YÜCEL / HIBRIDOMA TEKNOLOJİLERİ BÖLÜM 7 HİBRİDOMA TEKNOLOJİLERİ. Doç. Dr. Fatıma YÜCEL

Ebat: px
Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "YÜCEL / HIBRIDOMA TEKNOLOJİLERİ BÖLÜM 7 HİBRİDOMA TEKNOLOJİLERİ. Doç. Dr. Fatıma YÜCEL"

Transkript

1 BÖLÜM 7 HİBRİDOMA TEKNOLOJİLERİ Doç. Dr. Fatıma YÜCEL 163

2 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 Doç. Dr. Fatıma (Şahingöz) YÜCEL 1963 yılında Yozgat ilinde doğmuş, Ankara Kurtuluş lisesinden mezun olduktan sonra, lisans eğitimini Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü nde 1986 yılında tamamlamıştır yılında TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkezi (MAM) Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsünde (GMBE) araştırma görevlisi olarak çalışmaya başlamıştır. TÜBİTAK daki projeler çerçevesinde, yüksek lisans tezini, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Eğitimi Biyoloji Bölümüne bağlı olarak, Pseudomonas tomato bakterisine karşı monoklonal antikor salgılayan hibrit hücrelerin geliştirilmesi konusunda, doktora tezini ise Marmara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji ve Genetik ABD dalında Antijenliği Artırmaya Yönelik Yeni Yaklaşımlar konusunda gerçekleştirmiştir. Yurt dışındaki araştırma ve geliştirme faaliyetlerini takip etmek için 1990 yılında Almanya Göttingen Üniversitesi İmmünoloji laboratuarındaki çalışmalara katılmıştır yılında Biyoloji Bilim Alanında doçentlik ünvanını almıştır. Uzmanlık alanları, hücre kültür sistemleri, monoklonal antikorların elde edilmesi ve karakterizasyonu, protein saflaştırma yöntemleri, ELISA sistemleri, proteinlerin çeşitli enzimlerle işaretlenmesi, antikor/ antijen temelli teşhis kitlerinin geliştirilmesi, anti-idiotip antikorların hazırlanması, antijenliği arttırmaya yönelik çalışmalar sayılabilir. Araştırma çalışmaları sonucunda, 8 farklı antijene karşı monoklonal antikor sentezleyen hibridoma hücresi geliştirmiştir. Polimerik taşıyıcıların antijeniteyi artırma üzerine etkisi konusunda iki adet patente sahiptir.15 ulusal projede yürütücü, yardımcı araştırmacı ve danışman olarak görev almış, bir çok ulusal ve uluslararası makale, kongre sunumu gerçekleştirmiştir. Her yıl, kurumunda Hücre Füzyonu Yöntemi ile Monoklonal Antikor Üretimi Kuramsal ve Uygulamalı Kurs u düzenlemektedir yılından itibaren TÜBİTAK-Hayvan Deneyleri Etik Kurulu ve TÜBİTAK TOVAG Grup Yürütme Komite (GYK) Üyesidir. Halen TÜBİTAK MAM GMBE de uzman araştırmacı olarak çalışmakta, Laboratuvar ve Endüstriyel hizmet sorumluluğunu sürdürmektedir. Evli ve iki çocuk annesidir. 164

3 HİBRİDOMA TEKNOLOJİSİ 1. Monoklonal Antikorların Üretilmesi 2. Hibridoma Çalışmaları İçin Gerekli Malzemeler Ve Deneysel Çalışmalar 2.1 Çalışma Ortamında neler olmalı 2.2 Çalışma Ortamının Temizliği 2.3 Çalışma Alanının Temizliği 2.4 Çalışan Personelin Temizliği 2.5 Yıkama ve Sterilizasyon 2.6 Çalışmada Kullanılacak Hücreler, Besi Yerleri ve Tamponlar 3. Hibridoma Çalışmalarında Kullanılan Yöntemler 3.1 Deney Hayvanlarının Bağışıklanması 3.2 Bağışık Yanıt Kontrolü Dolaylı ELISA Yöntemi 3.3 Hücre Kültürü Çalışmaları Kanser (Myeloma) Hücrelerinin Kültür Şişelerine Aktarımı Hücrelerin Sayımı Hücrelerin Dondurulması 3.4 Füzyon ve Hazırlıkları Besleyici Hücrelerin Hazırlanması Bağışıklanmış Dalak Hücrelerinin Elde Edilmesi Bağışık Fareden Lenf Hücre Eldesi Myeloma Hücrelerinin Hazırlanması Füzyon Alt Klonlama İşlemi (Limiting Dilution) 3.5 Hibridomaların Geniş Ölçekte Üretimi 3.6 Monoklonal Antikorların Saflaştırılması Amonyum Sülfat (NH4)2SO4 ) ile Çöktürme Antikorların İmmünoafinite ile Saflaştırılması 3.7. Hücre Kültüründe Kontaminasyon 3.8. Monoklonal Antikorların Kullanım Alanları 3.9. Günümüzde Monoklonal Antikorların İlaç Amaçlı Kullanımları 165

4 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 HİBRİDOMA TEKNOLOJİSİ Vücut son derece farklı hücrelerden ve moleküllerden oluşan bir savunma sistemi tarafından korunur. Bu sistemde yer alan elemanlar öncelikle organizmanın kalıtsal yapısına yabancı olan, antijen olarak adlandırılan her türlü hücre dışı yapının (bakteri, virüs, mantar, hücre veya molekül vb.) vücuda girmesini engeller. Antijenler, deri, solunum ve sindirim sistemi gibi engelleri aşarak, organizmaya dâhil olduklarında savunma sistemi hemen harekete geçer. Kemik iliği, timus, lenf bezleri ve dalak gibi özelleşmiş merkezlerde yer alan fagositler, makrofajlar, lenfositler (B ve T hücreleri) gibi savunma hücreleri ve molekülleri devreye girerler. İlk etapta, öncü hücreler olan fagositler ve makrofajlar antijenleri yok etmeye çalışırlar, başarılı olamadıkları durumda B hücresi ve T hücresi olarak adlandırılan lenfositler devreye girerler. Antijen varlığını haber alan T hücreleri savunma sisteminin idaresini eline geçirerek, diğer hücreleri uyarırlar. Sitotoksik (öldürücü ) T hücreleri antijenleri yok etmek için uğraş verirken, savunmadan sorumlu B hücreleride bağışıklığın akıllı molekülleri olarak adlandırılan antikorları (=immünglobulin) sentezlemeye başlarlar. Antikorlar, bağışıklık sisteminde infektif ajan dediğimiz antijenleri bularak yok edilmesini sağlayan bir glikoproteindir. Bu moleküllerin üstünlüğü, üç boyutlu bir yapıda tıpkı anahtarla-kilit arasındaki uyum gibi antijene özgün olarak bağlanabilmesidir. Böylece antikorlar, organizmaya giren antijenlere bağlanarak onları etkisiz hale getirirler veya kompleman enzimleri ve diğer savunma hücrelerini harekete geçirerek antijenleri yok ederler. Sonuçta antikorlar vücudumuzun bekçisidir ve yabancı yapıyı tanıyarak onu kuşatır ve etkisiz hale getirirler. Bir antijen epitop adı verilen birçok antijenik bölge içerir ve organizmaya girdiğinde her bir epitopa karşı bir grup B hücresi özgül antikor üretmeye ve çoğalmaya başlar. Böylece farklı epitoplar içeren bir antijene karşı farklı B hücrelerince antikor üretimi olduğu için gelişen antikorlara poliklonal (çok klonun oluşturduğu) antikorlar denir. Bu antikorlar bir çok klon tarafından üretildiği için çeşitli tipte antikorları (IgG, IgM, IgA vb) içermektedir. Viruslerin, bakterilerin, mantarların, proteinlerin ve hormonların bazı ortak epitoplara sahip olmaları immünolojik testlerde ayırd edilme olanağını kısıtlar. Örneğin Erwinia amylovora bakterisine karşı geliştirilmiş bir poliklonal antikor diğer Erwinia türü bakterilerde bulunan ortak epitoplara bağlanabileceğinden çapraz reaksiyonlara ve güvenilir olmayan sonuçlara sebep olacaktır (Yücel 1999). Tanı ve tedavide kullanılan antikorların, canlıda en kolay elde edildiği yer kandır. Ancak kanda yer alan antikorların poliklonal özellikte olması, çapraz etkileşimlere sebep olması ve devamlılık arz etmemesi gibi sorunları vardır. Bu sorunları aşmak için 1972 yılında başlatmış oldukları çalışmalarda Cambridge Üniversitesinde iki araştırmacı 166

5 yeni bir teknik geliştirdiler. Bu teknikte biyoteknolojinin hızla ilerlemesinde önemli bir katkı olan, antijenin tek bir epitopuna özgü antikorların sınırsız üretilebildiği hibridoma hücrelerini geliştirdiler. Böylece kanda ve hücre dışı sıvıda bulunan antikorları, in vitro koşullarda da üretmeyi başardılar. İki somatik hücrenin sitoplazma ve çekirdeklerinin tamamen birbirine kaynaşması anlamına gelen bu tekniğin temelinde üç önemli bilgi yer almaktadır; 1- B-lenfositleri tek bir epitopa özgü antikor üreten ve salgılayan, yaşam süreleri bir kaç günle sınırlı immün sistem hücresidir. 2- Tümör hücreleri sınırsız bölünerek çoğalma kontrolünü kaybetmiş, yüksek oranda birleşme özelliğine sahip ölümsüz hücrelerdir. 3- Belli koşullarda aynı organizmaya ait değişik hücrelerin birleştirilerek her iki hücrenin özelliklerini taşıyabilen melez hücreler (hibridoma) elde edilebilir de Georges Köhler ve Cesar Milstein adlı araştırıcıların koyun alyuvarları ile immünize ettikleri farelerin, dalak hücreleri (blastositler) ile antikor sentezlemeyen fare myeloma hücrelerini sendai virus aracılığıyla birleştirmeleri sonucunda oluşan hibrit hücrelerin sadece alyuvarlara karşı antikor sentezlediklerini belirtmeleri ile bilimde bir devrim oluşturmuşlardır (Kohler 1975 ). Çalışmaların sonucunda oldukça spesifik ve tek bir B hücre klonundan sentezlenen monoklonal antikorlar elde edilmiş in-vitro ve in-vivo ortamda devamlı üreyebilen hücreler (hibridomalar) meydana getirilmiştir. Bu çalışmalar 1984 yılında Köhler ve Milstein a Nobel Tıp Ödülü nü kazandırmıştır. Monoklonallik kavramının tarihçesini incelediğimizde ilk kez 1950 yıllarında Burnet ve arkadaşları tarafından ortaya atılan klonal seçim hipotezi görülmektedir (Burnet 1957). Bu hipoteze göre her bir B hücresi farklı bir epitopa (6-10 aminoasitlik antijenik yapı) özgü bir antikor molekülü sentezlemek üzere programlanmıştır. Antijenik uyarı üzerine özgün lenfosit çoğalarak aynı özellikleri taşıyan hücrelerden oluşanları klon oluşturur. Farklı plazma hücrelerinin ürettiği antikorlar poliklonal, tek bir plazma hücresinin ürettiği antikorlar monoklonaldirler. Organizmanın aynı anda birçok farklı antijene karşı antikor ürettirmesi nedeni ile vücut sıvıları ve serumda poliklonal antikorlar oluşur. Monoklonal antikorların ise bir canlıdan eldesi mümkün değildir. Monoklonal antikorlar, antijenin belirli bir bölgesine spesifik olarak bağlanabilen ve tek bir B hücre klonundan sentezlendikleri için, tek tip immünglobulin yapısı gösteren moleküllerdir. İstenilen özelliklere sahip bir antikorun laboratuar koşullarında istendiği miktarda elde edilebilmesi için, ilgili antikoru sentezleyen B hücresinin ölümsüzleştirilmesi gerekmektedir. B lenfositleri in-vitro koşullarda 4 5 günden uzun süre yaşatılamazlar. Bu nedenle monoklonal antikor eldesi çalışmalarında başlangıçta B lenfositleri Epstein Barr Virüsü (EBV) gibi onkojenik virüslerle transforme edilerek ölümsüzleştirilmişlerdir. Bu yolla elde edilen antikor miktarının az olması ve kullanılacak antijen miktarının kısıtlı olması nede- 167

6 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 niyle yaygın olarak kullanılamamıştır yılında Cesar Milstein, Cotton ve Secher adlı araştırmacılar ile çalışırken in vitro şartlarda fare myeloma hücre kültüründen spontan mutasyon yapmayı başarmışlardır (Cotton 1973). Daha sonra Milstein ve Köhler, ilk kez mutant fare myeloma hücresini bir antijen ile immünize edilmiş dalak hücresiyle birleştirerek monoklonal antikor sentezleyen Hibridoma tekniğini tanımlamışlardır (Kohler 1977, Kohler 1979). Böylece B lenfositlerinin özgül antikor yapıcı özelliklerini myeloma hücrelerinin ise ölümsüz olma özelliğini kazanan hibrit hücreler özel şartlarda üretildikleri zaman tek bir antijenik determinanta karşı çok yüksek özgüllükte ve sonsuz miktarda monoklonal tipte antikor sentezleyebileceklerini göstermişlerdir. Monoklonal antikorlar üretimlerini teşvik eden antijenlere, onların yapılarını bozmadan bağlanarak, in vitro ve in vivo teşhis sistemlerinde, korunma ve tedavide başarılı bir şekilde kullanılabilmektedirler. Bu yapılar vücudumuza giren yabancı moleküllerin yerini ve türünü de belirleyebildiği için bünyelerine bağlanmış olan işaretli bir ajan yardımı ile (radyoaktivite, toksin vb) vücudun derinliklerindeki patojenin veya kanser metastazının tedavisinde öncü rol almışlardır (Byrd 2001, Sparano 2001, Stephan 2004). 1. Monoklonal Antikorlarin Üretilmesi Monoklonal antikor elde etmek için kullanılan melezleme tekniği, yararlı özelliklere sahip iki somatik hücrenin birleştirilmesi ile gerçekleşir. Hücre kültüründe hızla çoğalabilen, ölümsüzlük özelliği kazanmış myeloma (kanser) hücreleri ile aktif olarak istediğimiz antikoru üreten bağışık bir hayvanın dalak lenfositleri birleştirilir. Sonuçta, kompleks bir antijenin tek bir belirleyici grubuna (epitop) karşı monoklonal antikor üreten ölümsüz hibrit hücreler elde edilir (Grimaldi, 1995). Monoklonal antikorların hazırlanışını şu şekilde özetleyebiliriz (Şekil 1). 168

7 Şekil 1. Monoklonal Antikorların hazırlanmasının şematik gösterimi; 1- Fare, antijene karşı antikor üretimini ortaya çıkarmak için ilgili antijen ile immünize edilir, 2a- Dalaktan, antikor üreten B lenfosit hücreleri izole edilir, 2b- Fare kemik iliği kanser hücresi olan myeloma hücreleri toplanır, 3-Hibridoma oluşturmak için PEG aracılığı ile hücreler birleştirilir. Birleşmeyen hücreler ölür, 4 -Hibridomalar kültür plaklarında bölünmek üzere bırakılırlar, 5-Antikor sentezleyen klonlar ELISA yöntemi ile belirlenir, 6-Hibridomalar invitro (hücre kültürü) veya invivo (farede acid fluid oluşumu) koşullarda geniş ölçekte üretilir, 7- Fare asidik sıvıdan veya kültür üst sıvılarından antikorların saflaştırılması. Monoklonal antikorların hibridoma teknolojisi ile üretilmesi son derece titiz çalışma, dikkat, sabır, iyi gelişmiş laboratuvar koşulları gerektirmektedir ve yaklaşık 3 4 ay kadar zaman alan bir yöntemdir. İlk olarak deney hayvanı antikoru üretilecek antijen ile enjeksiyon yoluyla immünize edilir (Falkenburg 1998, Arda 1995, Walker 2007). Monoklonal antikor üretim çalışmalarında farelerden ve ratlardan yararlanılmaktadır. Bu hayvanların küçük ve kolay temin edilebilmeleri üretimlerinin bakım ve beslenmelerinin kolay ve ucuz olmaları, immünizasyonlara iyi cevap vermeleri tercih sebeplerindendir. Antijenik uyarımlara iyi yanıt vermelerinden ve myeloma hücrelerinin de fare orijinli olmaları gibi nedenlerle Balb/C genetik soyuna ait fareler kullanılmaktadır. İmmünizasyon hayvanı nın genç seçilmesi ( 6 8 haftalık) antijene karşı yanıtın etkinliği üzerine olumlu katkıda bulunur. İmmünizasyon için genellikle 5 10 arası fareler kullanılmaktadır. Çünkü immünizasyon süresi içinde şok veya çeşitli nedenlerle hayvanlar ölebilirler veya her fareden istenilen düzeyde immünolojik yanıt alınamamaktadır. İmmünizasyon yöntemleri, kullanılan antijenin yapısına, molekül ağırlığına bağlı olarak farklılıklar göstermektedir. Genellikle son enjeksiyondan 2 4 gün sonra füzyon yapılır. Hibridoma yönteminde, bir kemikiliği kanser hücresi olan BALB/c kökenli uygun myeloma hücrelerinin seçimi çalışmanın verimi açısından çok önemlidir. Çünkü iki farklı türe ait hücrelerden oluşturulan hibritlerin sürekli karakter değiştirdiği, kromozom kaybı ve antikor sentezleme sürelerinin azalması gibi sorunlar söz konusudur. İki hücrenin de antikor üretmesi hibridomanın tek tip antikor yapımına uygun değildir. Bu nedenle seçilmiş olan myeloma hücre hattının antikor üretmiyor olması tercih edilir. İmmunglobulin üretmeyen ilk fare myeloma hücre hattı 1978 de Schulman ve arkadaşlarınca izole edilmiştir ve monoklonal antikor yapan hibridoma oluşturmak için yararlı bir partner olmuştur (SP2-O-Ag14). Ayrıca Kearney ve arkadaşları immunglobilin ekspresyon kapasitesini kaybetmiş yeni bir myeloma hattı (P3x63-Ag8-653) geliştirmişlerdir (Kearney,1979). Hibridoma çalışmalarında seçilen myeloma hücresinde aranan diğer bir önemli özellikte, myelomaları, hibridoma hücrelerinden ayırt eden bir mutasyonun var olmasıdır. En yaygın kullanılan mutasyon purin biyosentezinde görevli bir enzim olan hipoksantin fosforiboziltransferaz (HGPRT) mutasyonudur. Fare myelom hatlarında 8 -Azaguanin veya 6-tioguanin ile seleksi- 169

8 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 yon yapılmaktadır. Hücreler genellikle pürin ve pirimidin sentezleri aracılığı ile DNA yaparlar. Bu iki maddeden birinin olmaması DNA sentezinin bloke edilmesine dolayısıyla hücrelerin ölümüne neden olur. Füzyonda hypoxanthine, aminopterin ve thymidine (HAT) içeren seçici kültür ortamı kullanılır, bu ortamda bulunan, aminopterin pürin ve pirimidin denovo (temel sentetik yol) sentez yolu inhibitörüdür. Seçici medyumda, HGPRT enzimi yönünden mutant olan myeloma hücrelerinin üremesi engellenmektedir. Pirimidin sentezi için timidin kinase (TK), pürin sentezi için de, HGPRT pozitif olan dalak B lenfositleri ve füzyon sonucu hibritleşmiş hücreler, ortamdaki hypoxanthine ve thymidini kullanarak yan yol denilen salvage sentez yolundan yararlanarak pürin ve pirimidin sentezini tamamlarlar. Füzyona girmemiş normal HGPRT pozitif B lenfositleri kültür şartlarında 4-5 gün içerisinde ölürler. Böylece hibridoma hücreleri myelom hücrelerin sonsuz üreme özelliğini ve B hücrelerinin HGPRT enzim sağlam genini almış olduğundan HAT ortamında üremesini devam ettirebilmektedir. Füzyona giren hücrelerin, füzyondaki seçicilik özellikleri Tablo 1 de gösterilmektedir. Tablo 1. Seçici ortamın füzyondaki hücrelere etkisi Hücre tipi Salvage sentez yolu DNA Sentezi De novo sentez yolu HAT medyumdaki yaşam Myeloma Dalak Myeloma-Dalak-Hibrit Myeloma-Myeloma Hibrit Dalak-Dalak-Hibrit HGPRT - HGPRT + HGPRT + HGPRT - HGPRT + Aminopterine duyarlı Aminopterine duyarlı Aminopterine duyarlı Aminopterine duyarlı Aminopterine duyarlı Ölür * Ölür ** YAŞAR Ölür * Ölür ** * DNA sentezi yok **In vitro ortamdaki yaşamı sınırlı Hibridoma yöntemi ile yüksek oranda monoklonal antikor üreten hibridomalar elde etmek için; farenin immünizasyon işleminin en uygun bir biçimde düzenlenmesi ve her antijenin immünizasyonunun en iyi sonucu alınacak bir protokolle uygulanması gerekmektedir. Myeloma hücre kültürlerinin istenilen özelliklere yani mutasyonuna, immünglobulin üretip üretmediğine, in vitro olarak sonsuz üreme yeteneğine, yüksek oranda birleşme özelliğine uyum derecesi çok önemlidir. Farklı polietilen glikol tiplerinden en uygun olanının seçilmesi de aynı derecede önemlidir. Monoklonal antikorlar ile poliklonal antikorlar karşılaştırıldığında; poliklonal antikorlar, vücutta B hücrelerinin yabancı bir antijenle uyarımları sonucu meydana gelen ve değişik aktivitelere sahip olan IgG, IgM ve IgA antikor izotipleri içeren hetorojenik özelliklerinden dolayı spesifiteleri zayıftır. Monoklonal antikorlar ise antijenin değişik determinantlarından belli bir epitopa özgül olarak bağlanabilen ve tek tip immünglobulin yapısı gösteren moleküllerdir. Monoklonal antikorun epitopa özgüllüğü, poliklonal antikor ile tanımlanması mümkün ol- 170

9 mayan antijenlerin tanımlanması sağlanır. Poliklonal antikorlar antijen üzerinde farklı epitoplara bağlanma eğilimleri gösterirler. Benzer antijenlerle çapraz tepkime, düşük özgünlük gibi istenmeyen özelliklere sahip olmaları, elde edilişlerinde bir süreklilik olmaması, bir canlıdan diğerine farklı özelliklerde poliklonal antikor karışımlarının oluşması ile pratik açıdan uygunluk göstermemektedir (The CCAC guidelines on: Antibody production 2002). Monoklonal antikor üreten hibridomalar sıvı nitrojende uzun süre muhafaza edilerek istenilen zamanda üretim yapılıp kullanılabilirler. Hücre kültür sistemine alındıklarında bir fabrika gibi sürekli antikor üretimlerini sürdürürler. Poliklonal antikorlar uzun immünizasyon periyodundan sonra bir kez elde edilirken, antikor aktivitelerini de uzun süre muhafaza edemezler. Hibridoma teknolojisinin ortaya çıkması ile poliklonal antikorların yarattığı problemler azaldığı gibi miktar ve duyarlılık yönünden daha verimli olan bu teknoloji immünoloji, biyoloji, tıp, veterinerlik sahalarındaki araştırmalara yeni bir boyut kazandırmaktadır. 2. Hibridoma Çalışmaları İçin Gerekli Malzemeler ve Deneysel Çalışmalar 2.1 Çalışma Ortamında neler olmalı - UV lambaları bulunan fazla büyük olmayan steril şartlarda hücre kültür odası Dışarıdan gelecek kontaminasyonlara bariyer oluşturacak ve pozitif hava basıncı sağlayacak filtreli klima tertibatı olmalı. - Hücre Kültür odasının yeri belirlenirken, mikrobiyolojik çalışmalar yapılan veya hayvan laboratuarına direk açılan koridor aralıklarında olmamalıdır. Odanın camları herhangi bir girişe izin vermeyecek şekilde izole olmalı -Sıcak oda, % 5 CO 2, % 96 nem ve 37ºC ortam şartları oluşturan inkübatör, ters mikroskop ve ışık mikroskobu, sıcak su banyosu, laminar flow, düşük hızda santrifüj oda içerisinde olmalı -Oda temizliği açısından, benç ve döşeme (zemin) yüzeyleri su geçirmez olmalı, duvarlar parlak, su geçirmez yağlı boya ile boyanmalıdır. Tüm oda duvarlarının birleştiği köşeler izole edilmelidir. Diğer alt yapı, cihaz ve malzemeler; buzdolabı, -20 C ve -70 C derin dondurucular, sıvı azot tankları, otoklav / yüksek dereceli fırınlar, ELISA okuyucu, besi yerlerinin sterilizasyonu için filtrasyon sistemi, hücre kültür çalışmaları için steril, atılabilir plastik malzemeler (mikrotitrasyon plakları (96 kuyucuklu), kültür şişeleri (25 cm 2 ve 75 cm 2 taban yüzeyli ), santrifüj tüpleri (10 ml ve 50 ml) füzyon plakları (Steril 96 kuyucuklu), dondurma tüpleri (Cryo tüp), petri kapları, makas, pens, hemositometre, süzgeç ve deney hayvanları (Balb/C ) kullanımı için deney hayvanları ünitesi gereklidir (Şekil 2). 171

10 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 Şekil 2. Hibridoma çalışmalarında gerekli olan alt yapı ve cihazlar 2.2 Çalışma Ortamının Temizliği Bu bölümde hücre kültürü ve hibridoma çalışmalarının gerçekleştirildiği laboratuvar ortamlarının ve deneysel çalışma alanlarının temizliğinde genel olarak uyulması gereken kurallardan bahsedilmektedir (Liddell 1991). Hücre kültür laboratuvar ortamlarının farklı süreçlerde temizliği şu şekilde olmaktadır. Günlük çalışmalarda; Çalışma gününün sonunda zemin deterjanla silinir. Hücre kültür laboratuarı için özel bir kova ve paspas olmalıdır. Haftalık çalışma sonrası; dolapların üstü, camların yüzeyi tüm genel yüzeyler %70 alkol ile silinmelidir. Steril çalışma kabini önce deterjanlı su ile arkasından %70 alkol ile silinmelidir. Her üç ayda bir çalışma sonrası; CO 2 inkübatörlerin içi deterjanla yıkanır ve alkol ile silindikten sonra sterilizasyon yapılır. Steril kabin içerisindeki prefilter ler deterjan ile yıkanır, kurutulur ve yeniden yerleştirilir. Ayrıca gaz tüpleri de, laboratuara yerleştirilmeden önce silinir. 2.3 Çalışma Alanının Temizliği Hücre laboratuarında kullanılacak tüm alet ve malzemeler %70 alkol ile temizlenerek laboratuara alınırken, kontamine materyaller hücre laboratuarına alınmamalıdır. Çalışmalarda kullanılacak tüm plastik veya cam beherler, şişeler, cam pipetler, pipet uçları steril olmalıdır. Laboratuarda kağıt atıklar dâhil tüm kirli materyaller uzaklaştırılmalıdır. 172

11 Çalışmaya başlamadan önce; steril çalışma kabini %70 lik alkolle temizlenmeli, hücre kültür çalışmasında kullanılacak besi yerleri ya önceden çıkarılarak ya da 37 C de ısıtılmalıdır. Çalışmada kullanılacak tüm malzemeler steril çalışma kabin içerisinde olmalı ve mümkünse eller minimum derecede dışarıya çıkmalıdır. Çalışmada kullanılacak atılabilir plastik malzemelerden, şişelerin sterilizasyonundan emin olunmalı, her araştırıcı kontaminasyonu kontrol açısından, kendi stoklarını ve steril malzemelerini kullanmalıdır. Steril çalışma kabin başında oturduğunuz sandalyenin rahat olmasına dikkat edilmelidir, aksi takdirde dikkatsiz el manipulasyonları olabilir. Birden fazla hücre hattı ile aynı anda çalışmak, birinden diğerini artırmaktadır. Çalışma sonunda; steril çalışma kabini çalışma sonrası boşaltılarak yüzeyi %70 alkol ile temizlenir. Çalışma atıkları, kullanılmış plastik veya diğer malzemeler tıbbi atık olarak değerlendirilerek imha edilmelidir. Paketi açılmış disposible hücre malzemeleri bir bant veya iğne ile tekrar kapatılarak isim ve tarih yazılarak etiketlenmeli ve steril kabin içerisinde bırakılmalıdır. 2.4 Çalışan Personelin Temizliği Hücre kültür laboratuarında giyilen önlük özel olmalı, sadece o laboratuarda giyilmelidir. Ayaklara galoş geçirilmeli veya bu laboratuarda giyilecek özel terlik olmalıdır. Saçlarımız uzun ise, kâğıt başlık kullanılmalı, Laminer flow kabinde çalışırken hapşırmaya veya çok konuşmamaya dikkat edilmelidir. Eğer soğuk algınlığı geçiriyorsak ya hücre kültür çalışmalarından uzak durulmalı, yada ağız ve burnu örtecek kâğıt maskeler kullanılmalıdır. Çalışmaya başlamadan önce ve sonra eller yıkanmalı, tırnaklar maya partikülleri yerleşebilir endişesi ile çalışmadan önce tırnak fırçası ile temizlenmelidir. Eldiven normalde önerilmemektedir çünkü çalışma becerisini azaltmaktadır, rahat değildirler. 2.5 Yıkama ve Sterilizasyon Cam malzemeler toksik olmayan deterjanlı su içerisinde veya kromik asitte gece boyu bekletilir. Makinada bolca yıkanır, şişeler tel fırça ile yıkanarak distile sudan geçirilir. Cam malzemeler kurutularak ağızları aluminyum folyo ile sarılarak 120 C de 20 dakika otoklav yapılmalıdır. Şişe kapakları fazla sıkılmamalı hafif aralanmalı, otoklav sonrası hemen kapatılmalıdır. Otoklavın sağlıklı olup olmadığını görmek için aluminyum folyo üzerine indikatör bandlar kullanılabilir. Makas, pens, cam pipetler, 160 C de 60 dakika olacak şekilde kuru sterilizasyon yapılmalıdır. 2.6 Çalışmada Kullanılacak Hücreler, Besi Yerleri ve Tamponlar Hibridoma çalışmalarında kullanılan hücreler; A. Hibridoma çalışmalarında kullanılan çeşitli kanser hücreleri (myeloma); FO (ATCC CRL 1646 ), Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581),P 3 X63Ag (ATCC CRL 1580) 173

12 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 Bu hücreler tümör dokusundan alınarak çeşitli kimyasal ajanlar yardımıyla kültürde yüksek yoğunluğa ulaşabilen, büyüme faktörleri ve seruma daha az gereksinim duyan, çoğalmak için hücre kültür plaklarına tutunma gereksinimleri az olan, sonsuz çoğalma yetenekleri olan hücrelerdir. B. Fare periton iç yüzeyi hücreleri (Balb/C fare). Bu hücreler hayvandan izole edildikten sonra kültüre edildiği için primer kültür adını almaktadır. C. Bağışıklanmış fare dalak hücreleri ve lenf düğümü (Balb/C fare) hücreleri Besi yerleri Her hücre tipi için kullanılacak besi yerleri yani büyüme çözeltileri farklıdır. Bunların her biri, hücrelerin optimal büyüme koşullarını sağlamaktadır. Her bir medyumun hem sıvı, hem liyofilize (toz) formu bulunmaktadır. Hücre besi yerleri HEPES veya sodyum bikarbonat temelinde bir ph tampon sistemi, vitaminler ve gerekli aminoasitlerin, koenzimlerin, vitaminlerin olduğu dengeli bir tuz solüsyonundan oluşur. Bunlar hücre büyümesini destekleyen ek katkı faktörleri olmakla birlikte asıl protein kaynağı olarak fetal calf ve fetal bovine serum gibi hayvan serumu hücre besi yerleri için gerekmektedir. Ayrıca ph indikatörü olarak fenol kırmızısı bulunmaktadır. İnkübatör ortamında CO 2 olmazsa, havadaki O 2, H 2 O ile birleşerek ortam bazikleşir veya CO 2 ortamda fazlalaşırsa, ortam asidik olur ve medyumun rengi sarıya dönüşür. Böylece fenol kırmızısı besi ortamlarındaki renk değişimlerine bağlı olarak besi yerinin ph sı hakkında bilgi vermektedir (Doyle 1998, Mather 1998, Freshney 1994). ph: 7,8 de besi ortamı mor renge dönüşür (bazik) ph: 7,6 da besi ortamı koyu pembe renge dönüşür (bazik) ph: 7,4 de besi ortamı kırmızı renge dönüşür ph: 7,0 de besi ortamı portakal rengine dönüşür (asidik) ph: 6,5 de besi ortamı sarı renge dönüşür (asidik) Normal Besi Yeri; FO myeloma hücreleri veya bu hücreler ile oluşturulan hibrit hücreler için; % 80 Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM), % 20 fetal sığır serumu (FCS), Gentamisin (50 µg/ml) kullanılırken, P 3 X63.Ag myeloma hücreleri veya bu hücreler ile oluşturulan hibrit hücreler için % 90 RPMI medyum %10 FCS, Gentamisin (50 µg/ml) kullanılır. Besi yeri +4 C de saklanır. Penisilin ve streptomisin antibiyotikleri hücre kültür ortamını bir çok grampozitif ve gram-negatif bakteriyel enfeksiyonlardan korurken, gentamisin hem bakteriyel hem de mycoplasma infeksiyonlarından korumaktadır. Seçici Besi Yeri; A) Normal besi yerine litre de 20 ml olacak şekilde Hypoxanthine-aminopterine-thymidine içeren (50 X HAT) çözeltinin eklenmesi ile hazırlanır. 174

13 B) Normal besi yerine litre de 20 ml olacak şekilde Hipoksantin-Timidin (50 X HT) içeren çözeltinin eklenmesi ile hazırlanır. Dondurma Besi Yeri; % 20 Fetal Sığır Serumu, % 70 DMEM, % 10 DMSO (Dimethyl Sulphoxide) olacak şekilde hazırlanır. DMSO kullanım anında ilave edilir. Polietilen Glikol (PEG) Hazırlanışı; 10 gr PEG MW 4000, 10 ml PBS (fosfat tamponu) içinde çözdürdükten sonra otoklav edilir. Sonuçta % 50 PEG solüsyonu (W/V) 1 ml olacak şekilde, steril tüplerde oda ısısında haftalarca saklanabilir. Tamponlar PBS (Fosfat) Tamponu; 10mM KH 2 PO 4, 10mM K 2 HPO 4 ile ph=7,2 olacak şekilde hazırlanır. 0,15 M NaCl ilave edilir. Fosfat-Tween 20 Tamponu; Fosfat tamponuna % 0,05 Tween 20 eklenir. Substrat Tamponu; 1 mm ZnCl 2, 1 mm MgCl 2, 0,1 M Glycine, ph=10,4 (KOH ile) olacak şekilde hazırlanır. -Kullanırken 1:1 oranında 4 paranitrophenylphosphate ilave edilerek karanlıkta saklanır. Kullanmadan 10 dakika önce hazırlanır. 3. Hibridoma Çalişmalarinda Kullanilan Yöntemler 3.1 Deney Hayvanlarının Bağışıklanması Hibridoma çalışmalarında bağışıklama çalışmaları için çoğunlukla 6 8 haftalık Balb/C türü fareler kullanılmaktadır. Bağışıklama protokolü antijenin çeşidine, yapısına ve molekül ağırlığına bağlı olarak değişebilir. Bağışıklama en az 3 veya 4 kez uygulanmalıdır. Fareleri bağışıklama işlemlerinde, antijenlerle birlikte adjuvantlar kullanılmaktadır. Adjuvantlar, antijen için bir depo görevi yaparken, antijenin uzun süreli salınmasını ve bağışıklık sisteminin hücrelerini uyarmaktan sorumludurlar. Adjuvantların kullanımı ile daha az miktardaki antijene hızlı, etkin ve uzun süreli bağışık yanıt oluşmaktadır. Adjuvantlar aynı zamanda antijen sunucu hücrelerin uyarımını sağlayarak antijenin daha etkin işlenmesini sağlarlar. Hibridoma çalışmalarında kullanılan adjuvantlar, mineral yağ (parafin) ve öldürülmüş Mycobacterium içeren complete Freund s adjuvant ve sadece mineral yağ içeren incomplete Freund s adjuvantıdır. Adjuvantlar kullanılırken, antijen ile 1:1oranında olacak şekilde hazırlanırlar (Howard 2007). Fare enjeksiyon yöntemleri ve miktarları Tablo 2 de, farelerin çeşitli antijenler ile bağışıklanma yöntemleri Tablo 3 de gösterilmektedir (Harlow,1988). 175

14 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 Tablo 2. Fare enjeksiyon yöntemleri ve miktarları Enjeksiyon Bölgesi Maksimum Miktar Adjuvant Antijen çeşidi Yorum Deri altı µl + / - Kas içi µl + / - Deri içi µl + / - Damar içi µl Freund s adjuvantsız Çözünebilir veya çözünmez Çözünebilir veya çözünmez Çözünebilir veya çözünmez Çözünebilir proteinler Kolay enjeksiyon Antijen salınımı yavaş Zor bağışıklama ve yavaş salınma Birincil bağışıklama için etkili değil Tablo 3. Farelerin çeşitli antijenler ile bağışıklanması. Antijen Tipi Örnek Enjeksiyon Bölgesi Miktar Çözünür Proteinler Partiküler Proteinler Enzimler Taşıyıcı proteinler ile konjuge edilmiş peptidler İmmün kompleksler Virüsler (öldürülmüş) Mayalar(öldürülmüş) Bakteriler(öldürülmüş) Yapısal proteinler Deri içi Kas içi Deri içi Damar içi Deri altı Kas içi Deri içi µg µg Çözünmeyen Proteinler Bakteriyel ürünler Katı faza bağlı proteinler Deri altı Deri içi Kas içi µg Karbonhidratlar Nükleik Asitler Polisakkaritler Glikoproteinler Nükleik asitler ile konjuge edilmiş taşıyıcı proteinler Deri altı Deri içi Kas içi Damar içi Deri altı Deri içi Kas içi Damar içi µg µg Farelerin bağışıklanma süreci antijenler arasında farklılık göstermekle birlikte burada model antijen olarak seçilen sığır serum albumini (BSA) ve adjuvantların farelerle bağışıklama protokolu Tablo 4 de gösterilmektedir. Şekil 3 de ise hibridoma çalışmalarında kullanılan deri altı bağışıklama yöntemi görülmektedir. Tablo 4. BSA proteini ile farelerin bağışıklanma protokolü Günler Antijen(BSA) Adjuvant Bağışıklama Şekli 1.gün 100 µg / 0.1ml PBS 1.1 ml Freund s complete adjuvant Deri altı 15.gün 100 µg / 0.1ml PBS 1.1 ml Freund s incomplete adjuvant Deri altı 35.gün 100 µg / 0.1ml PBS 0.1 ml Freund s incomplete adjuvant Deri altı 56.gün 50 µg / 0.1ml PBS adjuvantsız Damardan 176

15 Şekil 3. Deri altı Bağışıklama Yöntemi 3.2 Bağışık Yanıt Kontrolü Bağışık yanıt kontrolu için enzime bağlı immünolojik deneyler (ELISA) kullanılır. Antikor saptanması amacıyla yapılan dolaylı-elisa deneylerinde; ELISA plaklarındaki kuyucuklar ilgili antijen ile kaplanarak antikora duyarlı hale getirilir. Antikor düzeyi saptanacak olan örnek (fare serumu, hibridoma üst sıvısı) kuyucuklara ilave edilir. Böylece antikor, tabana bağlı antijen ile reaksiyona girer. Kuyucuklar yıkandıktan sonra ortamda sadece antijen antikor kompleksleri kalır. Bir sonraki aşamada kuyucuklara konan enzimle işaretli anti-immünglobulin antikorları ortamdaki antikor moleküllerine bağlanır. Kuyucukların tekrar yıkanmasından sonra ortama konan özgül substrat, enzim ile reaksiyona girer ve renk değişimi ile saptanan substratın parçalanma oranı örnekteki antikorun miktarını belirler (Crowther 2002). Fare serumlarındaki antikor aktivitelerinin belirlenmesi için genellikle farenin kuyruğundan kan alınır. Kuyruk ucundan 0.5 mm kesilerek alınan kan sodyum sitrat içerisinde santrifüj edilerek (10000g, yarım dakika) serum ayrılır ve ELISA da kullanılır. Farelerin seçiminde ve hibridoma çalışmalarında antikor düzeyi bu şekilde belirlenir Dolaylı ELISA Yöntemi 1-96 kuyuluk ELISA plakları (immunoplates) 100 µl antijen çözeltisi ile kaplanır. (Antijenin miktarı: BSA için 1 µg / µl dir). Gece boyu veya en az 6 saat, +4 C de inkübe edilir. 2- Plak 3 kez PBS-Tween 20 tamponu ile yıkanır. 3- % 0,2 lik 200 µl kazein çözeltisi ile kuyular boşlukların bloke edilmesi için kaplanır ve 1 saat 37 C de bekletilir. 4- Fare serumları PBS içerisinde seyreltilerek, hibridoma üst sıvıları ise direk olarak plaklara kaplanır ve 37 C de 1 saat bekletilir. 5- ELISA plakları yıkama tamponu ile 3 kez yıkanır. 6- Kuyular anti mouse-igg veya polyvalent (IgG, IgA, IgM) ile birleştirilmiş alkaline fosfatazın 1/1000 dilusyonunda (PBS ile) 37 C de 1 saat inkübe edilir (100 µl). 177

16 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 7- Kuyular 5 kez yıkandıktan sonra substrat tamponu ilave edilerek (100 µl), 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta inkübasyon sürer ve antikor düzeyi renk değişiminden 405 nm de ELISA sayacında okunur. ELISA yönteminde kullanılan enzim ve substratlar Tablo 5 de yer almaktadır. Tablo 5. ELISA testlerinde kullanılan enzim ve substratlar Enzim Substrat Reaksiyonu Durdurma Dalga Boyu (Nm) Alkaline phosphatase (ALP) Para-nitrophenyl phosphate(pnpp) 5-Bromo-4-chloro 3 indolyl phosphate (BCIP) 3M NaOH %2 Na 2 EDTA Horseradish peroxidase(hrp) Tetramethyl benzidine (TMB) O-phenylene diamine (OPD) azino-bis(9-ethylbenzthiazoline 6-sulfonic acid)(abts) +H 2 O 2 2M H 2 SO 4 3M H 2 SO 4 %1 SDS Hücre Kültürü Çalışmaları Kanser (Myeloma) Hücrelerinin Kültür Şişelerine Aktarımı Donmuş temin edilen myeloma hücreleri, 37 C sıcaklıkta çözülerek PBS tamponu içerisinde 900 rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Hücreler 2 kez bu şekilde yıkandıktan sonra, çöken hücreler normal besi yerine alınarak kültür şişelerine aktarılır (Hay 1992). Bu hücreler kültür şişelerinde zemine yapışma özelliğinde olan hücrelerdir. Pasaj işlemi ile hücreler kaldırılarak, diğer hücre kaplarına fazla miktarda üretmek amacıyla aktarılırlar Hücrelerin Sayımı Bir hücre süspansiyonunun konsantrasyonu, hücrelerin hemositometre (HS) adı verilen optik olarak düz bir hazneye konularak, binoküler, faz kontrast (ışığı ayarlanabilen) mikroskop altında sayılması ile belirlenir. Bu amaçla aşağıdaki işlemlerin yapılması gerekmektedir. 1. Hemositometrenin yüzeyi % 70 Etil alkol ile temizlenir. Üzerine lamel yerleştirilir. 2. Mililitre olarak miktarı belli hücre örneğinden yaklaşık 15-20µl, hemositometrenin her iki haznesine pipetlenir. Örneğin hazneden taşmamasına ve boş alan kalmamasına dikkat edilmelidir X objektif ile hazne üzerindeki grid çizgilerine odaklanarak Şekil 4 de görülen 1 mm 2 lik alandaki 25 kareye düşen hücreler sayılır (Barker 1998). 4. Hemositometrenin her iki haznesi de benzer şekilde sayılarak, iki sayımın ortalaması alınır ve hücre örneğinin konsantrasyonunu aşağıdaki formüle göre hesaplanır. Formül; 104 (Sabit katsayı) X Hücre hacmi (ml) X Sayılan hücre miktarı = Toplam Hücre Sayısı 178

17 Şekil 4. Hemositometre Hücrelerin Dondurulması Hücreler uzun yıllar boyunca dondurularak korunabilir. Sıvı azotta (-196 o C) saklama günümüzde tercih edilen hücre koruma yoludur. Hücre süspansiyonu tercihen yüksek bir konsantrasyon da olmalı ve yavaşça, 1 o C /dk hızıyla, gliserol ya da dimetil sülfoksit (DMSO) gibi bir koruyucu varlığında dondurulmalıdır. DMSO çoğunlukla %5 10 (v/v) konsantrasyonda, gliserol ise son konsantrasyonu %5 15 oranında olacak şekilde hücre tipine göre değiştirilerek kullanılır. DMSO güçlü bir çözücüdür, plastik tüplerin içinde kalan bir takım kimyasalları çözeceğinden orjinal stok şişesinde ya da cam kapaklı cam bir şişede saklanmalıdır. Hücre dondurma işleminde; hücreler yıkandıktan sonra, yaklaşık 5x x10 6 hücre/ml (dondurma medyumu) olacak şekilde özel dondurma tüplerine alınır (Şekil 5). Dondurma tüpleri ilk etapta -20 C de 2 3 saat kadar bekletilip -70 C ye alınır. Bir gün -70 C de bekletildikten sonra -196 C de sıvı azot tanklarında muhafaza edilirler. Şekil 5. Dondurma tüpleri 3.4 Füzyon ve Hazırlıkları Besleyici Hücrelerin Hazırlanması Füzyondan bir önceki gün yapılan işlemdir. Bu amaçla hiç immünize olmamış normal fare kullanılır. Fare öldürüldükten sonra alkol içerisinde temizlenir. Sırt üstü yatırılan farenin, laminar akımlı kabin içerisinde steril makas ve pens yardımıyla karın bölgesi yanlara doğru açılır, bir elle kuyruk tutulurken üst deri pens yardımı ile boyuna doğru çekilerek periton açığa çıkarılır. Yağsız bir bölgeden organlara değmeden periton içerisine 5 ml DMEM (serumsuz) zerk edilir, farenin karnı DMEM ile kaplanmasından sonra enjektöre geri çekilir (çekilebildiği kadar). Böylece periton iç yüzeyindeki besleyici hücreler alınmış olur (Şekil 6). 179

18 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 Enjektör içerisindeki hücreler bir tüpe alınır ve hücre sayımı yapılır. Çalışılacak hücre kültür plağı sayısına göre her kuyuya ~6000 hücre + normal besi yeri karışımı 100 µl olacak şekilde dağıtılır (Liddell 1991). Amaç; Hibrit hücreler normalde polistrenden yapılmış hücre kültür plaklarında yaşamakta güçlük çekerler. Makrofaj hücreleri, salgıladıkları sitokinler ile gerek hücre aktivitesini artırarak gerek ortamdaki artıkları varsa mikropları fagosite ederek ortamı hibrit hücrelerin yaşayabileceği hale getirirler. Şekil 6. İntraperitonal sıvının genel görünüşü Bağışıklanmış Dalak Hücrelerinin Elde Edilmesi Antijen ile immünize edilen fareler arasında en yüksek antikor cevabı veren fare ELISA yöntemi ile belirlenir. Fare dislokasyon yöntemi ile öldürülür ve %70 alkol içerisinde dezenfekte edilir. Laminar akımlı kabin içerisinde, bağışıklanmış fare yan yatırılarak sol kaburga hizasından açılır. Periton kesilerek kaburganın hemen altından dalak yağ dokusundan arındırılmış bir şekilde 5 ml PBS tamponu bulunan petri kabına alınır. Dalak burada diğer yabancı dokulardan temizlenerek 10 ml PBS tamponu içeren başka bir petri kabına alınır. Dalak küçük bir süzgeçte cam baget ile ezilerek hücreler açığa çıkarılır ve pipet yardımı ile süspanse edilir (Şekil 7). Hücreler, PBS tamponunda 900 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek 2 kez yıkanır. Çöken hücreler 10 ml PBS içerisine alınarak hücre sayımı yapılır. Şekil 7. Dalak hücrelerinin genel görünüşü 180

19 3.4.3 Bağışık Fareden Lenf Hücre Eldesi ELISA ile en yüksek bağışık yanıtı veren fare disloke edilerek alkol içinde dezenfekte edilir. Steril ortamda sırt üstü yatırılarak % 70 alkol içerisinde dezenfekte edilir. Ön ve arka ayaklarından yanlara doğru iğnelendikten sonra gövde üzerinde genital bölgeden alt çeneye kadar deriye kesit atılır. Deri yanlara doğru açılarak iğnelenir ve lenf toplama işlemi başlatılır. Çene ve koltuk altında 2 çift, yanlara açılan deri üzerinde ve kasıkta 1 er çift olan yüzey lenf düğümleri toplandıktan sonra periton açılarak bağırsaktaki 4, sırttaki 3 tane olan derin lenf düğümleri toplanır. Çıkarılan lenf düğümleri dalak hücre eldesinde olduğu gibi petri kabına alınarak mekanik ezme işlemiyle lenf hücreleri de açığa çıkarılır ve süspansiyon sonrası hücreler sayılır. Aynı fareden hem dalak hem lenf hücresi elde etmek için fare önce lenf hücre eldesindeki gibi açılıp yüzey lenf düğümleri toplandıktan sonra peritonu açılıp dalağı çıkarılır ve derin lenf düğümleri toplanır Myeloma Hücrelerinin Hazırlanması Füzyondan 10 gün öncesinde kültürde normal besi yeri içerisinde çoğaltılan FO myeloma (Şekil 8) hücreleri hücre kültür şişelerinde çoğaltılmaya alınır. Myeloma hücrelerinin çoğaltılması işlemlerinin başlangıcında hücrelerin bulunduğu besi yerine Azoguanin (20 µg/ml) eklenerek HGPRT mutantı hücrelerin ortamdan uzaklaştırılması sağlanır. Füzyon günü kültür şişelerinin içindeki kullanılmış besi yeri steril bir beher içine dökülür ve hücreler pasajla 50 ml lik santrifüj tüpü içerisine alınır ve 900 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek 2 kez yıkanır. Çöken hücreler 10 ml PBS içerisine alınarak hücre sayımı yapılır. Şekil 8. F0 myeloma hücreleri büyük parlak hücrelerdir Hücre sayımı yapılan FO myeloma hücreleri ve dalak hücreleri 1/10 1/5 oranı olacak şekilde birleştirilir ve 900 rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Üst kesim atılarak çöken hücre karışımına 37 C de ısıtılmış 1 ml Polietilen Glikol (PEG) dakika içerisinde oldukça yavaş eklenir. 1 dakika hücre karışımı 37 C bekler. 4 ml sadece DMEM (FCS +antibiyotik içermeyen)

20 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 dakika içerisinde yavaş yavaş ilave edilir Daha sonra tekrar 20 ml DMEM 2-3 dakika içerisinde ilave edilir en son % 15 FCS içeren, 20 ml DMEM aynı süreler içerisinde eklenir. Karışım 1 saat 37 C ısıdaki CO 2 li etüvde bekletildikten sonra, santrifüj edilir. Çöken hücrelere seçici kültür ortamı ilave edilerek bir önceki gün makrofaj ekilmiş hücre kültür plaklarına 150 µl /kuyu olacak şekilde dağıtılır (Şekil 9).10 gün sonra hücrelerin üst sıvılarından 100 µl çekilir ve üzerine 100 µl seçici HAT medyum ilave edilir. 12. gün aynı şekilde seçici HT ortamı eklenir. Hücrelerin gelişme periyoduna bağlı olarak normal besi yerine geçilir. Füzyondan yaklaşık 10 gün sonra hibrit hücreler HAT seçici besi yerinde canlı, belirgin ve büyük hücreler olarak gelişmekte ve klon oluşturmaktadır (Şekil 10). Şekil 9. Hibrit hücre geliştirmek amacı ile birleştirilen myeloma ve dalak hücrelerinin füzyon günü görünümleri Şekil 10. Hibrit hücreler (Füzyonun 4. ve 10. Günü) Hibrit hücreler polikaryot olmaları nedeni ile kromozom sayıları iki katına çıkmaktadır, dolayısıyla hücrelerde anormal bir durum oluşmakta ve hücreler kolaylıkla mitoz bölünme yapamamaktadır. Bu nedenle bazen uygun şartlarda dahi hibrit hücrelerin 1-2 hafta bölünmeden kaldığı gözlenebilir. Hibrit hücrelerde kontakt inhibisyon ortadan kalkmakta ve myeloma hücrelerinde gözlenen tek tabaka konumu kaybolmaktadır. Hibrit hücrelerin elde edilmesi için hücre füzyonunda kullanılan PEG, birleştirmeye çalışılan hücrelerin zarlarını etkileyen bir ajandır. Membranda geçici olarak porlar açarak hücrelerin kromozomlarının kaynaşmasını sağlar. 182

21 3.4.6 Alt Klonlama İşlemi (Limiting Dilution) Füzyon sonucu spesifik antikor üreten hibrit hücreleri, tek klondan oluşan soyu oluşturmak için seyreltme işlemi yapılır. Bu amaçla yaklaşık olarak füzyonun 10. veya 20. günlerinde ELISA yöntemi ile pozitif reaksiyon verdiği tespit edilen hibrit klonlara alt klonlama işlemi yapılır. Bu hücreler, pipet yardımı ile tüplere alınır ve hücre sayımı yapılarak 96 kuyuluk kültür kaplarında tek hücre olacak şekilde dağıtılırlar. 3.5 Hibridomaların Geniş Ölçekte Üretimi Hibridomaların üremelerini ve antikor sentezlerini arttırmak ve fazla miktarda antikor üretmek için başlıca iki yöntem kullanılmaktadır (in vitro ve in vivo). In vitro üretiminde; 75 cm 2 ve 150 cm 2 lik kültür şişelerinden yararlanılır. Ayrıca 1 2 litrelik magnetik karıştırıcılı kültür şişeleri içerisine koyulan polystrene yapılı küçük küreciklere hücrelerin yapışması ve çoğalma sırasında salgıladıkları antikorların şişedeki besi ortamına yayılması ile antikor toplanabilir. Bu şekilde hücre kültürünün üst sıvısında 1 ml de yaklaşık 10-50µg monoklonal antikor bulunabilir (Backer 1988, Jackson 1999). In vivo üretiminde; BALB/c farelerin derileri altına veya karın içerisine aktif üremekte olan hibridoma hücreleri hücre/ml olacak şekilde farelere zerk edilir. Bu işlemden önce farelere 2 hafta öncesinden 0,5 ml miktarında pristane (tetramethyl penta decone) verilir. Pristan farede immün sistemi geçici olarak zayıflatarak tümör oluşumunu hızlandıracaktır. Hidridomaların zerk edilmesinden yaklaşık 2 4 hafta içerisinde karında asidik sıvı oluşmaya başlar. Oluşan sıvı bir enjektör ile çekilerek alınır. Bu sıvının 1 ml sinde yaklaşık mg monoklonal antikor bulunabilir (Jackson 1999, Akçael 2008). Kültür üst sıvısı veya farenin asidik karın sıvısı santrifüjle hücrelerden ayrılır, saflaştırılır ve +4 C de monoklonal antikorları saklama tamponunda 6 ay süre ile -20 C de 1 yıl süre ile muhafaza edilir. Antikorların dondurulup çözülmesi etkinliğini azaltmaktadır. Şekil 11 de hibridomaların geniş ölçekte üretiminde kullanılan spinal kültür ve hücre kültür şişeleri yer almaktadır. Bunların dışında Cell roll, CELL Line, MiniPERM ve mini rekatörler de kullanılmaktadır. Spinal Kültür Hücre kültür şişeleri Şekil 11. Hibridomaların geniş ölçekte üretiminde kullanılan bazı sistemler 183

22 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / Monoklonal Antikorların Saflaştırılması Monoklonal antikorları içeren kültür üst sıvıları, bağışık fare antikorlarını içeren poliklonal antikorlar ve hibridoma hücrelerinin zerk edilmesi ile elde edilen fare asidik sıvı kesimleri saf değildir. Genellikle saflaştırma işleminden önce antikorun alt tipinin bilinmesi gerekmektedir. IgG ve IgM tipi antikorların saflaştırılabilmesi için farklı yöntemler kullanılmaktadır (Gagnon,1996). Burada hibridoma çalışmalarında, monoklonal antikor saflaştırmada kullanılan yöntemlerden bahsedilecektir Amonyum Sülfat (NH4) 2 SO 4 ) ile Çöktürme Amonyum sülfat ile çöktürme en genel ve pratik antikor saflaştırma yöntemlerinden biridir. Antikorların çoğu %45 50 doygunluktaki amonyum sülfat konsantrasyonunda çökerler. Amonyum sülfat ile çöktürme sonrası antikorlar yeterince saf değildir. Yüksek molekül ağırlıklı diğer proteinlerle kontamine olabilirler. Bu nedenle amonyum sulfat çöktürme tek başına yeterli bir saflaştırma yöntemi değildir. Tablo 6 da bulunan ek yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Deneysel çalışmalarda, geniş ölçekte toplanmış IgG tipi antikor içeren hibridoma üst sıvılarına % 45 oranında amonyum sülfat kristalleri (341 gr/lt) soğukta tüm proteinlerin çökmesi için yavaş bir şekilde ilave edildi. Üst sıvı gece boyu +4 C de bu şekilde karıştırıldı. Daha sonra rpm de 1 saat santrifüj edilerek üst kısım atılır, pellet PBS içerisinde çözülerek tekrar PBS tamponuna karşı gece boyu diyaliz edilerek yoğun tuzdan uzaklaştırılırlar. Diyaliz sonrası antikorların ilgili antijene aktivitesi ELISA ile tekrar belirlenir (Coligan 1991) Antikorların İmmünoafinite ile Saflaştırılması Affinite kromatografi (genel olarak Protein A veya G ile),iyon değiştirici kromatografi, HPLC (High performance liquid chromatography) gibi yöntemler kullanılarak çok yüksek düzeyde antikor saflaştırılabilir. Protein A farklı türden hayvan antikorlarına bağlanabilen Staphylococcus aureus dan izole edilen bakteriyel bir hücre duvarı proteinidir. Protein A, özellikle immünoglobulinlerin IgG ve alttürlerinin Fc kısmına spesifik olarak bağlanır. Protein A, antikorlar için 4 bağlanma bölgesine sahiptir. Ancak aynı anda sadece ikisi kullanılabilir. Antikorların farklı sınıf ve alt sınıfları Protein A ve Protein G için farklı affiniteye sahiptirler. Protein A ya iyi bağlanmayan pek çok sınıf veya alt sınıf içeren antikorlar Protein G ye daha iyi bağlanırlar (Schwarz 2001, Scopes 1994). Şekil 12 de Protein-G sefaroz immun afinite kolon kromatografi sistemi görülmektedir. Sistemde örnekler (hibridoma üst sıvı, serum veya asidik sıvı) kolona yüklemeden önce, kolonu tıkamaması ve var olan kalıntılardan uzaklaştırmak amacı ile 0,22 µm veya 0.45 µm 184

23 filtreden geçirilir. Filtreden geçirilen örnek 1:1 (v/v) Binding Buffer ile sulandırılır (Örneğin; 5 ml filtrelenmiş üst sıvı örneği + 5 ml buffer), 10 ml örnek kolona yüklenir. Antikor molekülü Protein G ye olan afinitesi sebebi ile kolona bağlanırken, diğer proteinler kolondan ayrılır. Kolona bağlanmış antikorlar, düşük ph lı 0.1 M Glisin tamponu kullanılarak kolondan uzaklaştırılarak saflaştırılmış olmaktadır. Şekil 12. Immun Afinite Kolon Kromatografisi ( ) Saflaştırma Metodu; Kolon, hacminin 5 katı (5X) kadar bağlama tamponu ile yıkama yapılır. amonyum sülfat çöktürme sonrası IgG tipi antikor üreten hibridoma üst sıvısı filtreden geçirildikten sonra protein-g veya protein-a immün afinite kolonuna yüklenir. Ardından bağlama tamponu eklenerek, kolon sonrası kesimler 1 er ml olmak üzere tüplerde toplanır. Tüplerin absorbans değerleri, 280nm de ölçülerek, sıfırı gösterinceye kadar kolondan bağlama tamponu geçirilir. Sonra kolona elüsyon tamponu yüklenir. Antikorlar 75µl denge tamponu içeren tüplerde 1 er ml olmak üzere toplanır. Absorbans 280nm de sıfırı gösterinceye kadar işlem devam ettirilir. Kolon, hacminin iki katı kadar %20 lik etanol ile yıkanarak 4 ο C ye kaldırılır. Kolon sonrası tüpler, ELISA ile test edilerek aktivite alınan monoklonal antikor kesimleri belirlenir. Tamponlar: Bağlama (binding) tamponu: 20mM Sodyum fosfat ph=7 Elüsyon tamponu: 0.1M Glisin-HCl ph=2,7 Denge (neutralizing) tamponu: 1M Tris-HCl ph=9 Saflaştırılmış Monoklonal Antikorlar, 1 M TRIS, ph.8.0 tamponu içerisinde, % 0.02 gr sodyum azid ilave edilerek +4 ο C'de 6 ay saklanır. 185

24 MODERN BİYOTEKNOLOJİ VE UYGULAMALARI / 7 Tablo 6. Çeşitli antikor saflaştırma teknikleri ve bu tekniklerin avantaj ve dezavantajları Teknik Uygunluğu Avantajları Dezavantajları Amonyum sulfat (% 45-% 50) Tek başına yeterli değildir, tüm kaynaklardan (serum, hücre üst sıvısı) antikorların kısmi saflaştırılmasında ve konsantre edilmesinde Ucuz olması, Konsantre olması, Kolay olması, yüksek miktarlar için uygun olması Antikorların saf elde edilememesi, Diğer tekniklere bağımlılığın olması (tam saflaştırma için) DEAE (Diethylamino ethyl kolonu ) Tek başına yeterli değildir, tüm kaynaklardan (serum, hücre üst sıvısı) antikorların kısmi saflaştırılmasında ve konsantre edilmesinde Ucuz olması, Konsantre olması, Yüksek miktarlar için uygun olması Antikorların saf elde edilememesi, Diğer tekniklere bağımlılığın olması ( tam saflaştırma için) Hidroksihepatit Tek başına yeterli değildir, tüm kaynaklardan (serum, hücre üst sıvısı) antikorların kısmi aflaştırılmasında ve konsantre edilmesinde Konsantre olması, Dializ işlemininin gerekli olmaması Antikorların saf elde edilememesi, Pahalı olması Gel filtrasyon Tek başına yeterli değildir, IgM tipi antikorlar için uygundur Poliklonal serumlardan IgM nin diğer antikorlardan ayrılması Antikorların saf elde edilememesi, Düşük kapasitede olması, Örneklerin dilue olması, IgG ler için uygun olmaması Protein A sefaroz IgG ler için ( IgG1, IgG2a, IgG2b ) Saf antikor, Kolay, Tek aşamalı, Yüksek ürün kapasitesi Pahalı olması, Tüm sınıf vet türler için uygun olmaması, Protein G sefaroz IgG ler için ( IgG2a, IgG2b, IgG3 ) Saf antikor, Kolay, Tek aşamalı, Yüksek ürün kapasitesi Pahalı olması, Tüm sınıf vet türler için uygun olmaması, Antijen afinite kolonu Poliklonal serumlar Saf antikor, spesifik antikor Pahalı olması, Çok aşamalı olması, Saf antijenin gerekli olması, antikorlar inaktive olabilir Anti-Ig afinite kolonu Poliklonal serumlardan özgün antikor tiplerinin seçiminde tür ve sınıfa özgü antikor eldesi Pahalı olması, Çok aşamalı olması, Ürün kapasitesinin düşük olma 3.7. Hücre Kültüründe Kontaminasyon Çoğu doku, hücre kültürü çalışmalarında bakteriler, mantarlar, mayalar kontaminasyon etkenleridir. Bu etkenlere karşı en iyi kontrol steril tekniktir. Bakteriyel kontaminasyonlar genelde zor olmamakla birlikte antibiyotik kullanılarak kontrol edilebilirler. Penisilin ve Streptomysin hücre kültür medyumlarında rutin olarak kullanılan antibiyotiklerdir. Gentamisin ise; penisilin ve streptomysine dirençli bakterilerin mevcudiyetinde kullanılan bir antibiyotiktir. Gentamisin aynı zamanda mycoplazma enfeksiyonlarında da etkili bir antibiyotiktir. 186

Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü.

Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü. Doç.Dr.Engin DEVECİ HÜCRE KÜLTÜRÜ Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerin invitro kültürlerini yaparak araştırmacılara kanser, kök hücre, hücre mekaniği çalışmaları gibi konularda hücre

Detaylı

İMMUNİZASYON. Bir bireye bağışıklık kazandırma! Bireyin yaşı? İmmunolojik olarak erişkin mi? Maternal antikor? Konak antijene duyarlı mı? Sağlıklı mı?

İMMUNİZASYON. Bir bireye bağışıklık kazandırma! Bireyin yaşı? İmmunolojik olarak erişkin mi? Maternal antikor? Konak antijene duyarlı mı? Sağlıklı mı? İMMUNİZASYON Bir bireye bağışıklık kazandırma! Bireyin yaşı? İmmunolojik olarak erişkin mi? Maternal antikor? Konak antijene duyarlı mı? Sağlıklı mı? Canlıya antijen verdikten belli bir süre sonra, o canlıda

Detaylı

RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti

RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 DNA parçalarının agaroz jelden geri kazanımı ve PZR ürünlerinin saflaştırılması için Yalnızca profesyonel kullanım için REF 09009050

Detaylı

Hücre Biyoloji Laboratuarı Güz dönemi Alıştırma Soruları (Dr.Selcen Çelik)

Hücre Biyoloji Laboratuarı Güz dönemi Alıştırma Soruları (Dr.Selcen Çelik) Hücre Biyoloji Laboratuarı 2014-2015 Güz dönemi Alıştırma Soruları (Dr.Selcen Çelik Konular: ph ve tamponlar, hücre kültür tekniği, mikrometrik ölçüm ph ve Tamponlar 1. ph sı 8.2 olan 500 ml. 20mM Tris/HCl

Detaylı

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ ve TEKNOLOJİSİ Doç.Dr. Engin DEVECİ

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ ve TEKNOLOJİSİ Doç.Dr. Engin DEVECİ DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ ve TEKNOLOJİSİ Doç.Dr. Engin DEVECİ Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerin invitro kültürlerini yaparak

Detaylı

ADIM ADIM YGS LYS Adım DOLAŞIM SİSTEMİ 5 İNSANDA BAĞIŞIKLIK VE VÜCUDUN SAVUNULMASI

ADIM ADIM YGS LYS Adım DOLAŞIM SİSTEMİ 5 İNSANDA BAĞIŞIKLIK VE VÜCUDUN SAVUNULMASI ADIM ADIM YGS LYS 177. Adım DOLAŞIM SİSTEMİ 5 İNSANDA BAĞIŞIKLIK VE VÜCUDUN SAVUNULMASI İNSANDA BAĞIŞIKLIK VE VÜCUDUN SAVUNULMASI Hastalık yapıcı organizmalara karşı vücudun gösterdiği dirence bağışıklık

Detaylı

MAIA Pesticide MultiTest

MAIA Pesticide MultiTest MAIA Pesticide MultiTest GIDALARDA PESTİSiT KALINTILARI İÇİN AB MAKSİMUM KALINTI LİMİTLERİ İLE UYUMLU ÇOKLU KALINTI TARAMA TESTİ Microplate Acetylcholinesterase Inhibition Assay (MAIA) katı veya sıvı gıda

Detaylı

TEMEL ARAŞTIRMA TEKNİKLERİ II

TEMEL ARAŞTIRMA TEKNİKLERİ II TEMEL ARAŞTIRMA TEKNİKLERİ II 6,7,8 HAFTA Prof. Dr. Eser ELÇİN Hücre kültüründe temel işlemler: besiyeri hazırlama, hücre ekimi, besiyeri değiştirme, alt kültüre geçiş, hücre sayımı, pasajlama, kontaminasyon

Detaylı

HÜCRE DONDURMA VE ÇÖZME. Uzm. Mol. Bio. Gamze ÇAĞATAY

HÜCRE DONDURMA VE ÇÖZME. Uzm. Mol. Bio. Gamze ÇAĞATAY HÜCRE DONDURMA VE ÇÖZME Uzm. Mol. Bio. Gamze ÇAĞATAY Neden Dondurma? Hücreleri saklamak Düşük pasajlarda araştırma yapmak Hücrenin orijinal yapısını korumak Genetik stabiliteyi korumak Mikrobiyal ve çapraz

Detaylı

PRİMER HÜCRE KÜLTÜRÜ UYGULAMALI KURSU

PRİMER HÜCRE KÜLTÜRÜ UYGULAMALI KURSU PRİMER HÜCRE KÜLTÜRÜ UYGULAMALI KURSU TÜRKHAYGEN-1 PROJESİ 23-24 Ocak 2008 (TUBITAK-MAM-GMBE) KURS ORGANİZASYONU Doç.Dr.Sezen ARAT Arzu TAŞ Gaye ÇETİNKAYA PROGRAM 1. Gün 23 OCAK 2008 Stok Medyum ve Kullanıma

Detaylı

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ. İmmunohistokimya teknikleri ve Kullanım Alanları. Doç.Dr.

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ. İmmunohistokimya teknikleri ve Kullanım Alanları. Doç.Dr. DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ İmmunohistokimya teknikleri ve Kullanım Alanları Doç.Dr. Engin DEVECİ İmmunohistokimya Hücre ve doku içinde bulunan bazı enzimlerin ya

Detaylı

ATIKSULARDA FENOLLERİN ANALİZ YÖNTEMİ

ATIKSULARDA FENOLLERİN ANALİZ YÖNTEMİ ATIKSULARDA FENOLLERİN ANALİZ YÖNTEMİ YÖNTEM YÖNTEMİN ESASI VE PRENSİBİ Fenolik maddeler uçucu özellik göstermeyen safsızlıklardan distilasyon işlemiyle ayrılır ve ph 7.9 ± 0.1 de potasyum ferriksiyanür

Detaylı

Bağışıklık sistemi nasıl çalışır?

Bağışıklık sistemi nasıl çalışır? On5yirmi5.com Bağışıklık sistemi nasıl çalışır? İnsanda bağışıklık sistemi, özellik ve görevleri nelerdir? Kaç çeşit bağışıklık sistemi vardır? Yayın Tarihi : 23 Ekim 2012 Salı (oluşturma : 10/3/2017)

Detaylı

STERİLİZASYON DERSİ 4. HAFTA DERS NOTLARI YRD. DOÇ. DR. KADRİ KULUALP

STERİLİZASYON DERSİ 4. HAFTA DERS NOTLARI YRD. DOÇ. DR. KADRİ KULUALP STERİLİZASYON DERSİ 4. HAFTA DERS NOTLARI YRD. DOÇ. DR. KADRİ KULUALP STERİLİZASYON YÖNTEMLERİ SÜZME YÖNTEMİ FİLTRASYON İLE STERİLİZASYON Süzme mekanizmalarına göre; a) Absorbsiyonla mikroorganizmaları

Detaylı

MİKROBİYOLOJİ LABORATUARINDA SIK KULLANILAN BAZI BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI VE MUHAFAZASI

MİKROBİYOLOJİ LABORATUARINDA SIK KULLANILAN BAZI BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI VE MUHAFAZASI MİKROBİYOLOJİ LABORATUARINDA SIK KULLANILAN BAZI BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI VE MUHAFAZASI Çevre Mühendisliği Laboratuarlarında yaptığımız mikrobiyolojik deneylerde en çok buyyon ve jeloz besiyerlerini

Detaylı

RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 IVD Bakteri örneklerinden genomik nükleik asit izolasyonu ve saflaştırılması için In vitro tanı amaçlı kullanım için Yalnızca

Detaylı

Steril Hücre Kültürü Tekniği h"ps://www.youtube.com/watch?v=ugcgo42vnqi

Steril Hücre Kültürü Tekniği hps://www.youtube.com/watch?v=ugcgo42vnqi Kontaminasyon Steril Hücre Kültürü Tekniği h"ps://www.youtube.com/watch?v=ugcgo42vnqi Kontaminasyon Kontaminasyon hücre kültürü laboratuvarlarında en çok karşılaşılan problemlerden birisidir. Hücrelerin

Detaylı

RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-05 IVD İnsan kan örneklerinden in vitro tanı amaçlı genomik nükleik asit izolasyon ve saflaştırması için In vitro tanı amaçlı

Detaylı

Yapay Bağışık Sistemler ve Klonal Seçim. Bmü-579 Meta Sezgisel Yöntemler Yrd. Doç. Dr. İlhan AYDIN

Yapay Bağışık Sistemler ve Klonal Seçim. Bmü-579 Meta Sezgisel Yöntemler Yrd. Doç. Dr. İlhan AYDIN Yapay Bağışık Sistemler ve Klonal Seçim Bmü-579 Meta Sezgisel Yöntemler Yrd. Doç. Dr. İlhan AYDIN Bağışık Sistemler Bağışıklık sistemi insan vücudunun hastalıklara karşı savunma mekanizmasını oluşturan

Detaylı

RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti

RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 Bakteri örneklerinden plazmid DNA izolasyonu ve saflaştırılması için Yalnızca profesyonel kullanım için REF 09007050 50 test 09007100

Detaylı

Kanın fonksiyonel olarak üstlendiği görevler

Kanın fonksiyonel olarak üstlendiği görevler EGZERSİZ VE KAN Kanın fonksiyonel olarak üstlendiği görevler Akciğerden dokulara O2 taşınımı, Dokudan akciğere CO2 taşınımı, Sindirim organlarından hücrelere besin maddeleri taşınımı, Hücreden atık maddelerin

Detaylı

İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Presipitasyon G)İMMUNOASSAY TESTLER İşaretli antikorların kullanılmasıyla 1942 de; FA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar) 1954 de; IFA (İndirekt Fluoresan Antikor) 1960 da; RIA

Detaylı

Yasemin Budama Kılınç1, Rabia Çakır Koç1, Sevim Meşe2, Selim Badur2,3

Yasemin Budama Kılınç1, Rabia Çakır Koç1, Sevim Meşe2, Selim Badur2,3 Yasemin Budama Kılınç1, Rabia Çakır Koç1, Sevim Meşe2, Selim Badur2,3 1 Yıldız Teknik Üniversitesi, Biyomühendislik Bölümü, 34220, İstanbul 2 İstanbul Üniversitesi, İst. Tıp Fak., Mikrobiyoloji ABD, Viroloji

Detaylı

Kromozom, DNA ve Gen. Allel Segregasyonu. DNA çift sarmalı. Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar. Hastalık yapan mutasyonlar

Kromozom, DNA ve Gen. Allel Segregasyonu. DNA çift sarmalı. Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar. Hastalık yapan mutasyonlar Temel Genetik Kavramlar DNA izolasyon yöntemleri Kromozom, DNA ve Gen Hücre Nukleus Kromozomlar Gen Prof.Dr.Uğur ÖZBEK Protein DNA çift sarmalı Allel Segregasyonu Şeker Fosfat omurga Bazlar Baz çifti A

Detaylı

PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI

PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI Bir hücre ve dokudan istenilen bir proteinin saf halde izole edilmesi oldukça güç bir olaydır. Bu proteinin konsantrasyonu düşük ise binlerce farklı protein arasından ayırmak

Detaylı

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP)

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP) Deney: M 1 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP) a) PCR yöntemi uygulaması b) RPLF sonuçları değerlendirilmesi I. Araç ve Gereç dntp (deoksi Nükleotid

Detaylı

ULUSAL BİYOÇEŞİTLİLİĞİNİN VE GEN KAYNAKLARININ KORUNMASI HEDEFLERİ DOĞRULTUSUNDA BÜYÜK MEMELİ TÜRLERİNİN ARAŞTIRILMASI, KORUNMASI VE YÖNETİMİ

ULUSAL BİYOÇEŞİTLİLİĞİNİN VE GEN KAYNAKLARININ KORUNMASI HEDEFLERİ DOĞRULTUSUNDA BÜYÜK MEMELİ TÜRLERİNİN ARAŞTIRILMASI, KORUNMASI VE YÖNETİMİ ULUSAL BİYOÇEŞİTLİLİĞİNİN VE GEN KAYNAKLARININ KORUNMASI HEDEFLERİ DOĞRULTUSUNDA BÜYÜK MEMELİ TÜRLERİNİN ARAŞTIRILMASI, KORUNMASI VE YÖNETİMİ Örnekleme Çalışmaları: Önemli Noktalar DNA ÇALIŞMASI Projenin

Detaylı

RTA Mayadan Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Mayadan Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Mayadan Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Klavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 Maya örneklerinden genomik nükleik asit izolasyonu ve saflaştırılması için Yalnızca profesyonel kullanım için REF 09002050

Detaylı

Biyofilmler; mikroorganizmaların, biyotik veya abiyotik yüzeylere adhezyonu sonrasında oluşturdukları glikokaliks olarak da adlandırılan

Biyofilmler; mikroorganizmaların, biyotik veya abiyotik yüzeylere adhezyonu sonrasında oluşturdukları glikokaliks olarak da adlandırılan Biyofilmler; mikroorganizmaların, biyotik veya abiyotik yüzeylere adhezyonu sonrasında oluşturdukları glikokaliks olarak da adlandırılan ekstraselluler matriks içinde, birbirlerine yapışarak meydana getirdikleri

Detaylı

Hücre. 1 µm = 0,001 mm (1000 µm = 1 mm)!

Hücre. 1 µm = 0,001 mm (1000 µm = 1 mm)! HÜCRE FİZYOLOJİSİ Hücre Hücre: Tüm canlıların en küçük yapısal ve fonksiyonel ünitesi İnsan vücudunda trilyonlarca hücre bulunur Fare, insan veya filin hücreleri yaklaşık aynı büyüklükte Vücudun büyüklüğü

Detaylı

Protokolü PD S Reaksiyon

Protokolü PD S Reaksiyon Salmonella sp. Real time PCR Tespit Kiti Protokolü PD S00 0 50 Reaksiyon REŞİT GALİP CADDESİ 74-7 06700 ÇANKAYA, ANKARA, TÜRKİYE T +90 32 447 22 79 / 80 F +90 32 447 22 07 www.bmlabosis.com İnternal Pozitif

Detaylı

EVDE BİYOTEKNOLOJİ. Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 5. DERS

EVDE BİYOTEKNOLOJİ. Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 5. DERS EVDE BİYOTEKNOLOJİ Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 5. DERS STERİLİZASYON; BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİNDE KULLANILAN STERİLİZASYON YÖNTEMLERİ VE BU STERİLİZASYON

Detaylı

1.1- AMAÇ Sağlık hizmetleri ile ilişkili enfeksiyonların önlenmesine yönelik uyulması gereken temizlik kurallarını belirlemektir.

1.1- AMAÇ Sağlık hizmetleri ile ilişkili enfeksiyonların önlenmesine yönelik uyulması gereken temizlik kurallarını belirlemektir. 1- GENEL BİLGİLER 1.1- AMAÇ Sağlık hizmetleri ile ilişkili enfeksiyonların önlenmesine yönelik uyulması gereken temizlik kurallarını belirlemektir. 1.2- KAPSAM Bu plan Kahramanmaraş Ağız ve Diş Sağlığı

Detaylı

Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir.

Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir. METABOLİZMA ve ENZİMLER METABOLİZMA Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir. A. ÖZÜMLEME (ANABOLİZMA) Metabolizmanın yapım reaksiyonlarıdır. Bu tür olaylara

Detaylı

YGS YE HAZIRLIK DENEMESi #7

YGS YE HAZIRLIK DENEMESi #7 YGS YE HAZIRLIK DENEMESi #7 1) 48 saat karanlıkta bekletilen bir saksı bitkisinden bu sürenin sonunda bir yaprak kopartılmış (1. yaprak) ve bitki aydınlık ortamda 12 saat bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda

Detaylı

Agaroz jel elektroforezi

Agaroz jel elektroforezi MOLEKÜLER TEKNİKLER Dr. Naşit İĞCİ Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü 4. Sınıf (2017-2018 Bahar) 2. NOT Agaroz jel elektroforezi PAGE daha çok proteinlerin ve küçük

Detaylı

KATI ATIK ÖRNEKLERİNDE TOPLAM FOSFOR ANALİZ YÖNTEMİ

KATI ATIK ÖRNEKLERİNDE TOPLAM FOSFOR ANALİZ YÖNTEMİ S a y f a 1 KATI ATIK ÖRNEKLERİNDE TOPLAM FOSFOR ANALİZ YÖNTEMİ YÖNTEM YÖNTEMİN ESASI VE PRENSİPLERİ Metot uygulanırken, örnekte bulunan tüm fosforlar, perklorik asitle parçalama işleminden geçirilerek

Detaylı

STERİLİZASYON Sterilizasyon: Bir üründeki tüm yaşayan mikroorganizmaların ve sporları ile virüslerin öldürülmesi veya uzaklaşerılmasıdır.

STERİLİZASYON Sterilizasyon: Bir üründeki tüm yaşayan mikroorganizmaların ve sporları ile virüslerin öldürülmesi veya uzaklaşerılmasıdır. STERİLİZASYON 1 STERİLİZASYON Sterilizasyon: Bir üründeki tüm yaşayan mikroorganizmaların ve sporları ile virüslerin öldürülmesi veya uzaklaşerılmasıdır. Hücre kültüründe; kullanılan besi yeri, malzeme,

Detaylı

KALITIM #12 MODERN GENETİK UYGULAMALARI (BİYOTEKNOLOJİ) SELİN HOCA

KALITIM #12 MODERN GENETİK UYGULAMALARI (BİYOTEKNOLOJİ) SELİN HOCA KALITIM #12 MODERN GENETİK UYGULAMALARI (BİYOTEKNOLOJİ) SELİN HOCA BİYOTEKNOLOJİ Canlılara temel bilimlerin ve mühendislik ilkelerinin uygulanmasıdır. Gen mühendisliği, genetik madde lan DNA üzerinde yapılan

Detaylı

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II. ( WESTERN BLOTTING (WESTERN EMDİRİMİ) ve İMMÜNODETEKSİYON

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II. ( WESTERN BLOTTING (WESTERN EMDİRİMİ) ve İMMÜNODETEKSİYON MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II ( WESTERN BLOTTING (WESTERN EMDİRİMİ) ve İMMÜNODETEKSİYON Western blotting: Akrilamit jeldeki protein bantlarının daha kararlı ve sabit bir ortama (örneğin,

Detaylı

Western Blot (veya immünblot), protein ekspresyonunu doğrulamak için standart laboratuvar

Western Blot (veya immünblot), protein ekspresyonunu doğrulamak için standart laboratuvar İçerik Giriş...2 Western Blot Yöntemi...2 Protein Örneklerinin Hazırlanması...2 Dikey Jel Sistemi Kullanımı...3 Kuru Transfer Sistem Kullanımı...4 Bloklama...6 Protein Tespiti...6 Kemilüminesans Tanımlama

Detaylı

Canlının yapısında bulunan organik molekül grupları; o Karbonhidratlar o Yağlar o Proteinler o Enzimler o Vitaminler o Nükleik asitler ve o ATP

Canlının yapısında bulunan organik molekül grupları; o Karbonhidratlar o Yağlar o Proteinler o Enzimler o Vitaminler o Nükleik asitler ve o ATP Tamamı karbon ( C ) elementi taşıyan moleküllerden oluşan bir gruptur. Doğal organik bileşikler canlı vücudunda sentezlenir. Ancak günümüzde birçok organik bileşik ( vitamin, hormon, antibiyotik vb. )

Detaylı

KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR?

KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR? KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR? Prof. Dr. METİN ATAMER Dr. EBRU ŞENEL ANKARA ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ SÜT TEKNOLOJİSİ BÖLÜMÜ Kaliteli süt üretimi için sağlanması gereken koşullar; Sağlıklı inek Özenli

Detaylı

Prof Dr Davut Albayrak Ondokuz mayıs üniversitesi Tıp Fakültesi Kan merkezi Ve çocuk hematoloji BD -Samsun

Prof Dr Davut Albayrak Ondokuz mayıs üniversitesi Tıp Fakültesi Kan merkezi Ve çocuk hematoloji BD -Samsun Prof Dr Davut Albayrak Ondokuz mayıs üniversitesi Tıp Fakültesi Kan merkezi Ve çocuk hematoloji BD -Samsun İNDİREKT COOMBS TESTİ ANTİKOR ARANAN PLAZMA + %5 LİK YIKANMIŞ KIRMIZI KAN HÜCRESİ EKLE FAB UÇLARI

Detaylı

MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI güz dönemi 2. HAFTA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI güz dönemi 2. HAFTA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI 2014-2015 güz dönemi 2. HAFTA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN CİHAZLAR ÇEKER OCAK STERİL KABİN HASSAS TERAZİ

Detaylı

Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuarları ve Üniteleri

Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuarları ve Üniteleri Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuarları ve Üniteleri Biyoloji Bölümünde Merkezi Araştırma Laboratuarlarının Kurulumu Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü

Detaylı

BİYOTEKNOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER. Araş. Gör. Dr. Öğünç MERAL

BİYOTEKNOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER. Araş. Gör. Dr. Öğünç MERAL BİYOTEKNOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER Araş. Gör. Dr. Öğünç MERAL Kromatografi, katı veya sıvı bir durağan fazın yüzeyine veya içine uygulanmış bir karışımdaki moleküllerin, sıvı veya gaz halindeki bir hareketli

Detaylı

BRCA 1/2 DNA Analiz Paneli

BRCA 1/2 DNA Analiz Paneli FAST-BRCA Sequencing Kit BRCA 1/2 DNA Analiz Paneli Dizi Analizi Amaçlı Kullanım İçin KULLANIM KILAVUZU İÇİNDEKİLER 1 GİRİŞ... 3 2 KİT İÇERİĞİ... 3 3 SAKLAMA... 3 4 GEREKLİ MATERYAL VE CİHAZLAR... 3 5

Detaylı

ANTİJENLER VE YAPILARI

ANTİJENLER VE YAPILARI ANTİJENLER VE YAPILARI IMMUNOJEN VE ANTIJEN nedir? Immun cevap oluşturan yabancı maddeler antijen veya immunojen olabilir. Immunojen; İmmun yanıt meydana getirme kabiliyetindeki herhangi bir madde Antijen

Detaylı

FİZYOLOJİ LABORATUVAR BİLGİSİ VEYSEL TAHİROĞLU

FİZYOLOJİ LABORATUVAR BİLGİSİ VEYSEL TAHİROĞLU FİZYOLOJİ LABORATUVAR BİLGİSİ VEYSEL TAHİROĞLU Fizyolojiye Giriş Temel Kavramlar Fizyolojiye Giriş Canlıda meydana gelen fiziksel ve kimyasal değişikliklerin tümüne birden yaşam denir. İşte canlı organizmadaki

Detaylı

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03. Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.2014) 1 5. Haftanın Ders İçeriği DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonunun amacı

Detaylı

DETERJAN VE DEZENFEKTANLAR. Fırat ÖZEL, Gıda Mühendisi 2006

DETERJAN VE DEZENFEKTANLAR. Fırat ÖZEL, Gıda Mühendisi 2006 DETERJAN VE DEZENFEKTANLAR Fırat ÖZEL, Gıda Mühendisi 2006 ÖNEMLİ! Gıdaları insanların sağlıklarını çok ciddi şekilde etkiler. Bu nedenle, gıda üreten kişilerin temizlik kurallarına uyması çok önemlidir.

Detaylı

Lizis tamponu (50mL) : NaC 0,15M, EDTA 5mM, Tris-HCL 50mM, Np40 %1, Proteaz inhibitör kokteyli-1 tablet (Roche 50mL için ETDA free)

Lizis tamponu (50mL) : NaC 0,15M, EDTA 5mM, Tris-HCL 50mM, Np40 %1, Proteaz inhibitör kokteyli-1 tablet (Roche 50mL için ETDA free) 4. UYGULAMALI PROTEİN ELDESİ YÖNTEMLERİ A. BİLGİ Organlarda, dokularda ve hücre içerisinde bulunan proteinlerin analiz edilebilmesi için önce hücrenin dışına, bir sıvı içerisinde çıkarılmalıdırlar. Bu

Detaylı

Protein Ekstraksiyonu

Protein Ekstraksiyonu Protein Ekstraksiyonu Dr.Gaye Güler Tezel Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemli makromoleküllerden biridir. Bazıları yapısal komponentleri

Detaylı

Final Sınavı Soruları

Final Sınavı Soruları Final Sınavı Soruları Soru1: PCR döngüsünü kısaca anlatılınız. Cevap1: İlk adımda solüsyonun sıcaklığı artırılarak DNA zincirinin denatüre olması sağlanır. Bu sırada Bundan sonra primerlerin tekli DNA

Detaylı

ENTEGRE YÖNETİM SİSTEMİ TALİMATLAR

ENTEGRE YÖNETİM SİSTEMİ TALİMATLAR 26.11.2011 01 10.04.2012 1 / 5 KYS.19 TA 01 1-AMAÇ Eker Süt Ürünlerinde, ham madde olarak kabulü yapılan çiğ sütün ve süttozunun antibiyotik içerip içermediğini kontrol etmek. 2-KAPSAM VE GEÇERLİLİK Bu

Detaylı

CANLILARIN YAPISINDA BULUNAN TEMEL BİLEŞENLER

CANLILARIN YAPISINDA BULUNAN TEMEL BİLEŞENLER CANLILARIN YAPISINDA BULUNAN TEMEL BİLEŞENLER Canlıların yapısında bulunan moleküller yapısına göre 2 ye ayrılır: I. İnorganik Bileşikler: Bir canlı vücudunda sentezlenemeyen, dışardan hazır olarak aldığı

Detaylı

ORGANİZMALARDA BAĞIŞIKLIK MEKANİZMALARI

ORGANİZMALARDA BAĞIŞIKLIK MEKANİZMALARI ORGANİZMALARDA BAĞIŞIKLIK MEKANİZMALARI Organizmalarda daha öncede belirtildiği gibi hücresel ve humoral bağışıklık bağışıklık reaksiyonları vardır. Bunlara ilave olarak immünoljik tolerans adı verilen

Detaylı

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ Çevre Mühendisliği Bölümü Fiziksel ve Kimyasal Temel İşlemler Laboratuvarı Dersi Güncelleme: Eylül 2016

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ Çevre Mühendisliği Bölümü Fiziksel ve Kimyasal Temel İşlemler Laboratuvarı Dersi Güncelleme: Eylül 2016 İYON DEĞİŞİMİ DENEYİN AMACI: Sert bir suyun katyon değiştirici reçine kullanılarak yumuşatılması ve reçinenin iyon değiştirme kapasitesinin incelenmesi TEORİK BİLGİLER İyon değiştirme benzer elektrik yüklü

Detaylı

WESTERN BLOT. Yrd. Doç. Dr. Eda Becer. Yakın Doğu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı

WESTERN BLOT. Yrd. Doç. Dr. Eda Becer. Yakın Doğu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı WESTERN BLOT Yrd. Doç. Dr. Eda Becer Yakın Doğu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Northern Blot (RNA) James Alwine George Stark Western Blot (Protein) Eastern Blot (??) George Stark

Detaylı

Konu: Mitoz Bölünme ve Eşeysiz Üreme

Konu: Mitoz Bölünme ve Eşeysiz Üreme Konu: Mitoz Bölünme ve Eşeysiz Üreme Hücre bölünmesi tüm canlılarda görülen ortak bir özelliktir. Hücre büyüyüp gelişirken madde ve enerji gereksinimleri artar. Sitoplâzma hücre zarına oranla daha hızlı

Detaylı

HPLC ile Elma Suyunda HMF Analizi

HPLC ile Elma Suyunda HMF Analizi UYGULAMA NOTU Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi L019 HPLC ile Elma Suyunda HMF Analizi HAZIRLAYANLAR Kim. Akın Osanmaz ve Uzm. Kim. Ozan Halisçelik Ant Teknik Cihazlar Ltd. Şti. KONU: Elma suyu numunelerinde,

Detaylı

Soru 1: DNA miktarını saptamak için spektrofotometrik yöntemin arkasındaki prensibi açıklayınız:

Soru 1: DNA miktarını saptamak için spektrofotometrik yöntemin arkasındaki prensibi açıklayınız: Ara Sınav Soruları Soru 1: DNA miktarını saptamak için spektrofotometrik yöntemin arkasındaki prensibi açıklayınız: Cevap1: 260 nm de 1 cm yol uzunluğundaki OD = 50 μ g/ml çift sarmal DNA için, 40 μ g/ml

Detaylı

Biyolistik - Gen Silahı. İlker Gönülalp Yıldız Teknik Üniversitesi Biyoloji Bölümü

Biyolistik - Gen Silahı. İlker Gönülalp Yıldız Teknik Üniversitesi Biyoloji Bölümü Biyolistik - Gen Silahı İlker Gönülalp Yıldız Teknik Üniversitesi Biyoloji Bölümü Biyolistik Biyolistik, biyolojik ve balistik kelimelerinin kısaltmalarının birleştirilmesi şeklinde adlandırılan, hücrelerin

Detaylı

ÜRÜN KULLANIM KILAVUZU

ÜRÜN KULLANIM KILAVUZU ÜRÜN KULLANIM KILAVUZU 1.0 Ürün bilgileri 1.1 Ürün adı : Alkali Fosfataz Lökosit Boyama Seti 1.2 Ürün Kodu : 5057-100 1.3 Ürün Marka adı : GBL 1.4 Ürün Tanımı: Kan, kemik iliği veya doku numunelerinde

Detaylı

KAPİLLER ELEKTROFOREZ DNA SEKANSLAMA

KAPİLLER ELEKTROFOREZ DNA SEKANSLAMA İçerik Giriş...2 Deney İçin Gerekli Olan Malzemeler...3 Deneyin Yapılışı... 4-9 Genomik DNA Kalıbının Hazırlanması...4 PCR Amplifikasyonu... 4-5 DNA Miktarının Belirlenmesi...6 Sekans Reaksiyonunun Hazırlanması...7

Detaylı

ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJEN TAYİNİ

ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJEN TAYİNİ ÇEVRE KİMYASI LABORATUVARI ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJEN TAYİNİ 1. GENEL BİLGİLER Doğal sular ve atıksulardaki çözünmüş oksijen (ÇO) seviyeleri su ortamındaki fiziksel, kimyasal ve biyokimyasal aktivitelere bağımlıdır.

Detaylı

Erciyes Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Analizleri ve Teknolojisi Laboratuvar Föyü Sayfa 1

Erciyes Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda Analizleri ve Teknolojisi Laboratuvar Föyü Sayfa 1 LABORATUVAR KURALLARI VE ÇÖZELTİ HAZIRLAMA LABORATUVAR KURALLARI 1. Laboratuvar çalışmaları sırasında elbiselerin özellikle yakıcı ve tehlikeli maddelerden korunması için laboratuara önlükle gelinmelidir.

Detaylı

NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ

NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ T.C. FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ Yüksek Lisans Semineri Hazırlayan: Venhar ÇELİK Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK NÜKLEİK ASİTLERİN

Detaylı

ARB BOYAMA NASIL YAPILIR

ARB BOYAMA NASIL YAPILIR ARB BOYAMA NASIL YAPILIR EZN (ARB) BOYAMA = Ehrlich Ziehl Neelsen = ASİDE DİRENÇLİ BOYAMA Tüberküloz bakterileri gibi dış yüzeyidne mikolik asit içeren bakteriler gram boyama ile boyanamazlar bu bakteriler

Detaylı

HAYVANSAL HÜCRELER VE İŞLEVLERİ. YRD. DOÇ. DR. ASLI SADE MEMİŞOĞLU RESİM İŞ ZEMİN KAT ODA: 111

HAYVANSAL HÜCRELER VE İŞLEVLERİ. YRD. DOÇ. DR. ASLI SADE MEMİŞOĞLU RESİM İŞ ZEMİN KAT ODA: 111 HAYVANSAL HÜCRELER VE İŞLEVLERİ YRD. DOÇ. DR. ASLI SADE MEMİŞOĞLU RESİM İŞ ZEMİN KAT ODA: 111 asli.memisoglu@deu.edu.tr KONULAR HAYVAN HÜCRESİ HAYVAN, BİTKİ, MANTAR, BAKTERİ HÜCRE FARKLARI HÜCRE ORGANELLERİ

Detaylı

Protokolü PD S001 01. 50 Reaksiyon

Protokolü PD S001 01. 50 Reaksiyon Salmonella sp. Real time PCR Tespit Kiti Protokolü PD S001 01 50 Reaksiyon REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen

Detaylı

İMMÜN YANITIN EFEKTÖR GRUPLARI VE YANITIN DÜZENLENMESİ. Güher Saruhan- Direskeneli İTF Fizyoloji AD

İMMÜN YANITIN EFEKTÖR GRUPLARI VE YANITIN DÜZENLENMESİ. Güher Saruhan- Direskeneli İTF Fizyoloji AD İMMÜN YANITIN EFEKTÖR GRUPLARI VE YANITIN DÜZENLENMESİ Güher Saruhan- Direskeneli İTF Fizyoloji AD HÜCRE İÇİ MİKROBA YANIT Veziküle alınmış mikroplu fagosit Sitoplazmasında mikroplu hücre CD4 + efektör

Detaylı

Brusellozda laboratuvar tanı yöntemleri 14.02.2006 1

Brusellozda laboratuvar tanı yöntemleri 14.02.2006 1 Brusellozda laboratuvar tanı yöntemleri 14.02.2006 1 Spesifik tanı yöntemleri: 1. Direk (kült ltür r ve bakterinin gösterilmesi) g 2. Antikorların n gösterilmesig 1.Standart tüp aglütinasyonu 2.Rose Bengal

Detaylı

SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER

SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER Doç. Dr. Gülsen YILMAZ 2009 BAŞLIKLAR 1 Tanım ve Prensip 22 Santrifüj teknikleri 33 Santrifüj tipleri 44 Santrifüj kullanım alanları Laboratuvarı ilgilendiren Süreç

Detaylı

ANTİGLOBULİN TESTLER. Dr. Güçhan ALANOĞLU

ANTİGLOBULİN TESTLER. Dr. Güçhan ALANOĞLU ANTİGLOBULİN TESTLER Dr. Güçhan ALANOĞLU Tanımlar İnsan nsan globulinlerine karşı oluşan antikorlara Anti-Human Globulinler (AHG, AHG, antikorlara karşı gelişen en anti-antikor) antikor) Bu u antikorların

Detaylı

SDS-PAGE Jel Elektroforezi İÇERİK

SDS-PAGE Jel Elektroforezi İÇERİK İÇERİK Tanım...2 SDS-PAGE jel elektroforez metodu...3 SDS-PAGE jel elektroforezi yürütme ortamının hazırlanması...4 Protein örneklerinin yüklenmesi...8 Jelin yürütülmesi...9 Jelin boyanması ve boyanın

Detaylı

SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ

SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ T.C. FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ Yüksek Lisans Semineri Hazırlayan: Abdullah ASLAN Danışman:

Detaylı

Bu metotta, toprak bir miktar su ile karıştırılarak süspansiyon hâline getirilir.

Bu metotta, toprak bir miktar su ile karıştırılarak süspansiyon hâline getirilir. Bouyoucos Hidrometre Yöntemi Bu metotta, toprak bir miktar su ile karıştırılarak süspansiyon hâline getirilir. Süspansiyonun hazırlanmasından sonra topraktaki her bir fraksiyon için belirli bir süre beklendikten

Detaylı

RTA Dokudan ve Parafine-Gömülü Dokudan Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Dokudan ve Parafine-Gömülü Dokudan Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Dokudan ve Parafine-Gömülü Dokudan Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-05 IVD İnsan dokusu ve parafine gömülü doku örneklerinden in vitro tanı amaçlı genomik nükleik asit

Detaylı

REAKSİYON PRENSİPLERİ

REAKSİYON PRENSİPLERİ REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen izole edilen DNA örneği Polimerase Chain Reaction (PCR): Son yıllarda

Detaylı

RTA Viral DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2010-05

RTA Viral DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2010-05 RTA Viral DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2010-05 IVD In vitro tanı amaçlı insan plazma ve serum örneklerinden viral nükleik asit izolasyon ve saflaştırılması için In vitro tanı amaçlı

Detaylı

Doç.Dr. Yıldız AKA KAÇAR

Doç.Dr. Yıldız AKA KAÇAR Doç.Dr. Yıldız AKA KAÇAR Selülozik yapıdaki hücre çeperleri, mekanik ya da enzimatik yollarla çıkarılmış olan hücrelere protoplast denilmektedir. Protoplast kültürü ise, izole edilen Protoplast kültürü

Detaylı

*Biyoteknoloji: Canlılar ve Canlıların ürünleri üzerinde, bilimsel teknikler uygulayarak yapılan çalışmalara; biyoteknoloji denir.

*Biyoteknoloji: Canlılar ve Canlıların ürünleri üzerinde, bilimsel teknikler uygulayarak yapılan çalışmalara; biyoteknoloji denir. BİYOTEKNOLOJİ *Biyoteknoloji: Canlılar ve Canlıların ürünleri üzerinde, bilimsel teknikler uygulayarak yapılan çalışmalara; biyoteknoloji denir. Biyoteknolojik çalışmalarda, en çok bakteriler kullanılır.

Detaylı

WEİL-FELİX TESTİ NEDİR NASIL YAPILIR? Weil Felix testi Riketsiyozların tanısında kullanılır.

WEİL-FELİX TESTİ NEDİR NASIL YAPILIR? Weil Felix testi Riketsiyozların tanısında kullanılır. WEİL FELİX TESTİ WEİL-FELİX TESTİ NEDİR NASIL YAPILIR? Weil Felix testi Riketsiyozların tanısında kullanılır. Riketsiyöz tanısında çapraz reaksiyondan faydalanılır bu nedenle riketsiyaların çapraz reaksiyon

Detaylı

DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ

DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ 3//03 00:00:00 Döner Sermaye İşletmesi Teklif No 039378 İLAN HASTANEMİZİN İHTİYACI OLAN AŞAĞIDA YAZILI MALZEME(LER) SATIN ALINACAKTIR. İLGİLENEN FİRMALARIN 5//03 TARİHİ, SAAT :00 'E/A KADAR TEKLİFLERİNİ

Detaylı

MÜŞTERİ BİLGİLENDİRME REHBERİ

MÜŞTERİ BİLGİLENDİRME REHBERİ MÜŞTERİ BİLGİLENDİRME REHBERİ ÇEVRE ANALİZ LABORATUVARI İZMİR P.02-FR.04/rev00/31.07.2017 Sayfa 1 / 7 NUMUNE KABUL KRİTERLERİ 1. Kabul Saatleri 08:00 12:00 ile 13:00-16:00 arasındadır. Cumartesi ve Pazar

Detaylı

HASTANE TEMİZLİĞİNDE RİSK SINIFLAMASI

HASTANE TEMİZLİĞİNDE RİSK SINIFLAMASI SAYFA NO 1/9 HASTANE TEMİZLİĞİNDE RİSK SINIFLAMASI YÜKSEK RİSKLİ ALANLAR ORTA RİSKLİ ALANLAR DÜŞÜK RİSKLİ ALANLAR 1. AMELİYATHANELER 1. ACİL SERVİS 1. İDARİ BİRİMLER (ayniyat, satın alma,muhasebe, maaş

Detaylı

GIDALARDAKİ M.O LARIN KONTROLÜNDE 4 TEMEL İLKE UYGULANIR

GIDALARDAKİ M.O LARIN KONTROLÜNDE 4 TEMEL İLKE UYGULANIR GIDALARDAKİ M.O LARIN KONTROLÜNDE 4 TEMEL İLKE UYGULANIR 1. Kontaminasyonun önlenmesi 2. Mikroorganizmaların uzaklaştırılması a) Yıkama b) Kesme ve ayıklama c) Santrifüje etme d) Filtrasyon 3. Mikrobiyal

Detaylı

ADIM ADIM YGS LYS. 93. Adım KALITIM -19 MODERN GENETİK UYGULAMALAR

ADIM ADIM YGS LYS. 93. Adım KALITIM -19 MODERN GENETİK UYGULAMALAR ADIM ADIM YGS LYS 93. Adım KALITIM -19 MODERN GENETİK UYGULAMALAR GEN KLONLAMA Seçilmiş bir genin plazmit ya da bir virüs içerisine yerleştirilerek bir bakteriye aktarılması ve bakteri aracılığı ile birçok

Detaylı

YGS ANAHTAR SORULAR #2

YGS ANAHTAR SORULAR #2 YGS ANAHTAR SORULAR #2 1) Bir hayvan hücresinde laktoz yapımı ile ilgili olarak, sitoplazmadaki madde miktarının değişimlerini gösteren grafik aşağıdakilerden hangisi olamaz? A) Glikoz B) Su miktarı 2)

Detaylı

YÜKSEK RİSKLİ ALANLAR ORTA RİSKLİ ALANLAR DÜŞÜK RİSKLİ ALANLAR

YÜKSEK RİSKLİ ALANLAR ORTA RİSKLİ ALANLAR DÜŞÜK RİSKLİ ALANLAR T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI ÖZEL KARAMAN MÜMİNE HATUN HASTANESİ HASTANE TEMİZLİK PLANI DÖK.KODU: YÖN.PLN.024 YAYIN TARİHİ: 11,11,2011 REVİZE NO:67 REVİZE TARİHİ: 02/06/2014 SAYFA:1/1 1-RİSKLER YÜKSEK RİSKLİ

Detaylı

ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ ORGANİK KİMYA LABORATUVARI DENEY 5: YENİDEN KRİSTALLENDİRME DENEYİ

ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ ORGANİK KİMYA LABORATUVARI DENEY 5: YENİDEN KRİSTALLENDİRME DENEYİ ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ ORGANİK KİMYA LABORATUVARI DENEY 5: YENİDEN KRİSTALLENDİRME DENEYİ TEORİ : Organik deneyler sonucunda genellikle elde edilen ürün,

Detaylı

Canlıların yapısına en fazla oranda katılan organik molekül çeşididir. Deri, saç, tırnak, boynuz gibi oluşumların temel maddesi proteinlerdir.

Canlıların yapısına en fazla oranda katılan organik molekül çeşididir. Deri, saç, tırnak, boynuz gibi oluşumların temel maddesi proteinlerdir. Canlıların yapısına en fazla oranda katılan organik molekül çeşididir. Deri, saç, tırnak, boynuz gibi oluşumların temel maddesi proteinlerdir. Proteinlerin yapısında; Karbon ( C ) Hidrojen ( H ) Oksijen

Detaylı

Laboratuar Tasarımı. Genel Gereksinimler. Yrd. Doç. Dr. Emrah TORLAK

Laboratuar Tasarımı. Genel Gereksinimler. Yrd. Doç. Dr. Emrah TORLAK Laboratuar Tasarımı Genel Gereksinimler Yrd. Doç. Dr. Emrah TORLAK 1. Genel Tehlikeli materyallerin kullanımı ve muhafazasının oluşturduğu riskler nedeni ile laboratuarlar ve laboratuar dışı aktivitelerin

Detaylı

ORTOPEDİK PROTEZ ENFEKSİYONLARINDA SONİKASYON DENEYİMİ

ORTOPEDİK PROTEZ ENFEKSİYONLARINDA SONİKASYON DENEYİMİ ORTOPEDİK PROTEZ ENFEKSİYONLARINDA SONİKASYON DENEYİMİ Dr. Şua Sümer Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Enf. Hast. ve Klin. Mikr. AD 17 Mayıs 2016 Prostetik eklem ameliyatları yaşlı popülasyonun artışına

Detaylı

HAYVAN BESLEMEDE ENKAPSÜLASYON TEKNOLOJİSİ VE ÖZELLİKLERİ. Prof.Dr. Seher KÜÇÜKERSAN

HAYVAN BESLEMEDE ENKAPSÜLASYON TEKNOLOJİSİ VE ÖZELLİKLERİ. Prof.Dr. Seher KÜÇÜKERSAN HAYVAN BESLEMEDE ENKAPSÜLASYON TEKNOLOJİSİ VE ÖZELLİKLERİ Prof.Dr. Seher KÜÇÜKERSAN Enkapsülasyon katı, sıvı ve gaz malzemelerin kaplanarak kapsüller içinde tutulması ile çok küçük bir maddeyi veya tüm

Detaylı

B unl a r ı B i l i yor mus unuz? MİTOZ. Canlının en küçük yapı biriminin hücre olduğunu 6. sınıfta öğrenmiştik. Hücreler; hücre zarı,

B unl a r ı B i l i yor mus unuz? MİTOZ. Canlının en küçük yapı biriminin hücre olduğunu 6. sınıfta öğrenmiştik. Hücreler; hücre zarı, MİTOZ Canlının en küçük yapı biriminin hücre olduğunu 6. sınıfta öğrenmiştik. Hücreler; hücre zarı, sitoplazma ve çekirdekten meydana gelmiştir. Hücreler büyüme ve gelişme sonucunda belli bir olgunluğa

Detaylı

İLK ANYONLAR , PO 4. Cl -, SO 4 , CO 3 , NO 3

İLK ANYONLAR , PO 4. Cl -, SO 4 , CO 3 , NO 3 İLK ANYONLAR Cl -, SO -, CO -, PO -, NO - İLK ANYONLAR Anyonlar negatif yüklü iyonlardır. Kalitatif analitik kimya analizlerine ilk anyonlar olarak adlandırılan Cl -, SO -, CO -, PO -, NO - analizi ile

Detaylı

BİYOLOJİ DERS NOTLARI YGS-LGS YÖNETİCİ MOLEKÜLLER

BİYOLOJİ DERS NOTLARI YGS-LGS YÖNETİCİ MOLEKÜLLER www.benimdershanem.esy.es Bilgi paylaştıkça çoğalır. BİYOLOJİ DERS NOTLARI YGS-LGS YÖNETİCİ MOLEKÜLLER NÜKLEİK ASİTLER Nükleik asitler, bütün canlı hücrelerde ve virüslerde bulunan, nükleotid birimlerden

Detaylı