T.C GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI OVULASYON İNDÜKSİYONUNDA OVARYUM PROLİFERASYON ANTİJENLERİNİN BELİRLENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ Sinem DEMİR Tez Danışmanı Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN ANKARA Ocak 2011

2 T.C GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI OVULASYON İNDÜKSİYONUNDA OVARYUM PROLİFERASYON ANTİJENLERİNİN BELİRLENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ Sinem DEMİR Tez Danışmanı Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 01/ proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Ocak 2011

3 i

4 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay i İçindekiler ii Resimler iv Tablolar x Kısaltmalar ve Simgeler xi 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER Ovaryum Embriyolojisi Oogenezis Ovaryum Anatomisi Ovarium un Yapısı Ovarium Arterleri Ovarium Venleri Lenf drenajı Ovarium Sinirleri Ovaryum Histolojisi Ovaryum Follikülleri Primordiyal Follikül Primer Follikül Sekonder Follikül Tersiyer Follikül( Graaf Follikül) Atretik Follikül Ovulasyon Korpus Luteum Ovaryum Fizyolojisi Ovaryum Hormonlarının İşlevi-Östradiol ve Progesteron Östrojenler Östrojenlerin İşlevleri Progestinler Progesteronların İşlevleri Hipotalamus tan Salgılanan GnRH ve Bu Hormonun FH ve LH Salgılanmasına Etkileri 34 ii

5 2.5. İnfertilite ve Ovulasyon İndüksiyonu İnfertilite Ovulasyon İndüksiyonu Gonadotropinler ile Ovulasyon İndüksiyonu Gonadotropin Endikasyonları Gonadotropinlerle Tedavi Rejimi Gonadotropin Tedavi Sonuçları Klomifen Sitrat(KS) ile Ovulasyon İndüksiyonu Klomifen Sitrat Endikasyonları Klomifen sitrat Dozu Klomifen Sitrat Tedavi Sonuçları Klomifen Sitrat ın Yan Etkileri Proliferasyon Hücre Çekirdek Antijeni (PCNA) c-fos Lösemi İnhibitör Faktör (LIF) 52 3.GEREÇ VE YÖNTEMLER Deney Hayvanları ve Gruplandırma İmmunohistokimyasal Yöntem İstatistiksel Yöntem BULGULAR PCNA Bulguları C-FOS Bulguları LIF Bulguları İstatistiksel Bulgular 63 5.TARTIŞMA SONUÇ ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER TEŞEKKÜR ÖZGEÇMİŞ 162 iii

6 RESİMLER Resim 1: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryum dokusunda yapılan PCNA boyaması (İmmünperoksidaz- HematoksilenX100). Resim 2: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryum dokusunda yapılan PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 3: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryum dokusunda yapılan PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 4: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100, CX100). Resim 5: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 6: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 7: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında yapılan PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100, CX100, DX100). Resim 8: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 9: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400). iv

7 Resim 10: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusunda yapılan PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100,BX100). Resim 11: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusunda yapılan PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400,BX400). Resim 12: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokularında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X100). Resim 13: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokularında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 14: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokularında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 15: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100, CX100). Resim 16: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400, CX400). Resim 17: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 18: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarında c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X100). v

8 Resim 19: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarında c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 20: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarında c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 21: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda c- fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). Resim 22: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda c- fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 23: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). Resim 24: : Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 25: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 26: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 27: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen X100). Resim 28: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen X400). vi

9 Resim 29: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen X400). Resim 30: Klomifen uygulaması yapılan grup ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). Resim 31: Klomifen uygulaması yapılan grup ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 32: : Klomifen uygulaması yapılan grup ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 33: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). Resim 34: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 35: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 36: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen X100). Resim 37: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubuna ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX400, BX400). Resim 38: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X40). vii

10 Resim 39: : Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 40: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 41: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması ). (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X40). Resim 42: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). Resim 43: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). Resim 44: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). Resim 45: Klomifen uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400, CX400). Resim 46: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). Resim 47: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). viii

11 Resim 48: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe grupların ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX100, BX100). Resim 49: : Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe grupların ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen X400). Resim 50: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe grupların ovaryum dokusunda yapılan LIF boyaması (İmmünperoksidaz- Hematoksilen X400). ix

12 TABLOLAR Tablo 1. Hormon ve klomifen sitrat grubuna ait Graaf değerlerinin istatistiksel açıdan değerlendirilmesi Tablo 2. Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum çaplarının istatistiksel açıdan değerlendirilmesi Tablo 3. Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplara ait primordiyal follikül sayılarının istatistiksel açıdan değerlendirilmesi Tablo 4. Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplara ait sekonder follikül sayılarının istatistiksel açıdan değerlendirilmesi Tablo 5. Hormon uygulaması yapılan gruba ait tanıtıcı istatistikler Tablo 6. Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait tanıtıcı istatistikler Tablo 7. Graaf çaplarına ait tanıtıcı istatistikler Tablo 8. Follikül sayılarına ait tanıtıcı istatistikler x

13 KISALTMALAR ve SEMBOLLER ATP camp DNA FSH GnRH hcg hmg KOH KS LH OHSS OMI PAS TBF TSH WHO ZP : Adenozin trifosfat : Siklik adenozin monofosfat : Deoksiribonükleik asit : Follikül uyaran hormon : Gonadotropin salgılatıcı hormon : İnsan koryonik gonadotropin hormonu : İnsan menapozal gonadotropin hormonu : Denetimli ovaryan hipersitimülasyon : Klomifen sitrat : Lüteinize hormon : Ovaryan hiperstimülasyon sendromu : Oosit olgunlaşmasını baskılayan madde : Periyodik asit Schiff : Testis belirleyici faktör : Tiroid uyaran hormon : Dünya Sağlık Örgütü : Zona pellucida xi

14 1.GİRİŞ Ġnfertilite; Dünya Sağlık Örgütü nce (WHO), korunmasız cinsel yaģama karģın bir yıl süresince gebe kalınamaması olarak tanımlanmaktadır. Üreme yaģ grubundaki çiftlerin %10-15 ini etkilemektedir. Ġnfertilite oranı son yıllarda giderek artmaktadır. Bu artıģın önemli nedenleri arasında kadınlarda artan kariyer düzeyi, yüksek evlilik yaģı ve boģanma oranı, doğum kontrolü ve aile planlaması alanında geliģmeler, gecikmiģ doğum yaģı gösterilmektedir. 1,2,3,4 Ġnfertilite değiģik toplumlarda farklı nedenlerle ortaya çıkmaktadır. Hull ve arkadaģlarının Ġngiltere Bristol da 708 çift arasında yaptıkları bir araģtırmada infertilite nedenlerinin %21 inin ovaryan yetmezlik, %14 ünün tubal etken, %21 inin erkek faktörü ve %28 inin açıklanamayan infertilite olduğu bildirilmiģtir. Günümüzde infertilite nedenleri anovulasyon, tubal etkenler, erkek faktörü ve açıklanamayan infertilite olarak gruplanabilmektedir. Uterin ve endometrial etkenler, gamet ve embriyo defektleri ve gamet ya da embriyonun mikro çevresini etkileyebilecek herhangi bir durum da infertilitede rol oynayan diğer faktörlerdir. 5,6 Toplumun büyük bir kesimini ilgilendiren bu sorun, psikolojik ve sosyal boyutunun yanı sıra son yıllarda ileri düzeyde geliģme gösteren yardımcı üreme tekniklerinin de kullanılmaya baģlanmasıyla, özellikle geliģmekte olan ülkeler için büyük finansal sorunları da birlikte getirmektedir. Bu nedenle infertilite olgularında hastaya uygun sistematik bir yaklaģımda bulunulması son derece önemlidir. 7 1

15 Sorunların aģılmasına yönelik tedavi yöntemleri arasında ovulasyon indüksiyonu intrauterin inseminasyon ile birlikte infertilite tedavisinin temelini oluģturur. Anovulatuar ya da normal ovulasyonu gerçekleģtiren ancak yetersiz folliküler ve luteal geliģmesi olan hastalarda infertilite tedavisi ilk seçenek olarak yerini almıģtır. Ovulasyon indüksiyonu kapsamında, denetimli ovaryan uyarım için genellikle klomifen sitrat kullanılır. Klomifen sitrat ın infertilite tedavisinde ilk aģama olarak seçilmesinin nedeni diğer tedavi seçeneklerine karģın ciddi yan etkisi az, maliyeti düģük, baģarısı yüksek bir tedavi seçeneği olmasından kaynaklanmaktadır. Klomifen sitrat kimyasal olarak bir trifeniletilen türevidir. Enklomifen ve zuklomifen olarak iki izomerin karıģımından oluģmaktadır. Enklomifen daha çok oranda antiöstrojenik erke sahiptir. Klomifen sitrat, hipofiz ve hipotalamusta östrojen reseptörlerini bloke ederek bu merkezlerin östrojenlerin olumlu geri denetimlerinden kurtulmasını sağlar. Klomifen sitrat östrojen reseptörlerine bağlandığında bu reseptörleri birkaç haftaya varan sürelerde iģgal eder. 7,8,9,10 Klomifen sitrat tedavisine yanıt vermeyen hastalara bir üst aģama olarak, insan menopozal gonadotropin (hmg) ile tedavi denenmektedir. FSH ve LH nın granuloza ve teka hücreleri üzerindeki etkileri çok iyi belirlenmiģtir ve folliküler geliģim için esastır. Etki düzeneği klomifen sitrata karģın daha iyi bilinmektedir. Tedavinin baģarılı olabilmesi için ovaryumların iģlevsel olması gerekir, çünkü verilen hmg endojen gonadotropinlerin yerini alarak ovulasyon indüksiyonu yapmaktadır. Kendiliğinden olan döngülerde olduğu gibi FSH birincil olarak granüloza hücreleri ve LH teka lutein hücreleri üzerinde etki göstererek folikülogenezisi uyarırlar. 11,12 2

16 Ġnsan koryonik gonadotropin (hcg) ise, karbonhidrat yan zincirli glikoprotein yapılı bir hormondur. LH, FSH ve TSH nın heterodimerik yapısı ile benzerlik gösterir. Mazer ve Ravetz gebe kısrakların serum gonodotropinlerini ve koyunların hipofiz ekstrelerini follikül uyarımı için ve hcg yi folikül olgunlaģmasının sonlandırılması için amenoreik kadınlarda kullanmıģlar ve hipofizer bir faktörün folikül geliģimini uyardığı ve hcg nin ovulasyonu indüklediği sonucuna varmıģlardır. 13,14 Bugün ovulasyon indüksiyonunda amaç, anovulatuar hastalarda ovulasyonu baģlatmaktır. Ovulasyon sağlanabildiği durumlarda ise esas amaç tek folliküllü ovulasyondur. 15 Ġnfertilite tedavisinde elde edilen baģarıya koģut olarak ovulasyon indüksiyon ajanlarının kullanımı her geçen gün artmaktadır. Bu artıģ aynı zamanda istenmeyen yan etkileri de beraberinde getirmektedir. En sık rastlanan ciddi yan etki ovaryan hiperstimulasyon sendromu (OHSS) dur. Bu uyarım protokollerinin % inde oluģan ölümcül olabilecek bir durumdur. Ovulasyon indüksiyonunda %35 oranında karģılaģılan çoğul gebelikler beraberinde getirdiği morbidite ve fötal mortalite nedeniyle istenmeyen durumlardan biridir. Ayrıca ovulasyon indüksiyonu sonrası meme, ovaryum ve endometriyum kanseri dağılımında artıģ ile ilgili çok sayıda olgu sunumları bildirilmiģtir. 6,16 Bu konuyla ilgili olarak yapılan diğer çalıģmalarda ise üst üste yapılan hormonal ovulasyon induksiyonu uygulamalarının, önlenemez hücre çoğalmasına ve kansere neden olduğu da bildirilmiģtir. Tüm bu çalıģmalara ek olarak bu maddelerin kullanımının ovaryumda tam olarak ne gibi histolojik değiģikliklere neden olduğu açıklığa kavuģmamıģtır. 17 3

17 Bizim çalıģmamızda, klomifen sitrat ve gonodotropinlerin ovulasyon induksiyonu için kullanımları sonucunda ovaryumlarda neden olabileceği yapısal değiģimlerin immunohistokimyasal olarak karģılaģtırmalı incelenmesi amaçlanmıģtır. Bu amaçla hücre proliferasyon iģaretleyicileri olan PCNA, LIF ve c-fos belirteçleri kullanılmıģ ve bulgular karģılaģtırmalı olarak değerlendirilmiģtir. 4

18 2.GENEL BİLGİLER 2.1.OVARYUM EMBRİYOLOJİSİ Embriyonun cinsiyeti, genetik olarak döllenme sırasında belirlenmiģ olmasına karģın, gonadlar geliģimin 7. Haftasına değin erkek ya da diģi yapısal özelliğe sahip değillerdir. 18 Cinsiyetin farklanması çok sayıda genin rol oynadığı karmaģık bir süreçtir. SRY geni (Y kromozomu nun üzerindeki cinsiyet belirleyici bölge) Y kromozomunun kısa kolunda (Yp11) bulunur ve cinsiyet belirleyicisidir. Bu genin protein ürünü olan transkripsiyon faktörü, geliģmemiģ durumdaki üreme organlarının cinsiyetini belirleyen genleri harekete geçirir. SRY geni Testis Belirleyici Faktör dür(tbf). Bu faktörün var olması durumunda fetusun cinsiyeti erkek, yokluğunda ise kızdır. 18 Gonadlar baģlangıçta kölom epitelinin çoğalması ve altındaki mezenģimin yoğunlaģmasıyla oluģmuģ bir çift genital ya da gonadal kabartılar Ģeklinde belirirler. GeliĢimin 6. haftasına değin bu kabartılar içinde üreme hücreleri görülmez. 18,19 Ġlkel (primordiyal) üreme hücreleri, geliģimin 2. haftasında primer embriyonik ektodermden (epiblast) köken alırlar. Daha sonra epiblasttan ayrılarak ameboid hareketlerle vitellus kesesinin ekstraembiyonik yapılarına 5

19 göç ederler. BaĢlangıçta embriyonun kaudalinde yerleģik ekstraembriyonik mezodermde görülürler, sonra vitellus kesesi duvarı endoderminde izlenirler. GeliĢimin 4. haftasında son bağırsağın mezenterinin dorsali boyunca ilerleyerek 5. hafta baģında ilkel gonadlara ulaģırlar. 6. haftada ise genital kabartılara yerleģirler. Ġlkel üreme hücrelerinin izlediği bu yola germ çizgisi (hattı) denir. Ġlkel üreme hücreleri açık renk sitoplazmaları ve oval Ģekilleriyle ayırt edilirler. Bu hücreler genital kabartılara ulaģamadıklarında gonadlar geliģemez. Gonadların ovaryum ya da testis e farklanmalarında ilkel üreme hücrelerinin tetikleyici etkisi vardır. 18,19 Ġlkel üreme hücrelerinin ilkel gonadlara ulaģmasından hemen önce ve ulaģması sırasında, genital kabartının epiteli çoğalır ve epitel hücreleri altındaki mezenģimin içine gömülürler. Burada ilkel cinsiyet kordonları olarak adlandırılan düzensiz Ģekilli kordonları oluģtururlar. Erkek ve diģi embriyolarda bu kordonlar yüzey epiteline bağlıdır ve bu evrede erkek ya da diģi gonadlarının birbirinden ayırt edilmesi olanaksızdır. Bu nedenle bu evreye farklanmamıģ evre, bu gonada da farklanmamıģ gonad denir. 18 XX kromozomları ovaryumun geliģimi için genler içerir. 10.haftaya değin ovaryumlar histolojik olarak ayırt edilmezler. XX kromozomlarına sahip diģi embriyolarda, ilkel cinsiyet kordonları düzensiz hücre kümelerine ayrılır. Ġlkel üreme hücresi grupları içeren bu kümeler, daha çok ovaryum un medullar bölgesinde yerleģmiģlerdir. Bu hücre kümeleri bir süre sonra kaybolarak yerlerini damarlı stromaya (medulla) bırakırlar. 18,19 6

20 DiĢi gonadın yüzey epiteli, erkek gonadın aksine çoğalmayı sürdürür. 7. haftada yüzey epitelinden köken alan hücre kordonları alttaki mezenģim içine gömülür. Bunlar yüzeye yakın yerleģirler ve ikincil kordonlar olarak adlandırılırlar. 4. ayda, bu kordonlar bir ya da daha çok sayıda ilkel üreme hücresini çevreleyen izole hücre toplulukları haline gelirler. Bu üreme hücreleri zamanla oogonyumlara dönüģürken yüzey epitelinden aģağıya göç eden ve üreme hücrelerini çevreleyen epitel hücrelerinden de foliküler hücreler oluģur. 18,19 Germ hücreleri göçleri sırasında bir yandan da çoğalırlar. Bunlar spermiyum ve oositlerin öncülleridir. 6. haftanın sonunda mitoz bölünmeyle çoğalan hücrelerin sayıları kadardır. 20,21 Ovaryum farklılaģmasının ilk belirtileri 6 ile 8. haftalar arasında germ hücrelerinin hızla mitotik bölünmesidir. Bu bölünme sonucunda 16 ile 20. haftalar arasında yaklaģık 6-7 milyon oogonyum oluģur. Bu evreden baģlayarak ovaryum un üreme hücre sayısı geri dönüģümsüz azalır ve yaklaģık 50 yıl sonra da tüm oosit içeriği tükenir. 20 li yaģlarda , erken 30 lu yaģlarda düzeyine inen folikül ve oosit sayısı 40 lı yaģlarda 7900 e kadar düģer. 21 7

21 2.1.1.Oogenezis Ġlkel üreme hücreleri, diģi gonada ulaģır ulaģmaz genetik olarak oogonyumlara farklanırlar. Ardı ardına geçirdikleri mitotik bölünmelerle çoğalan oogonyumlar 3. ayın sonunda kümeler halinde dizilir, yassı epitel hücreleriyle çevrelenirler. Yassı epitel hücreleri follikül hücreleri olarak isimlendirilirler ve ovaryum yüzey epitelinden köken alırlar. Bir küme içindeki oogonyumların tümü, tek bir ilkel üreme hücresinden geliģir. 18 Oogonyumların çoğunluğu mitozla bölünmeyi sürdürürken, bir kısmı bölünmesini I. Mayoz bölünmenin profaz evresinde durdurarak primer oositlere farklanır. Bundan sonraki birkaç ay içinde oogonyumların sayısı hızla artar. GeliĢimin 5. ayında ovaryum içindeki germ hücrelerinin sayısı ortalama 7 milyona ulaģır. Bu evreden sonra hücre ölümü baģlar. Çok sayıda oogonyum ve primer oosit atretik hale gelir. 7. ayda yüzeye yakın yerleģmiģ birkaç oogonyum dıģında çoğu dejenere olur. Hayatta kalan primer oositlerin tümü I. Mayoz bölünmenin profaz evresine girerler ve her biri tek sıra yassı folikül hücre katmanıyla çevrelenirler. Primer oosit, çevresindeki yassı epitel hücreleriyle birlikte primordiyal follikül adını alır. 18,19 Doğuma yakın evrede primer oositlerin tümü I. Mayoz bölünmenin profazının diploten evresindedirler. Primer oositler puberteye değin dinlenme evresinde kalırlar ve birinci mayoz bölünmelerini tamamlamazlar. Bu süre boyunca oosit olgunlaģması folikül hücrelerince salgılanan oosit olgunlaģmasını baskılayan madde (OMI) ile baskılanır. Doğumda ovaryumlardaki primer oosit sayısı 700 bin ile 2 milyon arasında 8

22 değiģir. Puberteye değin bunların büyük çoğunluğu atretik hale geldiğinden, puberte baģlangıcındaki bu sayı e düģer ve 500 den daha azı bir kadının üreme döngüsü içinde ovulasyonla atılır. Diğerleri çeģitli geliģim evrelerinde dejenere olup atretik hale gelir. Geç olgunlaģan oositlerin bazıları 40 yıl süresince I. Mayoz bölünmenin profaz evresinde bekler. 18,19,21 Puberteye gelindiğinde diģi gonad primordiyal foliküllerden beslenen bir folikül havuzuna sahip olmuģ durumdadır. Her ovaryal döngüde bu havuzdan seçilen 5 ile 15 arasında değiģen sayıda primordiyal folikül, primer (preantral), sekonder (antral) ve Graaf ( tersiyer, preovulatuvar) olarak adlandırılan 3 aģamadan geçerek olgunlaģmaya baģlar. Bunlar arasında en uzun olanı antral folikül evresidir. Preovulatuvar evre yaklaģık 37 saat sürer. I. Mayoz bölünmenin diploten evresinde dinlenme aģamasında olan primer oosit büyümeye baģlar. Bekleme evresinden çıkan bu folliküllere primer follikül denir ve bunlar iki tiptir: 1. Tek katmanlı primer folliküller: Bunların çevresinde tek sıralı kübik folliküler hücreler bulunur. 2. Çok katmanlı primer folliküller: Çok sıralı follikül hücre katmanıyla çevrilidirler. Folliküler hücreler, kendilerini ovaryum stromasından ayıran bir bazal lamina ile desteklenir. Primer follikül evresinde primer oosit zona pellusida denilen glikoprotein bir kılıf sentezlemeye baģlar. Zona pellusida folikül hücrelerini oositten ayırır. Folliküler hücrelerin ince sitoplazmik uzantıları zona 9

23 pellusidayı deler ve oositin mikrovilluslarıyla iliģki kurar. ĠliĢki bölgelerinde oluklu bağlantılar bulunur. 18,19,22 Bunu izleyen evrede follikül hücreleri sürekli olarak çoğalıp çok katmanlı follikül hücrelerini oluģtururlar. Zona pellusida kalınlaģır. Follikülü çevreleyen stromal hücreler, teka( kılıf) denilen hücresel bir kılıf oluģturulacak Ģekilde düzenlenirler. Teka katmanı daha sonra iki tabakaya farklanır: (1) Teka interna (iç kılıf) (2) Teka eksterna (dıģ kılıf). GeliĢmekte olan folikülün bazal laminasına komģu, iyi damarlanmıģ teka interna katmanı hücreleri steroit salgı oluģturur. Teka eksterna ise kapsül benzeri bir bağ dokusu katmanıdır ve ovaryum un stroması ile karıģır. Bu hale gelen follikül sekonder folliküldür. 22 Folliküler hücreler arasında, küçük hücreler arası boģluklar Call- Eksner cisimcikleri görülür. Bu aralıklar folliküler sıvı içerir ve daha sonra birleģerek, daha büyük bir boģluk olan follikül antrumunu yapar. Antrumun oluģmasıyla, foliküler hücreleri primer oosit çevresinde yeniden düzenlenirler. Oosit ile folikül duvarı arasında bulunan bir grup foliküler hücre kümesine kumulus ooforus denir. En büyük follikül, olgun folliküldür. Buna Graaf follikülü ya da preovulatuvar folikül denir mm çapındadır. Ovulasyondan hemen önce primer oosit, follikül içinde eksentrik bir konum alır. Primer oosit zona pellusidaya sıkıca yapıģmıģ ve korona radiata denilen tek sıralı kübik ya da prizmatik foliküler hücrelerle çevrilidir. 22 Ovulasyondan birkaç saat önce I. Mayoz bölünme tamamlanır. Bunun sonucunda sekonder oosit ve birinci kutup cismi olģur. Birinci kutup 10

24 cismi perivitellin aralık denilen zona pellusida ile oosit arasındaki aralığa atılır. I. Mayoz bölünmenin tamamlanmasından hemen sonra ve sekonder oositin çekirdeği dinlenme evresine geçmeden önce, DNA eģleģmesi olmaksızın hücre II. Mayoz bölünmeye girer. II. Mayoz bölünme ancak oosit II bir spermiyumla döllenirse tamamlanır. Döllenme olmazsa ovulasyondan 24 saat sonra oosit II dejenere olur. Ovaryumda oogonyumlardan oosit II oluģuncaya kadar gerçekleģen değiģimlere oogenezis denir. 18,19,22 11

25 2.2.OVARYUM ANATOMİSİ Ovariumlar; oval biçimde bademe benzer bir çift organdır. Erkekte testisin eģidir. Her biri 5-6 gr ağırlığa, cm boya, yaklaģık 1 cm ene sahiptir. Sağda ve solda, pelvis duvarında fossa ovarica denilen çukurlara yerleģiktirler. Bu çukurlar a.iliaca externa ve a.iliaca interna arasındadır. Bu çukuru alt- ön taraftan lig. latum uteri tabanı, yukarıda a. iliaca externa ve arkadan ureterler ile sınırlar. Çukurun dibinde ve peritonun altından a.-v. Obturatoriale n. Obturatorius geçer. Ġlk gebelikte ovariumlar uterus ile karın boģluğuna doğru çekilirler ve bir daha aynı yerlerine dönemezler. 23,24 Tuba uterina nın arka ve alt kısmında bulunan ovaryumlar lig. Latum uteri içinde bulunurlar. Pembemsi-gri renkli olan ovaryumların yüzü puberteye değin peritonla örtülü olup düz ve parlaktır. Puberteden sonra periton özelliğini yitirir ve matlaģır. Ovulasyon ve doğurmaya bağlı olarak üzeri pürtüklü bir görünüm alır. 23 Facies lateralis ve facies medialis olarak iki yüzü, extremitas tubaria ve extremitas uuterina olarak iki ucu ile margo liber ve margo mesovaricus olmak üzere iki kenarı vardır. 23 V. iliaca externa ya komģu olan extremitas tubaria ya fimbria ovarica ve lig. Ovarii suspensorium tutunur. Lig. Suspensorium ovarii, iliak damarların ön tarafında yukarı doğru uzanan bir periton plikası olup içinde a. 12

26 ve v. ovarica bulunur. Extremitas uterina aģağı pelvis döģemesine doğru yönelmiģtir. Bu uç lig. ovarii proprium aracılığı ile uterus un cornu uteri sine tutunur. 23 Facies lateralis, fossa ovarica yı örten parietal peritona oturur. Facies medialis dıģ yüze oranla daha konvekstir. Bu yüzü infindibulum tubae uterinae örter. Arka kenarına serbest olması nedeniyle margo liber denilir. Ön kenara oranla daha konveks ve künt olan bu kenar, ureter ile komģuluk yapar. Ön kenarına mesovarium tutunması nedeni ile margo mesovaricus denilir. Arka kenara oranla daha ince olan ön kenarda hilum ovarii bulunur ve a. umbricalis in artığı ile komģudur. Bu kenara lig.latum uteri nin bir bölümü olan mesovarium tutunur. Mesovarium un iki yaprağı arasında bulunan damar ve sinirler, hilum ovarii den ovarium a girer ve çıkarlar. Tuba uterina önce margo mesovaricus üzerinden kavisle geçer. Daha sonra extremitas tubaria nın üzerinden kıvrılarak margo liber e ve buradan da facies medialis e gelir Ovarium un yapısı Ovarium en dıģtan periton ile örtülüdür. Periton tek sıralı yassı epitel yapısında, düz ve parlaktır. Puberteden sonra ovarium un peritonu yapısını değiģtirir ve germinal epitel (Waldeyer tabakası) denilen tek sıralı prizmatik hücre katmanı ile kaplanır. Bu nedenle de mat-gri renge döner. Epitel katmanının altında tunika albuginea denilen kalın bir tabaka bulunur. Bu tabaka yaģ ilerledikçe kalınlaģır. Tunika albuginea nın altında ovarium un esas yapısını oluģturan stroma ovarii bulunur. Stroma ovarii de, cortex ovarii ve medulla ovarii denilen iki farklı bölümden oluģur. Cortex ovarii dıģ tarafta 13

27 bulunur ve hilum ovarii dıģında ovarium un her tarafını bir kabuk gibi sarar. Bu bölümde bağ dokusu arasında değiģik geliģme evrelerinde ovarium follikülleri bulunur. Medulla ovarii iç tarafta yerleģiktir ve cortex ovarii ye oranla daha gevģek bir yapıya sahiptir. Medulla ovari den gelen bağ dokusu uzantıları hilum ovarii de damarların etrafındaki bağ dokusu ile devam eder. Hilum ovarii den içeri giren damarların çoğu cortex ovarii de dağılır. Burada geliģen folliküller çevresinde kapiller ağlar oluģtururlar Ovarium Arterleri : Abdominal aorta dan çıkan a. ovarica lardır. A. ovarica lig. suspensorium ovarii içinde pelvise iner. Hilum ovarii den ovarium a girer ve folliküller çevresinde kılcal ağlar oluģturur Ovarium Venleri: Arterleri izleyerek hilum ovarii den çıkar. Bu venler plexus pampiniformis denilen venöz ağı oluģtururlar. Bu ağı oluģturan venler yukarı çıktıkça birbirleriyle birleģirler ve sonunda v. ovarica yı oluģtururlar. V. ovarica, a.ovarica ile birlikte seyreder. Sol tarafı v. renalis e, sağ tarafı ise v.cava inferior a açılır. 14

28 2.2.4.Lenf drenajı: Kan damarları ile birlikte uzanır ve nodi lymphatici preaortici ve nodi lymphatici aortici lateralis lere açılırlar Ovarium Sinirleri: Plexus hypogastricus inferior (plexus pelvicus) ve a.ovarica nın çevresindeki plexus ovaricus dan gelir. Parasempatikleri n. Vagus tan, sempatikleri ise n. splanchnicus minor ve bir kısım torakal medulla spinalis segmentlerinden gelir. Bunların ovarium içindeki dağılıģı ve görevleri tam olarak bilinmemektedir

29 2.3.OVARYUM HİSTOLOJİSİ Ovaryum tek katlı yassı epitelden alçak boylu kübik epitele değin değiģkenlik gösteren bir epitel ve epitelin hemen altındaki tunika albugina denilen bir bağ dokusu katmanıyla çevrelenmiģtir. Enine kesitlerde dıģta korteks (kabuk), içte medulla (öz) birbirinden kesin bir çizgiyle ayrılmaz. Korteks katmanı oldukça kalındır. Bağ dokusu ve çeģitli geliģim evrelerinde follikülleri içerir. 22 Medulla kollajen demetlerden ve elastik lif ağlarından zengin sıkı bağ dokusudur. Medullada kan ve lenf damarları, kalın sinir demetleri ve hilus yakınında birkaç düz kas hücresi izlenir. 24 Korteks stroma ve stromada yerleģik çeģitli geliģim evrelerindeki ovaryum folliküllerinden oluģur. Stroma kollajen ve elastik lifler ile retiküler lif ağları ve iğ biçimli bağ dokusu hücrelerinden yapılmıģtır. Korteksin bu intersitisyal bağ dokusu, germinal epitel altında sıklaģarak tunika albuginea yı oluģturur. 24 Kortekste stroma içinde çeģitli geliģim evrelerinde folliküller yerleģmiģtir. Ovaryum follikülleri ortada iri bir germ hücresi (oosit) ile bunu çevreleyen follikül epitelinden oluģan yapılardır

30 2.3.1.Ovaryum follikülleri: Yenidoğan bir çocuğun her iki ovaryumunda toplam adet follikül bulunur. Bunlar 40 mikron çapında yuvarlak oluģumlardır ve iri bir oosit ile bunu çevreleyen yassı follikül epitelinden oluģmuģtur. Bunlara primordiyal folliküller denir. Her 28 günde bir ovaryumlardan bir oosit atılır. Bir kadının üreme süreci yıl sürer. Bu süre içerisinde yaklaģık 450 oosit atılır Primordiyal Follikül Folliküllerin geliģiminde ilk fiziksel belirtiler oositin büyümesi ve granüloza hücrelerinin görünümündeki değiģikliklerdir. Primordiyal folliküller fötal yaģam sırasında oluģan tek sıralı yassı follikül hücreleriyle çevrili primer oositleri içerir. Primer oositler organellerden zengindirler. Çok sayıda mitokondriyon, geliģmiģ Golgi kompleksi, granüllü endoplazmik retikulum ve birkaç ribozom içerirler. Primordiyal folliküller korteksin en üst katmanında yer alırlar. Sayıları artmaz ancak büyüyüp geliģirler ve çoğu da dejenere olur. 25,26,27 17

31 Primer Follikül Pubertenin baģlamasıyla, her menstrual döngüde 5-15 arası primordiyal follikül olgunlaģmaya baģlar. Büyümenin ilk iģareti yassı follikül epitel hücrelerinin kübikleģmesidir. Bu aģamada follikül tek tabakalı (unilaminar) primer follikül adını alır. Ġlerleyen aģamalarda follikül hücrelerinin çoğalmasıyla çok tabakalı (multilaminar) primer follikül oluģur. Çoğalan follikül hücreleri de granüloza hücreleri adını alır. Granüloza hücreleri ile oosit arasında oluklu bağlantılar (nekzus) oluģur. Bunlar besleyici maddelerin, iyonların ve düzenleyici moleküllerin geçiģine olanak sağlar. 24,25,26,27 Granüloza hücreleri çoğalırken çevredeki stroma hücreleri de follikülü bağ dokusundan oluģmuģ bir kılıfla sararak teka follikülü katmanını oluģturur. Teka katmanı geliģtikçe iki tabakaya ayrılır. içte teka interna denilen oldukça damarlı, kübik salgı hücrelerinden oluģan kat yer alır. Bu kübik hücreler farklılaģarak steroid hormon üreten hücrelere dönüģürler. LuteinleĢtirici hormon (LH) reseptörü taģıyan hücreler östrojen öncülü androjenleri salgılarlar. Teka interna katmanı fibroblastlar, kollajen lifler ve küçük damarlardan oluģur. DıĢta bulunan diğer kat teka eksternadır. Ġçerdiği kollajen demetler ve düz kaslarıyla daha çok bir kapsül görevi görür. Teka eksterna katmanı ile ovaryum un stroması arasındaki sınır tam olarak belirgin olmamasına karģın teka interna ile granüloza katmanı arasındaki sınır burada bulunan bazal lamina (membrana limitans eksterna) ile oldukça iyi belirlenmiģtir

32 Oosit, follikül geliģimi sırasında kendi çevresinde, glikozaminoglikan ve glikoproteinlerden zengin bir katman olan zona pellusidayı (ZP) oluģturur. ZP, homojen, asidofilik, PAS (+) ve oldukça iyi boyanan jel kıvamında bir yapıdır. Zona pellusida ZP1, ZP2 ve ZP3 denilen 3 farklı glikoproteinden oluģur Sekonder follikül Büyümeyi sürdüren follikül içinde sıvı dolu boģluklar (antrum) oluģur. Kısa sürede boģluklar birbirleriyle birleģerek yarım ay Ģeklinde follikül antrumunu Ģekillendirir. Folliküler boģluğu dolduran sıvı kan damarlarından plazmanın sızmasıyla oluģup yerel salgıların metabolik ürünleri ile değiģmiģ hale gelir. BoĢluk oluģtuktan sonra follikül sekonder (antral) follikül adını alır. 22,26,27 Sekonder follikülün granüloza hücrelerinin çoğalması hipofiz bezinin ön lobundaki bazofil hücrelerinden salınan FSH a bağlıdır. FSH ın etkisi altında granüloza hücrelerinin sayısı artar ve hücrelerarası boģluğa follikül sıvısı birikir. Bu sıvı glikozaminoglikan, proteoglikan ve hormon bağlayıcı proteinler içeren kan plazması benzeridir. Follikül sıvısı hormonlardan progesteron, östradiol, inhibin, follistatin ve FSH ile LH salınımını düzenleyen aktivin içerir. 26,27 19

33 Granüloza katmanı oositi çevreleyen bölge dıģında her yerde aynı kalınlıktadır. Antrumda kenarda yerleģik oosit çevresinde ise granüloza hücreleri daha yoğun bir Ģekilde birikerek bir tepecik oluģturur. Buraya kumulus ooforus denir. Buradaki granüloza hücreleri ovulasyon sonrasına değin oosit ile birleģik halde kalırlar. Zona pellusida çevresinde gevģek yerleģmiģ kübik ya da alçak boylu prizmatik granüloza hücreleri sitoplazmik uzantılarıyla oosit ile bağlantılarını sürdürür. Primer oositi çevreleyen bu tek katlı granüloza hücre katmanına korona radiata denir. Oosit sitoplazmasında mitokondriyonlar çekirdek yakınında toplanırlar. Sitoplazmada protein ve lipit yapısında vitellus oluģmaya baģlar. Oosit mikron büyüklüğe ulaģır. 24,26, Tersiyer Follikül ( Graaf follikülü) Graaf follikülünde granüloza hücreleri çoğalır, antrum geniģler. Follikül boģluğu follikül sıvısı ile dolar. Oositi saran zona pellusida ya komģu ilk sıra granuloza hücreleri tek katlı kübik ya da prizmatiktir. Bunun dıģındakiler poligonal biçimlidir. Graaf follikülünü en dıģtan saran bazal membran kalın, homojen ve saydamdır. Buna camsı zar denir. Tersiyer follikül döngünün baģlangıcından baģlayarak günde oluģur. 24,26,27 20

34 Atretik Follikül Çok sayıda primer follikül olgunlaģma sürecine baģlasada bunlardan yalnızca bir tanesi geliģimini tamamlar, diğerleri atrezi denilen bir olayla dejenere olur. Bu nedenle ovaryum folliküllerinin büyük bölümü follikül hücreleri ve oositin ölümüyle geriler ve fagositoz yapan hücrelerce ortadan kaldırılır. Folliküller geliģimlerinin herhangi bir evresinde atreziye uğrayabilir. Atretik folliküller çok değiģikliğe uğramamıģ zona pellusida, dejenere olmuģ oosit ve follikül hücre kalıntıları ve makrofajlar ile ayırt edilir. Atretik folliküller doğum öncesinden baģlayarak menapozun birkaç yıl sonrasına kadar oluģurlar Ovulasyon Ovulasyondan yaklaģık 24 saat önce adenohipofizden LH salınımı tetiklenir. Kandaki LH hormonu düzeyinde oluģan aģırı yükselme sonucu granüloza hücrelerindeki LH reseptörleri duyarlılığını yitirir ve LH a yanıt olarak daha fazla östrojen üretemezler. Oositin I. Mayoz bölünmesi bu tetiklenme ile durakladığı yerden devam etmeye baģlar. LH yükselmesinden saat kadar sonra gerçekleģen bu olay, oositin mayoz I i tamamlayarak ilk kutup cisimciğini oluģturmasını ve aynı zamanda II. Mayoz bölünmenin baģlamasını sağlar. Ancak oosit ovulasyondan yaklaģık 3 saat öncesine değin metafaz evresinde duraklar. Bu sırada ovaryum un yüzeyinde bir kabarıklık oluģur. Bu kabarıklığın tam tepesinde stigma adı verilen damarsız bir nokta belirir. Yüksek LH düzeyi kollajenaz aktivitesini arttırır ve follikülün çevresindeki kollajen lifleri sindirir. LH düzeyindeki ani artıģın diğer bir etkisi 21

35 de prostaglandin miktarını arttırmasıdır. Prostaglandin ovaryum duvarında yerel kas kasılmalarına neden olur. Bu kasılmalarla olgun follikül (Graaf follikülü) yırtılarak içerdiği oositi tuba uterinanın fimbriyaları yakınında periton boģluğuna atar. Fimbriyaların hareketi ile oosit tuba uterina içine alınır. 22,24,27,28 Ovulasyon puberteden menapoza değin 28 günde bir olaylanır. Ovulasyon iki menstrual kanama arasındaki döngünün tam ortasında olur. Ovulasyon döngünün ortalama 14. gününde gerçekleģir. Ovulasyonda genelde bir oosit atılır. Bazen aynı anda birkaç oosit atılabilir. Bu da ikiz ya da çoklu gebeliklere neden olur Korpus Luteum Ovulasyondan sonra granüloza ve teka interna hücreleri bölünmeden büyüyerek hormon salgılayan lutein hücrelerine dönüģürler. Böylece geçici bir endokrin bez olan korpus luteum (sarı cisim) oluģur. Korpus luteum progesteron ve östrojen hormonları salgılar. Graaf follikülünde ovulasyon sonrası bir iç basınç düģmesi olur ve teka katmanındaki kan damarlarından kan sızması ile kısa bir süre için follikül içine kan toplanır. Buna kırmızı cisim ( korpus rubrum, korpus hemorajikum) denir. 24 Döllenme olmadığında, ovulasyonu izleyen 9. günde korpus luteum en fazla eriģebileceği boyuta ulaģır ve ovaryum un yüzeyinde sarımtrak bir çıkıntı halinde izlenir. Daha sonra luteal hücrelerin 22

36 dejenerasyonuyla giderek küçülür ve korpus albikans olarak bilinen fibrotik skar dokusu haline gelir. Bu sırada progesteron üretimi de azaldığından menstrual kanama baģlar. Oositin döllenmesi durumunda korpus luteumun dejenere olması geliģmekte olan embriyonun sinsityotrofoblastları tarafından salgılanan koriyonik gonodotropin ( hcg) hormonu tarafından engellenir. Böylece korpus luteum büyümesini sürdürür ve gebelik korpus luteumu na dönüģür. Bu yapı 3. ayın sonunda ovaryum un 1/ 3 ile 1/2 si kadar bir büyüklüğe ulaģır. Sarımtrak renkteki luteal hücreler dördüncü ayın sonuna değin progesteron salgılamayı sürdürür. Bundan sonra plasentanın trofoblastik bileģeni tarafından salgılanan progesteron hormonunun miktarı gebeliğin sürdürülmesine yetecek düzeye geldiğinden yavaģ yavaģ dejenere olur. 4. aydan önce gebelik korpus luteum unun dejenerasyonu genelde düģükle sonuçlanır

37 2.4.OVARYUM FİZYOLOJİSİ Bunlar: Kadın hormonal sistemi, üç ayrı hormon grubundan oluģur. 1) Daha önceleri luteinizan serbestleģtirici hormon olarak da isimlendirilen, bir hipotalamik serbestleģtirici hormon, Gonodotropin SerbestleĢtirici Hormon (GnRH) 2) Ön hipofiz hormonlarından Follikül-Uyaran Hormon (FSH) ve Luteinize edici Hormon (LH). Bu hormonların her ikisi de Hipotalamusta sentezlenen GnRH serbestleģtirici hormona yanıt olarak salgılanırlar. 3) Ovaryum hormonları; östrojen ve progestron. Bu hormonlar ön hipofiz bezinden salgılanan iki hormona (FSH, LH) yanıt olarak ovaryum tarafından salgılanırlar. Kadında menstrual döngü sürecinde, bu hormonların salgılanma miktarları değiģiklik gösterir. Döngünün farklı evrelerinde son derece farklı hızlarda salgılanırlar. Hipotalamustan GnRH salgısı artıģ ve azalıģ Ģeklinde büyük değiģiklikler gösterirken, bu artıģ ve azalıģlar aylık döngü sürecinde daha az ya da çok küçük düzeylerde bulunmaktadır. Hormonların ortalama her 1-3 saatlik kısa devrelerde salgılandığı bilinmektedir. 29,30 Menstrual döngü sürecinde ovaryumdaki değiģikliklerin tümü hipofiz bezi ön lobundan salgılanan gonadotropik hormonlar; FSH ve LH a bağlıdır. Gonadotropik hormonlarla uyarılmayan ovaryumlar inaktiftir. FSH ve 24

38 LH molekül ağırlıkları yaklaģık olan küçük glikoprotein yapıda hormonlardır. 30 FSH ve LH, ovaryumlardaki hedef hücrelerini, hücre zarlarında bulunan son derece özgül reseptörlere bağlanarak uyarırlar. Aktive olan reseptörler bu hücrelerin salgılama, büyüme ve çoğalma hızını artırırlar. Bu uyarıcı etkilerin hemen tümü hücre sitoplazmasındaki ikincil haberci siklik AMP( camp) sisteminin aktivasyonu sonucu gerçekleģir. camp protein kinaz oluģumunu sağlar daha sonra da çeģitli fosforilasyonlarda anahtar enzim görevi yaparak pek çok hücre içi fonksiyonu hızlandırır. 30 Ovulasyon öncesinde, folliküllerden birisi daha fazla büyümeye baģlar. Bu follikülde bol miktarda östrojen salgılanır ve östrojen follikül üzerinde pozitif geribildirim etkisi yapar. FSH, granüloza ve teka hücrelerinin çoğalmasını artırır. Bunun sonucunda daha fazla östrojen salgılanır ve yeniden hücresel proliferasyon döngüsüne girilir. FSH ve östrojenlerin birleģimi granüloza hücrelerinde FSH ve LH reseptör sayısının artmasına neden olur. Ayrıca teka hücrelerinde daha az bir pozitif geribildirim etkisi yaratır. Bu etkiler birlikte, folliküler sıvı ve hormon salgılanmasının hızla yükselmesine neden olur. Bunun yanında, follikülden salgılanan büyük miktarlardaki östrojen hipofiz bezi ön lobundan daha fazla FSH salgılanmasını baskılamak için hipotalamusu etkiler. Bu yolla kendi pozitif geribildirim uyarısıyla geride kalan az geliģmiģ folliküllerin daha da geliģmesini engellediği düģünülmektedir. Bu nedenle en büyük follikül pozitif geribildirim etkiyle büyümesini sürdürürken, diğer folliküller büyümeyi durdurur ve geriler. 29,30 25

39 LH follikül büyümesinin son evresinde ve ovulasyon anında gerekli bir hormondur. Bu hormon olmadığında çok fazla miktarlarda FSH olsa bile, follikül ovulasyon evresine kadar geliģemez. Ovulasyondan yaklaģık 2 gün önce hipofiz ön lobunun LH salgı hızı belirgin bir Ģekilde yükselir. Bu artıģ ovulasyondan yaklaģık 16 saat önce 6 ile 10 katı kadardır. FSH da aynı süreç içinde 2-3 kat artar. Böylece iki hormon aynı anda, birlikte etki ederek ovulasyon öncesi son birkaç gün içinde, follikülün hızla büyümesini sağlar. LH ayrıca granüloza ve teka hücreleri üzerine de etki ederek bu hücreleri daha çok progesteron ve daha az östrojen salgılayan hücrelere dönüģtürür. Bu nedenle ovulasyondan yaklaģık bir gün önce östrojen salgısı azalırken bir miktar progesteron salgılanmaya baģlar. 29,30 Ovulasyonu baģlatan neden hipofiz bezi ön lobundan aģırı miktarda LH salgılanmasıdır. LH öncelikle az miktarda progesteron içeren follikülden folliküler steroid hormonların hızla salgılanmasına neden olur. Birkaç saat içinde ovulasyon için gerekli iki önemli olay geliģir: 1- Teka hücrelerinin lizozomlarından proteolitik enzimler salgılanmaya baģlar. Bu enzimler kapsül duvarının çözülmesine ve duvarın zayıflamasına neden olur. Böylece tüm follikül daha fazla ĢiĢer ve stigma dejenere olur. 2- Aynı anda follikül duvarında hızla yeni kan damarları oluģurken folliküler dokuda prostaglandinler (vazodilatasyon oluģturan yerel hormonlar) salgılanır. Bu iki etki follikülün ĢiĢmesinde katkısı bulunan plazma sızıntısına yol açar. Sonunda follikülün ĢiĢmesi ve eģ zamanlı olarak stigmanın dejenerasyonu follikülün yırtılmasına ve oositin dıģarı atılmasına neden olur. 29,30 Oositin follikülden atılmasını izleyen ilk birkaç saat içinde geride kalan granüloza ve teka interna hücreleri hızla lutein hücrelerine dönüģür. 26

40 Hücrelerin çapları iki katı ya da daha fazla artar, içlerine dolan lipid inklüzyonları nedeniyle sarımsı bir renk alır. Bu sürece luteinizasyon, oluģan hücre kütlesine de korpus luteum adı verilir. 29,30 Korpus luteum granüloza hücrelerinin sitoplazmaları granülsüz endoplazmik retikulumdan zengindir. Bunlar çok miktarda progesteron ve östrojen oluģtururlar. Teka hücreleri ise kadın seks hormonlarından çok, androstenedion ve testesteron gibi belirli androjenleri sentezlerler. Ancak, bunların çoğunluğu granüloza hücrelerinde kadın hormonlarına dönüģtürülür. 30 Granüloza ve teka interna hücrelerinin lutein hücrelerine dönüģümü baģlıca hipofiz bezi ön lobundan salgılanan LH a bağımlıdır. LH a sarımsı renk verme özelliği nedeniyle luteinleģtirici adı verilmiģtir. Granüloza hücrelerinin luteinizasyonu aynı zamanda oositin follikülden atılmasına da bağımlıdır. Luteinizasyon olayını ovulasyona kadar denetleyen bir diğer etken, follikül sıvısında bulunan luteinizasyonu baskılayıcı faktördür. Bu nedenle ovulasyon olaylanıncaya değin follikül içinde korpus luteum geliģmez. 30 Özellikle ovulasyon evresinde salgılanan LH öncelikle granüloza ve teka hücrelerinde luteinizasyona neden olur. Yeni oluģan lutein hücreleri sırasıyla çoğalma, geniģleme, salgı ve dejenerasyona karģın programlanır. Hipofiz bezi ön lobundan LH salgılanmasa bile bu süreç devam eder. Olay ancak 4 ile 8 gün sonra sonlanır. Diğer yandan LH varlığında korpus luteumun büyümesi artar, salgılanması çoğalır. LH ile hemen hemen aynı 27

41 özelliklere sahip bir diğer hormon koryonik gonadotropindir. Plasentadan salgılanan bu hormon korpus luteum a etki ederek yaģamını uzatır ve genellikle gebeliğin 2-4 aylık süresinde devamını sağlar. 30 Menstrual döngünün luteal evresinde korpus luteumdan salınan özellikle östrojen ve daha az miktarda progesteron hipofiz bezi ön lobu üzerinde önemli geribildirim etki yaratarak, FSH ve LH nun dozda salgılanmasını sürdürür. Ayrıca luteal hücreler az miktarlarda da olsa inhibin hormonu salgılarlar. Bu hormon hipofiz bezi ön lobundan özellikle FSH salgısını baskılar. FSH ve LH nun kanda düģük düzeylere inmesi ve bu hormonların kaybolması halinde korpus luteum tamamen dejenere olur. Bu olaya korpus luteum un involusyonu denir. Korpus luteum dan östrojen, progesteron ve inhibin salgılanmadığı anda hipofiz bezi ön lobu üzerindeki baskılayıcı geribildirim etkisi ortadan kalkar ve bez yine bir miktar FSH ve birkaç gün sonra da yavaģ artıģlarla LH salgılamaya baģlar. FSH ve LH yeni bir menstrual döngüde yeni folliküllerin büyümesini baģlatır. Ancak bu folliküller yeterince geliģme göstermezler. Östrojen ve progesteron yokluğu uterusta menstrüasyona yol açar Ovaryum Hormonlarının İşlevleri Progesteron Östradiol ve Ovaryum un seks hormonları, östrojenler ve progestinler olarak iki tiptir. Östrojenlerin en önemlisi östradiyol hormonu, progestinlerin en önemlisi de progesteron dur. Östrojenler baģlıca vücutta sekonder kadın seks özelliklerini veren özgül hücrelerin çoğalma ve büyümesini sağlarlar. Diğer 28

42 yandan progestinlerin tümü uterus un gebeliğe, meme bezlerinin de laktasyona son hazırlıklarını yürütür Östrojenler Gebe olmayan normal bir kadında östrojenler yüksek miktarlarda yalnız ovaryum lardan, az miktarlarda da böbreküstü bezi korteksinden salgılanırlar. Gebelikte ise çok fazla miktarlarda plasentadan salınırlar. 29,30 Kadınlarda plazmada üç tip östrojen görülür: β-östradiyol, östron ve östriyol. Ovaryumlardan serbestleģen en önemli östrojen β-östradiyol dür. Bu organların östron salgısı çok az miktardadır. Östron çoğunlukla, böbreküstü bezi korteksi ve ovaryum teka hücrelerinden salgılanan androjenlerin periferik dokulardaki dönüģümünden kaynaklanır. Östriyol zayıf bir östrojendir ve özellikle karaciğerde östradiyol ve östron un oksidasyon ürünü olarak ortaya çıkar. 29,30 β-östradiyol ün östrojenik erki östron a karģın 12 kat, östriyol e ise 80 kat daha fazladır. Bu nedenle Β-östradiyol ün en önemli östojen olduğu, buna karģın östron un östrojenik etkisinin ihmal edilebilir düzeyde olduğu söylenebilir

43 Karaciğer, östrojenleri glukuronid ve sülfatlar halinde bağlar. Bağlı ürünlerin beģte biri safra ile geri kalanının çoğu idrar ile atılır. Bunun yanında, karaciğer kuvvetli östrojenler, östradiyol ve östronu tümüyle etkisiz östrojen olan östriyol e dönüģtürür. Bu nedenle, karaciğer fonksiyonlarının zayıflamasında, vücutta östrojen erkinin artarak hiperöstrinizm e yol açar Östrojenler in ĠĢlevleri Östrojenler çocuklukta çok az miktarda salgılanırlar. Pubertede ise salgılanan miktar hipofiz gonadotropik hormonların etkisi altında 20 kat ya da daha yüksek oranda artıģ gösterir. Bu sırada ovaryumlar, tuba uterina, uterus ve vajinanın boyutları artar. 30 Östrojenlerin buna ek olarak, vajina epitelini kübik Ģekilden, çok katlı epitele dönüģtürerek, puberte öncesine karģın travma ve enfeksiyonlara karģı daha dirençli hale getirir. 30 Puberte sonrası birkaç yıl içinde uterus un boyutları iki ya da üç kat artıģ gösterir. Daha da önemlisi östrojenlerin etkisiyle endometriyumda olaylanan değiģimlerdir. Östrojenler endometriyal stromada belirgin proliferasyona ve endometriyal bezlerde büyük geliģime yol açarak, daha sonraki günlerde implante olacak blastosistin beslenmesine yardımcı olurlar

44 Östrojenler, tuba uterinalardaki mukoza katmanlarına da uterus endometriyumuna benzer etkiler yaparlar. Tuba uterinada silyalı epitel hücrelerinin sayısında artıģ sağlarlar. Ayrıca döllenmiģ oositin uterus a doğru hareketini kolaylaģtırırlar. 29,30 Östrojenler, memede stromal dokuyu geliģtirir, kanal sistemlerinin geliģmesini ve memede yağ birikmesini sağlarlar. Meme bezlerinde lobul ve alveollerin geliģimi tek baģına östrojen etkisi altında yetersiz düzeydedir. Bu yapıların geliģimini tamamlaması ve iģlevsel özelliklerini kazanması için progesteron ve prolaktinin desteği gereklidir. 29,30 Östrojenler osteoblastik erkin artmasına neden olurlar. Pubertede kadınların üreme çağına girmesiyle birlikte birkaç yıl büyüme çok hızlıdır. Bunun yanında, östrojenlerin iskelet büyümesi üzerinde bir diğer etkisi, uzun kemiklerin cismi ile epifizlerin erken birleģmesine yol açmasıdır. Sonuç olarak kadında büyüme olayı genelde erkeğin büyümesinden daha erken yıllarda kesilir. Östrojenden yoksun, önükoid kadınlarda epifizler erken kapanmadığından, boyları normal eriģkin kadınlardan daha uzun olur. 30 Östrojenler toplam vücut proteinini hafifçe artırırlar. Östrojen uygulamasından sonra azot dengesinin pozitif tarafa kayması da bunun kanıtıdır. Östrojenin seksüel organlar, kemikler ve vücudun daha birçok dokusunda büyümeyi hızlandırıcı etkisi de bunu göstermektedir. 29,30 31

45 Östrojenler metabolik hızı hafif de olsa artırırlar. Ancak bu artıģ erkek seks hormonu testesteronun etkisine karģın 1/3 oranda daha düģüktür. Bunun yanında hormonun deri altı yağ oranını artırıcı etkisi de vardır. Östrojenler yağın göğüs ve deri altından baģka kalçalarda birikmesine yol açar ki, bu da kadın vücuduna özgü görünümünü kazandırır. 29,30 Östrojen hormonlarının kimyasal yapılarının adrenokortikal ve suyun geri emilimine neden olduğu belirtilmektedir. 30 Östrojenler salgılandıktan sonra, hedef hücrelere ulaģmadan önce birkaç dakikalık süre için dolaģımda kalırlar. Hücrelere girdikten sonra saniye içinde sitoplazmada bir reseptör proteini ile birleģirler ve çekirdeğe geçerler. Bu da kromozomal DNA nın özgül bölümüyle etkileģerek transkripsiyon iģlemini baģlatır. Böylece birkaç dakika içinde RNA üretimi baģlar. Birkaç saat sonra yeni DNA oluģabilir ve hücre bölünmesine gidilir Progestinler Progestinler içinde en önemli hormon progesteron dur. Az miktarlarda bulunan bir diğer progestin 17-α-hidroksiprogesteron dur. Bu hormon progesteronla birlikte salgılanır ve aslında onunla aynı etkiye sahiptir. Bu nedenle progesteron tek önemli progestin olarak kabul edilmemektedir

46 Gebe olmayan bir kadında progesteron ovaryum döngüsünün yalnızca ikinci yarısında, korpus luteum dan salgılanır. Döngünün ilk yarısında plazmada bulunan az miktardaki progesteron ise eģit olarak ovaryumlar ve adrenal korteks den salgılanır. Ancak gebelik sırasında, özellikle gebeliğin 4.ayından sonra plasentadan büyük miktarlarda progesteron serbestleģir. 30 Progesteron hormonu salgılandıktan birkaç dakika sonra tümüyle progesteron etkisi olmayan diğer steroidlere yıkılır. Hormonun değiģimi özellikle östrojenler için geçerlidir. Karaciğerin bu metabolik yıkımda özel bir yeri vardır. Progesteronun en önemli yıkım ürünü pregnandiyol dür. Özgün progesteronun yaklaģık %10 u idrarla, bu Ģekliyle atılır. 29, Progesteronların ĠĢlevleri Progesteronun en önemli iģlevi, kadın menstrual döngüsünün ikinci yarısında uterus endometriyumunda salgılama ile ilgili değiģimleri baģlatarak uterus u blastosistin implantasyonuna hazırlamaktır. Uterus kasılmalarının Ģiddetini azaltarak implante blastosistin atılmasını engeller. 29,30 Progesteron alveol hücrelerinin proliferasyonuyla memelerdeki lobül ve alveollerin geliģimini hızlandırır. Böylece göğüsler büyüyerek salgılayıcı bir yapı kazanırlar. Progesteron alveollerin süt salgısını sağlayamaz. Süt ileri dönemlerde memeler hazırlandıktan sonra hipofiz bezi ön lobundan salgılanan prolaktin hormonunun uyarısıyla salgılanabilir. 29,30 33

47 Büyük miktarlardaki progesteron hormonu böbrek distal tubuluslarından sodyum, klor ve suyun geri emilimini artırabilir. Tübül epitel hücrelerinden sodyum iyonlarının taģınmasını sağlayan progesteron ve aldosteron aynı reseptör proteinlerine bağlanırlar. Progesteron protein moleküllerine bağlandığında aldosteron bağlanamaz. Progesteron aldosteronun etkisine karģın çok daha düģük düzeyde sodyum taģınımına yol açar. Bu nedenle, progesteron böbrek tübüllerinden sodyum ve suyun geri emilimini ancak düģük düzeyde etkileyebilir. Hormonun etkisi daha çok aldosteronun etkisini baskılamaktadır. Bu Ģekilde vücutta belirgin bir su ve sodyum kaybı oluģur Hipotalamus tan Salgılanan GnRH ve Bu Hormonun FSH ve LH Salgılanmasına Etkileri Ön hipofiz hormonlarının çoğunluğu, hipotalamusdan salgılanan serbestleģtirici hormonlar tarafından denetlenir. Bu hormonlar hipofiz bezi ön lobuna hipotalamik-hipofizier portal sistem yoluyla taģınırlar. Gonodotropinlerin uyarılmasında bir serbestleģtirici hormon olan GnRH çok önemlidir. 30 Deneysel araģtırmalara karģın, hipotalamus un GnRH salgısı sürekli değildir. Salgılama her 1-3 saatte bir gerçekleģir ve birkaç dakika süreyle devam eder

48 GnRH sürekli uygulandığında ön hipofiz bezinin FSH ve LH salgısı kaybolur. Buna bağlı olarak GnRH aralıklı salgılanmasındaki özellik bilinmeyen nedenlerle hormonun iģlevsel olması açısından önemlidir. GnRH nın aralıklı salgısı, aynı Ģekilde aralıklı LH atılımına neden olur. 30 GnRH nın hipotalamusdan aralıklı salgılanması aynı Ģekilde FSH salgısının azalmasına ya da artmasına neden olur. Buradaki önemli nokta, GnRH nın FSH üzerine etkisinin uzun süreli olmasıdır

49 2.5.İNFERTİLİTE VE OVULASYON İNDÜKSİYONU İnfertilite Herhangi bir doğum kontrol yöntemi uygulamadan, haftada en az iki kez düzenli bir cinsel yaģama rağmen, bir yıl süreyle gebelik oluģmamasına infertilite denir. Ġnfertilite sorununun üreme çağındaki çiftlerin yaklaģık %10-15 ini etkileyen bir faktör olduğu bilinmektedir. Ġnfertilite primer ve sekonder olarak iki Ģekilde değerlendirilir. Daha önce gebelik oluģmamasına primer infertilite, ancak daha önce gebelik oluģmasına karģın bir baģka gebeliğin oluģmamasına sekonder infertilite adı verilir. Kadın yaģamının menapoz, puberte, gebelik gibi evrelerinde gebelik oluģması zordur ya da olası değildir, buna da fizyolojik infertilite adı verilir. 31,32 Ġnfertilitenin en sık görülen nedenleri; ovulatuvar bozukluk (%15), tubal ve peritoneal patoloji (%30-40) ve erkek faktörleridir (%30-40). Geri kalanı ise nedeni açıklanamamıģ infertilitedir. Her bir olgunun sıklığı yaģla değiģmektedir. Genç kadınlarda ovulasyon bozuklukları daha sık görülürken, tubal ve peritoneal faktörler genç ve yaģlılarda eģit sıklıktadır. Erkek faktörleri ve nedeni açıklanamayan infertilite ise ileri yaģlardaki çiftlerde daha sık görülmektedir. 33 Döllenmenin oluģması için oosite ulaģabilecek ve oositi dölleyebilecek normal, hareketli ve yeterli sayıda spermiyum olması, eģ zamanlı uygun oosit salınımı, spermin oosite ulaģabilmesi ve zigot ya da 36

50 embriyonun uterus a ulaģabilmesi için serbest bir pasajın olması ve implantasyona izin verecek olgun bir endometriyumun bulunması gerekmektedir. Bu evrelerdeki herhangi bir defekt gebelik oluģumunu engelleyecektir. 6 Kadınlardaki en önemli infertilite nedeni yaklaģık olarak %40 oranında ovulasyon yetersizliğidir. Ovulasyon yetersizliği anovulasyon veya ciddi oligoovulasyon Ģeklinde olabilir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ovulatuvar bozuklukları üç ana gruba ayırmıģtır: Grup I: Hipotalamik hipofizer yetmezlik DüĢük gonadotropin ve östrojen hormon düzeyleriyle seyreden hipogonadotropik hipogonadizmi, normal prolaktin yoğunlukları olan ve progesteron challenge testine yetersiz kanama ile yanıt veren hastalardır. Bu grup stres, kilo kaybı, egzersiz, hipotalamik amenore, strese bağlı amenore, anoreksia nevroza, Kallmann sendromu ve izole gonadotropin eksikliği olan hastalardır. Bu hastalarda hipogonadotropik hipogonadizm bulunmaktadır. FSH ve östrojen düzeyleri düģüktür, prolaktin normaldir. Grup II: Hipotalamik hipofizer disfonksiyon Normogonadotropik, normoöstrojenik, anovulatuar, oligomenoreik hastaları kapsamaktadır. Polikistik over sendromu (PKOS) bu gruba girmektedir. Bu gruptakiler tipik olarak normal FSH, östrojen ve prolaktin yoğunluğuna sahiptirler. 37

51 Grup III: Ovaryan yetmezlik Bu gruptaki hastalarda hipergonadotropik hipogonadizmle birlikte düģük östrojen düzeyleri vardır. Ovaryan yetmezlik ve ovaryan rezistansların tüm türleri bu gruba girmektedir. Yüksek FSH yoğunluğuna sahiptirler. 6, lı yılların baģlarına değin anovulasyon ve diğer infertilite tiplerinin etkili tedavisi tam olarak bilinmiyordu li yıllarda anovulasyon tedavisi için gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) ve prolaktin baskılayıcı ajanlar olarak iki seçenek öne sürülmüģtür. GnRH izole edilmiģ ve yapısı tanımlanmıģtır. Kısa bir süre sonra laboratuvarda doğal GnRH preparat sentezi ile klinik kullanım için daha uygun hale gelmiģtir. Hipofiz GnRH tedavisinin hipotalamik kökenli hipogonadotropik amenoreli kadınlarda ovulasyon indüksiyonu ve gebelik gerçekleģmesinde çok etkili olduğu kanıtlanmıģtır. 15,34,35,36,37,38, Ovulasyon İndüksiyonu Günümüzde ovulasyon indüksiyonunda amaç anovulatuar hastalarda ovulasyonu baģlatmaktır. Ovulasyon sağlanabildiği koģullarda ise esas amaç tek folliküllü ovulasyondur. Günümüzde 3 değiģik ovulasyon indüksiyonu uygulanmaktadır: 1) Yerine Koyma (Subtitution) Tedavisi: Gonadotropin eksikliği olan amenoreik kadınlara (WHO grup I) uygulanan tedavidir. 2) Düzenleme tedavisi: Oligoovulasyonu veya persiste anovulasyonu olan kadınlara uygulanan tedavidir. (PKOS gibi). 38

52 3) Denetimli Ovaryan Hiperstimülasyon (KOH): Bu yöntem ise çoklu infertilitesi (hafif endometriozis, geçici anovulasyon, hafif oligoastenospermi, tek taraflı tubal oklüzyon gibi nedenlerin kombinasyonu) olan ya da nedeni açıklanamayan infertilitesi bulunan hastalara uygulanmakta olan tedavidir ve herzaman intrauterin inseminasyon ve invitro fertilizasyon ile birlikte kullanılır Gonadotropinler İle Ovulasyon İndüksiyonu Ovulasyon indüksiyonu için kullanılan gonadotropinler 3 türdür. Bunlar; üriner, saf üriner ve rekombinant. YaklaĢık 30 yıl süresince tek gonadotropin tipi insan menapozal gonadotropin i olmuģtur (hmg, menotropin). Yeni hmg preparatları eskilerinden daha iyi saflaģtırılmıģtır ve cilt altı uygulanabilirler. 20 yıl önce anti-hcg antikorları ile yapılan immünoaffinite yöntemi sayesinde üriner LH uzaklaģtırılarak daha iyi saflaģtırılmıģ üriner FSH elde edilmiģtir. 40 FSH ve LH nın granuloza ve teka hücreleri üzerindeki etkileri çok iyi nitelendirilmiģtir ve folliküler geliģim için esansiyeldir. Etki mekanizması klomifen sitrat a karģın daha iyi bilinmektedir. Tedavinin baģarılı olabilmesi için ovaryumların iģlevsel olması gerekir, çünkü verilen HMG endojen gonadotropinlerin yerini alarak ovulasyon indüksiyonu yapmaktadır. Kendiliğinden olan döngülerde olduğu gibi FSH birincil olarak granüloza hücreleri ve LH teka lutein hücreleri üzerinde etki göstererek folikülogenezisi uyarırlar

53 Ġnsan menapozal gonadotropin i (HMG) üriner bir üründür ve postmenopozal kadınların idrarlarından elde edilmektedir. EĢit oranda FSH ve LH içermektedir. LH nın yüksek düzeyde olması ve bu nedenle fertilizasyon ve implantasyonun negatif olarak etkilenmesi FSH içeriği baskın olan yeni gonadotropin ürünlerinin (ufsh) geliģmesine yol açmıģtır. ufsh da üriner bir üründür ve idrar proteinleri ile kontaminedir. 41 Günümüzde gonadotropin preparatları artık IU dan az LH içermektedirler ve üriner protein içerikleri de cilt altı uygulanabilir. YaklaĢık 10 yıl önce genetik mühendisliği sayesinde in vitro rekombinant FSH ( rfsh) üretilmiģtir. rfsh insan FSH gen kodları ile transfekte edilmiģ hamster ovaryum hücrelerinden üretilmektedir. Rekombinant gonadotropinlerin avantajı daha az üriner protein içermeleri, daha tutarlı bir yapılarının olması ve biyolojik erklerinin kiģiden kiģiye çok daha az değiģiklik göstermesidir. 40,42,43 Ġnsan koryonik gonadotropin (hcg) ise, karbonhidrat yan zincirli glikoprotein yapılı bir hormondur. LH, FSH ve TSH nın heterodimerik yapısı ile benzerlik gösterir. Bu hormonların α-altbirimleri ortaktır, β-altbirimleri ile ayrılırlar. hcg 25 yıldan beri folliküler olgunlaģmanın sonlandırılmasında kullanılmaktadır. Mazer ve Ravetz gebe kısrakların serum gonodotropinlerini ve koyunların hipofiz ekstrelerini follikül uyarımı için ve hcg yi folikül olgunlaģmasının sonlandırılması için amenoreik kadınlarda kullanmıģlar ve hipofizer bir faktörün folikül geliģimini uyardığı ve hcg nin ovulasyonu indüklediği sonucuna varmıģlardır. 42,44,45 40

54 Gonadotropinlerin Endikasyonları Hipogonadotropik hipogonadizmi olan bireyler (hipotalamik amenore, WHO Grup I) ekzojen gonadotropin ile en çok tedaviye aday grubu oluģtururlar. Klomifen sitrat ve benzer tedavi yöntemleri hipotalamik-hipofizerovaryum aks düzgün olmadığında etkisizdir. Hipogonadotropik hipogonadizmli bir kadında ilaç seçimi insan Menapozal Gonadotropin (hmg) olmalıdır çünkü hem FSH hem de LH içermektedir. 46 Klomifen sitrat a dirençli anovulasyon durumunda; Klomifen sitrat ile gebelik sağlanamadığında ekzojen gonadotropin tedavisi açık bir seçenektir. Klomifen sitrat a dirençli PKOS lu( WHO Grup II) hastalarda serum gonadotropinleri normaldir. Çoğunlukla LH düzeyi de yüksektir. Bu hasta populasyonunda tedavi ile ekzojen gonadotropin, endojen gonadotropinlerle üst üste gelir. Açıklanamayan Ġnfertilite olgularında ekzojen gonadotropinler ile tedavide amaçlanan birden fazla olgun oositin sağlanmasıdır Gonadotropinlerle Tedavi Rejimi Hipogonadotropik hipogonadizmli (WHO grup I) ve klomifen sitrat a dirençli (WHO Grup II) hastalarda düģük doz ile indüksiyona (75 IU/ gün) step-up protokolü çerçevesinde baģlanabilir. 4-7 günlük bir uyarma süresi sonunda serum östradiol düzeyine ilk yanıtı ölçmek için bakılmalıdır. Daha sonra gonadotropin dozu aynen sürebilir ya da artırılabilir. Serum östrodiol düzeyi bir kez yükseldikten sonra, geliģen folliküllerin sayısını ve çapını ölçmek için 1-2 günde bir transvajinal ultrasonografi yapılır. Önde 41

55 giden follikül çapı mm ye ulaģtığında ovulasyonu sağlamak için hcg enjeksiyonu yapılır. Genelde saat sonra ovulasyon beklenir. 47 PKOS lu kadınlar çoğu zaman gonadotropinlere aģırı duyarlılık gösterebilirler. Bu kadınlarda genellikle FSH uyarısına yanıt verecek çok sayıda antral follikül vardır. 47 Ovaryan hiperstimulasyon sendromu (OHSS) ve çoğul gebelik riski daha düģük dozları içeren ( IU / gün) düģük-yavaģ (low dose step-up) tedavisi ile engellenebilir. 48 Alternatif olan step-down rejiminde ise tedavi yüksek dozda baģlar ( IU/gün) ve seçilmiģ folliküller içindeki duyarlılığı düģük folliküller gerilerken, duyarlılığı yüksek folliküllerin büyümeye devam etmesi için giderek dozların düģürülmesi esasına dayanır. 49 Klomifen sitrat a dirençli ve açıklanamayan infertilite hastalar için ardıģık klomifen sitrat ve gonadotropin tedavisi uygun görülmektedir. Tipik döngüde standart klomifen sitrat tedavisini izleyerek ( mg/gün) klomifen sitrat tedavisinin son günü düģük doz gonadotropin tedavisi (75 IU FSH veya hmg) uygulanır. Daha sonra sıradan bir gonadotropin ile indüksiyon tedavisinde olduğu gibi izlenir

56 Gonadotropin Tedavi Sonuçları Bir menstruel döngü içerisinde gebelik elde edebilme olasılığı artan östradiol ile birlikte artar. Bu durum ovarian hiperstimulasyonu ve çoğul gebelik olasılığını da artırır. Gonadotropin rejimleri ile en iyi sonuç en yüksek östradiol yoğunlukları pg/ml arasında olduğunda alınır. Ovaryan ultrasonografi ile folliküllerin sayısı ve çapı belirlenir. Kendiliğinden olan bir döngüde, o döngüde rol alacak antral folliküller menstruasyonun 5-7 gün arası izlenebilir. Baskın follikül 8-12 gün arası belirir ve günde yaklaģık 1-3 mm büyür, ortalama mm iken ovulasyon olur. Kendiliğinden olan döngülerin %5-10 kadarında iki preovulatuvar follikül geliģir. 50,51 Ekzojen gonadotropin ile uyarılmıģ döngülerde baskın follikül benzer bir büyüme gösterir ancak daha küçük çaplarda olgunluğa ulaģır. Follikül çapı arttıkça ovulasyon olasılığı da artar. hcg uygulandıktan sonra, 14 mm ve daha küçük folliküller ender ovulasyon gösterir. Folliküller yaklaģık %40 ı mm, %70 i 17-18mm, %80 i 19-20mm çapındadır ve aslında tüm büyük folliküller ovulasyon gösterir Klomifen Sitrat (KS) İle Ovulasyon İndüksiyonu Klomifen sitrat ilk olarak 1956 yılında sentezlenmiģtir. Klinik denemeleri ilk olarak 1960 da baģlatılmıģtır ve ABD de klinik kullanımı 1967 yılında onaylanmıģtır

57 Kimyasal olarak klomifen sitrat bir nonsteroidal trifeniletilen yapısında olup, östrojen agonisti ve antagonisti etkileri birlikte barındırır. Klomifen sitrat iki farklı steroizomerin karıģımıdır, farmakolojik olarak cis ve trans yapıları vardır; enklomifen (cis-klomifen) ve zuklomifen (trans-klomifen) olarak adlandırılırlar. Enklomifen en etkili izomerdir ve ovulasyonu sağlayan etkiden sorumludur. Enklomifenin yarı ömrü kısadır ve serum konsantrasyonu tedaviden sonra hızlıca yükselir ve birkaç gün sonra düģer. Zuklomifen daha yavaģ atılır. Tek dozdan sonra bile haftalarca serumda saptanabilir. ArdıĢık tedavilerde ovaryumda birikebilir. 51,52,53,54 Klomifen sitrat etkisini östrojen reseptörleri bloke ederek gösterir. Yapısal benzerliği nedeniyle tüm vücuttaki östrojen reseptörlerine bağlanır. Ancak östrojenden farklı olarak reseptörlere uzun süre bağlı kalır ve reseptör dönüģümünü düģürerek ortamdaki reseptör sayısını azaltır. Böylece çekirdekteki östrojen reseptörleri düzeyinde endojen östrojenlerle yarıģarak östrojen etkisini engeller. Bu engelleme hipotalamus-hipofiz sisteminde olduğunda östrojenin negatif geribildirim etkisi ortadan kalkacağından hipofizden FSH ve LH salgılanması artar. 51, Klomifen Sitrat Endikasyonları Klomifen sitrat tedavisi anovulatuvar infertilitesi olan kadınlarda kullanılan ilk sıradaki ilaç seçimidir. Anovulatuvar infertilitede KS tedavisi sadece dolaģan östrojen seviyesi gonadotropinler üzerinde negatif geribildirim oluģturacak düzeye geldiğinde etkilidir. Progesteron uygulanmasından sonra oluģan kanama, dolaģımdaki yeterli östrojenin klinik yansıması olarak kabul 44

58 edilebilir. Klomifen sitrat tedavisi genellikle anovulatuvar disfonksiyonlu kadınlar ile sınırlandırılmıģ olsa da, luteal evre hasarı ve açıklanamayan infertilitesi olan, infertilite süresi kısa olan hastalarda da kullanılabilir. Ovulatuvar infertilitede ise KS multifolliküler geliģimi uyararak olası bir ovulasyon disfonksiyonunu düzelterek gebeliği sağlamaktadır. 55,56 Klomifen sitrat ın hipotalamus-hipofiz aksı hasarlı kadınlarda ya da dolaģan östrojen düzeyi çok az olan hastalarda (WHO Tip I ve III) kullanılması uygun değildir Klomifen Sitrat Dozu Klomifen sitrat oral olarak uygulanır. Menstrüel döngünün 3 ile 5. günleri arasında uygulamaya baģlanabilir. Ġlk döngüde tedaviye 50mg/gün baģlanır, tedavi 5 gün olarak belirlenmiģtir. Ovulasyon olmaması durumunda izleyen döngülerde ilacın dozu 50 mg/gün arttırılır. 150mg/gün ile ovulasyon elde edilemezse farklı bir ilaca geçilmelidir. Ovulasyon sağlandıktan sonra, aynı doz gebelik oluģana değin ya da toplam tedavi süresi 6 döngüyü bulana değin tekrarlanır. 53, Klomifen Sitrat Tedavi Sonuçları KS ile yapılan ovulasyon indüksiyonunda %60-90 ovulasyon görülmüģtür. Üç baģarılı ovulasyondan sonraki kümülatif gebelik oranı 45

59 %70 dir. Amenoreik kadınlar oligomenoreik kadınlardan daha çok gebe kalırlar. Bunun nedeni olasılıkla bu hastalarda altta yatan diğer infertilite nedeni olması ve aslında ovulasyon yapabilmeleridir. Tüm çalıģmalarda ovulasyon sağlanmıģ tedavilerdeki döngü baģına gebelik oranı %15 dir. Artan yaģa koģut biyolojik fertilite azaldığından 35 yaģ üzerinde klomifen sitrat ile tedavi uygun bir yöntem değildir. 3-6 ovulatuvar döngüye karģın gebelik oluģmaz ise diğer infertilite nedenlerinin gözden geçirilmesi gereklidir. 58, Klomifen Sitrat ın Yan Etkileri Birçok çalıģmada çeģitli modellerde, KS nin endometriyal büyüme ve olgunlaģmaya, servikal mukusun kalitesine olan yan etkileri gösterilmiģtir. Genel olarak bu etkilerin uzun süreli tedavi ya da yüksek dozda tedavi sonrası olduğuna inanılır. 60 Klomifen sitrat tedavisinin küçük yan etkileri genelde sıktır ancak tedaviyi kesmeyi gerektirecek kadar Ģiddetli olması çok enderdir. Kısa dönem sıcak basmaları izlenmektedir ancak, klomifen sitrat tedavisinin sadece merkezi olarak endojen östrojen düzeylerinin düģük olarak algılanmasına neden olmasından dolayı bu etki geçicidir. Ruh halinde dalgalanmalar sıktır. Hafif ve seyrek yan etkiler ise meme hassasiyeti, pelvik basınç ya da ağrı ve bulantıdır. Görme bozuklukları, ıģığa duyarlılık sık rastlanmayan (%2) ve geri dönüģümlüdür

60 2.6.Proliferasyon Hücre Çekirdek Antijeni (PCNA) PCNA 36 kda ağırlığında türler arasında iyi korunmuģ, hücre döngüsü için esas olan düzenleyicidir. DNA sentezi sırasında DNA hasarlarının onarılması ve S fazında DNA polimeraz delta için ko-faktör olarak iģlem gördüğü gösterilmiģtir. 61,62,63 Hücre döngüsünün G1 evresinde ekspresyonu baģlar, en yüksek düzeye S fazında ulaģır ve G2/M fazında da azalır. Dinlenme evresindeki hücreler farklı mitojenlerle uyarıldığında aynı derecede PCNA ve DNA sentezi yaptığı gösterilmiģtir. Biyolojik yarı ömrü yaklaģık 20 saattir. Aldehitleri kullanarak fikse edilmiģ hücrelerde ise PCNA nın dağılımı farklıdır ve hücre döngüsü boyunca yoğun diffüz nükleer boyanma saptanır. 61,62,64,65,66,67 PCNA ni hücrelerde ve dokularda göstermeye yönelik çalıģmalara otoimmün hasta serumundan elde edilen poliklonal antikorların kullanılmasıyla baģlanmıģtır. Daha sonra 1990 da, bakterilerde PCNA ni ortaya çıkararak denatürasyona neden olmayan koģullarda saflaģtırılmıģ ve bununla farelerin immünizasyonundan elde edilen, 11 yeni monoklonal antikor tanımlanmıģtır. Normal eriģkin dokularında çekirdekte yaygın ve / veya granüler boyanma Ģeklinde izlenen PCNA hücre proliferasyonu ile birliktelik göstermiģtir. 68,69,70 47

61 PCNA nin normal dokularda gösterilmesi proliferatif potansiyeli yakından yansıtırken, neoplazmlarda daha karmaģık ifade biçimleri görülmektedir. Proliferasyonla birlikte olan çeģitli belirleyicilerin prognozla iliģkilerinin farklı tümör tiplerinde değiģkenlik göstermesi PCNA için de geçerlidir. PCNA nin immünohistokimyasal yöntemle gösterilmesi gibi proliferasyonu belirleyen tekniklerin tümü prognozla iyi korelasyon göstermektedir. 71,72,73,74 PCNA ovaryumda mayotik bölünme halinde olan hücrelerde, çekirdek ve sitoplazmada saptanmıģtır. Gonadotropinler ve östradiol granüloza hücrelerinin çoğalma evresini baģlatabilirler. Fare ve sıçanlar ile yapılan çalıģmalarda, granüloza hücre çoğalmasının hızlı evresinin antrum oluģumu sırasında gerçekleģtiği gösterilmiģtir. 63 Yapılan immünohistokimyasal çalıģmalarda; PCNA nin primordiyal folliküllerde zayıf olmakla birlikte oositte, geliģen folliküllerde ise granüloza hücrelerinde ve oositte izlenmiģtir. 75 Ovaryum da in vivo ve in vitro çalıģmalarda sıçan, sığır ve domuzlarda PCNA salınımının baģlangıç ve erken folliküllerde olaylandığı gösterilmiģtir. 63,76 48

62 2.7.C-FOS c-fos geninin transkripsiyonunu ilk kez 1984 yılında Mike E. Greenberg ve Ed B. Ziff büyüme faktörleri ile uyardıkları fibroblastlarda göstermiģlerdir. C-fos geninin transkripsiyonu hücreleri etkileyerek büyüme ve farklılaģmayı sağlayan çok sayıda etken tarafından hızla ve geçici olarak sağlanır. C-fos bu nedenle hücrede herhangi bir uyarana karģı ilk yanıt veren genlerdendir [erken ivedi geni, (IEG) ya da erken yanıt geni, (ERG)]. Bu gruba giren genler hücre büyümesi, çoğalması, farklılaģması ve hücrenin programlı ölümü (apoptosis) ile ilgili transkripsiyon faktörleridir. 77,78,79,80 IEG grubundan olan c-fos geni çekirdeksel bir transkripsiyon faktörüdür ve nükleer üçüncü ulak ya da hücresel iģlevler yönünden esas anahtar olarak düģünülmektedir. Bir diğer tanımlama ile çekirdeksel protoonkojen (nuclear protooncegene) olan c-fos hücre çoğalması ve farklılaģması sırasında, gen ekpresyonunun aģamalı düzenlenmesi ile ilgilidir. Fos proteinleri c-fos geninin ürünü olan çekirdek proteinleridir. Bunların hücredeki ekspresyonu ve birikimi herhangi bir etki olmaksızın görülebilir ancak bu ekspresyon ve birikim çeģitli uyarılara yanıt olarak hücre aktivasyonu ile birlikte artar. 81,82,83,84 Fos proteinleri yine bir IEG olan c-jun geninin ürettiği Jun proteinleri ile birlikte transkripsiyon faktör kompleksi Aktivatör Protein-1 (AP-1) in bileģenleri olarak birlikte iģlev görürler. Fos proteinlerinin ekspresyonu tipik olarak geçicidir. Ancak bu ailenin bazı üyelerinin ekspresyonundaki yüksekliğin devamının kronik uyaranlar tarafından engellendiği rapor edilmiģtir

63 Fos benzeri (Fos-like) proteinler Fra (kronik-fos akrabası antijen, chronic-fos related antigen) olarak adlandırılırlar. 86 AP-1 (Activator Protein-1); Fos proteinleri (c-fos, Fos B, Fra 1 ve Fra 2), Jun proteinleri (c-jun, Jun B ve Jun D) ve bazı ATF proteinlerinden (ATFa, ATF-2 ve ATF-3) oluģmuģtur. Fos proteinleri, Jun proteinleri ile stabil dimerler oluģturur. Oysa Jun proteinleri homodimerler ya da Fos ve ATF proteinleri ile heterodimerler oluģturabilir. Tüm AP-1 proteinleri fosfoproteinlerdir ve hiperfosforilasyon ve defosforilasyon onların DNAbağlanma ve transaktivasyon erklerini etkileyebilir. 87,88,89,90,91,92,93,94 AP-1 kompleksin üyeleri değiģik gen ekspresyonlarını düzenlerler. Bu bileģenler çoğalma, farklılaģma, programlı ölüm ve onkojenik transformasyon gibi çok sayıda hücresel süreçlerle kritik olarak ilgilidir. 95,96,97 c-fos transkripsiyonu çok çeģitli mitojenler ve farklılaģmayı uyaran maddeler tarafından uyarılabilir ve bağımsız olarak yeni protein sentezi oluģturur. Bu nedenle bu tür genler protoonkojenler ve bunların ürünü olan proteinler de onkoproteinler olarak adlandırılırlar. Kanser geliģiminde Fos proteinlerinin katkısı olduğu bilinmektedir. Bazı tümör tiplerinde c-fos ve c-jun düzeyinin arttığı gösterilmiģ ve bu artıģın artan hücre çoğalmasının bir kanıtı olacağı için tümör oluģmasında önemli bir rol oynadığı ileri sürülmüģtür. Ancak protoonkojenler yalnız kötü huylu geliģim ile birlikte değil, normal büyüme ve farklılaģmayı da düzenlerler. GeliĢimsel anomalilerin protoonkojenlerin uygun olmayan 50

64 aktivasyonuyla yüksek düzeyde onkoprotein üretmelerine veya protoonkojenlerin anormal üretimine yol açan bir mutasyona bağlı olabileceği ileri sürülmüģtür. 91, 98,99,100 Tüm AP-1 proteinleri büyüme faktörlerine hücresel yanıtın bazı yönlerini düzenlerler. c-fos protoonkojeninin büyüme faktörleri tarafından oluģturulan uyarıların hücre dıģı ortamdan hücre çekirdeği içine iletilmesinde esas rolü oynadığına inanılmaktadır. 101 c-fos gibi IEG lere NGF (sinir büyüme faktörü) aksiyonu için gereksinim olduğu ve örneğin; hasarlanmıģ retinal ganglion hücrelerinin rejenerasyonlarıyla ilgili olduğu, bu nedenle nöronların canlılığını sürdürmesi ve rejenerasyonunun anlaģılması için c-fos un düzenlediği biyolojik olaylar zincirinin kesin tanımlanmasına çok gereksinim olduğu bildirilmektedir. 101,102 c-fos, hücrelerin hücre dıģı değiģikliklere vereceği yanıtın büyüklüğünü saptamada da fonksiyonel bir gösterge olarak kullanılır. 103 Pek çok hücre dıģı etkenin c-fos transkripsiyonunun hızlı ve geçici olarak artmasını sağlamasına karģın, bazı geçici, nöral ve hormonal uyarıyla bu transkripsiyonun azaltılabileceğini gösteren çalıģmalar vardır. 104 c-fos geni ve Fos proteinlerinin büyüme faktörleri, mitojenler ve pek çok hücre dıģı etkenle ekspresyonunun artması ve bu artıģın hücredeki büyüme, çoğalma, farklılaģma ve programlı ölüm gibi çok önemli biyolojik süreçlerle ilgisi nedeniyle bu gen ve proteinler özellikle doğumsal anomalilerin, onkogenik transformasyonun ve normal geliģimin 51

65 değerlendirilmesi yönünde yapılacak hücresel ve genetik çalıģmalarda önemli bir anahtardır. 105,106 Yapılan çalıģmalarda c-fos un steroid metabolizmalı birçok enzimin ekspresyonunda düzenleyici rol oynadığı ortaya konulmuģtur. c- fos immunlokalizasyonu follikül teka hücrelerinde düģük düzeyde gözlenirken granüloza hücrelerinde yüksek bulunmuģtur Lösemi İnhibitör Faktör (LIF) Lösemi inhibitör faktör (LIF) 43 kda moleküler ağırlığa sahip bir glikoproteindir. ÇeĢitli dokularda biyolojik aktivitesi bulunur. LIF embriyonik kök hücrelerin, primordiyal germ hücrelerinin, periferal nöronların, osteoblastların, adipositlerin, hepatositlerin ve endotelyal hücrelerin büyümesini ve farklılaģmasını düzenler. 108 LIF fibroblastlar, alloreaktif T-lenfositler, mitojen aktiviteli dalak hücreleri, Krebs ve Ehrlich asit mayi hücreleri tarafından üretilir. Hücre aktivasyonundan sonra monositler tarafından da üretilir. LIF in mezenģimal hücrelerde sentezi, IL-1α, TGF-β,EGF ve bfgf tarafından uyarılır. 108,109 LIF in birbirine eklenmiģ birkaç izoformu tanımlanmıģtır. LIF- D, LIF-M, LIF-T. Tüm izoformlar 3 değiģik birinci ekson (D,M,T) ve ortak ikinci ve üçüncü ekson içerir

66 Ġnsan LIF-D, LIF reseptörü ile sinyallenen bir biyolojik aktif proteindir. LIF-M, ekstrasellüler matrikste aktif olur. LIF-T, intrasellüler bir protein olarak bulunur. 110 LIF, miyeloid lösemi hücrelerinin çoğunu engelleyen ve makrofajlara dönüģmesini uyaran bir etken olarak izole edilmiģtir. 110,111 Yapılan çalıģmalar LIF nün ovaryum iģlevinde önemli bir düzenleyici olabileceğini düģündürmektedir. 108 LIF mrna ve proteini ovaryum hücre kültürlerinde düģük düzeyde ancak yapıcı olarak ifade olmaktadır. LIF mrna konsantrasyonu IL-1α ve TNF-α tarafından zaman ve konsantrasyon bağımlı Ģekilde yükselmiģtir. HCG nin folliküler sıvıda LIF ekspresyonunu uyardığı yapılan çalıģmalarda gösterilmektedir. Aynı zamanda granuloza-lutein hücreleri ve ovaryum stromal hücreleri LIF mrna eksprese eder ve protein üretirler. LIF in bu hücrelerdeki bulunuģu ovulasyon fizyolojisinde önemli rol oynayabileceğini düģündürmektedir. 112,113,114 53

67 3.GEREÇ VE YÖNTEM 3.1.Deney Hayvanları ve Gruplandırma Bu çalıģmada Gazi Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları YetiĢtirme ve Deneysel AraĢtırma Merkezi nden sağlanan Wistar Albino cinsi, 36 adet, 20 haftalık, gr ağırlığında diģi sıçanlar kullanıldı. Denekler laboratuar ortamında 3 hafta süresince 12 saat gündüz ve 12 saat gece döngüsünde ve 23±2 C lik denetimli sıcaklıkta tutuldu. Tüm deneklerin su ve besine serbest eriģimi sağlandı. Bu süre boyunca tüm deneklerden vaginal smear örnekleri alınarak 3 döngü boyunca izlendi ve siklusları düzenli olan sıçanlar çalıģmaya alınarak, her birinde 6 Ģar denek bulunan 6 grup oluģturuldu. Bu gruplara ovulasyon indüksiyon modelleri uygulandı. Grup 1:Ovulasyon indüksiyonu sağlamak için hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu (n=6) Grup 2 : Hormon uygulaması yapılan grup (n=6) Grup 3 : Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu (n=6) Grup 4 : Klomifen Sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu (n=6) Grup 5 : Klomifen sitrat uygulaması yapılan grup (n=6) Grup 6 : Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu (n=6) Hormon uygulamasının kontrol grubu olarak belirlenen 1. gruba hormon uygulaması yapılan 2. grupta uygulanan enjeksiyonlarla eģ zamanlı olarak aynı dozlarda SF verildi. 2. grup olarak belirlenen hormonal 54

68 uyarım grubuna ise ovulasyon indüksiyonu için insan menopozal gonadotropin (hmg) uygulandı. Bu gruba alınacak deneklere 4. Menstural döngünün diöstrus evresindeyken 150 IU/kg insan menopozal gonadotropin (hmg) intramuskuler olarak 17:00 de verildi. 4. döngünün diöstrus evresini izleyen proöstrus evresinde ise 75 IU/kg insan koryonik gonadotropin (hcg) intramuskuler olarak 17:00 de uygulandı. Klomifen sitrat uygulamasının kontrol grubu olarak belirlenen 3. gruptaki deneklerin oluģturulabilmesi için, aynı 2. gruptaki denekler gibi hormonal uyarım yapıldıktan sonra östrus evresinde olduğu belirlenen diģi sıçanlar 1 gece erkek sıçanlarla birlikte bırakıldı. Vaginal plak oluģumu görülen sıçanlar gebeliğin 0. gününde kabul edilerek gruba alındı. Bu gruptaki deneklerin de gebeliğinin 6. gününe gelindiğinde implantasyon aģamasında oldukları kabul edildi. 4. gruba aynı stres koģullarının oluģturulması amacıyla diöstrus evresindeki deneklere 2 gün süresince lavage yoluyla sadece 2 ml SF verildi. 5. gruptaki deneklere ovulasyon induksiyonun oluģturulması ereğiyle 2 ml SF içerisinde 100 g/kg klomifen sitrat çözüldü. Çözelti 4 günlük östrus evresinin diöstrus evresindeki deneklere lavage yoluyla 2 gün boyunca verildi. 6. gruptaki deneklerin oluģturulabilmesi için, aynı 5. gruptaki denekler gibi klomifen sitrat uygulaması yapıldıktan sonra östrus evresinde olduğu belirlenen diģi sıçanlar 1 gece erkek sıçanlarla birlikte bırakıldı. Vaginal plak oluģumu görülen sıçanlar gebeliğin 0. gününde kabul edilerek gruba alındı. Denekler gebeliğin 6. gününe gelindiğinde implantasyon aģamasında oldukları kabul edildi. Denekler genel anestezi altındayken karın bölgeleri açılarak ovaryum ları çıkarıldıktan sonra intraperitoneal ketamin (44mg/kg) ve ksilazin enjeksiyonu ile uyutularak ötenazi gerçekleģtirildi. Tüm deneklerden immunohistokimyasal inceleme için alınan ovaryum örnekleri %10 luk nötral formaldehite alınarak, alıģılmıģ histolojik yöntemlerden geçirilerek parafin bloklar hazırlandı. 55

69 3.2.İmmünohistokimyasal Yöntem Kontrol ve deney gruplarına ait ovaryum dokusu bloklarından polilizinli camlara 4 µm kalınlığında kesitler alınarak immünohistokimyasal boyamaları yapıldı. ÇalıĢmada hücre proliferasyonunun izlenmesi amacıyla PCNA ( PC-10) Ab-1, (Lot: 106P8120) primer antikoru, LIF ( N- 18) primer antikoru (Cat: Sc- 1336, (Lot: #B-1710), C-fos( K-25) primer antikoru (Cat: Sc-253, Lot: #F-1110) kullanıldı. Kesitler 37ºC deki etüvde bir gece tutulduktan sonra deparafinizasyonu kolaylaģtırmak amacıyla etüv ısısı 57ºC ye çıkarılarak 1 saat daha bekletildi. Camlar deparafinizasyonu tamamlamak için 2 kez 15 er dakika ksilolde bırakıldıktan sonra sırasıyla %100 lük, %96 lık ve %80 lik alkol serilerinden 10 ar dakika geçirilerek sudan, 2 kez 5 er dakika distile sudan geçirilerek alkolden kurtarıldı. PCNA immünboyanması yapılacak kesitler doku içerisinde formaldehitin kapattığı reseptör bölgelerinin açığa çıkarılmasını sağlamak amacıyla mikrodalga fırında 1 M sitrat tamponuna (ph: 6.0) (Cat: AP , Lot: 9003LT13610, Lab Vision, Fremont, USA) etkin bırakıldı. Oda ısısında 20 dakika soğutulduktan sonra 15 dakika süreyle hidrojen peroksit (Cat: TA-125-HP, Lot: 125HP14119, Lab Vision, Fremont, USA) uygulandı ve endojen peroksidaz aktivitesi bloke edildi. LIF ve c-fos immünboyanması yapılacak kesitlere ise sitrat aģaması uygulanmadan direk hidrojen peroksit aģaması uygulandı. Daha sonra, camlar 3 kez 3 er dakika PBS (Phosphate Buffer Saline) (ph: 7.4) ile yıkandıktan sonra özgün olmayan bağlanmaların engellenmesi amacıyla 5 dakika, Ultra V Block, PCNA için (Anti-mouse HRP kit Lot: MHL90115, Thermo Scientific, 56

70 Fremont, USA) LIF için ( Histostain Plus, Lot: A, Ġnvitrogen,USA), c-fos için (sekonder kit, LOT: C0910, Santa Cruz Biotechnology, California,USA) uygulandı. Bloklama aģamasının ardından kesitler yıkanmadan PCNA ( PC-10) Ab-1, primer antikoru (Lot: 106P8120), LIF ( N-18) primer antikoru Cat: Sc- 1336, Lot: #B-1710), C-fos( K-25) primer antikoru (Cat: Sc-253, Lot: #F-1110) primer antikorlarına etkin bırakıldı. Daha sonra camlar, 3 kez 3 er dakika PBS ile yıkandıktan sonra PCNA için Anti-mouse HRP kit (Lot: MHL 90115) Thermo Scientific Fremont,USA) LIF için Histostain Plus (Lot: A) Ġnvitrogen,USA) ve c-fos için sekonder kit (Lot: C0910) Santa Cruz Biotechnology California,USA) 20 dakika biyotinli sekonder antikor uygulanarak primer antikora bağlanması sağlandı. Tekrar PBS ile yıkandıktan sonra dokular enzimin biyotine bağlanması amacıyla 20 dakika PCNA için Anti-mouse HRP kit (Lot: MHL 90115) Thermo Scientific Fremont,USA) LIF için Histostain Plus (Lot: A) Ġnvitrogen,USA) ve c-fos için sekonder kit (Lot: C0910) Santa Cruz Biotechnology California,USA) streptavidin peroksidaz enzim kompleksine etkin bırakıldı. Camlar tekrar PBS ile yıkandıktan sonra kromojen olarak PCNA antikoru için AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) (Lot: ASA100318, Thermo Scientific, Fremont, USA) uygulanarak gözle görülebilen immün reaksiyonun açığa çıkması sağlandı.lif primer antikoru için kromojen olarak DAB (3,3 iaminobenzidine Tatrahyrochloride-Plus kit) (Lot: A, Ġnvitrogen, USA) c-fos için yine DAB kromojen boyası( Sc Lot: C09110) Santa Cruz Biotechnology California,USA) kullanıldı. Zemin boyamasında Mayer in Hematoksileni (Cat:TA-125-MH, Lot: AMH70809, Lab Vision, Fremont, USA) kullanıldı. AEC ile boyanan camlar Ultramount (Cat: TA-125-UG, Lot: VM13518, Lab Vision, Fremont, USA) ile kapatıldı. DAB ile boyanan camlar alkol ve ksilol serilerinden geçirilerek entallan ile kapatıldı. Kesitler Leica DM 4000 (Germany) bilgisayar destekli 57

71 görüntüleme sisteminde, Leica Q Vin 3 programında değerlendirildi ve resimlendi İstatistiksel Yöntem Tüm istatistiksel analizler SPSS paket programı (SPSS Inc. USA) kullanılarak yapıldı. P< 0.05 anlamlı kabul edildi. Veri setini oluģturan değerlerin normal dağılım gösterip göstermediği Shaphiro-Wilk varyansların homojenliği Levene testi ile kontrol edildi. Verilerin normal dağılım göstermediği, varyansların homojen olmadığı belirlendi. Buna uygun olarak iki grup ortalamasının karģılaģtırılması için Mann Whitney U, ikiden fazla grup ortalamasının karģılaģtırılması için Kruskal-Wallis testi uygulandı. 58

72 4.BULGULAR 4.1.PCNA BULGULARI: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryumlarında geliģim aģamalarındaki tüm folliküler, atretik folliküller ve stroma normal yapıdaydı. Primordiyal folliküllerde oosit çekirdek ve çekirdekçiğinde, follikül hücre çekirdeklerinde PCNA tutulumu belirgin ve orta dereceliydi. Atretik folliküllerde, granüloza hücreleri ve teka interna hücrelerinde izleniyordu (Resim 1). Büyük büyültmeli resimlerde primordiyal, tek ve çok sıralı hücre katmanı içeren folliküllerde oosit, granüloza ve teka interna hücre çekirdeklerindeki immün tepkime belirgin olarak gözlemleniyordu. Antrumu belirgin sekonder folliküllerde oositteki PCNA tutulumunun oldukça azaldığı, granüloza hücre tutulumu ile teka interna hücre tutulumunun ise oldukça yoğun olduğu ayırt ediliyordu. Bazı stromal hücrelerde de zayıftan ortaya değiģen boyanma belirgindi. Atretik folliküllerde ise immünreaktivitenin oldukça kuvvetli olduğu görüldü (Resim 2,3). Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda PCNA immünreaktivitesinin geliģen folliküllerde oosit çekirdeği düzeyinde kuvvetli olduğu, buna karģın sekonder follikülden itibaren oosit çekirdek boyanmasının azaldığı belirlendi. Tüm folliküllerde granüloza ve teka interna hücrelerinde yaygın tutulum dikkati çekiyordu. Ġmmün tepkime çekirdek düzeyinde fazla sitoplazmik düzeyde ise daha azdı (Resim 4,5,6). Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarındaki PCNA tutulumu tüm folliküllerde granüloza hücreleri, teka interna hücreleri düzeyinde ve oosit çekirdeklerinde oldukça belirgindi. Ġmmünreaktivite 59

73 korpus luteum hücrelerinde ve atretik folliküllerdeki hücrelerde yaygındı. Bazı stromal hücrelerde de oldukça kuvvetli PCNA boyanması dikkat çekiciydi (Resim 7,8,9). Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol ovaryumlarında yapılan incelemelerde, PCNA tutulumunun hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryumlarına eģdeģ olduğu görüldü (Resim 10,11). Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokularında PCNA tutulumunun tüm folliküllerde, atretik olanlarda stromada ve korpus luteumda son derece az düzeyde olduğu izlendi. Granüloza hücrelerinde tepkime çekirdek düzeyinde ve az yoğundu. Oositte ise belirgin bir tutulum izlenmiyordu. Buna karģın çok sıralı primer folliküllerde birden fazla oositin gözlemlenmesi dikkati çekti (Resim12,13,14). Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA immünreaktivitesinin, tüm folliküllerde granüloza ve teka interna hücreleri düzeyinde olduğu ayırt ediliyordu. Oosit çekirdek ve sitoplazmasında tutulum belirgindi. Ġmmünreaktivitenin korpus luteumda daha az düzeyde olduğu belirlendi. Atretik folliküllerde de yaygın boyanma dikkati çekti. GeliĢen folliküllerde bazen iki oositin varlığı ilgiyi çekiyordu (Resim 15,16,17). 60

74 4.2.C-FOS BULGULARI: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarında c-fos immünreaktivitesi değerlendirildiğinde, tutulumun tüm folliküllerde oosit sitoplazması ile çekirdeğinde ve granüloza hücreleri ile teka interna hücrelerinde olduğu görüldü. Boyanmanın çekirdek ve sitoplazma düzeyinde granüler Ģekilde olduğu ve çoğunlukla orta dereceli gözlemlendiği ilgiyi çekti. Bu gruba ait incelemelerde korpus luteum hücrelerinde de orta dereceli immünreaktivite belirgindi (Resim 18,19,20). Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryumlarda c-fos immünreaktivitesi değerlendirildiğinde, tutulumun kontrole karģın biraz daha fazla ve çekirdek ile sitoplazma düzeyinde yaygın olduğu belirlendi (Resim 21,22). Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryumlarında ise c-fos tutulumunun diğer gruplara karģın biraz daha özgün olduğu, sitoplazma ve çekirdekte granüller boyanmanın varlığı dikkati çekti (Resim 23,24,25,26). Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarındaki c-fos immünreaktivitesi hormon grubu kontrolleri ile eģdeģ yapı sergiliyordu (Resim 27,28,29). Klomifen sitrat uygulaması yapılan grup ile hormon uygulaması yapılan grup ovaryumları karģılaģtırıldığında, klomifen sitrat 61

75 uygulaması yapılan grupta c-fos tutulumunun ağırlıklı olarak teka interna hücreleri ve stromada yoğunlaģtığı izlendi. Ġmmün tepkimenin bu grupta, tüm folliküllerde, granüloza hücreleri ve oositte, hormon grubuna karģın az olması ilgiyi çekti. Korpus luteum hücrelerinde de boyanma biraz daha yoğundu (Resim 30,31,32). Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokularında çok sıralı antrumun oluģmaya baģladığı folliküllerde c-fos tutulumunun belirgin olarak arttığı ve granüloza hücrelerinde, oosit ile teka interna hücrelerinde yaygınlaģtığı belirlendi. Boyanma sitoplazmada granüler Ģekildeydi. Ġmmünreaktivitenin atretik follikülde de belirginleģtiği ayırt edildi (Resim 33,34,35). 4.3.LIF BULGULARI: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol ovaryumlarında LIF tutulumu değerlendirildiğinde, korpus luteum, atretik ve geliģen folliküllerde ortadan zayıfa değiģen tepkime gözlemlendi (Resim 36,37). Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda yapılan incelemelerde LIF immünreaktivitesinin, kontrollere eģdeģ olduğu dikkati çekiyordu (Resim 38,39,40). Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokularında, bazı folliküllerde, granüloza, teka interna ve atretik follikül hücrelerinde diğer gruplara karģın tutulumun biraz daha yaygın olduğu ilgiyi çekti (Resim 41,42,43). 62

76 Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol ovaryum dokusu incelemelerinde LIF tutulumunun, hormon uygulaması yapılan grubun kontrol grubuyla eģdeģ olduğu görüldü (Resim 44,45). Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryumlardaki değerlendirmelerde, LIF immünreaktivitesinin korpus luteum hücrelerinde biraz daha fazla olduğu dikkati çekerken, diğer yapıların kontrol grubundakilerle aynı görünümde olduğu belirlendi. Sekonder folliküllerde ise oositi çevreleyen ilk sıra follikül hücrelerinde tutulumun biraz daha arttığı görüldü (Resim 46,47). Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusu yapılan incelemelerinde, LIF immünreaktivitesi diğer gruplara oranla artmıģtı. Tutulum oosit sitoplazmasında az, granüloza ve teka interna hücrelerinde ise biraz daha fazlaydı. Korpus luteumda da boyanmanın orta dereceli ve yaygın olduğu dikkati çekti (Resim 48,49,50). 4.4.İSTATİSTİKSEL BULGULAR Yapılan istatistiksel değerlendirmede, klomifen sitrat uygulaması yapılan grupta klomifen sitrat uygulaması yapılan hayvanların Graaf değerleri kontrol ve gebe grubuna karģın farklıydı ve bu fark anlamlıydı (p=0.006). Hormon uygulaması yapılan deneklerin Graaf değerlerinde, kontrol ve gebe gruplarına karģın anlamlı fark belirlenemedi (p=0.095). 63

77 Hormon uygulaması yapılan kontrol grupları, klomifen sitrat uygulaması yapılan kontrol grupları (p=0.749) ve hormon gebe ile klomifen sitrat uygulaması yapılan gebe grupları (p=0.522) arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark yoktu. Ancak hormon uygulaması yapılan deneklerle klomifen sitrat uygulaması yapılan deneklerin (p=0.006) Graaf çapları anlamlı olarak birbirinden farklıydı. Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplar değerlendirildiğinde, gruplar arası anlamlı bir fark bulunamadı (p=0.180, p=0.565). Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplar karģılaģtırıldığında ise anlamlı bir fark belirlenemedi (kontrol için p=1; hormon-klomifen sitrat için p=0.121, gebeler için p=0.439). Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplar arasında primordiyal follikül sayısında anlamlı bir fark yoktu (p= ve p= 0.802). Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplar karģılaģtırıldığında ise anlamlı bir fark belirlenemedi (kontrol için p=0.936; hormon-klomifen için p=0.936, gebeler için p=0.575). Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplar arasında sekonder follikül sayısında anlamlı bir fark görülmedi (p= ve p= 0.582). 64

78 Hormon ve klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplar karģılaģtırıldığında ise yine anlamlı bir fark belirlenemedi (kontrol için p=0.422; hormon-klomifen sitrat için p=0.258, gebe için p=0.808). 65

79 RESİMLER Resim 1: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryum dokusunda gelişim aşamalarındaki folliküller ve oositlerdeki PCNA tutulumu izleniyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (SF): Sekonder follikül, (Ç): Çekirdek, (O): Oosit, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri (İmmünperoksidaz-HematoksilenX100). 66

80 Resim 2A,B: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryum dokusunda; gelişen foliküllerde oosit çekirdeği düzeyinde kuvvetli olmakla birlikte, sekonder folikülden itibaren azalan PCNA immünreaktivitesi izleniyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (TKP): Tek sıralı primer follikül, (Ç): Çekirdek, (O): Oosit, (G): Granüloza hücreleri (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX400, BX400). 67

81 Resim 3: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait kontrol ovaryum dokusunda, antrumu belirgin sekonder folliküllerde oositteki PCNA tutulumunun belirgin olarak azaldığı görülüyor. (O): Oosit, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 68

82 Resim 4A,B,C: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda sekonder folliküllerde oosit çekirdek tutulumunun diğer folliküllere karşın az olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (O): Oosit, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100, CX100). 69

83 Resim 5A,B: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda PCNA immünreaktivitesinin özellikle çekirdek düzeyinde ve granüloza hücrelerinde yaygın olduğu dikkati çekiyor. (TKP): Tek sıralı primer follikül, (Ç): Çekirdek, (O): Oosit, (G): Granüloza hücreleri (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 70

84 Resim 6A,B: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda yaygın PCNA immünreaktivitesi görülüyor. (O): Oosit, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX400, BX400). 71

85 Resim 7A,B,C,D: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında çeşitli gelişim evrelerindeki folliküller ve korpus luteumda PCNA immünreaktivitesi görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (O): Oosit, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (ZP): Zona pellusida, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (Ç): Çekirdek, (KL): Korpus luteum (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100, CX100, DX100). 72

86 Resim 8A,B: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA immünreaktivitesinin çekirdek düzeyinde son derece belirgin olduğu görülüyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (Ç): Çekirdek, (O): Oosit, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX400, BX400). 73

87 Resim 9: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyamasında; oosit çekirdeğinde ve granuloza hücrelerinde belirgin tutulum izleniyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 74

88 Resim 10A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusunda PCNA tutulumunun doku genelinde hormon kontrol grubuna eşdeş olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (ZP): Zona pellusida, (O): Oosit (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100,BX100). 75

89 Resim 11A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusunda yapılan PCNA boyamasında; çekirdek tutulumunun sekonder folikülde primer foliküllere karşın kuvvetli olduğu ayırt ediliyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (ZP): Zona pellusida, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (TKP): Tek sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400,BX400). 76

90 Resim 12: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokularında PCNA immünreaktivitesinin tüm folliküllerde, atretik olanlarda stromada ve korpus luteumda son derece az düzeyde olduğu dikkati çekiyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (SF): Sekonder follikül, (AF): Atretik follikül, (S): Stroma, (KL): Korpus luteum, (Ç): Çekirdek (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X100). 77

91 Resim 13A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokularında büyük büyültmeli resimlerde, granüloza hücrelerinde ve çekirdek düzeyinde PCNA tutulumunun az olduğu görülürken, oositte belirgin bir tutulum izlenmiyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (Ç): Çekirdek, (PF): Primordiyal follikül, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 78

92 Resim 14A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokularında PCNA boyamasında; çok sıralı primer folliküllerde birden fazla oositin varlığı dikkati çekiyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum(An), (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 79

93 Resim 15A,B,C: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyamasında tutulumun tüm folliküllerde granüloza ve teka interna hücreleri düzeyinde olduğu ayırt ediliyordu. (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (KL): Korpus luteum, (PF): Primordiyal follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100, CX100). 80

94 Resim 16A,B,C: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA immünreaktivitesinin özellikle çekirdek düzeyinde belirgin olduğu görülürken, gelişen foliküllerde iki oositin varlığı ayırt ediliyor. (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (TKP): Tek sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400, CX400). 81

95 Resim 17A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryumlarında PCNA boyamasında tutulumun oosit, granuloza ve teka interna hücrelerinde belirgin olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, teka interna hücreleri(ti), oosit(o), çekirdek(ç), çok sıralı primer follikül(çkp), zona pellusida(zp). (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 82

96 Resim 18: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarında c-fos tutulumunun, tüm folliküllerde oosit sitoplazması, granüloza hücreleri ve teka interna hücrelerinde olduğu görülüyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (SF): Sekonder follikül, (An) Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X100). 83

97 Resim 19A,B: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarında c-fos immünreaktivitesinin çekirdek ve sitoplazma düzeyinde, granüler şekilde ve çoğunlukla orta dereceli olduğu ilgiyi çekiyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 84

98 Resim 20: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryumlarında c-fos boyamasında daha büyük büyültmelerde de tutulumun granüler şekilde ve orta dereceli olduğu izleniyor. (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek (İmmünperoksidaz- Hematoksilen X400). 85

99 Resim 21A,B: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda c-fos boyamasında tutulumun bir önceki gruba karşın doku genelinde biraz daha arttığı görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX100, BX100). 86

100 Resim 22A,B: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda c-fos immünreaktvitesinin daha büyük büyültmelerde çekirdek ile sitoplazma düzeyinde yaygın olduğu ayırt ediliyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ZP): Zona pellusida, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 87

101 Resim 23A,B: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda c-fos immünreaktivitesinin diğer gruplara karşın daha özgün olduğu dikkati çekiyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (ZP): Zona pellusida, (AF): Atretik follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). 88

102 Resim 24: : Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda c-fos tutulumunun çekirdek ve sitoplazmada granüler halde olduğu izleniyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (PF): Primordiyal follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 89

103 Resim 25: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda c-fos boyamasında, sekonder folllikülde oosit ve granuloza hücrelerinde belirgin tutulum izleniyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri, (O): Oosit, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 90

104 Resim 26: Hormon uygulaması yapılan gruplara ait gebe ovaryum dokusunda daha büyük büyültmelerde, çekirdek ve oosit düzeyinde belirgin c-fos tutulumu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 91

105 Resim 27: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusundaki c-fos imünreaktivitesinin doku genelinde hormon kontrol grubuna eşdeş olduğu izleniyor. (SF): Sekonder follikül, (Ç): Çekirdek, (O): Oosit (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X100). 92

106 Resim 28: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyamasında tutulumun çekirdek ve sitoplazma düzeyinde çoğunlukla orta dereceli gözlemlenmesi ilgiyi çekiyor. (O): Oosit, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (G): Granüloza hücreleri (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 93

107 Resim 29: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol grubu ovaryum dokusundaki c-fos immünreaktivitesi daha büyük büyültmelerde incelendiğinde tutulumun oositte yaygın ve granüler şekilde olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An(: Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400) 94

108 Resim 30A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda c-fos immünreaktivitesinin doku genelinde stromada daha belirgin olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ZP): Zona pellusida, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (Tİ): Teka interna hücreleri (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). 95

109 Resim 31: Klomifen sitrat uygulaması yapılan grup ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyamasında granuloza hücrelerinde tutulumun az yoğun olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ZP): Zona pellusida, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (Tİ): Teka interna hücreleri, (TKP): Tek sıralı primer follikül, (PF): Primordiyal follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 96

110 Resim 32: : Klomifen sitrat uygulaması yapılan grup ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyamasında tutulumun hormon uygulaması yapılan gruba karşın az olduğu izleniyor. (O): Oosit, (G): Granüloza hücreleri, (An): Antrum (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 97

111 Resim 33A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda, doku genelinde folliküllerde c-fos tutulumunun belirgin olarak arttığı ve granüloza hücrelerinde, oosit ile teka interna hücrelerinde yaygınlaştığı ayırt ediliyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ZP): Zona pellusida, (Tİ): Teka interna hücreleri, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX100, BX100). 98

112 Resim 34: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyamasında tutulumun stromada belirginleştiği görülüyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 99

113 Resim 35A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda yapılan c-fos boyamasında tutulumun sitoplazmada ve granüler şekilde olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ZP): Zona pellusida (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 100

114 Resim 36: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında korpus luteum, atretik ve gelişen folliküllerde ortadan zayıfa değişen tutulum gözlemleniyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (AF): Atretik follikül, (KL): Korpus luteum (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X100). 101

115 Resim 37A,B: Hormon uygulaması yapılan gruba ait kontrol ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında büyük büyültmelerde foliküllerde zayıftan ortaya değişen tutulum izleniyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 102

116 Resim 38: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında; immünreaktivitenin kontrol grubuna eşdeş olduğu dikkati çekiyor. (SF): Sekonder follikül, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (KL): Korpus luteum (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X40). 103

117 Resim 39: : Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında; tek ve çok sıralı primer foliküllerde tutulumun zayıf-orta dereceli olduğu görülüyor. (TKP): Tek sıralı primer follikül, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (O): Oosit, (G): Granüloza hücreleri (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 104

118 Resim 40: Hormon uygulaması yapılan gruba ait ovaryum dokusunda büyük büyültmelerde oosit ve çekirdekteki zayıf LIF tutulumu izleniyor (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 105

119 Resim 41: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe grubu ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında, doku genelinde bazı folliküllerde diğer gruplara karşın tutulumun biraz daha yaygın olduğu ilgiyi çekiyor. (SF): Sekonder follikül, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (KL): Korpus luteum (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X40). 106

120 Resim 42A,B: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında; tek ve çok sıralı primer foliküllerde bir önceki gruba karşın tutulumun biraz daha arttığı görülüyor. (TKP): Tek sıralı primer follikül, (SF): Sekonder follikül, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (G): Granüloza hücreleri, (Tİ): Teka interna hücreleri (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX400, BX400). 107

121 Resim 43: Hormon uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda sekonder folikülde ve oositteki LIF immünreaktivitesi izleniyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Tİ): Teka interna hücreleri (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 108

122 Resim 44A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında tutulumun hormon uygulaması yapılan grubun kontrol grubuyla eşdeş olduğu görülüyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (KL): Korpus luteum (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX100, BX100). 109

123 Resim 45A,B,C: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait kontrol ovaryum dokusunda; primordiyal, çok sıralı primer ve sekonder foliküllerde LIF immünreaktivitesinin son derece zayıf olduğu izleniyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (PF): Primordiyal follikül (İmmünperoksidaz- Hematoksilen AX400, BX400, CX400). 110

124 Resim 46A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda, LIF immünreaktivitesinin korpus luteum hücrelerinde biraz daha çok olduğu dikkati çekiyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (TKP): Tek sıralı primer follikül, (KL): Korpus luteum, (AF): Atretik follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100). 111

125 Resim 47A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruplara ait ovaryum dokusunda yapılan LIF boyamasında, sekonder folliküllerde oositi çevreleyen ilk sıra hücrelerde tutulumun biraz daha arttığı izleniyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Ç): Çekirdek, (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (TKP): Tek sıralı primer follikül (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX400, BX400). 112

126 Resim 48A,B: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda LIF immünreaktivitesinin diğer gruplara karşın artmış olması ilgiyi çekiyor. (SF): Sekonder follikül, (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (KL): Korpus luteum (İmmünperoksidaz-Hematoksilen AX100, BX100) 113

127 Resim 49: : Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda LIF tutulumunun oosit sitoplazmasında az yoğun olduğu izleniyor. (ÇKP): Çok sıralı primer follikül, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Tİ): Teka interna hücreleri (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 114

128 Resim 50: Klomifen sitrat uygulaması yapılan gruba ait gebe ovaryum dokusunda; sekonder folikülde granüloza hücrelerinde ve teka interna hücrelerinde LIF immünreaktivitesinin, oosite karşın biraz daha fazla olduğu görülüyor. (An): Antrum, (G): Granüloza hücreleri, (O): Oosit, (Tİ): Teka interna hücreleri (İmmünperoksidaz-Hematoksilen X400). 115