Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar Non İnvaziv Prenatal Test. Dr İsrael Aruh, Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü

Transkript

1 Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar Non İnvaziv Prenatal Test Dr İsrael Aruh, Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü

2 PRENATAL TEST: NIPT TEKNOLOJİSİNE BAKIŞ Kromozom Anomalilerinin Prenatal Görülme Sıklığı Percent of Reported Chromosome Abnormalities 16 T Major fetal aneuploidies T18 T13 45,X Sex trisomy Other rare Data adapted from Wellesley, D, et al., Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J of Hum Gen, 11 January 2012.

3 PRENATAL TARAMA SEÇENEKLERİ RISK SCORE Down Syndrome Testing with 5% Screen Positive Rate 1 st Trimester Detection Rate (%) st Trimester 2 nd Trimester 2 nd Trimester Integrated Screen Serum Integrated ACOG Practice Bulletin No. 77, January 2007.

4 GÜNÜMÜZDEKİ TANI SEÇENEKLERİ KARYOTYPE Trimester - Test Sensitivity Specificity 1 st CVS 99.25% % 1 2 nd - Amniocentesis 99.4% % 2 Kesin cevap, ancak girişimsel olup anne ve fetus için risk taşır. Tarama testlerindeki yüksek yanlış pozitif oranlarından dolayı, çoğu zaman gereksiz yere uygulanır. 1. Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS)--diagnostic consequences of CVS mosaicism and non-mosaic discrepancy in centres contributing to EUCROMIC Prenat Diagn Sep;17(9): Mid-trimester amniocentesis for prenatal diagnosis. Safety and accuracy. JAMA Sep 27; 236(13):

5 PRENATAL TEST SPEKTRUMU TARAMA Risk skorları biyokimyasal analiz ve populasyon istatistikleri kullanılarak elde edilir. TANI Sonuçlar tamamen genetik faktörlere bağlıdır. Serum Screening CVS Combined Serum Screens, NT, Ultrasound NIPT Amnio SCREENING DIAGNOSTIC

6 NIPT NİN HEDEFLERİ NELERDİR? Fetal, maternal riski azaltmak Yalancı pozitifleri azaltmak Tüm gebelere kolay uygulanır olması Yüksek tespit oranı sağlama

7 MATERNAL KANDA FETAL DNA NIN İKİ KAYNAĞI: Fetal hücreler Tüm hücre popülasyonunun milyarda biri İzolasyonu için mekanik ve biyokimyasal yöntemler gerekir Cell-free DNA (cfdna) Anne kanında maternal ve fetal cfdna birarada mevcuttur Total cfdna nın %2 20 si fetus a aittir.

8 MATERNAL KANDA FETAL cfdna Gebelikte güvenli analiz edilebilen bir komponenttir Apoptosis sonucu salınır Fetal cfdna plasentanın cytotrophoblastic hücrelerinden salınır Kan dolaşımına küçük DNA fragmentleri( bp) olarak karışır 7+ gebelik haftasında güvenle tespit edilir Postpartum saatler içinde dolaşımdan kaybolur.

9 NIPT Metodları COUNTING SNPs MPSS Massively Parallel Shotgun Sequencing DANS+FORTE Targeted Sequencing Digital Analysis of Selected Regions+ Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation

10 NIPT Metodları Massively Parallel Shotgun Sequencing Targeted Sequencing Targeted Sequencing Sequenom MaterniT21 Verinata Verifi Ariosa Harmony Natera Panorama COUNTING SNPs

11 Sayarak Chrom 21 Chrom 3

12 Sayarak Chrom 21 Chrom 3 Expected Amount: 20% 80% Observed Amount: 25% 75%

13 Sayma Metodu Collect (MPSS, Targeted) Sequence Assign/Map with Reference Calculate ratio Observed:Expected Create result Confidential and Privileged

14 Cell free DNA ve Fetal Fraksiyon cfdna comes from apoptytic cells derived from: Maternal Adipocytes Hematopoetic system Fetal Placenta (trophoblasts) Fetal Fraction = Fetal DNA Fetal DNA + Maternal DNA

15 Cell free DNA (cfdna) Chromosome 21 is 1.5% of genome equivalents (0.75 per chromo) Difference of 0.03% At 10% fetal DNA: [1.5% x (90% maternal)] + [ =2.25%] x (10% fetal)] = 1.575% At 5% fetal DNA: [1.5% x (95% maternal)] + [ =2.25%] x (5% fetal)] = 1.530%

16 Kromozoma bağlı amplifikasyon değişimleri Adapted from: Fan, Quake et al PNAS Average Counting Sensitivity 1,2,3,4 SNP Sensitivity 5 Trisomy % >99% Trisomy % >99% Trisomy % >99% - Özellikle G ve C nin çok düşük veya fazla olduğu kromozomlarda, amplifikasyon aşaması daha geniş varyasyonlara yol açar. 6 Sayma metodu DNA daki bilgilerden ziyade DNA miktarına dayanır ve bu nedenle bu varyasyonlardan daha çok etkilenir. - SNP metodu ile kromozomdan kromozoma amplifikasyon değişimi elimine edilerek, trizomi 13 ve seks kromozomlarındaki azalmış sensitivite ve spesifisite sorunu önlenir. 6 1 Palomaki Bianchi Ashoor Ashoor Nicolaides, Boon & Faas 2013

17 SNP ler: Genomdaki herhangi bir nükleotidin A,T,G ve C nin DNA sekanslarındaki dizilimindeki varyasyonlarından dolayı değişimine SNP adı verilir. SNP ler toplumlardaki doğal genetik varyasyonların bir parçasıdır.

18 SNP-Bazlı Yaklaşım 19,488 SNP simultane hedeflenir SNP Sequencing Plasma = Maternal + Fetal DNA Maternal + Fetal Genotype Maternal blood Buffy coat = Maternal DNA SNP Sequencing Maternal Genotype Fetal Genotype

19 SNP (NATUS) Algoritması kullanılarak Next-generation Anöploidi Testi Genotypic Data from Mom +/- Dad Multiple hypotheses for each chromosome + Data from Human Genome Project (HapMap) Sub-hypotheses with different crossover points

20 Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler Compare Sequencing Measurements from Maternal plasma

21 Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler Compare Sequencing Measurements from Maternal plasma

22 Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler Compare Sequencing Measurements from Maternal plasma Her koşul için kişiselleştirilmiş risk skoru

23 SNP profilinin çözülümü Mother AA, Fetus AA Disomy Trisomy Mother AA, Fetus AAA Mother AA, Fetus AB Mother AA, Fetus AAB Mother AB, Fetus AAA Mother AB, Fetus AA Mother AB, Fetus AAB Mother AB, Fetus AB Mother AB, Fetus ABB Mother AB, Fetus BB Mother AB, Fetus BBB Mother BB, Fetus AB Mother BB, Fetus ABB Mother BB, Fetus BB Mother BB, Fetus BBB

24 NATUS Algoritma Özeti Anne ve babadan fetüse geçen, ilgili kromozomlardaki (21,18,13,X,Y) tüm crossover lar dahil milyonlarca olası sonuç hipotezleri bilgisayar tarafından oluşturulur. Olası tüm sonuçlar fetüsün fragmente SNP profilleri ile karşılaştırılır Sonucu verebilmek için tüm eşleşmeler toplanıp maksimum olasılık bayesian analizi kullanılır Özelleştirilmiş risk skoru elde etmek için, SNP sayıları,, fetal fraksiyon,maternal yaş ve diğer örneğe bağlı faktörler kullanılır.

25 SNP-bazlı Yaklaşımın Avantajları Tüm otozomlarda daha tutarlı tespit oranı Düşük veya yüksek GC içeriğinden kaynaklanan kromozom amplifikasyonu önyargısından bağımsız Referans kromozoma ihtiyaç yok Düşük hata oranı Triploidiyi tespit edebilme Taken from Düşük fetal fraksiyonlarda daha hassas performans

26 Neden Sayma Metodu Triploidiyi Tespit Edemez? No difference

27 Triploidi Tespiti Sayma metodu triploidiyi tespit edememektedir Sayma metodu uygulanan 8 olgu etkilenmemiş olarak raporlanmıştır (Bianchi 2012, Futch 2013) 2 kör çalışmada, 5 paternal triploidi olgusunun tamamı SNP metoduyla tespit edilmiştir.

28 Triploidi Tipleri Extra haplotypes Maternal DIGYNIC Paternal Placenta Small, normal Large, cystic Fetus Growth-restricted, often abnormal Biochemistry Very low free β- hcg and PAPP-A Other findings Less affected DIANDRIC free β-hcg 10X higher than normal Partial Molar - Maternal complications

29 Vanishing Twin/Triploidi Sonucunu Alındığında Takip Vanishing twin/ Triploidi Eğer ikinci sak yok ve/veya anormal plasenta bulgusu mevcut ise, girişimsel tanı testi önerilir

30 Fetal Fraction (%) Düşük Fetal cfdna Fraksiyonu Tespit Oranını Düşürür gebelik haftasında anne adaylarının %25 inde fetal fraksiyon oranı %4-8 arasında saptanmıştır. (2,3) % Fetal DNA Fraction Counting Down Syndrome Sensitivity 1 Panorama Down Syndrome Sensitivity >8% >99% >99% 5 4-8% 75% >99% Gestational Age (weeks) 1.Palomaki GE et al DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an interntional clinical validation study. Genet Med 2011 Nov; 13(11): Natera Internal Data 3. Norton ME et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation(NICE) Study: results of a multicenter prospectgive cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. AJOB 2012;1.e1-1.e8

31 Fetal Fraksiyonun Önemi Son 1.5 yıl içerisinde, anöploidi tespiti için Dünya da 100,000 den fazla DNA testi uygulanmış olup, test performansını etkileyen faktörler daha belirginleşmiştir. cffdna nın relatif oranı yani fetal fraksiyonun önemi kriktir. -- Lyn Chitty and Diana Bianchi Prenatal Diagnosis 2013, 33,

32 Fetal Fraksiyon Aralıkları Fetal Fraction too low to report Intermediate fetal fraction decreased sensitivity with counting methodology Fetal fraction adequate to achieve best performance

33 Fetal fraksiyonun %4 ten düşük olduğu durumda puzzle daki resim aşağıdaki gibi gözükür. Sonuç alınamaz. What is this a picture of? Edges are minimum ff so no call is made by anyone <4% fetal fraction Confidential and Privileged 63

34 4-8% fetal fraksiyonda sayma metoduyla, puzzle da halen eksik parçalar bulunmasına rağmen, resim daha belirginleşti. Missing moderate amount of pieces, but still making call Photo of car and highway 4-8% fetal fraction, single Confidential and Privileged rejection test 64

35 SNP metoduyla 4-8% fetal fraksiyonda puzzle parçaları daha doğru Still yerleşerek have same amount resim daha of pieces, nettir. but now they are the right pieces -BUFFALO walking in the street 4-8% fetal fraction with metrics Confidential and Privileged 66

36 Reporting Sequenom MaterniT21 Plus Verinata Verifi Ariosa Harmony Natera Panorama Reporting Method Positive Negative Detected Not Detected Suspected Risk score (mat age, fetal fraction, 1 metric) Risk Score (mat age, fetal fraction, multiple metrics) Confidential and Privileged

37 Confidential and Privileged

38 Confidential and Privileged

39 Confidential and Privileged

40 Confidential and Privileged

41 Low Risk Report

42 High Risk Report for Trisomy 21 FETAL FRACTION: 9.2% Confidential and Privileged

43 Unable to Report Low Fetal Fraction FETAL FRACTION: 3.2%

44 Unable to Report Redraw Recommended Spesifik bir örnekteki DNA fragmentlerine bağlı bir durum olduğu düşünülüp, yeni bir örneğin daha hassas bir sonuç verebileceği ihtimalinde tekrar bir kan örneği alınması istenebilir. Böyle bir sonucun gelmesi, gebelikte herhangi bir sorun olduğunu göstermez. Redraw önerilmesinin amacı daha hassas ve güvenilir bir sonuç alınabilmesini hedefler. Redraw önerildiğinde, 2. bir örneğin alınmasıyla %90 ihtimalle sonuç alınır. DÜŞÜK FETAL FRAKSİYON <3.5% fetal fraksiyon Algoritmayla yüksek güvenirlikte sonuç alınamaz. Not:Diğer NIPT metodlarında fetal fraksiyon cutoff değeri %4 tür. DOES NOT PASS QUALITY METRICS -- DNA daha az bilgi verici ise ("noisy" data) Algoritmanın yüksek güvenirlikte sonuç vermesinde güçlük olduğunda. Bunlar, total DNA miktarı (kombine maternal ve fetal DNA), okuma sayısı ve de hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için iyi kalitede veri sağlıyan diğer kontrol ölçümlerini içerir.

45 Unable to report Redraw NOT recommended Uninformative DNA Pattern Vakaların <1% DNA yorumlanamıyorsa Bu hasta için klinik öykü tekrar dikkate alınıp takip ve/veya daha ileri tetkik seçenekleri önerilebilinir Fetal mozaisizm Maternal kromozom anomalileri veya mozaisizm Beklenenden fazla seviyedeki homozigosite (Haploblock) Egg donor or surrogate

46 NIPT IS A

47 INVASIVE PROCEDURE UPDATE BY MONTH (7/2010 THROUGH 3/2013)

48 NIPT yi öneren kurumlar

49 Nisan 2013, TJOD İstanbul Şubesi Maternal Kanda Hücre Dışı Fetal DNA (cffdna) ile Non-Invasive Prenatal Test (NIPT) Uzman Görüşü Raporu onaylayanlar (soyadı sırasına göre); BAKSU Başak, BAŞARAN Seher, BAŞGÜL Alin, BATUKAN Cem, ERMİŞ Hayri, GEDİKBAŞI Ali, GÜL Ahmet, HAS Recep, KALELİOĞLU İbrahim, PEKİN Oya, POLAT İbrahim, ŞAHİNOĞLU Zeki, ULUDOĞAN Mehmet, TUĞRUL Semih, YAZICIOĞLU Fehmi, YILDIRIM Gökhan, YÜKSEL Atıl) cffdna ile NIPT'nin olası kullanım alanları: * Maternal yaşın 35 ve üstünde olması. * Trizomi tarama testlerinin pozitif olması durumunda. * Trizomi 21 ve 18 için spesifik ultrason belirteçlerinin varlığında. * Trizomi 21 ve 18 li fetus / bebek öyküsünde. * Parental dengeli robertsonian Trizomi 21 ve Trizomi 13 translokasyonu.

50 The performance of screening for trisomy 21 and trisomy 18 by NIPT using chromosome-selective sequencing in a routine population is as effective as previously reported in high-risk groups with DR 99% and FPR 1%. Daha önce bildirilen yüksek risk gruplarındaki %99 tespit oranı ile %1 lik yalancı pozitif oranı, trizomi 21 ve trizomi 18 in taramasında kromozom-selektif sekanslama kullanılarak uygulanan NIPT performansı, rutin popülasyonlarda da eşit derecededir. Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.

51 On the basis of existing data, NIPT can potentially be used in universal screening for trisomies 21 and 18 in all singleton pregnancies and the main limiting factor for such widespread application of the test at present is the associated cost. Mevcut verilere göre, NIPT potansiyel olarak, tüm tekil gebeliklerin trizomi 21 ve trizomi 18 açısından taramasında üniversal kullanılabilinir. Günümüzde, yaygın uygulamayı sınırlayıcı esas faktör testin maliyetidir. Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.

52 Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y K.H. Nicolaides, A. Syngelaki, M. Gil, V. Atanasova and D. Markova This blinded validation study has demonstrated that cfdna testing in maternal blood using targeted sequencing of SNPs at chromosomes 13, 18, 21, X and Y and use of the NATUS algorithm holds promise as an accurate method for detecting fetal autosomal aneuplodies, sex chromosome aneuploidies and triploidy in the first trimester of pregnancy. Bu kör doğrulama çalışması, gebeliğin birinci trimestrinde maternal kanda cfdna testiyle, 13,18,21,X ve Y kromozomlarındaki SNP lere yönelik hedeflenmiş sekanslama ve NATUS algoritması kullanımının fetal otozomal anöploidileri, seks kromozom anöploidileri ve triplodiyi tespitte, gelecek vaad eden kesin bir metod olduğunu göstermiştir. Prenatal Diagnosis 2013 June, 33(6):

53 NIPT DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI 1. NIPT kadınlar için mevcut prenatal test opsiyonları spektrumunu genişletmiştir 2. Tarama sonucunun pozitif olduğu durumda, invaziv tanı testi yerine, NIPT, kadınlar için bir alternatiftir. T18 and T21 için yüksek sensitivite ve spesifisite. (T13 performansı nispeten daha düşük)

54 NIPT DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI 3. İnvaziv tanı testlerini kabule yanaşmayan kadınlar için, NIPT güven verici ve rahatlatıcı bir seçenektir. 4. NIPT, girişime bağlı riski ortadan kaldırarak kadınların bu tip testleri reddetme ihtimalini düşürür.

55 GELECEK UFUKLAR Düşük risk popülasyonlarda geniş kapsamlı çalışmalar Çoğul gebeliklerde çalışmalar Sub-kromozomal anomalilerin tespiti cfdna ve gebelik komplikasyonları Tek örnekte NIPT + Maternal taşıyıcılık taraması Genetik sendromların tedavisi (Down v.s)

56 Teşekkürler! Dr İsrael Aruh, Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü