therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı

Transkript

1 Ağustos 2016 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı Sürüm 2 24 İn vitro tanı amaçlı kullanım için Rotor-Gene Q MDx cihazları ile birlikte kullanım içindir QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Birleşik Krallık R TR Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Örnek ve Test Teknolojileri QIAGEN herhangi bir biyolojik örneğin içeriğinin izolasyonunu ve tespitini sağlayan yenilikçi örnek ve test teknolojilerinin öncü sağlayıcısıdır. Gelişmiş yüksek kaliteli ürünlerimiz ve hizmetlerimiz örnekten sonuca başarı sağlar. QIAGEN şu standartları belirler: DNA, RNA ve proteinlerin saflaştırılması Nükleik asit ve protein ölçümleri mikrorna araştırması ve RNAi Örnek ve test teknolojilerinin otomasyonu Misyonumuz, üstün başarı ve önemli buluşlar elde etmenizi sağlamaktır. Daha fazla bilgi için, adresini ziyaret edin.

3 İçindekiler Kullanım Amacı 5 Özet ve Açıklama 5 Prosedür Prensibi 7 Sağlanan Malzemeler 10 Kit içeriği 10 Gerekli Olan Ancak Sağlanmayan Malzemeler 11 Uyarılar ve Önlemler 12 Güvenlik Bilgileri 12 Genel önlemler 12 Reaktifi Saklama ve Kullanma 13 Numune Kullanımı ve Saklanması 14 Prosedür 15 DNA ekstraksiyonu ve hazırlanması 15 Protokol: Örnek değerlendirmesi 16 Protokol: EGFR mutasyon tespiti 26 Sonuçların Yorumlanması (Otomatik) 37 Rotor-Gene Q therascreen EGFR Test Paketi işaretleri 38 Sorun giderme kılavuzu 45 Kalite Kontrol 46 Sınırlamalar 46 Performans Özellikleri 47 Analitik Performans 47 Boş örnek sınırı (LOB), çalışma aralığı ve eşik değerler 47 DNA girişinin CT değerlerine etkisi 48 Çapraz reaktivite 48 Doğruluk: Analitik referans yöntemi ile karşılaştırma 48 Tespit sınırı (LOD) değerleri 49 Etkileşim 51 Yeniden üretilebilirlik 51 Klinik Performans 54 Klinik sonuç verileri - GIOTRIF 54 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016 3

4 Klinik sonuç verileri IRESSA 56 Referanslar 58 Semboller 60 Ek A: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Manuel Protokol 61 Genel bilgiler 61 Protokol: Sıcaklık profili oluşturma 61 Prosedür (Manuel) 69 Protokol: Örnek değerlendirme (manuel) 69 Protokol: EGFR mutasyon tespiti (manuel) 69 Protokol: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q kurulumu 70 Sonuçların Yorumlanması (Manuel) 75 Yazılım analiz ayarları 75 Örnek değerlendirme veri analizi 76 EGFR mutasyon tespiti veri analizi 77 Ek B: therascreen EGFR CE Test Paketinin kurulumu 83 İletişim Bilgileri 85 Sipariş Bilgileri 86 4 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

5 Kullanım Amacı therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, EGFR genindeki 29 somatik mutasyonun tespiti için in vitro tanı amaçlı bir testtir. Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) hastalarından elde edilen tümör örneklerinde mutasyon durumunun nitel değerlendirmesini sağlar. Sonuçların EGFR tirozin kinaz inhibitörleriyle tedaviden yararlanabilecek NSCLC'li hastaların belirlenmesinde klinisyene yardımcı olması amaçlanmıştır. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, formalinle fikse edilmiş, parafine gömülmüş (FFPE) NSCLC hastalarının tümör dokusundan alınan DNA örneklerini test eder ve Rotor-Gene Q MDx cihazında çalıştırılır. Profesyonel bir laboratuvar ortamında eğitimli personel tarafından kullanım içindir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, in vitro tanı amaçlı kullanım içindir. Özet ve Açıklama EGFR onkojenindeki mutasyonlar, insan kanserlerinde görülür (1, 2). Bu mutasyonların varlığı, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hastalarına (NSCLC) uygulanan bazı tirozin kinaz inhibitörleriyle (TKI) tedavilerine yanıt alınamaması ile ilişkilidir (3 8). EGFR onkojenindeki bu tür mutasyonlar, NSCLC'li genel hasta popülasyonunda ABD, Avrupa veya Avustralyalı hastalarda yaklaşık %10 ve Japonya ve Tayvanlı hastalarda %30'a kadar bir sıklıkta mevcuttur (1, 2, 9). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, Rotor-Gene Q MDx cihazında gerçekleştirilen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak kanserle ilişkili EGFR genindeki 29 mutasyonun tespiti için kullanıma hazır bir kittir. Scorpions (10) ve ARMS (Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi) (11) teknolojilerini kullanan therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, EGFR onkojenindeki 18, 19, 20 ve 21 kodonlarında yabani tip genomik DNA arka planına kıyasla görülen 29 mutasyonun tespit edilmesini sağlar (Tablo 1). Özetle, Ekson 19'daki 19 delesyon (19 delesyonun herhangi birinin varlığını tespit eder fakat aralarındaki farkı ayırt etmez) Ekson 20'deki 3 insersiyon (3 insersiyondan herhangi birinin varlığını tespit eder fakat aralarındaki farkı ayırt etmez) G719X (G719S, G719A veya G719C varlığını tespit eder fakat aralarındaki farkı ayırt etmez) S768I T790M L858R L861Q therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016 5

6 Kullanılan yöntemler oldukça seçici olup mevcut DNA'nın toplam miktarına bağlı olarak yabani tip genotip DNA'nın yapısındaki mutasyona uğramış DNA'nın düşük yüzdesinin tespitini mümkün kılar. Seçicilik ve tespit sınırları boya sonlandırmalı dizileme gibi teknolojilerden daha üstündür. Tablo 1. Mutasyon listesi ve COSMIC tanımları Ekson Mutasyon COSMIC* ID Baz değişimi 18 G719A G>C G719S G>A G719C G>T 19 Delesyonlar _2255>T _2258>CA _2252>GCA _2248>GC _2252>AAT _2251del _2247del _2253del _2254del _2251del _2255del _2249del _2250del _2253del _2256del _2254del _2257del _2248TTAAGAGAAG>C _2251>C * COSMIC: Kanserde somatik mutasyonlar kataloğu: Tablonun devamı bir sonraki sayfada 6 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

7 Tablo 1. Devamı Ekson Mutasyon COSMIC* ID Baz değişimi 20 S768I G>T İnsersiyonlar _2308insGCCAGCGTG _2311insGGT _2320insCAC T790M C>T 21 L858R T>G L861Q T>A * COSMIC: Kanserde somatik mutasyonlar kataloğu: Prosedür Prensibi therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, 8 adet farklı PCR amplifikasyon reaksiyon karışımından oluşur: EGFR onkojeninin 18, 19, 20 ve 21. eksonundaki 7 adet mutasyon spesifik reaksiyon ve 2. eksondaki yabani tip kontrol. Kitin ana bileşenleri aşağıda açıklanmaktadır. ARMS Allel veya mutasyona özgü amplifikasyon ARMS (Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi) yöntemi kullanılarak elde edilir. Taq DNA polimeraz (Taq) PCR primerinin 3' ucundaki eşleşen ve eşleşmeyen bölgeyi ayırt etmekte etkilidir. Spesifik mutasyona uğramış diziler, dizilerin çoğunun mutasyon taşımadığı örneklerde bile seçici olarak çoğaltılır. Primer tam olarak eşleştiğinde, amplifikasyon tam verimlilikle ilerler. 3' baz eşleşmesi olmadığında, yalnızca düşük seviyeli yapı amplifikasyonu oluşur. Scorpions Amplifikasyonun tespiti Scorpions primerler kullanılarak gerçekleştirilir. Scorpions primerler bir proba kovalent olarak bağlı PCR primerini içeren iki işlevli moleküllerdir. Bu probdaki florofor, probla da birleştirilmiş olan floresanı azaltan baskılayıcı molekülle etkileşir. Prob, PCR esnasında amplikona bağlandığında, florofor ve baskılayıcı molekül ayrılır, bu da floresan ışımanın belirgin şekilde yükselmesine yol açar. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016 7

8 Kit formatı therascreen EGFR RGQ PCR Kitinde 8 test bulunur: 1 kontrol testi (CTRL) 7 mutasyon testi Tüm reaksiyon karışımları, karboksifloresin (FAM ) ile işaretli hedefleri tespit etmek amacıyla kullanılan reaktifleri ve heksaklorofloresin (HEX ) ile işaretli internal kontrol testini içerir. İnternal kontrol testi yanlış negatif sonuçlara yol açabilen inhibitörlerin varlığını tespit edebilir. FAM amplifikasyonu internal kontrol amplifikasyonunu geçebilir ve internal kontrolün amacı FAM amplifikasyonu olmadığında bunun doğru negatif sonuç olduğunu ve başarısız PCR reaksiyonu olmadığını basit şekilde göstermektir. Testler therascreen EGFR RGQ PCR Kiti iki adımlı bir prosedürden oluşur. İlk adımda, örnekteki total çoğaltılabilir EGFR DNA'yı değerlendirmek için kontrol testi gerçekleştirilir. İkinci adımda, hem mutasyon hem de kontrol testleri mutant DNA'nın olup olmadığını belirlemek için gerçekleştirilir. Kontrol testi FAM ile işaretli kontrol testi örnekteki total çoğaltılabilir EGFR DNA'yı değerlendirmek için kullanılır. Kontrol testi EGFR geninin ekson 2 bölgesini çoğaltır. Primerler ve Scorpions probu, bilinen herhangi bir EGFR polimorfizmini önlemek için tasarlanmıştır. Mutasyon testleri Her bir mutasyon testi yabani tip DNA'nın ve spesifik mutant DNA'nın ayırt edilmesi için FAM işaretli Scorpions probu ve ARMS primeri içerir. Kontroller Not: Tüm deneysel çalışmalar pozitif ve negatif kontrolleri içermelidir. Pozitif kontrol Her bir çalışma 1 8 tüplerindeki pozitif bir kontrolü içermelidir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti pozitif kontrol reaksiyonunda şablon olarak kullanılacak EGFR Pozitif Kontrolünü (PC) içerir. Pozitif kontrol sonuçları kitin belirtilen kabul edilebilirlik kriterleri içinde çalıştığından emin olmak için değerlendirilir. Negatif kontrol Her bir çalışma 9 16 tüplerindeki bir negatif kontrolü ( şablonsuz kontrol : NTC) içermelidir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti şablonsuz kontrol için şablon olarak kullanılacak NTC suyu içerir. Şablonsuz kontrol, çalışma hazırlığı sırasında herhangi bir potansiyel kontaminasyonu belirlemek ve internal kontrol reaksiyon performansını değerlendirmek için kullanılır. 8 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

9 İnternal kontrol reaksiyon değerlendirmesi Her bir reaksiyon karışımı hedef reaksiyona ek olarak internal kontrol (IC) içerir. Hata, yanlış sonuçlara yol açabilecek inhibitör varlığının olabileceğini veya bu tüp için operatör çalışma hazırlığı hatasının oluşmuş olduğunu gösterir. IC, EGFR bağımsız bir oligonükleotid hedef sırası, etiketlenmemiş bir primer ve kontrol ve mutasyon reaksiyon karışımlarındaki FAM etiketli Scorpions primerinden ayırt etmek için HEX ile etiketlenmiş bir Scorpions primer kullanır. Üretilen IC CT (HEX) belirtilen aralığın dışında kalabileceğinden FAM amplifikasyonu IC amplifikasyonunu geçebilir. FAM sonuçları yine de bu örnekler için geçerlidir. Örnek değerlendirmesi Örnekteki total çoğaltılabilir EGFR DNA'yı değerlendirmek için therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile sağlanan Kontrol Reaksiyon Karışımını (tüp CTRL) kullanmanızı önemle öneririz. Kontrol testi EGFR geninin ekson 2 bölgesini çoğaltır. Örneklerin, pozitif kontrol olarak EGFR PC ve şablonsuz kontrol için şablon amaçlı su kullanılarak yalnızca kontrol testi ile ayarlanmasını öneririz. Not: DNA değerlendirmesi PCR'ye dayalı olmalıdır ve absorbans okumalarına dayalı miktar ölçümünden farklılık gösterebilir. Ek Kontrol Reaksiyon Karışımı (tüp CTRL), therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile analiz edilmeden önce örnekteki DNA'nın nitelik ve nicelik bakımından değerlendirilmesi için sağlanır. Platform ve yazılım therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, Rotor-Gene Q MDx cihazları ile birlikte kullanım için özel olarak tasarlanmıştır. Rotor-Gene Q MDx cihazı, therascreen EGFR CE Test Paketi tarafından farklı döngü parametreleri (yani çalışmalar ) için programlanmıştır. therascreen EGFR CE Test Paketi iki şablondan oluşur: therascreen EGFR CE Control Run Locked Template (therascreen EGFR CE Kontrol Çalışması Kilitli Şablon) (örnek incelemesi için) ve therascreen EGFR CE Locked Template (therascreen EGFR CE Kilitli Şablon) (EGFR mutasyonlarının tespiti için). Bu şablonlar, PCR çalışma parametreleri içerir ve sonuçları hesaplar. therascreen EGFR RGQ PCR Kitini açık modda Rotor-Gene Q yazılım sürümü 2.3 ile de kullanmak mümkündür (örn. Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Test Paketini kullanmadan). Ayrıntılar için, bkz. Ek A: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Manuel Protokol, sayfa 61. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016 9

10 Sağlanan Malzemeler Kit içeriği therascreen EGFR RGQ PCR Kit (24) Katalog no Reaksiyon sayısı 24 Renk Tanım Tüp Kimliği Hacim Kırmızı Mor Turuncu Pembe Yeşil Sarı Gri Mavi Bej Nane Yeşili Beyaz Beyaz Control Reaction Mix (Kontrol Reaksiyon Karışımı) T790M Reaction Mix (T790M Reaksiyon Karışımı) Deletions Reaction Mix (Delesyon Bölgeleri Reaksiyon Karışımı) L858R Reaction Mix (L858R Reaksiyon Karışımı) L861Q Reaction Mix (L861Q Reaksiyon Karışımı) G719X Reaction Mix (G719X Reaksiyon Karışımı) S768I Reaction Mix (S768I Reaksiyon Karışımı) Insertions Reaction Mix (İnsersiyon Bölgeleri Reaksiyon Karışımı) EGFR Positive Control (EGFR Pozitif Kontrol) Taq DNA Polymerase (Taq DNA Polimeraz) Şablonsuz Kontrol İçin Nükleaz İçermeyen Su Seyreltme İçin Nükleaz İçermeyen Su therascreen EGFR RGQ PCR Kit Handbook (İngilizce El Kitabı) 1 CTRL µl 2 T790M 600 µl 3 Del 600 µl 4 L858R 600 µl 5 L861Q 600 µl 6 G719X 600 µl 7 S768I 600 µl 8 Ins 600 µl 9 PC 300 µl Taq 2 80 µl NTC Dil. 1,9 ml 1,9 ml 1 10 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

11 Gerekli Olan Ancak Sağlanmayan Malzemeler Kimyasallar ile çalışırken, her zaman uygun laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi için, ürün sağlayıcısından edinebileceğiniz, uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. Reaktifler DNA extraction kit (DNA ekstraksiyon kiti) (bkz. DNA ekstraksiyonu ve hazırlanması, sayfa 15) Sarf malzemeleri ve genel laboratuvar ekipmanı Örnek hazırlığı için özel pipetler* (ayarlanabilir) PCR ana karışımı için özel pipetler* (ayarlanabilir) Şablon DNA'nın dağıtımı için özel pipetler* (ayarlanabilir) DNAse, RNAse ve DNA içermeyen filtreli pipet uçları (çapraz kontaminasyonu önlemek için, aerosol bariyerli pipet uçları önerilir) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml, 72 kuyulu rotor ile kullanım için (0,1 ml'lik Şerit Tüpler ve Kapakları) (kat. no veya ) Ana karışımları hazırlamak için DNAse, RNAse ve DNA içermeyen mikrosantrifüj tüpleri Loading Block ml Tubes (Yükleme Bloğu 72 0,1 ml'lik Tüp), tek kanallı pipet ile manuel reaksiyon kurulumu için alüminyum blok (kat. no ) Termomikser*, ısıtmalı orbital inkübatör*, ısıtma bloğu* veya 90 C'de inkübasyon sağlayabilen su banyosu* 2 ml'lik reaksiyon tüpleri için rotora sahip masaüstü santrifüj* Vorteks karıştırıcı* PCR ekipmanı Yeşil ve sarı döngü (sırasıyla FAM ve HEX tespiti) için floresan kanallı Rotor-Gene Q MDx cihazı* Rotor-Gene Q yazılımı sürüm 2.3 Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Test Paketi CD'si sürüm (kat. no ) Not: Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Test Paketi yazılımı, Rotor- Gene Q yazılım sürümü 2.3 gerektirir. * Cihazların ve ekipmanın üreticinin önerilerine göre kontrol ve kalibre edilmiş olduğundan emin olun. Bazı ülkelerde, mevcutsa, üretim tarihi Mayıs 2011 veya sonrası olan Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazı kullanılabilir. Üretim tarihi bilgisi, cihazın arkasındaki seri numarasından edinilebilir. Seri numarası, mm ibaresinin basamak olarak üretim ayını, yy ibaresinin üretim yılının son iki basamağını ve nnn ibaresinin benzersiz cihaz tanımlayıcıyı gösterdiği mmyynnn biçimindedir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

12 Uyarılar ve Önlemler İn vitro tanı amaçlı kullanım için Güvenlik Bilgileri Kimyasallar ile çalışırken, her zaman uygun laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi için lütfen ürün sağlayıcısından edinebileceğiniz, uygun güvenlik veri sayfalarına (SDSs) başvurun. Bunlar, her bir QIAGEN kiti ve kit bileşenlerine ait SDS'yi bulabileceğiniz, görüntüleyebileceğiniz ve yazdırabileceğiniz adresinde çevrimiçi olarak uygun ve kompakt PDF biçiminde mevcuttur. Rotor-Gene Q cihazı ile ilgili güvenlik bilgileri için, cihazla birlikte verilen kullanım kılavuzuna bakın. Örneği ve test atığını yerel güvenlik düzenlemelerinize göre atın. Genel önlemler Her zaman aşağıdakilere dikkat edin: Test, FFPE NSCLC örnekleriyle kullanım içindir. Pozitif materyalleri (numuneler ve pozitif kontrol) diğer reaktiflerden ayrı olarak saklayın ve çıkartın, bunları reaksiyon karışımına mekansal olarak ayrı bir yerde ekleyin. PCR tüplerinin sentetik kontrol materyali ile kontaminasyonunun önlenmesine çok dikkat edin. Reaksiyon karışımının hazırlanması ve DNA şablonunun eklenmesi için ayrı, özel pipetlerin kullanılması önerilir. Reaksiyon karışımının hazırlanması ve dağıtılması şablonun eklendiği farklı bir alanda yapılmalıdır. Rotor-Gene Q tüpleri PCR çalışması bittikten sonra açılmamalıdır. Bu PCR sonrası ürünler ile laboratuvar kontaminasyonunu engellemek içindir. Tüm kimyasallar ve biyolojik materyaller potansiyel olarak tehlikeli maddedir. Numuneler ve örnekler potansiyel olarak bulaşıcıdır ve bunlara biyotehlikeli madde olarak davranılmalıdır. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti için reaktifler en uygun şekilde seyreltilmiştir. Performans kaybı yaşanabileceği için, reaktifleri daha fazla seyreltmeyin. Yanlış negatif riskini artıracağı için 25 µl'den az reaksiyon hacimlerini (reaksiyon karışımı ve örnek) kullanmayın. therascreen EGFR RGQ PCR Kitindeki tüm reaktifler, yalnızca aynı therascreen EGFR RGQ PCR Kitinde verilen reaktiflerle birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Performansı etkileyebileceği için, therascreen EGFR RGQ PCR Kiti içindeki reaktifleri veya therascreen EGFR RGQ PCR Kitleri arasında reaktifleri değiştirmeyin. 12 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

13 Yalnızca therascreen EGFR RGQ PCR Kiti içinde verilen Taq DNA polimerazı (Taq tüpü) kullanın. Aynı veya başka tipte bir kitten alınan Taq DNA polimerazla veya başka bir sağlayıcıdan alınan Taq DNA polimerazla değiştirmeyin. Süresi dolmuş ve yanlış saklanmış bileşenleri kullanmayın. Not: Doğru örnek testi yapabilmek için yanlış örnek girişi, yükleme hataları ve pipetleme hatalarını ortadan kaldırma gibi durumlara karşı dikkatli olunmalıdır. Not: Reaktifler manuel kurulum için onaylanmıştır. Otomatik yöntem kullanılması bu cihazlardaki ölü hacimleri doldurmak için gerekli reaktiflere bağlı olarak olası reaksiyon sayısını azaltabilir. Reaktifi Saklama ve Kullanma therascreen EGFR RGQ PCR Kiti kuru buzda gönderilir ve ulaştığında donmuş halde olması gerekir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ulaştığında donmuş halde değilse, dış ambalajı nakliye esnasında açılmışsa veya paket içinde ambalaj notu, el kitabı veya reaktifler bulunmuyorsa, lütfen QIAGEN Teknik Servislerini veya yerel dağıtıcınızı arayın (arka kapağa bakın veya adresini ziyaret edin). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti teslim alınmasından hemen sonra -15 ila -30 C arasında sabit sıcaklıkta bir dondurucuda saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. Scorpions (tüm floresanla işaretlenen moleküller gibi) flor ışıldama bozulmasından veya performans kaybından kaçınmak için ışıktan korunmalıdır. Orijinal ambalajında önerilen saklama koşullarında saklandığında, kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Tekrarlanan dondurma ve çözdürme işlemlerinden kaçınılmalıdır. Maksimum 8 dondurma çözdürme döngüsü önerilir. Reaktifler, en az 1 ve en fazla 4,5 saat boyunca oda sıcaklığında (15 25 C) tutularak çözdürülmelidir. Reaktifler kullanıma hazır olduğunda, PCR reaksiyonları kurulabilir. Ana karışımları ve DNA örneğini içeren Rotor-Gene Q tüpleri hemen Rotor-Gene Q MDx cihazına yüklenebilir. PCR reaksiyonları kurulduktan sonra, çalıştırmaya kadar geçen toplam zaman: Oda sıcaklığında saklanıyorsa 7 saati geçmemelidir Not: Bu süreye, PCR kurulumu ve saklama dahildir. Buzdolabında saklanıyorsa (2 8 C), bu süre 18 saat olur Not: Bu süreye, PCR kurulumu ve saklama dahildir. Not: Optimal etkinlik ve performansın sağlanması için Scorpions (tüm floresanla işaretlenen moleküller gibi) flor ışıldama bozulmasından kaçınmak için ışıktan korunmalıdır. Not: therascreen EGFR RGQ PCR Kitindeki reaktiflerin optimal kullanımını sağlamak için, örnekler toplu çalışılmalıdır. Örnekler tek tek test edilirse, daha therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

14 fazla reaktif kullanılır ve therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile test edilebilecek örneklerin sayısı azalır. Numune Kullanımı ve Saklanması Not: Tüm örneklere potansiyel enfeksiyöz madde olarak bakılmalıdır. Örnek materyali, FFPE dokusundan alınmış insan genomik DNA'sı olmalıdır. Numuneler, numune kalitesini sağlamak için standart patoloji metodolojisine göre nakledilmelidir. Tümör örnekleri homolog değildir ve tümör örneğinden elde edilen veri aynı tümörden alınan diğer kısımlarla uyumlu olmayabilir. Ayrıca, tümör örnekleri tümör olmayan doku da içerebilir. Tümör olmayan dokudan elde edilen DNA'nın therascreen EGFR RGQ PCR Kiti aracılığıyla tespit edilen mutasyonlarını içermesi beklenmez. Doku örneklerinin DNA ekstraksiyonuna hazırlanması için: Standart malzemeler ve yöntemler kullanarak, doku numunesini %10 renksiz tamponlu formalin (NBF) içine yerleştirin ve parafine gömün. Mikrotom kullanarak parafin blokundan 5 µm'lik seri kesitler kesin ve bunları cam slaytlar üzerine yerleştirin. Hematoksilin ve Eozin (H&E) ile boyanmış kesiti tümör varlığı açısından doğrulamak için eğitimli bir görevliden (örn. bir patolog) yardım alın. Boyanan kesitler DNA ekstraksiyonu için kullanılmamalıdır. Tüm FFPE bloklarını ve slaytlarını oda sıcaklığında (15 25 C) saklayın. Slaytlar, DNA ekstraksiyonu öncesinde oda sıcaklığında 1 aya kadar saklanabilir. 14 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

15 Prosedür DNA ekstraksiyonu ve hazırlanması Bu kit için performans özellikleri, QIAamp DSP DNA FFPE Doku Kiti ile alınmış DNA ile belirlenmiştir. İşlevsel olarak eşdeğer QIAamp DNA FFPE Doku Kiti (kat. no ) kullanıyorsanız, DNA ekstraksiyonu işlemini el kitabındaki talimatlara uygun şekilde ve aşağıdakileri dikkate alarak gerçekleştirin: QIAGEN parafin temizleme solüsyonunu kullanmayın. Yalnızca, QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook'ta (QIAamp DNA FFPE Doku Kiti El Kitabı) açıklanan ksilen/etanol parafin temizleme yöntemini kullanın. Gereken tüm adımlar için moleküler biyoloji sınıfı etanol* kullandığınızdan emin olun. Tüm doku alanını, her bir örnek için yeni bir neşterle kazıyarak 2 kesitten etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Proteinaz K sindirimi (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook'ta yer alan 11. adım), 56 C ± 3 C'de 1 saat ± 5 dakika süreyle gerçekleştirilmelidir. İnkübasyon (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook'ta yer alan 12. adım), 90 C ± 3 C'de 1 saat ± 5 dakika süreyle gerçekleştirilmelidir. QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook'ta açıklanan RNase adımını kullanmayın. Örnekler, QIAamp DNA FFPE Doku Kitindeki 120 µl elüsyon tamponu (ATE) içinde ayrıştırılmalıdır (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Handbook'ta yer alan 20. adım). Genomik DNA, alındıktan sonra 1 hafta boyunca 2 8 C sıcaklıkta, ardından kullanım öncesinde 8 haftaya kadar -15 ila -25 C sıcaklıkta saklanabilir. Not: therascreen EGFR RGQ PCR Kitindeki tüm testler kısa PCR ürünleri oluşturur. Ancak, therascreen EGFR RGQ PCR Kiti aşırı derecede fragmente olmuş DNA ile çalışmaz. * Metanol veya metiletilketon gibi diğer kimyasal maddeleri içeren denatüre alkol kullanmayın. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

16 Protokol: Örnek değerlendirmesi Bu protokol, otomatik örnek değerlendirmesi amacıyla Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Test Paketi ile ilgili therascreen EGFR CE Control Run Locked Template (therascreen EGFR CE Kontrol Çalışması Kilitli Şablon) kullanılarak örneklerdeki total çoğaltılabilir DNA'yı incelemek için kullanılır. Not: Manuel DNA örnek değerlendirmesi için, bkz. Ek A: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Manuel Protokol, sayfa 61. Başlamadan önce önemli noktalar Prosedüre başlamadan önce Genel önlemler, sayfa 12'yi okuyun. Protokole başlamadan önce Rotor-Gene Q MDx cihazı hakkında bilgi edinin. Cihaz kullanım kılavuzuna bakın. Taq veya Taq içeren herhangi bir karışımı enzimi etkisizleştirebileceği için vorteksle karıştırmayın. Ucun aşırı enzimle kaplanmasını engellemek için Taq'i pipet ucunu sıvı yüzeyin hemen altına yerleştirerek pipetle çekin. Mevcut Kontrol Reaksiyon Karışımı kullanılarak 24'e kadar örnek incelenebilir. Başlamadan önce yapılması gerekenler therascreen EGFR CE Test Paketi yazılımının, Rotor-Gene Q MDx cihazı ilk defa kullanılmadan önce yüklendiğinden emin olun (bkz. Ek B: therascreen EGFR CE Test Paketinin kurulumu, sayfa 83). Her kullanımdan önce, tüm reaktiflerin oda sıcaklığında en az 1 saat ve en fazla 4,5 saat boyunca tam olarak çözdürülmesi (15 25 C), 10 kez ters yüz edilerek karıştırılması ve içeriği tüpün altında toplamak için kısa süreli santrifüj edilmesi gerekir. Tüm örnekleri 10 kez ters yüz ederek karıştırın ve içeriği tüpün altında toplamak için kısa süreli santrifüj edin. Her kullanımdan önce Taq'in oda sıcaklığında (15 25 C) olduğundan emin olun. Enzimi tüpün altında toplamak için tüpü kısa süre santrifüj edin. Prosedür 1. Kontrol Reaksiyon Karışımını (CTRL), Şablonsuz Kontrol (NTC) için nükleaz içermeyen suyu ve EGFR Pozitif Kontrolü (PC) oda sıcaklığında (15 25 C) en az 1 saat ve en fazla 4,5 saat boyunca bekleterek çözdürün. Reaktifi çözdürme, PCR kurulumu ve çalışmayı başlatmadan önce saklama süreleri Tablo 2'de verilmiştir. 16 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

17 Tablo 2. Çözdürme süreleri, PCR kurulum süreleri ve saklama sıcaklıkları Çözdürme süresi Minimum Maksimum 1 saat 4,5 saat PCR kurulumu sonrası saklama sıcaklığı Oda sıcaklığı (15 25 C) Maksimum PCR kurulumu ve saklama süresi 7 saat 1 saat 4,5 saat 2 8 C 18 saat Not: PCR kurulumu oda sıcaklığında (15 25 C) gerçekleştirilir. Saklama ifadesi, PCR kurulumunun tamamlanması ile Rotor-Gene Q MDx cihazında PCR çalıştırılmasının başlangıcı arasında geçen süredir. Not: Taq'ı diğer reaktiflerle aynı anda oda sıcaklığına (15 25 C) getirin (bkz. Reaktifi Saklama ve Kullanma, sayfa 13). Enzimi tüpün altında toplamak için tüpü kısa süre santrifüj edin. 2. Reaktifler çözündüğünde, bölgesel tuz konsantrasyonlarını engellemek için reaktifleri 10 kez ters yüz ederek karıştırın ve ardından içeriği tüpün altında toplamak için kısa süreli santrifüj edin. 3. Tablo 3'teki hacimlere göre DNA örnekleri için yeterli miktarda Kontrol ana karışımı (Kontrol Reaksiyon Karışımı [CTRL] ve Taq), bir EGFR PC reaksiyonu ve bir NTC reaksiyonu için hazırlayın. PCR'ı kurmak için yeterli farkı sağlamak amacıyla reaktifleri 1 fazla örneğe göre ekleyin. Ana karışım örnek hariç PCR için gerekli bileşenlerin tümünü içerir. Tablo 3. Kontrol testi ana karışımının hazırlanması Bileşen Hacim Kontrol Reaksiyon Karışımı (CTRL) 19,5 µl (n + 1)* Taq DNA polimeraz (Taq) 0,5 µl (n + 1) Toplam hacim 20 µl/reaksiyon * n = reaksiyon sayısı (örnekler artı kontroller). PCR kurulumu için yeterli farkı sağlamak amacıyla fazladan bir örnek (n + 1) için yeterli miktarda ana karışım hazırlayın. n değeri 26'yı geçmemelidir (24 örnek artı 2 kontrol). Not: Ana karışımı hazırlarken, önce gerekli hacimde Kontrol Reaksiyon Karışımı ilgili tüpe eklenir, en son olarak Taq eklenir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

18 4. Ana karışımı yavaşça 10 kez yukarı aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın. Uygun sayıdaki şeritli tüpü Tablo 4'teki düzene uygun olarak yükleme bloğuna yerleştirin. Hemen 20 µl ana karışımı her bir PCR şerit tüpüne ekleyin. Kapaklar gerekinceye kadar plastik kap içinde tutulmalıdır. DNA örneği incelemesi için, Kontrol testi ana karışımı, bir PC tüpüne, bir NTC tüpüne ve her bir örnek için bir tüpe eklenmelidir. Tablo 4. DNA örneği değerlendirme testlerinin yükleme bloğundaki düzeni. Sayılar, yükleme bloğu içinde konumları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu belirtir. Test Konum Kontrol 1 [PC] Kontrol 2 [NTC] Kontrol Kontrol Kontrol Kontrol Kontrol Kontrol NTC tüpü için 2. konumdaki tüpe hemen 5 µl su ekleyin ve tüpü kapatın. 6. Örnek tüplerine (tüp konumları 3 26) her bir örnekten 5 µl ekleyin ve tüpleri kapatın konumdaki tüpe 5 µl EGFR PC ekleyin ve tüpü kapatın. NTC, örnekler ve PC'nin uygun tüplere doğru eklenmesini sağlamak için yükleme veya pipetleme hatasını önlemeye özen gösterin. Tüpleri Rotor Gene Q MDx cihazına yüklemek için yönü gösterecek şekilde tüplerin kapaklarını işaretleyin. 8. Tüm PCR tüplerinin kapakları kapatıldıktan sonra, örneğin tüm tüplere eklendiğinden emin olmak için örnek tüplerinin dolum seviyeleri ile ilgili olarak görsel kontrol gerçekleştirin. 9. Tüm PCR tüplerini 4 kere ters çevirerek örnekleri ve reaksiyon karışımlarını karıştırın. 18 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

19 10. PCR şerit tüplerini, Tablo 4'teki düzene göre 72 kuyulu rotordaki uygun konumlara yerleştirin. Rotor tamamen dolmamışsa, rotordaki tüm boş pozisyonları kapatılmış boş tüplerle doldurun. 11. Hemen 72 kuyulu rotoru Rotor-Gene Q MDx cihazına yerleştirin. Kilitleme halkasının (Rotor-Gene Q MDx cihazının aksesuarı) çalışma sırasında tüpleri sabitlemek için rotorun üstüne yerleştiğinden emin olun. Not: Manuel örnek değerlendirmesi kullanıyorsanız, bkz. Ek A: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Manuel Protokol, sayfa Rotor-Gene Q MDx cihazına bağlı bilgisayar masaüstündeki therascreen EGFR CE Control Run Locked Template (therascreen EGFR CE Kontrol Çalışması Kilitli Şablon) simgesine çift tıklayarak Rotor-Gene Q yazılımını başlatın (Şekil 1). Şekil 1. Kontrol çalışması için EGFR CE Kilitli Şablon simgesi (örnek değerlendirme). 13. Varsayılan olarak Setup (Kurulum) sekmesi açılır (Şekil 2). Kilitleme halkasının uygun şekilde takıldığını doğrulayın ve ardından Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Takılı) kutusunu işaretleyin. Rotor- Gene Q MDx cihazının kapağını kapatın. 1 2 Şekil 2. Setup (Kurulum) sekmesi (1) ve Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Takılı) kutusu (2). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

20 14. Lokal isimlendirme mevzuatınıza göre Run ID (Çalıştırma Kimliği) diyalog alanına çalıştırma kimliğini girin. Lokal isimlendirme mevzuatınıza göre Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanına örnek adını girin ve Enter tuşuna basın. Bunu yapmak, örnek adını aşağıdaki örnek listesine ekler ve örneğe bir Sample ID (Örnek Kimliği) (1, 2, 3, vb.) verir. Ek olarak, sağ taraftaki Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneli, örnek adını içerecek şekilde güncellenir (Şekil 3). Not: Alternatif olarak, *.smp (Rotor-Gene Q örnek dosyası) veya *.csv (virgülle ayrılan değerler) biçimleri, Import Samples (Örnekleri Al) düğmesi kullanılarak alınabilir. Örnek adları, bu yöntem kullanılarak otomatik şekilde doldurulur. Not: Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneline örnek adının eklendiğinden ve bu adın renk değişimi ile vurgulandığından, ayrıca örnek adının örnek konumunda bulunduğundan emin olun (Şekil 3). Not: 8 karakterden uzun örnek adları, Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) panelinde tamamıyla görüntülenmeyebilir Şekil 3. Run ID (Çalıştırma Kimliği) ve Sample Name (Örnek Adı) Girme (1 = Run ID (Çalıştırma Kimliği) diyalog alanı 2 = Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanı; 3 = Sample List (Örnek Listesi); 4 = Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneli; 5 = Import Samples (Örnekleri Al) paneli). 15. Tüm ilave örneklerin adını girmek için 14. adımı tekrarlayın (Şekil 4). Not: Bir örnek adını düzenlemek için, örnek listesinden Sample Name (Örnek Adı) seçeneğine tıklayın; seçilen örnek yukarıdaki Sample Name 20 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

21 (Örnek Adı) diyalog alanında görünür. Örnek adını, lokal isimlendirme mevzuatınıza göre düzenleyin ve güncellemek için Enter tuşuna basın Şekil 4. Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanına ek örnek adları girme (1 = Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanı; 2 = Sample List (Örnek Listesi); 3 = Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneli). 16. Tüm örnek adları girildiğinde doğru olduklarını kontrol edin. Gerekiyorsa Notes (Notlar) diyalog alanına ilave bilgiler girin ve Start Run (Çalışmayı Başlat) düğmesine tıklayın (Şekil 5). Not: Kullanılmayan bir rotor pozisyonu varsa bir Warning (Uyarı) belirir (Şekil 5) ve kullanıcıya, tüm kullanılmayan pozisyonların kapatılmış boş tüplerle doldurulması gerektiğini hatırlatır. Kullanılmayan rotor pozisyonlarının kapatılmış boş tüplerle doldurulmuş olduğunu kontrol edin ve ilerlemek için OK (Tamam) seçeneğine tıklayın. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

22 1 3 2 Şekil 5. Notes (Notlar) diyalog alanı (1), Start Run (Çalışmayı Başlat) düğmesi (2) ve kullanılmayan rotor pozisyonlarını bildiren Warning (Uyarı) (3). 17. Bir Save As (Farklı Kaydet) penceresi açılır. Uygun dosya adını seçin ve PCR çalışmasını seçili konuma *.rex çalışma dosyası olarak kaydedin. Save (Kaydet) düğmesine tıklayın (Şekil 6) Şekil 6. Save As (Farklı Kaydet) penceresi (1) (2 = File Name (Dosya Adı) ve Save as type (Tip olarak kaydet) alanları; 3 = Save (Kaydet) düğmesi). 22 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

23 18. PCR çalışması başlar. Not: Çalışma başladığında, Run Progress (Çalışma İlerlemesi) sekmesi açılarak sıcaklık takibi ve kalan çalışma süresi konusunda bilgi verir (Şekil 7). 1 Şekil 7. Run Progress (Çalışma İlerlemesi) sekmesi (1). 19. Çalışma bittiğinde, Analysis (Analiz) sekmesi açılır. Not: Analysis (Analiz) sekmesi açılmazsa, bu sekmeye tıklamalısınız (Şekil 8). Not: Hesaplama yönteminin bir açıklaması Sonuçların Yorumlanması (Otomatik) kısmında, sayfa 37 içinde sunulmuştur. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

24 1 2 Şekil 8. Analysis (Analiz) sekmesi (1) ve sonuç raporu (2 = Sample QC Result Table (Örnek QC Sonuç Tablosu)). 20. Kontrol sonuçları, Sample QC Result Table (Örnek QC Sonuç Tablosu) içinde aşağıdaki gibi raporlanır (Şekil 8). Çalışma kontrolleri (PC ve NTC, sırasıyla 1 ve 2 numaralı tüp pozisyonları). Sonuçlar kabul edilebilir aralıklar dahilindeyse, her biri Valid (Geçerli) olarak görüntülenir. Aksi halde Invalid (Geçersiz) bir sonuç görülür. Örnek kontrol reaksiyonu CT > 31,10; Invalid (Geçersiz) olarak görüntülenir. DNA miktarı mutasyon analizi için yetersiz. Örneği yeniden test edin. DNA miktarı halen yetersizse, mümkünse daha fazla tümör dokusu alın. Örnek kontrol reaksiyonu CT < 23,70; Invalid (Geçersiz) olarak görüntülenir. DNA yoğunluğu mutasyon analizi için fazla yüksek. Seyreltme Amaçlı Nükleaz İçermeyen Su (Dil.) ile seyreltin ve yeniden test edin. CT değeri 23,70 31,10 olacak şekilde seyreltme yapın. 1:1 oranında seyreltme yapılması, CT değerini yaklaşık 1,0 oranında artırır. Örnek kontrol reaksiyonu CT 23,70 31,10 (23,70 Kontrol CT 31,10) Valid (Geçerli) olarak görüntülenir. DNA yoğunluğu mutasyon analizi için uygundur. Not: Yeniden örnek alma veya seyreltme gerekirse, DNA yoğunluğunun kullanıma uygun olduğundan emin olmak için kontrol reaksiyonunu tekrarlayın. 24 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

25 21. Rapor dosyası oluşturmak için Report (Rapor) öğesine tıklayın. Report Browser (Rapor Tarayıcısı) penceresi açılır. Templates (Şablonlar) altından EGFR CE Analysis Report (EGFR CE Analiz Raporu) seçeneğini seçin ve Show (Göster) seçeneğine tıklayın (Şekil 9). Not: Raporları, Web Arşivleri formatında alternatif bir konuma kaydetmek için, her raporun sol üst köşesindeki Save As (Farklı Kaydet) düğmesine tıklayın Şekil 9. EGFR CE Analysis Report (EGFR CE Analiz Raporu) seçeneğinin belirlenmesi (1 = Report (Rapor) düğmesi; 2 = Report Browser (Rapor Tarayıcısı) penceresi; 3 = EGFR Analysis Report (EGFR Analiz Raporu); 4 = Show (Göster) düğmesi). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

26 Protokol: EGFR mutasyon tespiti Bu protokol EGFR mutasyonlarının tespiti içindir. Örnek, DNA örnek değerlendirmesini geçtiğinde, EGFR mutasyon testleri otomatik yazılım kullanılarak test edilebilir. Not: Manuel mutasyon tespiti için, bkz. Ek A: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Manuel Protokol, sayfa 61. Başlamadan önce önemli noktalar Prosedüre başlamadan önce Genel önlemler, sayfa 12'yi okuyun. Protokole başlamadan önce Rotor-Gene Q MDx cihazı hakkında bilgi edinin. Cihaz kullanım kılavuzuna bakın. Bir örnek, DNA örnek incelemesinde başarılı olduğu zaman EGFR mutasyon testi kullanılarak test edilebilir. therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin etkili kullanımı için örnekler 7'li gruplar halinde gruplandırılmalıdır. Daha küçük gruplar, therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile daha az örneğin test edilebileceği anlamına gelir. Örnek, therascreen EGFR RGQ PCR Kiti içinde verilen tüm reaksiyon karışımları kullanılarak test edilmelidir. Taq veya Taq içeren herhangi bir karışımı enzimi etkisizleştirebileceği için vorteksle karıştırmayın. Ucun aşırı enzimle kaplanmasını engellemek için Taq'i pipet ucunu dikkatli biçimde sıvı yüzeyin hemen altına yerleştirerek pipetle çekin. Başlamadan önce yapılması gerekenler therascreen EGFR CE Test Paketi yazılımının, Rotor-Gene Q MDx cihazı ilk defa kullanılmadan önce yüklendiğinden emin olun (bkz. Ek B: therascreen EGFR CE Test Paketinin kurulumu, sayfa 83). Her kullanımdan önce, tüm reaktiflerin ortam sıcaklığında en az 1 saat ve en fazla 4,5 saat boyunca tam olarak çözdürülmesi (15 25 C), 10 kez ters yüz edilerek karıştırılması ve içeriği tüpün altında toplamak için kısa süreli santrifüj edilmesi gerekir. Tüm örnekleri 10 kez ters yüz ederek karıştırın ve içeriği tüpün altında toplamak için kısa süreli santrifüj edin. Her kullanımdan önce Taq'in ortam sıcaklığında (15 25 C) olduğundan emin olun. Enzimi tüpün altında toplamak için tüpü kısa süre santrifüj edin. 26 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

27 Prosedür 1. Tüm reaksiyon karışım tüplerini, NTC suyunu ve EGFR PC'yi oda sıcaklığında (15 25 C) en az 1 saat ve en fazla 4,5 saat boyunca çözdürün. Reaktifi çözdürme, PCR kurulumu ve çalışmayı başlatmadan önce saklama süreleri Tablo 5'te verilmiştir. Tablo 5. Çözdürme süreleri, PCR kurulum süreleri ve saklama sıcaklıkları Çözdürme süresi Minimum Maksimum 1 saat 4,5 saat PCR kurulumu sonrası saklama sıcaklığı Oda sıcaklığı (15 25 C) Maksimum PCR kurulumu ve saklama süresi 7 saat 1 saat 4,5 saat 2 8 C 18 saat Not: PCR kurulumu oda sıcaklığında (15 25 C) gerçekleştirilir. Saklama ifadesi, PCR kurulumunun tamamlanması ile Rotor-Gene Q MDx cihazında PCR çalıştırılmasının başlangıcı arasında geçen süredir. Not: Taq'ı (Taq tüpü) diğer reaktiflerle aynı anda oda sıcaklığına (15 25 C) getirin (bkz. Reaktifi Saklama ve Kullanma, sayfa 13). Enzimi tüpün altında toplamak için tüpü kısa süre santrifüj edin. 2. Reaktifler çözündüğünde, bölgesel tuz konsantrasyonlarını engellemek için reaktifleri 10 kez ters yüz ederek karıştırın ve ardından içeriği tüpün altında toplamak için kısa süreli santrifüj edin. 3. Tablo 6'daki hacimlere göre DNA örnekleri için yeterli miktarda test ana karışımı (test reaksiyon karışımı ve Taq), bir EGFR PC ve bir NTC reaksiyonu için hazırlayın. PCR'ı kurmak için yeterli farkı sağlamak amacıyla reaktifleri 1 fazla örneğe göre ekleyin. Karışımlar örnek hariç PCR için gerekli bileşenlerin tümünü içerir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

28 Tablo 6. Ana test karışımlarının hazırlanması Test Reaksiyon karışımı tüpü Reaksiyon karışımının hacmi Taq DNA polimeraz (Taq tüpü) hacmi Kontrol CTRL 19,5 µl (n + 1)* 0,5 µl (n + 1)* T790M T790M 19,5 µl (n + 1) 0,5 µl (n + 1) Delesyonlar Del 19,5 µl (n + 1) 0,5 µl (n + 1) L858R L858R 19,5 µl (n + 1) 0,5 µl (n + 1) L861Q L861Q 19,5 µl (n + 1) 0,5 µl (n + 1) G719X G719X 19,5 µl (n + 1) 0,5 µl (n + 1) S768I S768I 19,5 µl (n + 1) 0,5 µl (n + 1) İnsersiyonlar Ins 19,5 µl (n + 1) 0,5 µl (n + 1) * n = reaksiyon sayısı (örnekler artı kontroller). PCR kurulumu için yeterli farkı sağlamak amacıyla fazladan bir örnek (n + 1) için yeterli miktarda ana karışım hazırlayın. n değeri 7'yi aşmamalıdır (kontroller hariç), çünkü bir çalışmada kullanılabilecek en fazla örnek sayısı 7'dir. 4. Test ana karışımlarını yavaşça 10 kez yukarı aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın. Uygun sayıdaki şeritli tüpü Tablo 7'deki düzene uygun olarak yükleme bloğuna yerleştirin. Hemen 20 µl test ana karışımını her bir PCR şerit tüpüne ekleyin. Kapaklar gerekinceye kadar plastik kap içinde tutulmalıdır. 28 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

29 Tablo 7. Kontrol ve mutasyon testlerinin yükleme bloğundaki düzeni. Sayılar, yükleme bloğu içinde konumları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu belirtir. Kontroller Konum Örnek numarası Test PC NTC Kontrol T790M Delesyonlar L858R L861Q G719X S768I İnsersiyonlar NTC tüpü için konumlardaki tüplere hemen 5 µl su ekleyin ve tüplerin kapaklarını kapatın. 6. Örnek tüplerine (tüp konumları 17 24, 25 32, 33 40, 41 48, 49 56, ve 65 72) her bir örnekten 5 µl ekleyin ve tüpleri kapatın konumdaki tüpe 5 µl EGFR PC ekleyin ve tüplerin kapaklarını kapatın. NTC, örnekler ve EGFR PC'nin uygun tüplere doğru eklenmesini sağlamak için yükleme veya pipetleme hatasını önlemeye özen gösterin. Her bir tüpün toplam reaksiyon hacmi 25 µl olmalıdır (3. adım (Tablo 6) uyarınca hazırlanmış 20 µl test ana karışım, artı 5 µl NTC/örnek/PC). Sayılar, yükleme bloğu içinde konumları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu belirtir. Tüpleri Rotor Gene Q MDx cihazına yüklemek için yönü gösterecek şekilde tüplerin kapaklarını işaretleyin. 8. Tüm PCR tüplerinin kapakları kapatıldıktan sonra, örneğin tüm tüplere eklendiğinden emin olmak için örnek tüplerinin dolum seviyeleri ile ilgili olarak görsel kontrol gerçekleştirin. 9. Tüm PCR tüplerini 4 kere ters çevirerek örnekleri ve reaksiyon karışımlarını karıştırın. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

30 10. PCR şerit tüplerini, Tablo 7'deki düzene göre 72 kuyulu rotordaki uygun konumlara yerleştirin. Her PCR çalışmasında en fazla 7 örnek kullanılabilir. Rotor tamamen dolmamışsa, rotordaki tüm boş pozisyonları kapatılmış boş tüplerle doldurun. 11. Hemen 72 kuyulu rotoru Rotor-Gene Q MDx cihazına yerleştirin. Kilitleme halkasının (Rotor-Gene Q MDx cihazının aksesuarı) çalışma sırasında tüpleri sabitlemek için rotorun üstüne yerleştiğinden emin olun. Not: Manuel EGFR mutasyon tespiti kullanıyorsanız, bkz. Ek A: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Manuel Protokol, sayfa Rotor-Gene Q MDx cihazına bağlı dizüstü bilgisayardaki therascreen EGFR CE Locked Template (therascreen EGFR CE Kilitli Şablon) simgesine çift tıklayarak Rotor-Gene Q yazılımını başlatın (Şekil 10). therascreen EGFR CE Locked Template Şekil 10. EGFR CE Kilitli Şablon simgesi (EGFR mutasyon tespiti). 13. Varsayılan olarak Setup (Kurulum) sekmesi açılır (Şekil 11). Kilitleme halkasının uygun şekilde takıldığını doğrulayın ve ardından Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Takılı) kutusunu işaretleyin. Rotor-Gene Q MDx cihazının kapağını kapatın. 1 2 Şekil 11. Setup (Kurulum) sekmesi (1) ve Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Takılı) kutusu (2). 30 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

31 14. Lokal isimlendirme mevzuatınıza göre Run ID (Çalıştırma Kimliği) diyalog alanına çalıştırma kimliğini girin. Lokal isimlendirme mevzuatınıza göre Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanına örnek adını girin ve Enter tuşuna basın. Bunu yapmak, örnek adını aşağıdaki örnek listesine ekler ve örneğe bir Sample ID (Örnek Kimliği) (1, 2, 3, vb.) verir. Ek olarak, sağ taraftaki Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneli, örnek adını içerecek şekilde güncellenir (Şekil 12). Not: Alternatif olarak, *.smp (Rotor-Gene Q örnek dosyası) veya *.csv (virgülle ayrılan değerler) biçimleri, Import Samples (Örnekleri Al) düğmesi kullanılarak alınabilir. Örnek adları, bu yöntem kullanılarak otomatik şekilde doldurulur. Not: Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneline örnek adının eklendiğinden ve bu adın renk değişimi ile vurgulandığından, ayrıca örnek adının örnek konumunda bulunduğundan emin olun (Şekil 12). Not: En fazla 7 örnek eklenebilir. Örnek kimliklerine (örnek döngülerindeki), 1 ile 7 arasında bir sayı otomatik olarak atanır. Not: 8 karakterden uzun örnek adları, Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) panelinde tamamıyla görüntülenmeyebilir Şekil 12. Run ID (Çalıştırma Kimliği) ve Sample Name (Örnek Adı) Girme (1 = Run ID (Çalıştırma Kimliği) diyalog alanı 2 = Import Samples (Örnekleri Al) diyalog alanı; 3 = Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanı; 4 = Sample List (Örnek Listesi); 5 = Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneli; 6 = Alttaki 8 testin vurgulanmış örnek döngüsü ve sütunu). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

32 15. Tüm ilave örneklerin adını girmek için 14. adımı tekrarlayın (Şekil 13). Not: Bir örnek adını düzenlemek için, örnek listesinden Sample Name (Örnek Adı) seçeneğine tıklayın; seçilen örnek yukarıdaki Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanında görünür. Örnek adını, lokal isimlendirme mevzuatınıza göre düzenleyin ve güncellemek için Enter tuşuna basın Şekil 13. Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanına ek örnek adları girme (1 = Sample Name (Örnek Adı) diyalog alanı; 2 = Sample List (Örnek Listesi); 3 = Layout of the pipetting adapter (Pipetleme adaptörü düzeni) paneli). 16. Tüm örnek adları girildiğinde doğru olduklarını kontrol edin. Gerekiyorsa Notes (Notlar) diyalog alanına ilave bilgiler girin ve Start Run (Çalışmayı Başlat) düğmesine tıklayın (Şekil 14). Not: Kullanılmayan bir rotor pozisyonu varsa bir Warning (Uyarı) belirir (Şekil 14) ve kullanıcıya, tüm kullanılmayan pozisyonların kapatılmış boş tüplerle doldurulması gerektiğini hatırlatır. Kullanılmayan rotor pozisyonlarının kapatılmış boş tüplerle doldurulmuş olduğunu kontrol edin ve ilerlemek için OK (Tamam) seçeneğine tıklayın. 32 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

33 3 1 2 Şekil 14. Notes (Notlar) diyalog alanı (1), Start Run (Çalışmayı Başlat) düğmesi (2) ve kullanılmayan rotor pozisyonlarını bildiren Warning (Uyarı) (3). 17. Bir Save As (Farklı Kaydet) penceresi açılır. Uygun dosya adını seçin ve PCR çalışmasını seçili konuma *.rex çalışma dosyası olarak kaydedin. Save (Kaydet) düğmesine tıklayın (Şekil 15) Şekil 15. Save As (Farklı Kaydet) penceresi (1) (2 = File Name (Dosya Adı) ve Save as type (Tip olarak kaydet) alanları; 3 = Save (Kaydet) düğmesi). 18. PCR çalışması başlar. Not: Çalışma başladığında, Run Progress (Çalışma İlerlemesi) sekmesi açılarak sıcaklık takibi ve kalan çalışma süresi konusunda bilgi verir (Şekil 16). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

34 1 Şekil 16. Run Progress (Çalışma İlerlemesi) sekmesi. 19. Çalışma bittiğinde, Analysis (Analiz) sekmesi açılır. Not: Analysis (Analiz) sekmesi açılmazsa, bu sekmeye tıklamalısınız (Şekil 17). Not: Hesaplama yönteminin bir açıklaması Sonuçların Yorumlanması (Otomatik) kısmında, sayfa 37 içinde sunulmuştur Şekil 17. Analysis (Analiz) sekmesi (1) ve sonuçların raporlanması (2 = Run Controls, Positive Control (Çalışma Kontrolleri, Pozitif Kontrol) paneli; 3 = Run Controls, Negative Control (Çalışma Kontrolleri, Negatif Kontrol) paneli; 4 = Sample Result Table (Örnek Sonuç Tablosu); 5 = Mutation Status (Mutasyon Durumu) paneli). 34 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

35 20. Test sonuçları aşağıdaki gibi raporlanır (Şekil 18). Run Controls, Positive Control (Çalışma Kontrolleri, Pozitif Kontrol) Sonuçlar kabul edilebilir aralık dahilindeyse, Positive Control Status (Pozitif Kontrol Durumu) Valid (Geçerli) ifadesini gösterir; aksi halde Invalid (Geçersiz) ifadesi görülür. Run Controls, Negative Control (Çalışma Kontrolleri, Negatif Kontrol) Hem NTC hem de Internal Control (İnternal Kontrol) sonuçları kabul edilebilir aralıklar dahilindeyse, Negative Control Status (Negatif Kontrol Durumu) Valid (Geçerli) ifadesini gösterir; aksi halde Invalid (Geçersiz) ifadesi görülür. Sample Result Table (Örnek Sonuç Tablosu) Mutasyon Pozitif örnekler için spesifik mutasyonlar EGFR Mutation Status (EGFR Mutasyon Durumu) sütununda raporlanır. 21. Rapor dosyası oluşturmak için Report (Rapor) öğesine tıklayın. Report Browser (Rapor Tarayıcısı) penceresi açılır. Templates (Şablonlar) altından EGFR CE Analysis Report (EGFR CE Analiz Raporu) seçeneğini seçin ve Show (Göster) seçeneğine tıklayın (Şekil 18). Not: Bir raporu kaydetmek için, Web Arşivleri formatında alternatif bir konuma kaydetmek için, her raporun sol üst köşesindeki Save As (Farklı Kaydet) düğmesine tıklayın Şekil 18. EGFR CE Analysis Report (EGFR CE Analiz Raporu) seçeneğinin belirlenmesi (1 = Report (Rapor) düğmesi; 2 = Report Browser (Rapor Tarayıcısı) paneli; therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

36 3 = EGFR CE Analysis Report (EGFR CE Analiz Raporu); 4 = Show (Göster) düğmesi). 36 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

37 Sonuçların Yorumlanması (Otomatik) Analiz ve mutasyon sonuçları, çalışma tamamlandıktan sonra therascreen EGFR Test Paketi tarafından otomatik olarak çıkarılır. Aşağıdaki bilgiler, therascreen EGFR Test Paketinin analiz ve mutasyon sonuçlarını nasıl çıkardığını açıklamaktadır. Not: Manuel sonuç analizi için, bkz. Sonuçların Yorumlanması (Manuel), sayfa 75. Belirli bir reaksiyondan gelen floresan ışımanın bir eşik değeriyle kesiştiği PCR döngüsü, CT değeri olarak tanımlanır. CT değerleri, spesifik giren DNA miktarını ifade eder. Düşük CT değerleri, giren DNA düzeyinin yüksek olduğunu, yüksek CT değerleri ise giren DNA düzeyinin düşük olduğunu belirtir. CT değerine sahip reaksiyonlar, pozitif amplifikasyonlar olarak sınıflanır. Rotor-Gene Q yazılımı, kaydedilen herhangi 2 değer arasına floresan sinyaller ekler. Bu nedenle CT değerleri, 0 ile 40 arasında herhangi bir gerçek sayı olabilir (tam sayılarla sınırlı değildir). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti için eşik değeri, yeşil (FAM) kanal için 0,075 ve sarı (HEX) kanal için 0,02 göreceli floresan birim olarak ayarlanır. Bu değerler, therascreen EGFR Test Paketinden otomatik yapılandırılır. Çalışma kontrolleri (PC, NTC ve IC), kabul edilebilir CT değerlerinin alınmasını ve reaksiyonların doğru gerçekleştirilmesini sağlamak üzere değerlendirilir. Denklem kullanılarak her mutasyon testi için örnek CT değerleri hesaplanır: CT = [mutasyon testi CT değeri] [kontrol testi CT değeri] Örnekler bu teste ait eşik CT değerine eşit veya bundan daha düşük CT değeri verirse mutasyon pozitif olarak sınıflandırılır. Bu değerin üzerinde, örnek ya therascreen EGFR RGQ PCR Kiti tarafından tespit edilebilecek mutasyon yüzdesinden (test limitinin dışında) daha az içerir ya da mutasyon negatiftir, bu ikinci durum No Mutation Detected (Hiçbir Mutasyon Tespit Edilmedi) olarak raporlanır. Mutasyon reaksiyonlarında amplifikasyon görülmemesi, No Mutation Detected (Hiçbir Mutasyon Tespit Edilmedi) olarak kaydedilir. Arka plan amplifikasyonundan hesaplanan CT değerlerinin eşik CT değerlerinden daha yüksek olması beklenir ve örnek, No Mutation Detected (Hiçbir Mutasyon Tespit Edilmedi) olarak sınıflandırılır. Test sonuçları Mutation Detected (Mutasyon Tespit Edildi), No Mutation Detected (Hiçbir Mutasyon Tespit Edilmedi), Invalid (Geçersiz) veya çalışma kontrolü başarısız olursa Run Control Failed (Çalışma Kontrolü Başarısız) şeklinde görüntülenir. Mutasyon pozitif örnekler için spesifik mutasyonlar raporlanır. Bir tümör birden fazla mutasyona sahip olabilir. Bu gibi durumlarda, birden fazla mutasyon raporlanır. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

38 Rotor-Gene Q therascreen EGFR Test Paketi işaretleri Tablo 8'de Rotor-Gene Q therascreen EGFR Assay Package tarafından oluşturulabilecek olası işaretler, anlamları ve gerçekleştirilmesi gereken eylemler verilmiştir. İşaret adları, kitin etkilenen bileşeni, etkilenen örnek veya kontrol ve hata modu hakkında bilgi vermek üzere yapılandırılmıştır. Örneğin: PC_CTRL_ASSAY_FAIL = Pozitif Kontrolün (PC) Kontrol Testi (CTRL_ASSAY) başarısız oldu (FAIL) NTC_INT_CTRL_FAIL = Şablonsuz Kontrolün (NTC) İnternal Kontrolü (INT_CTRL) başarısız oldu (FAIL) SAMPLE_CTRL_HIGH_CONC = Örnek (SAMPLE), Kontrol Testinde (CTRL) Yüksek Konsantrasyon (HIGH_CONC) mevcut Tablo 8. İşaretler, anlamları ve gerçekleştirilecek eylemler İşaret Anlamı Eylem PC_CTRL_ASSAY_FAIL PC_MUTATION_ ASSAY_FAIL PC_CTRL_INVALID_ DATA PCR çalışması geçersiz kontrol reaksiyonunda FAM CT pozitif kontrol için aralık dışında. PCR çalışması geçersiz FAM CT bir veya daha fazla mutasyon kontrol reaksiyonu için aralık dışında. PCR çalışması geçersiz pozitif kontrol (kontrol reaksiyon karışımı) içindeki floresan ışıma verileri yorumlanamıyor. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. 38 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

39 İşaret Anlamı Eylem PC_MUTATION_ INVALID_DATA NTC_INT_CTRL_FAIL NTC_INT_CTRL_ EARLY_CT NTC_INVALID_CT NTC_INVALID_DATA SAMPLE_CTRL_ INVALID_DATA PCR çalışması geçersiz pozitif kontrol (mutasyon reaksiyon karışımı) içindeki floresan ışıma verileri yorumlanamıyor. PCR çalışması geçersiz internal kontrol, negatif kontrol için aralığın üstünde. PCR çalışması geçersiz internal kontrol, negatif kontrol için aralığın altında. PCR çalışması geçersiz FAM (limitten küçük), negatif kontrol için geçersiz. PCR çalışması geçersiz negatif kontrol içindeki floresan ışıma verileri yorumlanamıyor. Örnek geçersiz örnek kontrolü içindeki floresan ışıma verileri yorumlanamıyor. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. Tüm PCR çalışmasını tekrarlayın. İlgili örneği/örnekleri tekrar işlemek için yeni PCR kurun. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

40 İşaret Anlamı Eylem SAMPLE_CTRL_ HIGH_CONC SAMPLE_CTRL_FAIL Örnek Geçersiz örnek kontrolündeki FAM CT çok düşük. Örnek geçersiz örnek kontrol reaksiyonundaki FAM CT çok yüksek. CT değerini artırmak için örneği seyreltin. Bu seyreltme işlemi, kit içinde verilen suyla 1:1 oranında seyreltme yapmanın CT değerini 1,0 kadar yükselteceği varsayımına göre hesaplanmalıdır. Örnek seyreltildiğinde, örneği tekrar işlemek için yeni mutasyon değerlendirme çalışması kurun. Veya örnek, DNA örneği değerlendirme çalışmasını takiben seyreltildiyse, seyreltilmiş örnek ile doğrudan EGFR mutasyon tespiti çalışmasına geçin. Örneği tekrar işlemek için yeni PCR kurun. Örnek tekrarlanan PCR çalışmasında geçersizse ve DNA miktarı hala yetersizse, iki tane daha FFPE doku kesiti (varsa) alın. Alınan bu kesiti incelemek için yeni PCR kurun. Örnek geçersizse, PCR çalışmasını ikinci kesit için tekrarlayın. Örnek bu çalışmadan sonra da geçerli sonuç vermiyorsa, örneğe belirsiz mutasyon durumu atanır ve daha fazla test yapılmaz. 40 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

41 İşaret Anlamı Eylem SAMPLE_INT_CTRL_ FAIL İnternal kontrol (HEX) için CT çok yüksek (veya CT yok), FAM kanalı mutasyon negatif. Klinik olarak ilgili mutasyon reaksiyon karışımında mutasyon tespit edilmiş (veya tespit edilmemiş) SAMPLE POSITIVE AND INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti oluşturan örnekler için sonuçları rapor edin; daha fazla test gerekli değildir. Örnek geçersiz durumda ise: 1:1 oranında seyreltmenin kontrol reaksiyonunun CT değerini 1,0 artıracağı varsayımını kullanarak ve nihai hacmin > 40 µl olmasını (örn. DIL işaretli tüpten 40 µl DNA ve 40 µl su) sağlayarak kitte verilen su ile örneği seyreltin. Örneği tekrar işlemek için yeni PCR kurun. Tekrarlanan PCR çalışmasında da geçersiz sonuç alınırsa, iki tane daha FFPE kesiti örneği alın. Alınan bu kesiti incelemek için yeni PCR kurun. İkinci alınan örnek geçersizse yukarıda anlatıldığı şekilde seyreltin. Örnek bu çalışmadan sonra da geçerli sonuç vermiyorsa, örneğe belirsiz mutasyon durumu atanır ve daha fazla test yapılmaz. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

42 İşaret Anlamı Eylem SAMPLE_INT_CTRL_ EARLY_CT Mutasyon tüpü geçersiz CT HEX örnek (internal kontrol) için çok düşük Klinik olarak ilgili mutasyon reaksiyon karışımında mutasyon tespit edilmiş (veya tespit edilmemiş) SAMPLE POSITIVE AND INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti oluşturan örnekler için sonuçları rapor edin; daha fazla test gerekli değildir. Örnek geçersiz durumda ise: Örneği tekrar işlemek için yeni PCR kurun. Tekrarlanan PCR çalışmasında da geçersiz sonuç alınırsa, varsa yeni iki FFPE doku kesiti alın. Alınan bu kesiti incelemek için yeni PCR kurun. Geçersizse, PCR çalışmasını ikinci kesit için tekrarlayın. Örnek bu çalışmadan sonra da geçerli sonuç vermiyorsa, örneğe belirsiz mutasyon durumu atanır ve daha fazla test yapılmaz. 42 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

43 İşaret Anlamı Eylem SAMPLE_INVALID_ DATA SAMPLE_POSITIVE_ AND_INVALID Mutasyon tüpü geçersiz internal kontrol içindeki floresan ışıma verileri yorumlanamıyor. Klinik olarak ilgili mutasyon reaksiyon karışımında mutasyon tespit edilmiş (veya tespit edilmemiş) SAMPLE POSITIVE AND INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti oluşturan örnekler için sonuçları rapor edin; daha fazla test gerekli değildir. Örnek geçersiz durumda ise: Örneği tekrar işlemek için yeni PCR kurun. Tekrarlanan PCR çalışmasında da geçersiz sonuç alınırsa, varsa yeni iki FFPE doku kesiti alın. Alınan bu kesiti incelemek için yeni PCR kurun. Geçersizse, PCR çalışmasını ikinci kesit için tekrarlayın. Örnek bu çalışmadan sonra da geçerli sonuç vermiyorsa, örneğe belirsiz mutasyon durumu atanır ve daha fazla test yapılmaz. Bir örnek için bir veya daha fazla mutasyon geçerli ve pozitif, aynı zamanda aynı örnek için bir veya daha fazla mutasyon geçersiz (uyarıdır, hata değildir). Klinik olarak ilgili mutasyon reaksiyon karışımında mutasyon tespit edilmiş (veya tespit edilmemiş) SAMPLE POSITIVE AND INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti oluşturan örnekler için sonuçları rapor edin; daha fazla test gerekli değildir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

44 İşaret Anlamı Eylem Klinik olarak ilgili mutasyon reaksiyon karışımında INVALID (Geçersiz) sonuçlu SAMPLE POSITIVE AND INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti oluşturan örnekler için özel geçersiz işaret eylemini gerçekleştirdikten sonra örneği tüm reaksiyon karışımlarıyla yeniden test edin. Etkilenen örnek için bir başka işaret ile birlikte SAMPLE POSITIVE AND INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti oluşursa, SAMPLE_INT_CTRL_FAIL işaretindeki örneği seyreltme işlemi uygulanmalıdır. Yeni bir PCR çalışması kurun ve örneği yeniden test edin. Tekrarlanan PCR çalışmasında klinik olarak ilgili mutasyon reaksiyon karışımında INVALID (Geçersiz) sonuçlu SAMPLE POSITIVE AND INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti oluşturan örnekler için iki tane daha FFPE kesitinden örnek alın. Alınan bu kesiti test etmek için tüm reaksiyon karışımlarıyla yeni bir PCR çalışması kurun. Bu örnek yeniden klinik olarak ilgili mutasyon reaksiyon karışımı için geçersiz sonuç ortaya çıkarırsa, özel geçersiz işaret eylemini gerçekleştirdikten sonra örneği tüm reaksiyon karışımlarıyla tekrar test edin. Etkilenen örnek için bir başka işaret ile birlikte SAMPLE_INT_CTRL_FAIL (Örnek internal kontrol başarısız) oluşursa, SAMPLE_INT_CTRL_FAIL işaretindeki örneği seyreltme işlemi uygulanmalıdır. Yeni bir PCR çalışması kurun ve bu örneği yeniden test edin. Bu tekrarda SAMPLE_POS_AND_INVALID (Örnek pozitif ve geçersiz) işareti görülürse, örneğe belirsiz mutasyon durumu tayin edilir. 44 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

45 Sorun giderme kılavuzu Bu sorun giderme kılavuzu ortaya çıkabilecek sorunların çözümünde yardımcı olabilir. Daha fazla bilgi için ayrıca Teknik Destek Merkezimizdeki Sık Sorulan Sorular sayfasına da bakın: QIAGEN Teknik Servislerindeki uzmanlar her zaman bu el kitabındaki bilgiler ve protokoller ya da örnek ve test teknolojileriyle ilgili tüm sorularınızı yanıtlamaktan mutluluk duyar (iletişim bilgileri için arka kapağa bakın veya adresini ziyaret edin). Yorum ve öneriler NTC örnekleri Yeşil FAM kanalında pozitif sonuç veriyor PCR hazırlığı sırasında kontaminasyon meydana geldi EGFR pozitif kontrole ait sinyal yok a) PCR veri analizi için seçilen floresan kanalı protokol ile uyumlu değildir b) Rotor-Gene Q MDx cihazının sıcaklık profilinin yanlış programlanması c) PCR'ın yanlış yapılandırılması d) Bir veya daha fazla kit bileşenine ait saklama koşulları Reaktifi Saklama ve Kullanma (sayfa 13) bölümünde verilen talimatlara uymadı e) therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin süresi dolmuş Tekrarlardaki yeni reaktiflerle PCR'ı tekrarlayın. Mümkünse, test edilecek örneğin eklenmesinden sonra PCR tüplerini doğrudan kapatın. Çalışma alanının ve cihazların düzenli aralıklarla dezenfekte edildiğinden emin olun. Veri analizi için analitik EGFR PCR'ı için Yeşil Döngü Yapan floresan kanalını ve internal kontrol PCR'ı için Sarı Döngü Yapan floresan kanalını seçin. Sıcaklık profilini protokolle karşılaştırın. Yanlışsa, çalışmayı tekrarlayın. Pipetleme şeması aracılığıyla çalışma adımlarınızı kontrol edin ve gerekirse PCR'ı tekrarlayın. Reaktiflerin saklama koşullarını ve son kullanma tarihlerini (bkz. kit etiketi) kontrol edin ve gerekirse yeni bir kit kullanın. Reaktiflerin saklama koşullarını ve son kullanma tarihlerini (bkz. kit etiketi) kontrol edin ve gerekirse yeni bir kit kullanın. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

46 Kalite Kontrol QIAGEN ISO sertifikalı Kalite Yönetim Sistemi uyarınca, therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin her bir lotu tutarlı ürün kalitesi sağlamak için önceden belirlenmiş özelliklere göre test edilir. Sınırlamalar Üründen elde edilen sonuçlar tüm ilgili klinik ve laboratuvar bulguları çerçevesinde yorumlanmalıdır ve tanı amacıyla tek başına kullanım için değildir. Ürün yalnızca in vitro tanısal prosedürler ve Rotor-Gene Q MDx cihazları konusunda özel olarak bilgilendirilmiş ve eğitim almış personel tarafından kullanım içindir. Ürün, yalnızca Rotor-Gene Q MDx real-time PCR cycler kullanım için tasarlanmıştır. En iyi sonuçlar için therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı'na tam olarak uyulması gereklidir. Bu el kitabında açıklanın dışında reaktiflerin seyreltilmesi tavsiye edilmez ve performans kaybına neden olur. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti kullanılarak örnek analizi gerçekleştirilmeden önce örnekteki DNA'nın miktarının ve kalitesinin değerlendirilmesi önemlidir. Bu test için CT değerinin kabul edilebilir olduğunu belirlemek için ek Kontrol Reaksiyon Karışımı sağlanır. Fragmente olmuş DNA örneklerindeki CT değerleriyle örtüşmeyeceğinden absorbans okumaları kullanılmamalıdır. Tüm bileşenlerin kutusunda ve etiketlerinin üstünde yazılı olan son kullanma tarihlerine ve saklama koşullarına dikkat edilmelidir. Süresi dolmuş ve yanlış saklanmış bileşenleri kullanmayın. 46 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

47 Performans Özellikleri Analitik Performans therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin belirli performans özellikleri, NSCLC hastalarından ve FFPE insan hücre hatlarından (FFPE hücre hatları) toplanan FFPE doku örneklerinin kullanıldığı çalışmalarla belirlenmiştir. FFPE hücre hatları, istenen belirli EGFR mutasyonlarına sahip hücre hatları elde etmek için bir akciğer karsinom hücre hattı (A549) kullanılarak oluşturulmuştur. Doku örneği veya hücre hatlarının bulunmadığı durumlarda, plazmid DNA'sı kullanılmıştır. Boş örnek sınırı (LOB), çalışma aralığı ve eşik değerler Her mutasyon testi için LOB değerleri ve eşik değerlerini belirlemek için NCCLS EP17-A (2004) (12) içindeki yönergelerin izlendiği bir çalışmada toplam 417 FFPE örneği test edilmiştir. Ayrıca, çalışma aralığı belirlenmiştir. Eşik değerleri belirlenmiştir ve Tablo 9'da gösterilmektedir. Tablo 9. Her mutasyon testi için belirlenen eşik değerleri Test T790M 7,40 Delesyonlar 8,00 L858R 8,90 L861Q 8,90 G719X 8,90 S768I 8,90 İnsersiyonlar 8,00 Eşik değeri ( CT) Kontrol reaksiyonu CT aralığı 23,70 31,10 CT olarak saptandı. Test eşik değerleri ve çalışma aralıkları, standartlar ve yeni FFPE örnekleri kullanılarak doğrulanmıştır. Doğrulama sırasında, her test yüksek giriş genomik DNA ve yüksek giriş mutasyon DNA'sı değerlendirilerek yabani tip DNA arka planında doğru mutasyonu ayırt edebilmek için değerlendirilmiştir (bkz. Çapraz reaktivite, sayfa 48). Giriş DNA'sının mutasyon sonucu üzerine etkisi de değerlendirilmiştir (bkz. DNA girişinin CT değerlerine etkisi, sayfa 48). Şablon bulunmaması durumunda therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin performansını değerlendirmek ve boş bir örneğin veya yabani tip DNA içeren örneğin düşük mutasyon yoğunluğuna işaret edebilecek analitik bir sinyal therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

48 oluşturmadığından emin olmak için, NSCLC EGFR yabani tip DNA değerlendirilmiştir. Sonuçlar, NTC örnekleri ve FFPE yabani tip örnekler için pozitif mutasyon sonuçları olmadığını göstermiştir. DNA girişinin C T değerlerine etkisi DNA giriş düzeyi, kontrol reaksiyonundaki CT değerleri ile belirlendiği gibi, bir örnekteki toplam çoğaltılabilir EGFR DNA miktarı olarak tanımlanır. therascreen EGFR RGQ PCR Kit performansının kontrol reaksiyonu CT aralığı (23,70 31,10) boyunca tutarlı olduğunu göstermek için, 7 EGFR mutasyon testinin tümü, 1'ini hazırladıktan sonra, 6 noktalı, 3'lü seyreltme serisine karşı test edilmiştir (DNA, FFPE hücre hatlarından alınmıştır). Her mutasyona yönelik 1 seyreltme için hedef CT değeri yaklaşık 24,70'ti. Yaklaşık değerinde bir CT veren nihai seyreltme, kontrol reaksiyonu CT aralığının dışındaydı. Toplamda, farklı toplam DNA giriş düzeylerinde ölçülen CT değerleri, therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin çalışma aralığı boyunca tutarlıydı. Çapraz reaktivite Spesifik olmayan amplifikasyonu değerlendirmek için, yüksek DNA girişinde yabani tip EGFR DNA test edilmiştir. Sonuçlar, spesifik olmayan amplifikasyonun olmadığını belirtecek şekilde, en düşük CT değerlerinin belirlenen eşikleri aştığını göstermiştir. Potansiyel çapraz reaktiviteyi değerlendirmek için, yüksek DNA giriş düzeyindeki FFPE hücre hatları tüm reaksiyon karışımlarına karşı test edilmiştir. Sonuçlar, mutant reaksiyonlar arasındaki çapraz reaktiviteye bağlı herhangi bir etkiyi ortaya koymamıştır. Minimum CT değerlerinin tümü, eşleşmeyen tüm reaksiyon karışımları ve DNA örnekleri için ilgili test eşik değerlerinden daha yüksekti. Doğruluk: Analitik referans yöntemi ile karşılaştırma Bir çalışma, therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin iki yönlü Sanger dizilemesine kıyasla mutasyon tespiti uyumluluğunu göstermiştir. Bu çalışmada, 360 FFPE örneği test edilmiştir. Sanger ve therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile geçerli sonuçlara sahip örnekler, Pozitif Uyumluluk Oranı (PPA), Negatif Uyumluluk Oranı (NPA) ve Genel Uyumluluğu (OPA) değerlendirmek için analiz edilmiştir. Bu yüzde değerleri, ilgili iki taraflı %95 güven aralıkları (CI) ile birlikte Tablo 10'da özetlenmiştir. 48 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

49 Tablo 10. Uyumluluk analizi Ölçüm Uyumluluk yüzdesi (N) %95 GA Pozitif Uyumluluk Oranı %99,4 (157/158) %96,5 100,0 Negatif Uyumluluk Oranı %86,6 (175/202) %81,2 91,0 Genel uyumluluk %92,2 (332/360) %89,0 94,8 28 uyumsuz Genel Uyumluluk sonucu için: 1 (%3,6) örnek, therascreen EGFR RGQ PCR Kit ile yabani tipken (örn. hiçbir mutasyon tespit edilmedi) Sanger dizilemesi sonuçları ile mutasyon tespit edildi. 27 (%96,4) örnek, therascreen EGFR RGQ PCR Kit ile tespit edilen mutasyonken Sanger dizilemesi ile yabani tip sonuçlar tespit edildi. Tespit sınırı (LOD) değerleri 29 EGFR mutasyonunun her birinin LOD değerini belirlemek amacıyla bir araştırma yapılmıştır. LOD, mutant bir örneğin test sonuçlarının %95'inde mutasyon pozitif sonuçlar sağladığı yabani tip DNA arka planındaki en düşük mutant DNA miktarı olarak tanımlanır (C95). Her mutasyon için LOD belirlemek amacıyla, farklı mutasyon yüzdeleri olan örnekler, düşük ve yüksek giriş DNA konsantrasyonlarında hazırlanmış ve therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile test edilmiştir (Tablo 11). Her test için LOD, lojistik regresyon ile hesaplanmıştır. LOD'yi doğrulamak için, belirlenen LOD değerindeki mutasyon örnekleri test edilmiş ve pozitif test oranı doğrulanmıştır. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

50 Tablo 11. LOD, düşük ve yüksek DNA giriş FFPE klinik örnekleri, FFPE hücre hatları veya plazmidler kullanılarak belirlenmiştir LOD (% mutant) Ekson Mutasyon COSMIC* ID Baz değişimi Düşük Yüksek 18 G719A G>C 7,41 1,57 G719S G>A 5,08 7,75 ~ G719C G>T 10,3-19 Delesyonlar _2255>T 1,58 ~ 0,49 ~ _2258>CA 4,91 1, _2252>GCA 16,87 12, _2248>GC 3,24 1, _2252>AAT 4,24 1, _2251del15 0,55 ~ 0,24 ~ _2247del9 8, _2253del18 2, _2254del18 2, _2251del12 4, _2255del18 2,70 0, _2249del15 6,40 1, _2250del15 2,80 1, _2253del15 0,86 ~ 0,47 ~ _2256del18 0,14 ~ 0,05 ~ _2254del15 4,94 ~ 1,56 ~ _2257del18 8,10 ~ 2,08 ~ _2248TTAAGA GAAG>C 0,25 ~ 0,10 ~ _2251>C 4,58 ~ 1,74 ~ * COSMIC: Kanserde somatik mutasyonlar kataloğu: LOD değerleri, hücre hatları/plazmidler kullanılarak belirlenmiştir. LOD değerleri, hücre hatları/klinik örnekler kullanılarak belirlenmiştir. Değerlendirilmemiştir. Tablonun devamı bir sonraki sayfada 50 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

51 Tablo 11. Devamı LOD (% mutant) Ekson Mutasyon COSMIC* ID Baz değişimi Düşük Yüksek 20 S768I G>T 7,66 2,18 İnsersiyonlar _2308ins GCCAGCGTG 11, _2311insGGT 4,91 1, _2320insCAC 2,40 0,65 T790M C>T 9,72 5,09 21 L858R T>G 5,94 1,13 L861Q T>A 2,22 0,66 * COSMIC: Kanserde somatik mutasyonlar kataloğu: LOD değerleri, hücre hatları/plazmidler kullanılarak belirlenmiştir. LOD değerleri, hücre hatları/klinik örnekler kullanılarak belirlenmiştir. Değerlendirilmemiştir. Etkileşim Nekrotik dokunun etkileri EGFR mutant ve yabani tip örneklerinin %50 kadarını içeren nekrotik dokuya sahip NSCLC FFPE klinik örnekleri, therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin sonuçları ile etkileşmemiştir. Eksojen maddeler DNA numunesi alma işlemindeki potansiyel engelleyici maddeler, 10 konsantrasyondaki mutant ve yabani tip örneklerde test edilmiştir: parafin mumu, ksilen, etanol ve proteinaz K. Sonuçlar, bu maddelerin therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin sonuçları ile etkileşmediğini göstermiştir. Yeniden üretilebilirlik Lotlar arası tekrarlanabilirlik therascreen EGFR RGQ PCR Kit test sistemi 2 ayrı kit kullanır: DNA izolasyonu için QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAamp DSP DNA FFPE Doku Kitine işlevsel olarak eşdeğer) ve DNA amplifikasyonu ve EGFR mutasyon durumunun tespiti için therascreen EGFR RGQ PCR Kiti. Lotlar arası tekrarlanabilirlik ve değiştirilebilirlik, 3 QIAamp DSP DNA FFPE Doku Kiti lotu ve 3 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti lotu kullanılarak gösterilmiştir. EGFR therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

52 mutasyon testinin lotlar boyunca toplam doğru sonuç yüzdesi %97,8 (317/324) ve yabani tip örneklerinki %100'dü (379/379). Numune kullanımı QIAamp DSP DNA FFPE Doku Kitinin tekrarlanabilirliği, özellikle ekson 19 delesyon mutasyonu ( del15), ekson 21 L858R mutasyon numunesi ve bir yabani tip numunesi olmak üzere, 3 FFPE numune bloğundan alınan kesitler kullanılarak incelenmiştir. Her numune için, numune ekstraksiyonları 3 sahada çiftler halinde gerçekleştirilmiş ve numune başına toplam 18 veri noktası elde edilecek şekilde 6 günlük bir süre boyunca ardışık olmayan 3 günde test edilmiştir. Her sahada, 2 operatör sahalar boyunca aynı therascreen EGFR RGQ PCR Kit lotu ile birlikte QIAamp DSP DNA FFPE Doku Kitinin bir lotunu (her saha için bir lot, toplamda 3 lot) kullanılarak testleri gerçekleştirmiştir. Tüm mutant ve yabani tip numune sonuçları geçerliydi ve DNA izolasyonunun pre-analitik adımındaki therascreen EGFR RGQ PCR Kiti için yeniden üretilebilirlik ve tekrarlanabilirliği destekleyecek şekilde beklenen sonucu vermiştir (doğru sonuç = her numune için %100, 18/18). Hassasiyet ve yeniden üretilebilirlik therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin hassasiyeti ve yeniden üretilebilirliği, therascreen EGFR RGQ PCR Kitindeki 7 mutasyon testinin tümünü gösterecek şekilde, NSCLC FFPE klinik numuneleri veya FFPE hücre hatlarından alınan DNA test edilerek araştırılmıştır. NSCLC yabani tip FFPE klinik numuneleri de çalışmaya dahil edilmiştir (Tablo 12). 3 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti lotu ile (3 saha boyunca 3 lot), toplam 16 gün boyunca, çiftler halinde test edilen her örnekle (LOD değerine yakın bir düzeyde hazırlanmış olan) her sahada 2 operatör, saha başına 2 cihaz kullanılarak, 3 laboratuvarda (sahalar) örnekler test edilerek test yeniden üretilebilirliğini değerlendirmeye yönelik bir matris çalışma tasarımı uygulanmıştır. Her ayrı mutasyon için yeniden üretilebilirlik, her sahada ardışık olmayan günler boyunca gerçekleştirilmiştir. Doğru sonuçların oranı Tablo 12'te gösterilmiştir. 52 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

53 Tablo 12. Test yeniden üretilebilirliği Test edilen EGFR mutasyonları için doğru sonuçların oranı Ekson Mutasyon COSMIC* ID Doğru/ toplam Sonuçlar Doğru sonuç % % Doğru 18 G719A /78 98,72 94,06 19 Delesyonlar / / / / / / / / / / / / / / S768I / İnsersiyonlar / / T790M / L858R / L861Q / Yabani tip 84/84 84/ Daha düşük tek taraflı %95 CI * COSMIC: Kanserde somatik mutasyonlar kataloğu: therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

54 Çalışma içi, çalışmalar arası, günler arası, lotlar arası ve sahalar arası değişkenliğe yönelik standart sapma ve %95 güven aralıklarını belirlemek için değişim bileşeni analizi gerçekleştirilmiştir. Tüm değişim bileşenleri boyunca, toplam değişkenlik katsayısı (CV), test edilen tüm EGFR mutasyonları için %14,11'di. Tüm mutant panel üyeleri için, yüzde CV değeri lotlar arası, günler arası ve çalışmalar arasında %8,33 olmuştur. Çalışma içi değişkenlik için yüzde CV değeri (tekrarlanabilirlik/hassasiyet) %5,99 ile %13,49 arasında değişmiştir. Klinik Performans Klinik sonuç verileri - GIOTRIF LUX-Lung 3 klinik çalışması, EGFR aktive edici bir mutasyona sahip evre IIIB veya IV akciğer adenokarsinomu olan hastalar için başlangıç tedavisi olarak, kemoterapiye karşı uluslararası, çok merkezli, açık etiketli, randomize Faz 3 bir afatinib çalışmasıydı (ClinicalTrials.gov number NCT ). Bir hastanın çalışmaya alınmaya uygunluğu, Klinik Çalışma Testi (CTA) kullanılarak hastanın EGFR mutasyon durumu test edilerek belirlenmiştir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti kullanılarak doku numunelerinin retrospektif testi gerçekleştirilmiştir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ve CTA arasındaki uyumluluğu değerlendirmek için destekleyici bir çalışma yapılmıştır. CTA test sonuçlarına bağlı olarak, 345 hasta randomize edilmiş gruptaydı (afatinib: 230 hasta; kemoterapi: 115 hasta). Primer etkinlik sonucu, bağımsız bir inceleme komitesi (IRC) tarafından değerlendirildiği gibi ilerlemesiz sağkalım (PFS) şeklindeydi. Randomize edilen 345 hasta arasında, 264 hastadan elde edilen tümör örnekleri (afatinib: 178 hasta; kemoterapi: 86 hasta), therascreen EGFR RGQ PCR Kiti kullanılarak retrospektif olarak test edilmiştir. IRC tarafından belirlendiği gibi, genel CTA+ popülasyonu ve therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+ popülasyonunda, afatinib için randomize edilen hastalarda kemoterapi için randomize edilen hastalarla karşılaştırıldığında, PFS'de istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterilmiştir. Genel etkinlik sonuçları Tablo 13 ve Şekil 19'da özetlenmiştir. 54 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

55 Tablo 13. LUX-Lung 3 klinik çalışma popülasyonunda, therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile test edilen hastalarla ilgili klinik fayda Parametre therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+ popülasyon n = 264 Kemoterapi n = 86 İlerlemesiz sağkalım PFS Afatinib n = 178 CTA+ popülasyon n = 345 Kemoterapi n = 115 Afatinib n = 230 Ölüm veya ilerleme sayısı, N (%) 53 (%61,6) 120 (%67,4) 69 (%60,0) 152 (%66,1) Medyan PFS (ay) 6,9 11,2 6,9 11,1 Medyan PFS %95 CI [5,3, 8,2] [9,7, 13,7] [5,4, 8,2] [9,6, 13,6] Risk oranı 0,49 0,58 Risk oranı %95 CI [0,35, 0,69] [0,43, 0,78] P değeri (sınıflandırılmış log sıra sınaması)* < 0,0001 < 0,001 * EGFR mutasyon durumu ve ırka göre sınıflandırılmış. Şekil 19. Tedavi grubuna göre bağımsız inceleme ile ilerlemesiz sağkalım (PFS) Kaplan-Meier eğrisi (therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+ popülasyon). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

56 therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA+ alt kümesinin (n = 264) analizi, afatinib ile tedavi edilen hastaların PFS süresinde önemli artış olduğunu (medyan PFS 11,2 ve 6,9 ay) ve kemoterapi ile tedavi edilen hastalara göre ilerleyici hastalık veya ölüm olayının (HR = 0,49, %95 CI [0,35; 0,69], p < 0,0001) daha az olası olduğunu ortaya koymuştur. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile teste edilen hasta alt kümesinde gözlenen klinik fayda, tam çalışma popülasyonunda (n = 345) gözlenen klinik fayda ile karşılaştırılabilirdi. Klinik sonuç verileri IRESSA IRESSA Takip Ölçümü (IFUM) çalışması, IIIA/B/IV aşamasında, EGFR mutasyon pozitif bölgesel olarak ilerlemiş veya metastaz yapmış NSCLC'li beyaz hastalarda birinci basamak gefitinib tedavisinin etkililiğini ve güvenliliğini/tolere edilebilirliğini belirlemek üzere Faz 4, açık etiketli, tek kollu bir çalışmadır (NCT ). IFUM çalışması, prospektif olarak seçilmiş beyaz EGFR mutant NSCLC hastalarında RECIST kriterine göre objektif yanıt oranını değerlendirmek için tasarlanmıştır. Uygun hastaların tümör örneklerinde Clinical Trial Assay (CTA) (Klinik Çalışma Testi) ile prospektif olarak belirlenmiş EGFR ekson 19 delesyonu; L858R, L861Q veya G719X substitüsyon mutasyonu bulunması ve T790M veya S768I mutasyonu veya ekson 20 insersiyonu bulunmaması gerekmektedir. IFUM klinik çalışması için muayene edilmiş hastalardan alınan örneklerin retrospektif testi, diyagnostik therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile yapılmıştır. therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin IFUM klinik çalışması için hasta seçmek amacıyla kullanılan CTA ile uyumluluğunu değerlendirmek için destekleyici bir çalışma yapılmıştır. EGFR ekson 19 delesyonlarını ve L858R mutasyonunu tespit etmede iki test arasındaki genel uyumluluk %98,2'dir (n = 700/713; %95 CI: %96,9, %99,0); ilgili PPA değeri %88,2'dir (n = 90/102; %95 CI: %80,4, %93,8 ve NPA değeri %99,8'dir (n = 610/611; %95 CI: %99,1, %100,0). Muayene edilen 859 hastanın CTA test sonuçları alınmış ve 106 hasta gefitinib ile tedaviye uygun bulunmuştur. Bir CTA sonucu olan 859 örnekten hem CTA hem de therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile EGFR mutasyon pozitif bulunmuş 87 örnek dahil 765 örnek therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile retrospektif olarak test edilmeye uygun bulunmuştur. Ana etkililik sonucu, Kör Bağımsız Merkezi İnceleme (BICR) ve araştırmacılar tarafından değerlendirilen objektif yanıt oranı (ORR) olmuştur. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile test edilen hasta alt kümesinde gözlenen klinik fayda, çalışma popülasyonunun tamamında gözlenen klinik fayda ile karşılaştırılabilirdir. Genel etkililik sonuçları Tablo 14'te özetlenmiştir. 56 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

57 Tablo 1. IFUM klinik çalışma popülasyonunda, therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile test edilen hastalarla ilgili klinik fayda Parametre therascreen EGFR RGQ PCR Kit+ popülasyonu n = 87 BICR tarafından objektif yanıt oranı (ORR) CTA+ popülasyonu n = 106 Yanıt sayısı (N) ORR, % (%95 CI) Yanıtların medyan süresi (ay) 48,3 (38,1 58,6) 6,9 (5,6 11,4) Araştırmacılar tarafından objektif yanıt oranı (ORR) 50,0 (40,6 59,4) 6,0 (5,6 11,1) Yanıt sayısı (N) ORR, % (%95 CI) Yanıtların medyan süresi (ay) 71,3 (61,0 79,7) 8,3 (7,2 11,3) 69,8 (60,5 77,7) 8,3 (7,6 11,3) BICR: Körleştirilmiş bağımsız merkezi inceleme; CI: Güven aralığı; CTA: Klinik çalışma testi. Not: Kit+, ekson 19 delesyonları/l8585r/l861q/g719x için pozitif sonuçlardır. therascreen EGFR RGQ PCR Kitinin IFUM klinik çalışması için hasta seçmekte kullanılmadığı düşünüldüğünde, CTA ile negatif test edildiği için çalışmaya dahil edilmeyen ancak therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ile pozitif test edilebilecek (yani therascreen EGFR RGQ PCR Kit+/CTA-) ve çalışmaya katılan ancak therascreen EGFR RGQ PCR Kitinden geçerli tekrar testi sonuçları almayan (yani therascreen EGFR RGQ PCR Kiti bilinmiyor/cta+) hastaları göz önünde bulundurmak için ek etkililik analizleri gerçekleştirilmiştir. Tüm varsayımsal analizlerden gelen sonuçlar birincil etkililik analizinden gelen sonuçlara genel olarak benzerdir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

58 Referanslar Alıntı yapılan referanslar 1. Pao, W. and Miller, V.A. (2005) Epidermal growth factor receptor mutations, small molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions. J. Clin. Oncol. 23, Johnson, B.E. and Jaenne, P.A. (2005) Epidermal growth factor receptor mutations in patients with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 65, Inoue, A., Suzuki. T., Fukuhara, T., Maemondo, M., and Kimura, Y. (2006) Prospective Phase II study of gefitinib for chemotherapy-naive patients with advanced non-small cell lung cancer with epidermal growth factor receptor gene mutations. J. Clin. Oncol. 24, Asahina, H., et al. (2006) A Phase II study of gefitinib as a first-line therapy for advanced non-small cell lung cancers with epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutations. 42nd Ann Mtg of the American Society of Clinical Oncology (ASCO), Atlanta 2-6 June J. Clin. Oncol. 24 (18S) (Suppl), Abstr Paz-Ares, L. et al. A prospective phase II trial of erlotinib in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients (p) with mutations in the tyrosine kinase (TK) domain of the epidermal growth factor receptor (EGFR). 42nd Ann Mtg of the American Society of Clinical Oncology (ASCO), Atlanta 2-6 June J. Clin. Oncol. 24 (18S) (Suppl), Abstr Kobayashi, K., et al. (2008) First-line gefitinib for poor PS patients with EGFR mutations. 44th Ann Mtg of the American Society of Clinical Oncology (ASCO), Chicago 31 May-3 June J. Clin. Oncol. 26 (15S) (Suppl), Abstr Sequist, L.V., et al. (2008) First-line gefitinib in patients with advanced non-small cell lung cancer harbouring somatic EGFR mutations. J. Clin. Oncol. 15, Porta, R. et al. (2008) Erlotinib customization based on epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in stage IV non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients (p). J. Clin. Oncol. 26 (May 20 suppl), abstr Jaene, P.A. and Johnson, B.E. (2006) Effect of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain mutation on the outcome of patients with non-small cell lung cancer treated with epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. rd Cambridge Con on Novel Agents in the Treatment of Lung Cancer: Advances in EGFR-Targeted Agents, Cambridge, Sep Clin. Cancer Res. 12 (Suppl.14), therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

59 10. Whitcombe, D. et al. (1999) Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17, Thelwell, N. et al. (2000) Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2004). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation: Approved Guideline, 1st ed. CLSI Document EP-17A. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

60 Semboller Aşağıdaki semboller ambalaj ve etiket üzerinde görülebilir: <N> <N> reaksiyon için yeterli reaktif içerir Son kullanma İn vitro tanı amaçlı tıbbi cihaz Katalog numarası Lot numarası Materyal numarası Güneş ışığından uzak tutun Küresel Ticaret Parça Numarası Rn R harfi El Kitabı revizyonunu, n harfi ise revizyon numarasını temsil eder Sıcaklık sınırlaması Üretici Kullanım talimatlarına bakın Dikkat 60 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

61 Ek A: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Manuel Protokol Bu bölüm, therascreen EGFR RGQ PCR Kitini açık modda Rotor-Gene Q yazılım sürümü 2.3 ile kullanma talimatlarını içerir (örn. Rotor-Gene Q therascreen EGFR CE Test Paketini kullanmadan). Genel bilgiler Gereken malzeme listesi için, bkz. Gerekli Olan Ancak Sağlanmayan Malzemeler, sayfa 11. Örnek hazırlama ve örnek düzeni ile ilgili tüm talimatlar için, Protokol: Örnek değerlendirmesi, sayfa 16 ve Protokol: EGFR mutasyon tespiti, sayfa 26. Her çalışmaya başlamadan önce, döngü parametrelerinin doğru olduğundan emin olun. Protokol: Sıcaklık profili oluşturma Başlamadan önce, therascreen EGFR RGQ PCR Kit analizi için bir sıcaklık profili oluşturun. Döngü parametreleri, DNA örneği değerlendirmesi ve EGFR mutasyon tespiti için aynıdır. Prosedür Döngü parametrelerin bir özeti Tablo 15'de gösterilmiştir. Tablo 15. Sıcaklık profili Döngü Sıcaklık Süre Veri taraması 1 95 C 15 dakika Yok C 60 C 30 saniye 60 saniye Yok Yeşil ve sarı 1. Rotor-Gene Q MDx cihazına bağlı olan bilgisayarın masa üstündeki Rotor-Gene Q Series Yazılım 2.3 simgesine çift tıklayın. 2. Yeni şablon oluşturmak için Empty Run (Boş Çalışma) seçimini yapın ve ardından New Run Wizard a (Yeni Çalışma Sihirbazı) girmek için New (Yeni) seçeneğine tıklayın. 3. Rotor tipi olarak 72-Well Rotor (72 Kuyulu Rotor) seçimini yapın. Kilitleme halkasının takıldığını doğrulayın ve Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Takılı) kutusunu işaretleyin. Next (İleri) düğmesine tıklayın (Şekil 20). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

62 1 2 Şekil 20. New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) diyalog kutusu (1 = Rotor type (Rotor tipi); 2 = Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Takılı) kutusu; 3 = Next (İleri) düğmesi). 4. Operatörün adını girin. Herhangi bir not ekleyin ve reaction volume (reaksiyon hacmi) değerini 25 olarak girin. Sample Layout (Örnek Düzeni) kısmının 1, 2, 3 olarak okunduğundan emin olun. Next (İleri) düğmesine tıklayın (Şekil 21) Şekil 21. Operatör adı ve reaksiyon hacimlerini girme (1 = Operator (Operatör) diyalog alanı ve Notes (Notlar) diyalog alanı; 2 = Reaction Volume (Reaksiyon Hacmi) alanı ve Sample Layout (Örnek Düzeni) alanı; 3 = Next (İleri) düğmesi) therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

63 5. New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) diyalog kutusundaki (Şekil 22) Edit Profile (Profili düzenle) düğmesine tıklayın ve aşağıdaki adımlara göre çalışma parametrelerini kontrol edin. Şekil 22. New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) diyalog kutusundaki Edit Profile (Profili düzenle) düğmesi. 6. Insert after (Sonra Ekle) düğmesine tıklayın ve New Hold at Temperature (Yeni Sıcaklıkta Tutma) seçimini yapın (Şekil 23). 1 2 Şekil 23. Başlangıç inkübasyon adımı ekleme (1 = Insert after (Sonra Ekle) düğmesi; 2 = New Hold at Temperature (Yeni Sıcaklıkta Tutma)). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

64 7. Hold Temperature (Tutma Sıcaklığı) seçeneğini 95 C ve Hold Time (Tutma Süresi) seçeneğini 15 dak. 0 sn. olarak değiştirin. Insert After (Sonra Ekle) düğmesine tıklayın ve ardından New Cycling (Yeni Döngü) seçimini yapın (Şekil 24.) Şekil C'de başlangıç inkübasyon adımı (1 = Hold Temperature and Hold Time (Tutma Sıcaklığı ve Tutma Süresi) düğmesi; 2 = Insert after (Sonra Ekle) düğmesi; 3 = New Cycling (Yeni Döngü)). 8. Cycle repeats (Döngü tekrarları) sayısını 40 olarak değiştirin. İlk adımı seçin ve 95 C for 30 secs (30 sn. süreyle 95 C) olarak ayarlayın (Şekil 25) Şekil C'de döngü adımı (1 = Cycle repeats (Döngü tekrarları) kutusu; 2 = Adım bir: sıcaklık ayarı; 3 = Adım bir: süre ayarı). 64 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

65 9. İkinci adımı vurgulayın ve 60 C for 60 secs (60 sn. süreyle 60 C) olarak ayarlayın. Not Acquiring (Alınmıyor) düğmesini seçerek bu adım sırasında veri alımını etkinleştirin (Şekil 26). 2 1 Şekil C'de döngü adımı (1 = Adım iki: sıcaklık ve süre ayarı; 2 = Not Acquiring (Alınmıyor) düğmesi). 10. Bu kanalları Available Channels (Kullanılabilir Kanallar) listesinden aktarmak için > düğmesini seçerek tarama kanallarını Green (Yeşil) ve Yellow (Sarı) olarak ayarlayın. OK (Tamam) düğmesine tıklayın (Şekil 27). 1 2 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

66 Şekil C döngü adımındaki tarama (1 = Seçilen kanallar; 2 = OK (Tamam) düğmesi). 11. Üçüncü adımı vurgulayın ve - düğmesine tıklayarak silin. OK (Tamam) düğmesine tıklayın (Şekil 28). 2 1 Şekil 28. Uzama adımının kaldırılması (1 = Üçüncü adım; 2 = Sil düğmesi; 3 = OK (Tamam) düğmesi). 12. Bir sonraki iletişim kutusunda, Gain Optimisation (Optimizasyon Sağlama) seçeneğine tıklayın (Şekil 29). 3 1 Şekil 29. Optimizasyon sağlama (1). 66 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

67 13. Optimise Acquiring (Taramayı Optimize Et) düğmesine tıklayın. Her bir kanal için kanal ayarları görüntülenir. İki kanal için de OK (TAMAM) düğmesine tıklayarak varsayılan bu değerleri kabul edin (Şekil 30) Şekil 30. Yeşil kanal için otomatik optimizasyon sağlama (1 = Optimise Acquiring (Taramayı Optimize Et) düğmesi; 2 = OK (Tamam) düğmesi). 14. Perform Optimisation before 1st Acquisition (Optimizasyonu İlk Taramadan Önce Gerçekleştir) kutusunu işaretleyin ve ardından sihirbaza dönmek için Close (Kapat) düğmesine tıklayın (Şekil 31). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

68 1 2 Şekil 31. Yeşil ve sarı kanalların seçimi (1 = Perform Optimisation Before 1st Acquisition (Optimizasyonu İlk Taramadan Önce Gerçekleştir) işaret kutusu; 2 = Close (Kapat) düğmesi). 15. Save Template (Şablonu Kaydet) öğesini seçerek, therascreen EGFR RGQ PCR Kit şablonunu (*.ret dosyası) uygun bir konuma kaydetmek için Next (İleri) düğmesine (Şekil 32) tıklayın. 1 Şekil 32. Next (İleri) düğmesi (1). 68 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

69 Prosedür (Manuel) Protokol: Örnek değerlendirme (manuel) Bu protokol, örneklerdeki toplam çoğaltılabilir DNA'yı değerlendirmek için kullanılır ve EGFR mutasyon analizinden önce gerçekleştirilmelidir. Örnekleri, Protokol: Örnek değerlendirmesi sayfa 16, 11. adıma kadar açıklandığı şekilde hazırlayın. Rotor-Gene Q MDx cihazındaki PCR çalışmasını, sayfa 70, Protokol: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q kurulumu kısmında açıklandığı şekilde düzenleyin. Çalışma tamamlandıktan sonra, verileri sayfa 76, Örnek değerlendirme veri analizi kısmındaki talimatlara göre analiz edin. Protokol: EGFR mutasyon tespiti (manuel) Örnek, örnek değerlendirmesini geçtikten sonra EGFR mutasyonlarının tespiti için test edilebilir. Örnekleri, Protokol: EGFR mutasyon tespiti sayfa 26, 11. adıma kadar açıklandığı şekilde hazırlayın. Rotor-Gene Q MDx cihazındaki PCR çalışmasını, sayfa 70, Protokol: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q kurulumu kısmında açıklandığı şekilde düzenleyin. Çalışma tamamlandıktan sonra, verileri sayfa 77, EGFR mutasyon tespiti veri analizi kısmındaki talimatlara göre analiz edin. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

70 Protokol: therascreen EGFR RGQ PCR Kit Rotor-Gene Q kurulumu Prosedür 1. Rotor-Gene Q serisi yazılım sürümü 2.3'ü açın ve uygun therascreen EGFR RGQ PCR Kit sıcaklık profilini (*.ret dosyası) açın. Sıcaklık profili oluşturma ve çalışma parametrelerini kontrol etme talimatları için, bkz. Protokol: Sıcaklık profili oluşturma sayfa Doğru rotorun seçildiğinden emin olun ve kilitleme halkasının takıldığını doğrulamak için kutuyu işaretleyin. Next (İleri) düğmesine tıklayın (Şekil 33) Şekil 33. New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) diyalog kutusu ve hoş geldiniz ekranı (1 = Rotor tipi ; 2 = Locking Ring Attached (Kilitleme Halkası Takılı) kutusu; 3 = Next (İleri) düğmesi). 70 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

71 3. Operatörün adını girin. Notlar ekleyin, reaksiyon hacminin 25'e ve Sample Layout (Örnek Düzeni) alanının 1, 2, 3 değerlerini okuduğunu kontrol edin. Next (İleri) düğmesine tıklayın (Şekil 34) Şekil 34. New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) seçenek ekranı (1 = Operator (Operatör); 2 = Notes (Notlar) alanı; 3 = Reaction Volume (Reaksiyon Hacmi); 4 = Sample Layout (Örnek Düzeni) alanı; 5 = Next (İleri) düğmesi). 4. İleri penceresi, sıcaklık profilinin düzenlenmesini sağlar. ( Protokol: Sıcaklık profili oluşturma, sayfa 61'daki talimatlara göre, sıcaklık profili oluşturulduğundan düzenlemeye gerek yoktur.) Next (İleri) düğmesine tıklayın (Şekil 35). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

72 Şekil 35. New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) diyalog kutusu ve sıcaklık düzenleme ekranı (1 = Next (İleri) düğmesi). 5. Özeti kontrol edin ve çalışma dosyasını kaydederek çalışmayı başlatmak için Start Run (Çalışmayı Başlat) düğmesine tıklayın (Şekil 36). 1 1 Şekil 36. New Run Wizard (Yeni Çalışma Sihirbazı) diyalog kutusu ve özet ekranı (1 = Start Run (Çalışmayı Başlat) düğmesi). 72 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

73 6. Çalışma başlatıldıktan sonra, yeni bir pencere açılır. Örnek adlarını o anda girebilirsiniz ya da çalışma sırasında veya çalışma tamamlandığında Finish (Bitti) düğmesine tıklayıp Sample (Örnek) düğmesini seçerek sonradan da girebilirsiniz. Finish and Lock Samples (Bitir ve Örnekleri Kilitle) düğmesinin tıklanması, örnek adlarını düzenlemenizi engelleyecektir. Kullanıcı, doğru örnek test ve analizini sağlamak için örnek adlarını girerken özellikle dikkat etmelidir. Not: Örnekleri adlandırırken, boş tüplere yönelik alanlar, Name (Ad) sütununa boş bırakılmalıdır. 7. Çalışma tamamlandıktan sonra, verileri Örnek değerlendirme veri analizi, sayfa 76 veya EGFR mutasyon tespiti veri analizi, sayfa 77, kısımlarına göre uygun görüldüğü şekilde analiz edin. 8. Miktar tayini raporları gerekirse, Rotor-Gene Q çalışma dosyasındaki araç çubuğunda yer alan Reports (Raporlar) simgesine tıklayın. 9. Rapor tarayıcıda, Report Categories (Rapor Kategorileri) altındaki Cycling A. Green (Page 1) (Döngü A. Yeşil (Sayfa 1)) düğmesine tıklayın (Şekil 37). 1 Şekil 37. Rapor tarayıcı (1 = Cycling A. Green (Page 1) (Döngü A. Yeşil (Sayfa 1) düğmesi). 10. Templates (Şablonlar) sekmesi altındaki Quantitation (Full Report) (Miktar Tayini (Tam Rapor)) düğmesini seçin (Şekil 38). 1 Şekil 38. Miktar tayini raporu (Tam Rapor) (1). 11. Rapor oluşturmak için Show (Göster) düğmesine tıklayın. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

74 12. Elektronik sürümünü kaydetmek için Save As (Farklı Kaydet) düğmesine tıklayın. 13. (1 = Cycling A. Green (Page 1) (Döngü A. Yeşil (Sayfa 1) için tekrarlayın. 74 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

75 Sonuçların Yorumlanması (Manuel) therascreen EGFR RGQ PCR Kit çalışması (DNA örneği değerlendirme veya EGFR mutasyon analizi için) tamamlandıktan sonra, aşağıdaki prosedürlere göre verileri analiz edin: Analiz için yazılım ayarları DNA örneği değerlendirme analizi (manuel) Not: Tüp düzeni için, bkz. Tablo 4, sayfa 18 EGFR mutasyon tespiti analizi (manuel) Not: Tüp düzeni için, bkz. Tablo 7, sayfa 29 Yazılım analiz ayarları 1. Rotor-Gene Q serisi yazılım sürümü 2.3'ü kullanarak uygun çalışma dosyasını (*.rex) açın. 2. Çalışmayı gerçekleştirmeden önce örnekleri halihazırda adlandırmadıysanız, Edit Samples (Örnekleri Düzenle) düğmesine tıklayın. 3. Name (Ad) sütununa örnek adlarını girin. Not: Boş tüplerin adlarını boş bırakın. 4. Analysis (Analiz) seçeneğine tıklayın. Analiz sayfasında, Sarı (HEX) kanalını kontrol etmek için Cycling A. Yellow (Döngü A. Sarı) seçeneğine tıklayın. 5. Named On (Adlandırıldı) düğmesine tıklayın. Not: Bu, analizin boş tüpleri içermemesini sağlar. 6. Dynamic tube (Dinamik tüp) öğesini seçin. 7. Slope correct (Eğim düzeltme) öğesini seçin. 8. Linear scale (Doğrusal ölçek) öğesini seçin. 9. Take Off Adj. (Kalkış Noktası Ayarı) öğesini seçin ve üstteki kutuya 15,01 ( If take off point was calculated before cycle (kalkış noktası döngüden önce hesaplandıysa)) ve alttaki kutuya 20,01 ( then use the following cycle and take off point (aşağıdaki döngüyü ve kalkış noktasını kullanın)) değerlerini girin. 10. Eşik değerini 0,02 olarak ayarlayın ve Sarı (HEX) kanal CT değerlerini kontrol edin. 11. Analiz sayfasında, Yeşil (FAM) kanalını görüntülemek için Cycling A. Green (Döngü A. Yeşil) seçeneğine tıklayın. 12. Named On (Adlandırıldı) öğesini seçin. 13. Dynamic tube (Dinamik tüp) öğesini seçin. 14. Slope correct (Eğim düzeltme) öğesini seçin. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

76 15. Linear scale (Doğrusal ölçek) öğesini seçin. 16. Take Off Adj. (Kalkış Noktası Ayarı) öğesini seçin ve üstteki kutuya 15,01 ( If take off point was calculated before cycle (kalkış noktası döngüden önce hesaplandıysa)) ve alttaki kutuya 20,01 ( then use the following cycle and take off point (aşağıdaki döngüyü ve kalkış noktasını kullanın)) değerlerini girin. 17. Eşik değerini 0,075 olarak ayarlayın ve Yeşil (FAM) kanal CT değerlerini kontrol edin. Örnek değerlendirme veri analizi DNA örneği değerlendirme çalışması tamamlandıktan sonra, sayfa 75, Yazılım analiz ayarları kısmına bakın ve verileri aşağıdaki gibi analiz edin. (Tüp düzeni için, bkz. Tablo 4, sayfa 18.) Çalışma kontrol analizi Negatif kontrol Şablonda kontaminasyon olmadığından emin olmak için, NTC, Yeşil (FAM) kanalında 40'ın altında bir CT değeri oluşturmamalıdır. Çalışmanın doğru olarak kurulduğundan emin olmak için NTC, Sarı (HEX) kanalda 29,85 ila 35,84 aralığında amplifikasyon göstermelidir. Belirtilen değerler aralık dahilindedir ve bu değerleri içerir. Pozitif kontrol EGFR PC, Yeşil (FAM) kanalında 28,13 ila 34,59.aralığında bir CT değeri vermelidir. Bu aralığın dışındaki bir değer, test kurulum sorunu olduğunu gösterir. Çalışma başarısız olmuştur. Not: Negatif veya pozitif kontrollerinden herhangi biri başarısız olmuşsa örnek verileri kullanılmamalıdır. Örnek analizi DNA örneği inceleme çalışması kontrolleri geçerliyse, analiz devam edebilir. Bir örneğin kontrol CT değeri, Yeşil (FAM) kanalında 23,70 ila 31,10 aralığı içinde olmalıdır. Örnek CT değeri bu aralığın dışındaysa, aşağıdaki talimatlar verilmiştir. Örnek kontrol testi CT değeri < 23,70 Kontrol CT değeri < 23,70 olan örnekler (yüksek DNA konsantrasyonu) mutasyon testlerine aşırı yüklenmiştir ve seyreltilmelidir. Düşük seviyedeki her bir mutasyonu saptamak için yüksek konsantrasyonlu örnekler, 23,70 ila 31,10 CT aralığı içinde olacak şekilde seyreltilir. Örnek DNA'sının seyreltilmesi CT değerini yükseltir (1:1 oranında seyreltme CT değerini yaklaşık 1,0 değerinde yükseltir). Örnekleri kit içinde verilen suyu kullanarak seyreltin (Seyreltme Suyu [Dil.]). 76 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

77 Örnek kontrol testi CT değeri > 31,10 Yeşil (FAM) kanalında CT > 31,10 değerinde bir kontrolle örneklerin yeniden alınması önerilir. Test için belirtilen eşik değerlerindeki tüm EGFR mutasyonlarını tespit etmek için yetersiz başlangıç DNA şablonu bulunur. EGFR mutasyon tespiti veri analizi Bir örnek, EGFR mutasyonlarını tespit etmek amacıyla test edilmeden önce DNA örneği incelemesinden geçmelidir (bkz. Örnek değerlendirme veri analizi, sayfa 76). EGFR mutasyon tespit çalışması tamamlandıktan sonra, sayfa 75, Yazılım analiz ayarları kısmına bakın ve verileri aşağıdaki gibi analiz edin. (Tüp düzeni için, bkz. Tablo 7, sayfa 29.) Çalışma kontrol analizi Şekil 39'daki çalışma kontrol analizi akış şemasına bakın. Negative Control FAM C T value Is FAM C T <40? YES NO Negative Control Pass YES Is HEX C T in range to 35.84? NO RUN FAIL Positive Control FAM C T value Is control FAM C T tube in range to 34.59? YES Is T790M FAM C T tube in range to 34.98? YES Is Deletions FAM C T tube in range to 34.90? NO NO NO RUN FAIL RUN FAIL RUN FAIL YES NO NO NO NO Is L858R FAM C T tube in range to 34.81? YES Is L861Q FAM C T tube in range to 34.02? YES Is G719X FAM C T tube in range to 34.19? YES Is S768I FAM C T tube in range to 35.19? RUN FAIL YES NO Is Insertions FAM C T tube in range to 34.09? YES Positive Control Pass Proceed to sample analysis Şekil 39. EGFR mutasyon tespitine yönelik çalışma kontrol analizi akış şeması. Negatif kontrol Şablonda kontaminasyon olmadığından emin olmak için, her bir EGFR mutasyon testine yönelik NTC, Yeşil (FAM) kanalında 40'ın altında bir CT değeri oluşturmamalıdır. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

78 Çalışmanın doğru olarak kurulduğundan emin olmak için NTC, Sarı (HEX) kanalda 29,85 ila 35,84 aralığında amplifikasyon göstermelidir. Belirtilen değerler aralık dahilindedir ve bu değerleri içerir. Pozitif kontrol Her EGFR mutasyon testi için, EGFR PC, Tablo 16'te gösterildiği gibi Yeşil (FAM) kanalında bir CT değeri vermelidir. Bu aralığın dışındaki bir değer, test kurulum sorunu olduğunu gösterir. Çalışma başarısız olmuştur. Not: Negatif veya pozitif çalışma kontrollerinden herhangi biri başarısız olmuşsa örnek verileri kullanılmamalıdır. Tablo 16. Reaksiyon pozitif kontroller için kabul edilebilir CT aralıkları (EGFR mutasyon tespit testi) Reaksiyon Karışımı Örnek Kanal CT aralığı Kontrol PC Yeşil 28,13 ila 34,59 T790M PC Yeşil 30,22 ila 34,98 Delesyonlar PC Yeşil 28,90 ila 34,90 L858R PC Yeşil 29,97 ila 34,81 L861Q PC Yeşil 28,49 ila 34,02 G719X PC Yeşil 29,42 ila 34,19 S768I PC Yeşil 28,98 ila 35,19 İnsersiyonlar PC Yeşil 27,92 ila 34,09 Örnek analizi Örnek kontrolü Yeşil (FAM) kanal CT değeri EGFR mutasyon tespit çalışmasına yönelik pozitif ve negatif kontroller geçerliyse, örneklerdeki EGFR mutasyon tespitine devam edilebilir. Yeşil (FAM) kanalında bir örnek için kontrol CT değeri, 23,70 ila 31,10 aralığında olmalıdır. (Tüp düzeni için, bkz. Tablo 7, sayfa 29.) Örnek kontrol CT değeri bu aralığın dışındaysa, aşağıdaki talimatlar verilmiştir. Örnek kontrol testi CT değeri < 23,70 Kontrol CT değeri < 23,70 olan örnekler (yüksek DNA konsantrasyonu) mutasyon testlerine aşırı yüklenmiştir ve seyreltilmelidir. Düşük seviyedeki her bir mutasyonu saptamak için yüksek konsantrasyonlu örnekler, 23,70 ila 31,10 CT aralığı içinde olacak şekilde seyreltilir. Örnek DNA'sının seyreltilmesi CT değerini yükseltir (1:1 oranında seyreltme CT değerini yaklaşık 1,0 değerinde yükseltir). Örnekleri kit içinde verilen suyu kullanarak seyreltin (Seyreltme Suyu [Dil.]). 78 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

79 Örnek kontrol testi CT değeri > 31,10 Yeşil (FAM) kanalında CT > 31,10 değerinde bir kontrolle örneklerin yeniden alınması önerilir. Test için belirtilen eşik değerlerindeki tüm EGFR mutasyonlarını tespit etmek için yetersiz başlangıç DNA şablonu bulunur. Şekil 40'taki EGFR mutasyon tespitine yönelik örnek analizi akış şemasına bakın. Start Mutation detection Dilute Sample Sample requires dilution YES Sample control FAM CT value Is Control assay FAM CT in range to 31.10? NO Is FAM CT <23.70 YES NO Sample mutation assays HEX CT values Are any mutation HEX CT values <29.85? Is FAM CT > NO NO Sample mutation assays FAM CT values Is each mutation FAM CT in range ? Sample may not contain amplifiable DNA or could contain an inhibitor. YES Tube is FAM amplification positive YES NO Calculate DCT values for each mutation DCT = mutation CT control CT Compare DCT values to cut-off values by mutation See handbook Table 17 Sample internal control mutation assays HEX CT values Is any DCT value within the specified DCT range for the assay NO Is the mutation Internal Control HEX CT in range NO Tube Invalid YES YES Was any EGFR mutation detected? YES Sample Positive and Invalid NO EGFR mutation detected for mutation assay Mutation not detected Sample Invalid Şekil 40. EGFR mutasyon tespitine yönelik örnek analizi akış şeması. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

80 Örnek analizi Örnek internal kontrolü Sarı (HEX) kanal CT değeri Şekil 40'taki EGFR mutasyon tespitine yönelik örnek analizi akış şemasına bakın. Her örneğe ait tüm tüpler analiz edilmelidir. Her tüpün, Sarı (HEX) kanalında internal kontrolden 29,85 ila 35,84 aralığında bir HEX sinyali oluşturduğunu kontrol edin. Olası 2 sonuç söz konusudur. İnternal kontrol CT değeri herhangi bir mutasyon testi için belirtilen aralığın altında (< 29,85) yer alırsa, sonuç Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu için geçersizdir. Bu tüp için Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu geçersizdir. İnternal kontrol CT değeri belirtilen aralık içinde (29,85 ila 35,84) yer alırsa, sonuç Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu için pozitiftir Bu tüp için Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu geçerlidir. İnternal kontrol CT değeri belirtilen aralığın üstünde (> 35,84) yer alırsa, sonuç Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu için negatiftir. Yeşil (FAM) kanalında amplifikasyon varsa ve ilgili reaksiyonun DCT değeri, ilgili tüpün test eşik değerinden düşük veya bu değere eşitse, Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu geçerlidir. Tüp için Yeşil (FAM) kanalında amplifikasyon yoksa veya DCT değeri test eşik değerinden yüksekse, Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu geçersizdir. Sarı (HEX) kanalındaki internal kontrol amplifikasyonu PCR inhibisyonu nedeniyle başarısız olabilir. Örneğin seyreltilmesi inhibitörlerin etkisini azaltabilir. Bu eylemin aynı zamanda örnekteki hedef DNA'yı sulandırdığına da dikkat edilmelidir. Örnekleri kit içinde verilen suyu kullanarak seyreltin (Seyreltme Suyu [Dil.]). Örnek analizi Örnek mutasyon testleri Yeşil (FAM) kanal CT değeri Tüm 7 EGFR mutasyon reaksiyon karışımı için Yeşil (FAM) kanal değerleri, Tablo 17'da listelenen değerlerle karşılaştırılmalıdır. Belirtilen değerler aşağıda gösterilen aralık dahilindedir ve bu değerleri içerir. (Tüp düzeni için, bkz. Tablo 7, sayfa 29.) 80 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

81 Tablo 17. Yeşil (FAM) kanalındaki örnek EGFR mutasyon reaksiyonları için kabul edilebilir değerler (EGFR mutasyon tespit testi) Test CT aralığı Eşik değeri ( CT) T790M 0,00 ila 40,00 7,40 Delesyonlar 0,00 ila 40,00 8,00 L858R 0,00 ila 40,00 8,90 L861Q 0,00 ila 40,00 8,90 G719X 0,00 ila 40,00 8,90 S768I 0,00 ila 40,00 8,90 İnsersiyonlar 0,00 ila 40,00 8,00 Örneğe yönelik Yeşil (FAM) kanalı CT değeri belirtilen aralık içinde yer alıyorsa, FAM amplifikasyonu pozitiftir. Örneğe yönelik Yeşil (FAM) kanalı CT değeri belirtilen aralığın üzerindeyse veya hiç amplifikasyon yoksa, bu FAM amplifikasyonu negatiftir. Mutasyon ve kontrol CT değerlerinin aynı örnekten olduğundan emin olarak, FAM amplifikasyonu pozitif olan her EGFR mutasyon tespiti tüpü için CT değerini aşağıdaki şekilde hesaplayın. (Tüp düzeni için, bkz. Tablo 7, sayfa 29.) CT = [mutasyon testi CT değeri] [kontrol testi CT değeri] Söz konusu test için, örneğe yönelik CT değerini eşik değer noktası ile karşılaştırın (Tablo 17). Doğru eşik değerinin uygulandığından emin olun. Kesim noktası, pozitif sinyalin potansiyel olarak yabani tip DNA'daki ARMS primerinin arkaplan sinyalinden kaynaklandığı noktanın üzerindeki noktadır. Bir test için örnek CT değeri eşik değerden büyükse, örnek negatif olarak veya o test için kitin tespit sınırları dışında şeklinde sınıflandırılır. Her örnek için her bir mutasyon reaksiyonunun durumu şunlardan biri olabilir: Mutasyon saptandı Mutasyon saptanmadı Geçersiz Mutasyon saptandı Yeşil (FAM) kanal amplifikasyonu pozitif ve CT değeri, eşik değerde veya eşik değerin altındadır. Bir örnek için çoklu mutasyonlar saptanırsa, tümü bildirilebilir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

82 Mutasyon saptanmadı Yeşil (FAM) kanal amplifikasyonu pozitif ve CT değeri, eşik değerin üstündedir. Yeşil (FAM) kanal amplifikasyonu negatif ve Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu (internal kontrol) pozitiftir. Geçersiz Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu (internal kontrol) geçersizdir. Yeşil (FAM) kanal amplifikasyonu negatif ve Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu (internal kontrol) negatiftir. Not: Bir örneğin bir tüpte Sarı (HEX) kanal amplifikasyonu negatif ikinci bir tüpte ise Yeşil (FAM) kanal amplifikasyonu pozitif olabilir. Bu durumda, ikinci tüpteki mutasyon tespit edildi sonucu geçerli olarak değerlendirilebilir ancak tanımlanan özel mutasyon, o örnekteki olası tek mutasyon olmayabilir. 82 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

83 Ek B: therascreen EGFR CE Test Paketinin kurulumu therascreen EGFR RGQ PCR Kiti, Rotor-Gene Q MDx cihazı ve 72 kuyulu rotorla birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. therascreen EGFR CE Assay Package (Test Paketi), CD halinde (kat. no ) ayrıca satılır. Test paketi, therascreen EGFR CE Control Run Locked Template (therascreen EGFR CE Kontrol Çalışması Kilitli Şablon) ve therascreen EGFR CE Locked Template (therascreen EGFR CE Kilitli Şablon) içerir. Not: therascreen EGFR CE Test Paketi, yalnızca Rotor-Gene Q yazılım sürümü 2.3 ile uyumludur. therascreen EGFR CE Test Paketi kurulumuna devam etmeden önce, Rotor-Gene Q yazılımının doğru sürümünü yüklediğinizden emin olun. Rotor-Gene Q MDx cihazı önceki bir yazılım sürümü ile teslim edildiyse, on web sitesinde, Çalıştırma Yazılımı bölümü altındaki Ürün Kaynakları kısmında Rotor-Gene Q MDx ürün sayfasından, Product Resources Rotor-Gene Q yazılım sürümü 2.3'ü yükleyerek yükseltin. Prosedür 1. therascreen EGFR CE Test Paketi CD'sini (kat. no ) sipariş edin. 2. CD'yi, Rotor-Gene Q MDx cihazına bağlı bilgisayarın CD sürücüsüne takın. 3. CD otomatik yüklenirse, therascreen_egfr_ce_assay_package_3.0.5.exe dosyasına çift tıklayarak kurulumu başlatın. Alternatif olarak, bağlı bilgisayardaki dosya tarayıcısını kullanarak bu yürütülebilir dosyayı bulun ve başlatın. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

84 4. therascreen EGFR CE Test Paketi kurulum sihirbazı açılır. İlerlemek için Next (İleri) seçeneğine tıklayın (Şekil 41). 1 Şekil 41. Setup Wizard (Kurulum Sihirbazı) diyalog kutusu (1 = Next (İleri) düğmesi). 5. Diyalog kutusundan License Agreement (Lisans Sözleşmesi) okuyun ve I accept the agreement (Sözleşmeyi kabul ediyorum) seçeneğini işaretleyerek sözleşmeyi kabul edin. İlerlemek için Next (İleri) seçeneğine tıklayın (Şekil 42). 1 2 Şekil 42. License Agreement (Lisans Sözleşmesi) diyalog kutusu (1 = I accept the agreement (Sözleşmeyi kabul ediyorum); 2 = Next (İleri) düğmesi). 84 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

85 6. Kurulum otomatik olarak başlar. Kurulum tamamlandığında, son bir Setup Wizard (Kurulum Sihirbazı) diyalog kutusu açılır. Çıkmak için Finish (Bitti) seçeneğine tıklayın (Şekil 43). Şekil 43. Kurulum sihirbazı tamamlanıyor (1 = Finish (Bitti) düğmesi). 7. Bilgisayarı yeniden başlatın. therascreen EGFR CE Control Run Locked Template (therascreen EGFR CE Kontrol Çalışması Kilitli Şablon) ve therascreen EGFR CE Locked Template (therascreen EGFR CE Kilitli Şablon) için kısayollar otomatik olarak oluşturulur ve masaüstünde görülür. 1 therascreen EGFR CE Locked Template İletişim Bilgileri Teknik destek ve daha fazla bilgi için lütfen adresindeki Teknik Destek Merkezi'ne bakın, numarasını arayın ya da QIAGEN Teknik Servislerine veya yerel dağıtıcılara başvurun (arka kapağa bakın veya adresini ziyaret edin). therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

86 Sipariş Bilgileri Ürün İçindekiler Kat. no. therascreen EGFR RGQ PCR Kit (24) therascreen EGFR Assay Package CD QIAamp DNA FFPE Tissue Kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) Rotor-Gene Q Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q aksesuarları Loading Block ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) 24 reaksiyon için: Kontrol Testi, 7 Mutasyon Testi, Pozitif Kontrol, Taq DNA Polimeraz, NTC İçin Su ve Örnek Seyreltme İçin Su therascreen EGFR RGQ PCR Kiti ve QIAGEN Rotor-Gene Q MDx cihazı ile kullanım için yazılım protokol paketi 50 örnek için: 50 QIAamp MinElute Sütunları, Proteinaz K, Tamponlar ve Toplama Tüpleri (2 ml) Real-time PCR döngüleyici ve 5 kanal (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) artı HRM kanallı Yüksek Çözünürlüklü Erime analizörü, dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar, 1 yıl parça ve işçilik garantisi, kurulum ve eğitim Real-time PCR döngüleyici ve 5 kanal (yeşil, sarı, turuncu, kırmızı, kızıl) artı HRM kanallı Yüksek Çözünürlüklü Erime analizörü, dizüstü bilgisayar, yazılım, aksesuarlar, 1 yıl parça ve işçilik garantisi, kurulum ve eğitim dahil değildir 72 0,1 ml tüplerde tek kanallı pipet ile manuel reaksiyon kurulumu için alüminyum blok reaksiyon için 4 tüplü ve kapaklı 250 şerit reaksiyon için 4 tüplü ve kapaklı şerit Güncel lisans bilgileri ve ürüne özgü yasal uyarılar için ilgili QIAGEN kiti el kitabına veya kullanıcı kılavuzuna bakın. QIAGEN kiti el kitapları ve kullanıcı 86 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

87 kılavuzları adresinde bulunabilir veya QIAGEN Teknik Servisleri ve yerel dağıtıcınızdan istenebilir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

88 Bu sayfa bilerek boş bırakılmıştır. 88 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

89 Bu sayfa bilerek boş bırakılmıştır. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/

90 Bu sayfa bilerek boş bırakılmıştır. 90 therascreen EGFR RGQ PCR Kiti El Kitabı 08/2016

91 Bu ürünün satın alınması kullanıcının insan in vitro tanıları için tanı hizmetleri vermek üzere ürünü kullanmasını sağlar. Alımdan kazanılan bu özel kullanım hakkı dışında genel patent veya hiç bir türde başka lisans burada verilmemektedir. Ticari markalar: QIAGEN, Sample to Insight, QIAamp, MinElute, Rotor-Gene, Scorpions, therascreen (QIAGEN Group); FAM, HEX (Thermo Fisher Scientific Inc.); GIOTRIF (Boehringer Ingelheim), IRESSA (AstraZeneca Group) therascreen EGFR RGQ PCR Kiti Avrupa İn Vitro Diagnostik Direktifi 98/79/EC'ye göre CE işaretli diagnostik bir kittir. Tüm ülkelerde mevcut değildir. therascreen EGFR RGQ PCR Kiti için Sınırlı Lisans Sözleşmesi Bu ürünün kullanımı herhangi bir alıcının veya ürün kullanıcısının aşağıdaki koşulları kabul ettiği anlamına gelir: 1. Ürün yalnızca ürünle ve bu el kitabında verilen protokollere uygun olarak kullanılabilir ve yalnızca kitin içinde bulunan bileşenlerle kullanım içindir. QIAGEN, bu kit ile birlikte verilen bileşenlerin el kitabında ve adresinden ulaşılabilen ek protokollerde belirtilenlerin dışında bu kitin içinde yer almayan herhangi bir bileşenle kullanımı veya birleştirilmesi için kendi fikri mülkiyet haklarının herhangi biri altında lisans hakkı vermez. Bu ek protokollerden bazıları QIAGEN kullanıcıları tarafından QIAGEN kullanıcıları için sağlanmıştır. Bu protokoller QIAGEN tarafından kapsamlı şekilde denenmemiş veya optimize edilmemiştir. QIAGEN bu protokollerin üçüncü tarafların haklarını ihlal etmeyeceğini garanti etmez. 2. Açıkça belirtilen lisanslar dışında, QIAGEN bu kit ve/veya kullanımlarının üçüncü tarafların haklarını ihlal etmeyeceğini garanti etmez. 3. Bu kit ve bileşenleri bir kez kullanım için lisanslıdır ve tekrar kullanılamaz, yenilenemez ve tekrar satılamaz. 4. QIAGEN açıkça ifade edilenlerin dışında açık veya zımni diğer tüm lisansları açıkça reddeder. 5. Bu kitin alıcısı veya kullanıcısı yukarıda yasaklanan eylemlere neden olabilecek veya kolaylaştırabilecek herhangi bir girişi mde bulunmayacağını ve başka birisine izin vermeyeceğini kabul eder. QIAGEN herhangi bir Mahkemede bu Sınırlı Lisans Anlaşması yasaklamalarını uygulayabilir ve bu sınırlı lisans anlaşmasının veya kit ve/veya bileşenleriyle ilgili fikri mülkiyet haklarının herhangi birinin uygulanmasına yol açan tüm durumlarda avukat ücreti dahil tüm soruşturma ve mahkeme masraflarını geri alabilir. Güncellenmiş lisans koşulları için bkz. Aug-16 HB QIAGEN, tüm hakları saklıdır.

92 Sample & Assay