococcus lugdunensis (+) S53 Staphylococcus aureus (+) S54 Staphylococcus aureus (+) S55 Staphylococcus haemolyticus (-) Kontrol değeri Bu değerlendirmeye göre, biyofilm varlığının çalışıldığı toplam 55 Staphylococcus izolatının 38 inde (%69,1) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Biyofilm pozitif bu 38 Staphylococcus izolatının 16 sı S.aureus, 9 u S.epidermidis, 2 si S.saprophyticus, 4 ü S. haemolyticus, 2 si S.warneri, 2 si S.vitulus, 1 i S.lugdunensis ve 2 si S.cohnii dir. Şekil Biyofilm pozitif ve negatif saptanan Staphylococcus türlerinin dağılımı

286 251 Hasta materyallerinden izole edilen toplam 23 S.aureus türünün 16 sında (%69,6) biyofilm varlığı tespit edilmiş, 7 inde (%30,4) tespit edilememiştir (Şekil ). Şekil İzole edilen S.aureus türlerinde biyofilm varlığı İzole edilen toplam 11 S.epidermidis türünün 9 unda (%81,8) biyofilm varlığı tespit edilirken, 2 sinde (%18,2) tespit edilememiştir (Şekil ). Şekil S.epidermidis izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 6 S.haemolyticus izolatının 4 ünde (%66,7) biyofilm varlığı tespit edilirken, 2 sinde (%33,3) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.98)

287 252 Şekil 4.98 S.haemolyticus izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 5 S.saprophyticus izolatının 2 sinde (%40) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%60) tespit edilememiştir (Şekil 4.99.) Şekil S.saprophyticus izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 2 S.waneri izolatının 2 sinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.100) Şekil S.warneri izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 2 S.cohnii izolatının 2 sinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.101)

288 253 Şekil S.cohnii izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 1 S.lugdunensis izolatında (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil ) Şekil S.lugdunensis izolatlarında biyofilm varlığı Toplam 2 S.vitulus izolatının 2 snde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.103) Şekil S.vitulus izolatlarında biyofilm varlığı

289 254 Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.68 de gösterilmiştir. Çizelge Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyelleri Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen Staphylococcus türü 48 saat İdrar Staphylococcus vitulus (+) Trakeal Staphylococcus saprophyticus (+++) aspirat Kan Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Konjunktival sürüntü Staphylococcus aureus (+) Kateter içi kan Staphylococcus aureus (+) Yara Staphylococcus cohnii ssp. cohnii (++) Kan Staphylococcus aureus (+) Yara Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus epidermidis (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Yara Staphylococcus aureus (+) Yara Staphylococcus aureus (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Burun sürüntüsü Staphylococcus epidermidis (+) Yara Staphylococcus epidermidis (+) Konjunktival sürüntü Staphylococcus aureus (+)

290 255 Çizelge 4.68.(Devam) Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyelleri Kan Staphylococcus epidermidis (+) Kan Staphylococcus aureus (++) Yara Staphylococcus warneri (+) Kan Staphylococcus epidermidis (+) Konjunktival sürüntü Staphylococcus epidermidis (+) Kan Staphylococcus epidermidis (+) Püy Staphylococcus epidermidis (+) Kan Staphylococcus saprophyticus (+) Abse Staphylococcus epidermidis (+) Püy Staphylococcus warneri (+) Kan Staphylococcus haemolyticus (++) Periton sıvısı Staphylococcus haemolyticus (+) İdrar Staphylococcus haemolyticus (+) Kan Staphylococcus haemolyticus (+) Kan Staphylococcus saprophyticus (-) Yara Staphylococcus vitulus (+) Yara staphylococcus lugdunensis (+) Kan Staphylococcus aureus (+) Göz Staphylococcus aureus (+) Çalışmada elde edilen sonuçların kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak sınıflandırılması ile elde edilen verilerin, izole edilen Staphylococcus türlerine göre dağılımı Şekil te gösterilmiştir.

291 256 Şekil Kuvvetli pozitif (+++), Pozitif (++) ve zayıf pozitif (+) olarak biyofilm varlığı tespit edilen Staphylococcus türleri Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen Staphylococcus türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı İzolat no Hasta materyali İzole edilen tür 48 saat S3 Yara Staphylococcus aureus (-) S6 Kan Staphylococcus aureus (-) S8 Doku kültürü Staphylococcus aureus (-) S9 Yara Staphylococcus capitis (-) S15 Yara Staphylococcus saprophyticus (-) S19 Yara Staphylococcus aureus (-) S20 Kan Staphylococcus aureus (-) S25 Kan Staphylococcus hominis (-) S26 Yara Staphylococcus aureus (-) S36 Kan Staphylococcus saprophyticus (-) S41 Püy Staphylococcus intermedius (-) S42 Kan Staphylococcus epidermidis (-) S44 Kan staphylococcus aureus (-) S47 Kan Staphylococcus haemoliyticus (-) S48 Kan Staphylococcus epidermidis (-) S50 Kan Staphylococcus saprophyticus (-) S55 Kan Staphylococcus haemolyticus (-)

292 257 Safranin boyar maddesi kullanılarak yapılan biyofilm araştırmasında, 48 saatlik süre sonunda yapılan spektrofotometrik değerlendirmede, hasta materyallerinden izole edilmiş olan toplam 15 Candida cinsi mayanın 11 inde (%73,3) biyofilm varlığı tespit edilirken, 4 ünde (%26,7) biyofilm varlığı tespit edilememiştir (Şekil ) 26,70% Candida izolatları 73,30% Biyofilm pozitif Biyofilm negatif Şekil Candida izolatlarında biyofilm varlığı Biyofilm varlığı tespit edilen Candida ların izole edildiği toplam 11 hasta materyalinin 7 si (%63,6) idrar, 1 i (%9,1) cilt sürüntüsü, 1 i (%9,1) göğüs tüpü, 1 i (%9,1) püy ve 1 i (%9,1) derin trakeal aspirat kültürü örneğidir. Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı Şekil da gösterilmiştir. Şekil Biyofilm pozitif Candida izolatlarının, hasta materyallerine göre dağılımı

293 258 İzole edilen Candida larda biyofilm varlığının, safranin boyar maddesi kullanılarak, 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması ile edilde edilen sonuçların, izolasyonu yapılan Candida türlerine göre dağılımı Çizelge 4.70 te gösterilmiştir. Çizelge İzole edilen Candida türlerindeki biyofilm varlığının safranin boyar maddesi kullanılarak 48 saat sonunda, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometre cihazında yapılan okutulması sonucu elde edilen değerler Spektrofotometrede elde edilen değerler İzolat no İzole edilen Candida türü 48 saat C1 C.tropicalis 0,501 C2 C.tropicalis 0,544 C3 C.glabrata 0,145 C4 C.albicans 0,101 C5 C.albicans 0,023 C6 C.albicans 0,278 C7 C.albicans 0,100 C8 C.albicans 0,267 C9 C.albicans 0,783 C10 C.albicans 0,450 C11 C.albicans 0,496 C12 C.albicans 0,492 C13 C.albicans 0,561 C14 C.tropicalis 0,561 C15 C.albicans 0,111 Kontrol değeri 0,130

294 259 Çizelge 4.70 te gösterilen, spektrofotometrik okuma değerleri, 24 saat sonunda elde edilmiştir. Bu çalışma sırasında, kontrol amaçlı kullanılan kuyucukların spektrofotometre ile edilen sonuçlarının ortalaması 0,130 olarak belirlenmiştir. Bu değere göre, yapılan çalışmada elde edilen sonuçlar, kuvvetli pozitif (+++), pozitif (++), zayıf pozitif (+) ve negatif (-) olarak sınıflandırılmıştır. Bu sınıflandırma için kontrol değerinden düşük elde edilen değerler (-), 0,130 0,260 aralığında elde edilen değerler (+), 0,261 0,520 aralığında elde edilen değerler (++), 0,521 1,040 aralığındaki değerler (+++) olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen verilerin pozitif, zayıf pozitif ve negatif olarak sınıflandırılmasıyla ortaya çıkan biyofilm değerlendirmesi sonuçları Çizelge 4.71 de gösterilmiştir. Çizelge 4.71.İzole edilen Candida türlerinde, safranin kullanılarak, 470 nm. dalga boyunda spektrofotometrede 48 saatlik süre sonunda elde edilen sonuçlar İzolat no İzole edilen Candida türü Biyofilm varlığı 48 saat C1 C.tropicalis (++) C2 C.tropicalis (+++) C3 C.glabrata (+) C4 C.albicans (-) C5 C.albicans (+) C6 C.albicans (++) C7 C.albicans (-) C8 C.albicans (++) C9 C.albicans (+++) C10 C.albicans (++) C11 C.albicans (++) C12 C.albicans (++) C13 C.albicans (+++) C14 C.tropicalis (+++) C15 C.albicans (-)

295 260 Bu değerlendirmeye göre Biyofilm pozitif olarak tespit edilen Candida izolatlarının 2 si zayıf pozitif (+), 6 sı pozitif (++) ve 4 ü kuvvetli pozitif (+++) olarak tespit edilirken, 3 Candida izolatında biyofilm varlığı tespit edilememiştir. İzole edilen toplam 15 Candida nın 11 ini oluşturan C. albicans türünün 8 i biyofilm pozitif, 3 ü biyofilm negatif olarak tespit edilmiştir. İzole edilen toplam 3 C. tropicalis türünün hepsinde biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Toplam 1 C.glabrata izolatında biyofilm varlığı tespit edilmiştir(şekil ) Şekil Candida türlerinde biyofilm varlığı Hasta materyallerinden izole edilen 11 C.albicans türünün 8 inde (%72,7) biyofilm varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%27,3) biyofilm varlığı tespit edilememiştir. Toplam 3 C.izolatının izolatının hepsinde (%100) biyofilm varlığı tespit edilmiştir. Toplam 1 C.tropicalis izolatında %100 oranında biyofilm oluşumuna rastlanmıştır. Biyofilm pozitif olarak değerlendirilen Candida türlerinin, izole edildikleri hasta materyalleri Çizelge 4.72 de gösterilmiştir. Çizelge saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 24 saat idrar C.tropicalis (++)

296 261 Çizelge (Devam) 48 saat sonundaki okumada biyofilm pozitif olarak tespit edilen candida türlerinin izole edildiği hasta materyal erine göre dağılımı idrar C.tropicalis (+++) idrar c.glabrata (+) vajen c.albicans (+) idrar c.albicans (++) cilt c.albicans (++) idrar c.albicans (+++) göğüs tüpü c.albicans (++) idrar c.albicans (++) püy c.albicans (++) derin trakeal aspirat c.albicans (+++) idrar C.tropicalis (+++) Çizelge saatlik okuma sonucunda Biyofilm negatif olarak tespit edilen candida türlerinin izole edildiği hasta materyallerine göre dağılımı Biyofilm varlığı Hasta materyali İzole edilen tür 48 saat kateter C.albicans (-) vajen C.albicans (-) idrar C.albicans (-) 4.2. Slime Faktör Çalışması Çalışmada, Ankara daki çeşitli hastanelerin mikrobiyoloji laboratuvarlarından temin edilen klinik kültür materyallerinden Pseudomonas, Klebsiella, Staphylococcus ve Candida türleri izole edilmiştir. izolasyonu yapılan bu mikroorganizmalarda slime

297 262 faktör varlığı araştırılmıştır. Slime faktör araştırması Kongo Kırmızılı Agar Yöntemi ve Standart Cam Tüp Yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Mikroorganizmaların slime faktör varlığı çalışmasında elde edilen sonuçlar Çizelge 4.74 te gösterilmiştir. Çizelge Klinik örneklerden izole edilen mikroorganizmaların Slime faktö dağılımı Slime faktör Kongo kırmızılı agar yöntemi Standart cam tüp yöntemi Mikroorganizma Pozitif Negatif Pozitif Negatif Pseudomonas Klebsiella Staphylococcus Candida Toplam Çizelge 4.74 te gösterilen verilere göre slime faktör çalışmasında, Kongo kırmızılı agar yöntemi ve standart cam tüp yöntemi kullanılan her iki araştırmada da toplam 100 adet mikroorganizmanın 65 inde (%65) slime varlığı tespit edilirken, 35 inde (%35) slime varlığı tespit edilememiştir. Slime varlığı tespit edilen toplam 65 mikroorganizmanın dağılımı Şekil de gösterilmiştir. Şekil Kongo kırmızılı agar yöntemi ve Standart cam tüp yöntemi kullanılarak slime varlığı tespit edilen mikroorganizmaların dağılımı

298 Kongo kırmızılı agar yöntemi Araştırmada izole edilen 10 Pseudomonas, 20 Klebsiella, 55 Staphylococcus ve 15 Candida mikroorganizmalarında slime faktör varlığı Kongo kırmızılı agar yöntemi kullanılarak test edilmiştir. Çalışmada izole edilen toplam 100 mikroorganizmadan 65 inde (%65) slime faktör oluşumu tespit edilmiş, 35 inde (%35) tespit edilememiştir (Şekil 4.109). Şekil Araştırmada Kongo kırmızılı agar yöntemi ile Slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime faktör varlığı araştırılan mikroorganizmaların izole edildiği 100 hasta materyalinin dağılımı Çizelge 4.75 de gösterilmiştir. Çizelge Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı araştırılan mikroorga nizmaların izole edildiği hasta materyalleri Kongo kırmızılı agar yöntemi -Slime varlığı Hasta materyali Slime pozitif Slime negatif Toplam İdrar Kan Yara Trakeal aspirat Konjunktival sürüntü Kateter içi kan Doku kültürü Burun sürüntüsü Püy Abse Periton sıvısı 1 0 1

299 264 Çizelge (Devam) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı araştırılan mikroorga nizmaların izole edildiği hasta materyalleri Derin trakeal aspirat Balgam Kist sıvısı Göğüs tüpü Cilt Göz sürüntüsü Vajen sıvısı Toplam Çalışılan toplam 100 klinik örnekleri; 31 kan, 16 yara, 28 idrar, 4 trakeal aspirat, 3 konjunktival sürüntü, 1 kateter içi kan, 1 doku, 1 burun sürüntü, 4 püy, 1 abse, 1 periton sıvısı, 3 derin trakeal aspirat, 2 balgam, 1 kist sıvısı, 1 göğüs tüpü, 1 vajen sıvısı, 1 cilt ve 1 adet göz sürüntüsü kültürlerinden oluşmaktadır. Kongo kırmızılı agar yöntemi ileççalışılan toplam 31 kan kültürü örneğinin 16 sında (%51,6) slime varlığı tespit edilirken, 15 inde (%48,4) slime varlığı tespit edilememiştir.(şekil 4.110) Şekil Çalışılan kan örneklerinde Kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 16 yara kültürü örneğinin 11 inde (%68,8) silme varlığı tespit edilirken, 5 inde (%31,3) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.111).

300 265 Şekil Çalışılan yara örneklerinde Kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 28 idrar kültürü örneğinin 19 unda (%67,9) silme varlığı tespit edilirken, 9 unda (%32,1) slime varlığı tespit edilememiştir (Şeki 4.112). Şekil Çalışılan idrar örneklerinde Kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 4 trakeal aspirat kültürü örneğinin 1 inde (%25) silme varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%75) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.113).

301 266 Şekil Çalışılan trakeal aspirat örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 3 konjunktival sürüntü kültürü örneğinin 3 ünde (%10) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.114) Şekil Çalışılan konjunktival sürüntü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 2 kateter içi kan kültürü örneğinin 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilirken, 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.115)

302 267 Şekil Çalışılan kateter içi kan örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 doku kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.116) Slime varlığı 0,00% 100,00% Pozitif (1) Negatif(0) Şekil Çalışılan doku kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 burun sürüntü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.117) Şekil Çalışılan burun sürüntü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%)

303 268 Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 4 püy kültürü örneğinin 1 inde (%25) slime varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%75) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.118) Şekil Çalışılan püy kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 abse kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.119) Şekil Çalışılan abse kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 periton sıvısı kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.120)

304 269 Şekil Çalışılan periton sıvısı kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 3 derin trakeal aspirat kültürü örneğinin 3 ünde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.121) Şekil Çalışılan derin trakeal aspirat kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 2 balgam kültürü örneğinin 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilirken, 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.122) Şekil Çalışılan derin balgam kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%)

305 270 Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 göğüs tüpü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.123) Şekil Çalışılan göğüs tüpü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 cilt sürüntü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.124) Şekil Çalışılan cilt sürüntü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 göz sürüntü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil ) Şekil Çalışılan göz sürüntü kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%)

306 271 Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 vajen sıvısı kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil ) Şekil Çalışılan vajen sıvısı kültürü örneklerinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile çalışılan toplam 1 kist sıvısı kültür örneğinde slime varlığı tespit edilememiştir. Araştırmada hasta materyallerinden izole edilen toplam 100 mikroorganizmanın 10 u Pseudomonas, 20 si Klebsiella, 55 i Staphylococcus ve 15 i Candida olarak tespit edilmiştir. İzole edilen toplam 10 Pseudomonas cinsi bakterinin hiçbirinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime oluşumu tespit edilememiştir. İzole edilen toplam 20 Klebsiella bakterisinin hepsinde hiçbirinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime oluşumu tespit edilmiştir. Slime oluşumu tespit edilen toplam 20 Klebsiella bakterisinin 17 si K.pneumoniae, 3 ü K.ozaenae türü olarak tanımlanmıştır. İzole edilen toplam 55 Staphylococcus bakterisinin 33 ünde (%60) kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilirken, 22 sinde (%40) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.127)

307 272 Şekil Çalışılan toplam 55 Staphylococcus bakterisinde hiçbirinde kongo kırmızılı agar yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile Slime varlığı tespit edilen Staphylococcus ların izole edildikleri hasta materyallerinin dağılımı Şekil de gösterilmiştir. Şekil Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen toplam 33 Stahphylococcus bakterisinin izole edildiği hasta materyallerinin dağılımı (%) Şekil Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen 33 klinik materyalin 12 si (%36,4) kan, 11 i (%33,3) yara, 3 ü %27,3) konjukntival sürüntü, 1 i (%3,0)

308 273 idrar, 1 i (%3,0) trakeal aspirat, 1 i (%3,0) doku kültürü, 1 i (%3,0) kateter içi kan, 1 i (%3,0) burun sürüntüsü, 1 i (%3,0) abse ve 1 i (%3,0) göz sürüntü kültürleridir. Araştırmada Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen toplam 33 Staphylococcus bakterisinin 17 si (%51,5) S.aureus, 8 i (%24,2) S.epidermidis, 2 si (%6,1) S.saprophyticus, 1 i (%3,0) S.cohnii, 1 i (%3,0) S.warneri, 1 i (%3,0) S.hominis ve 1 i (%3,0) S.vitulus olarak tespit edilmiştir (Şekil ) Şekil Slime pozitif tespit edilen Staphylococcus türlerinin dağılımı Araştırmada izole edilen 15 Candida nın 12 sinde (%80) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%20) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.130)

309 274 20% Slime varlığı Pozitif (12) Negatif (3) 80% Şekil Araştırmada Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%) Şekil Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen toplam 12 Candida nın izole edildiği hasta materyallerinin dağılımı (%) Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen 12 klinik materyalin 7 si (%58,3) idrar, 1 i (%8,3) vajen sıvısı, 1 i (%8,3) cilt sürüntüsü, 1 i (%8,3) derin trakeal aspirat, 1 i (%8,3) püy ve 1 i (%8,3) göğüs tüpü kültürleridir. Araştırmada Kongo kırmızılı agar yöntemi ile slime varlığı tespit edilen toplam 12 Candida nın 8 i (%66,7) C.albicans, 3 ü (%25) C.tropicalis ve 1 i (%8,3) C.glabrata olarak tanımlanmıştır (Şekil 4.132)

310 275 Şekil Slime pozitif tespit edilen Candida türlerinin dağılımı Standart cam tüp yöntemi Araştırmada izole edilen 10 Pseudomonas, 20 Klebsiella, 55 Staphylococcus ve 15 Candida mikroorganizmalarında slime faktör varlığı standart cam tüp yöntemi kullanılarak test edilmiştir. Çalışmada izole edilen toplam 100 mikroorganizmadan 66 sında (%66) slime faktör oluşumu tespit edilmiş, 34 ünde (%34) tespit edilememiştir (Şekil 4.133). Şekil Araştırmada standart cam tüp yöntemi ile slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%) Standart cam tüp yöntemi ile Slime faktör varlığı araştırılan mikroorganizmaların izole edildiği 100 hasta materyalinin dağılımı Çizelge 4.76 da gösterilmiştir.

311 276 Çizelge Slime varlığı araştırılan mikroorganizmaların hasta materyallerine göre dağılımı Standart cam tüp yöntemi- Slime varlığı Hasta materyali Slime pozitif Slime negatif Toplam İdrar Kan Yara Trakeal aspirat Konjunktival sürüntü Kateter içi kan Doku kültürü Burun sürüntüsü Püy Abse Periton sıvısı Derin trakeal aspirat Balgam Kist sıvısı Göğüs tüpü Cilt Göz sürüntüsü Vajen sıvısı Toplam Çalışılan toplam 100 klinik örnekleri; 31 kan, 16 yara, 28 idrar, 4 trakeal aspirat, 3 konjunktival sürüntü, 1 kateter içi kan, 1 doku, 1 burun sürüntü, 4 püy, 1 abse, 1 periton sıvısı, 3 derin trakeal aspirat, 2 balgam, 1 kist sıvısı, 1 göğüs tüpü, 1 vajen sıvısı, 1 cilt ve 1 adet göz sürüntüsü kültürlerinden oluşmaktadır (Grafik 1) Çalışılan toplam 31 kan kültürü örneğinin 16 sında (%51,6) standart cam tüp yöntemi ile slime varlığı tespit edilirken, 15 inde (%48,4) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.134)

312 277 Şekil Çalışılan kan örneklerinde standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 16 yara kültürü örneğinin 11 inde (%68,8) silme varlığı tespit edilirken, 5 inde (%31,3) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.135). Şekil Çalışılan yara örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 28 idrar kültürü örneğinin 19 unda (%67,9) silme varlığı tespit edilirken, 9 unda (%32,1) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.136).

313 278 Şekil Çalışılan idrar örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 4 trakeal aspirat kültürü örneğinin 1 inde (%25) silme varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%75) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.137). Şekil Çalışılan trakeal aspirat örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 3 konjunktival sürüntü kültürü örneğinin 3 ünde (%10) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.138) Şekil Çalışılan konjunktival sürüntü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%)

314 279 Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 2 kateter içi kan kültürü örneğinin 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilirken, 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.139) Şekil Çalışılan kateter içi kan örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 doku kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.140) Şekil Çalışılan doku kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 burun sürüntü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.141)

315 280 Şekil Çalışılan burun sürüntü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 4 püy kültürü örneğinin 1 inde (%25) slime varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%75) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil ) Şekil Çalışılan püy kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 abse kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.143) Şekil Çalışılan abse kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 periton sıvısı kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.144)

316 281 Slime varlığı 0,00% 100,00% Pozitif (1) Negatif(0) Şekil Çalışılan periton sıvısı kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 3 derin trakeal aspirat kültürü örneğinin 3 ünde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.145) Şekil Çalışılan derin trakeal aspirat kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 2 balgam kültürü örneğinin 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilirken, 1 inde (%50) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.146) Şekil Çalışılan derin balgam kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 göğüs tüpü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.147)

317 282 Şekil Çalışılan göğüs tüpü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 cilt sürüntü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.148) Şekil Çalışılan cilt sürüntü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 göz sürüntü kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.149) Şekil Çalışılan göz sürüntü kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 vajen sıvısı kültürü örneğinin 1 inde (%100) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.150)

318 283 Slime varlığı 0,00% 100,00% Pozitif (1) Negatif(0) Şekil Çalışılan vajen sıvısı kültürü örneklerinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%) Standart cam tüp yöntemi ile çalışılan toplam 1 kist sıvısı kültür örneğinde slime varlığı tespit edilememiştir. Araştırmada hasta materyallerinden izole edilen toplam 100 mikroorganizmanın 10 u Pseudomonas, 20 si Klebsiella, 55 i Staphylococcus ve 15 i Candida olarak tespit edilmiştir. İzole edilen toplam 10 Pseudomonas cinsi bakterinin hiçbirinde Standart cam tüp yöntemi ile slime oluşumu tespit edilememiştir. İzole edilen toplam 20 Klebsiella bakterisinin hepsinde Standart cam tüp yöntemi ile slime oluşumu tespit edilmiştir. Slime oluşumu tespit edilen toplam 20 Klebsiella bakterisinin 17 si K.pneumoniae, 3 ü K.ozaenae türü olarak tanımlanmıştır. İzole edilen toplam 55 Staphylococcus bakterisinin 33 ünde (%60) Standart cam tüp yöntemi ile slime varlığı tespit edilirken, 22 sinde (%40) slime varlığı tespit edilmiştir (Şekil 4.151) Şekil Çalışılan toplam 55 Staphylococcus bakterisinde Standart cam tüp yöntemi ile elde edilen slime varlığı oranı (%)

319 284 Standart cam tüp yöntemi ile Slime varlığı tespit edilen Staphylococcus ların izole edildikleri hasta materyallerinin dağılımı Şekil de gösterilmiştir. Şekil Standart cam tüp yöntemi ile Slime varlığı tespit edilen toplam 33 Stahphylococcus bakterisinin izole edildiği hasta materyallerinin dağılımı (%) Standart cam tüp yöntemi ile Slime varlığı tespit edilen 33 klinik materyalin 12 si (%36,4) kan, 11 i (%33,3) yara, 3 ü %27,3) konjukntival sürüntü, 1 i (%3,0) idrar, 1 i (%3,0) trakeal aspirat, 1 i (%3,0) doku kültürü, 1 i (%3,0) kateter içi kan, 1 i (%3,0) burun sürüntüsü, 1 i (%3,0) abse ve 1 i (%3,0) göz sürüntü kültürleridir. Araştırmada Standart cam tüp yöntemi ile slime varlığı tespit edilen toplam 33 Staphylococcus bakterisinin 17 si (%51,5) S.aureus, 8 i (%24,2) S.epidermidis, 2 si (%6,1) S.saprophyticus, 1 i (%3,0) S.cohnii, 1 i (%3,0) S.warneri, 1 i (%3,0) S.hominis ve 1 i (%3,0) S.vitulus olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.153)

320 285 Şekil Slime pozitif Staphylococcus türlerinin dağılımı Araştırmada izole edilen 15 Candida nın 12 sinde (%80) Standart cam tüp yöntemi ile slime varlığı tespit edilirken, 3 ünde (%20) slime varlığı tespit edilememiştir (Şekil 4.154) Şekil Araştırmada Standart cam tüp yöntemi ile Slime faktör varlığı tespit edilen ve edilemeyen mikrooganizma oranları (%)