ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ÇORUM İLİ CİVARINDA YAYILIŞ GÖSTEREN KEMİRİCİLERDE (ORDO: RODENTIA) KENE ENFESTASYONUNUN VE KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ (KKKA) TAŞIYICILIĞININ ARAŞTIRILMASI Ceren TİLGEN BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2010 Her Hakkı Saklıdır

2 TEZ ONAYI Ceren TİLGEN tarafından hazırlanan Çorum İli Civarında Yayılış Gösteren Kemiricilerde (Ordo: Rodentia) Kene Enfestasyonunun ve Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) Taşıyıcılığının Araştırılması adlı tez çalışması 26/10/2010 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Nuri YİĞİT Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Jüri Üyeleri: Başkan: Prof. Dr. Nuri YİĞİT Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Üye : Doç. Dr. Nursel GÜL Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Üye : Doç. Dr. Selami CANDAN Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Orhan ATAKOL Enstitü Müdürü

3 1. GİRİŞ Keneler, kutup bölgeleri hariç dünyanın her yerinde, özellikle de tropik ve subtropik bölgelerinde yaygın olarak yaşayan eklembacaklılardır. Yaşamak için kan emerek beslenmek zorundadırlar. Kan emmek için konak seçimi yapmazlar. Memeli, sürüngen, kanatlı hayvanlar veya insanlardan kan emebilirler. Bu nedenle dış parazit olarak önemlidirler. Türkiye nin subtropik iklim kuşağında yer alıyor olması, coğrafik yapısı gibi özellikler nedeni ile birçok kene türünün üreme ve gelişmesi için çok uygun bir ortam oluşturmaktadır. Keneler tarafından taşınan zoonotik etkenler arasında bakteriyel (tularemi, lyme hastalığı), riketsiyal (benekli humma, Q humması, ehrlichiosis), parazitik (babesiosis) ve viral (tick borne encephalitis, kanamalı ateşler) infeksiyon etkenleri vardır (Despommier 2000, Jongejan ve Uilenberg 2004, Gratz 2006). Tüm bunlar, kenelerin hayvan sağlığı açısından önemli bir tehdit oldukları kadar insan sağlığı açısından da çok önemli olan parazitler arasında yer almasına yol açmaktadır (Despommier vd. 2000, Jongejan ve Uilenberg 2004, Karaer 2007). Keneler tarafından bulaşan diğer bir viral hastalık olan Kırım Kongo Kanamalı Ateşi ülkemizi 2002 yılından itibaren tehdit altına almış ve insan sağlığını etkilemeye başlamıştır. Hastalık ilk kez II. Dünya Savaşı yıllarında, 1944 ve 1945 yılı yaz aylarında, ürün toplamaya yardım eden Sovyet askerleri arasında görülmüş ve 200 den fazla kişiyi etkilemiştir. O zamanlar hastalığa Kırım Kanamalı Ateşi adı verilmiştir. Aynı virüs, 1956 yılında Zaire de ateşli bir hastadan izole edilerek, farklı bir etmen olduğu düşünülmüş ve Kongo Hastalığı olarak tanımlanmıştır. Ancak 1969 yılında Kongo ve Kırım Kanamalı Ateşi virüslerinin aynı olduğu anlaşılarak, hastalığa Kırım Kongo Kanamalı Ateşi ismi verilmiştir (Simpson 1978, Hoogstraal 1979, Capua 1998, Tavana vd. 2002). Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) Bunyaviridae ailesinden Nairovirus türü içinde tanımlanan virüsün etken olduğu, %3-30 mortalite ile seyreden önemli bir hastalıktır (Watts vd. 1988, Ergonul vd. 2004). Bunyavirus lar, zarflı ve negatif polaritesi olan tek iplikçikli RNA parçacığından oluşmaktadırlar (Elliott vd. 1991). KKKAV, Hyalomma cinsindeki kenelerle, özellikle de Hyalomma marginatum marginatum tarafından 1

4 taşınmaktadır (Hoogstraal 1979). KKKAV, Hyalomma anatolicum anatolicum ve Rhipicephalus, Ornithodoros, Boophilus, Dermacentor ve Ixodes spp. gibi kene türlerinde de saptanmıştır (Ergonul ve Whitehouse 2007). KKKAV nün taşınmasında en etkili olan Hyalomma cinsi kenelerin yaşam evreleri 2 konakta geçer. Bu cins keneler larva ve nimf dönemini bir konakta geçirir, nimfler kan emip doyduktan sonra konak hayvanı terk ederler. Dış ortamda gömlek değiştirip aç olgun hale gelirler. Aç olgun keneler ikinci bir hayvandan kan emer, çiftleşir ve doyar. Doyan dişiler toprakta, gizlendikleri yerde yaklaşık 1 aylık sürede 5-7 bin arası yumurta yumurtlarlar. H.m.marginatumun un larva ve nimf dönemleri çoğunlukla yerden beslenen kanatlılar olan keklik, sığırcık, sülünde, tavşan, kirpi ve fare gibi yabani hayvanlarda az olarak da büyük memelilerde ve insanda geçmektedir. Ergin dönemleri ise, uygun konak olarak yaban domuzu, at, sığır, koyun, keçi gibi evcil büyük memeliler ve de insanda geçer (Karaer 2007). Ülkemizdeki ilk olgulara 2002 yılında Karadeniz Bölgesi nin iç kısımlarında, İç ve Doğu Anadolu Bölgeleri nin kuzey kesimlerinde rastlanmıştır (Ergonul vd. 2004, Ergönül 2006, Özkurt vd. 2006). Türkiye de ilk kez, 2002 yılı nisan ayında, Tokat ta ortaya çıkmasından sonra hastalık bundan sonraki iki yıl içinde Erzurum, Erzincan, Sivas, Yozgat, Amasya, Çorum, Çankırı, Karabük, Samsun, Ordu, Giresun, Trabzon, Artvin, Gümüşhane ye kadar yayılmıştır (Karti vd. 2004). Virüsün vücuda alınmasından 7 gün sonra ELISA ve IFA testleriyle IgM ve IgG antikorları saptanabilmektedir (Shepherd vd. 1989). Spesifik IgM düzeyi enfeksiyondan 4 ay sonra saptanamayacak kadar azalır, ama IgG düzeyleri 5 yıl boyunca saptanabilir (Ergonul ve Whitehouse 2007). Moleküler yöntemlerden Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (Reverse transcription polymerase chain reaction = RT-PCR) yöntemi KKKAV enfeksiyonunun hızlı tanısında tercih edilmesi gereken yöntemdir. Yöntem son derece özgün, duyarlı ve hızlıdır (Drosten vd. 2003). 2

5 Kemiricilerde Kırım Kongo Kanamalı Ateşi etkeninin araştırılmasına dair yeterli bir çalışma bulunmamakla beraber kemiricilerdeki kene türlerinin saptanması adına 1976 ve 1977 yılları arasında Siirt, Diyarbakır ve Urfa illerinde bir çalışma yapılmıştır (Sert vd. 2001). Bu çalışmada Çorum ve çevresinden kemirici ve kene örnekleri alınarak kemiricilerde bulunan kenelerin tür tayini yapılmıştır ve kemiricilerden alınan kanlarda Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü etkeninin varlığı araştırılmıştır. 3

6 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Kenelerin Sınıflandırılması Hoogstraal ve Kim (1985) e göre kenelerin sınıflandırılması aşağıdaki gibidir; Phylum Subphylum Classis Ordo Subordo : Arthropoda : Chelicerata : Arachnida : Acarina : Ixodida Superfamilya : Ixodidoidea Familya : Argasidae (Yumuşak keneler) Ixodidae (Sert keneler) Nutalliellidae Daha sonraları familyalar Ixodidae, Argasidae, Nuttallelidae ve Laelaptidae olmak üzere dört gruba ayrılmıştır. Ixodidae ve Argasidae familyalarında yaklaşık olarak 878 tür bulunmaktadır (Çizelge 2.1). Nutalliellidae ve Laelaptidae familyaları en az öneme sahiplerdir ve her birinin bir türü vardır. Bunlardan Ixodidae familyası yaklaşık olarak 650 tür sayısına sahip olmasıyla ve Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı etkenini taşımasıyla önemli görülmektedir (Karaer 2006, Anderson ve Magnarelli 2008). 4

7 Çizelge 2.1 Cinslere göre kene türlerinin sayıları Familya Cins Ortalama tür sayısı Ixodidae Ixodes Amblyomma Bothriocroton Haemaphysalis Hyalomma Nosomma Anomalohimalaya Cosmiomma Dermacentor Margaropus Rhipicentor Rhipicephalus (Boopilus) Rhipicephalus Nuttalliellidae Nuttalliella 1 Argasidae Argas Carios Ornithodorus Otobius Laelaptidae Gammaridacarus 1 Toplam Kenelerin Morfolojik ve Biyolojik Özellikleri Keneler, capitulum (gnathosoma) ve bacakların bulunduğu vücut (idiosoma) kısımlarının birbiriyle kaynaşmasından oluşan iki bölümden meydana gelir (Balashov 1972, Sonenshine 1993). Larvalar 6 bacağa sahipken (Şekil 2.1), nimf ve erginler 8 bacağa sahiptir (Şekil ). Belirgin bir başları yoktur. Beslenmemiş ergin kenelerin uzunlukları 2 mm ile 20 mm arasında değişir. Kan emmiş dişi kenelerin uzunlukları 25 mm ile 30 mm arasında değişebilir ve ağırlıkları da kan emmeden önceki ağırlıklarının 100 katına çıkabilir. Ağız parçaları kapitulumda bulunur (Şekil ). İki tane dört segmentli palpe sahiplerdir ki ixodid kenelerin her birinde palplerin 4. küçük distal segmentinde kemisensör sensillalar vardır (Şekil 2.5). Palpler açılan yaraya girmezler; beslenme sırasında deriye yatay olarak yana doğru bir baskı uygularlar. Keliseral gövdenin ekstremitelerinde çok iyi hareket edebilen ve keskin kesici dijitler bulunur (Şekil ). Bu dijitler beslenme sırasında deriyi kesmeye, delmeye yarar. 5

8 Hipostom, tutunma organı ve besin kanalı olarak iş görür. Hipostomun şekli ve boyutu ve dişlerin dizilimi türler arasında çeşitlilik gösterir ve türlerin teşhisinde kullanılan önemli özelliklerdir. Konaktan kan bu besin yolu ile geçer. Salgısı, dokuları parçalayan ve eriten proteolitik enzimleri içerir, kene konaktan bu kanal ile çıkarılır. Basis capituli, kapitulumun bazal kısmı, kenenin vücuduna esnek bir membran ile tutunmuştur. Vücut, kapitulumun posteriyorunda kalan kısmıdır (Şekil ). Anteriyor kısımda bacaklar ve genital açıklık vardır ve posteriyor kısımda stigma ve anüs vardır. Larvalarda ve nimflerde genital açıklık kapalıdır ve belirsizdir, erginlerde ise açıktır (Şekil ). Sert kenelerde scutum, dişilerde ve juvenil kenelerde vücudun dorsal anteriyor kısmını kaplar (Şekil 2.2). Erkeklerde scutum tüm vücudu kaplar (Anderson and Magnarelli 2008). Şekil 2.1 Ixodes scapularis larvasının taramalı elektron mikrografisinde ventral olarak görüntüsü: (Anderson ve Magnarelli 2008). A. anüs, BC. basis capituli, D. keliserin dijitleri, H. hipostomun dış yüzeyi, L. bacak, P. palp 6

9 Şekil 2.2 Ixodes scapularis dişisinin taramalı elektron mikrografisinde dorsa-lateral görüntüsü: (Anderson ve Magnarelli 2008). B. vücut (idiosoma), C. capitulum (gnathosoma), L. bacak, P. palp, S. skutum, SP. spiracle (stigma) Şekil 2.3 Ixodes scapularis dişisinin elektron mikrografisinde ventral görüntüsü (Anderson ve Magnarelli 2008). A. anüs, BC. basis capituli, GA. genital açıklık, H. hipostomun dış yüzeyi, L. bacak, P. palp, SP. spiracle 7

10 Şekil 2.4 Ixodes scapularis dişisinin kapitulumunun taramalı elektron mikrografisinde dorsal görüntüsü (Anderson ve Magnarelli 2008). BC. basis kapituli, D. keliser dijitleri, DEN. hipostomun dış yüzündeki dişcikler, H. hipostomun iç yüzeyi, O. besin kanalı açıklığı, P. palp, PA. poros area, SC. keliser gövdesi Şekil 2.5 Ixodes scapularis nimfinin kapitulumununun ventral morfolojisinin taramalı elektron mikrografi görüntüsü (Anderson ve Magnarelli 2008). BC. basis capituli, F. palpin dördüncü segmenti, H. hipostomun dış yüzeyi, P. palp 8

11 Sert kenelerin hayat döngüsü, beslenme evrelerinde değiştirdikleri konak sayılarına göre ve ergin olmayan kenelerin gömlek değiştirmelerinin konak üzerinde olup olmadığına göre sınıflandırılır. Buna göre türler, bir konaklı, iki konaklı ve üç konaklı olarak sınıflandırılırlar (Balashov 1972, Sonenshine 1993). Dermacentor variabilis, Ixodes ricinus ve Ixodes scapularis gibi sert kene türleri 3 kere 3 farklı konaktan beslenirler ve yaygın olarak 3 konaklı keneler olarak isimlendirilirler (Şekil 2.6). Genellikle keneler konaklarının üzerinde sadece beslenirken kalırlar, bazı zamanlarını da konakta ilerlerken geçirirler. Bu keneler larva olarak beslenmelerini tamamlarlar ve konaklarının üzerinden yere düşerler, gömlek değiştirerek nimf haline geçerler. Nimfler diğer bir konak hayvana tutunurlar, beslenmelerini tamamlarlar ve yere düşerler. Gömlek değiştirip ergin hale geçtikten sonra her bir dişi birey, konağa tutunurlar, çiftleşirler, kan alımını tamamlarlar ve yere düşerler, bir yığın halinde yumurtalarını bırakırlar (Şekil 2.9). Dişi keneler arası yumurta bırakırlar ve yumurtlama dönemleri çevresel etkilere göre ay sürebilmektedir. Yumurtalardan, ay sonra larvalar çıkar. Bazı tür keneler bir konaklı veya iki konaklı keneler olarak adlandırılırlar. Rhipicephalus bursa ve Hyalomma türleri iki konaklı kenelere örnektir. Larvalar küçükbaş hayvanlarda beslenirler ve burada gömlek değiştirirler ve nimf haline geçerler. Kan ile doyan dişiler toprağa düşer gömlek değiştirip ergin hale geçerler (Şekil 2.7). Erginler yeni konak ararlar, çiftleşirler, beslenmelerini tamamlarlar, ayrılırlar ve daha sonraki yumurtlamaları için toprağa düşerler (Karaer 2006, Anderson ve Magnarelli 2008). Rhipicephalus (Boophilus) microplus tek konaklı bir kenedir. Larva ve nimfler büyükbaş hayvanlarda beslenirler ve gömlek değiştirirler ve sadece kan alınımını tamamlayan ve çiftleşen dişiler konaktan düşer ve yere yumurtalarını bırakırlar (Şekil 2.8). 9

12 Şekil 2.6 Üç konaklı kenelerin yaşam döngüsü ( Şekil 2.7 İki konaklı kenelerin yaşam döngüsü ( 10

13 Şekil 2.8 Bir konaklı kenelerin yaşam döngüsü ( Şekil 2.9 Yumurtalarını bırakmış bir dişi (Karaer 2006) 11

14 2.2.1 Türkiye de yayılış gösteren Ixodidae familyasındaki kenelerin cins ayrım karakterleri (Merdivenci 1969, Karaer vd. 1997, Aydın 2000) Ixodidae familyasındaki kenelerin, ağız organellerine, palp, hipostom ve basis kapituli, bakılarak cins düzeyinde ayrımları yapılabilmektedir. Ixodes cinsinde, palpler uzun, üzerinde kıllar vardır. Hyalomma cinsinde, palpler uzundur, 2. palp segmenti diğerlerine göre daha uzundur. Amblyomma cinsinde, palpler uzundur ve hipostom kalındır. Dermacentor cinsinde, palpler kısadır ve basis kapitulinin seviyesini geçmez Boophilus cinsinde, palpler kısa ve çıkıntılıdır ve palplerin boyu hipostoma eşit veya kısadır. Basis kapituli yanlara taşmıştır ve altıgen şeklindedir. Rhipicephalus cinsinde, palpler kısa ve hipostomdan uzundur ve basis capituli altıgendir. Haemaphysalis cinsinde, palpler kısadır ve 2. palp segmenti basis kapituliden yanlara taşmıştır. Palp ve hipostomları uzundur Palp ve hipostomları kısadır Göz, anal ve subanal plakları vardır. Skutum koyu renkli ve nakışsızdır. İkinci palp segmenti 3. den 2 kat daha uzundur. Festonlar düzensiz ve bir bölümü birbiriyle kaynaşmıştır..... Hyalomma Koch, 1884 Gözleri vardır, anal plak yoktur. Skutumları nakışlıdır. 2. palp segmenti 3. den 2 katından daha uzundur. Festonları düzenlidir ve kaynaşma yoktur..amblyomma Koch, 1884 Anal oluk belirgindir ve anüsü önden kuşatır. Skutum, göz, festun ve nakış taşımaz. Erkeklerin ventral yüzü birbirinden belirgin sınırlarla ayrılmış yedi alandan oluşmuştur... Ixodes Latreille,

15 2. Gözleri vardır, anal plakları yoktur. Skutumları renkli ve nakışlıdır. Festun taşırlar, palpleri geniştir.dermacentor Koch, 1884 Göz ve iki çift anal plakları vardır. Dorsal ve lateralde çıkıntılı olan palpler hipostomdan kısa ya da eşit uzunluktadır. Festunları yoktur...boophilus Curtis, 1891 Göz ve anal plakları vardır, anal oluk belirgindir. Festun taşırlar. Basis kapituli dışa doğru çıkıntılıdır..rhipicephalus Koch, 1884 Göz ve anal plakları yoktur. 2. palp segmenti uzunluğuna oranla iki katı daha geniştir. Anal oluk belirgin ya da değildir, anüsü arkadan kuşatır. Festun taşırlar Haemaphysalis Koch, Ixodidae familyasındaki kenelerin tür teşhis anahtarı (Merdivenci 1969, Karaer vd., 1997, Aydın 2000). Hyalomma türlerinin ayrım anahtarı Erkek 1. Lateral olukları kısa ve skutumun 1/3 üne kadar uzanır Lateral olukları uzun ve çoğunlukla gözlere kadar uzanır Vücut uzunca, scutum konveks ve parlak, arka kısmı az noktalı ancak basık değildir. Servikal olukları küçük ve sığdır......h.a.anatolicum Koch, 1884 Vücut ovalimsi, skutum koyu renkli ve üzerinde az sayıda büyük ve çok sayıda küçük noktalanmalar vardır. Arka kısmında parmanın önünde köprü benzeri bir kabarıklık mevcuttur, bu yapının önü basık ve sık noktalıdır. Ayakları eklem yerlerinden açık kahverengidir..h.a.excavatum Koch, Skutum düz parlak, üzerinde büyük ve seyrek noktalar mevcut, posteroparamedian oluklar öne doğru dışa yönelmiş durumda, ayak eklemlerinde halka görünümleri yoktur...h. detritum Schulze,

16 Vücut büyük yapılı, skutum koyu kahverengi görünümünde, üzeri tamamen veya arka kısımda yoğun noktalı, posteroparamedian oluklar birbirine paralel, ayak eklemlerinde halka şeklinde açık kahverengi alanlar vardır.h. marginatum Koch, Skutum parlak koyu kahverenkli, servikal oluklar çok kısa, lateral, posteromedian ve posteroparamedian olukar yok.... H. aegyptium Linnaeus, 1758 Hyalomma türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Skutum sarımsı kahverengi ve uzunluğuna göre çok az geniş, üzeri seyrek noktalıdır. Servikal olukları geriye doğru sığlaşarak skutumun ortasına kadar uzanır. Genital organ küçük ve yuvarlak ya da uzunca üç köşeli şekildedir... H.a.anatolicum 2. Skutum genişliğine göre daha uzun yapılı, servikal oluklar önde derin, arka kısımda sığ yapılı olup gözlere kadar uzanır. Genital organı düğme tarzında ya da uzunca üç köşelidir H.a. excavatum 3. Skutumun uzunluğu genişliğine eşit, servikal olukları düz ve yuvarlağımsı, üzeri az noktalı. Poros arealar oval ve birbirine yakın konumdadır. Genital organın arkası yanlardan basıktır. Bacakları açık kahverengidir....h. detritum 4. Skutum koyu kahverenginde, arka kısmı biraz basık olup beşgen tarzında eni boyuna eşittir. Üzerinde orta ya da çok sayıda belirgin nokta çukurları vardır. Servikal olukları derin ve uzun şekilde gözlere kadar uzanır. Genital organ büyük ve uzunluğuna göre daha geniş, küremsi oval ya da üç köşeli olup yanları daha iyi gelişmiştir H. marginatum 5. Skutum koyu kahverenginde, eni boyuna eşittir, poros areaları yuvarlak ve birbirine yakın konumdadır. Bacakları eklem yerlerinde açık kahverengi halkalıdır. Kaplumbağalarda yaygın olarak bulunur.h. aegyptium 14

17 Ixodes türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Vücut küçük yapılı, skutum parlak ve üzerinde çok sayıda kısa dağınık kıllar bulunur. Genital delik büyük ve 3. coxalar arasında medianda yer almıştır. Bacakları vücut boyundan kısadır. Birinci çift coxa dikenleri büyüktür.....ixodes ricinus Linnaeus, Vücudu orta büyüklükte, skutumu parlak ve üzeri çok küçük noktalı, genital delik enine yarık şeklinde, bacakları vücut boyundan kısadır. Birinci çift coxa dikenleri kalın ancak kısadır...i.hexaganus Leach, Bacakları vücut boyundan kısadır, birinci coxaların iç dikeni çok ince ve uzundur, dış dikeni çok küçüktür, dördüncü coxa üçgenimsidir, anal plakların boyu enine eşittir ve yan kenarları düzdür....i. laguri Olenev, Bacakları vücut boyundan uzundur. Birinci coxaların iç ve dış dikenleri çok küçüktür...i. vespertilionis Koch, 1844 Ixodes türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Skutumu yuvarlak yapılı olup, boyu vücut uzunluğunun yarısı kadardır. Servikal olukları yüzeyseldir. Poros areaları elipsoidal, arası açık ve enine yatık durumdadır. Birinci coxaların iç dikeni büyüktür.....i.ricinus 2. Skutumun arka kısmı daralarak uzamıştır. Poros areaları yuvarlağımsı, enine yatık eliptik ve arası açıktır. Birinci çift coxaların iç dikeni küçüktür.. I.hexaganus 3. Bacakları incedir, skutumun boyu eninden büyüktür, dördüncü coxa üçgenimsidir. Poros areaları yuvarlaktır. I. laguri 15

18 4. Bacakları vücut boyundan uzundur, birinci çift coxalarda diken yoktur. Yarasalarda parazitlenirler..... I.vespertilionis Dermacentor türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Skutumun üzerindeki nakışlı yapılar gümüşi renkli olup keskişn sınırlı değildir. Skutum üzerinde az sayıda büyük ve seyrek çok sayıda belirgin olmayan küçük nokta çukurları bulunur. Birinci coxanın dış dikeni iç dikeninden daha kısadır..d.marginatus Sulzer, Skutumun üzeri gümüşi sarı renkli ve keskin kenarlı nakışlıdır. Üzerinde çok sık ancak küçük ve belirsiz nokta çukurları bulunur. Birinci coxanın iç ve dış dikenleri aynı boydadır....d. niveus Neumann, 1897 Dermacentor türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Nakışları oluşturan alanlar servikal oluklarda ve skutumun yanlarında koyu, diğer kısımlarda açık kurşuni renktedir. Skutum üzerinde büyük nokta çukurları bulunur. Poros arealar oval ve arka kısımları yaklaşmış durumdadır. Dördüncü coxanın dikeni büyüktür......d. marginatus 2. Skutum üzerinde nakışlı yapı açık kurşuni sarı renkli olarak tüm yüzeyde eşit şekilde nağılmıştır. Skutum üzerinde çok küçük noktalamalar mevcuttur. Dördüncü coxanın dikeni küçüktür....d. niveus Boophilus türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Kaudal çıkıntısı yoktur. Birinci palp ekleminin iç kısmında çıkıntı yoktur. Birinci coxada yarık olmayıp, adanal plağın posterior çıkıntısı da yoktur.... B. annulatus Say,

19 2. Kaudal çıkıntılı, birinci palp ekleminin iç kısmı kıllı ve çıkıntılı, adanal plağın iç mahmuzu kısadır. Birinci çift coxalarda bir yarık vardır...b. kohlsi Hoogstraal ve Kaiser, 1960 Boophilus türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Scutumu küçük yapılı, birinci palp ekleminin çıkıntısı kılsız, porps arealar ovaldir. Birinci coxa düz girintili ve iki küçük mahmuzludur. Basis capitulinin arka kenarı düzdür. Gözleri küçüktür......b. annulatus 2. Birinci coxada V formunda belirgin bir yarık ve iki belirgin mahmuzu vardır. Gözleri büyüktür.....b. kohlsi Rhipicephalus türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Skutum üzerinde çok sayıda büyük noktalar vardır..2 Skutum üzerinde az sayıda büyük noktalar vardır Adanal plaklar dar ve uzun üçgenimsidir. Peritremin kuyruk uzantısı dar uzanmış ve kavislidir. Parması belirgindir..r.sanguineus Latreille, 1806 Adanal plaklar dar ve uzun üçgenimsidir. Peritremin kuyruk uzantısış kısa, kalın ve küttür. Parması belirgindir R. turanicus Pomerantzev ve Matikasvili, Adanal plaklar geniş üçgen tarzındadır. Palpleri küçük ve basis kapitulinin genişliğinden kısadır. Peritremin kuyruk uzantısı incedir......r. bursa Canestrini ve Fanzago,

20 Rhipicephalus türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Skutumun servika olukları az belirgindir, üzerinde az sayıda be büyük nokta çukurları vardır..2 Skutumun servikal olukları az belirgindir, üzeri fazla noktalıdır Poros arealar küçük ve birbirinden uzaktır. Genital deliğin arka kısmı açık V şeklindedir... R. sanguineus Poros arealar büyük ve birbirinden uzaktır. Genital deliğin arka kenarı yuvarlaktır..r. turanicus 3. Poros arealar büyük ve ovalimsi olup, öne yakın konumdadır.....r. bursa Haemaphysalis türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Palplerin ikinci eklemi dışa taşkındır ve festunları belirgindir Palplerin ikinci eklemi dışa taşkın değildir. Skutumda servikal ve lateral oluklar yoktur. Festonları belirgin değildir, dördüncü coxa dikenleri küçüktür...hae. inermis Birula, Dördüncü coxanın dikeni büyüktür ve içe dönüktür......hae. punctata Canestrini ve Fanzago, 1877 Dördüncü coxanın dikeni büyük ancak dışa dönüktür, scutumun üzeri çok noktalıdır...hae. sulcata Canestrini ve Fanzago,

21 Dördüncü coxanın dikeni çok küçüktür, palplerin ikinci eklemi az taşkındır, skutumun ön kısmında büyük nokta çukurları vardır....hae. parva Schulze, Vücudu uzunca oval, skutumu parlak, palplerin ikinci eklemi sivrilmiş halde yanlara taşkındır. Bütün coxaların dikenleri küçük ve aynı büyüklüktedir..... Hae. numidiana Neumann, 1794 Haemaphysalis türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Palplerin ikinci eklemi yanlara taşkındır 3 2. Scutumunun eni boyundan geniştir, porps areaları yuvarlak ve birbirinden uzaktır. Hipostom dişleri 3/3 sıralıdır. Palplerin ikinci eklemi yanlara taşkın değildir. Tüm coxa dikenleri küçük ve eşit yapıldır.....hae. inermis 3. Scutumun üzerinde küçük nokta çukurları vardır. Hipostom dişleri 4/4 sıralıdır. Servikal olukları belirgin olup skutumun ortasına kadar uzanır. Poros arealar küçük ve yuvarlak olup birbirlerinden ayrıktır. Genital delik yanlardan iki dar plakla kaplıdır Hae. parva Scutum üzerinde seyrek noktalamalar vardır. Hipostom dişleri 5/5 sıralıdır. Poros arealar büyük ve birbirine yakındır. Lateral olukları arkada birer festun kuşatır.....hae. punctata Scutumun kenarları yuvarlak yapılı olup, üzerinde düzenli dağılmış küçük noktalamalar bulunur. Hipostom dişleri 4/4 sıralıdır. Servikal olukları çok kısadır. Poros areaları yuvarlak yapılı ve araları fazla açık değildir. Coxaları geriye doğru büküktür hae. sulcata 19

22 Skutum açık kahverengindedir ve üzerinde sık ve büyük nokta çukurları bulunur. İkinci palp eklemi çok büyük olup, yan çıkıntısı sivrilmiştir. Hipostom dişleri 4/4 sıralıdır. Servikal olukları uzun ve derindir.hae. numidiana Türkiye deki keneler ve dağılımları Türkiye nin sürüngenlerde, kuşlarda ve memelilerde tespit edilen ve zarar veren kene faunası, 2 familyaya ait 10 cins ve yaklaşık olarak 32 türden oluşmaktadır (Oytun 1947, 1961, Kurtpınar 1954, Merdivenci 1969, Hoffman vd. 1971, Karaer vd. 1997, Aydın 2000). Türkiye de Ixodidae ve Argasidae familyasında hayvan hastalıkları açısından önemli yer tutan keneler şu şekildedir: Ixodes; Ixodes ricinus, Ixodes hexagonus Amblyomma; Amblyomma variegatum Haemaphysalis; Haemaphysalis parva, Haemaphysalis punctata, Haemaphysalis sulcata, Haemaphysalis inermis, Haemaphysalis concinna, Haemaphysalis numidiana Hyalomma; Hyalomma aegyptium, Hyalomma anatolicum anatolicum, Hyalomma anatolicum excavatum, Hyalomma marginatum, Hyalomma detritum, Hyalomma dromedarii Boophilus, Boophilus (Rhipicephalus) annulatus, Boophilus kohlsi, Dermacentor; Dermacentor marginatus, Dermacentor niveus, Rhipicephalus; Rhipicephalus bursa, Rhipicephalus sanguineus, Rhipicephalus turanicus Ornithodoros; Ornithodoros lahorensis Argas; Argas persicus, Argas reflexus Otobius; Otobius megnini (Aydın ve Bakırcı 2007). Bunun dışında ülkemizde kene türlerinin dağılımında muhtemelen bölgedeki ekolojik faktörler etkilidir. Yüksek yağış miktarı ve yoğun olarak bulunan ormanlık alanlardan dolayı Ixodes spp. Türkiye nin kuzeyinde, çoğunlukla Hatay da (Suriye sınırı) Amblyomma variegatum, Türkiye nin güneydoğusunda (Suriye sınırı) Boophilus kohlsi, 20

23 İç Anadolu ve Doğu Anadolu da Ornithodorus ve Doğu Anadolu da (Malatya) Otobius megnini. Haemphysalis, Hyalomma, Boophilus, Dermacentor, Rhipicephalus ve Argas Anadolu nun her yerinde yaygın olarak bulunur (Aydın ve Bakırcı 2007). Kayseri de yapılan bir araştırmaya göre Rhipicephalus türlerinin ilkbahar, yaz ve sonbaharda görüldükleri belirtilmiş ve en yaygın oldukları zamanın yaz olduğu, Hyalomma erginlerinin, ilkbahar, yaz ve sonbaharda görüldüğü ve en yaygın oldukları zamanın yaz olduğu bildirilmiştir. Haemaphysalis, sonbahar, kış ve ilkbaharda görülmüştür. Ornithodorus lahorensis, sonbahar, kış ve ilkbaharda görülmüştür ve en çok bulundukları zamanın kış olduğu belirtilmiştir. Dermacentor marginmatus bütün mevsimlerde görülmüştür. Boohilus annulatus türünün en çok ilkbaharda yaygın olduğu bildirilmiştir (Ica vd. 2007). 2.3 Kenelerin Bulaştırdıkları Hastalıklar Kenelerin ekonomik olarak öneme sahip olan hayvanlarda ciddi kayıplara ve insanlarda ölüm oranı yüksek olan hastalıklara yol açmaları açısından insan ve hayvan sağlığı açısından önemli yere sahiplerdir. Keneler tarafından taşınan zoonotik etkenler arasında bakteriyel (tularemi, lyme hastalığı), riketsiyal (benekli humma, Q humması, ehrlichiosis), parazitik (babesiosis) ve viral (tick borne encephalitis, kanamalı ateşler) infeksiyon etkenleri gösterilebilir (Despommier vd. 2000, Jongejan ve Uilenberg 2004). 21

24 Çizelge 2.2 Kenelerin insanlara bulaştırdığı bazı hastalıklar (Kaya 2007, Derviş 2009) Bakteriyal Hastalıklar Viral Hastalıklar Protozoal Hastalıklar Ricketsiyal Hastalıklar Hastalık Etken Vektör Lyme Hastalığı Borrelia Ixodes pasificus, burgdorferi I.scapularis, I. ricinus Dalgalı Humma Borrelia crocidurae Ornithodorus erractus Lekeli Humma Borellia borelli Rhipicephalus sanguineus İran Dalgalı Borrelia persicus Ornithodoros Humması tholozoni Hyalomma spp., Kırım Kongo Bunyaviridae Ixodes spp., Kanamalı Ateşi Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Kene Encephaliti Flaviviridae Ixodidae Kolarado Kene Reoviridae Dermacentor Humması Coltivirus andersoni Orta Avrupa Kene Flaviviridae Ixodes spp. Humması Ixodes spp., Rusya Bahar Yaz Flaviviridae Hyalomma spp., Humması Dermacentor spp., Rhipicephalus spp. Babesiosis Babesia spp Ixodes spp. Avustralya Kene Rickettsia australis Ixodes spp. Tifusu Akdeniz Lekeli Rickettsia conorii Rhipicephalus Humması sanguineus, Dermacentor 22

25 2.3.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı (KKKA) Hastalık ilk olarak 1944 yılında Kırım da görev yapan 200 Sovyet askerinde görülmüş ve Kırım Kanamalı Ateşi olarak adlandırılmıştır. Ardından 1956 yılında Belçika Kongosu nda görülen hastalığın, Kırım Kanamalı Ateşi ile aynı hastalık olduğu 1969 yılında anlaşılmış ve o günden itibaren de hastalık Kırım Kongo Kanamalı Ateşi adıyla anılmaya başlamıştır (Ergonul 2006a, Kara 2008). Hastalık tanımlandıktan sonra vakalar çoğunlukla Sovyetler Birliği ve Bulgaristan dan bildirilmekteydi (Whitehouse 2004, Ergonul 2006a). Çin in kuzeybatısında 1965 yılında mortalitesi % 80 olan bir salgın tanımlanmış, sonraki 30 yılda Çin de 260 KKKA vakası bildirilmiş ve % 21 mortalite ile sonuçlanmıştır. Pakistan da büyük KKKA salgınları olmuş, yılları arasında görülen 101 KKKA vakasından % 40 ı kaybedilmiştir. Suudi Arabistan da yılları arasında mezbaha işçileri arasında 40 vaka tanımlanmış ve bunların % 30 u ölmüştür. KKKA, Yunanistan ve Romanya dışında Balkan Yarımadası nda endemiktir. Bulgaristan da yılları arasında 124 KKKA vakası bildirilmiş ve bunların 24 ü kaybedilmiştir (Ergonul 2006a, Kara 2008). 23

26 Şekil 2.10 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü nün dünyadaki dağılımı (Ergonul 2006a) Vektör olduğu kanıtlanmış 10 kene türü bulunmaktadır. Bunların altısını Hyalomma cinsi keneler oluşturmaktadır. Bunlar; Amblyomma variegatum, Hyalomma marginatum, Hyalomma rufipes, Hyalomma anatolicum, Hyalomma asiaticum, Hyalomma truncatum, Hyalomma impeltatum, Dermacentor marginatus, Rhipicephalus evertsi, Rhipicephalus rossicus türleridir. Bunlar içinde özellikle bazı Hyalomma türlerinin KKKA hastalığında çok etkili rol oynadığı kabul edilmektedir ve KKKA hastalığı yayılışı da Hyallomma türlerinin yayılışı ile örtüşmektedir (Korsunova ve Petrova-Pointovskaya 1949, Hoogstraal 1979, Logan vd. 1989, Camicas vd. 1994, Dohm vd. 1996, Butenko ve Karganova 2007, Turell 2007). Hyalomma marginatum türünün Balkanlar, Kırım ve Kafkaslarda; Hyalomma anatolicum türünün İran, Pakistan, Türkmenistan ve Tacikistan da; Hyalomma asiaticum türünün Orta Asya ve Çin de; Hyalomma rufipes ve Amblyomma variegatum türlerinin ise Afrika da ve 24

27 Karayip Adaları nda, Avrupa da da Ixodes ricinus türlerinin virüsün ana vektörleri olduğu belirtilmiştir (Hoogstraal 1979, Butenko ve Karganova 2007, Turell 2007 Anderson ve Magnarelli 2008) (Çizelge 2.3). Hyalomma marginatum, Hyalomma anatolicum ve Dermacentor marginatus türü kenelerin vektörlüğü ve bu türlerin ülkemizde de bulunduğu bildirilmiş olmasına rağmen, 2005 yılından itibaren başlayan saha çalışmalarının sonucunda KKKA salgınları ile ilişkili kene türünün H. marginatum olduğu ortaya konmuştur (Tonbak vd. 2006, Vatansever vd. 2007). KKKAV ilk olarak 1960'larda Hyalomma cinsinin yetişkin formlarından izole edilmiştir (Watts vd. 1988, Ergonul 2006b). Hyalomma cinsi kenelerin KKKA virüsünün ana vektörü olduğu düşünülse de R. bursa türünün de virüsün taşınmasında rol oynuyor olabileceği belirtilmiştir (Tonbak vd. 2006). Bununla birlikte bir tane de ısıran tatarcıktan (Culicoides spp.) KKKA virüsü izole edilmiştir (Hoogstraal 1979, Linthicum ve Bailey 1994). 25

28 Çizelge ten beri ortaya çıkan Kırım Kongo Kanamalı Ateşi salgınları (Ergonul 2006a) Coğrafi bölge Yıllar Olgu sayısı Olgu ölüm oranı (%) Meslekler Güneydoğu Avrupa Kırım Astrahan Rostov Bulgaristan Arnavutluk Kosova Hayatta kaldı 33 Askerler Tarım ve sağlık çalışanları Tarım çalışanları Tarım ve sağlık çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım ve sağlık çalışanları Tarım çalışanları Türkiye Asya Çin Kazakistan Tacikistan Pakistan Orta Doğu Birleşik Arap Emir. Irak Suudi Arabistan Umman Emirliği İran Afrika Zaire (Kongo) Uganda Moritanya Burkina Faso Güney Afrika Cumh. Tanzanya Güneybatı Afrika Kenya Bilinmiyor Bilinmiyor 18 Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım ve lab. çalışanları Çoban, sağlık çalışanları Sağlık çalışanları Tarım ve sağlık çalışanları Sağlık çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Hekim Laboratuvar çalışanları Deve sahibi Tarım ve sağlık çalışanları Bilinmiyor Çiftçiler, sağlık çalışanları Öğrenci Bilinmiyor Tarım çalışanları 26

29 Türkiye de Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı Ülkemizdeki ilk olgularla 2002 yılında Karadeniz Bölgesi nin iç kısımlarında, İç ve Doğu Anadolu Bölgeleri nin kuzey kesimlerinde karşılaşılmıştır yılına kadar toplam 500 olgu Sağlık Bakanlığı na bildirilmiş ve bu olguların 26 tanesi ölümle sonuçlanmıştır (Ergonul vd. 2004, Ergonul 2006b, Ozkurt vd. 2004). Hastalık ülkemizde ilk olarak Tokat, Amasya ve Sivas illerinde 2002 yılının Mayıs, Haziran ve Temmuz aylarında görülmeye başlamıştır. Bu dönemde Tokat ilinden yapılan 50 vaka bildiriminden 6 sı ölümle sonuçlanmıştır (Gozalan vd. 2004, Sağlık Bakanlığı 2005) yılından günümüze vaka sayısı artarak devam etmektedir (Çizelge 2.4). Çizelge 2.4 Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi vaka ve ölümlerinin yıllarına göre dağılımı (Anonim 2009) Yıllar Vaka Sayısı Ölüm Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü KKKAV, Bunyaviridae ailesinden Nairovirus cinsinde yer alan 100 nm büyüklüğünde kılıflı bir RNA virüsüdür. Bunyaviruslar, zarflı ve negatif polaritesi olan tek iplikçikli RNA parçacığından oluşmaktadırlar (Elliott vd. 1991). Bunyaviridae ailesi içinde 27

30 Nairovirüslerin dışında Hantavirüs, Orthobunyovirüs, Phlebovirüs ve Tospovirüs türleri bulunmaktadır (Ergonul 2006a, Kara 2008, Tanır vd. 2008). KKKAV nispeten dayanıksızdır, konakçı dışında yaşayamaz, ultraviyole ile hızla ölür. Kanda 40 C de 10 gün yaşayabilir. Virüs 56 C de 30 dakikada inaktive olur. Antiseptiklerden % 1 hipoklorit ve % 2 gluteraldehite, antivirallerden ribavirine duyarlıdır (Ergonul 2006a, Kara 2008). KKKAV nin 8 farklı genetik grubu bulunmaktadır. Türkiye den izole edilen KKKAV suşlarının tamamına yakını Güney Rusya (kuzey Kafkaslar) ve Kosova suşlarına yakındır ve İran da 2002 de görülen salgındaki suşlardan farklıdır (Midilli vd. 2007, Vatansever vd. 2007). Virüs, evcil ve yabani hayvanlarda 7-10 gün kadar kalabilirken kenelerde hayatları boyunca bulunabilmektedir. Hatta kenelerde transstadial ve transovarial nakil ile nesillere de aktarılabilir. Transstadial nakilde, kene larva ve/veya nimf halindeyken viremik konaktan kanı emip gömlek değiştirip ergin hale geçtikten sonra bu virüsü başka konaklara vermesidir. Transovarial nakil ise, erişkin dönemlerde enfeste konaklardan kan emen bir dişi kenenin virüsü yumurtalarına aktarmasıyla gerçekleşir (Jongejan ve Uilenberg 2004) Kırım Kongo Kanamalı Ateşi hastalığının tanısı Serolojik tanısı 1980 den önce KKKAV enfeksiyonu tanısında ve çalışmalarında, komplement fiksasyon, immünodifüzyon ve hemaglütinasyon inhibisyonu gibi hassas olmayan ve tekrarlanamayan serolojik testler kullanılıyordu (Hoogstraal 1979). KKKA enfeksiyonunu ispat etmek zordu. Günümüzde ise hastalığın başlamasından yedi gün sonra enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ve indirekt fluoresans antikor (IFA) testleriyle IgM ve IgG antikorları saptanabilmektedir (Shepherd 1989). Spesifik 28

31 IgM düzeyi enfeksiyondan dört ay sonra saptanamayacak kadar azalırken IgG düzeyleri beş yıl boyunca saptanabilir seviyede kalmaktadır (Charrel vd. 2004) Moleküler tanısı Ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (Reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) yöntemi, KKKAV enfeksiyonun hızlı tanısında tercih edilmesi gereken yöntemdir. RT-PCR tekniği ile hastalığın 16. gününe kadar viral RNA, serum örneklerinde saptanabilmektedir. Yöntem son derece özgün, duyarlı ve hızlıdır (Drosten vd. 2003, Bakır ve Elaldı 2006). RT-PCR, virüsün genetik materyalini tespit eder, virüs kültürü yapılmadan KKKA tanısı yapmak mümkündür. RT-PCR ın hassasiyetinin fazla olmasından dolayı, kültürü negatif olan örneklerin serumlarından bazen pozitif sonuç elde edilebilir (Schwarz vd. 1996) Hayvanlarda Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKAV) genellikle doğada kene-omurgalı-kene döngüsünde fark edilmeden dolaşmaktadır. KKKAV, sığır ve keçi (Causey vd. 1970, Woodall vd. 1965), koyun (Yu-Chen vd. 1985), yabani tavşan (Chumakov 1974), kirpi (Causey 1970), Mastomys spp. (Saluzzo 1985) ve hatta evcil köpekleri bile içeren (Shepherd vd. 1987a, b) çeşitli evcil ve vahşi hayvanlardan izole edilmiştir. Çeşitli vahşi hayvanların serumlarında KKKAV ye karşı antikorlar vardır ve seroepidemiolojik çalışmalarda ayrıca Avrupa, Asya ve Afrika nın çeşitli bölgelerindeki evcil sığır, at, eşek, koyun, keçi ve domuzlarda KKKAV ye karşı antikorlar tespit edilmiştir (Watts vd. 1989). KKKAV nin vektörü olan Hyalomma anatolicum kenelerinin ergin olmayan formlarının bazen kertenkelelerden beslendiği bilinmesine rağmen (Hoogstraal 1979) ilginç bir şekilde KKKAV ye karşı antikor sürüngende, sadece Tacikistan da bir kaplumbağada, tespit edilmiştir ( Pak vd. 1971). 29

32 Birçok evcil ve vahşi omurgalılar KKKAV ile enfekte olmasına rağmen, genel olarak, kuşlardaki vireminin ve/veya antikor cevabının artışı KKKAV enfeksiyonuna karşı dayanıklı olduğunun kanıtıdır. Hoogstraal ın yaptığı çalışmalar kuşların çok fazla sayıda KKKAV enfekteli kenelerle muamele edilse bile KKKA viremisine karşı dayanıklı olduklarını göstermiştir (Hoogstraal 1979). Buna rağmen bazı istisnalar da vardır: Kazakistan daki 428 tavuk ve ördek serum örneğinde 1 tane KKKAV ye karşı antikor tespit edilmiştir. Ayrıca saksağan serumlarında da (Pica pica) KKKAV ye karşı antikorlar saptanmıştır. Evcil tavuklarda da KKKAV enfeksiyonuna karşı dayanıklılığı kanıtlanmıştır (Shepherd vd. 1987a, b). Aynı zamanda bu çalışmada, deneysel olarak KKKAV ile enfekte edilen beçtavuğunda (Numidia meleagris) düşük miktarda KKKA viremisi tespit edildi. Yapılan başka çalışmalarda, kırmızı gagalı gucuk kuşuna ve sığırcıklara yapılan KKKAV aşılaması sonrasında antikorlar tespit edilmiştir, hiçbir kuşta tespit edilebilir bir viremi gözlemlenmemiştir (Zeller vd. 1994). Diğer bir istisna da Güney Afrika da ticari devekuşlarının et endüstrisinde hastalığın görünmesi olmuştur te, Güney Afrika da çiftlikte devekuşu (Struthio camelus) kesimi yapan çalışanlarda KKKA vakası ortaya çıkmıştır (Van Eeden vd. 1985). Çevredeki çiftliklerdeki devekuşlarının % 24 ünde KKKAV ye karşı antikor tespit edilmiştir. Hasta çalışanların olduğu bir çiftlikteki dokuz deve kuşundan altısında da antikorlar tespit edildi. İlginç bir şekilde, bu çalışma esnasında test edilen başka 37 tür 460 kuşun hiç birinde KKKAV ye karşı tespit edilebilir antikorlar saptanmamıştır (Shepherd vd. 1987a, b). Ayrıca, 1996 da devekuşu mezbahasında çalışanlarında 17 tane KKKA vakası görülmüştür (Swanepoel vd. 1998). İki örnekte de, enfeksiyonun devekuşlarının kanıya temas ile ya da devekuşlarının derisi yüzülürken yanlışlıkla enfekte kenelerin ezilmesi ile bulaştığından şüphelenilmiştir. Devekuşları KKKAV ile enfekte edilmişlerdir (Swanepoel vd. 1998). Deri altından KKKAV ile enfekte edilen devekuşlarında vireminin 1-4 gün sonra arttığı ve aşılamadan sonra 5 güne kadar iç organlarda virüsün tespit edilebilir seviyede olduğu görülmüştür. 30

33 2.4 Kenelerin Kontrolü Biyolojik kontrol Günümüzde keneler çoğunlukla kimyasal akarasitlerle kontrol edilse de biyolojik kontrol şu nedenlerden dolayı daha cazip bir hal almaktadır. 1) Çevresel güvenlik ve insan sağlığı hakkında artan endişeler. 2) Kimyasal kontrolün artan fiyatları 3) Kenelerin pestisitlere karşı artan direnci (Samish vd. 2004). Doğal düşmanlara karşı uygulama metotları şunları içerebilir: 1) Bireysel aşı (inoculative) ya da = kritik zamanda aşılama= 2) Kitle halinde salım (inundative) Kenelerin akarasitlerle 2 genel kontrol yöntemi vardır. 1) Konak üzerinde (On-host) 2) Konak dışında (Off-host) Konak üzerindeki kontrolde, keneler için omurgalılar konak olarak kullanılır. Küçük alanlarda oldukça fazla konsantrasyondaki pestisitler uygulanır ve keneleri öldürür. Ayrıca bu strateji daha sabit çevresel şartlardaki konaklar için daha faydalı olabilir (sıcaklık nisbi nem gibi). Bunlar biyolojik kontrol için önemli etkenlerdir. Konak dışında kontrol stratejileri, konaktan uzakta uygulamaya olanak sağlarlar. Konak dışındaki kontrol, bireysel olarak omurgalı konaklarının pestisitlere maruz kalmasını azaltır fakat çevredeki büyük alanlar bazı tehlikelere maruz kalabilir. Bu iki uygulamada da çevresel tehlike, eğer biyokontrol teknikleri verimli bir şekilde uygulanıyorsa büyük ölçüde azalır (Samish vd. 2004). 31

34 Patojenlerle kontrol Bakterilerle kontrol Brum ve arkadaşları Boophilus microplus kenesine patojenik olan Cedecea lapagei bakterisini bulmuşlardır. Laboratuvar şartları altında bu bakteri kenenin genital açıklığı yolu ile keneyi enfekte ettiği ve % 100 ölümle sonuçlandığı görülmüştür (Brum vd. 1991a, Brum vd. 1991b, Brum vd. 1992). Proteus mirabilis bakterisinin Dermacentor andersoni, Amblyomma hebraeum, Hyalomma marginatum, Rhipicephalus eversti eversti ve Boophilus decolarus kene türlerinde türünde patojen olduğu bildirilmiştir (Brown vd. 1970, Hendry ve Rechav 1981). Petri kaplarında yapılan çalışmalar sonucunda Bacillus thuringiensis in 3 farkı ticari varyasyonu bulunmuştur (B. t. kurstaki, B. t. israelensis ve B. t. thuringiensis). Bunlardan beslenmemiş ya da kan emmiş ergin Argas persicus ya da Hyalomma dromedarii türlerinin üzerine sıkıldığında öldüren B. thuringiensis bakterileri üretilmiştir (Hassanain vd. 1997). Ixodes scapularis larvaları B. t. kurstaki türünün spor solüsyonuna 30 saniye daldırılmış ve bu bakterinin bu kenede patojen olduğu saptanmıştır (Zhioua vd. 1999a, b). B. thuringiensis türünün endotoksininin kristal yapıda olduğu ve zararlıların orta bağırsak duvarını sarıp spor ürettiği ve kenelerde kan zehirlenmesine sebep olduğu belirtilmiştir (Gill vd. 1992, Flexner ve Belnavis 2000). B.thuringiensis ürünleri, ziraatte, tarımda en çok kullanılan kanıtlanmış biyokontrol ajanlarıdır (Navon 2000). 32

35 Mantarlarla kontrol 700 ün üzerinde entomopatojenik mantar bildirilmiştir. Ama bunlardan sadece 10 tanesi insektisit kontrolü için geliştirilmiştir (Hajek 1994, Butt 2001). Doğada, kenelerle ilişkili 20 mantar türü belirtilmiştir. 7 cins keneden 13 türünün mantarlar tarafından enfekte edildiği bulunmuştur (Kolomyetz 1950, Samsinakova 1957, Steinhaus ve Marsh 1962, Cherepanova 1964, Krylov 1972, Samsinakova vd. 1974, Estrada vd. 1990, Mwangi vd. 1995, Zhioua 1999a, Guerra 2001). En umut vadeden mantar Deuteromycetes (mitosporic fungi) familyasındandır. Entomopatojenik mantarlar, Arthropodların kutikulasından içeri girebilmektedir. Mantarların bazı dezavantajları da vardır. Bunlar şu şekilde sıralanabilir: 1) Konağı öldürmede yavaştırlar. 2) Çimlenmeleri ve sporlanmaları için yüksek neme ihtiyaçları vardır. 3) UV ışınlarına karşı duyarlıdırlar. 4) Bazıları hedef dışı arthropodlara etki ederler 5) Üretimleri ve muhafazaları zordur (Ginsberg vd. 2002). Entomopatojen fungusların zararlıları, genellikle vücutları içinde misellerinin gelişmesi ile vücut boşluklarını miselleri ile doldurmaları yoluyla zararlıyı, salgıladıkları toksinlerle zehirleyip öldürdükleri saptanmıştır (Yıldırım 2008). Kuzeydoğu Amerika da Verticillium spp. ve Beauveria bassiana kenelerden izole edilmiştir. Avrupa dan 10 tür Afrika dan 3 tür izole edilmiştir (Cherepanova 1964, Samsinakova 1974, Mwangi 1995, Zhioua 1999a). Brezilya da toplanan doymuş B. microplus dişilerinin % i Beauveria bassiana tarafından, % 10 u Metarhizium anisopliae tarafından kontamine edilmiştir (Da Costa vd. 2001). 33

36 Kuzey Avrupa da mevsime bağlı olarak doğada % 6-32 arasında doymuş I.ricinus dişileri mantarlar tarafından enfekte edildiği gözlemlenmiştir (Kalsbeek vd. 1995). Kenya da mantarlarla enfekteden dolayı % 1.7 oranında doymuş Rhipicephalus appendiculatus ölmüştür (Mwangi vd. 1995). Kuzeydoğu Amerika da toplana I. scapularis doymamış dişilerinin % 4.3 oranında enfekte olduğu saptanmıştır (Zhioua vd. 1999a). Doğada, ergin kenelerin diğer evrelerdeki kenelere göre daha kolay enfekte olduğu ve doymuş dişilerin de çok kolay bir şekilde enfekte olduğu görülüyor (Kalsbeek vd. 1995, Zhioua vd. 1999a). Laboratuvar çalışmalarında Metarhizium anisopliae ve Beauveria bassiana nın en güçlü kene karşıtı patojenlik gösterdiği ortaya konmuştur (Guangfu 1984, Gindin vd. 2001, Samish vd. 2001). Birçok durumda M. anisopliae suşlarının B. bassiana ya göre daha zarar verici olduğu görülmüştür (Castineiras vd. 1987, Mwangi vd. 1995, Barci 1997, Kaaya ve Hassan 2000, Sewify vd. 2001, Zangi 2003). Laboratuvar şartları altında en az 15 sert kene türünün ve 2 yumuşak kene türünün mantarlara karşı duyarlı olduğu bulunmuştur (Samish vd. yayınlanmamış gözlem). B. annulatus, H. excavatum ve R. sanguineus un doymamış larvalarının 5 mantarın 12 izolatına karşı olan duyarlılıkları incelendiğinde Boophilus ve Hyalomma larvalarının benzer ve Rhipicephalus cinsine göre daha duyarlı oldukları genel yargısı ortaya çıkmıştır. Bunun aksine doymuş H. excavatum dişilerinin, diğer iki türün dişilerinden entamopatojenik mantarlara karşı direncinin çok daha fazla olduğu görülmüştür (Gindin vd. 2003). 34

37 Birçok insektisit yumurtasına göre kene yumurtaları mantarlara karşı daha duyarlıdır. Yumurtalar laboratuvar şartları altında mantara maruz bırakılmıştır ve hiç biri yumurtadan çıkamamıştır (Boichev and Rizvanov 1960, Gorshkova 1966, Castineiras vd. 1987, Monteiro vd. 1998a, Monteiro vd. 1998b, Bittencourt vd. 1994, Kaaya ve Hassan 2000, Paiao vd. 2001, Gindin vd. 2003). B.microplus un larvalarının bulunduğu bir ortama M.anisopliae sporları püskürtülmüş ve bir hafta sonra kontrol grubu ile karşılaştırıldığında daha az larva görüldüğü belirtilmiştir (Bittencourt 2000). M. anisopliae sporları sığırlar üzerinde bulunan B. microplus ve B. decoloratus enfeksiyonlarına karşı püskürtülmüş ve kene populasyonunda % 50 lik bir azalma olduğu görülmüştür. Uygulamadan sonra toplanan kenelerin laboratuvarda % 79 unun öldüğü ve yumurta üretiminin % 50 azaldığı görülmüştür (Castro vd. 1997, Correia vd. 1998, Bittencourt vd. 1999, Kaaya ve Hassan 2000). M. anisopliae türünün B. microplus kenelerine karşı olan etkileri sığırlar üzerinde doğal ortamda denenmiş ve bu mantarın % oranında doymuş dişilere karşı etkili olduğu bildirilmiştir (Alonso- Diaz vd. 2007). B. microplus türünün sığırlardaki enfeksiyonuna karşı Verticillium lecanii fungusu denenmiştir. Bir kere yapılan denemede kene sayısının % oranında azaldığı ve dört kere yapılan uygulamada ise kene sayısının % oranında azaldığı bildirilmiştir (Camacho 1998). B. bassiana, M. anisopliae, M. flavoviridae, Paecilomyces fumosoroseus ve V. lecanii fungus türlerinin laboratuvar şartları altında B. annulatus türünün değişik dönemlerine karşı patojeniteleri karşılaştırılmış ve M. anisopliae ve B. bassiana izolatlarının en virulant oldukları belirtilmiştir (Gindin vd. 2001). R. apperndiculatus ve A. variegatum ya da H. excavatum ve R. sanguineus arasındaki karşılaştırmada görülüyor ki mantarlara karşı olan duyarlılıkları; larva, nimf, ergine 35

38 doğru azalmaktadır (Kaaya ve Hassan 2000, Samish ve Alekseev 2001, Gindin vd. 2003). Fakat doymamış I.scapularis larvaları, doymamış erginlere göre daha az dayanıklıdır (Zhioua vd. 1997) Entomopatojenik nematodlarla kontrol Heterorhabditidae ve Steinernematidae ailelerine ait, Steinernema ve Heterorhabditis cinsine bağlı entomopatojenik nematodlar insektler için zorunlu parazitlerdir. Konağın ağız, anüs, stigma gibi doğal açıklıklarından içeri girerler. Buradan konağın bağırsağına ve bağırsağı delerek vücut boşluğuna geçerler. Taşıdıkları bakteriyi konağın vücut boşluğuna ve sindirim sistemine bırakırlar ve konağın saat arasında ölümüne sebep olurlar (Glazer 2001a, Samish vd. 2004, Yıldırım 2008). Steinernema cinsine bağlı entomopatojen nematodların Xenorhabdus, Heterorhabditis cinsine bağlı entomopatojen nematodların ise Photorhabdus cinsine ait bakteriler ile ortak yaşadığı bilinmektedir (Hazır vd. 2003). Entomopatojenik nematodlar doymuş B. annulatus un dişilerine anüs ya da genetik açıklıktan girerler. Heterorhabdit nematodları, petri kabında, 2.5 saatten daha az bir sürede doymuş dişi B.annulatus ları öldürdüğü gözlemlenmiştir. Buna karşılık Steinernematid nematodlarının kenelere etki etmesi için, keneye girebilmesi için 4 saatten fazla zamana ihtiyaçları olduğu bulunmuştur (Glazer vd. 2001b). Tek bir heterorhabdit nematodun bile keneye girişi ölüme neden olmaktadır (Glazer 2001b). Laboratuvar çalışmalarında Ixodidae familyasından 6 cins, Argasidae familyasından 2 cinsin entomopatojenik nematodlar tarafından öldürüldüğü saptanmıştır. Sadece B. microplus un nematod saldırılarına karşı dirençli olduğu görülmüştür (Mauleon vd. 1993). 36

39 Kenelerin değişik dönemlerinde entomopatojenik nematodlara karşı hassasiyetlerinin farklı olduğu gösterilmiştir. Tamamen doymuş dişi kenelerin daha hassas olduğu, larva ve nimf dönemlerinde hassasiyetlerinin daha az olduğu, beslenme sırasında keneler entomopatojenik nematodlara ve onların yumurtalarına karşı çok dirençli olduğu, aç dişi kenelerin, doymuşlarına göre 6 kat daha hızlı öldükleri belirtilmiştir (Samish vd. 2000a, Samish vd. 2000b). Bu durumun kenelerin hemolimflerinin antibakteriyel özelliklerinden dolayı olabileceği düşünülmektedir (Ceraul vd. 2002). Bu çalışmalar sonucunda heterorohabdit nematodlarının steinernematidlere göre kenelere karşı daha zararlı olduğu ortaya çıkmıştır (Mauleon vd. 1993). Kene kontrolünde genellikle bazı avantajlarından dolayı nematodlar tercih edilir. Bu avantajlar şu şekilde sıralanabilir; 1) Doymuş dişi kenelerin bazı entomopatojen nematodlara karşı duyarlı olması ve buna rağmen bazı nematod türlerinin bulunduğu bölgelerde bulunmayı tercih etmeleri. 2) Sabit kenelerin, hareketli nematodları çekmeleri. 3) Nematod uygulamalarında spreylemek ya da sulama şeklindeki yöntemlerin, kene habitatlarına uygulamanın daha kolay olması (Samish vd. 2004). Bu avantajlarının yanında nem, sıcaklık, toprağın yapısı ve içeriği gibi ekolojik şartlar, kenelerin dönemlerinden kaynaklı olan farklılıklar ve türler arasındaki hassasiyet farklılıklarından dolayı entomopatojen nematodların kullanımları sınırlıdır (Samish vd. 2004, Yıldırım 2008) Parazitoidlerle kontrol Parazitodilerde konağı bulma görevi dişilere aittir. Dişi birey yumurtalarını konağın üzerine veya içine bırakır. Yumurtalardan çıkan bireyler ergin oluncaya kadar konağa zarar vermezler (Yıldırım 2008). Zararlılara karşı biyolojik mücadelede kullanılan parazitoitlerin çoğu Hymenoptera takımında yer almaktadır. (De Bach ve Rosen 1991). Hymenopteran parazitlerinden 37

40 sadece birkaç türün kenelere karşı olduğu bilinmektedir. Kenelerde etkili olan birkaç parazitoit türünün olduğunu ve bu türlerin de Encyrtidae familyasında Ixodiphagus cinsinin içinde yer aldığı ve hepsi de kene paraziti olan 7 tür içerdiği bildirilmiştir (Mwangi vd. 1997). En yaygını Ixodiphagus hookeri nin (sinonimleri: I. caucurtei, Hunterellus hookeri), Asya, Afrika, Kuzey Amerika ve Avrupa da kayıtları vardır (Hu vd. 1993). Mısırda göç eden kuşlarda Hyalomma rufipes te Hunterellus theileri yapışmış halde bulunmuştur (Kaiser ve Hoogstraal 1958). Ixadiphagus cinslerinin kenenin içine girerek yumurta bıraktıkları, yumurtadan çıkan larvaların kene içinde beslendikleri ve burada pupa haline geçerek keneyi delip ergin halde dışarı çıktığı kaydedilmiştir (Samish vd. 2004). Hindistan da yapılan bir çalışmada Ixodiphagus ların birçoğu sert kenelerden toplanmıştır, bir tanesi ise (I. mysorensis) Ornithodorus sp. den toplanmıştır (Mani 1941). Kenya nın batısında laboratuvar ve arazi şartlarında Amblyomma variegatum türünün parazitoiti olan Ixodiphagus hookeri türü ile yapılan çalışmalarda bu parazitoitin, kenenin doymuş nimfleri kadar doymamış nimflerine de yumurtalarını koyduğunu ve nadiren de olsa larvalarına da yumurtalarını koyduğu ve Ixodiphagus hookeri parazitoitinin konağı bulmak için kenenin kokusundan faydalandığı belirtilmiştir (Takasu vd. 2003) Predatörlerle kontrol Bir predatör akar olan Anystis baccarum türünün kene larvalarına hücum ettiği kaydedilmiştir (Holm ve Wallace 1989). 38

41 50 tane kuş türünün keneleri yediği belirtilmiştir (Petrischeva ve Zhmayeva 1949, Mwangi vd. 1991, Samuel ve Welch 1991, Petney ve Kok 1993, Verissimo 1995, Samish ve Rehacek 1999). Ama sadece birkaç türün özellikle kenelerle beslendiği görülmektedir. Bu yüzden sadece birkaç tanesinin kene populasyonu üzerine etkisi olması beklenmektedir (Samish vd. 2004). Afrika da sığırlarla birlikte bulunan tavukların 5,5 saatte her bir tavuğun 338 kene yediği bildirilmiştir. Diğer bir çalışmada, her beslenme saatinde tavuklardan her birinin 9,7 ile 81 arasında kene yediği bildirilmiştir. Kene yoğunluğunun çok olduğu durumlarda, kenelerin % 69 unun tavuklar tarafından tüketildiği görülmüştür (Hassan vd. 1991, Hassan vd. 1992, Dreyer vd. 1997). Tavuklar ne spesifik ne de zorunlu kene predatörleridir. Bunun için bunların kene tüketimi, bulabildikleri alternatif yiyeceklere ve kene populasyonunun yoğunluğuna bağlıdır. Bu yüzden tavuklar, kene populasyonunu belirli bir düzeyden aşağıya indiremiyorlar. Bununla birlikte küçük çiftliklerde fazla maliyete sebep olmadan kene populayonunun azalmasına yardım ederler (Samish vd. 2004). Buphagus africanus (sarı gagalı sığırkuşu = YBO) ve Buphagus eurthyrorhynchus (kırmızı gagalı sığırkuşu = RBO), ikisi de Afrika ya özgü kuşlardır ve spesifik olarak sadece ektoparazitlerle ve özellikle kenelerle beslenirler. Sığırkuşu populasyonu, kuşları zehirleyen akarasitlerin kullanımının artmasıyla azalmaktadır ve muhtemelen de kene populasyonu azalmaktadır (Van Someren 1951, Stutterheim and Stutterheim 1980, Stutterheim ve Brooke 1981, Robertson ve Jarvis 2000). Kenya da yapılan bir araştırmada yakalanan sığırkuşlarında mide içeriklerine bakıldığında her kuş başına tane kene olduğu görülmüştür (Van Someren 1951, Bezuidenhout ve Stutterheim 1980). Genç kırmızı gagalı sığırkuşlarının 6-7 gün içerisindeki kene tarafından enfekte olmuş sığırlar üzerindeki Boophilus tüketimi: larva 1176, nimf 1549 ve ergin 1293 şeklinde olduğu görülmüştür. 39

42 Sarı gagalı sığırkuşlarının, kırmızı gagalı sığırkuşlarına göre % 10 daha fazla kene tükettikleri gözlemlenmiştir (Bezuidenhout ve Stutterheim 1980, Stutterheim vd. 1988). Sığırkuşları görsel predatörlerdir. Öncelikle doymuş dişileri koparırlar, sonra büyük gövdelileri ararlar ve sonra da daha küçük keneleri koparırlar. Sarı gagalı sığırkuşları beslenmek için bufaloları ve beyaz gergedanları tercih ederler. Buna karşılık kırmızı gagalı sığırkuşları diğer toynaklıları tercih ederler. Sığırkuşları, beslenmek için kuvvetsiz memelileri seçerler ve tekrarlı bir şekilde aynı sürüdeki spesifik bireyleri seçerler (Van Someren 1951, Mooring ve Mundy 1996). Karıncalar, böcekler ve bazı kuş türleri gibi kene biyo-supresörleri kene ile arada bir beslenirler. Bundan dolayı bunların populasyonu, kene populasyonunun boyutuna bağlı değildir. Genel predatörler bazen doğada kene populasyonunun büyüklüğüne etki edebilirler. Ama kene sayısını azaltmak için populasyonla oynamak predatör populasyonunda büyük artışlara ihtiyaç duyar ki bu da doğada, hedef olmayan türlerin populasyonlarında büyük değişikliklere neden olur (Symondson vd. 2002) Feromonlar ve diğer semiokimyasallarla kontrol Semiokimyasallar olarak bilinen bu bilgi taşıyan bileşikler, hayvan vücudunun dışına salgılanır ve fark edildiğinde özelleşmiş davranışsal yanıtlar verir; besin, av lokasyonu kaçmak ya da diğer davranışlar gibi. Bireyler arasındaki kimyasal sinyaller açıkça yeryüzünde uzun zaman önce beliren ilk bilgi alma şeklidir. Bundan dolayı, semiokimyasallar aracılığıyla olan kimyasal iletişim hala bir çok hayvan arasındaki hakim olan iletişimdir. Semiokimyasalların kimyasal bileşimi; biyosentez, salgılama, algı ve çeşitli biyolojik rolleri düzenler (Sonenshine 2004). 40

43 Semiokimyasallar 4 büyük grupta kategorize edilirler: a) Feromonlar b) Allomonlar c) Kairomonlar d) Synomonlar (Evenden vd. 1999) Feromonlar Bir türün bireylerinden, aynı türün diğer bireylerinde değişiklik meydana getirirler (Eşey feromonu, toplama feromonu gibi). Genellikler feromonlar gelişmelerinin sadece belirli dönemlerinde salgılanırlar. Örneğin: dişiler omurgalılar üzerinde beslenirken. Buna ek olarak feromonu algılayan alıcı hayvanlar, sadece belirli bir psikolojik evrede ya da belirli bir gelişme evresindeyken karşılık verebilirler. Örneğin: doymuş ya da beslenme halindeki erkekler, ama beslenmemiş erkekler değil (Evenden vd. 1999). Feromon çeşitlerine, besin bulma feromonu, uyarı feromonu, yuva yapma feromonu gibi örnekler verilebilir (Wheeler 1976, Ayasse 1995, Fauvergue 1995, Roelofs 1995, Stowe vd. 1995) de 2,6-diklorofenol Amblyomma americanum da eşey feromonu olarak keşfedildi. Bu Arachnidlerde keşfedilen ilk feromondur. Bundan sonra kenelerde 4 tip daha feromon tanımlandı. Bunlar şu şekilde sıralanır: a) Arrestment (=assembly) Feromonları = Toplanma b) Attraction-aggregation-attachment Feromonları = Çekici-Toplama-Ekleme c) Eşey Feromonları d) Primer Feromonlar Synomonlar; Lepidoptera da iyi bilinmesine karşılık, muhtemelen diğer arthropodlarda da, kenelerde de bildirilmemiştir (Evenden vd. 1999). 41

44 a) Arrestment (Assembly= Toplanma) Feromonları Bu feromonlar Argasid ve Ixodid kenelerde bilinmesine rağmen en iyi Argasid kenelerde bilinmektedir. Kenelerin saklandıkları oyuklarda, taşlar altında, çatlaklarda ya da konaklarının yuvalarında kümeler oluşmasına yol açarlar. Kümeleşmeleri, çiftleşmeyi artırırlar ve konak bulmayı başarılı hale getirirler (Sonenshine 1985). Bu feromonlar ilk Argas ta tanımlanmıştır (Leahy vd. 1973). Bu toplanma davranışları yumuşak kenelerde en az 14 türde ve birkaç da sert kene türünde bildirilmiştir. Bu türler: Ixodes ricinus (Graf 1978), I. holocyclus, Aponnomca concolor (Trevorrow vd. 1977), Hyalomma dromedarii (Leahy vd. 1981), Rhipicephalus appendiculatus, Amblyomma cohaerans (Otieno vd. 1985), R. everesti (Gothe ve Neitz 1985), I. scapularis şeklindedir (Allan ve Sonenshine 2002). Bu davranışlarda pürinler, birçok kenede en önemli komponenttir. Pürinler kene dışkılarında bol miktarda bulunmaktadır (Grenacher vd. 2001). Diğer pürinler (örneğin; ksantin ve hipoksantin) birkaç kene türünün dışkısında da belirtilmiştir. Argas persicus ta kene dışkısındaki pürinin % sı guaninden oluşmaktadır. Geriye kalanı hipoksantinden (% 1.5) ve ksantinden (% 9.0 a kadar) meydana gelmektedir. Bazı Argasid kenelerde ürik asit ve guanozin kalıntılarına da rastlanır ama bunlar arrestment cevaba neden olmazlar. Hipoksantinin, A.reflexus ta diğer çalışılan Argasid kenelere oranla daha bol bulunduğu görülmüştür. Ksantin:guanin karışımının (1:25) ya da adenin:ksantin:guanin karışımının (1:1:25) normal cevaba çok yakın olduğu belirtilmiştir (Dusba bek vd. 1991). Guanin, A. persicus için birincil uyarıcıdır ve birçok kene türü için de öyledir. En az 8 10 ¹² mol/cm² konsantrasyonda aktif olduğu bulunmuştur (Otieno vd. 1985). 42

45 I. ricinus ta her bir dışkısal bileşenin guanin, ksantin, ürik asit ve 8-azaguanin (guaninin bakteriyal bozulma ürünü), erkek keneler tarafından toplanma cevabı olarak salınmaktadır (Grenacher vd. 2001). I. scapularis keneleri guanine hipoksantine, ksantine, inozine ve hematine cevap olarak toplanmaktadırlar. I. scapularis in dışkısında yapılan çalışmalar hematin, guanin ve ksantinin varlığını gösterirken diğer pürinlerle ilgili bir kanıt olmadığını ortaya koymuştur (Sonenshine 2004). Toplanma feromonları kenelerde çok yaygın olmasına rağmen bütün kenelerde bulunmamaktadır. Dermacentor variabilis ya da D. andersoni de toplama feromonlarına rastlanmamıştır (Taylor vd. 1987). b) Atraction- Aggregation-Attachment (AAA) Feromonları: Bu feromonlar bu şekilde adlandırılmaktadırlar çünkü bunlar, beslenmemiş erkek ve dişileri onların doğal çevresinden çekerler (çimenlik alanlar, kumlu barınaklar gibi). Bu feromonlar aynı zamanda çekilmiş keneleri, omurgalılarla temasa geçmesi için ve birbirlerine yakın beslenmeleri için uyarmaktadırlar. AAA feromonları, organik değişkenlerin olduğu bir karışımdır. Sadece beslenen erkeklerden salınırlar ama bütün dişi ve erkekleri çekerler. Erkek orjinli olmasına rağmen bir eşey feromonu değildir, çünkü her iki cinsiyeti de etkilemektedir. Bu feromon sadece büyük toynaklılardan beslenen ergin Amblyomma cinsine ait türlerde bulunmaktadır. Bu türler Afrika da A. variegatum, A. lepidum, A. gemma, A. marmoreum; Kuzey Amerika da nesli tükenen tek bir tür olan A. maculatum dur (Obenchain 1984) (Şekil 2.11). AAA feromonu ilk olarak A. variegatum da açıklanmıştır (Schöni vd. 1984). Bu feromon toplanmayı, yapışmayı ve çiftleşmeyi kolaylaştırmakatdır. Bu toplanma konak vücudunun herhangi bir yerinde olabilir (Sonenshine 2004). 43

46 Şekil 2.11 Zimbabwe de bir inekte beslenen Amblyomma hebraeum (Mahan) AAA feromonu 3 tane organik değişkenden meydana gelmektedir: o-nitrofenol (2- nitrofenol), metil salisilat, nonanoik asit. Bu bileşiklerin 2:1:8 oranında olduğu bildirilmiştir. o-nitrofenol ün aramayı ve toplanma davranışını uyardığı, metil salisilatın ve nonanoik asitin yapışmayı (birleşmeyi) uyardığı düşünülmektedir (Schöni vd. 1984). Bazı çalışmalarda 2,6-diklorofenol ve benzaldehit gibi ek komponentler ortaya çıkmıştır (Lusby vd. 1991, Price, vd. 1994). Bu komponentlerden özellikle o-nitrofenol ve metil salisilat uzun mesafedeki çekimde etkilidir. Keneleri, en uzak 4 m mesafeden çekebilmektedir (Norval vd. 1991). c) Sert Kenelerde Eşey Feromonları Tanımlamaya göre eşey feromonları, bireyler tarafından salınan, karşı cinsiyeti etkileyen bileşik ya da bileşiklerin karışımıdır. Eşey feromonları kur yapma davranışının en önemli komponentidir. Dişilerde döllenmeyi etkiler ve böylece türlerin bozulmadan doğru bir şekilde saklanmasında esas element olarak görev almaktadır. 44

47 Eşeysel seçilim işlemlerindeki hiyerarşi, türler arası (türdeş) çiftleşmeyi maksimuma çıkartan önemli bir esastır. Metastriate larda cinsel aktivite kanla beslenme sırasında konak üzerinde olurken, konak dışında çiftleşme beslenmemiş erginlerde olmaktadır. Metastriate keneler, nimfal evreden çıktıklarında eşeysel bakımdan gelişmemişlerdir ve bir konağa tutunana ve beslenmeye başlayana kadar da aynı kalmaktadırlar. Beslenme başladığında spermatogenez ve oogenez başlar ve bunu feromon salgılanması takip eder. 3 farklı eşey feromonu tanımlanmıştır. 1) Attractant eşeysel feromonları (ASP) 2) Mounting eşeysel feromonları (MSP) 3) Genital eşeysel feromonları (GSP) (Sonenshine 2004) Allomonlar Bilgi taşıyan bileşik ya da karışımlardır. Bir türün bireyleri tarafından başka türün bireylerine etki etmek amacıyla salınmaktadırlar. Kenelerden salınan ve karınca predatörlüğünü engelleyen hidrokarbon salınımı buna örnektir (Sonenshine 2004). D. variabilis gibi keneler özellikle ayaklarla dorsalateral yüzeye tutunduklarında hidrokarbon esaslı skualen bakımından zengin sıvılar salgılamaktadırlar (Yoder vd. 1993a, Yoder ve Domingus 2003). Salgının miktarı azımsanmayacak derecededir. Yaklaşık değeri kenenin vücut ağırlığının % 2 si kadardır. Beslenmemiş ergin kenelerin (D. variabilis ya da Amblyomma americanum), ateş karıncaları (Solenopsis invicta) tarafından saldırıya uğrandığında, prdeasyondan korunmaları için mumsu bir madde salgıladıkları gözlemlenmiştir. 45

48 Savunmada kullanılan mumsu maddelerin azalması ya da hareketsizlik (örneğin doymuş kene) keneleri karıncalara karşı savunmasız hale getirmektedir (Yoder vd. 1993b). Prostraite keneler, I. scapularis ya da argasid keneler, Ornithodoros moubata, geniş dermal salgı bezleri olmayanlar, yiyecek arayan karıncalar tarafından saldırıya uğrayıp ve parçalara ayrılmaktadırlar. Böcekler (Tenebrio molitor), un böceği, karşılaştığı kenelere saldırır ve onları yer. Karıncalar da böcekleri yemektedir. Bundan dolayı karıncalar hem kenelerle hem böceklerle birlikte bulunduğunda, böceklerdeki karınca predasyonu, aksi halde böcekler tarafından yenecek olan birçok keneyi korur veya kurtarır. Görünüşe göre keneler, öncü bileşiklerden skualenin sentezini yapma kabiliyetinden yoksunlardır ve bunun yerine kanla beslenme sırasında bunu konaklarından elde etmektedirler. Kene bu bileşiği % 25 e çıkana kadar çok miktarda geniş dermal bezlerde tutmaktadır. Kene savunmasında tanımlanan diğer hidrokarbon salgılar, (C 20, C 24 ve metil dallı C 25 alkan) keneleri karınca saldırısından koruyan skualen kadar etkilidir. Bu şunu belirtir: hidrokarbon esaslı olduğu için allomon fonksiyonu göstermektedirler. Diğer kimyasallar da savunma kimyasalı olarak rol oynayabilmektedir (Sonenshine 2004). Skualenden yoksun olan larval keneler, karıncaların predasyonundan korunurlar, bu da gösterir ki skualen tek kene allomon bileşiği değildir (Yoder vd. 1997). Bugüne kadar başka savunma bileşiği tanımlanmamıştır. Kene savunma salgıları kötü repellent kokusuna sahip değillerdir. Kene savunma salgıları predatörlerden kaçmada rol oynamasından ziyade geçici olarak predatör saldırganlığını etkisiz hale getirmektedir. İlginç bir şekilde kene allomonlarının özellikleri böcek allomonlarının çoğunluğuyla karşılaştırılabilmektedir (Blum 1985). 46

49 Kairomonlar Bilgi taşıyan bileşik ya da karışımlardır. Bir türün bireyleri tarafından salınıp diğer bir türün bireyleri tarafından tespit edilmektedirler. Genelde kairomonlar omurgalılarda görsel işaretlerle, vücut sıcaklığıyla ve hatta seslerle bile daha etkili hale gelmektedir (Sonenshine 2004). Kairomonlar, olası konaklardan yayılan bileşiklerdir. Örneğin; hayvanın nefesindeki CO 2, konağın derisindeki NH 3, laktik asit gibi bileşikler ya da vejetasyonda geçip giden hayvanlardan depolanan bileşiklerdir. Bunlar kenenin iştahını (doğal eğilimini) uyarmaktadır. Muhtemelen en iyi bilinen kairomonlar, konak arayan keneleri çeken, CO 2 ve NH 3, genellikle hayvanın nefesinde bulunan bileşikler. A. variegatum (Tropical bont ticks), ortamdaki CO 2 seviyesinin artmasıyla dinlenme yerindeyken uyarılmaktadır (Steullet ve Guerin 1992a). Bu kene türü için ve diğer birçok kene türü için CO 2 uyarıcı bir maddedir. Amonyağın da keneleri çektiği bilinmektedir (Haggart ve Davis 1981). CO 2 ve NH 3 e ek olarak lipit skualen insan derisinde üre, bütrik asit ve laktik asitle bulunan ana bileşiktir (Yoder vd. 1998). İnsan teri, alifatik karboksilik asit bakımından zengindir. Karboksilik asitin bir sınıfı olan C 4 - C 6, 2-oxocarboksilic asitleri sivrisinekler (Anopheles gambiae) için oldukça çekicidir (Healy ve Halket 2002). Farklı konaklardan elde edilen kokuların karışımının I.ricinus ve Boophilus microplus ta çekici olduğu bulunmuştur. Sığırların kokularından elde edilen fenolik kısımlar B. microplus u uyarırken, I.ricinus u uyarmamaktadır. Kenede, kokular tek başına, karışık ve doğal konak kokusuna benzeyen kokular kadar çekici değildir. Sığır kokusunda bulunan 2 tane belli bileşik, 1-okten-3-ol ve o-nitrofenol, sığır kokusunda tipik olarak bulunmaktadır. B.microplus ta, I.ricinus a göre daha güçlü bir cevaba yol açmaktadır (Osterkamp vd. 1999). 47

50 I. scapularis (Black legged ticks) dişileri ve erkekleri, beyaz kuyruklu geyiklerin (Odocoileus virginianus) ayak bileklerindeki kıllardaki ve parmak arasındaki, salgı bezlerinin içeriğiyle temas edince toplanma cevabı göstermektedirler. Geyiklerin preorbital salgı bezlerinden elde edilen içerikler, I. scapularis in dişileri arasında güçlü bir toplanma cevabı oluşturmaktadır (Carroll vd. 1996). Benzer cevap Ixodes neitzi de de gözlemlenmiştir (Rechav ve Whitehead 1978) Synomonlar Başka bir türün bireyleriyle iletişim kuran bir türün bireylerinden üretilen semiokimyasallardır. Yayan ve kabul eden için uygun cevabı harekete geçirmektedirler. Synomonlar, Lepidoptera da iyi bilinmesine karşılık, belki diğer Arthropodlar da da, kenelerde bildirilmemiştir (Evenden vd. 1999) Semiokimyasalların keneler tarafından algılanması Keneler de diğer hayvanlar gibi birçok algısal organ taşımaktadırlar. Bunlar kenelere çevrelerindeki kimyasalları algılama imkânı vermektedir. Bunun yanı sıra, kabul edilen bilgiye cevap ve nöral ağlar tarafından çevirme işlemi için de olanak sağlamaktadır. Keneler özelleşmiş kemosensör sensillalarına göre çevrelerindeki kimyasal bileşikleri algılamalarına göre sınıflandırılmaktadır. Böylece iki tane ana kemosensilla tipi ortaya çıkmaktadır. Bunlar: 1) Olfactory sensilla (olfaktör) 2) Gustatory sensilla Keneler ön ayaklarını, çevrelerini araştırırken ya da konaktan gelen uyarılara karşı cevapta uzatmaktadırlar. Bu davranış, ön ayaklarda tarside (son kısım) yer alan koku sensillalarıyla kokuların tespitine olanak sağlamaktadır. 48

51 Koku sesillaları haller organında bulunmaktadır. Bu çıkıntılı duyu organı tarsusun dorsal yüzeyindedir, diğerleri ise bu yapının anterior ve pasterior kısımlarında bulunmaktadır. Single wall (tek duvarlı) koku sesillaları yüksek büyütmeli SEM de bakılınca, bütün yüzeyinde bulunan çok sayıdaki küçük porlarıyla dikkati çekmektedir. Porlar direkt lenf boşluğuna açılırlar, içerisinde sensilyum (olfaktör duyu almacı) barındırır ve bu sensilyum atmosferde absorbe edilen bileşikleri yüzeyden iç kısıma taşımakta ve sinir impulslarını üreten dendiritleri uyarmaktadır. Haller organının ön tarafındakiler, belirgin sert kıl şekildeki diğer sensillalardır. Aralarında en az biri koku sensilyumudur. Bu büyük porlu koku sensillası eşeysel feromonunu tespit etmektedir. Bunlar 2,6-diklorofenol ve diğer yerine geçen fenollerdir. Haller organı birkaç tane görünür setiform sensilla ile çevrili fonksiyonel olarak farklı nöronları sunmaktadır. Örneğin; Rhipicephalus sanguineus ta NH 3, tarsustaki 2 sensillayla tespit edilir. 1 tanesi enterior çukurda, diğeri ise haller organının distalinde 4 tane sensillanın kümeleşmesinden oluşmaktadır. Amblyomma americanum da 2,6- diklorofenol geniş büyük porlu koku sensillalarıyla (AP1= Haller organının anterior çukurunda bulunur, etrafı diğer sensillalarla çevrilidir, koku sensilyumu, kalın kıl şeklindedir) tespit edilmektedir. Diğer nöronlar CO 2 i tespit etmektedir. A. variegatum da haller organı sensillaları H 2 S i de tespit etmektedir (Steullet ve Guerin 1992b). CO 2 in koku konsantrasyonlarındaki farktan dolayı 2 tip sensillayla tespit edilebilmektedir. A. variegatum 2 tane CO 2 duyu reseptörüne sahiptir. Biri CO 2 tarafından uyarılan diğer CO 2 tarafından inhibe edilen. İkisi de phasic-tonic (uyarıcı faz) cevaplarıdır. Aynı zamanda keliseral dijitlerinin kesici uçlarında sensilla taşımaktadırlar. Papillaya (B. microplus) ya da mekanoreseptör olan konik çukurlara (D. variabilis) ek olarak sensör nöronları tarafından sinirle donatılmış olan porlar bulunmaktadır. Keliseral dijitler, NaCl, ATP ve gluttayon bileşiklerinin konak kanında normal olarak bulunan fizyolojik konsantrasyonlarından sorumludur. Bu fagostimülantların tespitine ek olarak 49

52 seksüel olarak aktif olan D. variabilis erkeklerinde keliseral dijitler aynı zamanda türdeş dişi vulvalarının ekstratlarına ve ekdizon (çiftleşmeye teşvik eden hormon) ve 20- hidroksiekdizonun fizyolojik konsantrasyonuna cevap vermektedir. Aksine, seksüel olarak aktif olan D. andersoni erkekleri 20-hidroksiekdizon a cevap verir ama ekdizona cevap vermez (Taylor vd. 1991). Keliseral dijitler çıkarıldığında, seksüel olarak aktif olan erkeklerle normal, değişiklik yapılmamış dişi kenelerle çiftleştirme denenmiştir. Erkekler ağız parçalarını dişilerin genital porlarına gömmüşlerdir fakat spermatofor oluşturmaya yetenekleri olmadığı görülmüştür ve çiftleşme başarısız olmuştur (Sonenshine vd. 1984). Bu bulgular, keliseral dijitlerin çiftleşmede, beslenme davranışında da olduğu gibi önemli rol oynadığını ileri sürmektedir. 50

53 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışmada, 2010 yılının nisan ayında Sorgun da (Yozgat) ve haziran ayında Çorum civarında yapılan arazi çalışmasından elde edilen kemirgen ve kene örnekleri kullanıldı. Toplamda 19 kemirgen ve 23 kene örneği elde edildi. Kemirgen örneklerinin yakalanması canlı yakalama kapanları ile yapıldı. Kapanlara hayvanı çekmek için yem olarak fıstık ve ekmek karışımı kullanıldı (Şekil a, b). Yakalanan hayvanlar laboratuvara getirildi. Kemiricilerde kene kontrolü yapıldı. Kene olan hayvanlardan, ince uçlu pens kullanılarak keneleri alındı. Keneler, içerisinde %70 lik alkol bulunan ependorflara alındı. Daha sonra keneler Aydın, 2000, Karaer vd. 1997, Merdivenci, 1969 ye göre türleri teşhis edildi. Kemiricilerin lokaliteleri, dış ölçüleri ve ağırlıkları kaydedildi. Kemirgenler teşhis edilip dış ölçümleri ve ağırlık tartımları yapıldı (Yiğit vd. 2006).. Daha sonraki çalışmalar için karaciğer, kalp, böbrek ve kas dokuları alınarak -70 C de bekletildi. Keneleri alınan hayvanlar müze materyali olacak şekilde tahnit edildi. Kan örnekleri alınarak 2500 rpm de 5 dakika çevrilerek serumlarına ayrıldı ve serumları -70 C de ELISA testinde kullanılmak üzere ependorflarda saklandı. Şekil 3.1 Araziye yerleştirilcek kapanlar hazırlanırken (Nisan 2010) 51

54 Şekil 3.2.a Yuva ağızlarına yerleştirilmiş bir kapan (Nisan 2010) Şekil 3.2.b Araziye yerleştirilmiş kapanlar (Nisan 2010) 52

55 3.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ELISA solüsyonlarının hazırlanışı 1. % 1 lik Thiomersal (Merthiolate) Thiomersal (sodyum etil-civa tiyosalisilat), organik bir civa bileşiğidir lu yıllardan beri çoklu-doz aşıların içerisine eklenerek, enjektöre defalarca aşı çekilmesi yoluyla veya aşının üretimi sırasında oluşabilecek bakteri ve mantar kontaminasyonunu önlemek amacıyla koruyucu olarak kullanılmaktadır (Yurdakök 2006). 10 gr thiomersal 1000 ml. distile suda çözülür (Oda ısısında karanlık ortamda saklanır). 2. Coating Buffer (Kaplama Solüsyonu) 10 tablet PBS (Phosphate buffered saline) (ph konsantrasyonunun sabit kalmasına yardımcı oluyor) ve 10 ml % 1 lik Thiomerson 1000 ml distile suda çözünür (Oda ısısında saklanır, 5 gün içinde kullanılmalıdır). 3. Master Plate (Serum) Dilüent 10 tablet PBS, 50 gr Skim Milk Powder DIFCO (Nonspesifik protein bağlanmalarına engel olur), 10 ml % 1 lik Thiomersol, 5ml Triton 100 distile su ile 1000 ml ye tamamlanır (-20 C de saklanır). 4. Wash Buffer (Yıkama Solüsyonu) 10 tablet PBS, 10 ml % 1 lik Thiomersol, 1 ml Tween 20 (deterjan ya da emulsifier olarak uygulamada kullanılır) distile su ile 1000 ml ye tamamlanır. (Oda ısısında saklanır, 5 gün içerisinde kullanılmalıdır). 53

56 3.1.2 ELISA testinin yapılışı 1. Test için gerekli olan coating buffer, masterplate dilüent ve wash buffer yeterli miktarlarda hazırlandı. 2. Plaklarda A dan H ye kadar sıra bulunmaktadır ve her sırada da toplam 12 kuyucuk vardır. Plaklar 2 kısıma bölündü. A dan D ye kadar konulan serum örnekleri kontrol amaçlı olarak E den H ye kadar da aynı sırada kuyucuklara yerleştirildi. 3. Plaklar, 1/500 oranında 100 µl IgM ile kaplandı ve +4⁰C de 1 gece inkübe edildi. 4. Plaklar çalışma gününde oda ısısına getirildi ve 3 kere yıkandı. 5. Her bir kuyucuğa 100 µl dilüent kondu, plaklar negatif ve pozitif kısımlar olmak üzere 2 ye ayrıldı ve üzerlerine önceden 56 ⁰C de inaktive edilmiş olan serum örneklerinden 33 µl eklendi. 6. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı. 7. A dan D ye kadar 1/20 oranında dilüe edilmiş pozitif antijen ve E den H ye kadar da negatif antijenden 100 er µl konuldu. 8. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı. 9. 1/1000 oranında masterplate dilüentle dilüe edilmiş Anti-CCHF HMAF tan her kuyucuğa 100 er µl kondu. 10. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı /8000 oranında hazırlanan konjugatlardan her kuyucuğa 100 er µl kondu. 12. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletilir ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı. 54

57 13. En son aşama olarak hazırlanan 10 ml substrat karışımından her kuyucuğa 100 er µl kondu. 14. Nemli bir kaba konan plak yarım saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve renklenmeler gözlendi. 15. ELISA okuma cihazında, 410 nanometrede okundu ve renklenmenin şiddetine göre viral yük tayini yapıldı (Lab. Diagnosis of CCHF, Centers for Disease Control and Prevention Department of Healt and Human Services). 11 serum örneğine bu prosedüre göre test uygulandı. Konjugat olarak SIGMA Anti- Mouse IgG (whole molecule)- Peroxidase, Produced in goat, Afinity isolated antibody ve SIGMA Anti- Mouse IgM (whole molecule)- Peroxidase, Produced in goat, Afinity isolated antibody kullanıldı. Belirtilen oranlarda dilüe edilerek kullanıldı. Testin sonunda bütün plaklarda aynı derecede renklenme olduğu gözlemlendiğinden bu yöntemde değerlendirilebilecek bir sonuç elde edilemedi. Vector-Best VECTOCRIMEAN-CHF-IgG, Koltsovo, Russia hazır kiti ile ikinci deneme yapıldı. Prosedür şu şekilde uygulandı: 1. A-1 kuyusuna 100 µl serum dilüenti (SD) konuldu. Sonraki 2 kuyuya negatif kontrol ve sonraki kuyuya da pozitif kontrol kondu. 2. Geriye kalan her bir kuyuya 90 µl SD ve üzerilerine 10 µl önceden dilüe edilmiş serum örnekleri kondu. Serum örnekleri, önceden ependorflarda hazırlandı. Ependorflara 90 µl serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum örnekleri eklenerek tamamen karışması sağlandı. Burada rengin sarıya dönmesi beklendi. 3. Uygun boyutlarda kesilmiş bir filmle stripler kalandı ve nemli bir haznenin içine kondu. 60 dakika 37 C de inkübe edildi. 4. Strip sayısına göre yıkama solüsyonu hazırlandı ( 1 strip için; 2 ml PBS, 48 ml distile su, 2 strip için 4 ml PBS, 96 ml distile su). Elisa yıkama aletinde 4 yıkama yapıldı. 5. A-1 hariç her bir kuyuya 100 µl konjugat solüsyonu kondu. Negatif ve pozitif kontroller için hazır kitin içinden çıkan kendi konjugat solüsyonundan hazırlandı (1 strip için 0.1 ml konjugat, 1 ml konjugat dilüenti, 2 strip için 0.2 ml konjugat, 2 ml konjugat dilüenti). Fare örnekleri için ise, insanlar için kullanılan konjugat yerine 55

58 SIGMA Anti- Mouse IgG (whole molecule)- Peroxidase, Produced in goat, Afinity isolated antibody konjugatı kullanıldı. 6. A-1 kuyusuna 100 µl conjugate diluent (CD) kondu. 7. Striplerin üzeri filmle sıkı bir şekilde kaplanarak nemli bir haznenin içine konuldu ve 30 dakika 37 C de inkübe edildi. 8. İnkübasyonun bitmesine 5-10 dakika kala TMB (tetramethyl benzidine concentrate) solüsyonu hazırlandı (1 strip için 70 µl TMB 1 ml SB (substrate buffer) de, 2 strip için 140 µl TMB 2 ml SB de iyice dağıtılır). 9. İnkübasyon sonunda stripler önceden bahsedildiği gibi yıkandı. 10. Hazırlanan TMB solüsyonundan her bir kuyucuğa 100 µl pipetlendi ve karanlık bir ortamda 25 dakika C de inkübe edildi. 11. İnkübasyonun sonunda reaksiyonu durdurmak için her bir kuyuya 100 µl stopping reagent konuldu. 12. Durdurma reaksiyonundan dakika sonra ölçümler 450 nm de Elisa okuma cihazı ile yapıldı. Bu prosedüre göre yapılan ilk denemede, konjugat oranını ayarlamak adına sadece 1 örnek üzerinde çalışıldı. Konjugat 1:20000, 1: 30000, 1:40000 ve 1:50000 oranlarında dilüe edilerek tek bir strip ile çalışıldı. Deney sonunda 1:20000 oranında dilüe edilmiş konjugatın konduğu kuyudan 1:50000 oranında dilüe edilmiş konjugatın konduğu kuyucuğa doğru renklenmenin azaldığı gözlemlenmesi beklenirken renklenmelerin birbirine çok yakın olduğu görüldü. Bunun üzerine bu hazır kit ile yapılan ikinci denemede hem konjugat dilüsyon oranları azaltıldı hem de serumlar daha fazla dilüe edildi ve bu sefer 2 serum örneği kullanıldı. İlk denemedeki örneğin dilüsyonuna 1:70000, , 1: ve 1: şeklinde devam edildi. İkinci serum örneğinde ise denemeler şu şekilde yapılıdı; serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:70000, serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:100000, serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:120000, serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:150000, serum dilüesi 1:400, konjugat dilüesi 1:70000, serum dilüesi 1:400, konjugat dilüesi 1:100000, serum dilüesi 1:400, konjugat dilüesi 1:120000, serum dilüesi 1:00, konjugat dilüesi 1:

59 Serum dilüsyonları hazırlanırken 1:200 dilüsyon için 190 µl serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum, 1:400 dilüsyon için 390 µl serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum eklendi ve içerisinden 10 µl alınıp önceden 90 serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum konan kuyucuklara eklendi. Konjugat dilüsyonları hazırlanırken, 1:20000 dilüsyonu için 10 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:30000 dilüsyon için 15 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:40000 dilüsyon için 20 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:50000 dilüsyon için 25 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:70000 dilüsyon için 35 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1: dilüsyon için 50 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1: dilüsyon için 60 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1: dilüsyon için 75 ml PBS de 0.5 µl konjugat dağıtıldı. Bu deneme sonucunda bütün örneklerin serumlarının 1:400 oranında dilü edilmesine ve konjugat dilüsyonunun ise 1: olmasına karar verilerek yeni bir deneme yapıldı. Serum örnekleri konduktan sonra 1 saat olan inkübasyon süresi 2 saate çıkartıldı, konjugat ilavesinden sonra 30 dakika olan inkübasyon süresi 20 dakikaya düşürüldü ve yıkama sayıları 5 e çıkarıldı. Daha önceki denemelerde 2 serum örneğinin tükenmesi sonucunda bu deneme 9 serum örneği ile yürütüldü. Bu denemeler sonucunda kesin sonuçlar elde edilememesinden dolayı virüs tespiti için Real Time PCR denendi. Bu denemede Yozgat bölgesinden 2 Apodemus ve 1 Cricetulus migratorius olmak üzere 3 ve Çorum bölgesinden ise 1 tane Apodemus örneği kullanıldı. İlk önce serum örneklerinden RNA ekstraksiyonu yapıldı. Bu yöntemde QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit kullanıldı. Bu yöntemde şu aşamalar izlendi: 1. Liziz; 560 µl AVL Tampon+Carrier RNA karışımı 1.5 ml.lik ependorflara kondu µl örnek üzerlerine eklendi ve 15 sn vortekslendi 3. Oda ısısında 10 dk bekletildi 4. Spin santrifüj yapıldı 5. Örneğe 560 µl etanol eklendi ve 15 sn vortekslendi. 57

60 6. QIAamp spin kolonlu tüplere 5. aşamadaki tüp içeriğinden 630 µl aktarıldı ve 8000 rpm de 1 dk çevrildi. 7. QIAamp spin kolonu yeni 2 ml lik kapaksız tüpe konuldu ve önceki tüp atıldı. 8. QIAamp spin kolonu dikkatlice açıldı ve tüp içeriğinden 630 µl tekrar aktarıldı ve 8000 rpm de 1 dk çevrildi. 9. QIAamp spin kolonu yeni 2 ml lik kapaksız tüpe kondu ve önceki tüp atıldı. 10. QIAamp spin kolonu dikkatlice açıldı ve 500 µl AW1 tamponu eklenerek kapağı kapatıldı rpm de 1 dk çevrildi. 11. QIAamp spin kolonu yeni 2 ml lik kapaksız tüpe konuldu ve önceki tüp atıldı. 12. QIAamp spin kolonu dikkatlice açıldı ve 500 µl AW2 tamponu eklenerek kapağı kapatıldı rpm de 3 dk çevrildi. 13. QIAamp spin kolonu 1.5 ml lik tüplere kondu. 14. Tüpler dikkatlice açıldı ve 60 µl AVE tamponu eklendi rpm de 1 dakika çevrildi. Bunun sonucunda elde edilen RNA ekstraktı Real Time PCR da kullanıldı. PCR için Atra Diagnostics CCHV RT-PCR Kit 1.0 Hamburg, Germany hazır kiti kullanıldı. Kitin içinde bulunan Mater A ve Master B solüsyonlarından 15 er µl ve serum örneklerinden 10 µl alınarak PCR aletindeki striplere konuldu. PCR aleti olarak Real Time Qiagen Rotor-Gene Q kullanıldı. Real- Time PCR işlemi aşağıda gösterilen şartlar altında gerçekleştirildi (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1 Real Time PCR sıcaklık ve zaman koşulları Sıcaklık Zaman Denatürasyon 50 C 10 dakika Amplifikasyon 95 C 95 C 58 C 2 dakika 15 saniye 45 saniye 45 siklus 58

61 4. BULGULAR 4.1 Biyotoplar ve Kemiricilerde Kene Enfestasyonu Çorum yöresinde yapılan arazi çalışmalarında 2 tip biyotop saptandı. Bunlardan birisi tahıl üretimi yapılan veya mera olarak kullanılan step alanları diğeri ise orman (meşe meşçeresi) alanlarıdır. İlk arazi çalışması Nisan 2010 da Aşağı Cumafakılı Köyü (Sorgun/Yozgat) çevresindeki step karakterli arazide yapıldı (Şekil 4.1). Arazi içinde kuru dere yatakları ve söğütlükler de bulunmaktadır (Şekil 4.2 ve 4.3). Arazi çalışmalarında gece sıcaklığının eksi değerlere düştüğü, sabah arazideki suların donmuş olduğu, gündüz yapılan ölçümlerde toprak sıcaklığının 7 C olduğu belirlendi. Bu alanda yapılan çalışmada 10 örnek (4 tane Apodemus flavicollis, 3 tane Mus sp., 2 tane Microtus lydius ve 1 tane Cricetulus migratorius) canlı yakalandı. Kapanda ölmüş örneklerin üzerleri kene enfestasyonu olup olmadığı bakımından kontrol edildi. Canlı ve ölü örneklerin hiç birinde keneye rastlanmadı. Nisan ayında yapılan arazi çalışmasında kontrol edilen koyun sürülerinde kene enfestasyonunun çok düşük olduğu görüldü. Bu 10 örnekten 8 tanesinin kanı alınıp serumlarına ayrıldı. İkinci arazi çalışması Haziran 2010 da Çorum un kuzeyinde ve güneyinde 2 farklı lokalitede yapıldı (Şekil 4.1). Kuzeydeki lokalite step karakterli olup, güneydeki lokalite ise dere kenarında meşe ormanını içermektedir (Şekil 4.4 ve 4.5). Bu alanlarda yapılan çalışmalarda 9 örnek canlı olarak laboratuvara getirilmiştir (5 Apodemus flavicollis, 2 Microtus lydius, 2 Mus sp.) ve bunların 2 tanesi (Apodemus flavicollis) ölmüştür. 7 hayvandan kan alındı ancak 3 tanesi (Apodemus flavicollis) serumlarına ayrıldı. Arazi çalışmaları sırasında kenelerin genellikle farelerin göz çevresini ve kulağını tutunmak için tercih ettiği görülmüştür (Şekil 4.6, 4.7, 4.8). 59

62 Şekil 4.1 Lokalite 1: Yozgat/Sorgun/Aşağı Cumafakılı Köyü, Lokalite 2: Çorum, Sarmaşa yol kenarı, Lokalite 3: Çorum, Alaca yolu üzeri Şekil 4.2 Sorgun Aşağı Cumafakılı Köyü çevresinde kapan atılan bir tarla (Nisan 2010) 60

63 Şekil 4.3 Sorgun Aşağı Cumafakılı Köyü çevresinde kapan atılan çalılık bir bölge (Nisan 2010) Şekil 4.4 Çorum Sarmaşa Yolu kenarında kapan atılan çalılık alan ve tarla (Haziran 2010) 61

64 Şekil 4.5 Çorum Sarmaşa Yolu kenarında kapan atılan dere kenarı ve ormanlık alan (Haziran 2010) Şekil 4.6 Çorum arazisinde örneklenmiş göz bölgesinde kene bulunan bir Apodemus flavicollis 62

65 Şekil 4.7 Çorum arazisinde örneklenmiş kulağında ve sırtında kene bulunan bir Apodemus flavicollis Şekil 4.8 Çorum arazisinde örneklenmiş göz çevresinde kene bulunan Microtus lydius 63

66 Haziran 2010 da Çorum bölgesinden gelen hayvanlarda kene kontaminasyonu görülmüştür. Ölen hayvanlar da dahil olmak üzere 9 tane kemirgenin üzerlerindeki keneler alınmış, toplamda 23 kene elde edilmiştir. Keneler, içinde %70 lik alkol bulunan ependorflara alınmıştır. Bu keneler stereomikroskop altında incelenerek cins ve tür düzeyinde ayrıldılar. Apodemus flavicollis, Mus sp., Microtus lydius türlerine ait elde edilen kemirici örnekleri arasındaki kenelerin dağılımı şu şekilde belirlenmiştir: Elde edilen 7 Apodemus flavicollis örneğinin hepsinde de kenelere rastlandı. Bu keneler; Ixodes cinsinin larva ve nimf formları (Şekil 4.9,4.10, 4.11 ve 4.12), Haemaphysalis cinsinin nimf ve larva formları (Şekil 4.13, 4.14, 4.15 ve 4.16) şeklindeydi. Elde edilen 2 tane Microtus lydius türünden 1 tanesinde Ixodes in nimf formu olmak üzere 1 adet keneye rastlandı. Elde edilen 2 tane Mus sp. örneğinde ise keneye rastlanmadı. Kenelerin kemiriclere göre dağılımları çizelgede verilmiştir (Çizelge 4.1). Ayrıca karşılaştırma yapmak amacıyla Çorum un güneyinde koyunlardan keneler toplanmıştır. Toplamda 14 kene elde edilmiştir ve hepsinin Rhipicephalus cinsi oldukları tespit edilmiştir. Toplamda 1 erkek ve 1 dişi keneye rastlanmıştır. Şekil 4.9 Ixodes larvasının stereo mikrokop altında dorsal görüntüsü 64

67 Şekil 4.10 Ixodes larvasının stereo mikroskop altındaki ventral görüntüsü Şekil 4.11 Ixodes nimfinin stereo mikroskop altında dorsalden görüntüsü 65

68 Şekil 4.12 Ixodes nimfinin stereo mikroskop altında ventralden görüntüsü Şekil 4.13 Haemaphysalis larvasının stereo mikroskop altındaki dorsal görüntüsü 66

69 Şekil 4.14 Haemaphysalis larvasının stereo mikroskop altındaki ventral görüntüsü Şekil 4.15 Haemaphysalis nimfinin stereo mikroskop kop altında dorsalden görüntüsü 67

70 Şekil 4.16 Haemaphysalis nimfinin stereomikroskop altında lateralden görüntüsü Çizelge 4.1 Toplanan kemirgenlerden elde edilen kene tür, sayı ve cinsiyetleri Kemirgen Türü Kene Türü Larva/Nimf Sayısı Mus sp. Kene görülmedi - - Apodemus Kene görülmedi flavicollis - - Yozgat- Sorgun = Lokalite 1 (Nisan 2010) Microtus lydius Kene görülmedi - - Cricetulus Kene görülmedi - - migratorius Mus sp. Kene görülmedi - - Çorum-Alaca Apodemus Haemaphysalis 3 larva Yolu, Sarmaşa flavicollis 1 nimf 4 Yol Kenarı = Lokalite 2, Ixodes 4 larva Lokalite 3 14 nimf 18 (Haziran, 2010) Microtus lydius Ixodes 1 nimf 1 Toplam 7 larva 16 nimf 23 68

71 4.2 Kemirgenlerde ELISA ve Real Time PCR ile KKKAV nin Araştırılması Örneklerin serumlarının dilüsyonu 1:400 oranında ve konjugat dilüsyonu ise 1: oranında hazırlandı. 9 örneğin serumu ELISA ile çalışıldı. Bütün örneklerde aşırı pozitif reaksiyon gözlemlenmesi üzerine sonuçlar güvenli bulunmadı. Bunun üzerine Real Time PCR denendi. Bu denemede Yozgat bölgesinden 2 Apodemus ve 1 Cricetulus migratorius olmak üzere 3 ve Çorum bölgesinden ise 1 tane Apodemus örneği kullanıldı. Real Time PCR sonucunda test edilen bu 4 örneğin de negatif sonuç verdiği görülmüştür. Buna göre çalışılan kemirgen örneklerinin serumlarında virüs kontaminasyonunun olmadığı saptandı. 69

72 5. TARTIŞMA Merdivenci (1958, 1962, 1967, 1968, 1970) nin yaptığı çalışmalarda; Arvicola terrestris hintoni, Crocidura sp. Meriones blackeri intraponticus, Citellus citellus ve Microtus sp. gibi kemiricilerde Ixodes laguri nin; Microtus sp., Citellus sp., Arvicola sp. de Dermacentor marginatus ve bir Rattus cinsine ait bireyde Haemaphysalis parva ve Haemaphysalis sulcata nın varlığı tespit edilmiştir. Sert vd. (2001) tarafından Ankara, Bursa, Diyarbakır, Siirt ve Urfa illerinde yürütülen çalışmada 2 tane Microtus guantheri de 1 adet Haemaphysalis spp larvasına, 1 adet Ixodes spp. larvasına ve 10 tane nimfine, yine 2 tane Microtus arvalis te 1 adet larva ve 1 adet nimf olmak üzere Ixodes spp. ye rastlanılmıştır. Bununla uyumlu olarak bu çalışmada yakalanılan Microtus lydius türünde 1 adet Ixodes nimfine rastlandı. Sert vd. (2001) tarafından yapılan aynı çalışmada 1 adet Apodemus sylvaticus ta 8 adet Haemaphysalis spp. nimfi belirtilmiştir. Elde edilen Apodemus spp. örneğinde ise 1 adet Ixodes nimfine rastlanılmıştır Bizim çalışmamızda da bununla uygunluk gösterir bir biçimde yakalanan 5 adet Apodemus flavicollis örneğinde Haemaphysalis in 3 larva ve 1 nimfine ve Ixodes in 4 larva ve 14 nimfi saptandı. Sert vd. (2001) tarafından yapılan çalışmada kemiriciler üzerinde Ixodes larva ve nimfleri yanında Argas soyuna bağlı larvalar da görülürken bu çalışmada kemiriciler üzerinde sadece Ixodes soyuna ait keneler gözlemlenmiştir. Aydın ve Bakırcı nın (2007) Türkiye kenelerinin dağılımı üzerine yaptığı çalışmada Ixodes hexagonus un Marmara Bölgesi nde ve Ixodes ricinus un ise İç Anadolu ve Güneydoğu Anadolu bölgeleri hariç diğer tüm bölgelerde yayılış gösterdiği belirtilmiştir. Haemaphysalis numidiana hariç, Hae. concinna, Hae. inermis, Hae. parva, Hae. punctata ve Hae. sulcata nın ise Çorum un da içerisinde bulunduğu Karadeniz Bölgesi nde bulunduğu belirtilmiştir. Bizim çalışmamızda da Çorum ilinden gelen kemirici örneklerinde Haemaphysalis in larva ve nimf formları saptanmıştır. 70

73 Balashov un (1972) çalışmasında kenelerin hayvanlarda yapışmak için kulak kepçesinin iç ve dış kısmını, boyun altını, anal ve perianal bölgeler ile sırt ve kuyruk bölgelerini tercih ettiği görülmüştür. Bu çalışmada da kenelerin yapışmak için kemiriclerin göz çevresini, kulaklarını ve sırt bölgesini tercih ettikleri gözlemlenmiştir. Qing vd. (2003) tarafından Çin de koyun serumlarında yapılan çalışmada ELISA testi ile IgG tespitinde konjugat 1:1000 dilüsyon oranında kullanılmıştır. Asya, Avrupa ve Afrika nın çeşitli bölgelerinde at, eşek, keçi ve domuzların serumlarında KKKAV ye karşı antikor bulunduğu gösterilmiştir (Watts vd. 1988). Hoogstraal ın yaptığı çalışmalar kuşların çok fazla sayıda KKKAV enfekteli kenelerle muamele edilse bile KKKA viremisine karşı dayanıklı olduklarını göstermiş olmasına rağmen Kazakistan daki 428 tavuk ve ördek serum örneğinde 1 tane KKKAV ye karşı antikor tespit edildiği ayrıca saksağan serumlarında da (Pica pica) KKKAV ye karşı antikorlar saptandığı bildirilmiştir (Hoogstraal 1979, Shepherd vd. 1987a,b). Bu çalışmada kemirici örneklerinden elde edilen serumlarla yapılan ELISA testlerinin verimli sonuçlar vermemesi nedeniyle yapılan Real Time PCR testi de negatif sonuç vermiştir. 71

74 6. SONUÇ Çorum un güneyinden Yozgat il sınırları içinden Nisan 2010 da, Mus sp., Apodemus flavicollis, Cricetulus migratorius, Microtus lydius türlerine ait toplam 10 örnek elde edilmiştir. Bu örneklerin hiçbirinde keneye rastlanmamıştır. Nisan ayında yakalanan kemirgenlerde kene enfestasyonu olmaması mevsimle ilgili olabilir. Çorum un güneyinde Alaca Yolu ve Çorum un 10 km kuzeyinden Apodemus flavicollis, Mus sp., Microtus türlerine ait toplam 10 örnek yakalanmıştır. Getirilen Apodemus flavicollis, Mus sp., Microtus lydius cinslerine ait elde edilen kemirici örneklerinden Apodemus flavicollis örneklerinin hepsinde, 2 tane Microtus lydius türünden 1 tanesinde keneye rastlandı. Apodemus flavicollis te Ixodes cinsinin larva ve nimf formları, Haemaphysalis cinsinin nimf ve larva formları, Microtus lydius ta ise Ixodes cinsinin nimf formuna rastlanmıştır. Elde edilen 2 tane Mus sp. örneğinde ise keneye rastlanmamıştır. KKKAV nin taşıyıcı vektörü olduğu düşünülen Hyalomma cinsine ait kenelere incelenen örneklerde rastlanılmadı. Kemirgenlerden canlı olanlardan kanlar alınmış serumlarına ayrılmış ve kene kontaminasyonuna bakılmıştır. Centers for Disease Control and Prevention Department of Healt and Human Services protokolüne göre ELISA testi yapılmış ve verimli sonuçlar elde edilememiş ve Vector-Best VECTOCRIMEAN-CHF-IgG, Koltsovo, Russia hazır kiti ile denemeler yapılmıştır. Bunların sonucunda da virüsün varlığına dair kesin sonuçlar elde edilememiş ve Real Time PCR yöntemine gidilmiştir. Bunun sonucunda da örneklerde KKKAV varlığına rastlanmamıştır. Bütün örnekler negatif sonuç vermiştir. Çorum ili ve çevresinin KKKA hastalığı bakımından önem taşıdığı düşünülürse buradaki çalışmalarda örnek sayılarının artırılıp elde edilen bu verilerin doğruluğunun araştırılması gereksinimi vardır. 72

75 KAYNAKLAR Allan, S.A. and Sonenshine, D.E Evidence of an assembly pheromone in the black-legged deer tick, Ixodes scapularis. Journal of Chemical Ecology, 28, Alonso-Diaz, M.A., Garcia, L., Galindo-Velasco, E., Lezama-Gutierrez, R., Angel- Sahagün, C.A., Rodriguez-Vivas, R.I. and Fragoso-Sanchez, H., Evaluation of Metarhizium anisopliae (Hyphomycetes) for the control of Boophilus microplus (Acaria: Ixodidae) on naturally infested attle in the Mexican tropics. Veterinary Parasitology, 147, Anderson, J.F. and Magnarelli, L.A Biology of Ticks. Infect Dis Clin N Am, 22, Anonim, Sağlık Bakanlığı. Bulaşıcı Hastalıklar Bölümü, Ankara. Ayasse, M., Paxton, R.J. and Tengo, J Mating behavior and chemical communication in the order Hymenoptera. Annual Review of Entomology, 46, Aydın, L Güney Marmara Bölgesi ruminantlarında görülen kene türleri ve yayılışları. Parazitol Derg, 24, Aydin, L. and Bakirci, S Geographical distribution of ticks in Turkey, Parasitol, 101 (2); Bakır, M. ve Elaldı, N Kırım-Kongo Hemorajik Atesi, Ankem Dergisi, 20, Balashov, Y.S Bloodsucking ticks (Ixodoidea)-vectors of diseases of man and animals. Miscellaneous Publications of the Entomological Society of America, 8, Barci, L.A.G Biological control of the cattle tick Boophilus microplus (Acari, Ixodidae) in Brazil. Arquivos Instuto Biologico, 64, , Sao Paulo. Bezuidenhout, J.D. and Stutterheim, C.J A critical evaluation of the role played by the red-billed oxpecker Buphagus erythrorhychus in the biological control of ticks. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 47, Bittencourt, V.R.E.P., Massard, C. L. and Lima, A. F The action of Metarhizium anisopliae, at eggs and larvae of tick Boophilus microplus. Revisto da Universidade Rural Serie Ciencias da Vida, 16, Bittencourt, V.R.E.P., Souza, E. J., Peralva, S.L.F.S. and Reis, R.C.S., Efficacy of the fungus Metarhizium anisopliae (Metschnikoff, 1887) Sorokin, 1883 in field test with bovines naturally infested with the tick Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae). Revista Brasileiro de Medicina Veterinaria, 21, Bittencourt, V.R.E.P Trials to control South American ticks with entomopathogenic fungi. Annals of the New York Academy of Science, 916, Blum, M.S Fundamentals of Insect Physiology, Department of Entomology, University of Georgia, Athens, USA, 598, New York. Boichev, D. and Rizvanov, K Relation of Botrytis cinerea Pers. to ixodid ticks. Zoologicheskii Zhurnal Akademija Nauk USSR 39,

76 Brown, R.S., Reichelderfer, C.F. and Anderson, W.R., An endemic disease among laboratory populations of Dermacentor andersoni (=D. venustus) (Acarina: Ixodidae). Journal of Invertebrate Pathology, 16, Brum, J.G.W., Faccini, J.L.H. and Do Amaral, M.M a. Infection in engorged females of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). II. Histopathology and in vitro trials. Arquivos Brasileiro Medicina Vetrinaria Zootecnologia, 43, Brum, J.G.W., Teixeira, M.O. and Da Silva, E. G. 1991b. Infection in engorged females of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). I. Etiology and seasonal incidence. Arquivos Brasileiro de Medicina Veterinariai Zoologia, 43, Brum, J.G.W. and Teixeira, M.O Acaricidal activity of Cedea lapagei on engorged females of Boophilus microplus exposed to the environment. Arquivos Brasileiro de Medicina Veterinariai Zoologia, 44, Butenko, A. and Karganova, G.G Crimean-Congo Hemorrhagic Fever in Russia and Other Countries of the Former Soviet Union. Ergonul O, Whitehouse CA, eds. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever: A Global Perspective, Butt, T. M., Jackson, C.W. and Magan, N Fungi as Biocontrol Agents Progress, Problems and Potential. Oxford, UK, CABI. Camacho, E.R., Navaro, G., Rodriguez, R.M. and Murillo, E.Y Effectiveness of Verticillium lecanii against the parasitic stage of the tick Boophilus microplus (Acari: Metastigmata: Ixodidae). Revista Colombiana Entomologia, 24, Camicas, J.L., Cornet, J.P., Gonzalez, J.P., Wilson, M.L., Adam, F. and Zeller, H.G Crimean-Congo hemorrhagic fever in Senegal. Latest data on the ecology of the CCHF virus. Bull Soc Pathol Exot, 87, Capua, I Crimean- congo haemorrhagic fever inostriches of the european union. Av. Pathol., 27, Carroll, J.F., Mills, G.D. and Schmidtmann, E.T Field and laboratory responses of adult Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) to kairomones produced by whitetailed deer. Journal of Medical Entomology, 33, Castineiras, A., Jimeno, G., Lopez, M. and Sosa, L.M Effect of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae (Fungi, Imperfecti) and Pheidole megacephala (Hymenopthera, Formicidae) on eggs of Boophilus microplus (Acarina: Ixodidae). Revista Salud Animal, 9, Castro, A. B. A., Bittencourt, V. R. E. P., Daemon, E. and Viegas, E. C Efficacy of the fungus Metarhizium anisopliae (isolate 959) on the tick Boophilus microplus in a stall test. Revista Universidade Rural, Serie Ciencias da Vida 19, Causey, O.R., Kemp, G.E., Madbouly, M.H. and David-West, T.S Congo virus from domestic livestock, African hedgehogs, and arthropods in Nigeria. Am. J. Trop. Med. Hyg., 19, Ceraul, S.M., Sonenshine, D.E. and Hynes, W.L Resistance of the tick Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae) following challenge with the bacterium Escherichi coli (Enterobacteriales: Enterobacteriaceae). Journal of Medical Entomology, 39, Charrel, R.N., Attoui, H., Butenko, A.M., Clegg, J.C., Deubel, V., Frolova, T.V., Gould, E.A., Gritsun, T.S., Heinz, F.X., Labuda, M., Lashkevich, V.A., Loktev, V.A., Lvov, D.V., Mandl, C.W., Niedrig, M., Papa, A., Petrov, V.S., Plyusnin, A., Randolph, S., Suss, J., Zlobin, V.I. and de Lamballerie, X Tick-borne virus diseases of human interest in Europe. Clin Microbiol Infect, 10,

77 Cherepanova, N.P Fungi which are found on ticks. Botanicheskii Zhurnal, 49, Chumakov, M.P., On 30 years of investigation of Crimean hemorrhagic fever. Tr. Inst. Polio Virusn. Entsefalitov Akad. Med., Nauk SSSR 22, 5 18 Correia, A.C.B., Fiorin, A.C., Monteiro, A.C. and Verissimo, C.J Effects of Metarhizium anisopliae on the tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) in stabled cattle. Journal of Invertebrate Pathology, 71, Da Costa, G.L., Sarquis, M.I.M., De Moraes, A.M.L. and Bittencourt, V.R.E.P Isolation of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae var. anisopliae from Boophilus microplus tick (Canestrini, 1887), in Rio de Janeiro State. Micropathologia, 154, , Brazil. De Bach, P. and Rosen, D Biological Control by Natural Enemies. 2nd Edn. New York, Cambridge University Pres. Derviş, E., Keneler ve Dermatoloji. Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Dermatoloji Kliniği, Türkderm, 43, 132-8, İstanbul - Türkiye. Despommier, D.D., Gwadz, R.W., Hotez, P.J., Knirsch, C.A Parasitic Diseases. 4.ed., Apple Trees Prod, New York. Dohm, D.J., Logan, T.M., Linthicum, K.J., Rossi, C.A. and Turell, M.J., Transmission of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by Hyalomma impeltatum (Acari:Ixodidae) after experimental infection. J Med Entomol., 33, Dreyer, K., Fourie, L.J. and Kok, D.J Predation of livestock ticks by chickens as a tick-control method in a resource-poor urban environment. Ondersterpoort Journal of Veterinary Research, 64, Drosten, C., Kummerer, B.M., Schmitz, H. and Gunther, S Molecular diagnostics of Viral Hemorrhagic fevers. Antiviral Res., 57(1-2); Dusba Bek, F., Sımek, P., Jegorov, A. and Troska, J Identification of xanthine and hypoxanthine as components of assembly pheromone in excreta of argasid ticks. Experimental and Applied Acarology, 11, Elliott, R.M., Schmaljohn, C.S. and Collett, M.S Bunyaviridae genome structure and gene expression. Curr Top Microbiol Immunol., 169, Ergonul, O., Celikbas, A., Dokuzoguz, B., Eren, S., Baykam, N. and Esener, H Characteristics of Crimean-Congo hemorrahagic fever in a recent outbreak in Turkey and the impact of oral ribavirin therapy. Clin Infect Dis., 39(2); Ergonul, O a. Crimean-Congo haemorrhagic fever. Lancet Infect Dis., 6, Ergonul, O b. Türkiye'de Yeni Bir Enfeksiyon: Kırım Kongo Kanamalı Ateşi, An Emerging Infection in Turkey: Crimean Congo Hemorrhagic Fever. Marmara Ü. Tıp Fak. Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji AD., 15 (6); 98. Ergonul, O. and Whitehouse, C.A Crimean Congo Hemorrhagic Fever: A Global Perspective. Springer publications. Estrada Pena, A., Gonzalez, J. and Casasolas, A The activity of Aspergillus ochraceus (Fungi) on replete females of Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in natural and experimental conditions. Folia Parasitologica, 37,

78 Evenden, M.L., Judd, J.R. and Borden, J.H A synomone imparting distinct sex pheromone communication channels for Choristonuera rosaceana (Harris) and Pandemis limitata (Robinson) (Lepidoptera: Tortricidae). Chemoecology, 9, Fauvergue, X., Hopper, K.R. and Antolin, M.F Mate finding via a trial sex pheromone by a parasitoid wasp. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 92, Flexner, J.L. and Belnavis, D.L., Microbial insecticides. In Biological and Biotechnological Control of Insect Pests (ed. Rechcigl, J. E., Rechcigl, N. A.), pp , Boca Raton, Florida, USA. Gill, S.S., Cowles, E. A. and Pietrantonio, P.V., The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins. Annual Review of Entomology, 37, Gindin, G., Samish, M., Alekseev, E. and Glazer, I The susceptibility of Boophilus annulatus (Ixodidae) ticks to entomopathogenic fungi. Biocontrol Science and Technology 11, Gindin, G., Samish, M., Zangi, G., Mishoutchenko, A. and Glazer, I The susceptibility of different species and stages of ticks to entomopathogenic fungi. Experimental and Applied Acarology 28, Ginsberg, H.S., Lebrun, R.A., Heyer, K. and Zhioua, E Potential nontarget effects of Metarhizium anisopliae (Deuteromycetes) used for biological control of ticks (Acari: Ixodidae). Environmental Entomology, 31, Glazer, I a. Survival biology. In Entomopathogenic Nematology (ed. Gaugler, R.), pp Oxford, UK, CABI. Glazer, I., Alekseev, E. and Samish, M b. Factors affecting the virulence of Entomopathogenic Nematodes To Engorged Female Boophilus annulatus. Journal Of Parasitology, 87, Gorshkova, G.J Reduction of fecundity of ixodid ticks females by fungal infection. Vestnik Leningradskogo Universiteta Seria Biologia, 21, Gothe, R. and Neitz, A.W.H Investigation into the participation of male pheromones of Rhipicephalus evertsi evertsi during infestation. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 52, Gozalan, A., Akin, L., Rolain, J.M., Tapar, F.S. Oncül, O., Yoshikura, H., Zeller, H., Raoult, D. and Esen, B Epidemiological evaluation of a possible outbreak In And Nearby Tokat Province. Mikrobiyol Bul, 38, Graf, J. F Ecologie and ethology d Ixodes ricinus L. en Suisse (Ixodoidea: Ixodidae). 2 e partie. Bulletin de la Socie te Entomologuiqe Suisse, 51, Gratz, G. N., The vector- and rodent- borne diseases of Europe and North America: their distribution and public healt burden. Cambridge. Grenacher, S., Kro Ber, T., Guerin, P. M. and Vlimant, M Behavioral and Chemoreceptor Cell Responses Of The Tick, Ixodes ricinus To Its Own Faeces And Faecal Constituents. Experimental and Applied Acarology, 25, Guangfu, T Experiment of infection and killing of Hyalomma detritum with fungi. Journal of Veterinary Sciences (China), 7, Guerra, R.M S.N.C., Teixeira Filho, W.L., Costa, G. L. and Bittencourt, V.R.E.P Fungus isolated from Rhipicephabus sanguineus (Acari: Ixodidae), Cochliomya macellaria (Diptera: Muscidae) and Musca domestica (Diptera: Muscidea), naturally infected on Seropedica. Ciencia Animal, 11,

79 Haggart, D.A.and Davis, E.E Ammonia-sensitive neurons on the first tarsi of The Tick, Rhipicephalus sanguineus. Journal of Insect Physiology, 26, Hajek, A.E. and ST. Leger, R.J Interaction between fungal pathogens and insect hosts. Annual Review of Entomology, 39, Hassan, S.M., Dipeolu, O.O., Amoo, A.O. and Odhiambo, T.R Predation on livestock ticks by chickens. Veterinary Parasitology, 38, Hassan, S.M., Dipeolu, O.O. and Munyinyi, D.M Influence of exposure period and management methods on the effectiveness of chickens as predators of ticks infesting cattle. Veterinary Parasitology, 43, Hassanain, M.A., El Garhy, M.F., Abdel-Ghaffar, F.A., El-Sharaby, A. and Megeed, K. N.A Biological control studies of soft and hard ticks in Egypt, I. The effect of Bacillus thuringiensis varieties on soft and hard ticks (Ixodidae). Parasitology Research, 83, Hazır, S., Kaya, H.K., Stock, S.P. and Keskün, N., Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) for Biological Control of Soil Pests. Turk J. Biol., 27, Healy, T.P., Copland, M.J., Cork, A., Przvborowska, A. and Halket, J Landing responses of Anopheles gambiae elicited by oxocarboxylic acids. Medical and Veterinary Entomology, 16, Hendry, D.A. and Rechav, Y., Acaricidal bacteria infecting laboratory colonies of the tick Boophilus decoloratus (Acarina: Ixodidae). Journal of Invertebrate Pathology, 38, Hoffman, G., Hörchner, F., Schein, E. and Gerber, E Saisonales auftreten von Zecken und Piroplasmen bei Haustieren in den asiatischen Provinzen der Türkei. Berl Münch Tierarztl Wschr, 94, Holm, E. and Wallace, M.M.H., Distribution of anystid mites (Acari: Anystidae) in Australia and Indonesia and their role as possible predators of the cattle tick Boophilus microplus (Acari:Ixodidae). Experimental and Applied Acarology, 6, Hoogstraal, H The epidemiology of tick-borne Crimean-Congo hemorrhagic fever in Asia, Europe, and Africa. J Med Entomol., 15(4); Hoogstraal, H. and Kim, K.C., Tick and mammal coevolution, with emphasis on Haemaphysalis. Kim, K.C., (ed): Coevolution of Parasitic Arthropods and Mammals, 505, New York, Wile. Hu, R., Hyland, K.E. and Mather, T.N Occurrence and distribution in Rhode Island of Hunterellus hookeri (Hymenoptera: Encyrtidae), a wasp parasitoid of Ixodes dammini. Journal of Medical Entomology, 30, Ica, A., İnci, A.,Vatansever, Z. and Karaer, Z Status of tick infestation of cattle in the Kayseri region of Turkey. Parasitol Res., 101 (2); Jongejan, F. and Uilenberg, G The global importance of ticks. Parasitology, 129, Kaaya, G.P. and Hassan, S Entomogenous fungi as promising biopesticides for tick control. Experimental and Applied Acarology 24, Kaiser, M.N. and Hoogstraal, H Hunterellus theileri Fiedler (Encyrtidae, Chalcidoidea) parasitizing an African Hyalomma tick on a migrant bird in Egypt. Journal of Parasitology, 44,

80 Kalsbeek, V., Frandsen, F. and Steenberg, T Entomopathogenic fungi associated with Ixodes ricinus ticks. Experimental and Applied Acarology, 19, Kara, A Kırım Kongo kanamalı ateşi. Turk Ped Arş., 43, Karaer, Z., Yukarı, B.A. ve Aydin, L., Türkiye keneleri ve vektörlükleri. Özcel MA, Daldal N (eds) Parazitoloji de artropod hastalıkları ve vektörler. Ege Üniv, , İzmir-Turkey. Karaer, Z., Kırım-Kongo Kanamalı Atesi ve Keneler. Veteriner Hekimler Derneği Dergisi, 77 (2); Karaer, Z Türkiye de keneler- ekolojik özellikleri ile Kırım Kongo Hastalığında Planlı Mücadele ve Korunma Yöntemleri. 1. Zoonoz Kongresi 3-6 Aralık 2007, Erzurum. Karti, S. S., Odabaşı, Z., Korten, V., Yılmaz, M., Sönmez, M., Ceylan, R., Akdoğan, E., Eren, N., Köksal, I. and Ovalı, E., Crimean-congo hemorrhagic fever in Turkey. Emerging Infectious Disease, 10(8); Kaya, G., Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) ve Diğer Kene Kaynaklı Hastalıklarda Koruyucu Hekimlik. Mustafa Kemal Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji A.D., Hatay. Kolomyetz, U.S Aspergilus fumigatus as a parasite of ticks. Priroda 39, Korsunova, O.S. and Petrova-Pointovskaya, S.P., A virus isolated from Hyalomma marginatmn marginatum Koch, ticks. Zool. Zh., 28, Krylov, B Some problems in the study of fungal diseases of the bed bugs Cimex lectularius and ticks Argas persicus. Microbiol met borbys ectoparazit ptic Frunze, Ilim, Kurtpınar, H Türkiye Keneleri. Güven Matbaası, 96, Ankara. Leahy, M.G., Vandehay, R. and Galun, R Assembly pheromones in the soft tick, Argas persicus (Olsen). Nature (London), 246, Leahy, M.G., Hajkova, Z. and Bourchalova, J Two females pheromones in the metastriate ticks, Hyalomma dromedarii (Acarina: Ixodidae). Acta Entomologica Bohemoslavia, 78, Linthicum, K.J. and Bailey, C.L., Ecology of Crimean Congo hemorrhagic fever. In: Sonenshine, D.E., Mather, T.N. (Eds.), Ecological Dynamics of Tick- Borne Zoonoses. Oxford University Press, , New York. Logan, T.M., Linthicum, K.J., Bailey, C.L., Watts, D.M. and Moulton, J.R., Experimental transmission of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by Hyalomma truncatum Koch. Am J Trop Med Hyg, 40, Lusby, W.R., Sonenshine, D.E., Yunker, C.E., Norval, R.A.I. and Burridge, M.J Comparison of known and suspected pheromonal constituents in males of the African ticks Amblyomma hebraeum Koch and Amblyomma variegatum (Fabricius). Experimental and Applied Acarology, 13, Mahan, S. Heartwater Research Project, Department of Veterinary Pathology, University of Florida, Gainesville, Fl., USA. Mani, M.S Studies on Indian parasitic Hymenoptera. I. Indian Journal of Entomology, 3, Mauleon, H., Barre, N. and Panoma, S Pathogenicity of 17 isolates of entomophagous nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) for the ticks Amblyomma variegatum (Fabricius), Boophilus microplus (Canestrini) and Boophilus annulatus (Say). Experimental and Applied Acarology, 17,

81 Merdivenci, A Türkiye zoo-parazit faunası sistematiği ve Parazitolojik bibliyografyası. Türk Vet Hek Dern Yay, No:7 Merdivenci, A İstanbul da insan zooparazitozları bakımından kenelerde bir araştırma, Türk Vet Hek Dern Derg. 32, ; Merdivenci, A Türkiye de son on sene ( ) içinde bulduğum parazitler, Türk Biol Derg. 17 (1); Merdivenci, Yabanil hayvanlarda parazitolojik araştırmalar. VI. Milli Türk Biol Kong. (15-21 Ağustos 1968). İzmir. Serbest tebliğler, Merdivenci, A Türkiye Keneleri Üzerine Araştırmalar. Kutulmuş Matbaası, 420, İstanbul. Merdivenci, A Türkiye Parazitleri ve Parazitolojik Yayınları. Kutulmuş Matba. 324, İstanbul. Midilli, K., Gargili, A., Ergonul, O., Sengoz, G., Ozturk, R., Bakar, M. and Jongejan, F., Imported Crimean-Congo Haemorrhagic Fever in Istanbul. BMC Infect Dis, 7, 54. Monteiro, S.G.M., Bittencourt, V.R.E.P., Daemon, E. and Faccini, J.L.H a. Effect of the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana on eggs of Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). Ciencia Rural, Santa Maria, 28, Monteiro, S.G.M., Bittencourt, V.R.E.P., Daemon, E. and Faccini, J.L.H b. Pathogenicity under laboratory conditions of the fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae on larvae of the tick Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria, 7, Mooring, M.S. and Mundy, P.J Factors influencing host selection by Yellowbilled oxpeckers at Matoba national park, Zimbabwe. African Journal of Ecology 34, Mwangi, E.N., Dipeolu, O.O., Newson, R.M., Kaaya, G.P. and Hassan, S.M Predators, parasitoids and pathogens of ticks: a review. Biocontrol Science and Technology, 1, Mwangi, E.N., Kaaya, G.P. and Essumen, S Experimental infections of the tick Rhipicephalus appendiculatus with entomopathogenic fungi, Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, and natural infections of some ticks with bacteria and fungi. Journal African Zoology, 109, Mwangi, E.N. and Kaaya, G.P Prospects of using tick parasitoids (Insecta) for tick management in Africa. International Journal of Acarology, 23, Navon, A Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. In Bacillus thuringiensis Application in Agriculture (ed. Charles, J. F., Delecluse, A. & Nielsen-Le Roux, C.), Dordrecht, Kluwer Academic Publishers. Norval, R.A.I., Peter, T., Yunker, C.E., Sonenshine, D.E. and Burridge, M. J Response of the ticks Amblyomma hebraeum and A. variegatum to known or potential components of the aggregation attachment pheromone. I. Long range attraction. Experimental and Applied Acarology, 13, Obenchain, F.D Behavioral interactions between the sexes and aspects of species specificity pheromone mediated aggregation and attachment in Amblyomma. In Acarology Vol. 1 (ed. Griffith, D. A. & Bowman, C. E.), Chichester, Ellis Horwood. 79

82 Osterkamp, J., Wahl, U., Schmalfuss, G. and Haas, W Host-odour recognition in two tick species is coded in a blend of vertebrate volatiles. Journal of Comparative Physiology, 185, Otieno, D.A., Hassanalı, A., Obenchain, F. D., Steinberg, A. and Galun, R Identification of guanine as an assembly pheromones of ticks. Insect Science Applications, 6, Oytun, H.Ş Keneler, zararları ve savaş çareleri. YZE Basımevi, 109, Ankara. Oytun, H.Ş Tıbbi entomoloji. Ankara Üniv Tıp Fak Yayın 100. İkinci baskı. Güzel İstanbul Matbaası, , Ankara. Ozkurt, Z., Kiki, I., Erol, S., Erdem, F., Yılmaz, N., Parlak, M., Gundogdu, M. and Tasyaran, M Crimean-Congo hemorrhagic fever in Eastern Turkey:clinical features, risk factors and efficacy of ribavirin therapy. J Infect, 52, Qing, T., Saijo, M., Lei, H., Niikura, M., Maeda, A., Ikegami, T., Xinjung, W., Kurane, I. and Morikawa, S Detection of immunoglobulin G to Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in sheep sera by recombinant nucleoprotein-based enzymelinked immunosorbent and immunofluorescence assays. Journal of Virological Methods, 108, Paiao, J.C.V., Monteiro, A. C. and Kronka, S. N Susceptibility of the cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) to isolates of the fungus Beauveriabassiana. World Journal of Microbiology and Biochemistry 17, Pak, T.P., Smirnova, S.E., Zgurskaya, G.N., Yasinsky, A.V., Berdyev, K.B., Apostoli, L.A., Karovkin, V.P., Feldman, E.M., Derlyatko, K.I., Golovko, E.N., Makhmudov, R.K. and Chumakov, M.P., Results of a serological survey of Crimean hemorrhagic fever in Tadzhik SSR in Tr. Inst. Polio Virusn. Entsefalitov Akad. Med. Nauk SSSR, 19, Petney, T.N. and Kok, O.B Birds as predators of ticks (Ixodoidea) in South Africa. Experimental and Applied Acarology 17, Petrischeva, P.A. and Zhmayeva, Z.M Natural enemies of field ticks. Zoologichesku Zhurnal, 28, Price, T.L. Jr., Sonenshine, D.E., Norval, R.A.I., Yunker, C. E. and Burridge, M. J Pheromonal composition of two species of African Amblyomma ticks: similarities, differences and possible species specific components. Experimental and Applied Acarology, 18, Rechav, Y. and Whitehead, G.B Field trials with pheromone-acaricide mixtures for control of Amblyomma hebraeum. Journal of Economic Entomology, 71, Robertson, A. and Jarvis, A.M Oxpeckers in northeastern Namibia: recent population trends and the possible negative impacts of drought and fire. Biological Conservation, 92, Roelofs, W.L Chemistry of sex attraction. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 92, Saluzzo, J.F., Digoutte, J.P., Camicas, J.L. and Chauvancy, G., Crimean Congo haemorrhagic fever and Rift Valley fever in southeastern Mauritania. Lancet, 1, 116. Samish, M. and Rehacek, J Pathogens and predators of ticks and their potential in biological control. Annual Review of Entomology 44,

83 Samish, M., Alekseev, E.A. and Glazer, I a. Biocontrol of ticks by entomopathogenic nematodes. Annals of the New York Academy of Science, 916, Samish, M., Alekseev, E.A. and Glazer, I b. Mortality rate of adult ticks due to infection by entomopathogenic nematodes. Journal of Parasitology 86, Samish, M., Gindin, G., Alekseev, E. and Glazer, I Pathogenicity of entomopathogenic fungi to different developmental stages of Rhipicephalus sanguineus. Journal of Parasitology, 87, Samish, M., Ginsberg H. and Glazer I Biological control of ticks, Parasitology, 129, Samsinakova, A Beauveria globulifera (SPEG) Pic. as a parasite of the tick Ixodes ricinus. L. Zoologicke Listi, 20, Samsinakova, A., Kalalova, S., Daniel, M., Dusbabek, F., Houzakova, E. and Cerny, V Entomogenous fungi associated with the tick Ixodes ricinus. Folia Prarasitologica (Praha), 21, Samuel, W.M. and Welch, D.A Winter ticks on moose and other ungulates: factors influencing their population size. Alces, 27, Schöni, R., Hess, E., Blum, W. and Ramstein, K The aggregation attachment pheromone of the tropical bont tick Amblyomma variegatum Fabricius (Acari:Ixodidae): isolation, identification and action of its components. Journal of Insect Physiology, 30, Schwarz, T.F., Nsanze, H., Longson, M., Nitschko, H., Gilch, S., Shurie, H., Ameen, A., Zahir, A.R., Acharya, U.G. and Jager, G., Polymerase chain reaction for diagnosis and identification of distinct variants of Crimean Congo hemorrhagic fever virus in the United Arab Emirates. Am. J. Trop. Med. Hyg., 55, Sert, H., Yağcı, Ş., Aktaş, M. ve Karaer Z., Türkiye'nin Farklı Bölgelerinden Yakalanan Kemiricilerde Kene (Acari: Ixodidae, Argasidae) Enfestasyonu. Türkiye Parazitoloji Dergisi, 25(3); Sewify, G.H. and Habib, S.M Biological control of the tick fowl Argas persicargas persicus by the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopbiae. Journal of Pest Science, 74, Shepherd, A.J., Swanepoel, R., Leman, P.A. and Shepherd, S.P., 1987 a. Field and laboratory investigation of Crimean Congo haemorrhagic fever virus (Nairovirus, family Bunyaviridae) infection in birds. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 81, Shepherd, A.J., Swanepoel, R., Shepherd, S.P., McGillivray, G.M. and Searle, L.A., 1987 b. Antibody to Crimean Congo hemorrhagic fever virus in wild mammals from southern Africa. Am. J. Trop. Med. Hyg., 36, Shepherd, A.J., Swanepoel R. and Leman P.A Antibody response in Crimean- Congo hemorrhagic fever. Rev Infect Dis, 11, Simpson, D.I.H Viral haemorrhagic fevers of man. Bull Wld Hlth Org., 56, Sonenshine, D.E., Homsher, P.J., Dees, W.H., Carson, K.A. and Wang, V.B Evidence Of The Role Of The Cheliceral Digits In The Perception Of Genital Sex pheromones during mating in the American dog tick, Dermacentor variabilis (Say). Journal of Medical Entomology, 21,

84 Sonenshine, D. E Pheromones and other semiochemicals of the Acari. Annual Reveiw of Entomology, 30, Sonenshine, D. E Biology of ticks, vol. 2. Oxford University Press, New York. Sonenshine, D.E Pheromones and other semiochemicals of ticks and their use in tick control. Parasitology, 129, Steinhaus, E.A. and Marsh, G.A Report of diagnoses of diseased insects Hilgardia, 33, Steullet, P. and Guerin, P.M a. Perception of breath components by the tropical bont tick Amblyomma variegatum Fabricius (Ixodidae). I. CO2-excited and CO2-inhibited receptors. Journal of Comparative A. Physiology A, 170, Steullet, P. and Guerin, P.M b. Perception of breath components by the tropical bont tick Amblyomma variegatum Fabricius (Ixodidae). II. Sulfide receptors. Journal of Comparative Physiology A 170, Stutterheim, C. J. and Stutterheim, I.M Evidence of an increase in a red-billed oxpecker population in the Kruger National Park. South African Journal of Zoology, 15, 284. Stutterheim, C. and Brooke, R Past and present ecological distribution of the yellow billed oxpecker in South Africa. African Journal of Zoology, 16, Stutterheim, I.M., Bezuidenhout, J.D. and Elliott, E.G.R Comparative feeding behavior and food preferences of oxpeckers (Buphagus erythrorhynchus and B. africanus) in captivity. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 55, Stowe, M.K., Turlings, T.C., Loughrin, J.H., Lewis, W.J. and Tumlinson, J.H The chemistry of eavesdropping, alarm and deceit. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92, 23 28, USA. Symondson, W.O.C., Sunderland, K.D. and Greenstone, M.H Can generalist predators be effective biocontrol agents? Annual Revue of Entomology, 47, Swanepoel, R., Leman, P.A., Burt, F.J., Jardine, J., Verwoerd, D.J., Capua, I., Bruckner, G.K. and Burger, W.P Experimental infection of ostriches with Crimean Congo haemorrhagic fever virus. Epidemiol. Infect., 121, Takasu, K., Takano, S.I., Sasaki, M., Yagi, S. and Nakamura, S Host recognition by the tick parasitoid Ixodiphagus hookeri (Hymenoptera: Encyrtidae). Environmental Entomology, 32, Tanır, G., Özgelen, Ş. ve Tuygun, N Kenelerin biyolojik özellikleri, kene ile bulaşan hastalıklar ve Türkiye deki epidemiyolojik veriler. Çocuk Enf Derg, 3, Tavana, A. M., Chinikar, S. and Mazaheri, V., The seroepidemiological aspects of crimean congo hemorrhagic fever in three health workers: A Repot From Iran. Arch. Iranian Med., 5(4); Taylor, D., Phillips, J.S., Allan, S.A. and Sonenshine, D.E Absence of assembly pheromones in the hard ticks, Dermacentor variabilis and Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, 24,

85 Taylor, D., Sonenshine, D.E. and Phillips, J.S Ecdysteroids as a component of the genital sex pheromone in two species of hard ticks, Dermacentor variabilis (Say) and Dermacentor andersoni Stiles (Acari: Ixodidae). Experimental and Applied Acarology, 12, Tonbak, S., Aktas, M., Altay, K., Azkur, A.K., Kalkan, A., Bolat, Y., Dumanli, N. and Ozdarendeli, A., Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus: Genetic Analysis and Tick Survey in Turkey. Journal Of Clinical Microbiology, Trevorrow, N.L., Stone, B.F. and Cowie, M Aggregation pheromone in two Australian hard ticks, Ixodes holocyclus and Aponomma concolor. Experientia, 33, Turell, M.J, Role of Ticks in the Transmission of Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus. Ergonul O, Whitehouse CA, eds. Crimean Congo Hemorrhagic Fever: A Global Perspective. Dordrecht (NL), Van Eeden, P.J., Joubert, J.R., van de Wal, B.W., King, J.B., de Kock, A. and Groenewald, J.H., A nosocomial outbreak of Crimean Congo haemorrhagic fever at Tygerberg Hospital. Part I. Clinical features. S. Afr. Med. J., 68, Vatansever, Z., Uzun, R., Estrada-Pena, A. and Ergonul, O., Crimean Congo Hemorrhagic Fever in Turkey. Ergonul O, Whitehouse CA, eds. Crimean Congo Hemorrhagic Fever: A Global Perspective. Dordrecht (NL), Springer, Verissimo, C.J Natural enemies of the cattle parasitic tick. Agropecuaria Catarinense, 8, Watts, D.M., Ksiasek, T.G., Linthicum, K.J. and Hoogstraal, H Crimean- Congo Hemorrhagic fever. In T.P. Monath, ed. The arboviruses: epidemiology and ecology, vol.2. CRC, , Boca Raton, FL, USA. Watts, D.M., Ussery, M.A., Nash, D. and Peters, C.J., Inhibition of Crimean Congo hemorrhagic fever viral infectivity yields in vitro by ribavirin. Am. J. Trop. Med. Hyg., 41, Wheeler, J.W Insect and mammalian pheromones. Lloydia, 39, Whitehouse, C.A Crimean-Congo Hemorrhagic Fever. Antivir Res, 64, Woodall, J.P., Williams, M.C., Simpson, D.I.H., Ardoin, P., Lule, M. and West, R., The Congo group of agents. Rep. East Afr. Virus Res. Inst., 14, Van Someren, V.D The red billed oxpecker and its relation to stock in Kenya. East African Agricultural Journal, 17, Yıldırım, E., Tarımsal Zararlılarla Mücadele Yöntemleri ve İlaçlar. 2. Baskı. Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları No: 219, 350, Ziraat Fakültesi Ofset Tesisi, Erzurum. Yiğit, N.,Çolak, E., Sözen, M. and Karataş, A Rodents of Türkiye.Meteksan,Ankara. Yoder, J.A., Pollack, R.J., Spielman, A., Sonenshine, D.E. and Johnston, D.E a. Secretion of squalene by ticks. Journal of Insect Physiology, 39, Yoder, J.A., Pollack, R.J. and Spielman, A b. An ant-diversionary secretion of ticks: first demonstration of an acarine allomone. Journal of Insect Physiology, 39,

86 Yoder, J.A., Wittenberg, T.L. and Blomquist, G.J Dietary contribution to the defense secretion of ixodid ticks. In Acarology IX. Proceedings (ed. Mitchell, R., Horn, D. J., Needham, G. R. and Welbourn, W. C.), Columbus, Ohio Biological Survey. Yoder, J. A., Atwood, A. D. and Stevens, B.W Attraction to squalene by ticks (Acari: Ixodidae): First demonstration of a host-derived attractant. International Journal of Acarology 24, Yoder, J.A. and Domingus, J.L Identification of hydrocarbons that protect ticks (Acari: Ixodidae) against fire ants (Hymenoptera: Formicidae) but not lizards (Squamata: Polychrotidae), in allomonal defense secretion. International Journal of Acarology, 29, Yu-Chen, Y., Ling-Xiong, K., Ling, L., Yu-Qin, Z., Feng, L., Bao-Jian, C. and Shou-Yi, G., Characteristics of Crimean Congo hemorrhagic fever virus (Xinjiang strain) in China. Am. J. Trop. Med. Hyg., 34, Yurdakök, K Thiomersal ve aşılar. Hacettepe Tıp Dergisi 37, Zangi, G Tick Control by Means of Entomopathogenic Nematodes and Fungi. MSc thesis. The Hebrew University of Jerusalem, Israel. Zeller, H.G., Cornet, J.P. and Camicas, J.L., Experimental transmission of Crimean Congo hemorrhagic fever virus by west African wild ground-feeding birds to Hyalomma marginatum rufipes ticks. J. Trop. Med. Hyg., 50, Zhioua, E., Browning, M., Johnson, P.W., Ginsberg, H.S. and Lebrun, R.A Pathogenicity of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Deuteromycetes) to Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Parasitology, 83, Zhioua, E., Ginsberg, H.S., Humber, R.A. and Lebrun, R.A a. Preliminary survey for entomopathogenic fungi associated with Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) in southern New York and New England, USA. Journal of Medical Entomology, 36, Zhioua, E., Heyer, K., Browning, M., Ginsberg, H.S. and Lebrun, R.A., 1999 b. Pathogenicity of Bacillus thuringiensis variety kurstaki to Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, 36,

87 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı: Ceren TİLGEN Doğum Yeri: ANKARA Doğum Tarihi: Medeni Hali: Bekar Yabancı Dili: İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Çankaya Lisesi (Yabancı Dil Ağırlıklı) (2002) Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü (2008) Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı (Eylül 2008 Kasım 2010) Katıldığı Seminerler ve Kongreler 19. Uluslararası Biyoloji Kongresi, Karadeniz Teknik Üniversitesi. 2008, Haziran. 4.Ulusal Speoloji Sempozyumu. Şubat, Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar Kursu, Ankara Üniversitesi,

88 ÖZET Yüksek Lisans Tezi ÇORUM İLİ CİVARINDA YAYILIŞ GÖSTEREN KEMİRİCİLERDE (ORDO: RODENTIA) KENE ENFESTASYONUNUN VE KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ (KKKA) TAŞIYICILIĞININ ARAŞTIRILMASI Ceren TİLGEN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Nuri YİĞİT Bu çalışmada Çorum ili ve çevresinden elde edilen kemiricilerde kene enfestasyonu ve kemirgenlerin kanında Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) etkeninin varlığı araştırıldı. Arazi çalışmalarında toplam 19 adet kemirici örneği elde edildi; bunlardan 9 tanesi Apodemus flavicollis, 5 tanesi Mus sp., 4 tanesi Microtus lydius ve 1 tanesinin de Cricetulus migratorius türlerine ait olduğu saptandı. Bu türlerden kene enfestasyonuna Apodemus flavicollis ve Microtus lydius türlerinde rastlandı. Çalışılan örneklerde Ixodes ve Haemaphysalis cinslerinin larva ve nimf formlarının enfestasyon yaptığı belirlendi. Elde edilen 9 Apodemus flavicollis örneğinde Ixodes ve Haemaphysalis cinslerine ait larva ve nimf formlarına rastlanırken Microtus lydius un 2 örneğinin 1 tanesinde Ixodes cinsinin nimf formu olmak üzere 1 adet keneye rastlanmıştır. Elde edilen 2 tane Mus sp. örneğinde ise keneye rastlanmamıştır. Yakalanan kemiricilerin kanları alınıp santrifüj yöntemiyle serumlarına ayrıldı. Bu serum örnekleri ile virüs varlığı araştırılmak üzere ELISA testi uygulandı. Bu testin verimli sonuçlar vermemesi üzerine Real Time PCR yöntemi denendi. Uygulamanın sonucunda bütün örneklerin negatif sonuç verdiği görüldü. Ekim 2010, 85 sayfa Anahtar Kelimeler: Kene, Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), kemirici, Türkiye. i

89 ABSTRACT Master Thesis RESEARCHES ON THE TICK INFESTATION AND THE VECTORING OF CRIMEAN CONGO HEMORRHAGIC FEVER (CCHF) ON RODENTS (ORDO: RODENTIA) IN ÇORUM PROVINCE Ceren TİLGEN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Nuri YİĞİT In this study, tick infestation and Crimean Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) agents were investigated in rodents which were captured from Çorum province. Totally 19 rodent samples were obtained; 9 of them were Apodemus flavicollis, 5 Mus sp., 4 Microtus lydius and 1 Cricetulus migratorius. In these specimens, tick infestations were found only in Apodemus flavicollis and Microtus lydius species. These ticks were; larval and nymphal forms of the genus Ixodes and larval and nymphal forms of the genus Haemaphysalis. Seven specimens of Apodemus flavicollis were found to be infested by the genera Ixodes and Haemaphysalis larval and nymphal forms, whereas one of the 2 Microtus lydius were only infested by lnymphal form of the genus Ixodes. There were no ticks found Mus sp. samples. Eleven rodents bloods were seperated from their seras in order to determine the presence of the virus in these sera samples using ELISA test. This test didn t give effective results therefore Real Time PCR method was applied to the sera samples. Finally, test results were indicated that all of the sera samples were given to the negative results. October 2010, 85 pages Key Words: Tick, Crimean Congo Hemorrhagic Fever (CCHF), rodent, Turkey. ii

90 TEŞEKKÜR Çalışmalarımda bana bilgi ve tecrübeleriyle katkı sağlayan danışmanım Prof. Dr. Nuri YİĞİT e; benden bilimsel ve manevi desteğini eksik etmeyen Prof. Dr. Zafer KARAER e ve Doç. Dr. Nursel GÜL e; arazi çalışmalarımda bana yardımcı olan Duygu YÜCE, Murat DOĞAN a ve bütün çalışma arkadaşlarıma, hiçbir zaman desteklerini ve inançlarını benden esirgemeyen aileme, Özlem ŞEKER, Ezgi HALATLI ve Ezgi TEKİN e sonsuz teşekkürler. Ayrıca kimyasal temini ve arazi çalışmalarına yaptıkları kısmi finansal destek için Ankara İleri Teknoloji Yatırımları ve Eko-Zon Halk Sağlığı ve Çevre Danışmanlık şirketlerine ve deneylerimin bir kısmını yaptığım Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı na teşekkür ederim. Ceren TİLGEN Ankara, Ekim 2010 iii

91 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Kenelerin Sınıflandırılması Kenelerin morfolojik ve biyolojik özellikleri Türkiye de yayılış gösteren Ixodidae familyasındaki kenelerin cins ayrım karakterleri Ixodidae familyasındaki kenelerin tür teşhis anahtarı Türkiye deki keneler ve dağılımları Kenelerin Bulaştırdıkları Hastalıklar Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı (KKKA) Türkiye de Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü Kırım Kongo Kanamalı Ateşi hastalığının tanısı Serolojik tanısı Moleküler tanısı Hayvanlarda Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı Kenelerin Kontrolü Biyolojik Kontrol Patojenlerle kontrol Bakterilerle kontrol Mantarlarla kontrol Entomopatojenik nematodlarla kontrol Parazitoidlerle kontrol Predatörlerle kontrol Feromonlar ve diğer semiokimyasallarla kontrol iv

92 Feromonlar Allomonlar Kairomonlar Synomonlar Semiokimyasalların keneler tarafından algılanması MATERYAL VE YÖNTEM ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ELISA solüsyonlarının hazırlanışı ELISA testinin yapılışı BULGULAR Biyotoplar ve Kemiricilerde Kene Enfestasyonu Kemirgenlerde ELISA ve Real Time PCR ile KKKAV nin Araştırılması TARTIŞMA SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ v

93 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Ixodes scapularis larvasının taramalı elektron mikrografisinde ventral olarak görüntüsü. A. anüs, BC. basis capituli, D. keliserin dijitleri,h. hipostomun dış yüzeyi, L. bacak, P. palp (Anderson and Magnarelli 2008).6 Şekil 2.2 Ixodes scapularis dişisinin taramalı elektron mikrografisinde dorsa- lateral görüntüsü. B. vücut (idiosoma), C. capitulum (gnathosoma), L. bacak, P. palp, S. skutum, SP. spiralce (stigma) (Anderson and Magnarelli 2008)....7 Şekil 2.3 Ixodes scapularis dişisinin elektron mikrografisinde ventral görüntüsü. A. anüs, BC. basis capituli, GA, genital açıklık, H. hipostomun dış yüzeyi, L. bacak, P. palp, SP. spiracle (Anderson and Magnarelli 2008)... 7 Şekil 2.4 Ixodes scapularis dişisinin kapitulumunun taramalı elektron mikrografisinde dorsal görüntüsü. BC. basis kapituli, D. keliser dijitleri, DEN. hipostomun dışyüzündeki dişcikler, H. hipostomun iç yüzeyi, O. besin kanalı açıklığı, P. palp, PA. poros area, SC. keliser gövdesi (Anderson and Magnarelli 2008)... 8 Şekil 2.5 Ixodes scapularis nimfinin kapitulumunun ventral morfolojisinin taramalı elektron mikrografi görüntüsü. BC. basis capituli, F. palpin dördüncü segmenti, H. hipostomun dış yüzeyi, P. Palp (Anderson and Magnarelli 2008)... 8 Şekil 2.6 Üç konaklı kenelerin yaşam döngüsü Şekil 2.7 İki konaklı kenelerin yaşam döngüsü Şekil 2.8 Bir konaklı kenelerin yaşam Şekil 2.9 Yumurtalarını bırakmış bir dişi Şekil 2.10 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü nün dünyadaki dağılımı (Ergönül 2006) Şekil 2.11 Zimbabwe de birr inekte beslenen Amblyomma hebraeum (Photo credit Dr Suman Mahan) Şekil 3.1 Araziye yerleştirilcek kapanlar hazırlanırken (Nisan 2010) Şekil 3.2.a Yuva ağzına yerleştirilmiş bir kapan (Nisan 2010) Şekil 3.2.b Araziye yerleştirilmiş kapanlar Şekil 4.1 Lokalite 1: Yozgat/Sorgun/Aşağı Cumafakılı Köyü, Lokalite 2: Çorum, Sarmaşa yol kenarı, Lokalite 3: Çorum, Alaca yolu üzeri Şekil 4.2 Sorgun Aşağı Cumafakılı Köyü çevresinde kapan atılan bir tarla (Nisan Şekil 4.3 Sorgun Aşağı Cumafakılı Köyü çevresinde kapan atılan çalılık bir bölge (Nisan 2010) Şekil 4.4 Çorum Sarmaşa Yolu kenarında kapan atılan çalılık alan ve tarla (Haziran 2010) Şekil 4.5 Çorum Sarmaşa Yolu kenarında kapan atılan dere kenarı ve ormanlık alan (Haziran 2010) Şekil 4.6 Çorum arazisinde örneklenmiş göz bölgesinde kene bulunan bir Apodemus flavicollis Şekil 4.7 Çorum arazisinde örneklenmiş kulağında ve sırtında kene bulunan bir Apodemus flavicollis Şekil 4.8 Çorum arazisinde örneklenmiş göz çevresinde kene bulunan Microtus lydiu Şekil 4.9 Ixodes larvasının stereo mikrokop altında dorsal görüntüsü vi

94 Şekil 4.10 Ixodes larvasının stereo mikroskop altındaki ventral görüntüsü Şekil 4.11 Ixodes nimfinin stereo mikroskop altında dorsalden görüntüsü Şekil 4.12 Ixodes nimfinin stereo mikroskop altında ventralden görüntüsü Şekil 4.13 Haemaphysalis larvasının stereo mikroskop altındaki dorsal görüntüsü Şekil 4.14 Haemaphysalis larvasının stereo mikroskop altındaki ventral görüntüsü Şekil 4.15 Haemaphysalis nimfinin stereo mikroskop altında dorsalden görüntüsü Şekil 4.16 Haemaphysalis nimfinin stereomikroskop altında lateralden görüntüsü vii

95 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Cinslere göre kene türlerinin sayıları... 5 Çizelge 2.2 Kenelerin insanlara bulaştırdığı bazı hastalıklar (Kaya 2007, Derviş 2009) Çizelge ten beri ortaya çıkan Kırım Kongo Kanamalı Ateşi salgınları (Ergönül, 2006) Çizelge 2.4 Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Vaka Ve Ölümlerinin Yıllarına Göre Dağılımı (Sağlık Bakanlığı 2009) Çizelge 3.1 Real Time PCR sıcaklık ve zaman koşulları Çizelge 4.1 Toplanan kemirgenlerden elde edilen kene tür, sayı ve cinsiyetleri viii

96 1. GİRİŞ Keneler, kutup bölgeleri hariç dünyanın her yerinde, özellikle de tropik ve subtropik bölgelerinde yaygın olarak yaşayan eklembacaklılardır. Yaşamak için kan emerek beslenmek zorundadırlar. Kan emmek için konak seçimi yapmazlar. Memeli, sürüngen, kanatlı hayvanlar veya insanlardan kan emebilirler. Bu nedenle dış parazit olarak önemlidirler. Türkiye nin subtropik iklim kuşağında yer alıyor olması, coğrafik yapısı gibi özellikler nedeni ile birçok kene türünün üreme ve gelişmesi için çok uygun bir ortam oluşturmaktadır. Keneler tarafından taşınan zoonotik etkenler arasında bakteriyel (tularemi, lyme hastalığı), riketsiyal (benekli humma, Q humması, ehrlichiosis), parazitik (babesiosis) ve viral (tick borne encephalitis, kanamalı ateşler) infeksiyon etkenleri vardır (Despommier 2000, Jongejan ve Uilenberg 2004, Gratz 2006). Tüm bunlar, kenelerin hayvan sağlığı açısından önemli bir tehdit oldukları kadar insan sağlığı açısından da çok önemli olan parazitler arasında yer almasına yol açmaktadır (Despommier vd. 2000, Jongejan ve Uilenberg 2004, Karaer 2007). Keneler tarafından bulaşan diğer bir viral hastalık olan Kırım Kongo Kanamalı Ateşi ülkemizi 2002 yılından itibaren tehdit altına almış ve insan sağlığını etkilemeye başlamıştır. Hastalık ilk kez II. Dünya Savaşı yıllarında, 1944 ve 1945 yılı yaz aylarında, ürün toplamaya yardım eden Sovyet askerleri arasında görülmüş ve 200 den fazla kişiyi etkilemiştir. O zamanlar hastalığa Kırım Kanamalı Ateşi adı verilmiştir. Aynı virüs, 1956 yılında Zaire de ateşli bir hastadan izole edilerek, farklı bir etmen olduğu düşünülmüş ve Kongo Hastalığı olarak tanımlanmıştır. Ancak 1969 yılında Kongo ve Kırım Kanamalı Ateşi virüslerinin aynı olduğu anlaşılarak, hastalığa Kırım Kongo Kanamalı Ateşi ismi verilmiştir (Simpson 1978, Hoogstraal 1979, Capua 1998, Tavana vd. 2002). Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) Bunyaviridae ailesinden Nairovirus türü içinde tanımlanan virüsün etken olduğu, %3-30 mortalite ile seyreden önemli bir hastalıktır (Watts vd. 1988, Ergonul vd. 2004). Bunyavirus lar, zarflı ve negatif polaritesi olan tek iplikçikli RNA parçacığından oluşmaktadırlar (Elliott vd. 1991). KKKAV, Hyalomma cinsindeki kenelerle, özellikle de Hyalomma marginatum marginatum tarafından 1

97 taşınmaktadır (Hoogstraal 1979). KKKAV, Hyalomma anatolicum anatolicum ve Rhipicephalus, Ornithodoros, Boophilus, Dermacentor ve Ixodes spp. gibi kene türlerinde de saptanmıştır (Ergonul ve Whitehouse 2007). KKKAV nün taşınmasında en etkili olan Hyalomma cinsi kenelerin yaşam evreleri 2 konakta geçer. Bu cins keneler larva ve nimf dönemini bir konakta geçirir, nimfler kan emip doyduktan sonra konak hayvanı terk ederler. Dış ortamda gömlek değiştirip aç olgun hale gelirler. Aç olgun keneler ikinci bir hayvandan kan emer, çiftleşir ve doyar. Doyan dişiler toprakta, gizlendikleri yerde yaklaşık 1 aylık sürede 5-7 bin arası yumurta yumurtlarlar. H.m.marginatumun un larva ve nimf dönemleri çoğunlukla yerden beslenen kanatlılar olan keklik, sığırcık, sülünde, tavşan, kirpi ve fare gibi yabani hayvanlarda az olarak da büyük memelilerde ve insanda geçmektedir. Ergin dönemleri ise, uygun konak olarak yaban domuzu, at, sığır, koyun, keçi gibi evcil büyük memeliler ve de insanda geçer (Karaer 2007). Ülkemizdeki ilk olgulara 2002 yılında Karadeniz Bölgesi nin iç kısımlarında, İç ve Doğu Anadolu Bölgeleri nin kuzey kesimlerinde rastlanmıştır (Ergonul vd. 2004, Ergönül 2006, Özkurt vd. 2006). Türkiye de ilk kez, 2002 yılı nisan ayında, Tokat ta ortaya çıkmasından sonra hastalık bundan sonraki iki yıl içinde Erzurum, Erzincan, Sivas, Yozgat, Amasya, Çorum, Çankırı, Karabük, Samsun, Ordu, Giresun, Trabzon, Artvin, Gümüşhane ye kadar yayılmıştır (Karti vd. 2004). Virüsün vücuda alınmasından 7 gün sonra ELISA ve IFA testleriyle IgM ve IgG antikorları saptanabilmektedir (Shepherd vd. 1989). Spesifik IgM düzeyi enfeksiyondan 4 ay sonra saptanamayacak kadar azalır, ama IgG düzeyleri 5 yıl boyunca saptanabilir (Ergonul ve Whitehouse 2007). Moleküler yöntemlerden Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (Reverse transcription polymerase chain reaction = RT-PCR) yöntemi KKKAV enfeksiyonunun hızlı tanısında tercih edilmesi gereken yöntemdir. Yöntem son derece özgün, duyarlı ve hızlıdır (Drosten vd. 2003). 2

98 Kemiricilerde Kırım Kongo Kanamalı Ateşi etkeninin araştırılmasına dair yeterli bir çalışma bulunmamakla beraber kemiricilerdeki kene türlerinin saptanması adına 1976 ve 1977 yılları arasında Siirt, Diyarbakır ve Urfa illerinde bir çalışma yapılmıştır (Sert vd. 2001). Bu çalışmada Çorum ve çevresinden kemirici ve kene örnekleri alınarak kemiricilerde bulunan kenelerin tür tayini yapılmıştır ve kemiricilerden alınan kanlarda Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü etkeninin varlığı araştırılmıştır. 3

99 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Kenelerin Sınıflandırılması Hoogstraal ve Kim (1985) e göre kenelerin sınıflandırılması aşağıdaki gibidir; Phylum Subphylum Classis Ordo Subordo : Arthropoda : Chelicerata : Arachnida : Acarina : Ixodida Superfamilya : Ixodidoidea Familya : Argasidae (Yumuşak keneler) Ixodidae (Sert keneler) Nutalliellidae Daha sonraları familyalar Ixodidae, Argasidae, Nuttallelidae ve Laelaptidae olmak üzere dört gruba ayrılmıştır. Ixodidae ve Argasidae familyalarında yaklaşık olarak 878 tür bulunmaktadır (Çizelge 2.1). Nutalliellidae ve Laelaptidae familyaları en az öneme sahiplerdir ve her birinin bir türü vardır. Bunlardan Ixodidae familyası yaklaşık olarak 650 tür sayısına sahip olmasıyla ve Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı etkenini taşımasıyla önemli görülmektedir (Karaer 2006, Anderson ve Magnarelli 2008). 4

100 Çizelge 2.1 Cinslere göre kene türlerinin sayıları Familya Cins Ortalama tür sayısı Ixodidae Ixodes Amblyomma Bothriocroton Haemaphysalis Hyalomma Nosomma Anomalohimalaya Cosmiomma Dermacentor Margaropus Rhipicentor Rhipicephalus (Boopilus) Rhipicephalus Nuttalliellidae Nuttalliella 1 Argasidae Argas Carios Ornithodorus Otobius Laelaptidae Gammaridacarus 1 Toplam Kenelerin Morfolojik ve Biyolojik Özellikleri Keneler, capitulum (gnathosoma) ve bacakların bulunduğu vücut (idiosoma) kısımlarının birbiriyle kaynaşmasından oluşan iki bölümden meydana gelir (Balashov 1972, Sonenshine 1993). Larvalar 6 bacağa sahipken (Şekil 2.1), nimf ve erginler 8 bacağa sahiptir (Şekil ). Belirgin bir başları yoktur. Beslenmemiş ergin kenelerin uzunlukları 2 mm ile 20 mm arasında değişir. Kan emmiş dişi kenelerin 5

101 uzunlukları 25 mm ile 30 mm arasında değişebilir ve ağırlıkları da kan emmeden önceki ağırlıklarının 100 katına çıkabilir. Ağız parçaları kapitulumda bulunur (Şekil ). İki tane dört segmentli palpe sahiplerdir ki ixodid kenelerin her birinde palplerin 4. küçük distal segmentinde kemisensör sensillalar vardır (Şekil 2.5). Palpler açılan yaraya girmezler; beslenme sırasında deriye yatay olarak yana doğru bir baskı uygularlar. Keliseral gövdenin ekstremitelerinde çok iyi hareket edebilen ve keskin kesici dijitler bulunur (Şekil ). Bu dijitler beslenme sırasında deriyi kesmeye, delmeye yarar. Hipostom, tutunma organı ve besin kanalı olarak iş görür. Hipostomun şekli ve boyutu ve dişlerin dizilimi türler arasında çeşitlilik gösterir ve türlerin teşhisinde kullanılan önemli özelliklerdir. Konaktan kan bu besin yolu ile geçer. Salgısı, dokuları parçalayan ve eriten proteolitik enzimleri içerir, kene konaktan bu kanal ile çıkarılır. Basis capituli, kapitulumun bazal kısmı, kenenin vücuduna esnek bir membran ile tutunmuştur. Vücut, kapitulumun posteriyorunda kalan kısmıdır (Şekil ). Anteriyor kısımda bacaklar ve genital açıklık vardır ve posteriyor kısımda stigma ve anüs vardır. Larvalarda ve nimflerde genital açıklık kapalıdır ve belirsizdir, erginlerde ise açıktır (Şekil ). Sert kenelerde scutum, dişilerde ve juvenil kenelerde vücudun dorsal anteriyor kısmını kaplar (Şekil 2.2). Erkeklerde scutum tüm vücudu kaplar (Anderson and Magnarelli 2008). Şekil 2.1 Ixodes scapularis larvasının taramalı elektron mikrografisinde ventral olarak görüntüsü: (Anderson ve Magnarelli 2008). A. anüs, BC. basis capituli, D. keliserin dijitleri, H. hipostomun dış yüzeyi, L. bacak, P. palp 6

102 Şekil 2.2 Ixodes scapularis dişisinin taramalı elektron mikrografisinde dorsa-lateral görüntüsü: (Anderson ve Magnarelli 2008). B. vücut (idiosoma), C. capitulum (gnathosoma), L. bacak, P. palp, S. skutum, SP. spiracle (stigma) Şekil 2.3 Ixodes scapularis dişisinin elektron mikrografisinde ventral görüntüsü (Anderson ve Magnarelli 2008). A. anüs, BC. basis capituli, GA. genital açıklık, H. hipostomun dış yüzeyi, L. bacak, P. palp, SP. spiracle 7

103 Şekil 2.4 Ixodes scapularis dişisinin kapitulumunun taramalı elektron mikrografisinde dorsal görüntüsü (Anderson ve Magnarelli 2008). BC. basis kapituli, D. keliser dijitleri, DEN. hipostomun dış yüzündeki dişcikler, H. hipostomun iç yüzeyi, O. besin kanalı açıklığı, P. palp, PA. poros area, SC. keliser gövdesi Şekil 2.5 Ixodes scapularis nimfinin kapitulumununun ventral morfolojisinin taramalı elektron mikrografi görüntüsü (Anderson ve Magnarelli 2008). BC. basis capituli, F. palpin dördüncü segmenti, H. hipostomun dış yüzeyi, P. palp 8

104 Sert kenelerin hayat döngüsü, beslenme evrelerinde değiştirdikleri konak sayılarına göre ve ergin olmayan kenelerin gömlek değiştirmelerinin konak üzerinde olup olmadığına göre sınıflandırılır. Buna göre türler, bir konaklı, iki konaklı ve üç konaklı olarak sınıflandırılırlar (Balashov 1972, Sonenshine 1993). Dermacentor variabilis, Ixodes ricinus ve Ixodes scapularis gibi sert kene türleri 3 kere 3 farklı konaktan beslenirler ve yaygın olarak 3 konaklı keneler olarak isimlendirilirler (Şekil 2.6). Genellikle keneler konaklarının üzerinde sadece beslenirken kalırlar, bazı zamanlarını da konakta ilerlerken geçirirler. Bu keneler larva olarak beslenmelerini tamamlarlar ve konaklarının üzerinden yere düşerler, gömlek değiştirerek nimf haline geçerler. Nimfler diğer bir konak hayvana tutunurlar, beslenmelerini tamamlarlar ve yere düşerler. Gömlek değiştirip ergin hale geçtikten sonra her bir dişi birey, konağa tutunurlar, çiftleşirler, kan alımını tamamlarlar ve yere düşerler, bir yığın halinde yumurtalarını bırakırlar (Şekil 2.9). Dişi keneler arası yumurta bırakırlar ve yumurtlama dönemleri çevresel etkilere göre ay sürebilmektedir. Yumurtalardan, ay sonra larvalar çıkar. Bazı tür keneler bir konaklı veya iki konaklı keneler olarak adlandırılırlar. Rhipicephalus bursa ve Hyalomma türleri iki konaklı kenelere örnektir. Larvalar küçükbaş hayvanlarda beslenirler ve burada gömlek değiştirirler ve nimf haline geçerler. Kan ile doyan dişiler toprağa düşer gömlek değiştirip ergin hale geçerler (Şekil 2.7). Erginler yeni konak ararlar, çiftleşirler, beslenmelerini tamamlarlar, ayrılırlar ve daha sonraki yumurtlamaları için toprağa düşerler (Karaer 2006, Anderson ve Magnarelli 2008). Rhipicephalus (Boophilus) microplus tek konaklı bir kenedir. Larva ve nimfler büyükbaş hayvanlarda beslenirler ve gömlek değiştirirler ve sadece kan alınımını tamamlayan ve çiftleşen dişiler konaktan düşer ve yere yumurtalarını bırakırlar (Şekil 2.8). 9

105 Şekil 2.6 Üç konaklı kenelerin yaşam döngüsü ( Şekil 2.7 İki konaklı kenelerin yaşam döngüsü ( 10

106 Şekil 2.8 Bir konaklı kenelerin yaşam döngüsü ( Şekil 2.9 Yumurtalarını bırakmış bir dişi (Karaer 2006) 11

107 2.2.1 Türkiye de yayılış gösteren Ixodidae familyasındaki kenelerin cins ayrım karakterleri (Merdivenci 1969, Karaer vd. 1997, Aydın 2000) Ixodidae familyasındaki kenelerin, ağız organellerine, palp, hipostom ve basis kapituli, bakılarak cins düzeyinde ayrımları yapılabilmektedir. Ixodes cinsinde, palpler uzun, üzerinde kıllar vardır. Hyalomma cinsinde, palpler uzundur, 2. palp segmenti diğerlerine göre daha uzundur. Amblyomma cinsinde, palpler uzundur ve hipostom kalındır. Dermacentor cinsinde, palpler kısadır ve basis kapitulinin seviyesini geçmez Boophilus cinsinde, palpler kısa ve çıkıntılıdır ve palplerin boyu hipostoma eşit veya kısadır. Basis kapituli yanlara taşmıştır ve altıgen şeklindedir. Rhipicephalus cinsinde, palpler kısa ve hipostomdan uzundur ve basis capituli altıgendir. Haemaphysalis cinsinde, palpler kısadır ve 2. palp segmenti basis kapituliden yanlara taşmıştır. Palp ve hipostomları uzundur Palp ve hipostomları kısadır Göz, anal ve subanal plakları vardır. Skutum koyu renkli ve nakışsızdır. İkinci palp segmenti 3. den 2 kat daha uzundur. Festonlar düzensiz ve bir bölümü birbiriyle kaynaşmıştır..... Hyalomma Koch, 1884 Gözleri vardır, anal plak yoktur. Skutumları nakışlıdır. 2. palp segmenti 3. den 2 katından daha uzundur. Festonları düzenlidir ve kaynaşma yoktur..amblyomma Koch,

108 Anal oluk belirgindir ve anüsü önden kuşatır. Skutum, göz, festun ve nakış taşımaz. Erkeklerin ventral yüzü birbirinden belirgin sınırlarla ayrılmış yedi alandan oluşmuştur... Ixodes Latreille, Gözleri vardır, anal plakları yoktur. Skutumları renkli ve nakışlıdır. Festun taşırlar, palpleri geniştir.dermacentor Koch, 1884 Göz ve iki çift anal plakları vardır. Dorsal ve lateralde çıkıntılı olan palpler hipostomdan kısa ya da eşit uzunluktadır. Festunları yoktur...boophilus Curtis, 1891 Göz ve anal plakları vardır, anal oluk belirgindir. Festun taşırlar. Basis kapituli dışa doğru çıkıntılıdır..rhipicephalus Koch, 1884 Göz ve anal plakları yoktur. 2. palp segmenti uzunluğuna oranla iki katı daha geniştir. Anal oluk belirgin ya da değildir, anüsü arkadan kuşatır. Festun taşırlar Haemaphysalis Koch, Ixodidae familyasındaki kenelerin tür teşhis anahtarı (Merdivenci 1969, Karaer vd., 1997, Aydın 2000). Hyalomma türlerinin ayrım anahtarı Erkek 1. Lateral olukları kısa ve skutumun 1/3 üne kadar uzanır Lateral olukları uzun ve çoğunlukla gözlere kadar uzanır Vücut uzunca, scutum konveks ve parlak, arka kısmı az noktalı ancak basık değildir. Servikal olukları küçük ve sığdır......h.a.anatolicum Koch, 1884 Vücut ovalimsi, skutum koyu renkli ve üzerinde az sayıda büyük ve çok sayıda küçük noktalanmalar vardır. Arka kısmında parmanın önünde köprü benzeri bir kabarıklık mevcuttur, bu yapının önü basık ve sık noktalıdır. Ayakları eklem yerlerinden açık kahverengidir..h.a.excavatum Koch,

109 4. Skutum düz parlak, üzerinde büyük ve seyrek noktalar mevcut, posteroparamedian oluklar öne doğru dışa yönelmiş durumda, ayak eklemlerinde halka görünümleri yoktur...h. detritum Schulze, 1919 Vücut büyük yapılı, skutum koyu kahverengi görünümünde, üzeri tamamen veya arka kısımda yoğun noktalı, posteroparamedian oluklar birbirine paralel, ayak eklemlerinde halka şeklinde açık kahverengi alanlar vardır.h. marginatum Koch, Skutum parlak koyu kahverenkli, servikal oluklar çok kısa, lateral, posteromedian ve posteroparamedian olukar yok.... H. aegyptium Linnaeus, 1758 Hyalomma türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Skutum sarımsı kahverengi ve uzunluğuna göre çok az geniş, üzeri seyrek noktalıdır. Servikal olukları geriye doğru sığlaşarak skutumun ortasına kadar uzanır. Genital organ küçük ve yuvarlak ya da uzunca üç köşeli şekildedir... H.a.anatolicum 2. Skutum genişliğine göre daha uzun yapılı, servikal oluklar önde derin, arka kısımda sığ yapılı olup gözlere kadar uzanır. Genital organı düğme tarzında ya da uzunca üç köşelidir H.a. excavatum 3. Skutumun uzunluğu genişliğine eşit, servikal olukları düz ve yuvarlağımsı, üzeri az noktalı. Poros arealar oval ve birbirine yakın konumdadır. Genital organın arkası yanlardan basıktır. Bacakları açık kahverengidir....h. detritum 4. Skutum koyu kahverenginde, arka kısmı biraz basık olup beşgen tarzında eni boyuna eşittir. Üzerinde orta ya da çok sayıda belirgin nokta çukurları vardır. Servikal olukları derin ve uzun şekilde gözlere kadar uzanır. Genital organ büyük ve uzunluğuna göre daha geniş, küremsi oval ya da üç köşeli olup yanları daha iyi gelişmiştir H. marginatum 14

110 5. Skutum koyu kahverenginde, eni boyuna eşittir, poros areaları yuvarlak ve birbirine yakın konumdadır. Bacakları eklem yerlerinde açık kahverengi halkalıdır. Kaplumbağalarda yaygın olarak bulunur.h. aegyptium Ixodes türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Vücut küçük yapılı, skutum parlak ve üzerinde çok sayıda kısa dağınık kıllar bulunur. Genital delik büyük ve 3. coxalar arasında medianda yer almıştır. Bacakları vücut boyundan kısadır. Birinci çift coxa dikenleri büyüktür.....ixodes ricinus Linnaeus, Vücudu orta büyüklükte, skutumu parlak ve üzeri çok küçük noktalı, genital delik enine yarık şeklinde, bacakları vücut boyundan kısadır. Birinci çift coxa dikenleri kalın ancak kısadır...i.hexaganus Leach, Bacakları vücut boyundan kısadır, birinci coxaların iç dikeni çok ince ve uzundur, dış dikeni çok küçüktür, dördüncü coxa üçgenimsidir, anal plakların boyu enine eşittir ve yan kenarları düzdür....i. laguri Olenev, Bacakları vücut boyundan uzundur. Birinci coxaların iç ve dış dikenleri çok küçüktür...i. vespertilionis Koch, 1844 Ixodes türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Skutumu yuvarlak yapılı olup, boyu vücut uzunluğunun yarısı kadardır. Servikal olukları yüzeyseldir. Poros areaları elipsoidal, arası açık ve enine yatık durumdadır. Birinci coxaların iç dikeni büyüktür.....i.ricinus 15

111 2. Skutumun arka kısmı daralarak uzamıştır. Poros areaları yuvarlağımsı, enine yatık eliptik ve arası açıktır. Birinci çift coxaların iç dikeni küçüktür.. I.hexaganus 3. Bacakları incedir, skutumun boyu eninden büyüktür, dördüncü coxa üçgenimsidir. Poros areaları yuvarlaktır. I. laguri 4. Bacakları vücut boyundan uzundur, birinci çift coxalarda diken yoktur. Yarasalarda parazitlenirler..... I.vespertilionis Dermacentor türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Skutumun üzerindeki nakışlı yapılar gümüşi renkli olup keskişn sınırlı değildir. Skutum üzerinde az sayıda büyük ve seyrek çok sayıda belirgin olmayan küçük nokta çukurları bulunur. Birinci coxanın dış dikeni iç dikeninden daha kısadır..d.marginatus Sulzer, Skutumun üzeri gümüşi sarı renkli ve keskin kenarlı nakışlıdır. Üzerinde çok sık ancak küçük ve belirsiz nokta çukurları bulunur. Birinci coxanın iç ve dış dikenleri aynı boydadır....d. niveus Neumann, 1897 Dermacentor türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Nakışları oluşturan alanlar servikal oluklarda ve skutumun yanlarında koyu, diğer kısımlarda açık kurşuni renktedir. Skutum üzerinde büyük nokta çukurları bulunur. Poros arealar oval ve arka kısımları yaklaşmış durumdadır. Dördüncü coxanın dikeni büyüktür......d. marginatus 16

112 2. Skutum üzerinde nakışlı yapı açık kurşuni sarı renkli olarak tüm yüzeyde eşit şekilde nağılmıştır. Skutum üzerinde çok küçük noktalamalar mevcuttur. Dördüncü coxanın dikeni küçüktür....d. niveus Boophilus türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Kaudal çıkıntısı yoktur. Birinci palp ekleminin iç kısmında çıkıntı yoktur. Birinci coxada yarık olmayıp, adanal plağın posterior çıkıntısı da yoktur.... B. annulatus Say, Kaudal çıkıntılı, birinci palp ekleminin iç kısmı kıllı ve çıkıntılı, adanal plağın iç mahmuzu kısadır. Birinci çift coxalarda bir yarık vardır...b. kohlsi Hoogstraal ve Kaiser, 1960 Boophilus türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Scutumu küçük yapılı, birinci palp ekleminin çıkıntısı kılsız, porps arealar ovaldir. Birinci coxa düz girintili ve iki küçük mahmuzludur. Basis capitulinin arka kenarı düzdür. Gözleri küçüktür......b. annulatus 2. Birinci coxada V formunda belirgin bir yarık ve iki belirgin mahmuzu vardır. Gözleri büyüktür.....b. kohlsi Rhipicephalus türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Skutum üzerinde çok sayıda büyük noktalar vardır..2 Skutum üzerinde az sayıda büyük noktalar vardır

113 2. Adanal plaklar dar ve uzun üçgenimsidir. Peritremin kuyruk uzantısı dar uzanmış ve kavislidir. Parması belirgindir..r.sanguineus Latreille, 1806 Adanal plaklar dar ve uzun üçgenimsidir. Peritremin kuyruk uzantısış kısa, kalın ve küttür. Parması belirgindir R. turanicus Pomerantzev ve Matikasvili, Adanal plaklar geniş üçgen tarzındadır. Palpleri küçük ve basis kapitulinin genişliğinden kısadır. Peritremin kuyruk uzantısı incedir......r. bursa Canestrini ve Fanzago, 1877 Rhipicephalus türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Skutumun servika olukları az belirgindir, üzerinde az sayıda be büyük nokta çukurları vardır..2 Skutumun servikal olukları az belirgindir, üzeri fazla noktalıdır Poros arealar küçük ve birbirinden uzaktır. Genital deliğin arka kısmı açık V şeklindedir... R. sanguineus Poros arealar büyük ve birbirinden uzaktır. Genital deliğin arka kenarı yuvarlaktır..r. turanicus 3. Poros arealar büyük ve ovalimsi olup, öne yakın konumdadır.....r. bursa Haemaphysalis türlerinin ayrım anahtarı Erkekler 1. Palplerin ikinci eklemi dışa taşkındır ve festunları belirgindir..3 18

114 2. Palplerin ikinci eklemi dışa taşkın değildir. Skutumda servikal ve lateral oluklar yoktur. Festonları belirgin değildir, dördüncü coxa dikenleri küçüktür...hae. inermis Birula, Dördüncü coxanın dikeni büyüktür ve içe dönüktür......hae. punctata Canestrini ve Fanzago, 1877 Dördüncü coxanın dikeni büyük ancak dışa dönüktür, scutumun üzeri çok noktalıdır...hae. sulcata Canestrini ve Fanzago, 1877 Dördüncü coxanın dikeni çok küçüktür, palplerin ikinci eklemi az taşkındır, skutumun ön kısmında büyük nokta çukurları vardır....hae. parva Schulze, Vücudu uzunca oval, skutumu parlak, palplerin ikinci eklemi sivrilmiş halde yanlara taşkındır. Bütün coxaların dikenleri küçük ve aynı büyüklüktedir..... Hae. numidiana Neumann, 1794 Haemaphysalis türlerinin ayrım anahtarı Dişiler 1. Palplerin ikinci eklemi yanlara taşkındır 3 2. Scutumunun eni boyundan geniştir, porps areaları yuvarlak ve birbirinden uzaktır. Hipostom dişleri 3/3 sıralıdır. Palplerin ikinci eklemi yanlara taşkın değildir. Tüm coxa dikenleri küçük ve eşit yapıldır.....hae. inermis 3. Scutumun üzerinde küçük nokta çukurları vardır. Hipostom dişleri 4/4 sıralıdır. Servikal olukları belirgin olup skutumun ortasına kadar uzanır. Poros arealar küçük ve yuvarlak olup birbirlerinden ayrıktır. Genital delik yanlardan iki dar plakla kaplıdır Hae. parva 19

115 Scutum üzerinde seyrek noktalamalar vardır. Hipostom dişleri 5/5 sıralıdır. Poros arealar büyük ve birbirine yakındır. Lateral olukları arkada birer festun kuşatır.....hae. punctata Scutumun kenarları yuvarlak yapılı olup, üzerinde düzenli dağılmış küçük noktalamalar bulunur. Hipostom dişleri 4/4 sıralıdır. Servikal olukları çok kısadır. Poros areaları yuvarlak yapılı ve araları fazla açık değildir. Coxaları geriye doğru büküktür hae. sulcata Skutum açık kahverengindedir ve üzerinde sık ve büyük nokta çukurları bulunur. İkinci palp eklemi çok büyük olup, yan çıkıntısı sivrilmiştir. Hipostom dişleri 4/4 sıralıdır. Servikal olukları uzun ve derindir.hae. numidiana Türkiye deki keneler ve dağılımları Türkiye nin sürüngenlerde, kuşlarda ve memelilerde tespit edilen ve zarar veren kene faunası, 2 familyaya ait 10 cins ve yaklaşık olarak 32 türden oluşmaktadır (Oytun 1947, 1961, Kurtpınar 1954, Merdivenci 1969, Hoffman vd. 1971, Karaer vd. 1997, Aydın 2000). Türkiye de Ixodidae ve Argasidae familyasında hayvan hastalıkları açısından önemli yer tutan keneler şu şekildedir: Ixodes; Ixodes ricinus, Ixodes hexagonus Amblyomma; Amblyomma variegatum Haemaphysalis; Haemaphysalis parva, Haemaphysalis punctata, Haemaphysalis sulcata, Haemaphysalis inermis, Haemaphysalis concinna, Haemaphysalis numidiana Hyalomma; Hyalomma aegyptium, Hyalomma anatolicum anatolicum, Hyalomma anatolicum excavatum, Hyalomma marginatum, Hyalomma detritum, Hyalomma dromedarii Boophilus, Boophilus (Rhipicephalus) annulatus, Boophilus kohlsi, Dermacentor; Dermacentor marginatus, Dermacentor niveus, 20

116 Rhipicephalus; Rhipicephalus bursa, Rhipicephalus sanguineus, Rhipicephalus turanicus Ornithodoros; Ornithodoros lahorensis Argas; Argas persicus, Argas reflexus Otobius; Otobius megnini (Aydın ve Bakırcı 2007). Bunun dışında ülkemizde kene türlerinin dağılımında muhtemelen bölgedeki ekolojik faktörler etkilidir. Yüksek yağış miktarı ve yoğun olarak bulunan ormanlık alanlardan dolayı Ixodes spp. Türkiye nin kuzeyinde, çoğunlukla Hatay da (Suriye sınırı) Amblyomma variegatum, Türkiye nin güneydoğusunda (Suriye sınırı) Boophilus kohlsi, İç Anadolu ve Doğu Anadolu da Ornithodorus ve Doğu Anadolu da (Malatya) Otobius megnini. Haemphysalis, Hyalomma, Boophilus, Dermacentor, Rhipicephalus ve Argas Anadolu nun her yerinde yaygın olarak bulunur (Aydın ve Bakırcı 2007). Kayseri de yapılan bir araştırmaya göre Rhipicephalus türlerinin ilkbahar, yaz ve sonbaharda görüldükleri belirtilmiş ve en yaygın oldukları zamanın yaz olduğu, Hyalomma erginlerinin, ilkbahar, yaz ve sonbaharda görüldüğü ve en yaygın oldukları zamanın yaz olduğu bildirilmiştir. Haemaphysalis, sonbahar, kış ve ilkbaharda görülmüştür. Ornithodorus lahorensis, sonbahar, kış ve ilkbaharda görülmüştür ve en çok bulundukları zamanın kış olduğu belirtilmiştir. Dermacentor marginmatus bütün mevsimlerde görülmüştür. Boohilus annulatus türünün en çok ilkbaharda yaygın olduğu bildirilmiştir (Ica vd. 2007). 2.3 Kenelerin Bulaştırdıkları Hastalıklar Kenelerin ekonomik olarak öneme sahip olan hayvanlarda ciddi kayıplara ve insanlarda ölüm oranı yüksek olan hastalıklara yol açmaları açısından insan ve hayvan sağlığı açısından önemli yere sahiplerdir. Keneler tarafından taşınan zoonotik etkenler arasında bakteriyel (tularemi, lyme hastalığı), riketsiyal (benekli humma, Q humması, ehrlichiosis), parazitik (babesiosis) ve viral (tick borne encephalitis, kanamalı ateşler) infeksiyon etkenleri gösterilebilir (Despommier vd. 2000, Jongejan ve Uilenberg 2004). 21

117 Çizelge 2.2 Kenelerin insanlara bulaştırdığı bazı hastalıklar (Kaya 2007, Derviş 2009) Bakteriyal Hastalıklar Viral Hastalıklar Protozoal Hastalıklar Ricketsiyal Hastalıklar Hastalık Etken Vektör Lyme Hastalığı Borrelia Ixodes pasificus, burgdorferi I.scapularis, I. ricinus Dalgalı Humma Borrelia crocidurae Ornithodorus erractus Lekeli Humma Borellia borelli Rhipicephalus sanguineus İran Dalgalı Borrelia persicus Ornithodoros Humması tholozoni Hyalomma spp., Kırım Kongo Bunyaviridae Ixodes spp., Kanamalı Ateşi Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Kene Encephaliti Flaviviridae Ixodidae Kolarado Kene Reoviridae Dermacentor Humması Coltivirus andersoni Orta Avrupa Kene Flaviviridae Ixodes spp. Humması Ixodes spp., Rusya Bahar Yaz Flaviviridae Hyalomma spp., Humması Dermacentor spp., Rhipicephalus spp. Babesiosis Babesia spp Ixodes spp. Avustralya Kene Rickettsia australis Ixodes spp. Tifusu Akdeniz Lekeli Rickettsia conorii Rhipicephalus Humması sanguineus, Dermacentor 22

118 2.3.1 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı (KKKA) Hastalık ilk olarak 1944 yılında Kırım da görev yapan 200 Sovyet askerinde görülmüş ve Kırım Kanamalı Ateşi olarak adlandırılmıştır. Ardından 1956 yılında Belçika Kongosu nda görülen hastalığın, Kırım Kanamalı Ateşi ile aynı hastalık olduğu 1969 yılında anlaşılmış ve o günden itibaren de hastalık Kırım Kongo Kanamalı Ateşi adıyla anılmaya başlamıştır (Ergonul 2006a, Kara 2008). Hastalık tanımlandıktan sonra vakalar çoğunlukla Sovyetler Birliği ve Bulgaristan dan bildirilmekteydi (Whitehouse 2004, Ergonul 2006a). Çin in kuzeybatısında 1965 yılında mortalitesi % 80 olan bir salgın tanımlanmış, sonraki 30 yılda Çin de 260 KKKA vakası bildirilmiş ve % 21 mortalite ile sonuçlanmıştır. Pakistan da büyük KKKA salgınları olmuş, yılları arasında görülen 101 KKKA vakasından % 40 ı kaybedilmiştir. Suudi Arabistan da yılları arasında mezbaha işçileri arasında 40 vaka tanımlanmış ve bunların % 30 u ölmüştür. KKKA, Yunanistan ve Romanya dışında Balkan Yarımadası nda endemiktir. Bulgaristan da yılları arasında 124 KKKA vakası bildirilmiş ve bunların 24 ü kaybedilmiştir (Ergonul 2006a, Kara 2008). 23

119 Şekil 2.10 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü nün dünyadaki dağılımı (Ergonul 2006a) Vektör olduğu kanıtlanmış 10 kene türü bulunmaktadır. Bunların altısını Hyalomma cinsi keneler oluşturmaktadır. Bunlar; Amblyomma variegatum, Hyalomma marginatum, Hyalomma rufipes, Hyalomma anatolicum, Hyalomma asiaticum, Hyalomma truncatum, Hyalomma impeltatum, Dermacentor marginatus, Rhipicephalus evertsi, Rhipicephalus rossicus türleridir. Bunlar içinde özellikle bazı Hyalomma türlerinin KKKA hastalığında çok etkili rol oynadığı kabul edilmektedir ve KKKA hastalığı yayılışı da Hyallomma türlerinin yayılışı ile örtüşmektedir (Korsunova ve Petrova-Pointovskaya 1949, Hoogstraal 1979, Logan vd. 1989, Camicas vd. 1994, Dohm vd. 1996, Butenko ve Karganova 2007, Turell 2007). Hyalomma marginatum türünün Balkanlar, Kırım ve Kafkaslarda; Hyalomma anatolicum türünün İran, Pakistan, Türkmenistan ve Tacikistan da; Hyalomma asiaticum türünün Orta Asya ve Çin de; Hyalomma rufipes ve Amblyomma variegatum türlerinin ise Afrika da ve 24

120 Karayip Adaları nda, Avrupa da da Ixodes ricinus türlerinin virüsün ana vektörleri olduğu belirtilmiştir (Hoogstraal 1979, Butenko ve Karganova 2007, Turell 2007 Anderson ve Magnarelli 2008) (Çizelge 2.3). Hyalomma marginatum, Hyalomma anatolicum ve Dermacentor marginatus türü kenelerin vektörlüğü ve bu türlerin ülkemizde de bulunduğu bildirilmiş olmasına rağmen, 2005 yılından itibaren başlayan saha çalışmalarının sonucunda KKKA salgınları ile ilişkili kene türünün H. marginatum olduğu ortaya konmuştur (Tonbak vd. 2006, Vatansever vd. 2007). KKKAV ilk olarak 1960'larda Hyalomma cinsinin yetişkin formlarından izole edilmiştir (Watts vd. 1988, Ergonul 2006b). Hyalomma cinsi kenelerin KKKA virüsünün ana vektörü olduğu düşünülse de R. bursa türünün de virüsün taşınmasında rol oynuyor olabileceği belirtilmiştir (Tonbak vd. 2006). Bununla birlikte bir tane de ısıran tatarcıktan (Culicoides spp.) KKKA virüsü izole edilmiştir (Hoogstraal 1979, Linthicum ve Bailey 1994). 25

121 Çizelge ten beri ortaya çıkan Kırım Kongo Kanamalı Ateşi salgınları (Ergonul 2006a) Coğrafi bölge Yıllar Olgu sayısı Olgu ölüm oranı (%) Meslekler Güneydoğu Avrupa Kırım Astrahan Rostov Bulgaristan Arnavutluk Kosova Hayatta kaldı 33 Askerler Tarım ve sağlık çalışanları Tarım çalışanları Tarım ve sağlık çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım ve sağlık çalışanları Tarım çalışanları Türkiye Asya Çin Kazakistan Tacikistan Pakistan Orta Doğu Birleşik Arap Emir. Irak Suudi Arabistan Umman Emirliği İran Afrika Zaire (Kongo) Uganda Moritanya Burkina Faso Güney Afrika Cumh. Tanzanya Güneybatı Afrika Kenya Bilinmiyor Bilinmiyor 18 Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım ve lab. çalışanları Çoban, sağlık çalışanları Sağlık çalışanları Tarım ve sağlık çalışanları Sağlık çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Tarım çalışanları Hekim Laboratuvar çalışanları Deve sahibi Tarım ve sağlık çalışanları Bilinmiyor Çiftçiler, sağlık çalışanları Öğrenci Bilinmiyor Tarım çalışanları 26

122 Türkiye de Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı Ülkemizdeki ilk olgularla 2002 yılında Karadeniz Bölgesi nin iç kısımlarında, İç ve Doğu Anadolu Bölgeleri nin kuzey kesimlerinde karşılaşılmıştır yılına kadar toplam 500 olgu Sağlık Bakanlığı na bildirilmiş ve bu olguların 26 tanesi ölümle sonuçlanmıştır (Ergonul vd. 2004, Ergonul 2006b, Ozkurt vd. 2004). Hastalık ülkemizde ilk olarak Tokat, Amasya ve Sivas illerinde 2002 yılının Mayıs, Haziran ve Temmuz aylarında görülmeye başlamıştır. Bu dönemde Tokat ilinden yapılan 50 vaka bildiriminden 6 sı ölümle sonuçlanmıştır (Gozalan vd. 2004, Sağlık Bakanlığı 2005) yılından günümüze vaka sayısı artarak devam etmektedir (Çizelge 2.4). Çizelge 2.4 Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi vaka ve ölümlerinin yıllarına göre dağılımı (Anonim 2009) Yıllar Vaka Sayısı Ölüm Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü KKKAV, Bunyaviridae ailesinden Nairovirus cinsinde yer alan 100 nm büyüklüğünde kılıflı bir RNA virüsüdür. Bunyaviruslar, zarflı ve negatif polaritesi olan tek iplikçikli RNA parçacığından oluşmaktadırlar (Elliott vd. 1991). Bunyaviridae ailesi içinde 27

123 Nairovirüslerin dışında Hantavirüs, Orthobunyovirüs, Phlebovirüs ve Tospovirüs türleri bulunmaktadır (Ergonul 2006a, Kara 2008, Tanır vd. 2008). KKKAV nispeten dayanıksızdır, konakçı dışında yaşayamaz, ultraviyole ile hızla ölür. Kanda 40 C de 10 gün yaşayabilir. Virüs 56 C de 30 dakikada inaktive olur. Antiseptiklerden % 1 hipoklorit ve % 2 gluteraldehite, antivirallerden ribavirine duyarlıdır (Ergonul 2006a, Kara 2008). KKKAV nin 8 farklı genetik grubu bulunmaktadır. Türkiye den izole edilen KKKAV suşlarının tamamına yakını Güney Rusya (kuzey Kafkaslar) ve Kosova suşlarına yakındır ve İran da 2002 de görülen salgındaki suşlardan farklıdır (Midilli vd. 2007, Vatansever vd. 2007). Virüs, evcil ve yabani hayvanlarda 7-10 gün kadar kalabilirken kenelerde hayatları boyunca bulunabilmektedir. Hatta kenelerde transstadial ve transovarial nakil ile nesillere de aktarılabilir. Transstadial nakilde, kene larva ve/veya nimf halindeyken viremik konaktan kanı emip gömlek değiştirip ergin hale geçtikten sonra bu virüsü başka konaklara vermesidir. Transovarial nakil ise, erişkin dönemlerde enfeste konaklardan kan emen bir dişi kenenin virüsü yumurtalarına aktarmasıyla gerçekleşir (Jongejan ve Uilenberg 2004) Kırım Kongo Kanamalı Ateşi hastalığının tanısı Serolojik tanısı 1980 den önce KKKAV enfeksiyonu tanısında ve çalışmalarında, komplement fiksasyon, immünodifüzyon ve hemaglütinasyon inhibisyonu gibi hassas olmayan ve tekrarlanamayan serolojik testler kullanılıyordu (Hoogstraal 1979). KKKA enfeksiyonunu ispat etmek zordu. Günümüzde ise hastalığın başlamasından yedi gün sonra enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ve indirekt fluoresans antikor (IFA) testleriyle IgM ve IgG antikorları saptanabilmektedir (Shepherd 1989). Spesifik 28

124 IgM düzeyi enfeksiyondan dört ay sonra saptanamayacak kadar azalırken IgG düzeyleri beş yıl boyunca saptanabilir seviyede kalmaktadır (Charrel vd. 2004) Moleküler tanısı Ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (Reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) yöntemi, KKKAV enfeksiyonun hızlı tanısında tercih edilmesi gereken yöntemdir. RT-PCR tekniği ile hastalığın 16. gününe kadar viral RNA, serum örneklerinde saptanabilmektedir. Yöntem son derece özgün, duyarlı ve hızlıdır (Drosten vd. 2003, Bakır ve Elaldı 2006). RT-PCR, virüsün genetik materyalini tespit eder, virüs kültürü yapılmadan KKKA tanısı yapmak mümkündür. RT-PCR ın hassasiyetinin fazla olmasından dolayı, kültürü negatif olan örneklerin serumlarından bazen pozitif sonuç elde edilebilir (Schwarz vd. 1996) Hayvanlarda Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKAV) genellikle doğada kene-omurgalı-kene döngüsünde fark edilmeden dolaşmaktadır. KKKAV, sığır ve keçi (Causey vd. 1970, Woodall vd. 1965), koyun (Yu-Chen vd. 1985), yabani tavşan (Chumakov 1974), kirpi (Causey 1970), Mastomys spp. (Saluzzo 1985) ve hatta evcil köpekleri bile içeren (Shepherd vd. 1987a, b) çeşitli evcil ve vahşi hayvanlardan izole edilmiştir. Çeşitli vahşi hayvanların serumlarında KKKAV ye karşı antikorlar vardır ve seroepidemiolojik çalışmalarda ayrıca Avrupa, Asya ve Afrika nın çeşitli bölgelerindeki evcil sığır, at, eşek, koyun, keçi ve domuzlarda KKKAV ye karşı antikorlar tespit edilmiştir (Watts vd. 1989). KKKAV nin vektörü olan Hyalomma anatolicum kenelerinin ergin olmayan formlarının bazen kertenkelelerden beslendiği bilinmesine rağmen (Hoogstraal 1979) ilginç bir şekilde KKKAV ye karşı antikor sürüngende, sadece Tacikistan da bir kaplumbağada, tespit edilmiştir ( Pak vd. 1971). 29

125 Birçok evcil ve vahşi omurgalılar KKKAV ile enfekte olmasına rağmen, genel olarak, kuşlardaki vireminin ve/veya antikor cevabının artışı KKKAV enfeksiyonuna karşı dayanıklı olduğunun kanıtıdır. Hoogstraal ın yaptığı çalışmalar kuşların çok fazla sayıda KKKAV enfekteli kenelerle muamele edilse bile KKKA viremisine karşı dayanıklı olduklarını göstermiştir (Hoogstraal 1979). Buna rağmen bazı istisnalar da vardır: Kazakistan daki 428 tavuk ve ördek serum örneğinde 1 tane KKKAV ye karşı antikor tespit edilmiştir. Ayrıca saksağan serumlarında da (Pica pica) KKKAV ye karşı antikorlar saptanmıştır. Evcil tavuklarda da KKKAV enfeksiyonuna karşı dayanıklılığı kanıtlanmıştır (Shepherd vd. 1987a, b). Aynı zamanda bu çalışmada, deneysel olarak KKKAV ile enfekte edilen beçtavuğunda (Numidia meleagris) düşük miktarda KKKA viremisi tespit edildi. Yapılan başka çalışmalarda, kırmızı gagalı gucuk kuşuna ve sığırcıklara yapılan KKKAV aşılaması sonrasında antikorlar tespit edilmiştir, hiçbir kuşta tespit edilebilir bir viremi gözlemlenmemiştir (Zeller vd. 1994). Diğer bir istisna da Güney Afrika da ticari devekuşlarının et endüstrisinde hastalığın görünmesi olmuştur te, Güney Afrika da çiftlikte devekuşu (Struthio camelus) kesimi yapan çalışanlarda KKKA vakası ortaya çıkmıştır (Van Eeden vd. 1985). Çevredeki çiftliklerdeki devekuşlarının % 24 ünde KKKAV ye karşı antikor tespit edilmiştir. Hasta çalışanların olduğu bir çiftlikteki dokuz deve kuşundan altısında da antikorlar tespit edildi. İlginç bir şekilde, bu çalışma esnasında test edilen başka 37 tür 460 kuşun hiç birinde KKKAV ye karşı tespit edilebilir antikorlar saptanmamıştır (Shepherd vd. 1987a, b). Ayrıca, 1996 da devekuşu mezbahasında çalışanlarında 17 tane KKKA vakası görülmüştür (Swanepoel vd. 1998). İki örnekte de, enfeksiyonun devekuşlarının kanıya temas ile ya da devekuşlarının derisi yüzülürken yanlışlıkla enfekte kenelerin ezilmesi ile bulaştığından şüphelenilmiştir. Devekuşları KKKAV ile enfekte edilmişlerdir (Swanepoel vd. 1998). Deri altından KKKAV ile enfekte edilen devekuşlarında vireminin 1-4 gün sonra arttığı ve aşılamadan sonra 5 güne kadar iç organlarda virüsün tespit edilebilir seviyede olduğu görülmüştür. 30

126 2.4 Kenelerin Kontrolü Biyolojik kontrol Günümüzde keneler çoğunlukla kimyasal akarasitlerle kontrol edilse de biyolojik kontrol şu nedenlerden dolayı daha cazip bir hal almaktadır. 1) Çevresel güvenlik ve insan sağlığı hakkında artan endişeler. 2) Kimyasal kontrolün artan fiyatları 3) Kenelerin pestisitlere karşı artan direnci (Samish vd. 2004). Doğal düşmanlara karşı uygulama metotları şunları içerebilir: 1) Bireysel aşı (inoculative) ya da = kritik zamanda aşılama= 2) Kitle halinde salım (inundative) Kenelerin akarasitlerle 2 genel kontrol yöntemi vardır. 1) Konak üzerinde (On-host) 2) Konak dışında (Off-host) Konak üzerindeki kontrolde, keneler için omurgalılar konak olarak kullanılır. Küçük alanlarda oldukça fazla konsantrasyondaki pestisitler uygulanır ve keneleri öldürür. Ayrıca bu strateji daha sabit çevresel şartlardaki konaklar için daha faydalı olabilir (sıcaklık nisbi nem gibi). Bunlar biyolojik kontrol için önemli etkenlerdir. Konak dışında kontrol stratejileri, konaktan uzakta uygulamaya olanak sağlarlar. Konak dışındaki kontrol, bireysel olarak omurgalı konaklarının pestisitlere maruz kalmasını azaltır fakat çevredeki büyük alanlar bazı tehlikelere maruz kalabilir. Bu iki uygulamada da çevresel tehlike, eğer biyokontrol teknikleri verimli bir şekilde uygulanıyorsa büyük ölçüde azalır (Samish vd. 2004). 31

127 Patojenlerle kontrol Bakterilerle kontrol Brum ve arkadaşları Boophilus microplus kenesine patojenik olan Cedecea lapagei bakterisini bulmuşlardır. Laboratuvar şartları altında bu bakteri kenenin genital açıklığı yolu ile keneyi enfekte ettiği ve % 100 ölümle sonuçlandığı görülmüştür (Brum vd. 1991a, Brum vd. 1991b, Brum vd. 1992). Proteus mirabilis bakterisinin Dermacentor andersoni, Amblyomma hebraeum, Hyalomma marginatum, Rhipicephalus eversti eversti ve Boophilus decolarus kene türlerinde türünde patojen olduğu bildirilmiştir (Brown vd. 1970, Hendry ve Rechav 1981). Petri kaplarında yapılan çalışmalar sonucunda Bacillus thuringiensis in 3 farkı ticari varyasyonu bulunmuştur (B. t. kurstaki, B. t. israelensis ve B. t. thuringiensis). Bunlardan beslenmemiş ya da kan emmiş ergin Argas persicus ya da Hyalomma dromedarii türlerinin üzerine sıkıldığında öldüren B. thuringiensis bakterileri üretilmiştir (Hassanain vd. 1997). Ixodes scapularis larvaları B. t. kurstaki türünün spor solüsyonuna 30 saniye daldırılmış ve bu bakterinin bu kenede patojen olduğu saptanmıştır (Zhioua vd. 1999a, b). B. thuringiensis türünün endotoksininin kristal yapıda olduğu ve zararlıların orta bağırsak duvarını sarıp spor ürettiği ve kenelerde kan zehirlenmesine sebep olduğu belirtilmiştir (Gill vd. 1992, Flexner ve Belnavis 2000). B.thuringiensis ürünleri, ziraatte, tarımda en çok kullanılan kanıtlanmış biyokontrol ajanlarıdır (Navon 2000). 32

128 Mantarlarla kontrol 700 ün üzerinde entomopatojenik mantar bildirilmiştir. Ama bunlardan sadece 10 tanesi insektisit kontrolü için geliştirilmiştir (Hajek 1994, Butt 2001). Doğada, kenelerle ilişkili 20 mantar türü belirtilmiştir. 7 cins keneden 13 türünün mantarlar tarafından enfekte edildiği bulunmuştur (Kolomyetz 1950, Samsinakova 1957, Steinhaus ve Marsh 1962, Cherepanova 1964, Krylov 1972, Samsinakova vd. 1974, Estrada vd. 1990, Mwangi vd. 1995, Zhioua 1999a, Guerra 2001). En umut vadeden mantar Deuteromycetes (mitosporic fungi) familyasındandır. Entomopatojenik mantarlar, Arthropodların kutikulasından içeri girebilmektedir. Mantarların bazı dezavantajları da vardır. Bunlar şu şekilde sıralanabilir: 1) Konağı öldürmede yavaştırlar. 2) Çimlenmeleri ve sporlanmaları için yüksek neme ihtiyaçları vardır. 3) UV ışınlarına karşı duyarlıdırlar. 4) Bazıları hedef dışı arthropodlara etki ederler 5) Üretimleri ve muhafazaları zordur (Ginsberg vd. 2002). Entomopatojen fungusların zararlıları, genellikle vücutları içinde misellerinin gelişmesi ile vücut boşluklarını miselleri ile doldurmaları yoluyla zararlıyı, salgıladıkları toksinlerle zehirleyip öldürdükleri saptanmıştır (Yıldırım 2008). Kuzeydoğu Amerika da Verticillium spp. ve Beauveria bassiana kenelerden izole edilmiştir. Avrupa dan 10 tür Afrika dan 3 tür izole edilmiştir (Cherepanova 1964, Samsinakova 1974, Mwangi 1995, Zhioua 1999a). Brezilya da toplanan doymuş B. microplus dişilerinin % i Beauveria bassiana tarafından, % 10 u Metarhizium anisopliae tarafından kontamine edilmiştir (Da Costa vd. 2001). 33

129 Kuzey Avrupa da mevsime bağlı olarak doğada % 6-32 arasında doymuş I.ricinus dişileri mantarlar tarafından enfekte edildiği gözlemlenmiştir (Kalsbeek vd. 1995). Kenya da mantarlarla enfekteden dolayı % 1.7 oranında doymuş Rhipicephalus appendiculatus ölmüştür (Mwangi vd. 1995). Kuzeydoğu Amerika da toplana I. scapularis doymamış dişilerinin % 4.3 oranında enfekte olduğu saptanmıştır (Zhioua vd. 1999a). Doğada, ergin kenelerin diğer evrelerdeki kenelere göre daha kolay enfekte olduğu ve doymuş dişilerin de çok kolay bir şekilde enfekte olduğu görülüyor (Kalsbeek vd. 1995, Zhioua vd. 1999a). Laboratuvar çalışmalarında Metarhizium anisopliae ve Beauveria bassiana nın en güçlü kene karşıtı patojenlik gösterdiği ortaya konmuştur (Guangfu 1984, Gindin vd. 2001, Samish vd. 2001). Birçok durumda M. anisopliae suşlarının B. bassiana ya göre daha zarar verici olduğu görülmüştür (Castineiras vd. 1987, Mwangi vd. 1995, Barci 1997, Kaaya ve Hassan 2000, Sewify vd. 2001, Zangi 2003). Laboratuvar şartları altında en az 15 sert kene türünün ve 2 yumuşak kene türünün mantarlara karşı duyarlı olduğu bulunmuştur (Samish vd. yayınlanmamış gözlem). B. annulatus, H. excavatum ve R. sanguineus un doymamış larvalarının 5 mantarın 12 izolatına karşı olan duyarlılıkları incelendiğinde Boophilus ve Hyalomma larvalarının benzer ve Rhipicephalus cinsine göre daha duyarlı oldukları genel yargısı ortaya çıkmıştır. Bunun aksine doymuş H. excavatum dişilerinin, diğer iki türün dişilerinden entamopatojenik mantarlara karşı direncinin çok daha fazla olduğu görülmüştür (Gindin vd. 2003). 34

130 Birçok insektisit yumurtasına göre kene yumurtaları mantarlara karşı daha duyarlıdır. Yumurtalar laboratuvar şartları altında mantara maruz bırakılmıştır ve hiç biri yumurtadan çıkamamıştır (Boichev and Rizvanov 1960, Gorshkova 1966, Castineiras vd. 1987, Monteiro vd. 1998a, Monteiro vd. 1998b, Bittencourt vd. 1994, Kaaya ve Hassan 2000, Paiao vd. 2001, Gindin vd. 2003). B.microplus un larvalarının bulunduğu bir ortama M.anisopliae sporları püskürtülmüş ve bir hafta sonra kontrol grubu ile karşılaştırıldığında daha az larva görüldüğü belirtilmiştir (Bittencourt 2000). M. anisopliae sporları sığırlar üzerinde bulunan B. microplus ve B. decoloratus enfeksiyonlarına karşı püskürtülmüş ve kene populasyonunda % 50 lik bir azalma olduğu görülmüştür. Uygulamadan sonra toplanan kenelerin laboratuvarda % 79 unun öldüğü ve yumurta üretiminin % 50 azaldığı görülmüştür (Castro vd. 1997, Correia vd. 1998, Bittencourt vd. 1999, Kaaya ve Hassan 2000). M. anisopliae türünün B. microplus kenelerine karşı olan etkileri sığırlar üzerinde doğal ortamda denenmiş ve bu mantarın % oranında doymuş dişilere karşı etkili olduğu bildirilmiştir (Alonso- Diaz vd. 2007). B. microplus türünün sığırlardaki enfeksiyonuna karşı Verticillium lecanii fungusu denenmiştir. Bir kere yapılan denemede kene sayısının % oranında azaldığı ve dört kere yapılan uygulamada ise kene sayısının % oranında azaldığı bildirilmiştir (Camacho 1998). B. bassiana, M. anisopliae, M. flavoviridae, Paecilomyces fumosoroseus ve V. lecanii fungus türlerinin laboratuvar şartları altında B. annulatus türünün değişik dönemlerine karşı patojeniteleri karşılaştırılmış ve M. anisopliae ve B. bassiana izolatlarının en virulant oldukları belirtilmiştir (Gindin vd. 2001). R. apperndiculatus ve A. variegatum ya da H. excavatum ve R. sanguineus arasındaki karşılaştırmada görülüyor ki mantarlara karşı olan duyarlılıkları; larva, nimf, ergine 35

131 doğru azalmaktadır (Kaaya ve Hassan 2000, Samish ve Alekseev 2001, Gindin vd. 2003). Fakat doymamış I.scapularis larvaları, doymamış erginlere göre daha az dayanıklıdır (Zhioua vd. 1997) Entomopatojenik nematodlarla kontrol Heterorhabditidae ve Steinernematidae ailelerine ait, Steinernema ve Heterorhabditis cinsine bağlı entomopatojenik nematodlar insektler için zorunlu parazitlerdir. Konağın ağız, anüs, stigma gibi doğal açıklıklarından içeri girerler. Buradan konağın bağırsağına ve bağırsağı delerek vücut boşluğuna geçerler. Taşıdıkları bakteriyi konağın vücut boşluğuna ve sindirim sistemine bırakırlar ve konağın saat arasında ölümüne sebep olurlar (Glazer 2001a, Samish vd. 2004, Yıldırım 2008). Steinernema cinsine bağlı entomopatojen nematodların Xenorhabdus, Heterorhabditis cinsine bağlı entomopatojen nematodların ise Photorhabdus cinsine ait bakteriler ile ortak yaşadığı bilinmektedir (Hazır vd. 2003). Entomopatojenik nematodlar doymuş B. annulatus un dişilerine anüs ya da genetik açıklıktan girerler. Heterorhabdit nematodları, petri kabında, 2.5 saatten daha az bir sürede doymuş dişi B.annulatus ları öldürdüğü gözlemlenmiştir. Buna karşılık Steinernematid nematodlarının kenelere etki etmesi için, keneye girebilmesi için 4 saatten fazla zamana ihtiyaçları olduğu bulunmuştur (Glazer vd. 2001b). Tek bir heterorhabdit nematodun bile keneye girişi ölüme neden olmaktadır (Glazer 2001b). Laboratuvar çalışmalarında Ixodidae familyasından 6 cins, Argasidae familyasından 2 cinsin entomopatojenik nematodlar tarafından öldürüldüğü saptanmıştır. Sadece B. microplus un nematod saldırılarına karşı dirençli olduğu görülmüştür (Mauleon vd. 1993). 36

132 Kenelerin değişik dönemlerinde entomopatojenik nematodlara karşı hassasiyetlerinin farklı olduğu gösterilmiştir. Tamamen doymuş dişi kenelerin daha hassas olduğu, larva ve nimf dönemlerinde hassasiyetlerinin daha az olduğu, beslenme sırasında keneler entomopatojenik nematodlara ve onların yumurtalarına karşı çok dirençli olduğu, aç dişi kenelerin, doymuşlarına göre 6 kat daha hızlı öldükleri belirtilmiştir (Samish vd. 2000a, Samish vd. 2000b). Bu durumun kenelerin hemolimflerinin antibakteriyel özelliklerinden dolayı olabileceği düşünülmektedir (Ceraul vd. 2002). Bu çalışmalar sonucunda heterorohabdit nematodlarının steinernematidlere göre kenelere karşı daha zararlı olduğu ortaya çıkmıştır (Mauleon vd. 1993). Kene kontrolünde genellikle bazı avantajlarından dolayı nematodlar tercih edilir. Bu avantajlar şu şekilde sıralanabilir; 1) Doymuş dişi kenelerin bazı entomopatojen nematodlara karşı duyarlı olması ve buna rağmen bazı nematod türlerinin bulunduğu bölgelerde bulunmayı tercih etmeleri. 2) Sabit kenelerin, hareketli nematodları çekmeleri. 3) Nematod uygulamalarında spreylemek ya da sulama şeklindeki yöntemlerin, kene habitatlarına uygulamanın daha kolay olması (Samish vd. 2004). Bu avantajlarının yanında nem, sıcaklık, toprağın yapısı ve içeriği gibi ekolojik şartlar, kenelerin dönemlerinden kaynaklı olan farklılıklar ve türler arasındaki hassasiyet farklılıklarından dolayı entomopatojen nematodların kullanımları sınırlıdır (Samish vd. 2004, Yıldırım 2008) Parazitoidlerle kontrol Parazitodilerde konağı bulma görevi dişilere aittir. Dişi birey yumurtalarını konağın üzerine veya içine bırakır. Yumurtalardan çıkan bireyler ergin oluncaya kadar konağa zarar vermezler (Yıldırım 2008). Zararlılara karşı biyolojik mücadelede kullanılan parazitoitlerin çoğu Hymenoptera takımında yer almaktadır. (De Bach ve Rosen 1991). Hymenopteran parazitlerinden 37

133 sadece birkaç türün kenelere karşı olduğu bilinmektedir. Kenelerde etkili olan birkaç parazitoit türünün olduğunu ve bu türlerin de Encyrtidae familyasında Ixodiphagus cinsinin içinde yer aldığı ve hepsi de kene paraziti olan 7 tür içerdiği bildirilmiştir (Mwangi vd. 1997). En yaygını Ixodiphagus hookeri nin (sinonimleri: I. caucurtei, Hunterellus hookeri), Asya, Afrika, Kuzey Amerika ve Avrupa da kayıtları vardır (Hu vd. 1993). Mısırda göç eden kuşlarda Hyalomma rufipes te Hunterellus theileri yapışmış halde bulunmuştur (Kaiser ve Hoogstraal 1958). Ixadiphagus cinslerinin kenenin içine girerek yumurta bıraktıkları, yumurtadan çıkan larvaların kene içinde beslendikleri ve burada pupa haline geçerek keneyi delip ergin halde dışarı çıktığı kaydedilmiştir (Samish vd. 2004). Hindistan da yapılan bir çalışmada Ixodiphagus ların birçoğu sert kenelerden toplanmıştır, bir tanesi ise (I. mysorensis) Ornithodorus sp. den toplanmıştır (Mani 1941). Kenya nın batısında laboratuvar ve arazi şartlarında Amblyomma variegatum türünün parazitoiti olan Ixodiphagus hookeri türü ile yapılan çalışmalarda bu parazitoitin, kenenin doymuş nimfleri kadar doymamış nimflerine de yumurtalarını koyduğunu ve nadiren de olsa larvalarına da yumurtalarını koyduğu ve Ixodiphagus hookeri parazitoitinin konağı bulmak için kenenin kokusundan faydalandığı belirtilmiştir (Takasu vd. 2003) Predatörlerle kontrol Bir predatör akar olan Anystis baccarum türünün kene larvalarına hücum ettiği kaydedilmiştir (Holm ve Wallace 1989). 38

134 50 tane kuş türünün keneleri yediği belirtilmiştir (Petrischeva ve Zhmayeva 1949, Mwangi vd. 1991, Samuel ve Welch 1991, Petney ve Kok 1993, Verissimo 1995, Samish ve Rehacek 1999). Ama sadece birkaç türün özellikle kenelerle beslendiği görülmektedir. Bu yüzden sadece birkaç tanesinin kene populasyonu üzerine etkisi olması beklenmektedir (Samish vd. 2004). Afrika da sığırlarla birlikte bulunan tavukların 5,5 saatte her bir tavuğun 338 kene yediği bildirilmiştir. Diğer bir çalışmada, her beslenme saatinde tavuklardan her birinin 9,7 ile 81 arasında kene yediği bildirilmiştir. Kene yoğunluğunun çok olduğu durumlarda, kenelerin % 69 unun tavuklar tarafından tüketildiği görülmüştür (Hassan vd. 1991, Hassan vd. 1992, Dreyer vd. 1997). Tavuklar ne spesifik ne de zorunlu kene predatörleridir. Bunun için bunların kene tüketimi, bulabildikleri alternatif yiyeceklere ve kene populasyonunun yoğunluğuna bağlıdır. Bu yüzden tavuklar, kene populasyonunu belirli bir düzeyden aşağıya indiremiyorlar. Bununla birlikte küçük çiftliklerde fazla maliyete sebep olmadan kene populayonunun azalmasına yardım ederler (Samish vd. 2004). Buphagus africanus (sarı gagalı sığırkuşu = YBO) ve Buphagus eurthyrorhynchus (kırmızı gagalı sığırkuşu = RBO), ikisi de Afrika ya özgü kuşlardır ve spesifik olarak sadece ektoparazitlerle ve özellikle kenelerle beslenirler. Sığırkuşu populasyonu, kuşları zehirleyen akarasitlerin kullanımının artmasıyla azalmaktadır ve muhtemelen de kene populasyonu azalmaktadır (Van Someren 1951, Stutterheim and Stutterheim 1980, Stutterheim ve Brooke 1981, Robertson ve Jarvis 2000). Kenya da yapılan bir araştırmada yakalanan sığırkuşlarında mide içeriklerine bakıldığında her kuş başına tane kene olduğu görülmüştür (Van Someren 1951, Bezuidenhout ve Stutterheim 1980). Genç kırmızı gagalı sığırkuşlarının 6-7 gün içerisindeki kene tarafından enfekte olmuş sığırlar üzerindeki Boophilus tüketimi: larva 1176, nimf 1549 ve ergin 1293 şeklinde olduğu görülmüştür. 39

135 Sarı gagalı sığırkuşlarının, kırmızı gagalı sığırkuşlarına göre % 10 daha fazla kene tükettikleri gözlemlenmiştir (Bezuidenhout ve Stutterheim 1980, Stutterheim vd. 1988). Sığırkuşları görsel predatörlerdir. Öncelikle doymuş dişileri koparırlar, sonra büyük gövdelileri ararlar ve sonra da daha küçük keneleri koparırlar. Sarı gagalı sığırkuşları beslenmek için bufaloları ve beyaz gergedanları tercih ederler. Buna karşılık kırmızı gagalı sığırkuşları diğer toynaklıları tercih ederler. Sığırkuşları, beslenmek için kuvvetsiz memelileri seçerler ve tekrarlı bir şekilde aynı sürüdeki spesifik bireyleri seçerler (Van Someren 1951, Mooring ve Mundy 1996). Karıncalar, böcekler ve bazı kuş türleri gibi kene biyo-supresörleri kene ile arada bir beslenirler. Bundan dolayı bunların populasyonu, kene populasyonunun boyutuna bağlı değildir. Genel predatörler bazen doğada kene populasyonunun büyüklüğüne etki edebilirler. Ama kene sayısını azaltmak için populasyonla oynamak predatör populasyonunda büyük artışlara ihtiyaç duyar ki bu da doğada, hedef olmayan türlerin populasyonlarında büyük değişikliklere neden olur (Symondson vd. 2002) Feromonlar ve diğer semiokimyasallarla kontrol Semiokimyasallar olarak bilinen bu bilgi taşıyan bileşikler, hayvan vücudunun dışına salgılanır ve fark edildiğinde özelleşmiş davranışsal yanıtlar verir; besin, av lokasyonu kaçmak ya da diğer davranışlar gibi. Bireyler arasındaki kimyasal sinyaller açıkça yeryüzünde uzun zaman önce beliren ilk bilgi alma şeklidir. Bundan dolayı, semiokimyasallar aracılığıyla olan kimyasal iletişim hala bir çok hayvan arasındaki hakim olan iletişimdir. Semiokimyasalların kimyasal bileşimi; biyosentez, salgılama, algı ve çeşitli biyolojik rolleri düzenler (Sonenshine 2004). 40

136 Semiokimyasallar 4 büyük grupta kategorize edilirler: a) Feromonlar b) Allomonlar c) Kairomonlar d) Synomonlar (Evenden vd. 1999) Feromonlar Bir türün bireylerinden, aynı türün diğer bireylerinde değişiklik meydana getirirler (Eşey feromonu, toplama feromonu gibi). Genellikler feromonlar gelişmelerinin sadece belirli dönemlerinde salgılanırlar. Örneğin: dişiler omurgalılar üzerinde beslenirken. Buna ek olarak feromonu algılayan alıcı hayvanlar, sadece belirli bir psikolojik evrede ya da belirli bir gelişme evresindeyken karşılık verebilirler. Örneğin: doymuş ya da beslenme halindeki erkekler, ama beslenmemiş erkekler değil (Evenden vd. 1999). Feromon çeşitlerine, besin bulma feromonu, uyarı feromonu, yuva yapma feromonu gibi örnekler verilebilir (Wheeler 1976, Ayasse 1995, Fauvergue 1995, Roelofs 1995, Stowe vd. 1995) de 2,6-diklorofenol Amblyomma americanum da eşey feromonu olarak keşfedildi. Bu Arachnidlerde keşfedilen ilk feromondur. Bundan sonra kenelerde 4 tip daha feromon tanımlandı. Bunlar şu şekilde sıralanır: a) Arrestment (=assembly) Feromonları = Toplanma b) Attraction-aggregation-attachment Feromonları = Çekici-Toplama-Ekleme c) Eşey Feromonları d) Primer Feromonlar Synomonlar; Lepidoptera da iyi bilinmesine karşılık, muhtemelen diğer arthropodlarda da, kenelerde de bildirilmemiştir (Evenden vd. 1999). 41

137 a) Arrestment (Assembly= Toplanma) Feromonları Bu feromonlar Argasid ve Ixodid kenelerde bilinmesine rağmen en iyi Argasid kenelerde bilinmektedir. Kenelerin saklandıkları oyuklarda, taşlar altında, çatlaklarda ya da konaklarının yuvalarında kümeler oluşmasına yol açarlar. Kümeleşmeleri, çiftleşmeyi artırırlar ve konak bulmayı başarılı hale getirirler (Sonenshine 1985). Bu feromonlar ilk Argas ta tanımlanmıştır (Leahy vd. 1973). Bu toplanma davranışları yumuşak kenelerde en az 14 türde ve birkaç da sert kene türünde bildirilmiştir. Bu türler: Ixodes ricinus (Graf 1978), I. holocyclus, Aponnomca concolor (Trevorrow vd. 1977), Hyalomma dromedarii (Leahy vd. 1981), Rhipicephalus appendiculatus, Amblyomma cohaerans (Otieno vd. 1985), R. everesti (Gothe ve Neitz 1985), I. scapularis şeklindedir (Allan ve Sonenshine 2002). Bu davranışlarda pürinler, birçok kenede en önemli komponenttir. Pürinler kene dışkılarında bol miktarda bulunmaktadır (Grenacher vd. 2001). Diğer pürinler (örneğin; ksantin ve hipoksantin) birkaç kene türünün dışkısında da belirtilmiştir. Argas persicus ta kene dışkısındaki pürinin % sı guaninden oluşmaktadır. Geriye kalanı hipoksantinden (% 1.5) ve ksantinden (% 9.0 a kadar) meydana gelmektedir. Bazı Argasid kenelerde ürik asit ve guanozin kalıntılarına da rastlanır ama bunlar arrestment cevaba neden olmazlar. Hipoksantinin, A.reflexus ta diğer çalışılan Argasid kenelere oranla daha bol bulunduğu görülmüştür. Ksantin:guanin karışımının (1:25) ya da adenin:ksantin:guanin karışımının (1:1:25) normal cevaba çok yakın olduğu belirtilmiştir (Dusba bek vd. 1991). Guanin, A. persicus için birincil uyarıcıdır ve birçok kene türü için de öyledir. En az 8 10 ¹² mol/cm² konsantrasyonda aktif olduğu bulunmuştur (Otieno vd. 1985). 42

138 I. ricinus ta her bir dışkısal bileşenin guanin, ksantin, ürik asit ve 8-azaguanin (guaninin bakteriyal bozulma ürünü), erkek keneler tarafından toplanma cevabı olarak salınmaktadır (Grenacher vd. 2001). I. scapularis keneleri guanine hipoksantine, ksantine, inozine ve hematine cevap olarak toplanmaktadırlar. I. scapularis in dışkısında yapılan çalışmalar hematin, guanin ve ksantinin varlığını gösterirken diğer pürinlerle ilgili bir kanıt olmadığını ortaya koymuştur (Sonenshine 2004). Toplanma feromonları kenelerde çok yaygın olmasına rağmen bütün kenelerde bulunmamaktadır. Dermacentor variabilis ya da D. andersoni de toplama feromonlarına rastlanmamıştır (Taylor vd. 1987). b) Atraction- Aggregation-Attachment (AAA) Feromonları: Bu feromonlar bu şekilde adlandırılmaktadırlar çünkü bunlar, beslenmemiş erkek ve dişileri onların doğal çevresinden çekerler (çimenlik alanlar, kumlu barınaklar gibi). Bu feromonlar aynı zamanda çekilmiş keneleri, omurgalılarla temasa geçmesi için ve birbirlerine yakın beslenmeleri için uyarmaktadırlar. AAA feromonları, organik değişkenlerin olduğu bir karışımdır. Sadece beslenen erkeklerden salınırlar ama bütün dişi ve erkekleri çekerler. Erkek orjinli olmasına rağmen bir eşey feromonu değildir, çünkü her iki cinsiyeti de etkilemektedir. Bu feromon sadece büyük toynaklılardan beslenen ergin Amblyomma cinsine ait türlerde bulunmaktadır. Bu türler Afrika da A. variegatum, A. lepidum, A. gemma, A. marmoreum; Kuzey Amerika da nesli tükenen tek bir tür olan A. maculatum dur (Obenchain 1984) (Şekil 2.11). AAA feromonu ilk olarak A. variegatum da açıklanmıştır (Schöni vd. 1984). Bu feromon toplanmayı, yapışmayı ve çiftleşmeyi kolaylaştırmakatdır. Bu toplanma konak vücudunun herhangi bir yerinde olabilir (Sonenshine 2004). 43

139 Şekil 2.11 Zimbabwe de bir inekte beslenen Amblyomma hebraeum (Mahan) AAA feromonu 3 tane organik değişkenden meydana gelmektedir: o-nitrofenol (2- nitrofenol), metil salisilat, nonanoik asit. Bu bileşiklerin 2:1:8 oranında olduğu bildirilmiştir. o-nitrofenol ün aramayı ve toplanma davranışını uyardığı, metil salisilatın ve nonanoik asitin yapışmayı (birleşmeyi) uyardığı düşünülmektedir (Schöni vd. 1984). Bazı çalışmalarda 2,6-diklorofenol ve benzaldehit gibi ek komponentler ortaya çıkmıştır (Lusby vd. 1991, Price, vd. 1994). Bu komponentlerden özellikle o-nitrofenol ve metil salisilat uzun mesafedeki çekimde etkilidir. Keneleri, en uzak 4 m mesafeden çekebilmektedir (Norval vd. 1991). c) Sert Kenelerde Eşey Feromonları Tanımlamaya göre eşey feromonları, bireyler tarafından salınan, karşı cinsiyeti etkileyen bileşik ya da bileşiklerin karışımıdır. Eşey feromonları kur yapma davranışının en önemli komponentidir. Dişilerde döllenmeyi etkiler ve böylece türlerin bozulmadan doğru bir şekilde saklanmasında esas element olarak görev almaktadır. 44

140 Eşeysel seçilim işlemlerindeki hiyerarşi, türler arası (türdeş) çiftleşmeyi maksimuma çıkartan önemli bir esastır. Metastriate larda cinsel aktivite kanla beslenme sırasında konak üzerinde olurken, konak dışında çiftleşme beslenmemiş erginlerde olmaktadır. Metastriate keneler, nimfal evreden çıktıklarında eşeysel bakımdan gelişmemişlerdir ve bir konağa tutunana ve beslenmeye başlayana kadar da aynı kalmaktadırlar. Beslenme başladığında spermatogenez ve oogenez başlar ve bunu feromon salgılanması takip eder. 3 farklı eşey feromonu tanımlanmıştır. 1) Attractant eşeysel feromonları (ASP) 2) Mounting eşeysel feromonları (MSP) 3) Genital eşeysel feromonları (GSP) (Sonenshine 2004) Allomonlar Bilgi taşıyan bileşik ya da karışımlardır. Bir türün bireyleri tarafından başka türün bireylerine etki etmek amacıyla salınmaktadırlar. Kenelerden salınan ve karınca predatörlüğünü engelleyen hidrokarbon salınımı buna örnektir (Sonenshine 2004). D. variabilis gibi keneler özellikle ayaklarla dorsalateral yüzeye tutunduklarında hidrokarbon esaslı skualen bakımından zengin sıvılar salgılamaktadırlar (Yoder vd. 1993a, Yoder ve Domingus 2003). Salgının miktarı azımsanmayacak derecededir. Yaklaşık değeri kenenin vücut ağırlığının % 2 si kadardır. Beslenmemiş ergin kenelerin (D. variabilis ya da Amblyomma americanum), ateş karıncaları (Solenopsis invicta) tarafından saldırıya uğrandığında, prdeasyondan korunmaları için mumsu bir madde salgıladıkları gözlemlenmiştir. 45

141 Savunmada kullanılan mumsu maddelerin azalması ya da hareketsizlik (örneğin doymuş kene) keneleri karıncalara karşı savunmasız hale getirmektedir (Yoder vd. 1993b). Prostraite keneler, I. scapularis ya da argasid keneler, Ornithodoros moubata, geniş dermal salgı bezleri olmayanlar, yiyecek arayan karıncalar tarafından saldırıya uğrayıp ve parçalara ayrılmaktadırlar. Böcekler (Tenebrio molitor), un böceği, karşılaştığı kenelere saldırır ve onları yer. Karıncalar da böcekleri yemektedir. Bundan dolayı karıncalar hem kenelerle hem böceklerle birlikte bulunduğunda, böceklerdeki karınca predasyonu, aksi halde böcekler tarafından yenecek olan birçok keneyi korur veya kurtarır. Görünüşe göre keneler, öncü bileşiklerden skualenin sentezini yapma kabiliyetinden yoksunlardır ve bunun yerine kanla beslenme sırasında bunu konaklarından elde etmektedirler. Kene bu bileşiği % 25 e çıkana kadar çok miktarda geniş dermal bezlerde tutmaktadır. Kene savunmasında tanımlanan diğer hidrokarbon salgılar, (C 20, C 24 ve metil dallı C 25 alkan) keneleri karınca saldırısından koruyan skualen kadar etkilidir. Bu şunu belirtir: hidrokarbon esaslı olduğu için allomon fonksiyonu göstermektedirler. Diğer kimyasallar da savunma kimyasalı olarak rol oynayabilmektedir (Sonenshine 2004). Skualenden yoksun olan larval keneler, karıncaların predasyonundan korunurlar, bu da gösterir ki skualen tek kene allomon bileşiği değildir (Yoder vd. 1997). Bugüne kadar başka savunma bileşiği tanımlanmamıştır. Kene savunma salgıları kötü repellent kokusuna sahip değillerdir. Kene savunma salgıları predatörlerden kaçmada rol oynamasından ziyade geçici olarak predatör saldırganlığını etkisiz hale getirmektedir. İlginç bir şekilde kene allomonlarının özellikleri böcek allomonlarının çoğunluğuyla karşılaştırılabilmektedir (Blum 1985). 46

142 Kairomonlar Bilgi taşıyan bileşik ya da karışımlardır. Bir türün bireyleri tarafından salınıp diğer bir türün bireyleri tarafından tespit edilmektedirler. Genelde kairomonlar omurgalılarda görsel işaretlerle, vücut sıcaklığıyla ve hatta seslerle bile daha etkili hale gelmektedir (Sonenshine 2004). Kairomonlar, olası konaklardan yayılan bileşiklerdir. Örneğin; hayvanın nefesindeki CO 2, konağın derisindeki NH 3, laktik asit gibi bileşikler ya da vejetasyonda geçip giden hayvanlardan depolanan bileşiklerdir. Bunlar kenenin iştahını (doğal eğilimini) uyarmaktadır. Muhtemelen en iyi bilinen kairomonlar, konak arayan keneleri çeken, CO 2 ve NH 3, genellikle hayvanın nefesinde bulunan bileşikler. A. variegatum (Tropical bont ticks), ortamdaki CO 2 seviyesinin artmasıyla dinlenme yerindeyken uyarılmaktadır (Steullet ve Guerin 1992a). Bu kene türü için ve diğer birçok kene türü için CO 2 uyarıcı bir maddedir. Amonyağın da keneleri çektiği bilinmektedir (Haggart ve Davis 1981). CO 2 ve NH 3 e ek olarak lipit skualen insan derisinde üre, bütrik asit ve laktik asitle bulunan ana bileşiktir (Yoder vd. 1998). İnsan teri, alifatik karboksilik asit bakımından zengindir. Karboksilik asitin bir sınıfı olan C 4 - C 6, 2-oxocarboksilic asitleri sivrisinekler (Anopheles gambiae) için oldukça çekicidir (Healy ve Halket 2002). Farklı konaklardan elde edilen kokuların karışımının I.ricinus ve Boophilus microplus ta çekici olduğu bulunmuştur. Sığırların kokularından elde edilen fenolik kısımlar B. microplus u uyarırken, I.ricinus u uyarmamaktadır. Kenede, kokular tek başına, karışık ve doğal konak kokusuna benzeyen kokular kadar çekici değildir. Sığır kokusunda bulunan 2 tane belli bileşik, 1-okten-3-ol ve o-nitrofenol, sığır kokusunda tipik olarak bulunmaktadır. B.microplus ta, I.ricinus a göre daha güçlü bir cevaba yol açmaktadır (Osterkamp vd. 1999). 47

143 I. scapularis (Black legged ticks) dişileri ve erkekleri, beyaz kuyruklu geyiklerin (Odocoileus virginianus) ayak bileklerindeki kıllardaki ve parmak arasındaki, salgı bezlerinin içeriğiyle temas edince toplanma cevabı göstermektedirler. Geyiklerin preorbital salgı bezlerinden elde edilen içerikler, I. scapularis in dişileri arasında güçlü bir toplanma cevabı oluşturmaktadır (Carroll vd. 1996). Benzer cevap Ixodes neitzi de de gözlemlenmiştir (Rechav ve Whitehead 1978) Synomonlar Başka bir türün bireyleriyle iletişim kuran bir türün bireylerinden üretilen semiokimyasallardır. Yayan ve kabul eden için uygun cevabı harekete geçirmektedirler. Synomonlar, Lepidoptera da iyi bilinmesine karşılık, belki diğer Arthropodlar da da, kenelerde bildirilmemiştir (Evenden vd. 1999) Semiokimyasalların keneler tarafından algılanması Keneler de diğer hayvanlar gibi birçok algısal organ taşımaktadırlar. Bunlar kenelere çevrelerindeki kimyasalları algılama imkânı vermektedir. Bunun yanı sıra, kabul edilen bilgiye cevap ve nöral ağlar tarafından çevirme işlemi için de olanak sağlamaktadır. Keneler özelleşmiş kemosensör sensillalarına göre çevrelerindeki kimyasal bileşikleri algılamalarına göre sınıflandırılmaktadır. Böylece iki tane ana kemosensilla tipi ortaya çıkmaktadır. Bunlar: 1) Olfactory sensilla (olfaktör) 2) Gustatory sensilla Keneler ön ayaklarını, çevrelerini araştırırken ya da konaktan gelen uyarılara karşı cevapta uzatmaktadırlar. Bu davranış, ön ayaklarda tarside (son kısım) yer alan koku sensillalarıyla kokuların tespitine olanak sağlamaktadır. 48

144 Koku sesillaları haller organında bulunmaktadır. Bu çıkıntılı duyu organı tarsusun dorsal yüzeyindedir, diğerleri ise bu yapının anterior ve pasterior kısımlarında bulunmaktadır. Single wall (tek duvarlı) koku sesillaları yüksek büyütmeli SEM de bakılınca, bütün yüzeyinde bulunan çok sayıdaki küçük porlarıyla dikkati çekmektedir. Porlar direkt lenf boşluğuna açılırlar, içerisinde sensilyum (olfaktör duyu almacı) barındırır ve bu sensilyum atmosferde absorbe edilen bileşikleri yüzeyden iç kısıma taşımakta ve sinir impulslarını üreten dendiritleri uyarmaktadır. Haller organının ön tarafındakiler, belirgin sert kıl şekildeki diğer sensillalardır. Aralarında en az biri koku sensilyumudur. Bu büyük porlu koku sensillası eşeysel feromonunu tespit etmektedir. Bunlar 2,6-diklorofenol ve diğer yerine geçen fenollerdir. Haller organı birkaç tane görünür setiform sensilla ile çevrili fonksiyonel olarak farklı nöronları sunmaktadır. Örneğin; Rhipicephalus sanguineus ta NH 3, tarsustaki 2 sensillayla tespit edilir. 1 tanesi enterior çukurda, diğeri ise haller organının distalinde 4 tane sensillanın kümeleşmesinden oluşmaktadır. Amblyomma americanum da 2,6- diklorofenol geniş büyük porlu koku sensillalarıyla (AP1= Haller organının anterior çukurunda bulunur, etrafı diğer sensillalarla çevrilidir, koku sensilyumu, kalın kıl şeklindedir) tespit edilmektedir. Diğer nöronlar CO 2 i tespit etmektedir. A. variegatum da haller organı sensillaları H 2 S i de tespit etmektedir (Steullet ve Guerin 1992b). CO 2 in koku konsantrasyonlarındaki farktan dolayı 2 tip sensillayla tespit edilebilmektedir. A. variegatum 2 tane CO 2 duyu reseptörüne sahiptir. Biri CO 2 tarafından uyarılan diğer CO 2 tarafından inhibe edilen. İkisi de phasic-tonic (uyarıcı faz) cevaplarıdır. Aynı zamanda keliseral dijitlerinin kesici uçlarında sensilla taşımaktadırlar. Papillaya (B. microplus) ya da mekanoreseptör olan konik çukurlara (D. variabilis) ek olarak sensör nöronları tarafından sinirle donatılmış olan porlar bulunmaktadır. Keliseral dijitler, NaCl, ATP ve gluttayon bileşiklerinin konak kanında normal olarak bulunan fizyolojik konsantrasyonlarından sorumludur. Bu fagostimülantların tespitine ek olarak 49

145 seksüel olarak aktif olan D. variabilis erkeklerinde keliseral dijitler aynı zamanda türdeş dişi vulvalarının ekstratlarına ve ekdizon (çiftleşmeye teşvik eden hormon) ve 20- hidroksiekdizonun fizyolojik konsantrasyonuna cevap vermektedir. Aksine, seksüel olarak aktif olan D. andersoni erkekleri 20-hidroksiekdizon a cevap verir ama ekdizona cevap vermez (Taylor vd. 1991). Keliseral dijitler çıkarıldığında, seksüel olarak aktif olan erkeklerle normal, değişiklik yapılmamış dişi kenelerle çiftleştirme denenmiştir. Erkekler ağız parçalarını dişilerin genital porlarına gömmüşlerdir fakat spermatofor oluşturmaya yetenekleri olmadığı görülmüştür ve çiftleşme başarısız olmuştur (Sonenshine vd. 1984). Bu bulgular, keliseral dijitlerin çiftleşmede, beslenme davranışında da olduğu gibi önemli rol oynadığını ileri sürmektedir. 50

146 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışmada, 2010 yılının nisan ayında Sorgun da (Yozgat) ve haziran ayında Çorum civarında yapılan arazi çalışmasından elde edilen kemirgen ve kene örnekleri kullanıldı. Toplamda 19 kemirgen ve 23 kene örneği elde edildi. Kemirgen örneklerinin yakalanması canlı yakalama kapanları ile yapıldı. Kapanlara hayvanı çekmek için yem olarak fıstık ve ekmek karışımı kullanıldı (Şekil a, b). Yakalanan hayvanlar laboratuvara getirildi. Kemiricilerde kene kontrolü yapıldı. Kene olan hayvanlardan, ince uçlu pens kullanılarak keneleri alındı. Keneler, içerisinde %70 lik alkol bulunan ependorflara alındı. Daha sonra keneler Aydın, 2000, Karaer vd. 1997, Merdivenci, 1969 ye göre türleri teşhis edildi. Kemiricilerin lokaliteleri, dış ölçüleri ve ağırlıkları kaydedildi. Kemirgenler teşhis edilip dış ölçümleri ve ağırlık tartımları yapıldı (Yiğit vd. 2006).. Daha sonraki çalışmalar için karaciğer, kalp, böbrek ve kas dokuları alınarak -70 C de bekletildi. Keneleri alınan hayvanlar müze materyali olacak şekilde tahnit edildi. Kan örnekleri alınarak 2500 rpm de 5 dakika çevrilerek serumlarına ayrıldı ve serumları -70 C de ELISA testinde kullanılmak üzere ependorflarda saklandı. Şekil 3.1 Araziye yerleştirilcek kapanlar hazırlanırken (Nisan 2010) 51

147 Şekil 3.2.a Yuva ağızlarına yerleştirilmiş bir kapan (Nisan 2010) Şekil 3.2.b Araziye yerleştirilmiş kapanlar (Nisan 2010) 52

148 3.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ELISA solüsyonlarının hazırlanışı 1. % 1 lik Thiomersal (Merthiolate) Thiomersal (sodyum etil-civa tiyosalisilat), organik bir civa bileşiğidir lu yıllardan beri çoklu-doz aşıların içerisine eklenerek, enjektöre defalarca aşı çekilmesi yoluyla veya aşının üretimi sırasında oluşabilecek bakteri ve mantar kontaminasyonunu önlemek amacıyla koruyucu olarak kullanılmaktadır (Yurdakök 2006). 10 gr thiomersal 1000 ml. distile suda çözülür (Oda ısısında karanlık ortamda saklanır). 2. Coating Buffer (Kaplama Solüsyonu) 10 tablet PBS (Phosphate buffered saline) (ph konsantrasyonunun sabit kalmasına yardımcı oluyor) ve 10 ml % 1 lik Thiomerson 1000 ml distile suda çözünür (Oda ısısında saklanır, 5 gün içinde kullanılmalıdır). 3. Master Plate (Serum) Dilüent 10 tablet PBS, 50 gr Skim Milk Powder DIFCO (Nonspesifik protein bağlanmalarına engel olur), 10 ml % 1 lik Thiomersol, 5ml Triton 100 distile su ile 1000 ml ye tamamlanır (-20 C de saklanır). 4. Wash Buffer (Yıkama Solüsyonu) 10 tablet PBS, 10 ml % 1 lik Thiomersol, 1 ml Tween 20 (deterjan ya da emulsifier olarak uygulamada kullanılır) distile su ile 1000 ml ye tamamlanır. (Oda ısısında saklanır, 5 gün içerisinde kullanılmalıdır). 53

149 3.1.2 ELISA testinin yapılışı 1. Test için gerekli olan coating buffer, masterplate dilüent ve wash buffer yeterli miktarlarda hazırlandı. 2. Plaklarda A dan H ye kadar sıra bulunmaktadır ve her sırada da toplam 12 kuyucuk vardır. Plaklar 2 kısıma bölündü. A dan D ye kadar konulan serum örnekleri kontrol amaçlı olarak E den H ye kadar da aynı sırada kuyucuklara yerleştirildi. 3. Plaklar, 1/500 oranında 100 µl IgM ile kaplandı ve +4⁰C de 1 gece inkübe edildi. 4. Plaklar çalışma gününde oda ısısına getirildi ve 3 kere yıkandı. 5. Her bir kuyucuğa 100 µl dilüent kondu, plaklar negatif ve pozitif kısımlar olmak üzere 2 ye ayrıldı ve üzerlerine önceden 56 ⁰C de inaktive edilmiş olan serum örneklerinden 33 µl eklendi. 6. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı. 7. A dan D ye kadar 1/20 oranında dilüe edilmiş pozitif antijen ve E den H ye kadar da negatif antijenden 100 er µl konuldu. 8. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı. 9. 1/1000 oranında masterplate dilüentle dilüe edilmiş Anti-CCHF HMAF tan her kuyucuğa 100 er µl kondu. 10. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı /8000 oranında hazırlanan konjugatlardan her kuyucuğa 100 er µl kondu. 12. Nemli bir kaba konan plak 1 saat 37 ⁰C de etüvde bekletilir ve sonrasında 3 kere yıkama yapıldı. 54

150 13. En son aşama olarak hazırlanan 10 ml substrat karışımından her kuyucuğa 100 er µl kondu. 14. Nemli bir kaba konan plak yarım saat 37 ⁰C de etüvde bekletildi ve renklenmeler gözlendi. 15. ELISA okuma cihazında, 410 nanometrede okundu ve renklenmenin şiddetine göre viral yük tayini yapıldı (Lab. Diagnosis of CCHF, Centers for Disease Control and Prevention Department of Healt and Human Services). 11 serum örneğine bu prosedüre göre test uygulandı. Konjugat olarak SIGMA Anti- Mouse IgG (whole molecule)- Peroxidase, Produced in goat, Afinity isolated antibody ve SIGMA Anti- Mouse IgM (whole molecule)- Peroxidase, Produced in goat, Afinity isolated antibody kullanıldı. Belirtilen oranlarda dilüe edilerek kullanıldı. Testin sonunda bütün plaklarda aynı derecede renklenme olduğu gözlemlendiğinden bu yöntemde değerlendirilebilecek bir sonuç elde edilemedi. Vector-Best VECTOCRIMEAN-CHF-IgG, Koltsovo, Russia hazır kiti ile ikinci deneme yapıldı. Prosedür şu şekilde uygulandı: 1. A-1 kuyusuna 100 µl serum dilüenti (SD) konuldu. Sonraki 2 kuyuya negatif kontrol ve sonraki kuyuya da pozitif kontrol kondu. 2. Geriye kalan her bir kuyuya 90 µl SD ve üzerilerine 10 µl önceden dilüe edilmiş serum örnekleri kondu. Serum örnekleri, önceden ependorflarda hazırlandı. Ependorflara 90 µl serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum örnekleri eklenerek tamamen karışması sağlandı. Burada rengin sarıya dönmesi beklendi. 3. Uygun boyutlarda kesilmiş bir filmle stripler kalandı ve nemli bir haznenin içine kondu. 60 dakika 37 C de inkübe edildi. 4. Strip sayısına göre yıkama solüsyonu hazırlandı ( 1 strip için; 2 ml PBS, 48 ml distile su, 2 strip için 4 ml PBS, 96 ml distile su). Elisa yıkama aletinde 4 yıkama yapıldı. 5. A-1 hariç her bir kuyuya 100 µl konjugat solüsyonu kondu. Negatif ve pozitif kontroller için hazır kitin içinden çıkan kendi konjugat solüsyonundan hazırlandı (1 strip için 0.1 ml konjugat, 1 ml konjugat dilüenti, 2 strip için 0.2 ml konjugat, 2 ml konjugat dilüenti). Fare örnekleri için ise, insanlar için kullanılan konjugat yerine 55

151 SIGMA Anti- Mouse IgG (whole molecule)- Peroxidase, Produced in goat, Afinity isolated antibody konjugatı kullanıldı. 6. A-1 kuyusuna 100 µl conjugate diluent (CD) kondu. 7. Striplerin üzeri filmle sıkı bir şekilde kaplanarak nemli bir haznenin içine konuldu ve 30 dakika 37 C de inkübe edildi. 8. İnkübasyonun bitmesine 5-10 dakika kala TMB (tetramethyl benzidine concentrate) solüsyonu hazırlandı (1 strip için 70 µl TMB 1 ml SB (substrate buffer) de, 2 strip için 140 µl TMB 2 ml SB de iyice dağıtılır). 9. İnkübasyon sonunda stripler önceden bahsedildiği gibi yıkandı. 10. Hazırlanan TMB solüsyonundan her bir kuyucuğa 100 µl pipetlendi ve karanlık bir ortamda 25 dakika C de inkübe edildi. 11. İnkübasyonun sonunda reaksiyonu durdurmak için her bir kuyuya 100 µl stopping reagent konuldu. 12. Durdurma reaksiyonundan dakika sonra ölçümler 450 nm de Elisa okuma cihazı ile yapıldı. Bu prosedüre göre yapılan ilk denemede, konjugat oranını ayarlamak adına sadece 1 örnek üzerinde çalışıldı. Konjugat 1:20000, 1: 30000, 1:40000 ve 1:50000 oranlarında dilüe edilerek tek bir strip ile çalışıldı. Deney sonunda 1:20000 oranında dilüe edilmiş konjugatın konduğu kuyudan 1:50000 oranında dilüe edilmiş konjugatın konduğu kuyucuğa doğru renklenmenin azaldığı gözlemlenmesi beklenirken renklenmelerin birbirine çok yakın olduğu görüldü. Bunun üzerine bu hazır kit ile yapılan ikinci denemede hem konjugat dilüsyon oranları azaltıldı hem de serumlar daha fazla dilüe edildi ve bu sefer 2 serum örneği kullanıldı. İlk denemedeki örneğin dilüsyonuna 1:70000, , 1: ve 1: şeklinde devam edildi. İkinci serum örneğinde ise denemeler şu şekilde yapılıdı; serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:70000, serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:100000, serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:120000, serum dilüesi 1:200, konjugat dilüesi 1:150000, serum dilüesi 1:400, konjugat dilüesi 1:70000, serum dilüesi 1:400, konjugat dilüesi 1:100000, serum dilüesi 1:400, konjugat dilüesi 1:120000, serum dilüesi 1:00, konjugat dilüesi 1:

152 Serum dilüsyonları hazırlanırken 1:200 dilüsyon için 190 µl serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum, 1:400 dilüsyon için 390 µl serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum eklendi ve içerisinden 10 µl alınıp önceden 90 serum dilüe solüsyonu ve 10 µl serum konan kuyucuklara eklendi. Konjugat dilüsyonları hazırlanırken, 1:20000 dilüsyonu için 10 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:30000 dilüsyon için 15 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:40000 dilüsyon için 20 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:50000 dilüsyon için 25 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1:70000 dilüsyon için 35 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1: dilüsyon için 50 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1: dilüsyon için 60 ml PBS de 0.5 µl konjugat, 1: dilüsyon için 75 ml PBS de 0.5 µl konjugat dağıtıldı. Bu deneme sonucunda bütün örneklerin serumlarının 1:400 oranında dilü edilmesine ve konjugat dilüsyonunun ise 1: olmasına karar verilerek yeni bir deneme yapıldı. Serum örnekleri konduktan sonra 1 saat olan inkübasyon süresi 2 saate çıkartıldı, konjugat ilavesinden sonra 30 dakika olan inkübasyon süresi 20 dakikaya düşürüldü ve yıkama sayıları 5 e çıkarıldı. Daha önceki denemelerde 2 serum örneğinin tükenmesi sonucunda bu deneme 9 serum örneği ile yürütüldü. Bu denemeler sonucunda kesin sonuçlar elde edilememesinden dolayı virüs tespiti için Real Time PCR denendi. Bu denemede Yozgat bölgesinden 2 Apodemus ve 1 Cricetulus migratorius olmak üzere 3 ve Çorum bölgesinden ise 1 tane Apodemus örneği kullanıldı. İlk önce serum örneklerinden RNA ekstraksiyonu yapıldı. Bu yöntemde QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit kullanıldı. Bu yöntemde şu aşamalar izlendi: 1. Liziz; 560 µl AVL Tampon+Carrier RNA karışımı 1.5 ml.lik ependorflara kondu µl örnek üzerlerine eklendi ve 15 sn vortekslendi 3. Oda ısısında 10 dk bekletildi 4. Spin santrifüj yapıldı 5. Örneğe 560 µl etanol eklendi ve 15 sn vortekslendi. 57

153 6. QIAamp spin kolonlu tüplere 5. aşamadaki tüp içeriğinden 630 µl aktarıldı ve 8000 rpm de 1 dk çevrildi. 7. QIAamp spin kolonu yeni 2 ml lik kapaksız tüpe konuldu ve önceki tüp atıldı. 8. QIAamp spin kolonu dikkatlice açıldı ve tüp içeriğinden 630 µl tekrar aktarıldı ve 8000 rpm de 1 dk çevrildi. 9. QIAamp spin kolonu yeni 2 ml lik kapaksız tüpe kondu ve önceki tüp atıldı. 10. QIAamp spin kolonu dikkatlice açıldı ve 500 µl AW1 tamponu eklenerek kapağı kapatıldı rpm de 1 dk çevrildi. 11. QIAamp spin kolonu yeni 2 ml lik kapaksız tüpe konuldu ve önceki tüp atıldı. 12. QIAamp spin kolonu dikkatlice açıldı ve 500 µl AW2 tamponu eklenerek kapağı kapatıldı rpm de 3 dk çevrildi. 13. QIAamp spin kolonu 1.5 ml lik tüplere kondu. 14. Tüpler dikkatlice açıldı ve 60 µl AVE tamponu eklendi rpm de 1 dakika çevrildi. Bunun sonucunda elde edilen RNA ekstraktı Real Time PCR da kullanıldı. PCR için Atra Diagnostics CCHV RT-PCR Kit 1.0 Hamburg, Germany hazır kiti kullanıldı. Kitin içinde bulunan Mater A ve Master B solüsyonlarından 15 er µl ve serum örneklerinden 10 µl alınarak PCR aletindeki striplere konuldu. PCR aleti olarak Real Time Qiagen Rotor-Gene Q kullanıldı. Real- Time PCR işlemi aşağıda gösterilen şartlar altında gerçekleştirildi (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1 Real Time PCR sıcaklık ve zaman koşulları Sıcaklık Zaman Denatürasyon 50 C 10 dakika Amplifikasyon 95 C 95 C 58 C 2 dakika 15 saniye 45 saniye 45 siklus 58

154 4. BULGULAR 4.1 Biyotoplar ve Kemiricilerde Kene Enfestasyonu Çorum yöresinde yapılan arazi çalışmalarında 2 tip biyotop saptandı. Bunlardan birisi tahıl üretimi yapılan veya mera olarak kullanılan step alanları diğeri ise orman (meşe meşçeresi) alanlarıdır. İlk arazi çalışması Nisan 2010 da Aşağı Cumafakılı Köyü (Sorgun/Yozgat) çevresindeki step karakterli arazide yapıldı (Şekil 4.1). Arazi içinde kuru dere yatakları ve söğütlükler de bulunmaktadır (Şekil 4.2 ve 4.3). Arazi çalışmalarında gece sıcaklığının eksi değerlere düştüğü, sabah arazideki suların donmuş olduğu, gündüz yapılan ölçümlerde toprak sıcaklığının 7 C olduğu belirlendi. Bu alanda yapılan çalışmada 10 örnek (4 tane Apodemus flavicollis, 3 tane Mus sp., 2 tane Microtus lydius ve 1 tane Cricetulus migratorius) canlı yakalandı. Kapanda ölmüş örneklerin üzerleri kene enfestasyonu olup olmadığı bakımından kontrol edildi. Canlı ve ölü örneklerin hiç birinde keneye rastlanmadı. Nisan ayında yapılan arazi çalışmasında kontrol edilen koyun sürülerinde kene enfestasyonunun çok düşük olduğu görüldü. Bu 10 örnekten 8 tanesinin kanı alınıp serumlarına ayrıldı. İkinci arazi çalışması Haziran 2010 da Çorum un kuzeyinde ve güneyinde 2 farklı lokalitede yapıldı (Şekil 4.1). Kuzeydeki lokalite step karakterli olup, güneydeki lokalite ise dere kenarında meşe ormanını içermektedir (Şekil 4.4 ve 4.5). Bu alanlarda yapılan çalışmalarda 9 örnek canlı olarak laboratuvara getirilmiştir (5 Apodemus flavicollis, 2 Microtus lydius, 2 Mus sp.) ve bunların 2 tanesi (Apodemus flavicollis) ölmüştür. 7 hayvandan kan alındı ancak 3 tanesi (Apodemus flavicollis) serumlarına ayrıldı. Arazi çalışmaları sırasında kenelerin genellikle farelerin göz çevresini ve kulağını tutunmak için tercih ettiği görülmüştür (Şekil 4.6, 4.7, 4.8). 59

155 Şekil 4.1 Lokalite 1: Yozgat/Sorgun/Aşağı Cumafakılı Köyü, Lokalite 2: Çorum, Sarmaşa yol kenarı, Lokalite 3: Çorum, Alaca yolu üzeri Şekil 4.2 Sorgun Aşağı Cumafakılı Köyü çevresinde kapan atılan bir tarla (Nisan 2010) 60

156 Şekil 4.3 Sorgun Aşağı Cumafakılı Köyü çevresinde kapan atılan çalılık bir bölge (Nisan 2010) Şekil 4.4 Çorum Sarmaşa Yolu kenarında kapan atılan çalılık alan ve tarla (Haziran 2010) 61

157 Şekil 4.5 Çorum Sarmaşa Yolu kenarında kapan atılan dere kenarı ve ormanlık alan (Haziran 2010) Şekil 4.6 Çorum arazisinde örneklenmiş göz bölgesinde kene bulunan bir Apodemus flavicollis 62

158 Şekil 4.7 Çorum arazisinde örneklenmiş kulağında ve sırtında kene bulunan bir Apodemus flavicollis Şekil 4.8 Çorum arazisinde örneklenmiş göz çevresinde kene bulunan Microtus lydius 63

159 Haziran 2010 da Çorum bölgesinden gelen hayvanlarda kene kontaminasyonu görülmüştür. Ölen hayvanlar da dahil olmak üzere 9 tane kemirgenin üzerlerindeki keneler alınmış, toplamda 23 kene elde edilmiştir. Keneler, içinde %70 lik alkol bulunan ependorflara alınmıştır. Bu keneler stereomikroskop altında incelenerek cins ve tür düzeyinde ayrıldılar. Apodemus flavicollis, Mus sp., Microtus lydius türlerine ait elde edilen kemirici örnekleri arasındaki kenelerin dağılımı şu şekilde belirlenmiştir: Elde edilen 7 Apodemus flavicollis örneğinin hepsinde de kenelere rastlandı. Bu keneler; Ixodes cinsinin larva ve nimf formları (Şekil 4.9,4.10, 4.11 ve 4.12), Haemaphysalis cinsinin nimf ve larva formları (Şekil 4.13, 4.14, 4.15 ve 4.16) şeklindeydi. Elde edilen 2 tane Microtus lydius türünden 1 tanesinde Ixodes in nimf formu olmak üzere 1 adet keneye rastlandı. Elde edilen 2 tane Mus sp. örneğinde ise keneye rastlanmadı. Kenelerin kemiriclere göre dağılımları çizelgede verilmiştir (Çizelge 4.1). Ayrıca karşılaştırma yapmak amacıyla Çorum un güneyinde koyunlardan keneler toplanmıştır. Toplamda 14 kene elde edilmiştir ve hepsinin Rhipicephalus cinsi oldukları tespit edilmiştir. Toplamda 1 erkek ve 1 dişi keneye rastlanmıştır. Şekil 4.9 Ixodes larvasının stereo mikrokop altında dorsal görüntüsü 64

160 Şekil 4.10 Ixodes larvasının stereo mikroskop altındaki ventral görüntüsü Şekil 4.11 Ixodes nimfinin stereo mikroskop altında dorsalden görüntüsü 65

161 Şekil 4.12 Ixodes nimfinin stereo mikroskop altında ventralden görüntüsü Şekil 4.13 Haemaphysalis larvasının stereo mikroskop altındaki dorsal görüntüsü 66

162 Şekil 4.14 Haemaphysalis larvasının stereo mikroskop altındaki ventral görüntüsü Şekil 4.15 Haemaphysalis nimfinin stereo mikroskop kop altında dorsalden görüntüsü 67

163 Şekil 4.16 Haemaphysalis nimfinin stereomikroskop altında lateralden görüntüsü Çizelge 4.1 Toplanan kemirgenlerden elde edilen kene tür, sayı ve cinsiyetleri Kemirgen Türü Kene Türü Larva/Nimf Sayısı Mus sp. Kene görülmedi - - Apodemus Kene görülmedi flavicollis - - Yozgat- Sorgun = Lokalite 1 (Nisan 2010) Microtus lydius Kene görülmedi - - Cricetulus Kene görülmedi - - migratorius Mus sp. Kene görülmedi - - Çorum-Alaca Apodemus Haemaphysalis 3 larva Yolu, Sarmaşa flavicollis 1 nimf 4 Yol Kenarı = Lokalite 2, Ixodes 4 larva Lokalite 3 14 nimf 18 (Haziran, 2010) Microtus lydius Ixodes 1 nimf 1 Toplam 7 larva 16 nimf 23 68