MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II. SPEKTRAL YÖNTEMLER Protein Tayin Yöntemleri

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II SPEKTRAL YÖNTEMLER Protein Tayin Yöntemleri

2 Protein Tayin Yöntemleri Bir çözeltideki toplam protein miktarının belirlenmesi, bilimsel araştırmalarda, gıda analizlerinde, endu striyel ve biyoteknolojik birçok u ru nu n analizinde kullanılır. Proteinlerin saflaştırma basamaklarında mutlaka protein tayinleri yapılmalıdır. Saflaştırılan protein bir enzimse ek olarak aktivite tayinlerinin de yapılması gerekir. Özellikle kromatografik ve elektroforetik ayırmalarda deneylerin optimizasyonuiçinmiktar tayini yapılmasıgerekir. Gu nu mu zde teşhis için önemli olan enzim ve serum proteinlerinin hemen hepsi otomasyonlu spektrofotometrik yöntem ve kitler kullanılarakyapılmaktadır.

3 Protein Tayin Yöntemleri Protein tayinleri tu m biyokimya laboratuvarlarında rutin olarak yapılır, kan ve idrardaki protein miktarlarından bazı hastalık teşhisleri yapılır. Temel biyokimyasal işlemlerde de spesifik aktivite tanımı için biyolojik örneğin protein miktarından yararlanılır (aktivite/mg protein).

4 Total protein miktarının bilinmesi şarttır: n protein veriminin belirlenmesi n saflık kontrolu n deneylerin optimizasyonu n spesifik aktivite tayini ve saflaştırma derecesinin belirlenmesi (enzimler için)

5 KULLANILAN YÖNTEMLER Kjeldahl yöntemi (azot miktarının tayinine dayanır) Kızıl ötesi spektrometri ZOR, Türbidimetri Fluorimetri Refraktometri Polarografi Amino asit analizine dayanarak (asit hidrolizden sonra yapılır. Trp, Cys asit hidrolize duyarlı; Gln, Asn, asit forma dönüşür. Bunlar da hatalar yol açar) duyarlılığı düşük, hata payı yüksek yöntemler

6 Son yıllarda en çok kullanılan yöntemler: UV ve GÖRÜNÜR ALANDA ABSORBSİYONA DAYANAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER

7 OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA KISA BİLGİ: ELEKTROMANYETİK IŞINLAR ile MADDE arasındaki etkileşimden yararlanan yöntemlerdir.

8 ELEKTROMANYETİK IŞIN NE DEMEKTİR?

9 Elektromanyetik Işın: Uzayda büyük bir hızla ilerleyen bir enerji İki önemli karakteri var: 1) Dalga karakteri: Uzayda sinüzoidal (dalga hareketiyle) yayılan elektrik ve manyetik vektörlere sahiptir. Madde ile etkileşiminde elektrik vektörü roloynar. λ (lambda)= c/ν(nü) λ= Dalga boyu c= Işık hızı (3x10 10 cm/sn) ν = frekans (birim zamanda belli bir noktadan geçen dalga sayısı) 2) Tanecik karakteri: Bir ışın demeti çok sayıda tanecikten oluşur. Enerjili bu taneciklere FOTON denir. E = h x ν h= Planck sabiti (6.626 x j.sn)

10

11

12 MADDE- IŞIN ETKİLEŞİMİ Işının elektrik alanı ile maddenin bağ elektronları arasında gerçekleşir. Maddenin yapısına göre değişir.

13 Madde ortamına giren ışın değişime uğrar: Doğrultusu değişir. YANSIMA (REFLECTION) KIRILMA (REFRACTION)

14 Başka demetlere ayrılır. ÇİFTE KIRILMAYA UĞRAR. (DOUBLE REFRACTION) SAÇILIMA UĞRAR. (SCATTERING) KIRINIMA UĞRAR. (DIFFRACTION)

15 Kutuplaşma düzlemi değişir: OPTİK ÇEVİRME Kutuplaşma derecesi azalır: DEPOLARİZASYON

16 Bu fiziksel değişimler maddenin enerji düzeylerinde herhangi bir değişime yol açmaz.

17 Işının belli dalga boyları madde tarafından ABSORBLANIR (SOĞURULUR, EMİLİR): ABSORBSİYON Bu enerji maddeyi (yani onu oluşturan atom veya molekülleri) UYARILMIŞ (EKSİTE) hale geçirir. X + hν X* Düşük enerji düzeyi (ground: G ile de gösterilir) Yüksek enerji düzeyi (uyarılmış durum: S 1 ile de gösterilir) Tanecik eski haline dönerken bu enerji geri verilir: X* X + ısı

18 Uyarılmış madde bir ışın yayabilir: EMİSYON X* X + hν SPEKTROSKOPİK YÖNTEMLERİN TEMELİNDE ABSORPSİYON VE EMİSYON YATMAKTADIR. Bu olaylar enerji düzeyinde değişim yaratır.

19 OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ Spektroskopik Yöntemler TEMELİ: Enerji düzeyleri arasındaki geçişler sonucu ortaya çıkan SPEKTRUM ölçülür. Spektroskopik Olmayan Yöntemler TEMELİ: Işının YÖNÜNDEKİ veya FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNDEKİ DEĞİŞİM ölçülür. Enerji düzeyleri arasında geçişler olmasınıgerektirmez.

20 Spektroskopik Yöntemler Spektrofotometri (UV- Visible, IR, X ışını) Kolorimetri Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi NMR Spektroskopisi ESR (Elektron Spin Rezonans) Spektroskopisi (Kütle Spektrometrisi) Emisyon Spektroskopisi Atomik Emisyon Spektroskopisi Fluoresan Spektroskopisi Radyokimyasal Yöntemler ÖLÇÜLEN ÖZELLİK IŞININ ABSORPLANMASI IŞININ YAYILMASI (EMİSYON)

21 Spektroskopik Olmayan Yöntemler Türbidimetri Nefelometri Raman Spektroskopisi Refraktometri İnterferometri X ışını Difraksiyonu Elektron Difraksiyonu Polarimetri ÖLÇÜLEN ÖZELLİK IŞININ SAÇILMASI IŞININ KIRILMASI IŞININ KIRINIMA UĞRAMASI IŞININ KUTUPLANMA ÖZELLİKLERİNİN DEĞİŞİMİ

22 1. Kjeldal Yöntemi Protein Tayin Yöntemleri 2. Spektrometrik Yöntemler Ultraviyole Bölgedeki Ölçu mler Uzak UV Bölgedeki Ölçu mler Göru nu r Bölgedeki Ölçu mler - Biu re Yöntemi - Bikinkoninik asit (BCA) Yöntemi - Lowry Yöntemi Florimetrik Yöntemler 3. Boya Bağlama Yöntemleri- Bradford Yöntemi 4. İmmünolojik Yöntemler 5. Kolloidal Altın Yöntemi 6. Gravimetrik Yöntemler

23 Protein tayinleri dolaylı (indirekt) ve doğrudan (direkt) yöntemler olarak iki kısımda incelenebilir. Doğrudan Yöntemler Proteinlerin fiziksel özelliklerinden yararlanılarak yapılan tayinlerdir. 1.Gravimetrik Yöntemler (Kuru kuẗle) Analizleri: Bir fırında kurutulduktansonra kuru ağırlık bulunur. 2. Toplam Azot Miktarı (Kjeldahl Yöntemi): Azot tayini u zerinden yapılır. 3. Amino Asit Analizleri: Asit hidrolizinden sonra amino asitlerin ölçu mu yapılır. 4. UV Spektroskopisi: Aromatikyan zincirlerin ışın absorbsiyonuna dayanır.

24 Doğrudan yöntemler, örnekteki proteinin gerçek ku tlesini ölçtu ğu için avantajlıdır. Ancak hassas olmadıkları için az kullanılır. Bu tayinler için daha fazla protein örneğine gerek duyulur ve işlem zaman alıcıdır. UV spektroskopisi hızlı bir yöntemdir, ancak girişim etkileri fazladır.

25 Dolaylı Yöntemler Proteinlerin çeşitli kimyasal reaktiflerle oluşturduğu renkli bileşiklerin belirli dalga boylarında verdikleri absorbansa dayalı ölçümlerdir. Bu yöntemin dezavantajı, farklı proteinler, farklı kolorimetrik reaktiflerle farklı reaksiyonlar verir. Reaktifle protein örneğinin reaksiyonu sonucu oluşan absorbans, örnekteki proteinin bağıl miktarını hesaplamak için kullanılır (protein standardına göre bağıl miktar). Dolaylı yöntemler, proteinin gerçek miktarını ölçen doğrudan yöntemlerlekıyaslandıklarındaherzaman bağıl miktarı belirtir. Dolaylı yöntemler hızlı, spesifik ve hassas oldukları için çok kullanılır. Bu yöntemlerle çok küçük miktardaki proteinler bile hesaplanabilir.

26 Dolaylı Yöntemler Primer yapısı bilinen bir proteinin amino asit analizleri ile miktar tayini yapılmaktadır. Bu yöntemde asidik ortamda triptofan, sistin ve sistein gibi amino asitler hidrolize karşı hassas olduklarından bunlarla ilgili bazı hatalar olabilmektedir. Ayrıca glutamin ve asparajin amino asitleri de hidrolizden sonra glutamik asit ve aspartik aside dönu şmektedir.

27 Protein Standartları Birçok protein tayin yönteminde bilinen bir proteinin kullanılmasıylaçizilen standart grafikler yardımıylabilinmeyen örneğinmiktarı bulunur. Proteinin amino asit bileşimi ve protein prostetik grupların varlığı (glikoproteinlerdeki karbohidrat grupları gibi) spektrometrik birölçümderenk değişiminietkileyebilir. Ölçümü yapılacak tu m standartlar ve örnek iki veya üç seri halindehazırlanmalıdır. Bu dahadoğrusonuçların alınması için çok önemlidir.

28 Mu mku nse saflaştırılmak istenen proteinin saf bir örneği ile ölçümü kalibre etmek, benzer renk verimine ulaşmak için iyi bir çözu mdu r. Böyle bir çözu mu n mu mku n olmadığı durumlarda yaygın olarak kullanılan protein standardı, sığır serum albuminidir (BSA). İmmu noglobulin G de bu amaçla kullanılmaktadır. Farklı proteinler aynı yöntemde bile bazen farklı sonuçlar verebilir. Örneğin Lowry yönteminde 10 g jelatin 10 g BSA'ın verdiği absorbansın %69'unu verir.

29 Ku vetler Protein tayinlerinde farklı koşullarda farklı ku vetlerden yararlanılmaktadır. Cam ku vetlerle Kuartz ku vetler 320 nm nin u zerindeki ölçu mler UV- VIS bölgedeki ölçu mler Tek kullanımlık polisitiren ku vetler 340 nm nin u zerinde Akrilik ku vetler nm arasında kullanılmaktadır.

30 Özellikle boya- bağlama esaslı protein tayin yöntemlerinde boya veya boya- protein kompleksinin ku vet çeperlerine yapışması sorun yarattığı için tek kullanımlık ku vetleri kullanmak daha uygundur. Ku vetlerle çalışırken cam ku vetlere cam pipetlerin değdirilmemesine, ku vet içinde hava kabarcıkları oluşmamasına, ku vetin ışık geçiren yu zeyinde parmak izi olmamasına özen gösterilmelidir. Oluşan parmak izleri %70 lik etanolle silinmelidir.

31 Protein tayin yönteminin seçimi Belirlenecek proteinin örnekdekimiktarına Örneğin yapısına (en uygun örnekler sıvı halde olanlardır) Yöntemin o proteine spesifikliğine Girişim yapan maddelerin varlığına (protein çöktu rmesi yaptıktan sonra yıkama işlemleriyle bu maddeler ayrılabilir. Amino asitler vetuzlar gibi ku çu k moleku ller ise diyalizle uzaklaştırılabilir). Miktar tayini yapılacak proteinin amino asit bileşimine bağlıdır.

32 I. Kjeldahl Yöntemi 1883 yılındajohan Kjeldahl tarafından geliştirilmiş, bileşiklerin azot miktarını belirlemekiçinkullanılanoldukçaeski bir yöntemdir. Bu yöntemde bileşiklerde bulunan azot, derişik H 2 SO 4 le ve Cu +2 iyonları, civa iyonları ve metalik selenyum gibi katalizörlerle reaksiyona sokularak NH 3 a dönu şu r. Böylece NH 3 asidik ortamda NH 4 iyonları halindetutulur. Çözelti H 2 SO 4 ilavesinden sonra kahverengi- siyah bir renk alır, ısıtıldıkcaberraklaşır. Soğuyan karışım distilasyon cihazına alınır ve ortamın kuvvetli bazik olması için NaOH ilave edilir. Oluşan NH 3 destillenerek alınır ve borik asit çözeltisinde tutulur. NH 4+ iyonları, ayarlı HCl ile titre edilir. Proteindeki azot oranından hareket ederek protein miktarı belirlenir.

33 Bu yöntemle; aminlerde, proteinlerde ve amitlerde bulunan amonyak azotları tayin edilebilir. Ancak bu yöntem, ortamda protein dışında başka azot kaynağı olduğu durumlarda kullanılamaz. Böyle bir durumda proteinler çöktu ru ldu kten sonra tayin yapılmalıdır. Bu yöntemin hassasiyeti iyi değildir. I. Kjeldahl Yöntemi

34 Proteindeki Toplam Azot Miktarının Hesaplaması Hesaplama, bir mol azot atomunun, bir mol NH 3 oluşturmasına ve bunu nötralize etmek için bir mol asit kullanılması gerektiği temeline göre yapılır. 1,0 mol HCl, 14 g azota eşdeğerdir. Örnekte bulunan azottan oluşan amonyağı nötralize etmek için B mol/l konsantrasyonundaki A ml asit çözeltisi gerekiyorsa örnekte bulunanazot miktarı aşağıdaki formu llebulunur. N (g) = 14/1000 x A x B Proteinler ortalama olarak % 16 civarında azot içerdiğinden titrasyon sonucu bulunan azot yardımıyla protein miktarı hesaplanır. 1 mg azot (N) 6,25 mg proteine eşdeğerdir. (100: 16= 6,25 Kjeldahl Fakt.ru ) Örnekteki protein miktarı (g) = 14/1000 x A x B x 6,25 eşitliğinden bulunur.

35 Protein Kaynağı Azot % si Dönu şu m Faktöru Kan Plazması Su t Buğday Et Yumurta

36 II. SPEKTROMETRİK YÖNTEMLER Protein konsantrasyonunun belirlenmesinde çok fazla kullanılır. Beer yasasına göre absorbans konsantrasyonla ilgili olduğundan örnektekiproteinmiktarı hesaplanır. A = є x l x c A = Absorbans Є = Molar absorbsiyon katsayısı (ekstiksiyon katsayısı, M- 1 cm- 1) l = Işığın geçtiği yol (cm) Her proteinin kendi molar ekstinksiyon katsayısı (ε) vardır. Bu işlemlerde molar konsantrasyon kullanılır ve ışığın geçtiği yol ise genel olarak 1 cm olduğu için molar ekstiksiyon katsayısının birimi (M- 1cm- 1) dir. Absorbans skalanın dışına çıkarsa protein örneği tamponla seyreltilir ve ölçu m tekrarlanır. Buna alternatif olarak daha kısa ışık yolu olan bir ku vet de kullanılabilir.

37 SPEKTROMETRİK YÖNTEMLER Absorbans yardımıyla konsantrasyonun belirlenmesi için molar absorbans katsayısının kesin değerinin bilinmesi gerekir. İşlemlerde kullanılan cihazlar da önemli olduğu için literatu rde verilen değerleri kullanmak yerine Є değerinin hesaplanması daha uygundur. Belirli bir dalga boyunda molar absorbsiyon katsayısının belirlenmesi için o madde için hazırlanan stok çözeltiden seyreltmeler yapılır ve bir seri çözelti hazırlanır. Bunların absorbsiyon değerleri konsantrasyonlarına karşı grafiğe geçirilir ve bu doğrunun eğiminden Є belirlenir.

38 YÖNTEMİN ADI: SPEKTROFOTOMETRİ ALETİN ADI: SPEKTROFOTOMETRE

39 Monokromatör: tek bir dalga boyundaki ışının seçilmesi için kullanılır Döteryum (D2) lamba: UV ışık için Tungsten (W) lamba: görünür ışık için kullanılır.

40 Spektrofotometrenin çalışma prensibi: Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör (prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına (monokromatik ışına) dönüştürülür. Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. Ölçümü yapılacak örnek, KÜVET içinekonulur. Görünür alanda çalışılıyorsa CAM (optik) KÜVET; UV de çalışılıyorsa KUVARTZ (silika) KÜVET kullanılır. Örnekten geçen ışığın şiddeti detektör tarafından algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali şeklinde gönderilir.

41 Double-beam (Çift ışınlı spektrofotometrelerde ışın hem örnekten hem de kör örnekten (referans) geçirilir.

42 UV- Visible Spektroskopisi ve Lambert- Beer Yasası: Moleküler Biyolojide UV ve görünür ışınlar kullanılarak : Molekülün yapısı hakkında bilgi edinilebilir. (özellikle UV alandaki absorpsiyon önemlidir.) Konsantrasyon (derişim) belirlenebilir Kimyasalreaksiyonungidişi izlenebilir. Enzim aktivitesi ölçülebilir.

43 Tabakaya gelen ışık Şiddeti: I 0 Tabakadan çıkan ışık Şiddeti: I Homojen bir absorplayıcı ortam

44 Lambert yasası: Homojen bir absorplayıcı ortamdan geçen ışının şiddeti tabaka kalınlığının artması ile üssel olarak azalır: I = I 0 x e - kd I = geçen ışının şiddeti I 0 = gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı d = tabakanın kalınlığı

45 Beer yasası: Işının şiddeti içerisinden geçtiği maddenin konsantrasyonuna bağlıdır. I = I 0 x e - kc I = geçen ışının şiddeti I 0 = gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon

46 Bu iki yasanın birleştirilmesiyle : I = I 0 x e - kcd I/I 0 = e - kcd ln I/I 0 = - k x c x d ln I 0 /I = k x c x d I = geçen ışının şiddeti I 0 = gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon d = ışık yolu (sıvının içinde bulunduğu küvetin genişliği) log I 0 /I = k x c x d k/2.303= ε (epsilon) 2.303

47 Maddenin konsantrasyonu Işık yolu (cm) log I 0 /I = ε x c x d = A (Absorbans) veya E (Ekstinksiyon) Absorpsiyon (veya Ekstinksiyon) katsayısı Konsantrasyonun (c) birimi g/l olursa, ε S, spesifik absorpsiyon katsayısı;; Konsantrasyonun (c) birimi mol/l olursa, ε M, molar absorpsiyon katsayısı adını alır.

48 Işık yolu (d) 1 cm olduğunda A yerine OPTİK DANSİTE (O.D.) terimi kullanılır.

49 Lambert- Beer yasasından sapmalar: NEDENİ: YÜKSEK KONSANTRASYON YANLIŞ DALGA BOYU SEÇİMİ Pozitif sapma uygunluk Negatif sapma Optik dansite Konsantrasyon

50 Spektrofotometrik ölçümler iki farklı şekilde yapılabilir: Belli bir dalga boyunda absorbans ölçülür. Konsantrasyon veya absorbsiyon katsayısının belirlenmesine yarar. Belli bir dalga boyu aralığında absorbans taraması yapılır. Böylece ABSORPSİYON SPEKTURUMU elde edilir. Maddenin kimyasal karakteri hakkında bilgi sağlar.

51 Ultraviyole Bölgedeki Spektrofotometrik 280 nm deki ölçümler Ölçu mler Tirozin ve fenilalaninde bulunan fenolik ve triptofandaki indolik grupların 280 nm de maksimum absorbans göstermesinden yararlanılarak protein miktarı belirlenmektedir. Yöntem çok duyarlıdeğildir ( mg protein/ml ) Ancak protein örneğinde bir ön işleme gerek olmadan yapılan kolay ve hızlı bir yöntem olması nedeniyle çok kullanılır.

52

53 PROTEİNLERİN KONSANTRASYONUNU BELİRLEMEK İÇİN KULLANILAN UV- VISIBLE YÖNTEMLER:

54 280 nm deki absorbans değerleri protein miktarını kabaca verir. Ancak protein saflaştırmalarının protein saflaştırmalarının ileri aşamalarında ve ekstinksiyon katsayısı biliniyorsa o zaman daha hassas sonuçlar alınır. Bu teknik genellikle kolon kromatografisinde protein pikinin nerede elue olacağını belirlemek için ve ham protein karışımlarındaki protein miktarlarının belirlenmesiiçin kullanılır. Protein çözeltisinin saflık du zeyi yu kseldikçe hatalar da en aza indirgenir. Bu nedenle bu yöntem genellikle yarı saf veya saf protein çözeltilerine uygulandığında çok daha hassas sonuçlar elde edilir. UV absorbans yönteminde aynı konsantrasyondaki iki farklı proteinin aromatik amino asit içerikleri farklıysa farklı UV absorbsiyon değeri verir. Bu durum örnek proteinle aynı olan bir standartla deney yapılırsa ortadan kaldırılır.

55 Bu yöntemin önemli bir sakıncası, 260 nm de maksimum absorpsiyon veren nu kleik asitlerle girişim vermeleridir. Nu kleik asit artıkları ile kontamine olmuş ilk kaba ekstrelerle çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir yılında E. Adams, Warburg ve Christian ın verilerini kullanarak bir nomograf oluşturmuştur. Burada nu kleik asit ve protein için belirli konsantrasyonlardaki A 280 ve A 260 değerleri verilmektedir. Buradan yararlanarak hata du zeltme faktörleri belirlenmiş ve listelenmiştir.

56 A 280 /A 260 Oranı (Warburg Christian Yöntemi) Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok protein 280 nm de maksimum absorbsiyon gösterir. Bu özellikten yararlanılarak örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için hızlı bir yöntem geliştirilmiştir. Çok duyarlı olmamakla beraber (duyarlılık: mg/ml), kolaylığı ve hızlı sonuç vermesi nedeniyle çok kullanılan bir tekniktir. Ancak, 260 nm de maksimum absorbsiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm de de absorbsiyon yetekleri olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle nükleik asit artıkları ile kontamine durumdaki ilk kaba ekstrelerle çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir. Bunun önüne geçmek için, Warburg ve Christian (1941) tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü (Tablo 2) genel olarak tüm proteinler için kullanılmakta ve bu yöntemdeortayaçıkabilecek hatapayıdahaazaindirgenebilmektedir.

57 Tablo 2. A 280 /A 260 oranına bağlı olarak, örnekteki nükleik asit % si ve düzeltme faktörlerinin yaklaşık değerleri. (1 cm ışık yolu için geçerli) A 280 /A 260 oranı % Nükleik asit Faktör

58 DNA ve Protein Absorbsiyonları Bu yöntemin uygulanışı 1. Protein çözeltisinin 260nm ve 280nm de absorbansları ölçülür. 2. A 280 /A 260 oranı belirlenir. 3. Hata du zeltme faktöru formu lde yerinekoyularak proteinmiktarı hesaplanır. Protein Derişimi (mg/ml)= faktör x A 280 Schleif ve Wensink 280nm ve 260nm de ölçülen absorbans değerleriyle protein miktarının hesaplanabileceği formu l geliştirmişdir. Protein Derişimi(mg/ml)=1.5 x A x A 260

59 Uzak Ultraviyole Bölgedeki Ölçu mler Proteinlerdeki peptit bağları nm de bir maksimum absorbans gösterirler. Bu teknik protein örneğinde herhangi bir işleme gerek olmayan pratik ve kolay bir yöntem olmasına rağmen kullanılantamponlarla girişim söz konusu olabilir. Çu nku bu dalga boyunda alkoller, kullanılan tamponlardaki iyonlar ve karboksilik asitler de absorbans verir. Bu nedenle protein tayini için fazla kullanılmaz. Bu yöntem proteinlerin amino asit bileşimine bağlı olmadığı için 280 nm deki ölçu mlere göre daha başarılıdır. Ancak oksijen bu bölgede absorbsiyon yaptığı için bu amaçla rutin spektrofotometreler dışındaözel cihazlar kullanılmalıdır.

60 Eğer protein örneği çok az veya hiç tirozin ve triptofan amino asitlerini içermiyorsa protein miktarı 205 nm deki absorbansı ölçerek belirlenebilir. Bu teknik Scopes yöntemi olarak bilinmektedir (1974). 205 nm deki absorbansın buÿu k bir kısmı peptit bağlarından kaynaklanmaktadır. Scopes, tirozin ve triptofan amino asitlerini içeren örnekler için bu dalga boyunda yapılabilen bir yöntem önermiştir. Protein örneği triptofan ve tirozin içeriyorsa, 280 nm deki absorbans ölçu muÿle 205 nm deki ölçu mlerin kombinasyonu sonucu elde edilen formu l kullanılarak daha uygun sonuçlar elde edilir. Protein derişimi (mg/ml) = 27 x 120 x A 280 / A 205

61 Göru nu r Bölgedeki Spektrofotometrik Ölçu mler Biu re Yöntemi Biure reaksiyonunu iki veya daha fazla peptit bağı içeren maddeler verir. Bu yöntem adını u renin kuru ısıtılması sonucu oluşan biu re isimli maddeden (H 2 N- CO- NH- CO- NH 2 ) almaktadır. Bu yöntemde alkali ortamdaki Cu +2 iyonları protein ve peptitlerdeki peptit bağı azotuyla mavi- menekşe renkli kompleks verirler. Renk şiddeti 540 nm de fotometrik olarak tayin edilebilir. Bakır iyonları ile koyu mavi renkli bakır- tetraamin kompleksi oluşur. Ortamda amonyum iyonları bulunduğu zaman (tampon olarak tris kullanılması ve amonyum su lfat ile protein..ktu ru lmesi) bu yöntem uygulanamaz. Böyle bir durumda bakır iyonları amonyakla koyu mavi renkli bakır- tetraamin kompleksi oluşturur.

62 Biu re yönteminin duyarlığı du şu ktu r (1-10 mg protein/ml). Ancak kullanılan reaktiflerin ucuz, hazırlanmasının kolay olması ve diğer yöntemlere göre girişim etkilerinin daha az olmasından dolayı kullanılmaktadır. Bu yöntemle miktar tayini yapılabilmesi için örnekteki protein miktarının 1-20 mg civarında olması gerekmektedir. Cu +2 iyonları ana zincire bağlandığı için bu yöntem proteindeki amino asit içeriğindenetkilenmez.

63 Biu re reaksiyonu sonucu bakır- tetra amin kompleksi oluşumu Biu re Belirtecinin Hazırlanması: 0.15 g bakır su lfat (CuSO 4. 5 H 2 O) ve 0.6g Na, K- tartarat 50 ml suda çözu lu r. 30 ml %10 luk NaOH ilave edilir ve hacım 100 ml ye tamamlanır.

64 Uygulama 1 er ml 1-12mg BSA proteini içeren standartlar (1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 mg/ml) ve tayini yapılacak protein örneği ve kör örnek (1 ml tampon veya saf su) u zerine 4 ml biu re reaktifi ilave edilerek vortekslenir. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilir.

65 Absise standart proteinlerin konsantrasyon değerleri, ordinata ise bunların absorbans değerleri yerleştirilerek doğrusal bir grafik (standart eğri) hazırlanır. Bu eğrinin oluşturulmasında en az 5 nokta kullanılmalıdır. Derişimi bilinmeyen protein örneğinin absorbans değerinin eğriyi kestiği noktadan absise indirilen bir dikey vasıtasıyla bilinmeyen derişim bulunur. Bu işlemlerdee ölçümler sırasında yapılan seyretmeler de dikkate alınmalıdır.

66 ÖLÇÜM Protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun ölçülmesi Protein çözeltisinin bir belirteçle reaksiyona sokulup oluşan renkli bileşiğin (kromofor) görünür alanda ölçülmesi

67 Biüre Yöntemi Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir. Reaksiyonun esası Cu atomunun peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide nm de maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleks oluşumuna dayanır. Bakır atomlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit içeriğinin ölçümler üzerinde herhangi bir önemli etkisi yoktur.

68 Lowry Yöntemi Bu yöntem, fosfomolibdotungstik asit (Folin- Ciocalteau Belirteci) çözeltisinin tirozin bakiyeleri ile reaksiyona girerek mavi bir renk oluşturması esasına dayanır. Reaksiyon, bakır ile protein arasında kompleks oluşumu ile başlar, alkali çözeltide, oda temperatüründe 5-10 dakika içinde tamamlanır. Bakırın varlığı yöntemin duyarlılığını 3-15 kat artırmaktadır, çünkü Cu ile yapılan kompleks, Folin belirtecindeki Mo ve WO 4 ile birleşerek yeni bir kompleks ortaya koyar. Ancak analiz edilen örnekteki fenolik maddeler hatalara yol açabilir. Duyarlılık: µg/ml

69 Lowry Yöntemi Lowry tarafından 1951 yılındakullanılmayabaşlanmıştır. Protein tayininde en yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Fosfomolibdik/fosfotungstik asit çözeltisinin (Folin- Ciocalteau reaktifi) alkali koşullarda proteinlerdeki fenolik amino asitlerle verdiğireaksiyona dayanmaktadır. Bu yöntemde alkali koşullarda iki farklı reaksiyon gerçekleşmektedir. Birinci reaksiyonda peptit bağları ile Cu+2 arasında biu re reaksiyonu sonucu indirgenmiş bakır oluşur. İkinci reaksiyonda ise Folin- Ciocalteu ayıracı, tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek indirgenir ve mavi renkli heteropolimolibden kompleksi meydana getirir. Oluşan kompleks nm aralığında absorbsiyon piki verir.

70 Lowry Yöntemi Lowry yöntemine proteinin amino asit bileşiminin etkisi orta du zeydedir. Ancak amino tu revleri, tamponlar, deterjanlar, lipitler, karbohidratlar ve şelatlayıcı ajanlar bu yöntemle girişim yapmaktadır. Protein örneği seyreltilerek bu girişim etkileri azaltılabilir. Ayrıca bu etkilerin önlenebilmesi için, yöntemin her bir girişim etkisi için farklı modifikasyonları bulunmaktadır. Lowry yöntemi, tirozin ve triptofan içeriği fazla olan proteinlerle daha fazla hassasiyet gösterdiği için bu amino asitler açısından zengin olan proteinlerde oldukça iyi sonuçlar alınmaktadır.

71 Lowry Yöntemi Bu yöntemin hassasiyeti μg/ml civarındadır. Reaksiyon ph a çok fazla bağlıdır (ph ). Bu nedenle uygun bir ph ın sağlanabilmesi içinreaktifin seyreltilmesi gerekebilir. Reaksiyon oda sıcaklığında 40 dakikada tamamlanır. Absorbans okuması cam veya polistiren ku vetler kullanılarak 750 nm yapılır. Ancak 600 ve 650 nm de absorbans ölçu mleri yapılmaktadır.

72 Lowry Yöntemi Lowry yöntemi, hassasiyetinin iyi olması ve kolaylığı açısından protein biyokimyası işlemlerinde çok fazla kullanılır. En fazla gıda proteinlerinin tayininde kullanılır. Çünkü gıda karışımından proteinleri izole etmeğe gerek yoktur. Biu re yöntemine göre kez daha hassastır. 280 nm de absorbans yöntemine göre ise kez hassastır. Diğer yöntemlere göre daha spesifiktir. Dezavantajları: Renk oluşumu proteinlere göre farklılık gösterebilir. Renk tamamen protein konsantrasyonuyla orantılı olmayabilir. Lipitler, sakaroz, fosfat tamponları, monosakkaritler ve hegzoaminlar girişim yaparlar.

73 Reaktifler A Reaktifi: 1 g Na veya K- tartarat ve 0.5 g CuS04.5H ml destile suda çözu lu r. Çözeltinin ışıktan korunması gerekir. B Reaktifi: 20 g Na 2 C0 3 ve 4 g NaOH bir litre destile suda çözu lu r. C Reaktifi: 1 ml A reaktifi + 50 ml B reaktifi

74 Folin Ciocalteau Reaktifi: 5 g sodyum tungstat dihidrat (Na 2 WO 4 H 2 O), 1.25 g sodyum molibdat (Na 2 MoO 4.H 2 O), 2.5 ml %85 lik H 3 PO 4, 5 ml derişik HCl, 35 ml su ile karıştırırlır. Çözelti 10 saat oda sıcaklığında bekletilir. 7.5 g lityum su lfat,2.5 ml su ve birkaç damla Br 2 damlatılır. (10 saat geri soğutucu altında kaynatılıp soğutulur) 50 ml ye seyreltilir, taze hazırlanırve ışıktan korunur. Folin Ciocalteau belirteci ticari olarak da satılmaktadır. BSA kullanılarak konsantrasyon 1 mg/ml olacak şekilde stok çözelti olarakhazırlanır. Daha sonra bu stoktan bir seri standarthazırlanır. Örnek çözeltinin konsantrasyonu, standart çözeltilerin konsantrasyon aralığında ise seyreltilmesine gerek yoktur. Daha derişik olan örnekler seyreltilir. 0,01 mg/ml'den du şu k protein içeren numuneler ise TCA ile çöktu ru lerek deriştirilir.

75 Uygulama

76

77 Bikinkoninik (BCA) Asit Yöntemi Lowry yönteminin farklı bir uygulaması olan bu teknik, Smith ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Diğer protein tayin yöntemlerine göre dahayenidirve reaktif olarak bikinkoninik asit (BCA) kullanılır. Bu yöntem alkali çözeltideki proteinlerin Biu re reaktifi ile Cu+2 den Cu+1 indirgenmesi ve daha sonra Cu+1 in BCA ile verdiği renkli kompleksin 562 nm deki spektrofotometrik ölçu mu ne dayanır. Renk yeşilden koyu mora dönu şu r. Yöntemin duyarlılığı Lowry metoduna yakındır ( μg Protein/ml). Mikro ölçüm işlemi ile duyarlılığın daha da arttırılması mu mku ndu r.

78 Bikinkoninik (BCA) Asit Yöntemi BCA yöntemi proteinin amino asit kompozisyonundan az etkilenir ve girişim etkisi gösteren çok fazla bileşik yoktur. Ancak BCA reaktifi pahalıdır ve tekrarlanabilirlik du şu ktu r. Amino asitler, deterjanlar, lipitler, şekerler ve nu kleik asitler Lowry metoduna göre daha iyi tolere edilir. İndirgen şekerler ve bakır şelatlayıcı maddeler bu yöntemde girişim etkisi gösterir. Cu +2 iyonları ile şelat oluşturan EDTA gibi maddeler de girişime yol açar. Ditiyotreitol, glutatyon ve 2- merkaptoetanol gibi indirgeyici reaktifler de Cu +2 iyonlarını Cu +1 e indirgeyerek oldukça fazla girişim etkisi gösterir. BCA yönteminde girişim etkilerini engellemek için Gates tarafından bir teknik bulunmuştur. Bu teknikte ph 8.5 da pozitif yu klu naylon bir membrana protein bağlanır. Girişim yapan maddeler yıkanarak uzaklaştırıldıktan sonra BCA reaktifi ile reaksiyona sokulur. Taze hazırlanan maddelerle çalışıldığında girişim etkisi daha az olmaktadır.

79

80 Uygulama Standart çözeltilerin, kör ve örneğin 0.1 ml sine, standart çalışma reaktifinden 2 ml ilaveedilir. Oda sıcaklığında 2 saat veya 370 C da 30 dakika inku be edilir. Eğer 37 0 C da tutulmuşsa soğutulur. Spektrofotometrede 562 nm de absorbans okuması yapılır. Hazırlanan standart eğriden protein örneğinin miktarı belirlenir.

81 Boya- Bağlama (Bradford Yöntemi) Bu yöntem, Coomassie Brilliant Blue G- 250 boyasının farklı konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak, farklı renk şiddetinde (koyulukta) çözeltiler ortaya koymasından yararlanılarak geliştirilmiştir. Boyanın özellikle arjinin gibi bazik amino asitlere ve bazı aromatik amino asitlere bağlanma eğiliminde olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi vardır. Duyarlılık sınırları, total reaksiyon karışımında (5.1 ml) µg olan bu yöntemde (ki bu da örnek konsantrasyonunun mg/ml arasında olması demektir) asidik boya proteine bağlanır ve nm arasında maksimum absorbsiyon değerleri elde edilir.

82 Bradford (Coomassie Brillant Blue) Yöntemi Boya bağlama esaslı yöntemlerin en yaygını 1976 yılında Bradford tarafından geliştirilen ve Coomassie Brilliant Blue G- 250 boyasının kullanıldığı yöntemdir. Proteinlerin asidik ve bazik grupları uygun koşullarda organik boyalarla etkileşerek renkli bileşikler oluşturur. Özellikle aromatik boyarmaddeler proteinlereçok sağlam bağlanırlar. Proteinlerin tayin edilmesi işlemlerinde Orange G, Amido siyahı, Bromkrezol yeşili ve Coomassie Brilliant Blue G- 250 (CBBG) gibi boyalar kullanılmaktadır.

83 Bradford (Coomassie Brillant Blue) Yöntemi Coomassie Brillant (CB) boyalarının proteinlere bağlanması ilk kez Fazekas ve St Groth tarafından 1963 yılındaçalışılmıştır. Yöntem bu boyanın farklı konsantrasyondaki protein çözeltilerinde farklı şiddette mavi renk oluşturmasından yararlanılarak geliştirilmiştir. Boya özellikle arginin gibi bazik amino asitlere ve bazı aromatik amino asitlere bağlanmaktadır. Spector isimli bilim adamı protein örneği ile kullanılan boyanın hacmini uygun şekilde oranlayarak çok daha hassas protein tayinleri yapılabileceğinibelirtmiştir.

84 Bradford (Coomassie Brillant Blue) Yöntemi Bu yöntemle oldukça geniş bir aralıkta protein tayini yapmak mu mku ndu r. Kolay vehassas biryöntemdir. Arginin amino asidi bu boyayla diğer amino asitlere göre sekiz kat daha fazla cevap verir. Çalışılan arginince zengin bir proteinse standardın da aynı şekilde arginince zengin olması gerekir. G- 250 boyası sulu ortamda kırmızı(a) ve mavi(b)olmak u zere iki şekilde bulunur. Asidik ortamda kırmızı renkli A şekli fazladır ve 470 nm de maksimum absorbsiyon yapar. Bu boya, (+) yu klu bir proteinebağlandığındaise 595 nm de mavi bir renk oluşturur. Renk oluşumu 5 dakikada tamamlanır,ancak dakika çökmeler olabilir.

85 Le Chatelier yasasına göre asidik ortamda A ve B şekilleri dengedeyken proteinler ilave edildiğinde kırmızı form konsantrasyonu azalır ve mavi form konsantrasyonu artar. Boyanın bu iki halinin geçisi artan protein konsantrasyonuyla 450 nm de azalan absorbansı ölçerek veya 595 nm de artan absorbası ölçerek spektrofotometrik olarak izlenebilir. 1.Adım: A kırmızı B mavi 2. Adım: B mavi + Protein B mavi protein Net Reaksiyon: Akımızı+protein Bmavi protein Kırmızı renk azalır vemavi renk artar (595 nmde).

86

87 Sedmak ve Grossberg, boya- protein kompleksinin boyanın kaynağınabağlıolarak maksimum absorbans aralığının nmarasında değiştiğinibildirmiştir. Bu araştırmacılar protein miktarının belirlenmesi için 620 ve 464 nmdeki absorbansların oran oranının kullanılmasının daha uygun olacağını ve asidik bir ortam oluşturmak için fosforik asit yerine perklorik asit veya hidroklorik asit kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Zor ve Selinger ise 590 ve 450 nm dalga boylarının oranının kullanılmasının CB tayin sisteminin lineerliğini de arttırdığını belirtmiştir. Bu oranın kullanılması ayni zamanda tayinin hassasiyetini de arttırır.

88 Bu yöntemde duyarlılık μg protein/ml civarındadır. Bu duyarlık mikro tayinlerle daha da arttırılabilir ( μg protein/ml). Boya- protein komleksinin ekstinksiyon katsayısı substratın 10 kata kadar olan farklı konsantrasyonunda bile kararlıdır. Örneğin absorbansı lineer bölgenin u stu ndeyse toplam hacım 5 ml oluncaya kadar Bradford çalışma tamponuyla seyreltilebilir. Blank de ayni hacime seyreltilmelidir (Spector, 1978). Bu yöntem için alternatif bir standart olarak ovalbu min kullanılabilir. Bradford yöntemi kolonlarda bulunan immobilize proteinlerin ve membrana bağlı proteinlerin konsantrasyonunu belirlemek için de kullanılır(fanger,1987).

89

90 Protein Tayin Yöntemi Uygun şekilde seyreltilen protein örneğine standartlara ve köre 1 ml boya reaktifi katılıp vortekslenir. 5 dakika sonra köre karşı 595 nm deki absorbanslar ölçülür. Standart grafikten proteinderişimi belirlenir.

91 Standartların renk göstergesi (en sağdaki tu p kör tu pu du r) ve standart grafiği

92 Gu mu ş Bağlama Yöntemi Gu mu ş iyonlarının proteinlerle bağlanmasıyla oluşan renkli bileşiğin 420 nm deki absorbansının okunmasıyla yapılır. Oldukça yu ksek bir hassasiyeti vardır (150 ng 20 μg protein/ml). Ancak şelatlayıcı ajanlar (EDTA) tarafından, % 0.01 den fazla SDS den ve DTT ve 2- merkaptoetanol gibi indirgeyici ajanlardan kolayca etkilenerek bozulur.

93 FLORİMETRİK TEKNİKLER Florimetrik yöntemlerle diğer yöntemlerde göru len girişim sorunları ortadan kaldıranve oldukçahassas sonuçlar elde edilir. Floresans tekniklerin en buÿu k avantajı, duyarlıkları ve sonuçların nanogram (10-9) du zeyine kadar belirlenebilmesidir. Bu tu r floresans temelli tayinlerden biri Udenfriend tarafından 1972 yılındauygulanmıştır. Bu yöntemde floresan olmayan bir bileşik olan floresamin, proteinlerdeki primer aminlerle (peptitlerin terminal amino grupları ve lizinin Є amino asidi gibi) oldukça hızlı bir şekilde floresan bir bileşik oluşturarak reaksiyon verir yılında Lorenzon bu yöntemimodifiye etmiştir. Bio- tek FL600 firması 2006 yılında bu iki yöntemden yararlanarak ve mikroplate floresans okuyucu kullanarak toplam protein miktarını oldukça hassas bir şekilde belirlemiştir.

94 Yaygın olarak kullanılan yöntem ise proteinlerin o- fitalaldehit (OPA)- ile tu revlendirilmesine dayanır. OPA proteinlerdeki primer aminlerle (amino asidin NH 2 terminali ve lizinin є- amino asidi gibi) reaksiyon verir. Yöntemin hassasiyeti tayinden önce protein örneğinin hidrolizlenmesiyle daha da arttırılabilir. Hidroliz işlemi proteinde yan grup olarak bulunan Є- amino gruplarını reaksiyona hazır hale getirir. Bu yöntemle yapılan tayinlerde çok az miktardaki protein örneği yeterli olmaktadır. Tris (hidroksimetil) aminometan, amino asit tamponları gibi primer aminler o- fitalaldehit ile reaksiyon verdiği için ortamdan uzaklaştırılmalıdır. OPA genellikle 2- merkaptoetanol varlığında ve ph 9.5 de peptit ve proteinlerin primer amin gruplarıyla oldukça floresans bileşikler olan izoindolleri meydana getirir.

95 Spesifik dalga boyu kullanılarak uyarılır ve yayılan floresans miktarından ölçu m yapılır. Standart Çözeltiler: Uygun bir standart, örneğin hazırlandığı tamponda çözu lerek hazırlanır. Bu işlem için en az 5 adet standart hazırlanmalıdır ( μg/ml konsantrasyon aralığında). Örnek Çözeltisi: Konsantrasyonu belirlenecek olan protein uygun bir tamponda çözu lu r. Konsantrasyonun standart çözeltilerin aralığında olmasına dikkat edilmelidir. Blank (kör): Örnek ve standart çözeltilerin hazırlandığı tampon kullanılır. Bu ölçümlerdefloresan olmayanbirkör kullanılır.

96 Reaktifler Borat Tamponu: g borik asit suda çözu lu r ve ph potasyum hidroksitle 10.4 e ayarlanır. Suyla 1 litreye seyreltilir. Stok OPA Reaktifi: 120 mg o- fitalaldehit 1.5 ml metanolde çözu lu r, 100 ml borat tamponu ilave edilir, 0.6 ml polioksietilen loril eter ilave edilir ve karıştırılır. Bu çözelti oda sıcaklığında en az 3 hafta kararlıdır. OPA Reaktifi: 5 ml stok OPA Reaktifine 15 μl 2- merkaptoetanol ilave edilir. Bu reaktifin kullanılmadan en az 30 dakika önce hazırlanması gerekir. 1 gu n için kararlıdır.

97 İşlem Standartlar ve örnek protein çözeltisi ph ları arasında olacak şekilde ayarlanır. Standart çözeltiler ve 10 μl örnek protein çözeltisi, 100 μl OPA ile karıştırılır ve oda sıcaklığında 15 dakika beklenir. 3 ml 0.5 N NaOH ilave edilip karıştırılır. Bir florimetre kullanılarak standart çözeltilerin ve örneğin 340 nm deki uyarma dalga boyu ve nm deki emisyon dalga boyunda floresans şiddetleri belirlenir. Hesaplama Protein konsantrasyonu ve floresans şiddeti arasındaki ilişki lineerdir. Lineer regresyon yöntemi kullanarak protein konsantrasyonuna karşı standart çözeltilerin floresans şiddetleri grafiğe geçirilerek standart eğri çizilir. Daha sonra standart eğri yardımıyla floresans şiddeti bilinen örneğin protein konsantrasyonu belirlenir.

98 Floresans Yöntemi

99 İMMÜNOLOJİK YÖNTEMLER Protein tayinlerinde antikorlar da spesifik bir şekilde kullanılmaktadır, monoklonol antikorlar oldukça geniş bir şekilde bu amaçla kullanılır. Birçok antikor hedef proteini çöktu ru r, oluşan bulanıklık tu rbidometrik yöntemlerle ölçülür. Alternatif immu no tayinler de hassasiyeti arttırır. KOLOİDAL ALTIN YÖNTEMİ Bu yöntemin temeli, asidik ortamda (+) yu klu proteinlerin ( ) yu klü kolloidlerle etkileşmesi ve oluşan rengin 560 nm de okunmasıdır. Bu yöntem 2-60 μg protein/ml aralığında bir duyarlığa sahiptir yılında yapılan bir çalışmada Western blot tekniğinde olduğu gibi nitroselu lozdaki proteinleri boyamak için kolloidal altın çözeltisi kullanılmıştır. Böylece duyarlık nanogram du zeyine çıkmıştır.

100 KOLOİDAL ALTIN YÖNTEMİ Bu işlemde proteinlerin bağlanması için genellikle nitroselu loz membranlar kullanılmaktadır. Membrana bağlı proteinler kolloidal altın çözeltisi ile 2-16 saat inku be edildikten sonra örnekteki protein miktarıyla orantılı olarak mor renkli protein bantları gözlenir. Tu m bantların göru nu r hale gelmesi 1-2 saat içinde gerçekleşir. Sonra kolloidal altın çözeltisi birkaç kez yıkanarak uzaklaştırılır. Tu m yıkama ve inku basyonlar oda sıcaklığında yapılmaktadır. Kloru r iyonları gibi kontaminantlar kolloidal altının farklı çökmesine yol açar.

101 KOLOİDAL ALTIN YÖNTEMİ Altın çözeltileri Bio- Rad firması tarafından hazır olarak satılmaktadır. Bu işlemde membranın cm 2 si başına yaklaşık 0.2 ml kolloidal altın çözeltisi kitikullanılmasıönerilmektedir. Bantların dansitometrik analizinde,aynı nitroselu loza yerleştirilen protein standartlardan yararlanarak miktar tayini yapılır. Klasik protein tayin yöntemlerine göre bu yöntemde çok az miktarda protein örneğine gerek duyulur (2 μl). Böylece nanogram du zeyinde protein tayinleri yapmak mu mku n olmaktadır.

102 Gravimetrik Yöntemler Protein suda çözu lu r ve 95 C tu m su uçuncaya kadar kurutulur. Daha sonra sıcaklık fiziksel olarak bağlı bulunan suyun uzaklaştırılması için C ye kadar arttırılır. Soğuduktan sonra bir vakum desikatöru nde P 2 O 5 ile kuruttuktan sonra kuru ağırlık belirlenir. Bu değerє%1 280 değerini belirlemek için kullanılır. Kuru ağırlık g olarak belirlenmiş olsun. Bu 100 ml suda çözu ldu ğu zaman Konsantrasyon = 0.073g/100 ml = % olarak bulunur. A 280 = olarak bulunsun A 280 = Є x cx l l = 1 cm olduğundan Є = A 280 / c bulunur. Є %1 280 = 0.815/0.073 = olur.

103

104 Protein tayinleri hazır olarak satılan kitlerle de yapılmaktadır. Bunları satan firmalar: Amerscham- Bioscience Pharmacia Bio- Rad Molecular probes Pierce Roche