B ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay

Transkript

1 B ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay ABD Patent No ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; U /04 Türkçe KULLANIM AMACI BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Legionella pneumophila [LP] Amplifiye edilmiştir DNA Testi) klinik pnömoni şüphesi bulunan hastalardan balgam örneklerindeki Legionella pneumophila DNA sının (serogrup 1 14) doğrudan kalitatif olarak tespit edilmesi için Dizi Yerdeğiştirme Amplifikasyonu (SDA) teknolojisini kullanır. Kültür ve diğer yöntemlerle birlikte lejyoner hastalığının muhtemel tanısına yardım amaçlıdır. ÖZET VE AÇIKLAMA Lejyoner hastalığı, Legionella içeren aerosollerin solunması veya kontamine suyun mikroaspirasyonu yollarıyla bulaşabilir. Avrupa ve Kuzey Amerika daki çalışmalarda Legionella, hastaneye yatırılmayı gerektiren salgın pnömoninin (CAP) %2-15 inin sebebi olarak bildirilmiştir. Lejyonelloz hastalarının ölüm oranı, yaşlı ve bağışıklık yetmezliği olan hastalarda daha yüksek ölüm riski ile birlikte, % 5-30 dur. 1 Yarısı insanda hastalığa sebep olan kırk farklı Legionella türü belirlenmiştir. Lejyonelloz tanılı vakaların %90 ına Legionella pneumophila sebep olmaktadır. On dört L. pneumophila serogrubu bilinmesine rağmen, L. pneumophila enfeksiyonlarının %80 inin sebebi serogrup 1 dir. 2 Pnömoni tanısı ve etiyolojisi, aşırı antibiyotik kullanımı hakkında artan endişe nedeniyle daha fazla önem kazanmıştır. L. pneumophila tanı testi sonuçları hızla doktora bildirilmelidir, çünkü uygun tedavinin gecikmesi durumunda mortalitenin arttığı görülmüştür. Geleneksel kültür yöntemleri ile, pozitif suptum örneklerinden Legionella organizmalarının gelişmesi en az iki gün; negatif sonucun kesinleştirmesi ise toplam yedi ila on gün sürmektedir. Kültüre ek olarak, idrar örneklerinde L. pneumophila serogrup 1 antijeninin saptanması için piyasada enzim immüno test kitleri mevcuttur. 3 Bununla birlikte, iyi bir duyarlılık ve özgüllük ile hızlı sonuçlar veren Legionella enfeksiyonu tanı testleri son derece sınırlıdır. PROSEDÜR İLKELERİ BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay, amplifikasyon primerleri ve flüoresan etiketli detektör probu kullanarak hedef DNA nın eşzamanlı amplifikasyonu ile tespitini temel almaktadır. SDA reaktifleri tek kullanımlık iki ayrı microwellde kurutulmuştur. İşlenen örnek, amplifikasyon primerlerini, floresan etiketli detektör probunu ve amplifikasyon için gerekli diğer reaktifleri içeren Primer Microwelline eklenir. Primerler türün bütün serogruplarında korunmuş olan L. pneumophila makrofaj infektivite artırıcı (mip) geninin 68 baz çiftinden oluşan bölgesini amplifiye eder. İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımı SDA için gerekli iki enzimi (DNA polimeraz ve restriksiyon endonükleaz) içeren Amplifikasyon İşlemi Microwelline aktarılır. Amplifikasyon Microwelleri kontaminasyonu önlemek için kapatılır ve daha sonra her reaksiyonun amplifiye ürünlerin oluşumu açısından izlendiği, ısıl olarak kontrol edilen floresan okuyucularda inkübe edilir. Her reaksiyon, amacı amplifikasyon için uygun koşulların mevcut olduğunu doğrulamak ve test inhibitörlerinin varlığına bağlı olarak hatalı-negatif sonuçlar bildirme olasılığını azaltmak olan bir Dahili Amplifikasyon Kontrolünü (IAC) koamplifiye eder ve tespit eder. L. pneumophila DNA varlığı veya yokluğu, örneğe ait PAT (Eşikten Sonra Geçişler) sonuçlarının önceden belirlenen eşik değeri ile ilişkilendirilmesiyle belirlenir. Cihaz sonuçları pozitif, negatif veya belirsiz olarak otomatik olarak bildirir. REAKTİFLER VE MATERYALLER BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Legionella pneumophila [LP] Amplifiye edilmiş DNA Testi) şunları içerir: Legionella pneumophila (LP) Priming Microwelleri, (1x24) 6 Oligonükleotid 7,5 pmol, dntp ler 15,2 nmol, 2 Detektör Probu 22,5 pmol, Sentetik Oligonükleotid kopya Legionella pneumophila (LP) Amplifikasyon İşlemi Microwelleri, (1x24) Restriksiyon Enzimi: 33 Birim, DNA Polimeraz 14 Birim 10 Primer Kapağı, 16 Yapışkanlı Kapak (1/2), 8 Atık Çantası BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF*/LP/MP**) (BD ProbeTec ET Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kiti [CF*/LP/MP**]): İçindekiler: Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı: Bisin, Potasyum Fosfat, Potasyum Hidroksit, DMSO ve Proclin; 10 (CF/LP/MP) Pozitif Kontrol: ng Salmon Sperm DNA, 47,3 µg Tris, 9,0 µg EDTA, Kopya CF Plasmid, Kopya LP Plasmid, Kopya MP Plasmid; 10 (CF/LP/MP) Negatif Kontrol: ng Salmon Sperm DNA, 47,3 µg Tris, 9,0 µg EDTA; 100 adet 2 ml Geçme Kapaklı Tüp * BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay e (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Familyası [CF] amplifiye edilmiş DNA Testi) karşılık gelir ** BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay e (BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae [MP] amplifiye edilmiş DNA Testi) karşılık gelir Cihaz, ekipman ve sarf malzemeleri: BD ProbeTec ET Instrument and Instrument Plate (BD ProbeTec ET Cihazı ve Cihaz Plağı), BD ProbeTec ET Lysing Heater (BD ProbeTec ET Lize İşlemi Isıtıcısı), BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (BD ProbeTec ET Priming Isıtıcısı), BD ProbeTec ET Pipettor, stand and

2 Power Supply, 2 ml Sample Tube Rack (BD ProbeTec ET Pipetör, Stand ve Güç Kaynağı, 2 ml Örnek Tüp Sporu), BD ProbeTec ET Accessories Kit (BD ProbeTec ET Aksesuar Kiti), BD ProbeTec ET Pipette Tips (BD ProbeTec ET Pipet Uçları). Gerekli fakat sağlanmamış malzemeler: Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini (BSC), vorteks karıştırıcı, -20 C ve/veya -70 C (veya daha soğuk) sıcaklık döngüsüz dondurucu, x g kapasiteli mikrosantrifüj, su banyoları, dijital termometre, vida kapaklı su banyosu yuvası, diğer uygun örnek tüp sporları, QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kits (QIAGEN QIAamp DNA Feçes Mini Kitleri), % Etanol, BBL CultureSwab EZ Swabs (BBL CultureSwab EZ Swabları), BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tubes and Caps (BD ProbeTec ET 2 ml Örnek Tüpü ve Kapakları), tek kullanımlık eldivenler, alkole dayanıklı marker, µl kapasiteli mikropipetler, aerosole dirençli pipet uçları, distile su, L. pneumophila ATCC (Philadelphia-1), %0,85 (a/h) tuz çözeltisinde %0,2 (a/h) Bovin Albümin (Fraksiyon V), %1 (h/h) Alconox lu sodyum hipoklorit.* * 7,5 g Alconox u 1 L %1 (h/h) sodyum hipoklorit çözeltisi ile çözün ve karıştırın. Her gün yenisini hazırlayın. Saklama ve İşleme Gereklilikleri: BD ProbeTec ET LP Reagent Packs (BD ProbeTec ET Reaktif Paketleri) 2 33 C de saklanabilir. Son kullanım tarihi geçen açılmamış reaktif paketlerini kullanmayın. Açılan bir torba, microweller uygun şekilde tekrar kapatıldıkları sürece 12 hafta boyunca veya daha önce geliyorsa son kullanma tarihine kadar stabildir. Dondurmayın. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) (BD ProbeTec ET Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kiti [CF/LP/MP]) 2 33 C de saklanabilir. Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. Dondurmayın. Uyarılar ve Önlemler In vitro Diyagnostik Kullanım içindir. 1. Klinik örneklerde hepatit virüsü ve İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü de dahil olmak üzere patojenik mikroorganizmalar bulunabilir. Kan veya diğer vücut sıvılarıyla kontamine olan tüm öğelerle çalışılırken, Standard Precautions (Standart Önlemler) 4-7 ve kurumsal düzenlemeler takip edilmelidir C de inkübasyon basamağından önceki alt solunum örneği çalışma ve işleme adımları, bir Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabininde (Class II Biological Safety Cabinet - BSC) gerçekleştirilmelidir C inkübasyon basamağı sırasında potansiyel olarak biyolojik tehlike arz eden alt solunum örneklerine ilave koruma kabı olarak vida kapaklı su banyosu yuvası kullanın. 4. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (BD ProbeTec ET Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı) dimetil sülfoksit (DMSO) içerir. DMSO solunduğunda, ciltle teması halinde veya yutulduğunda tehlikelidir. Göze temas ettirmekten kaçının ve çalışırken her zaman eldiven kullanın. Gözlerle temas etmesi halinde, derhal bol suyla yıkayın ve bir doktora danışın. Ciltle teması halinde, derhal bol suyla yıkayın. 5. Bu prosedürde kullanılan QIAGEN reaktifleri hakkında güvenlik bilgileri için QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook a bakın. QIAGEN reaktiflerini çamaşır suyu çözeltilerine atmayın. QIAGEN reaktiflerini çamaşır suyuna maruz bırakmayın. 6. Reaktiflerin Legionella DNA sı ile kontamine olması potansiyeli sebebiyle, QIAGEN DNA ekstraksiyon kitlerinin Legionella PCR için (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) uygun olmadığını belirten raporlar bulunmaktadır. 8,9 Bu ihtimalin düşük olmasına ve bu çalışmalarda L. pneumophila dışındaki Legionella türleri tanımlanmış olmasına rağmen, kullanıcı hasta örnekleri ile birlikte kullanmadan önce her yeni QIAGEN reaktifi lotunun performansını doğrulamalıdır. 7. BD ProbeTec ET tasarımı test ortamında amplikon kontaminasyonu olasılığını düşürdüğünden bu işlem için özel çalışma alanları gerekmese de, kontaminasyonun önlenmesi, özellikle de işlem sırasında örnek kontaminasyonunun önlenmesi için diğer önlemlerin alınması gerekmektedir. 8. Kullanılmamış Priming İşlemi Microwelleri ve Amplifikasyon İşlemi Microwellerini içeren reaktif torbaları açıldıktan sonra dikkatlice tekrar KAPATILMALIDIR. Reaktif torbalarını tekrar kapatmadan önce torbada desikant bulunduğundan emin olun. 9. Amplifikasyon İşlemi Microwellerini içeren plak, BD ProbeTec ET Priming Isıtıcısından BD ProbeTec ET Cihazına taşınmadan önce Yapışkanlı Kapak kullanılarak uygun şekilde KAPATILMALIDIR. Plağın kapatılması amplifikasyon ve tespit için kapalı bir reaksiyon sağlar ve cihazın ve çalışılan alanın amplifikasyon ürünleri ile kontamine olmasını önlemek için gereklidir. Kapatma malzemesini microwellerden kesinlikle çıkarmayın. 10. Sıvı kalıntısı (sıvının Priming Microwellinden Amplifikasyon İşlemi Microwelline aktarılmasından sonra) içeren Priming Microwelleri hedef kontaminasyon kaynağı oluştururlar. Priming Microwellerini atmadan önce yapışkanlı kapağını dikkatle kapatın. 11. Çalışma alanının amplifikasyon ürünleri ile kontaminasyonunu önlemek için test edilen Amplifikasyon İşlemi Microwellerini atmak için Reaktif Paketlerinde bulunan atık çantalarını kullanın. Atmadan önce çantaların düzgün şekilde kapatıldığından emin olun. 12. Örneklerin çapraz kontaminasyonunun önüne geçmek için, örnek işleme ve test prosedürleri sırasında belirtilen adımlarda ELDİVEN DEĞİŞTİRİN. Eldivenler örnekle temas ederse, diğer örneklerin kontamine olmasını önlemek için eldivenleri derhal değiştirin. 13. Çalışma alanının veya ekipmanın örneklerle kontamine olması halinde, kontamine olan alanı %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle iyice temizleyin ve suyla iyice durulayın. Diğer testlere devam etmeden önce yüzeyin tamamen kurumasını bekleyin. Herhangi bir QIAGEN örnek işleme reaktifini temizlemeden önce, etkilenen bölgeyi suyla silin ve ardından Alconox içeren %1 (h/h) sodyum hipoklorit çözeltisini kullanın. 14. İşlenmiş örnekleri Priming Microwellerine aktarmak için ve örneklerin Priming Microwellerinden Amplifikasyon İşlemi Microwellerine aktarılması için sadece BD ProbeTec ET Pipetörü ve BD ProbeTec ET Pipet Uçlarını kullanın. 15. Kullanılmış pipet uçlarını, örnek tüplerini, Priming Microwellerini ve diğer tek kullanımlık malzemeleri atarken belirlenen laboratuvar uygulamalarını kullanın. Tek kullanımlık malzemeleri dikkatle atın. Atık kaplarını ¾ oranında dolduklarında veya günlük olarak (hangisi daha önce gerçekleştirilirse) kapatın ve atın. 2

3 16. Farklı lot numaralarına sahip kitlerdeki Microwelleri, Kontrolleri veya işlem reaktiflerini değiştirmeyin veya birbirleriyle karıştırmayın. 17. BD ProbeTec ET cihazına temizlemeyle giderilemeyen şekilde sıvı dökülmesi veya DNA ile kontamine olması gibi beklenmedik durumlar oluştuğunda Teknik Servis i arayın. ÖRNEK TOPLAMA VE NAKİL 1. Örnek Toplama Örnekler Clinical Microbiology Procedures Handbook 10 veya kendi laboratuvarınızın prosedür kılavuzu tarafından önerilen şekilde toplanmalıdır. 2. Örneklerin Saklanması ve Nakledilmesi Örnekler en fazla 6 saat süreyle C de saklanabilir/taşınabilir. Örnekler en fazla 3 gün süreyle 2 8 C de soğuk koşullarda saklanabilir. Örnekler en fazla 14 hafta süreyle -20 C veya altında saklanabilir. TEST PROSEDÜRÜ Sistem bileşenlerinin çalıştırılması ve bakımına ilişkin özel talimatlar için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzu na başvurun. A. Cihazın Hazırlanması: 1. Cihaz açılmalı ve test gerçekleştirilmeden önce cihazın ısınması beklenmelidir. a. Priming Isıtıcısının ısınması ve stabilizasyonu yaklaşık 90 dakika sürer. Priming Isıtıcısının Priming bileşeni için ayarlanan sıcaklık değeri 72,5 C dir. Priming Isıtıcısının Isıtma bileşeni için ayarlanan sıcaklık değeri 54 C dir. b. BD ProbeTec ET cihazı yazılım kontrolü altındadır ve ısınması yaklaşık olarak 30 dakika sürer. 2. Isıtıcı sıcaklıkları teste başlamadan önce kontrol edilmelidir. BD ProbeTec ET System Maintenance Log üzerindeki sıcaklıkları kaydedin. a. Priming Isıtıcısı Priming Isıtıcısının termometresi C yi göstermelidir. Isıtma İşlemi Isıtıcısının termometresi 53,5 54,5 C yi göstermelidir. 3. BD ProbeTec ET ekranında görüntülenen sıcaklığı kontrol edin. Sıcaklık okuması 47,5 55,0 C aralığında olmalıdır. BD ProbeTec ET System Maintenance Log üzerindeki sıcaklıkları kaydedin. B. Pipetör: BD ProbeTec ET Pipetör tuş takımı fonksiyonlarına ilişkin detaylı açıklamalar için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzu na başvurun. Ayrıca, BD ProbeTec ET Pipetör her kullanımdan sonra temizlenmelidir. BD ProbeTec ET Pipetörün doğru temizlenmesi ve bakımı hakkında yol göstermesi için Teknik Servis temsilcinize başvurun. BD ProbeTec ET LP Testinin gerçekleştirilmesi için aşağıdaki programlar gereklidir. Program 1 işlenen örneklerdeki sıvıyı LP Priming Microwellerine aktarır. Program 5 LP Priming Microwellerindeki sıvıyı LP Amplifikasyon İşlemi Microwellerine aktarır. Pipetörü şu şekilde programlayın: Program 1: 1. Pipetörü AÇIN. Pipetör bir kez bip sesi verir, ZERO (Sıfır) yanıp söner, Software Version # (Yazılım Sürüm No.) yanıp söner ve bir kez daha bip sesi verir. 2. Mavi Prog (Program) tuşuna basın. Program 1 i seçmek için 1 görüntülenene kadar Vol (Ses) tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 3. Programlama moduna girmek için Prog tuşuna basın ve tuşu basılı tutun. Prog (Program) tuşundan parmağınızı çekerken aynı zamanda pipetin ucuyla veya bir atacın ucuyla Special Function Key e (Özel Fonksiyon Tuşu) basın. 4. Fill e (Doldur) basın. 200 görüntülenene kadar yukarı okuna basın. Enter a (Giriş) basın. 5. Disp e (Dağıt) basın. 150 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 6. Programı kaydetmek ve çıkmak için Enter a (Giriş) bir kez daha basın. Programlamanın tamamlandığını belirten bir bip sesi duymanız gerekir. 7. Adımlar arasında ilerlemek için tetikleyiciye basarak programınızı doğrulayın. Her adımda, aspirasyon/ dağıtım hızını Vol (Hacim) tuşunu kullanarak ayarlayın. Her adımda Hız göstergesi görüntülenir. Hız göstergesini Fill (Doldur) ve Disp (Dağıt) adımları için 2 kare gösterecek şekilde ayarlamak üzere Vol (Ses) tuşunu kullanın. Program 5 1. Prog (Program) tuşuna basın. Program 5 i seçmek için 5 görüntülenene kadar Vol (Ses) tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 2. Programlama moduna girmek için Prog tuşuna basın ve tuşu basılı tutun. Prog (Program) tuşundan parmağınızı çekerken aynı zamanda pipetin ucuyla veya bir atacın ucuyla Special Function Key e (Özel Fonksiyon Tuşu) basın. 3. Fill e (Doldur) basın. 100 görüntülenene kadar yukarı okuna basın. Enter a (Giriş) basın. 4. Disp e (Dağıt) basın. 100 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 5. Mix e (Karıştır) basın. 50 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 6. Programı kaydetmek ve çıkmak için Enter a (Giriş) bir kez daha basın. Programlamanın tamamlandığını belirten bir bip sesi duymanız gerekir. 3

4 7. Adımlar arasında ilerlemek için tetikleyiciye basarak programınızı doğrulayın. Her adımda, aspirasyon/ dağıtım/karıştırma hızını Vol (Ses) tuşunu kullanarak ayarlayın. Her adımda Hız göstergesi görüntülenir. Hız göstergesini aspirasyon ve dağıtım fonksiyonları için 2 kare gösterecek şekilde ayarlamak üzere Vol (Ses) tuşunu kullanın. Karışım hızını 3 kare gösterecek şekilde ayarlamak için Vol (Ses) tuşuna basın. Programın Gözden Geçirilmesi Programlar prosedüre başlanmadan önce gözden geçirilmelidir. Programı gözden geçirmek için, pipetörü AÇIN. Mavi Prog (Program) tuşuna basın. Uygun program numarası (1 veya 5) görüntülenene kadar Vol (Ses) tuşuna basın. Enter (Giriş) tuşuna basın. Programda adım adım ilerlemek için pipetleme tetikleyicisini kullanın. Program 1: Bu program 200 µl çeker; LP microwelline 150 µl dağıtır. Pipetör ekranında aşağıdaki ifade görüntülenmelidir: Fill 200 µl SII (200 µl S II doldur) Dispense 150 µl SII (150 µl SII doldur) Program 5: Bu program 100 µl çeker; 100 µl dağıtır ve 50 µl yi üç kez karıştırır. Pipetör ekranında aşağıdaki ifade görüntülenmelidir: Fill 100 µl SII (100 µl SII doldur) Dispense 100 µl SII (100 µl SII dağıt) Mix 50 µl SIII (50 µl SIII karıştır) Zero (Sıfır yanıp söner) C. Plak Yerleşimi: Test türü, örnek tanıtıcısı, kontrol lotu numarası ve kit lotu numarası sisteme girildikten sonra BD ProbeTec ET cihazı, Plak Yerleşim Raporu oluşturur. Plak Yerleşim Raporu test edilecek her plak için örneklerin ve kontrollerin fiziki yerleşimini gösterir. Bu konumlandırma Priming Microwelli ve Amplifikasyon İşlemi Microwelli plaklarının her ikisi tarafından da kullanılır. LP testi için, Priming Microwelleri katı, gri renkteki microwell stripleridir. Amplifikasyon İşlemi Microwelleri gri çizgili microwell stripleridir. D: Alt Solunum Örneği İşleme: Prosedür Notları: Başlamadan önce önemli prosedür notları ve önlemler için QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook u gözden geçirin. Örnek işlemeye başlamadan önce bir su banyosunu distile su ile doldurun ve 70 C (± 5 C) sıcaklığa kadar ısıtın. Kapları ve tüpleri etiketlemek için alkole dayanıklı marker kullanın. Bütün sıvı aktarımları arasında pipet uçlarını değiştirin. Aerosol bariyer uçların kullanılması tavsiye edilir. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent in (CF/LP/MP) (BD ProbeTec ET Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı [CF/LP/MP]) oda sıcaklığına gelmesini bekleyin ve kullanmadan önce yavaşça ters çevirerek karıştırın. Gerekli BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) miktarını temiz bir kaba aktarın. İhtiyaç duyulan miktarı hesaplamak için her örnek için 0,4 ml kullanın ve pipetleme işlemini kolaylaştırmak için fazladan 1 2 ml ekleyin. Seyreltim Sıvısının kontaminasyonunu önlemek için: Kalan Seyreltim Sıvısını Şişeye Geri Koymayın. 1. QIAGEN reaktiflerini hazırlayın (bkz Preparation of Reagents (Reaktiflerin Hazırlanması) QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook). 2. Örneklerin oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin. 3. Test edilecek her örnek için bir 2 ml geçme kapaklı tüp etiketleyin. Aşağıdaki adımlar bir Biyolojik Güvenlik Kabininde (BSC) gerçekleştirilmelidir: 4. İyice karıştırmak için örneklere 5 15 sn puls vorteks uygulayın. 5. Örneğin 350 µl sini etiketli tüpe pipetleyin. NOT: Balgam örneklerinin doğru olarak pipetlenmesi zor olabilir. Bu durumda, tüpe uygun hacmin aktarılmasını sağlamak için tüpün yanındaki seviye çizgilerini kullanın. Alternatif olarak, rehber olması açısından 350 µl suyun dağıtıldığı bir tüp kullanın. 6. Örneklerin eklenmesinden sonra ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 7. Her örnek tüpüne 150 µl QIAGEN ASL buffer (QIAGEN ASL tamponu) pipetleyin. 8. Her örnek tüpüne 25 µl QIAGEN Proteinase K (QIAGEN Proteinaz K) pipetleyin. 9. Her örnek tüpüne 500 µl QIAGEN AL lysis buffer (QIAGEN AL lizis tamponu) pipetleyin. 10. Her bir tüpün kapağını tekrar takın ve 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. Tüpleri vidalı kapaklı su banyosu yuvasına yerleştirin. Aşağıdaki adımlar Biyolojik Güvenlik Kabini (BSC) dışında gerçekleştirilebilir: 11. Tüpleri 70 C (± 5 C) su banyosunda 15 dakika inkübe edin dakika sonra, tüpleri su banyosundan çıkarın ve yaklaşık 5 saniye santrifüj ( x g) edin. 13. Tüpleri santrifüjden çıkarın. Her tüpü açın ve 500 µl % etanol ekleyin. 14. Her bir tüpün kapağını tekrar takın ve 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. 15. Örnekleri yaklaşık 5 saniye santrifüj edin ( x g). 16. Her örnek için bir QIAGEN döndürme kolonu ve toplama tüpü etiketleyin. 17. Örnekten 700 µl yi uygun şekilde etiketlenen QIAGEN döndürme kolonuna aktarın. 18. Tüpleri 1 dakika santrifüj edin ( x g). 4

5 19. Kolonları yeni QIAamp toplama tüplerine aktarın. Filtrat içeren tüpleri atın. 20. Uygun kolona dikkatlice 700 µl daha örnek aktarın. 21. Tüpleri 1 dakika santrifüj edin ( x g). 22. Kolonları temiz QIAamp toplama tüplerine aktarın. Filtrat içeren tüpleri atın. 23. QIAamp kolonlarını açın ve her birine 500 µl QIAGEN AW1 yıkama tamponu ekleyin. 24. Tüpleri 1 dakika santrifüj edin ( x g). 25. Kolonları yeni QIAamp toplama tüplerine aktarın. Filtrat içeren tüpleri atın. 26. QIAamp kolonlarını açın ve her birine 500 µl QIAGEN AW2 yıkama tamponu ekleyin. 27. Tüpleri 3 dakika santrifüj edin ( x g). 28. Kolonları son olarak etiketlenen QIAamp toplama tüplerine aktarın. Filtrat içeren tüpleri atın. NOT: Toplama tüpü bu noktada etiketlenmelidir. NOT: Kolonun tabanına yapışmış sıvı kalmamasını sağlayın. Sıvı kalıntısının toplama tüpüne aktarılması sonuçları etkileyebilir. 29. Kolonları açın ve her birine 225 µl QIAGEN AE elüsyon tamponu ekleyin. 30. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. 31. Tüpleri 1 dakika santrifüj edin ( x g). 32. Kolonları atın. 33. Her örnek için bir 2 ml vida kapaklı tüp etiketleyin. 34. Her vida kapaklı tüpe 400 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı (CF/LP/MP) aktarın. NOT: Adım 38 de kullanmak üzere bir su banyosunu distile su ile doldurun ve kaynatın. 35. Eluatın 200 µl sini 400 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı (CF/LP/MP) içeren uygun şekilde etiketlenmiş tüpe aktarın. 36. Tüpün kapağını takın ve 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. 37. Kontrolleri hazırlayın. Alt Solunum Kontrolü Hazırlığına Bakın (Bölüm E). 38. Örnekleri ve kontrolleri su banyosu yuvasına aktarın. 39. Banyo yuvasını kaynar su banyosunda 5 dakika bekletin dakika sonra su banyosu yuvasını çıkarın ve tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika soğumaya bırakın. UYARI: Kaynar suyla yanmamak için dikkat edin, su banyosu yuvası veya su banyosu yüzeyleri sıcak olabilir. 41. Soğuttuktan sonra, yaklaşık 5 sn santrifüjleyin ( x g). NOT: Örnekleri kaynattıktan sonra: a C de 6 saate kadar saklanabilir ve tekrar kaynatılmadan test edilebilirler. b. 2 8 C de 3 güne kadar saklanabilirler. Örnekler testten önce vortekslenmeli ve tekrar kaynatılmalıdır. c. -20 C de 14 güne kadar saklanabilirler. Örnekler testten önce oda sıcaklığında çözülmeli, vortekslenmeli ve tekrar kaynatılmalıdır. 42. Örnekler BD ProbeTec ET LP Test Çalıştırması Prosedürü için hazırdır (Bölüm F). E. Alt Solunum Kontrolü Hazırlığı: 1. Her test çalışması (test edilecek plak) için, bir Negatif Kontrol (CF/LP/MP) Tüpü ve bir Pozitif Kontrol (CF/LP/MP) Tüpü hazırlayın. Bir plak birden fazla Reaktif Paketi lot numarası içeriyorsa, kontroller her lot için test edilmelidir. 2. Kullanımdan önce QIAGEN tampon AE ile Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısını hafifçe ters çevirerek karıştırın. 3. Negatif Kontrol (CF/LP/MP) tüpünün kapağını çıkarın. 4. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 200 µl QIAGEN tampon AE ekleyin. 5. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 400 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ekleyin. 6. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 7. Pozitif Kontrol (CF/LP/MP) tüpünün kapağını çıkarın. 8. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 200 µl QIAGEN tampon AE ekleyin. 9. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 400 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ekleyin. 10. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 11. Kontrol tüplerini 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. 12. Kontroller kaynatılmaya hazırdır. Alt Solunum Örnek İşlemine Bakın (Bölüm D). F. BD ProbeTec ET LP Test Çalıştırması Prosedürü: NOT: Test prosedürünü gerçekleştirmeden önce, işlenmiş örnekleri ve işlenmiş kontrolleri, BD ProbeTec ET Pipetör ile uyumlu olan BD ProbeTec ET 2 ml lik Örnek Tüp Sporunda 2 ml örnek tüpü kapasiteli bir spora yerleştirin. 1. Soğutulmuş örnekler ve kontrollerden kapakları çıkarın ve atın. 2. Kontaminasyonu önlemek için devam etmeden önce ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 3. Plak Yerleşim Raporunu kullanarak, Priming Microwell plağını hazırlayın bkz Plak Yerleşimi (Bölüm C). 4. Microwell torbalarını aşağıdaki şekilde tekrar kapatın: a. Torbayı düz bir yüzeye koyun. Açık ucu bir elinizle düz şekilde tutun. b. Basınç uygulayarak parmağınızı kilidin dışından torbanın bir ucundan diğer ucuna doğru kaydırın. c. Torbayı kapalı olduğundan emin olmak için kontrol edin. 5

6 5. BD ProbeTec ET Pipetörde Program 1 i seçin. 6. Pipet uçlarını takın. Boşluk topuzunu tamamen dışarı çekerek BD ProbeTec ET Pipetörünü genişletin. NOT: Sızıntıyı önlemek için pipetör uçlarının tamamen yerleştiğinden emin olun örnek sütunundan 200 µl çekin. 8. Pipetörü yavaşça çekin, pipet uçlarıyla kuyucukların kenarlarına dokunun ve Priming Microwellerindeki ilgili sütuna (1 A H) 150 µl dağıtın. NOT: Kontaminasyona neden olacağından pipetörü örneklerin veya microwellerin üzerinde çekmeyin. Ani hareketler damlama ve aerosollere neden olabilir. 9. Uçları atın. Pipetleme tetiğini bırakarak pipetörü sıfırlayın. NOT: Çalışma alanını kontamine edebileceğinden uçları atarken damlama ve aerosol olmamasına özen gösterin. 10. Yeni uç takın, pipetörü genişletin ve 2. örnek sütunundan 200 µl çekin. 11. Pipetörü yavaşça çekin, pipet uçlarıyla kuyucukların kenarlarına dokunun ve Priming Microwellerindeki ilgili sütuna (2 A H) 150 µl dağıtın. 12. Uçları atın. 13. Çalışma için kalan örnekleri aktararak devam edin. 14. Primer Microwell plağını Primer Kapağıyla kapatın ve plağı oda sıcaklığında en az 20 dakika inkübasyona bırakın. (6 saat sürebilir.) NOT: İşlenilen örnekleri yeni kapaklar kullanarak kapatın. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 15. Priming işlemi inkübasyonu sonrasında Amplifikasyon İşlemi Microwell plağını hazırlayın. Amplifikasyon İşlemi Microwellerini bir plakta Plak Yerleşim Raporuna uygun şekilde konfigüre edin (priming plağıyla aynı şekilde). Microwell torbalarını adım 4 te açıklanan şekilde tekrar kapatın. 16. Priming Microwell plağının kapağını çıkarın ve plağı Priming Isıtıcısına aktarın. Amplifikasyon İşlemi Microwell plağını ön ısıtma işlemi için DERHAL Isıtma İşlemi Isıtıcısına yerleştirin. 17. Zamanlayıcıyı 10 dakikaya ayarlayın. (NOT: Bu adım zaman açısından kritiktir.) dakikalık (± 1 dakika) inkübasyon sonrasında pipetörde Program 5 i seçin. 19. Pipet uçlarını takın ve Priming Microwell plağının 1. sütunundan 100 µl çekerek Amplifikasyon İşlemi Microwelli plağının 1. sütununa aktarın. Pipet uçlarının kuyucukların kenarlarına değmesini sağlayın ve sıvıyı dağıtın. Dağıtma işleminden sonra pipetörün kuyucuklardaki sıvıyı otomatik olarak karıştırmasını sağlayın. Pipetörü plaktan dikkatle uzaklaştırın. Diğer kuyucuklara dokunmaktan kaçının. 20. Uçları atın. Yeni uç takın ve Priming Microwellindeki reaksiyon karışımını Amplifikasyon İşlemi Microwellerine sütun sütun aktarmaya, her sütun için yeni uçlar kullanarak devam edin. 21. Son sütun da aktarıldığında, bir Yapışkanlı kapağın desteğini çıkarın (Yapışkanlı Kapak Desteği [1/2] 6 kolon kapsayabilir. Plak 6 sütunu aşarsa bir TAM yapışkanlı kapak kullanılmalıdır.) Yapışkanlı kapağın kenarlarından tutun ve microwellerin üzerine uygulayın. Yapışkanlı kapağın uygulanmasıyla ilgili olarak Isıtma İşlemi Isıtıcısı yönergelerine bakın. Tüm microwellerin tamamen kapatılmasını sağlamak için yapışkanlı kapağı aşağı doğru bastırın. 22. BD ProbeTec ET kullanıcı arayüzünde taşıyıcıyı dışarı çıkarın, kapıları açın ve plak kapağını kaldırın. Kapatılan Amplifikasyon İşlemi Microwelli plağını DERHAL (30 sn içinde) BD ProbeTec ET Cihazına aktarın ve çalışmayı başlatın. (Detaylı bilgi için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzuna başvurun.) 23. Çalışmayı başlattıktan sonra, aşağıdaki temizlik prosedürüyle devam edin: a. Priming Microwellerini Yapışkanlı Kapakla kapatın ve plağı Priming Isıtıcısından çıkarın. UYARI: Sıcaklık 70 C den yüksektir. Plağı çıkarmak için ısıya dayanıklı eldiven kullanın. b. Plağı tezgah üzerinde 5 dakika soğumaya bırakın. c. Kapatılmış Priming Microwellerini yapışkanlı kapağın iki yanından tutarak ve kuyucukları bir birim olarak yukarı doğru kaldırarak plaktan çıkarın. Kapatılmış microwelleri bir atık çantasına koyun ve kapatın. d. Metal plağı temizleyin: Plağı %1 (h/h) sodyum hipoklorit - Alconox çözeltisiyle temizleyin. Plağı suyla durulayın. Plağı temiz bir kağıt havluya sarın ve tekrar kullanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. 24. Çalışma tamamlandığında, sonuçların bir çıktısı alınır. 25. Plak taşıyıcısını yuvadan çıkarın, kapıyı açın ve plağı çıkarın. Kapağı kapatın ve plak yuvasını tekrar cihazın içine yerleştirin. 26. Kapatılmış Amplifikasyon İşlemi Microwellerini plaktan çıkarın. DİKKAT: Yapışkanlı kapakları microwellerden çıkarmayın. Kapatılmış microweller, yapışkanlı kapağın üst ve altından tutularak ve plağın dışına, yukarı doğru kaldırılarak bir birim olarak kolayca çıkarılabilir. Kapatılmış microwelleri atık çantasına yerleştirin. Çantayı kapatın. 27. Metal plağı temizleyin: Plağı %1 (h/h) sodyum hipoklorit Alconox çözeltisiyle temizleyin. Plağı suyla durulayın. Plağı temiz bir kağıt havluya sarın ve tekrar kullanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. 28. Günün son çalıştırma işleminden sonra, aşağıdaki temizleme prosedürlerini uygulayın: a. Kağıt havlu veya gazlı bezleri %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle ıslatın ve tezgahlara ve Priming Isıtıcısı, 2 ml örnek tüp sporu, su banyoları, santrifüj ve BD ProbeTec ET Cihazının dış yüzeylerine uygulayın. Çözeltinin 2 3 dakika boyunca bu yüzeylerde kalmasını sağlayın. Kağıt havlu ve gazlı bezleri suyla ıslatın ve temizleme çözeltilerini temizleyin. Temizleme çözeltilerini uygularken ve suyla durularken havlu ve gazlı bezleri sık sık değiştirin. Kağıt havlu veya gazlı bezleri %1 (h/h) sodyum 6

7 hipoklorit ve Alconox ile ıslatın ve Pipetör tutacağını silin (SADECE TUTACAĞI SİLİN). 2 3 dakika sonra tutacağı suyla ıslatılmış kağıt havlu veya gazlı bez kullanarak silin. b. Su banyosu yuvasını 1 2 dakika boyunca %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox a batırın. Su ile iyice çalkalayın ve hava ile kurumaya bırakın. c. Pipetörü tekrar şarj edin. d. Kapalı atık çantasını ve biyolojik tehlike atığını kontamine atık malzemelere ilişkin prosedürlere uygun şekilde atın. 29. Aşağıdaki prosedürleri en azından haftalık olarak gerçekleştirin. a. Su banyolarındaki suyu atın. b. Su banyolarını %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle temizleyin. Su ile çalkalayın ve kurumaya bırakın. c. Distile su ile tekrar doldurun. Kalite Kontrolü Gerekli kalite kontroller ilgili yerel, devlet ve/veya federal düzenlemeler veya akreditasyon gerekliliklerine veya laboratuvarınızın standart Kalite Kontrol prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kullanıcının, uygun Kalite Kontrol uygulamaları için ilgili CLSI (eski adı NCCLS) yönergelerine ve CLIA düzenlemelerine uyması önerilir. Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontroller, Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kitinde (CF/LP/MP) birlikte sağlanmaktadır. Plaka üzerinde her test çalışmasında ve her yeni reaktif lotu numarası için bir pozitif ve bir negatif kontrol bulunmalıdır. Kontroller tesadüfi olarak konumlandırılabilir. Pozitif kontrol önemli reaktif hatalarını izlemek içindir. Negatif kontrol reaktif ve/veya ortam kontaminasyonunu izlemek içindir. Pozitif ve negatif kontrol, örnek sonuçlarının raporlanması için sırasıyla pozitif ve negatif olarak test edilmelidir. Kontroller beklenen performansı göstermezse, test çalıştırması geçersiz sayılır ve cihaz hasta sonuçlarını raporlamaz. Çalışma Kontrolleri beklenen sonuçları vermezse, yeni bir kontrol seti, yeni microweller ve işlenen örnekleri kullanarak tüm çalışmayı tekrarlayın. Yeniden test etme için yeterli olmayan miktarda işlenmiş örnek kalırsa, birincil örneğin başka bir kısmını yeniden işleyin. Tekrarlanan kontroller beklenen sonuçları vermezse Teknik Servis le temas kurun (bkz. Test Sonuçlarının Yorumlanması ). Priming Microwellerinin içine bir Dahili Amplifikasyon Kontrolü (IAC) yerleştirilmiştir. IAC, örnek matriksinin varlığında amplifiye olan nükleik asit hedefi içerir. IAC nin tasarlanma amacı, amplifikasyon reaksiyonun doğruluğunu onaylamak ve işlenen örnekteki potansiyel inhibisyonun tespit edilmesini sağlamaktır. Örnek İşlem Kontrolleri Örnek işlem kontrolleri ilgili akreditasyon kurumlarının gerekliliklerine uygun şekilde test edilebilir. Bir pozitif kontrolle tüm test sistemi test edilmelidir. Bu amaçla, bilinen pozitif örnekler, bilinmeyen örneklerle birlikte işlenip test edilerek kontrol olarak kullanılabilir. İşlem kontrolleri olarak kullanılan örnekler prospektüse göre saklanmalı, işlenmeli ve test edilmelidir. Alt solunum örneklerini simüle eden örnek işleme kontrolleri, aşağıda tanımlanan şekilde de hazırlanabilir: C veya altındaki depodan bir flakon dondurularak kurutulmuş L. pneumophila ATCC (Philadelphia-1) çıkarın. 2. %0,2 (a/h) Bovin Albümin (Fraksiyon V) içeren 1 ml %0,85 (a/h) tuz çözeltisi ile sulandırın. 3. %0,2 (a/h) Bovin Albümin (Fraksiyon V) içeren 1 ml %0,85 (a/h) tuz çözeltisindeki L. pneumophila stokunu 1: e seyreltin µl seyreltilmiş L. pneumophila yı geçme kapaklı tüpe pipetleyin. 5. Alt Solunum Örnek İşlemi nde (Bölüm D) tanımlandığı gibi işleyin. DNA Kontaminasyonu Varlığının İzlenmesi Çalışma alanının ve ekipman yüzeylerinin DNA kontaminasyonu varlığı açısından izlenmesi için aşağıdaki test prosedürleri en az ayda bir kez gerçekleştirilmelidir. Kontaminasyonun bir sorun oluşmadan önce tespit edilebilmesi için ortamın izlenmesi önemlidir. 1. Test edilecek her alan* için bir BBL CultureSwab EZ swabı kullanın. 2. Test edilecek her alan için bir 2 ml vida kapaklı tüp etiketleyin. Her tüpe 600 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı pipetleyin ve 300 µl QIAGEN tampon AE veya moleküler ölçekli distile su ekleyin. Karıştırmak için 5 saniye vorteksleyin. 3. Adım 2 de hazırlanan ilk swabı Seyreltim Sıvısına batırın ve ilk alanı geniş bir süpürme hareketiyle silin. 4. Swabı Seyreltim Sıvısıyla karıştırın, tüpün yanlarına doğru akıtın. Tüpün kapağını tekrar takın ve 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. Swabı atın. 5. Test edilecek her alan için prosedürü tekrarlayın. 6. Tüpleri su banyosu yuvasına yerleştirin ve kaynar suda 5 dakika ısıtın. Yuvayı kaynar sudan çıkarın ve devam etmeden önce örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika soğumaya bırakın. 7. Soğuttuktan sonra, yaklaşık 5 sn santrifüjleyin ( x g). 8. Tüpler ısıtılırken, test edilen yüzeylerdeki tampon karışımı kalıntısını ortadan kaldırmak için suyla ıslatılmış temiz havlular kullanın. 9. Örnekler soğuduktan sonra, BD ProbeTec ET LP Test Çalıştırması Prosedürü ile devam edin (Bölüm F). * Test edilmesi önerilen alanlar şunlardır: Su banyosu yuvası, mikrosantrifüj, Priming Isıtıcısı, siyah microwell plağı, pipetör tutacağı, cihaz dokunmaya duyarlı tuşları, cihazın klavyesi, su banyolarının kuru yüzeyleri, örnek sporlarının yüzeyleri ve çalışılan tezgahların yüzeyleri ile örnek işlem alanlarıdır. Bir alan pozitif sonuç verirse, bu alanı %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisi ile temizleyin. Tüm alanın temizlik çözeltisiyle ıslatıldığından emin olun ve temizlik çözeltisinin yüzey üzerinde en az 2 dakika boyunca veya kuruyana kadar kalmasına izin verin. Gerektiğinde temizleme çözeltisinin fazlasını temiz bir havluyla alın. Alanı 7

8 suyla ıslatılmış temiz bir havluyla silin ve yüzeyi kurumaya bırakın. Alanı tekrar test edin. Negatif sonuç alana kadar bu işlemi tekrarlayın. Kontaminasyon sorunu çözülemezse, daha fazla bilgi için Teknik Servis i arayın. TEST SONUÇLARININ YORUMLANMASI L. pneumophila DNA varlığı veya yokluğu, örneğe ait PAT (Eşikten Sonra Geçişler) sonuçlarının önceden belirlenen eşik değeri ile ilişkilendirilmesiyle belirlenir. PAT sonucu reaksiyonun sonucu olarak üretilen sinyalin büyüklüğünün belirlenmesi için kullanılan bir ölçüttür. Bu ölçüm için, daha büyük sayılar eşiğe amplifikasyonun erken fazında ulaşıldığı gösterirken, daha küçük sayılar eşiğe daha sonra, reaksiyon sırasında ulaşıldığı anlamına gelir. PAT sonucunun büyüklüğü örnekte bulunan L. pneumophila DNA miktarını göstermez. Test kontrollerinin sonuçları beklenenden farklıysa, hasta sonuçları raporlanmamalıdır. Beklenen kontrol değerleri için Kalite Kontrol bölümüne bakın. Raporlanan sonuçlar aşağıdaki şekilde belirlenir: PAT Sonucu LP Hedefi IAC Hedefi Sonuç Yorum Rapor > 0 > 0 veya = 0 Pozitif SDA ile saptanan L. pneumophila serogrup 1 14 e ait organizmalar L. pneumophila DNA. için mevcut enfeksiyonu gösterecek şekilde pozitif. Epidemiyolojik amaçlarla gerektiğinde serogrubu belirlemek için ihtiyaç duyulan ilave test. = 0 > 0 Negatif SDA ile saptanmayan L. pneumophila serogrup 1 14 için yakın zaman L. pneumophila DNA. önce enfeksiyon olmadığını gösterecek şekilde tahmini negatif. Legionella kaynaklı enfeksiyon yok sayılamaz çünkü: 1) 1 14 ten başka serogruplar veya diğer Legionella türleri hastalığa sebep olabilir ve 2) mevcut DNA miktarı testin saptama sınırının altında olabilir. = 0 = 0 Belirlenemeyen Amplifikasyon kontrolü inhibe edilmiştir. Sonucun yorumlanması için ilave test gereklidir. a a İşlenmiş örnek tüpünden tekrar BD ProbeTec ET LP Testi. İşlenen örnekten yeterli hacim kalmaması durumunda orijinal örnekten tekrarlayın. Tekrar sonucu pozitif veya negatifse, yukarıda açıklanan şekilde yorumlayın. Sonuç belirlenemiyorsa yeni bir örnek alınmalıdır. LP ve IAC Eşiğinin Belirlenmesi: L. pneumophila hedef DNA sı için eşik değerleri ve IAC, başlangıçta pozitif ve negatif kontrollerden elde edilen verilerin Algılayıcı İşletim Özelliği eğri analiziyle belirlenmiştir. Bu eşik değerleri klinik çalışmalarda ve retrospektif L. pneumophila-pozitif ve negatif alt solunum örnekleri ile doğrulanmıştır. Eşik değerleri ilave klinik çalışmalar ile doğrulanmıştır. PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR 1. BD ProbeTec ET LP Testi yalnızca L. pneumophila serogrup1 14 için spesifiktir. Diğer L. pneumophila serogrupları test edilmemiştir. 2. BD ProbeTec ET LP Testi diğer Legionella türlerinin sebep olduğu enfeksiyonları saptamaz. 3. BD ProbeTec ET LP Testi için performans özellikleri yalnızca balgam örnekleri ile tesis edilmiştir. Diğer örnek türleriyle performansı belirlenmemiştir. 4. BD ProbeTec ET LP Testi yalnızca 13 yaş ve üzeri hastalarda değerlendirilmiştir. 5. Birçok tanı amaçlı testte olduğu gibi, BD ProbeTec ET LP Testinden gelen sonuçlar da doktorun kullanabileceği diğer laboratuvar verileri ve klinik verilerle ilişkili olarak yorumlanmalıdır. 6. Negatif bir test sonucu enfeksiyonun var olmadığını göstermeyebilir; çünkü test sonuçları örneğin uygun olmayan şekilde alınmasından, teknik hatalardan, örneğin karıştırılmasından, eşzamanlı antibiyotik tedavisinden veya örnekte mevcut olan L. pneumophila DNA miktarının testin analitik duyarlılık sınırının altında olmasından etkilenebilir. 7. L. pneumophila den gelen nükleik asitler antimikrobiyal tedavi sonrasında da ortamda kalabileceğinden, tedavinin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için BD ProbeTec ET LP Testi kullanılamaz. 8. BD ProbeTec ET LP Testi çevre örnekleri ile değerlendirilmemiştir (örn., kullanma suyu veya su kalite testi). 9. Testin optimum performans göstermesi için örneğin doğru şekilde toplanması ve işlenmesi gerekir. 10. BD ProbeTec ET LP Testi, yalnızca test prosedürü ve BD ProbeTec ET Sistemi hakkında eğitim almış personel tarafından kullanılmalıdır. 11. BD ProbeTec ET LP Testi kalitatif sonuçlar sunar. PAT sonucunun büyüklüğüyle örnekte bulunan L. pneumophila DNA miktarı arasında herhangi bir ilişki kurulamaz. BEKLENEN SONUÇLAR A. Görülme Sıklığı L. pneumophila testinde gözlenen pozitiflik oranı, kullanılan test yöntemi, hastanın yaşı, altta yatan risk faktörlerinin varlığı, coğrafi bölge ve en önemlisi olası salgın durumlarını da kapsayan yerel hastalık görülme sıklığına bağlı olarak değişkenlik gösterecektir. B. PAT Sonucu Frekans Dağılımı ABD, Avrupa ve Kanada da dört klinik tesisten toplam 83 retrospektif balgam örneği toplanmış ve BD ProbeTec ET LP Testi ile test edilmiştir. Kültür ile karşılaştırılan LP PAT Sonuçlarının frekans dağılımı Şekil 1 de gösterilmiştir. 8

9 Şekil 1: Kültür ile Karşılaştırılan LP PAT Sonucu Frekans Dağılımı Kültür Sonucu Toplam Negatif Pozitif Toplam C. Kontroller Klinik değerlendirme sırasında, BD ProbeTec ET LP Testi için 46 çalışmadan birinde kontrol hatası gözlenmiştir (yani, bir çalışmada prosedür hatası olmuştur). Geri kalan 45 çalışma için LP PAT sonuçları Tablo 1 de özetlenmiştir Tablo 1: Solunum ve Ortam Kontrolleri için LP PAT Sonucu Dağılımı Kontrol N. Aralık 5. Persentil Ortalama Medyan 95. Persentil LP Negatif LP Pozitif 45 29,4 50,7 40,1 46,7 47,6 49,7 Performans Özellikleri Prospektif Çalışma BD ProbeTec ET LP Testi solunum dönemi sırasında Amerika Birleşik Devletleri ve Kanada da yedi klinik merkezde prospektif olarak değerlendirilmiştir. Her hastadan bir balgam ve bir idrar örneği toplanmıştır. BD ProbeTec ET LP Testi, Legionella kültürü ve Direkt Floresan Antikor testi (DFA) kullanılarak balgam örnekleri test edilmiştir. İdrar örnekleri piyasada mevcut L. pneumophila idrar antijen testi kullanılarak test edilmiştir. Toplam 118 hasta çalışmaya dahil olmak için gerekli kriterlere uygundur (yani, radyografik pnömoni kanıtı, hasta yaşı 13, antibiyotik kullanımı 14 gün, geçerli örnek tipinin toplanması, uygun referans yöntemlerinin yürütülmesi, vb.). 118 hastadan 114 ünün BD ProbeTec ET LP Test sonucu geçerlidir. Balgam örneklerinin sonuçları performans özelliklerini hesaplamak için balgam kültürü ile karşılaştırılmıştır. Kültür test sonucu pozitif ise örnek pozitif olarak kabul edilmiştir. Kültür test sonucu negatif ise bir sonuç negatif olarak kabul edilmiştir. Başlangıçta belirsiz bütün sonuçlar işlenen örnekten veya orijinal örnekten (yeterli işlenmiş örnek olmaması durumunda) tekrarlanmıştır. Başlangıçta ve tekrarda (yani, son olarak) belirsiz sonuç veren örnek performans özelliklerine dahil edilmemiştir. Başlangıçta belirsiz sonuç veren ve pozitif veya negatif olarak tekrarlanan örnek performans özelliklerine dahil edilmiştir. Başlangıçta belirsiz sonuç veren ve yeterli miktarda örnek kalmaması sebebiyle tekrarlanamayan örnek başlangıçta belirsiz sonuç olarak kalmış ve performans özelliklerine dahil edilmemiştir

10 Balgam örnekleri için kültür ile karşılaştırılan BD ProbeTec ET LP Testi sonuçları Tablo 2 de özetlenmiştir. Tablo 2: BD ProbeTec ET LP Testi Kültür ile Karşılaştırılan Prospektif Balgam Sonuçları Bölge Duyarlılık (%95 CI) 1 GD 2 GD 3 GD 6 GD 7 GD Genel GD Kültür e karşı Özgüllük (%95 CI) %100 (17/17) (%80,5 %100) %100 (2/2) (%15,8 %100) %100 (31/31) (%88,8 %100) %100 (33/33) (%89,4 %100) %100 (31/31) (%88,8 %100) %100 (114/114) a (%96,8 %100) 10 Belirlenemeyen Başlangıç/Son a 114 kültür negatif örneğin hepsi Direkt Floresan Antikor (DFA) negatiftir. 114 hastanın seksen yedisi aynı zamanda idrar antijen testi ile test edilmiş ve negatif bulunmuştur. b Bir örnek negatif olarak tekrarlanmış ve özgüllük hesaplamasına dahil edilmiştir. Bir örnek tekrar testi için yetersiz hacme sahiptir. c Tekrar testinde iki örnek belirsiz olarak kalmıştır. Bir örnek tekrar testi için yetersiz hacme sahiptir. GD = Geçerli Değildir Retrospektif Çalışma BD ProbeTec ET LP Testi ile aynı zamanda ABD, Avrupa ve Kanada da klinik tesislerden alınan 83 retrospektif balgam örneği de değerlendirilmiştir. Retrospektif örnekler altı yıla kadar dondurularak saklanmış, örneklerin çoğu (%65,1; 54/83) üç yıldan kısa süre saklanmıştır. Her tesis her retrospektif çalışma için orijinal kültür sonucunu kaydetmiştir. Her tesis BD ProbeTec ET LP Testinde balgam örneklerini test etmiş ve sonuçları kültür sonucu ile karşılaştırmıştır. Kültür test sonucu pozitif ise bir örnek pozitif olarak kabul edilmiştir. Kültür test sonucu negatif ise bir örnek negatif olarak kabul edilmiştir. Retrospektif balgam örnekleri için kültür ile karşılaştırılan BD ProbeTec ET LP Testi sonuçları Tablo 3 de özetlenmiştir. Tablo 3: BD ProbeTec ET LP Testi Kültür ile Karşılaştırılan Retrospektif Balgam Sonuçları Kültür Yüzde Benzerlik Hesapları (%95 CI) Bölge LP Sonucu Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Genel 6 Pozitif Negatif Toplam %100 (1/1) %100 (1/1) GD (%2,5 %100) (%2,5 %100) 8 Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Genel Pozitif 21 8 a 29 Negatif 2 b Toplam 23 c %94,1 (16/17) (%71,3% %99,9) %100 (1/1) (%2,5 %100) %75 (3/4) (%19,4 %99,4) %91,3 (21/23) (%72 %98,9) 0/0 0/0 0/0 2/0 b 3/2 c 5/2 %82,8 (24/29) (%64,2 %94,2) %88 (22/25) (%68,8 %97,5) %100 (6/6) (%54,1 %100) %86,7 (52/60) (%75,4 %94,1%) %87 (40/60) (%73,7 %95,1) %88,5 (23/26) (%69,8 %97,6) %90 (9/10) (%55,5 %99,7) %88 (73/83) (%79 %94,1) a Sekiz örnek kültür negatif, BD ProbeTec ET LP Testi pozitiftir. İdrar antijen testi ile sekiz örneğin hepsi pozitiftir. Sekiz örneğin altısında PCR testi gerçekleştirilmiş ve altı örneğin hepsi PCR ile pozitif sonuç vermiştir. b İki örnek kültür pozitif, BD ProbeTec ET LP Testi negatiftir. İdrar antijen testi ile her iki örnek negatiftir. Her iki örnek üzerinde de PCR testi gerçekleştirilmiştir; PCR ile bir örnek pozitif sonuç vermiştir. c 23 kültür pozitif örnek aşağıdaki serogruplar arasına dağılım göstermiştir: %47,8 (11/23) Serogrup 1; %17,4 (4/23) Serogrup 3; %13,0 (3/23) Serogrup 4; %4,3 (1/23) Serogrup 5; %4,3 (1/23) Serogrup 6 ve %13 (3/23) Serogrup bilgileri mevcut değil. GD = Geçerli Değildir NOT: Tutarsız kültür ve BD ProbeTec ET LP Testi sonuçlarını test etmek için kullanılan PCR yöntemi FDA tarafından tanınan bir yöntem değildir.

11 Analitik Çalışmalar BD ProbeTec ET LP Testi amplifikasyon reaksiyonu hacmi, 100 µl işlenmiş örnektir. Analitik Duyarlılık 14 farklı L. pneumophila serogrubu için BD ProbeTec ET LP Testinin analitik duyarlılığı, bakteriyel süspansiyonlarının reaksiyon başına 0, 150, 300 ve 450 koloni oluşturma birimi (CFU) seviyesine seyreltilmesiyle belirlenmiştir. Örnekler üçlü tekrarlar halinde işlenmiş ve test edilmiştir. %100 pozitiflik temel alınarak, serogrup 2 10 ve 12 için analitik duyarlılık 150 CFU/reaksiyon olarak tespit edilmiştir; bununla birlikte gerçek Tespit Sınırı (LOD) test edilen en düşük seviyenin altında olabilir. %100 pozitiflik temel alınarak, serogrup 1 ve 11 için analitik duyarlılık 300 CFU/reaksiyon; serogrup 13 için 450 CFU/reaksiyon ve serogrup 14 için 700% CFU/reaksiyon olarak tespit edilmiştir. Alt solunum örnek matriksi bulunması durumunda BD ProbeTec ET LP Testinin analitik duyarlılığı balgam içerisinde makrofaj-enfekte L. pneumophila serogrup 1 stokunu reaksiyon başına 0, 150, 300 ve 450 CFU seviyelerinde güçlendirerek belirlenmiştir. Örnekler üçlü tekrarlar halinde işlenmiş ve test edilmiştir. %100 pozitiflik temel alınarak, güçlendirilmiş alt solunum örnekleri için analitik duyarlılık 150 CFU/reaksiyon olarak belirlenmiştir; bununla birlikte gerçek LOD test edilen en düşük seviyenin altında olabilir. Analitik Özgünlük BD ProbeTec ET LP Testi kullanılarak toplam 79 mikroorganizma (69 bakteri, bir maya ve dokuz virüs) değerlendirilmiştir. Bakteriyel izolatlar 1 x 10 6 CFU/mL ila 1 x 10 8 CFU/mL aralığında değişen konsantrasyonlarda test edilmiştir. Virüsler 1 x 10 6 viral partikül/ml konsantrasyonda test edilmiştir. Coccidioides immitis, McFarland Standart 5 e eşdeğer miselyal süspansiyon olarak hazırlanmıştır. Test edilen mikroorganizmaların hiçbiri pozitif bir sonuç vermemiş veya IAC ı inhibe etmemiştir (Tablo 4). Tablo 4: BD ProbeTec ET LP Testi Analitik Özgünlük Acinetobacter calcoaceticus Actinomyces israelii Adenovirus-5 Aeromonas hydrophila Blastomyces dermatitidis Bordetella bronchiseptica Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella catarrhalis Candida albicans Chlamydia trachomatis, sero L2 Chlamydophila pneumoniae, AR-39 Citrobacter freundii Coccidioides immitis Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium jeikeium Cryptococcus neoformans Cytomegalovirus Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterovirus (Echovirus) Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Herpes simplex virus-1 Histoplasma capsulatum Influenza virus A Influenza virus B Kingella kingae Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae tip 4 Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae Lactobacillus acidophilus Legionella anisa Legionella bozemanii Legionella cherrii Legionella cincinnatiensis Legionella dumoffii Legionella erytha Legionella fairfieldensis Legionella feeleii Legionella gormanii Legionella hackeliae Legionella jordanis Legionella longbeachae Legionella maceachernii Legionella oakridgensis Legionella sainthelensi Legionella spiritensis Legionella worsleiensis Moraxella osloensis Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Neisseria mucosa Parainfluenza I virus Peptostreptococcus anaerobius Porphyromonas asaccharolytica Prevotella oralis Pseudomonas aeruginosa Respiratory Syncytial virus, Uzun suş Rhinovirus Salmonella choleraesuis serotip Enteritidis Salmonella choleraesuis serotip Typhi Serratia marcescens Staphylococcus aureus, protein A üreten Staphylococcus aureus, protein A üretmeyen Staphylococcus epidermidis Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus Grup B Streptococcus mutans Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Tatlockia (Legionella) micdadei Veillonella parvula İnterferant Maddeler Alt solunum örneklerinde rastlanabilen potansiyel interferant maddeler hedef yokluğunda veya 750 CFU/ reaksiyon L. pneumophila varlığında BD ProbeTec ET LP Testi ile test edilmiştir. Hedef yokluğunda test edilen maddelerin hiçbiri Tablo 5 te listelenen konsantrasyonlarda pozitif sonuç vermemiştir veya IAC yi inhibe etmemiştir. Tablo 5 te listelenen konsantrasyonlarda maddelerin hedefi varlığında test edilen bütün örnekler pozitif sonuç vermiştir. 11

12 Tablo 5: BD ProbeTec ET LP Testi İnterferans için Taranan Maddeler Alt Solunum Örnekleri Test Edilen Maddeler Konsantrasyon Tam Kan (heparin) %2,65 Lidokain %2 %0,21 Balgam İndüksiyon Çözeltisi (%3 NaCl) %0,32 Azitromisin 0,42 µg/ml Penisilin G 17 µg/ml Tetrasiklin 2,3 µg/ml Doksisiklin 26,5 µg/ml Siprofloksasin 4,88 µg/ml Mycoplasma pneumoniae 5 x 10 6 hücre/ml Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 10 7 EBs/mL Mycoplasma pneumoniae ve Chlamydophila pneumoniae sırasıyla, 1,06 x 10 7 hücre/ml ve 1,06 x 10 7 EBs/mL Tekrarlanabilirlik BD ProbeTec ET LP Testinin tekrarlanabilirliği üç laboratuvarda PBS/BSA ile güçlendirilen 24 örnek içeren bir panel test edilerek değerlendirilmiştir. Panel, L. pneumophila için negatif 12 örnek; üç düşük (300 CFU/ reaksiyon) ve üç yüksek (500 CFU/reaksiyon) pozitif L. pneumophila örneği; ve her biri Chlamydophila pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) ve Mycoplasma pneumoniae (MP) içeren üç düşük (sırasıyla, 30 Temel Yapı (EB)/reaksiyon, 300 CFU/reaksiyon, 900 hücre/reaksiyon) ve üç yüksek (sırasıyla, 50 EB/reaksiyon, 500 CFU/reaksiyon, hücre/ reaksiyon) pozitif örneği içermektedir. Her tesiste bir operatör, üç gün boyunca günde bir kez panelleri test etmiştir. Sonuçlar Tablo 6 da özetlenmiştir. Tablo 6: Örnek Seviyesinde Alt Solunum Tekrarlanabilirlik Hesapları Günler arasında Tesis içinde Tesisler Arasında Panel Üyesi N. % Doğru Ortalama PAT SS %VK SS %VK LP-YÜKSEK 27 %100,0 47,2 0,94 2,00 1,42 3,02 LP-DÜŞÜK 27 %100,0 44,8 0,44 0,98 2,06 4,59 CP/LP/MP-YÜKSEK 27 %100,0 46,2 1,13 2,45 1,79 3,88 CP/LP/MP-DÜŞÜK 26 a %100,0 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01 Negatif 108 %100,0 0,0 LP-negatif örnekler ile IAC 108 %100,0 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70 a Prosedür hatası nedeniyle bir örnek analizden çıkarılmıştır. TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ Aşağıdaki BD ProbeTec ET ürünleri mevcuttur: Kat. No. Açıklama BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit BD ProbeTec ET Accessories Kit (10 Priming Kapağı, 16 Yapışkanlı Kapak ½ ve 8 Atık Çantası) BD ProbeTec ET Pipette Tips 6 x BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tubes and Caps, 200 ea BD ProbeTec ET 2 ml Caps, BD ProbeTec ET Instrument, Ex ABD BD ProbeTec ET Instrument, ABD ve Kanada BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, 220V BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, 120V BD ProbeTec ET Pipettor BD ProbeTec ET Lysing Rack REFERANSLAR 1. Cloud J.L., Carroll K.C., Pixton P., Erall M., Hillyard D.R. (2000) Detection of Legionella species in respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation. J Clin Micro 38: Stout, J.E., Yu, V.L Legionellosis. N. Engl. J. Med. 337: Bartlett, J.G., Dowell, S.F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J Guidelines from the Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin.Infect. Dis. 31: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 5. Garner. J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 12

13 7. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Van der Zee, A., Peeters, M., de Jong, C., Verbakel, H., QIAGEN DNA extraction kits for sample preparation for Legionella PCR are not suitable for diagnostic purposes. J. Clin. Microbiol. 40 (3): Evans, G.E. et al Contamination of QIAGEN DNA extraction kits with Legionella DNA. J. Clin. Microbiol. 41 (7): Isenberg, H.D. (ed.) Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 13

14 Manufacturer / Výrobce / Producent / Fabrikant / Tootja / Valmistaja / Fabricant / Hersteller / ÊáôáóêåõáóôÞò / Gyártó / Ditta produttrice / Gamintojas / Producent / Fabricante / Výrobca / Tillverkare / Производител / Producãtor / Üretici Use by / Spotøebujte do / Anvendes før / Houdbaar tot / Kasutada enne / Viimeinkäyttöpäivä / A utiliser avant / Verwendbar bis / Çìåñïìçßá ëþîçò / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Naudokite iki / Brukes før / Stosowaæ do / Utilizar em / Použite do / Usar antes de / Använd före / Използвайте до / A se utiliza pânã la / Son kullanma tarihi YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec mìsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) / JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) VVVV-KK-PP / VVVV-KK (kuukauden loppuun mennessä) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) / JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) / ÅÅÅÅ-ÌÌ-ÇÇ / ÅÅÅÅ-ÌÌ (ÌÌ = ôýëïò ôïõ ìþvá) / ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) / MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mënesio pabaiga) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesi¹ca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) aaaa-mm-dd / aaaa-mm (mm = fin del mes) / ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet på månaden) / ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) / AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârºitul lunii) / YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) Catalog number / Katalogové èíslo / Katalognummer / Catalogusnummer / Kataloogi number / Tuotenumero / Numéro catalogue / Bestellnummer / Áñéèìüò êáôáëüãïõ / Katalógusszám / Numero di catalogo / Katalogo numeris / Numer katalogowy / Número do catálogo / Katalógové èíslo / Número de catálogo / Каталожен номер / Numãr de catalog / Katalog numarası Authorized Representative in the European Community / Autorizovaný zástupce pro Evropskou unii / Autoriseret repræsentant i EU / Erkend vertegenwoordiger in de Europese Unie / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Valtuutettu edustaja Euroopan yhteisössä / Représentant agréé pour la C.E.E. / Autorisierte EG-Vertretung / ÅîïõóéïäïôçìÝíïò áíôéðñüóùðïò óôçí ÅõñùðáúêÞ Êïéíüôçôá / Hivatalos képviselet az Európai Unióban / Rappresentante autorizzato nella Comunità europea / Ágaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo w Unii Europejskiej / Representante autorizado na União Europeia / Autorizovaný zástupca v Európskom spoloèenstve / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Auktoriserad representant i EU / Оторизиран представител в ЕU / Reprezentant autorizat în Uniunea Europeanã / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi Temperaturbegränsning In Vitro Diagnostic Medical Device / Lékaøské zaøízení urèené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medisch hulpmiddel voor in vitro diagnose / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Lääkinnällinen in vitro -diagnostiikkalaite / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro äéáãíùóôéêþ éáôñéêþ óõóêåõþ / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medico diagnostico in vitro. / In vitro diagnostikos prietaisas / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urz¹dzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Dispositivo médico de diagnóstico in vitro / Medicinsk anordning för in vitro-diagnostik / Медицински уред за диагностика ин витро / Aparaturã medicalã de diagnosticare in vitro / In Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz Temperature limitation / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperatuurlimiet / Temperatuuri piirang / Lämpötilarajoitus / Température limite / Zulässiger Temperaturenbereich / ¼ñéï èåñìïêñáóßáò / Hõmérsékleti határ / Temperatura limite / Laikymo temperatûra / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limitação da temperatura / Ohranièenie teploty / Limitación de temperatura / / Температурни ограничения / Limitare de temperaturã / Sıcaklık sınırlaması Consult Instructions for Use / Prostudujte pokyny k použití / Læs brugsanvisningen / Raadpleeg gebruiksaanwijzing / Lugeda kasutusjuhendit / Tarkista käyttöohjeista / Consulter la notice d emploi / Gebrauchsanweisung beachten / Óõìâïõëåõôåßôå ôéò ïäçãßåò ñþóçò / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l'uso / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja u ytkowania / Consulte as instruções de utilização / Pozri Pokyny na používanie / Consultar las instrucciones de uso / Se bruksanvisningen / Направете справка в инструкциите за употреба / Consultaþi instrucþiunile de utilizare / Kullanım Talimatları na başvurun m Becton, Dickinson and Company A BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland USA Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. Alconox is a trademark of Alconox, Inc. QIAamp is a trademark of QIAGEN Inc. CultureSwab is a trademark of Difco Laboratories, subsidiary of Becton, Dickinson and Company. BD, BD Logo, BBL and ProbeTec are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD