REKOMBİNAT DNA TEKNOLOJİSİ TEMEL İLKELERİ VE UYGULAMA ALANLARI. Yard.Doç.Dr. Gülay Büyükköroğlu Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji ABD.

Transkript

1 REKOMBİNAT DNA TEKNOLOJİSİ TEMEL İLKELERİ VE UYGULAMA ALANLARI Yard.Doç.Dr. Gülay Büyükköroğlu Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji ABD.

2 Tarihçe Rekombinant DNA teknolojisine ilişkin deneysel çalışmalar 1944 yılında genetik bilginin nükleik asitlerde depolandığının bulunması ile başlamıştır 1953 yılında Nükleik asitlerden biri olan DNA nın çift sarmal ve iki nükleotid dizisinden oluştuğu bulunmuş 1961 de genetik kodun işleyişi belirlenmiş 1966 da 20 amino asit için tam genetik kodlar bulunmuş 1970 de test tüpünde ilk kez bir gen sentezi başarılmıştır

3 Rekombinant DNA Teknolojisinin gerçek hikayesi 1970 de Smith in mikroorganizmalarda bulunan ve DNA yı spesifik dizi bölgelerinden kesen restriksiyon endonükleaz enzimlerinin bulunmasıyla başlamıştır Bu dönemde belirli bazı virüslerde genetik bilginin ters yönde yani RNA DNA yönünde yürüdüğü ve bu sentezin revers transkriptaz enzimi ile gerçekleştirildiği gösterilmiştir. Böylece çeşitli dokulardan elde edilen mrna dan cdna sentezi gerçekleştirilmiştir

4 1972 yılında ilk kez rekombinant DNA molekülü elde edilmiş 1973 de gen klonlaması için plazmid vektörler kullanılmış 1977 de hemen bütün genlerde intron ve ekson bölgelerinin bulunduğu tespit edilmiş Transkripsiyonda öncü mrna daki intronların kesilip atılarak esas işlev gören eksonlardan oluşan mrna nın translasyon prosesini gerçekleştirdiği saptanmıştır

5 Bu gelişmelerle bir insan proteininin (peptid hormonu olan somatostatin) sentezi gerçekleştirilmiştir 1979 da rekombinant DNA teknolojisi ile insülinin biyosentezi gerçekleştirilmiş Hepatit B viral antijeni klonlanmış ve bu gelişme ile belirli hastalıklara karşı etkili ve koruyucu aşıların yapılabileceği ortaya konmuştur 1982 yılında insan kanser geninin (mesane kanseri) izolasyonu, klonlanması ve tanımlanmasıyla ilgili ilk çalışmalar gerçekleştirilmiştir

6 Rekombinant DNA Teknolojisinde en büyük buluş 1985 yılında, bir ya da iki hücreden elde edilen DNA materyalinin birkaç saat içerisinde çoğaltılarak genetik tanının konmasını sağlayan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction PCR) yönteminin uygulamaya konmasıdır

7 GENETİK MATERYALİN YAPISI Nükleik asitler, üç yapı taşı olan azotlu heterosiklik bazların (pürin ve pirimidin), bir pentoz şekerin (riboz ya da 2-deoksiriboz) ve bir de anorganik fosfat molekülünün 1:1:1 molar oranlarında birleşmesiyle meydana gelmiş makromoleküllerdir Canlılarda DNA ve RNA olmak üzere iki türlü nükleik asit bulunmaktadır

8 DEOKSİRİBONÜKLEİK ASİT (DNA) DNA materyali üç temel yapı taşından olşmaktadır Organik bazlar (pürin ve pirimidin bazları) 5 karbonlu şeker olan pentoz Fosforik asit

9 Organik Bazlar Pürin bazları: Adenin (A) ve Guanin (G) Primidin derivatıdır, pirimidine birleşmiş 5 atomlu imidazol halkası vardır Pirimidin bazları: Sitozin (C), Timin (T) ve Urasil (U) Bu bazlar 4 karbon ve iki nitrojenden oluşmuş tek halkalıdır ve serbest uçlarına atom ve atom grupları bağlanarak primidinler oluşur

10 5 Karbonlu Pentoz Şeker Bu şekerin DNA da bulunan türünün ikinci pozisyonundaki karbon atomuna bağlı oksijen olmadığından 2-deoksi-Driboz olarak adlandırılır. DNA molekülü yapısında deoksi riboz molekülünün bulunması nedeniyle deoksiribonükleik asit adını almıştır

11 Fosfat Molekülü (Anorganik fosfat) Hem DNA da hem RNA da yer alır

12 Pürin yada pirimidin bazlarının birinin deoksiribozla birleşmesi ile oluşan bileşiğe deoksiribonucleoside (nükleozid) denir Bu oluşuma (nükleozid) bir de fosforik asit eklenirse o zaman deoxyribonucleotide (nükleotid) adı verilir

13 Nükleik asit zincirlerinde bir başlangıç ucu (5 ı ) ve diğer uç ise son ucu (3 ı ) olarak adlandırılır ve bu nedenle DNA molekülü kutupsaldır denir 2 nükleotid birbirine foafodiester bağı ile bağlanır Nükleotidlerin birbirine eklenmesinde organik bazlar hiçbir fonksiyona sahip değildir.

14 Nükleotidlerin Birbirine Bağlanması

15

16 DNA ve RNA Arasındaki Farklar DNA Çekirdekte yer alır (Mitokondrial ve kloroplast DNA ları bu organellere ait proteinleri kodlar) Çift polideoksiribonükleotid dizisinden yapılmıştır 5 C lu fakat bir oksijeni noksan olan DEOKSİRİBOZ şekeri vardır TİMİN organik bazı içerir Kalıtsal materyal olarak görev yapar RNA %90 sitoplazmada %10 çekirdekte bulunur Tek poliribonükleotid dizisinden yapılmıştır. 5 C lu RİBOZ şekeri vardır URASİL organik bazı içerir Protein sentezi ile görevlidir (Bazı virüslerde :tütün Mozaik virüsu enfluenza virüsu, Çocuk felci virüsu kalıtsal materyal olarak görev yapar)

17

18 DNA Molekülünün Yapısal Özellikleri DNA molekülü, 2 polideoksiribonükleotid zincirinin bir araya gelmesiyle oluşan bir merdivene benzemektedir. Buna göre: her iki zincirde bulunan nükleotidlerin fosforik asit ve şeker molekülleri merdivenin direklerini, organikbaz molekülleri ise merdivenin basamaklarını oluşturmaktadır. DNA molekülünü meydana getiren 2 polideoksiribonükleotid zincirinin bir arada tutulması, şekerlerin 1 numaralı C nuna bağlı olan organik bazlar tarafından sağlanır. Organik bazlar rastgele dizilmezler; A:T ve G:C eşleşir Yani, her zaman pürin grubu ile primidin grubu bazlar bir araya gelir Bu eşleşme Hidrojen Bağı (H-bağı) adı verilen özel bir bağ sayesinde gerçekleşir

19 H-bağları, kovalent bağlara göre çok daha zayıf bağlardır, fakat 2 zincir boyunca mevcut olan H-bağı sayısının çokluğu, DNA yı oluşturan polinükleotid zincirlerini bir arada tutmak için yeterlidir A-T çiftinde 2 ve G-C çiftinde 3 adettir. Buna bağlı olarak, G ile C bazlarını bir arada tutan bağ, A- ile T mini bir arada tutan daha kuvvetlidir ve G-C bağının kırılabilmesi için gereken enerji miktarı da A-T bağının kırılması için gereken enerji miktarından daha fazladır.

20 DNA Molekülünün Basitleştirilmiş Olarak Yapısı

21 A=T eşleşmesinde şekerler arası mesafe 10.8, G=C eşleşmesinde şekerler arası mesafe 11,1 A 0 Bu farktan dolayı DNA çift zinciri kendi ekseni etrafında dönerek helix=sarmal=spiral şeklinde bir yapı meydana getirir. Birbiri etrafında kıvrılan düzgün bir çift sarmal durumdaki DNA; her 34 A 0 de bir tam dönüş yapar ve bu 34 A 0 lük kısma 10 nükleotid sığar (nükleotidler arası mesafe 3.4 A 0 ). DNA molekülünün yarıçapı 10 A 0 olup, geniş ve dar oluklar ayırt edilir. DNA molekülünü meydana getiren 2 polinükleotid dizisi birbirine zıt yönde uzanır (Anti paralel) Tüm DNA moleküllerde, merdivenin direk kısımları P-nükleozid tekrarından meydana geldiği için, çeşitli canlıların DNA larını birbirinden farklı kılan baz gruplarıdır Bağlanış sıralarına göre bir canlıda; A:T oranı =1 G:C onarı =1 dir fakat farklı canlılarda A - T : G - C oranı belirli değildir. (Yüksek yapılı bitki ve hayvanlarda A-T oranının G-C oranından daha yüksek olduğu tespit edilmiştir)

22 DNA REPLİKASYONU

23 Görüldüğü gibi DNA molekülünde 2 polinük, zinciri birbirini tamamladığı için, bunlardan birinin hangi nükleotidlerden yapıldığını bilmek bize diğerinin diziliş sırasını kolaylıkla bulmamızda yardımcı olur Bütün DNA moleküllerinde, molekülün direk kısımları bir fosforik asit, bir şeker tekrarından meydana geldiği için, çeşitli canlıların DNA larını birbirimden farklı kılan, bu merdivenin basamakları yani purin ve pirimidin bazlarıdır Ve her zaman Adenin bazı ancak bir Timinle ve G bazı da ancak bir C ile eşlenebildiği için bir canlıda A/T ve G/C oranları her zaman 1:1 oranı gibidir. Fakat farklı canlılarda A-T/G-S çiftine oranı değişiklik gösterebilir Ör. Yüksek yapılı bitki ve hayvanlarda A-T oran G-S oranından daha yüksek bulunmuştur

24 DNA nın kendini Eşlemesi (Dublikasyonu=Replikasyonu) Canlıların karakterleri ve hayatsal faaliyetler DNA üzerindeki genlerde şifrelenmiştir Hücrede birbirinden farklı görevler gören, farklı DNA parçalarına GEN denir Bütün faaliyetler bu genlerdeki şifreye göre yönetilir DNA taşıdığı bilgi sayesinde hücrenin hayatsal faaliyetlerini yönetmekle birlikte, çoğalarak yeni hücreler (nesiller) de meydana getirmek zorundadır DNA molekülünün eşini oluşturarak çoğalmasına replikasyon (ikileşme, eşleme) adı verilir.

25 Çoğalma olacağı zaman bazlar arasındaki hidrojen bağları kopar ve dallar birbirinden ayrılır Her dal yeni oluşacak dal için kalıp ya da model görevini görür Bu yolla, daha önceki bir çift DNA dalından aynı yapıda iki çift dal meydana gelmiş olur 3 nolu C a bağlı OH ve 5 nolu C a bağlı fosforik asite bağlanacak şekilde sentez yapabilmektedir yönünde sentez gerçekleşir Sentez için gerekli enerji ise fosfat grupları arasındaki yüksek enerjili bağın kopartılmasıyla oluyor Zincir 2 ye ayrılınca bir zincir devamlı uzayabilir Diğer zincirde parçalı uzayan kısımlar vardır ve bu parcalı uzayan kısımlara da Okazaki fragmentleri adı verilir

26 DNA replikasyon reaksiyonunu katalizleyen enzim DNA polimeraz enzimidir. Bu enzim yavru DNA zincirinin oluşumu sırasında nüklotidlerin şeker ve fosfat grupları arasıda fosfodiester bağı oluşturmakla görevlidir Bazların hangi sıraya göre dizileceğini bilmez Bununla ilgili derektifler kalıp görevi gören eski DNA zincirinden gelmektedir DNA zincirine her yeni bir nükleotidin eklenmesi her zaman yönünde olur Özetle, kalıp görevi gören DNA zincirindeki nükleotide uygun baz işlemesi yapabilen bir nükleotid DNA polimeraz tarafından bu geni nükleotidin fosfat grubu ile zincirdeki bir önceki nükleotidin 3-OH grubu arasında fosfodiester bağı oluşturularak DNA nın replikasyonu sağlanır. DNA, polimerazn yanlış bir nükleodi bağlaması olasılığı oldukça düşüktür

27 DNA polimerazın DNA sentezini gerçekleştirebilmesi için Önem sırasına göre; Kalıp zincire 4 çeşit deoksinükleotid trifosfat molekülüne (datp, dgtp, dctp ve dttp) Mg ++ iyonuna Primer (DNA kalıp zincirine H bağı ile bağlı nükleotidden oluşan RNA zincirine) ihtiyaç vardır

28 E. Coli DNA Replikasyonunda Rol Alan Proteinler DNA helikaz: DNA çift sarmalini açarak replikasyonu mümkün kılar DNA primaz: Primosonla kompleks halde bulunur, kısa primer RNA dizilerini sentezler DNA polimeraz III : Primer RNA dizilerini kullanarak DNA sentezini gerçekleştirir (saniyede 1000 nükleotid ekleyebilir) Bugüne kadar tespit edilen hiçbir DNA polimeraz enzimi yeni zincirin birden bire oluşumunu başlatamaz bu nedenle 3 -OH gurubu yeni nükkotidin P grubunun eklenmesine müsait yani açık olan bir primer başlatıcı zincire ihtiyaç vardır Tek iplikli DNA ya bağlanan protein kompleksi: replikasyon sırasında geçici olarak oluşan DNA tek iplikciklerine bağlanarak bu kısımların stabilizasyonunu sağlar DNA polimeraz I : RNA primerini kopardıktan sonra gereken (eksik) nükleotidleri ilave eder ( ekzonükleaz aktivitesi) ( ~10 nük/saniye) DNA Ligaz : Okazaki segmenleri arasındaki gedikleri doldurarak segmenleri birbirine ekler ( Sayfasında şematik olarak anlatımını bulabilirsiniz)

29

30

31 DNA nın Deratürasyonu Ayrışımı= Erimesi Yüksek ısıya tabi tutulduğunda DNA çift sarmalinin kolları, bunları birbirine bağlayan H-bağı noktalarından çözülebilir. Buna DNA nın denatürasyonu=erimesi denir. Erime noktası ile A-T ve G-C oranları arasında bilirgin bir ilişki söz konusudur. G-C oranı fazla olan DNA, daha yüksek erime noktasında denatüre olurken, A-T oranı daha fazla olan DNA daha düşük sıcaklıkta erime özelliği gösterir Bu özelliğe dayalı olarak 2 farklı DNA molekülü G-C oranları bu iki molekülün erime noktalarının karşılaştırılması suretiyle saptanabilir Belirli bir DNA molekülünün çift sarmali belli bir ısı sınırının üzerinde birbirinden ayrışır. Bu nokta Tm= erime noktası denir ve DNA nın baz dizisi ve solüsyonun tuz konsantrasyonundan etkilenerek değişebilir

32 Bazı Bakterilerde Erime noknoktası ve G-C S.Pneamoniae E.coli S.Marcesans 86 0 C, %38 G-C 90 0 C, %52 G-C 94 0 C, %58 G-C

33 DNA nın Denatürasyonu ve Renaturasyonu

34 DNA molekülünün bu özelliği, DNA nın manipülasyonunu mümkün kılar. DNA gevşemiş (rahat) ve süper helozonlaşmış formlarda bulunabilir, bakteri, bakteriyofaj ve pek çok virus DNA ları dairesel yapıya sahiptir. Bu yapı DNA nın polaritesini (ön ve son uç) tahrip etmez ancak serbest olan 5 fosforil ve 3 hidroksil gruplarını ortadan kaldırır Bu kapalı daire şeklindeki yapılar; gevşek veya aşırı helozonlaşmış formlarda bulunurlar Kapalı daire şeklindeki DNA kendi ekseni etrafında kıvrılınca veya bir taraftaki uçları tespit edilmiş düzlemsel duplex DNA diğer serbest ucundan kıvrılınca yapısına helezonlar katılır Enerji gerektiren bu olay DNA molekülünü gerilim altında bırakır. Buna bağlı olarak süper helezonların sayısı artıkça gerilim = torsiyon da o denli artar. DNA molekülü sağa dolanan çift sarmalin tam aksi yönünde kıvrılınca negatif süperhelezonlar meydana gelir. Negatif süper helezonla DNA nın dolanımı düşük düzeyde olarak kabul edilir. Enerji gerektiren başka bir forma geçiş, bu düşük düzeydeki dolanım tarafından kolaylaştırılmaktadır. Söz konusu DNA nın diğer formu; DNA çift sarmalının birbirinden ayrılmasıyla ortaya çıkan formdur. DNA çift sarmalının birbirinden ayrılması, DNA nın replikasyonu ve transkripsiyonu için gereklidir. Bu nedenle süper helezonlaşmış DNA biyolojik sistemlerde tercih edilen bir formdur

35 DNA nın topolojik (strüktürel) değişikliklerini katalize eden enzimler Topoizomerazlardır Topoizomerazlar, süper helezonları açarak gevşetebilir veya DNA ya yeni helezonlar ekleyebilirler Topoizomeraz I : Süper helezonlu DNA yı gevşetir DNA Giraz indükler. : negatif helezonlaşmayı

36 DNA nın İŞLEVİ Kalıtsal bilgi DNA daki nükleotidlerin belirli bir düzen içersinde sıralanmasıyla belirlenir ve dölden döle bu şeklide aktarılır Sonuçta, herhangi bir türe ait özellikler DNA da şifrelenen protein ve enzim moleküllerinin sentezi ile ortaya çıkar DNA hücrenin yalnızca çekirdeğinde yer aldığı için protein sentezlenmesini doğrudan doğruya yönlendiremez Hücre içinde bu görev RNA denilen diğer nükleik asit molekülleri tarafından gerçekleştirilir Protein sentezine doğrudan doğruya katılan RNA molekülleri ana kalıp olan DNA dan ara kalıplar meydana getirerek DNA da şifrelenen bilgileri hücrenin sitoplazmasına aktarır ve ribozomlar vasıtasıyla protein sentezini gerçekleştirir. DNA, RNA ve Protein arasındaki ilgi sentral Dogma prensibi ile ifade edilir.

37 RNA nın YAPISI RNA da DNA gibi uzun iplik şeklinde bir molekül olup, 4 çeşit nükleotid birbirlerine fosfodiester bağlarıyla bağlanmıştır Canlılarda bulunan ikinci nükleik asit türüdür Bu molekülün DNA dan farkı yapısına şeker olarak riboz molekülü ve Timin bazı yerine Urasil bazının bulunmasıdır RNA, ribonükleotidlerin birbirine bağlanmasıyla oluşan tek iplikçi bir yapıya sahiptir RNA molekülünün boyu DNA molekülüne oranla daha kısa olup, hemen hemen bütün hücrelerde bol miktara bulunur Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde genel olarak üç tür RNA (mrna, trna ve rrna) bulunurken, ökaryotik hücrelerde üç tür RNA nın yanı sıra iki tür öncül RNA molekülü bulunur. Bunlar; heterojen nükleer RNA (hnrna) ve small nükleer RNA (snrna)dır.

38 mrna Messenger RNA, DNA da saklı bulunan kalıtsal bilginin protein yapısına dönüştürülmesinde kalıp görevi yapar RNA plimeraz enzimi yardımıyla çift dallı DNA nın yalnızca bir dalından hücre çekirdeği içinde sentezlenir, stoplazmaya geçerek ribozomlara tutunur DNA dan aldığı genetik bilgiye göre sentezlenecek proteinin amino asit sırasını tayin eder Her mrna molekülü DNA üzerinde yer alan ve gen adı verilen belirli bir bölgeye komplementerlik gösterir mrna molekülleri değişik büyüklükte olabilir ve total hücre RNA nın %4 ünü oluşturur Hücre içindeki yarı ömrü 7-24 saat kadardır

39

40 trna Taşıyıcı RNA çeviri (translasyon) işleminde görev alan RNA türüdür trna mrna gibi tek dallıdır fakat stoplazmada bulunan en küçük RNA molekülüdür Seçme ve taşıma işlevini yerine getirir Prokaryot ve ökaryot trna molekülleri düzenlenmesi gereken daha büyük öncül moleküllerden yapılmaktadır trna büyük primer RNA moleküllerinin 5 1 ve 3 1 uçlarında fazla olan nükleotidlerin enzimatik uzaklaştırılması ile meydana gelir ve molekül içindeki intron uzaklaştırılır 20 amino asidin her biri için en az bir trna molekülü bulunmaktadır Hücrede sentezlenen ve enzimler tarafından aktive edilen amino asit molekülleri, kendilerine özgül olan trna moleküllerince aranıp bulunur ve trna molekülünün serbest ucu özgül amino asitlerle birleşir trna lar adaptörlük görevi yaparak bir uçlarına bağladıkları amino asitleri ribozoma tutunmuş mrna nın taşıdığı kodonlara göre polipeptid zincirine dizerler Total RNA nın %10 unu oluştururlar

41 rrna Hücresel total RNA nın %40-50 sini oluştururlar rrna lar ribozomların bir parçasıdır ve özgül değillerdir Doğrudan doğruya DNA dan sentezlenirler Metabolik olarak kararlıdırlar Ribozomların yapı ve işlevlerinde önemli rol oynarlar Nükleolusta önce prekürsörler şeklinde sentez edilirler sonra enzimatik yolla kesilerek depolanırlar

42 TRANSKRİPSİYON (mrna Sentezi) Hücre içinde DNA da şifrelenmiş bilgilerin (genetik kodlar) yararlanılabilir hale gelmesi için aracı bir moleküle aktarılması gereklidir, bu da mrna dır. DNA da şifrelenmiş olan bilgilerin DNA iplikciklerinden biri kullanılarak, RNA polimeraz (transkriptaz) enziminin katalitik etkisiyle sentezlenen mrna ya şifreler halinde aktarılmasına transkripsiyon adı verilir. RNA polimeraz, kopyalaması yapılacak olan bölgede hem DNA çift sarmalini açar, hemde bu bölgede şifrelenen bilgiyi DNA alfabesinden RNA alfabesine çevirerek mrna yı sentezler. Oluşan mrna kendisine kalıp görevi yapan DNA iplikciğine anti-paraleldir ( Kalıp görevi yapan DNA iplikçiğine anlamlı iplikcik adı verilir)

43 Transkripsiyon sırasında DNA nın hangi iplikciğinin kalıp olarak kullanılacağı transkripsiyonu yapılacak yere ait promotor dizisi tarafından belirlenir a) sağdan sola doğru ilerleyen RNA polimeraz üst zinciri kalıp olarak kullanır b) soldan sağa doğru ilerleyen RNA polimeraz alt zinciri kalıp olara kullanılır DNA daki nükleotidlerin diziliş sıraları, proteinlerdeki amino asitlerin dizilişine karşılık geldiği için, bu iki molekül DNA ve proteinler KO- LİNEAR olarak kabul edilir Transkripsiyonun sona ermesi RNA polimeraz enziminin belli bir kodona (Terminatör: bitiş sinyalini veren kodon) ulaşmasıyla gerçekleşir

44

45

46 Revers Transkripsiyon Transkripsiyonda RNA polimeraz I, DNA iplikciklerinden birini kalıp olarak kullanarak genetik bilgiyi aynen mrna ya aktarır ve bu işlemi DNA ya bağımlı olarak sürdürür (DNA mrna) Hücrelerde bir diğer mekanizma vardır ki oda RNA veya mrna kalıp olarak kullanılarak buna komplementer olan DNA (cdna) sentezlenmesidir. Tersine bir transkripsiyon olduğu için buna revers transkripsiyon (RNA DNA) adı verilir. Burada mrna kalıp görevindedir, buna antiparalel ve komlementer DNA (cdna) sentezinde DNA ya değil mrna ya bağımlı DNA polimeraz (revers transkriptaz) enzimi etkin rol oynar.

47 Revers transkripsiyona genellikle, RNA karakterindeki genoma sahip virüslerin (retrovirüs) genetik materyali olan mrna kalıp görevini yapar mrna ya göre oluşturulan cdna da daha sonra kalıp olarak görev yaparak DNA polimeraz III yardımıyla ikinci DNA iplikçiği sentezlenir Oluşan bu çift iplikçi DNA hücre DNA sına entegre olur Bu ters transkripsiyonda RNA özelliğinde genom taşıyan virüslerden Rekombinant aşılar yapmak ve yabancı genleri hücre DNA sına entegre etmek mümkün olabilmektedir

48 Ekstra Kromozomal Genetik Elementler (Plasmidler) Plazmidler ekstrakromozomal DNA zincirleridir Hemen her tür bakteride plazmidlere rastlanabilmektedir Genellikle çift zincirli çembersel DNA lar olmakla birlikte, bazı bakterilerde çizgisel plazmidlere de rastlanmıştır Kromozomal DNA gibi, çeşitli proteinler dizgelerler Bu proteinler genellikle yaşam için şart olan proteinler değil, belli ortamlarda, özel koşullarda, bakterilere avantaj sağlayan proteinlerdir Bunlar arasında antibiyotik ve başka toksik maddelere karşı direnç, antibiyotik sentezi, toksin yapımı sayılabilir

49 Bilindiği gibi, çifte zincirli DNA doğal şekli ile 10.4 bazçiftte bir kendi etrafında dönen sarmal halindedir Plazmidler gibi iki ucu çembersel yapıda olan DNA larda bu sargı sayısı arttırılabilir veya azaltılabilir Doğal halinin bu şekilde bozulması ile yaratılan gerilim plazmitin kendi üzerine katlanması ile giderilir Ortaya çıkan bu katlanmaya süpersarmal adı verilir Bu oluşum sargı sayısının artışı ile ortaya çıkıyorsa pozitif süper sarmal, azalma ile ortaya çıkıyorsa negatif süpersarmal adını alır Bakterilerin büyük çoğunluğunda kromozomal ve plazmid DNA sı negatif süpersarmal şeklinde bulunur

50 Plazmidlerin kromozomdan bağımsız var olabilmeleri için başalngıç proteinlerinin tanıyabileceği bir replikasyon orijini ori bölgesi bulunur Replikasyon için gerekli tüm diğer enzimler (DNA polimeraz, primaz, helikaz, ligaz vb), kromozom tarafından dizgilenerek yapılan enzimler şeklinde sağlanır Çoğalma genellikle iki zincirin ori bölgesinde birbirinden ayrılması ve iki zincir üzerinde başlayıp karşı yönde sentez yapılması şeklinde gerçekleşir (Teta replikasyonu) Bir başka çoğalma şekli ise, bir zincirin kesilip açılması ve diğer zincir üzerinde sentez yapılmasıdır (yuvarlanan çember)

51 Teta replikasyonu Yuvarlanan çember

52 Plazmitlerin birçok önemli özelliği ori bölgesine bağlıdır: Konak çeşidi: Birçok ori, sadece bir tür bakteri tarafından tanındığı için sadece o bakteri içerisinde çoğalabilir. Birçok türde bakteri içerisinde çoğalabilen plazmidler saptanmıştır. Bu tür plazmidler genellikle kendi çoğalmaları için gerekli genlerin çoğunu kendi üzerlerinde taşırlar. İki farklı tür bakteride çalışabilen farklı iki ori aynı plazmid üzerine konarak, her iki bakteride de çoğalabilen melez plazmitler yapılmıştır. Kopya sayısı: bakterilerde plazmidler çok değişik sayılarda bulunabilirler. Belli sayıya ulaşan plazmitin çoğalması, ori bölgesinin inhibisyonu ile durdurulur. Genellikle pşazmid tarafından kodlanan, inhibitör bir protein ya da RNA tarafından yapılır. Plazmid replikasyonu bir RNA primeri ile başlatılır. Plazmid sayısı arttıkça, bunlarda dizgelenen bir başka RNA primeri ile başlatılır. Plazmid sayısı arttıkça, bunlarda dizgelenen bir başka RNA çoğalır ve primer görevi gören RNA ya bağlanarak onun replikasyonunu başlatmasını engeller.

53

54

55