Bitki Doku Kültürü Terminolojisi

Transkript

1 Bitki Doku Kültürü Terminolojisi Absizik Asit (Abscisic Acid): ABA biçiminde kısaltılarak da kullanılan, dormansi ve yaşlanma olaylarında rol oynayan bir bitkisel hormon. Büyüme engelleyici hormon olarak da söz edilebilmektedir. Adventif (Adventitious): Organların (kök, tomurcuk, sürgün, çiçek vb.) veya embriyoların (embriyo benzeri yapıların); kallus dokusunun da aralarında olduğu alışılmamış oluşum yerlerinden meydana gelerek gelişmesi. Örneğin, yaprak yüzeyinden (yaprak ayasından) hazırlanan bir eksplantın üzerinde oluşan adventif kökler gibi. Agar: Alg den elde edilen, polisakkarit yapısında bir toz jelleştirici. Besin ortamlarını yarı-katı kıvama getirmek için kullanılmakta olup, genellikle kullanım dozu %0.6-8 (6-8 g/l) arasındadır. Aktarma (Passage, Subculture): Kültüre alınmış hücrelerin, doku veya organların; seyreltme yapılarak veya yapılmaksızın, taze besin ortamlarına transfer edilmesi, bir kültür kabından bir başka kültür kabına aktarılması. Alkol: Etil alkol (C2H5OH), etanol olarak da adlandırılabilir. Amino asitler: Protein biyosentezinde yapıtaşı olan organik bileşiklerin bulunduğu grup. Androgenesis: Erkek gameten, dölleme olaya olmaksızın embriyo gelişmesi (Male parthenogenesis). Olgunlaşmamış polen tanesinden haploid yapıda embriyo ve bitki oluşumu. Anti-oksidantlar (Anti-oxidants): Oksidasyon oluşumunu engelleyen kimyasal maddeler (sitrik asit, C vitamini gibi).

2 Antiseptik (Antiseptic): Enfeksiyon oluşumuna engel olma, özellikle mikroorganizma gelişiminin engellenmesi için gerekli koşulları sağlama. Apikal dominansi (Apical dominance): En tepedeki sürgün ucunda bulunan ana tomurcuğun (terminal bud), koltukaltı tomurcuklarından (axillary buds) sürgün gelişmesini engelleyerek baskı altında tutması durumudur (Tepe Hakimiyeti). Apikal meristem: Sürgün veya kökün en uç kısmında bulunan ve bu organların uzayarak gelişmelerini sağlayan, hücre bölünmesinin en yoğun olduğu hücrelerden oluşan doku. Aseptik (Aseptic): Bütün mikroorganizmalardan ari, mikroorganizma (mantar, bakteri, maya, virüs, mikoplazma, vs.) bulundurmayan. Asimbiyotik (Asymbiotic): Mikroorganizmalarla ortakpaylaşımlı (simbiyotik) olmayan bir biçimde. Aksiller (Axillary): Yaprak koltuğu kökenli. Örn; aksiller sürgün, aksiller tomurcuk vb. Binoküler (Binocular): 5-20 kez büyütme gücü olan stereomikroskop. Biyosentez (Biosynthesis): Bitki ve hücreler tarafından bileşiklerin sentezlenmesi. Boğumarası (Internode): Gövde üzerinde iki boğum arasında kalan kısım. Bulaşma (Kontaminasyon=Contamination): Bakteri veya funguslar gibi istenmeyen mikroorganizmaların kültür ortamı veya eksplant üzerinde gelişmeye başlaması. Deiyonize su: İnorganik bileşiklerden arındırılmış su. Deterjan (Detergent): Sterilizasyon amacıyla kullanılan çözeltinin yüzey basıncını azaltan ve buna ek olarak bitki parçası ile sterilize eden kimyasal madde arasındaki teması güçlendiren maddeler (Tween 20 gibi)

3 Eksplant (Explant): Bitkinin üzerinde bulunduğu orijinal yerinden alınan ve yapay besin ortamları üzerine aktarılan doku parçası. Embriyogenesis: Yeni bir embriyonun meydana gelmesi. (A) Zigotik Embriyogenesis: Erkek ve dişi gametlerin birleşmesi sonucunda embriyo oluşması, (B) Somatik Embriyogenesis: Somatik bitki dokularından embriyo (embriyo benzeri) nun oluşması, (C) Gametik Embriyogenesis: Bir bitki türünün sahip olduğu kromozom sayısının yarısı kadar kromozoma sahip gamet hücrelerinden, döllenme olmaksızın embriyo (embriyo benzeri) nun oluşması. Embrioid: Embriyoya benzer, embriyo gibi farklılaşıp gelişen yapı (Ör: somatik veya gametik embriyogenesis sonucunda meydana gelen embriyolar). Farklılaşma (Differentiation): Özel işlevleri olan hücrelerin veya dokuların gelişmesi ve/veya organ ya da organ benzeri yapıların (kök, sürgün vb.), (pro)embriyoların oluşması. Gibberellinler: Hücre uzamasını ve hücre bölünmesini teşvik eden, bunun yanında dormansiyi ortadan kaldırma gibi diğer bazı etkileri de bulunan bitki hormonları grubu (GA 3, GA 7 gibi. ) Haploid (Monoploid): Somatik hücrelerinde, ait olduğu bitki türünün temel kromozom sayısının yarısı kadar kromozom taşıyan bitkilere verilen isim. Ör: patlıcanda 2n=2x=24 adet kromozom vardır ve diploiddir. Bu bitkiden elde edilecek haploid bir bitkinin kromozom sayısı 2n=x=12 olacaktır. Hindistan cevizi sütü (Coconut milk): Hindistan cevizinin sıvı endospermi. zeatin sitokinini bulundurduğu ve olgunlaşmış hücreleri de bölünmeye ve yeniden kallus oluşturmaya teşvik ettiği bilinmektedir. Hormonlar: Büyüme düzenleyicileri. Genellikle sentetik hormonlar kullanılır ve büyüme üzerinde kuvvetli etkileri vardır (sitokininler, oksinler ve gibberellinler). Kallus (Callus): 1. Organize olmamış, farklılaşmamış ve düzensiz olarak çoğalan hücre yığını, 2. bitkide yaralanmaya karşı verilen yanıt, yara dokusu.

4 Kambiyum: Gövdede bulunan, odun ve kabuk (ksilem ve floem) yapılarını oluşturan, bölünebilir özellikteki hücrelerden oluşan doku. Karbonhidratlar: Enerji kaynağı olarak hizmet eden kimyasal bileşikler (ör: glukoz, sukroz, fruktoz, vb.) Kimerik (Chimera): Sahip olduğu hücrelerin bazı katmanları veya bir grubunda genetik olarak farklılık bulunduran bitki. Klon: Tek bir bitkiden, eşeysiz olarak çoğaltılmış, birörnek bitkiler. Klonal Çogaltım: Tek bir bitkisel kaynaktan, ya da bir eksplantan, eşeysiz (vegetatif) çoğaltma yöntemleri kullanılarak çoğaltım yapılması ve genetik özellikleri birörnek olan bitkilerin elde edilmesi. Kültür (Culture): in vitro koşullarda geliştirilen bitki. Kültür Odası: Kültürlerin geliştirilmek üzere bırakıldığı (inkübe edildiği); ışık, sıcaklık ve nem bakımından kontrol altında tutulan oda. Laminar akışlı kabin (Laminar flow unit): İçerisinde steril edilmiş havanın dolaştırıldığı, çevresi kapatılmış çalışma alanı olarak kullanılan kabin. Hava kabin içinde uniform akış hızı ve birbirine paralel hatlar boyunca yukarıdan aşağıya (vertikal) veya karşıdan (horizontal) olarak üflenmektedir. Yer aldığı ortamın havasını bir fan yardımıyla içine alarak HEPA (High Energy Particulate Air) filtre sisteminin içinden geçiren, 0.3 μm ve daha büyük tüm partikülleri filtre ederek steril havayı kabinin çalışma alanı bölümüne yollayan bir cihazdır. Makro elementler: Bitkilerin beslenmesinde, normal gelişme için ve büyük miktarlarda ihtiyaç duydukları, gerekli elementler (N, P, K, Ca ve Mg gibi).

5 Mikro çoğaltım (Micropropagation): -Bitkilerin sürgün uçlarından veya boğum eksplantları kullanılarak, In vitro koşullar altında alt kültürler (subcultures) yaparak ve böylece kısa sürede yüksek çoğaltım katsayısı elde etmek suretiyle klonal çoğaltma işleminin gerçekleştirilmesi. Ortam (Besin ortamı=medium), (çoğul: Media): Yarı katı veya sıvı, eksplantların kültüre alınması için hazırlanan besleyici çözelti. (II. Üzerinde veya içinde hücrelerin, dokuların veya organların gelişebileceği, agar ilave edilmiş veya sıvı yapıda olan, gereken besin maddelerini içeren karışım). Mikro elementler: Bitkilerin beslenmesinde küçük miktarlarda ihtiyaç duyulmakla birlikte, büyük önem taşıyan inorganik elementler (Fe, Cu, B, Zn, Mo, Mn gibi ). Meristem: Bölünme yeteneğinde olan hücrelerden oluşmuş hücre topluluğu veya doku. Kök ucunda, sürgün ucunda (apikal meristem), ya da kambiyum dokusundaki meristematik özelliğe sahip hücreler bu kapsamda yer alır. Ancak doku kültürü genelinde meristem kültürü denince, anlaşılan sürgün ucunda bulunan apikal meristem olmaktadır. Mutasyon: Sonraki döllere aktarılabilen, kalıcı genetik değişiklik. Oksinler (Auxins): Hücre uzamasını ve hücre bölünmesini teşvik eden; çoğunlukla adventif kök oluşumunu uyaran, adventif tomurcuk ve sürgün oluşumunu ise engelleyici etkisi bulunan doğal veya sentetik yapılı bitkisel hormonlardan oluşan grup. Otoklav (Autoclave): -Kuru veya ıslak materyalleri, besin ortamlarını; basınç altında, buharla sterilize etme kapasitesine sahip bir cihaz. Düdüklü tencere olarak bilinen buharlı ve basınç altında pişiren tencereler de bir çeşit otoklavdır. Partenogenesis (Parthenogenesis): Erkek gametin katılımı olmaksızın, dişi gametten embriyo oluşumu. Patojen: Hastalığa yol açan organizma.

6 Petiol: Yaprak sapı; Yaprak ayasını gövde üzerindeki boğuma bağlayan bitki kısmı. Petri kutusu (Petri dish): Camdan veya sentetik materyalden yapılmış, düz ve çevresi yuvarlak, tabak gibi bir alt parça ile bunun üzerini kapatan kapaktan oluşan yetiştirme kabı. Primordium: Organ oluşturmak üzere gelişen hücre grubu. Protokorm: Orkide türlerinde tohumlar çimlendiği zaman veya meristem kültürü yapıldığında oluşan yumru benzeri yapı. Protoplast: Hücre duvarının enzimatik dejenerasyonu neticesinde elde edilen, hücre duvarı bulunmayan bitki hücresi. Rejenerasyon: Bitki doku kültüründe, organ, embriyo veya tüm bitkinin oluşumuyla sonuçlanan, herhangi bir uyarana karşı verilen morfogenetik bir yanıt. Sitokininler (Cytokinins): Hücre bölünmesini teşvik eden; adventif tomurcuk veya sürgünlerin oluşmasını uyaran ve çoğunlukla da adventif kök gelişimini engelleyen doğal veya sentetik yapılı bitkisel hormonlardan oluşan bir grup. Sitokininler apikal dominansiyi azaltmaktadır. Somaklonal Varyasyon: -Somaklonlar içinde (birörnek hücre topluluklarında), genetik veya epigenetik kökenli olarak ortaya çıkan fenotipik varyasyon. Steril: (A) Hiçbir canlının bulunmadığı ortam, yer, (B) Fonksiyonal gametler oluşturma yeteneğinden yoksun olma durumu, (C) Mikroorganizmalardan arındırılmış kültürler. Totipotensi (Totipotency): Olgun bir organizmada yer alan bütün hücre tiplerinin, yeni biçimlere dönüşebilme ve birey oluşturabilme yeteneğinde olmasını açıklayan bir hücre özelliği.

7 Vitro: Sözlük anlamı, cam içinde. Deney tüpü, petri kutusu, cam kutu, kavanoz vs. içinde. in vitro, labortuvar ortamında, cam içinde olarak algılanabilir. Ex vitro; canlı materyalin (bitkiciğin) tüp veya cam kaplardan çıkartılıp dış ortamda geliştirilmesi anlamında kullanılmaktadır. Örneğin, Tüp içinde geliştirilen sürgünler serada, perlit içinde ex vitro koşullarda köklendirildi cümlesinde olduğu gibi. Vivo: Canlı, yaşayan organizma. in vivo, canlının üzerinde, ondan ayrılmadan, canlının içinde anlamını taşımaktadır (in situ). Serada, açık arazide vs. yetiştirilen tam bitki üzerindeki gelişmeyi anlatır.

8 Bitki doku kültürlerinin bazı avantajları Bitki hücrelerinin bio-reaktörlerde ikincil ürün (sekonder metabolit) yapısındaki kimyasal maddeleri, büyük miktarlarda (large scale) üretmesi sağlanabilir. Haploid bitkiler elde edilerek, bunlardan geliştirilen dihaploid bitkilerden homozigot ve saf hatlara ulaşmak mümkündür. Safhatların elde edilmesi için gerekli zamanı, klasik ıslah yöntemlerine göre kısaltabilir. Uzak akraba türler arasında melezleme yapma olanağının kısıtlı olduğu durumlarda, somatik hücrelerden protoplast izolasyonu ve bunların birleşdtirilerek somatik füzyon yapılması sayesinde, yarayışlı bazı agronomik özellikler yerli çeşitlere aktarılabilir. Hücre düzeyinde seleksiyon yapma olanağı sağlayan hücre kültürleri sayesinde, somaklonal varyasyonun ortaya çıkartılması veya uyarılmış mutantların elde edilmesi mümkün olabilmektedir. Meristem ve sürgün ucu (shoot tip) kültürü teknikleri ile sınırlı sayıdaki başlangıç materyalinden birörnek genetik yapıya sahip kitle halinde çoğaltım yapmak, yani mikro çoğaltım mümkün olabilir. Gen aktarımı için doku kültürlerinden yararlanmak, transformasyon tekniğinin temelini oluşturmaktadır.

9 Bitki doku kültüründe besin ortamlarında kullanılan bazı büyüme düzenleyiciler Normal konsantrasyon aralığı 10-7 ~ 10-5 Marasında değişmektedir. Sınıf İsim Kısaltma Molekl Ağırlığı Stok çözelti Oksin p-chlorophenoxyacetic acid 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Indole-3-acetic acid Indole-3-butyric acid 1-Naphthaleneacetic acid 2-Napthoxyacetic acid pcpa 2,4-D IAA IBA NAA NOA Tüm oksinler seyreltik NaOH veya sulandırılmış etil alkolde çözünür. Sitokinin 6-Benzylaminopurine N-Isopenteylaminopurine 6-Furfurylaminopurine (Kinetin) Zeatin BAP 2iP K Zea Tüm sitokininler seyreltik NaOH veya sulandırılmış etil alkolde çözünür. Gibberellin Absizik asid Gibberellic acid Abscisic acid GA 3 ABA Suda çözünür. Sulandırılmış etil alkolde çözünür.

10 Bitki büyümesi için gerekli elementler Bazı elementler bitki beslenmesinnde ve bitkilerin fizyolojik işlevlerini yerine getirmede önemlidir. Bu elementler, in vitro koşullarda bitkilerin sağılıklı gelişmeleri için mutlaka kültür ortamına ilave edilmelidir. Element İşlevi Nitrojen Potasyum Kalsiyum Magnezyum Fosfor Sülfür (kükürt) Klor Demir Manganez Kobalt Bakır Çinko Molibden Proteinlerin, nükleik asitlerin ve bazı koenzimlerin yapısında yer alır. Aralarında en fazla ihtiyaç duyulanı nitrojendir. Ozmotik potansiyeli düzenler, inorganik katyondur. Hücre duvarı oluşumunda, hücre zarı işlevlerinde, sinyal iletişiminde rol alır. Nzim kofaktörüdür, klorofilin yapısında bulunur. Nükleik asitlerin yapısında bulunur, enerji transferi, solunum ve fotosentez işlevlerinde rol alır. Bazı amino asitlerin (methionine, cysteine) ve bazı kofaktörlerin yapısında bulunur. Fotosentez için ihtiyaç duyulur. Sitokromların yapısında olması dolayısıyla elektron transferinde rol oynar. Enzim kofaktörüdür. Bazı vitaminlerin yapısında bulunur. Enzim kofaktörü, elektron-transfer reaksiyonları Enzim kofaktörü, klorofil biyosentezi Enzim kofaktörü, nitrat redüktaz enziminin yapısında yer alır.

11 Murashige ve Skoog (MS) Ortamı Makroelement (10x) Mikroelement (1000x) Organik Bileşikler NH 4 NO 3 MgSO 4 CaCl 2 KPH 2 O 4 KNO g/l 370 mg/l 440 mg/l 170 mg/l 1.9 g/l H 3 BO CoCl 2 CuSO 4 ZnSO 4 (7H 2 O) NaMo0 4 (2H 2 O) MnSO 4 (4H 2 O) KI *FeSO 4 (7H 2 O) *Na 2 EDTA 6.2 mg/l mg/l mg/l 8.6 mg/l 0.25 mg/l 22.3 mg/l 0.83 mg/l 27.8 mg/l 37.3 mg/l Nicotinic acid 0.5mg/L Pyridoxin-HCl 0.5 mg/l Thiamine-HCl 0.1 mg/l myo-inositol 100 mg/l Glycine 2 g/l Sukroz (Sakaroz) 30 g/l

12 Besin Ortamı Hazırlama 1. 1 litre ortam hazırlama (40-60 örneklik) 2. 2 litrelik erlenmayer (ya da balon-joje) içine 800 ml distile su koyunuz. 1 litre ortam için 2 lt lik kap kullanılması, kaynama sırasında ve sterilizasyon aşamasında sıvının taşma olasılığına karşı kullanılmalıdır. 3. Hazır toz halinde karışım kullanıyorsanız, 1 lt lik karışımı ilave ediniz. Bir kaç ml su ile paketin içinde kalan toz karışımı da çözerek ölçü silindirine katınız. Karışım suyun içinde eriyene kadar karıştırınız. 4. Sakaroz u ilave edip şekerin tamamen çözünebilmesi için karıştırınız (Mıknatıslı balık kullanarak, manyetik karıştırıcıdan da yararlanabilirsiniz.) 5. ph değerini ölçünüz (ph değerini ölçme işlemi bitmeden agar ı ilave etmeyiniz). 6. ph değerini 5.7 ye ayarlayınız. 7. Erlenmayerdeki toplam hacim 1 litre olacak şekilde distile su ilave ediniz. 8. Agar (7-8 g/liter) katınız. Agar bu aşamada, ortam ısıtılmadan çözünmeyecektir. 9. Erlenmayerin ağzını 2 kat alüminyum folye ile kapatınız. Otoklavda sterilizasyon, 121 o C de 15 dakika, 15 lb in -2 basınçta ( standart otoklav koşulları) yapılmalıdır.

13 10. Cam tüpler veya plastik kapaklı Magenta-kutuları kullanıyorsanız, kapları distile su ile çalkalayıp otoklava koyunuz. (kutu kapakları açık olmalı). Tek kullanımlık santrifüj tüpleri veya plastik Petri kutuları kullanılıyorsa, bunları otoklavlamayınız, yüksek sıcaklığa dayanıklı değillerdir. Cam tüpler, kavanozlar ve Magenta kutuları, otoklavda yarım saat ile 1 saat arasında tutulabilir ve besin ortamı otoklavlanmadan önce stirilize edilerek laminar flow kabine alınarak soğumaları sağlanır. 11. Besin ortamını en düşük 60oC sıcaklıkta olacak şekilde aseptik koşullarda steril kabin içinde kültür kaplarına boşaltın. Erimiş haldeki agar, yaklaşık 1 saat içinde ortamı jel kıvamına dönüştürecektir. 12. Besin ortamlarını dikim için hemen kullanabileceğiniz gibi, iyice soğuduktan sonra steril büyük kutular içinde veya ağızlarını streç filmle kapattıktan sonra buzdolabında saklayabilirsiniz. Hazır toz karışım kullanmıyorsanız, herbir makro element için ayrı ayrı, mikro elementlerin de tümünü bir arada bulunduracak şekilde stok çözeltilerini hazırlamak gerekmektedir. Stok çözelti, herhangi bir maddenin, esas kullanım dozundan 10, 100 veya 1000 kat daha yoğun hazırlanmasıyla elde edilir (10x), (100x), (1000x). 1 litre besin ortamı hazırlanırken de; 10x lik stok çözeltiden 100 ml, 100x lik stok çözeltiden 10 ml, 1000x lik stok çözeltiden 1 ml alınarak besin ortamı karışımı için kullanılır. 10 veya 100 kat yoğun stoklar makro ve mikro elementler için, 1000 katlık stoklar ise genellikle vitamin, aminoasit veya diğer organik katkı maddelerinde kullanılır.

14 Otoklavlama,sterilizasyonda alternatif yöntemler ve yüksek sıcaklıkta bozulan maddeler Otoklavlama Bakteri ve fungal enfeksiyon kaynaklarını yok etmek için, besin ortamları yüksek sıcaklık ve basınç altında tutulmalıdır. Özellikle fungus sporlarının sadece yüksek sıcaklık uygulanması halinde canlılıklarını korudukları bilinmektedir. Bu nedenle, ortamlar 121 C de ve 103.5kPa (15 lb in -2 ) basınç altında sterilize edilmelidir. Sterilizasyon süresi, otoklava konulan besin ortamı hacmine göre değişiklik gösterebilmektedir. Tablo 1 de besin ortamı hacmine göre gerekli otoklavlama süreleri verilmiştir.

15 Tablo 1. Bitki doku kültürü ortamlarının minimum otoklavlama süreleri Her bir kültür kabının hacmi (ml) Minimum otoklavlama (dak)* ---- Her bir kültür kabının hacmi (ml) Minimum otoklavlama (dak)* *Minimum otoklavlama süresi, besin ortamının sıcaklığı 121 o C ye ulaştıktan sonra hesaplanır.

16 Kuru Sterilizasyon Cam malzemeler, 200 C de 1-4 saat süreyle etüv (fırın) içinde tutularak da sterilize edilebilir. Fırın içinden cam malzemelerin çıkartılması sırasında aseptik koşulların devam edebilmesi için bu malzemelerin alüminyum folye ile sarılmış olduğundan emin olmak gerekir. Plastik kapları, streç film, kağıt veya diğer yanıcı malzemeleri, herhangi bir zarara yol açmamak içni uzak tutmak gereklidir. Sterilizasyonu Belirli ortam bileşenlerinin yapıları, yüksek sıcaklıklara karşı duyarlıdır. Bu tip maddeler, besin ortamına otoklavlama işleminden sonra ilave edilmelidir. Bu maddeleri çözündükten sonra 0.22µm delik çapına sahip filtreden geçirmek gerekir. Hindistan cevizi sütü, otoklavlama yerine filtre yardımıyla sterilize edilebilmektedir. Bunun için, önce 0.45µm por büyüklüğüne sahip filtreler kullanılabilir, bundan sonra 0.22µm por çapındaki filtreler ile sterilizasyon işlemi tamamlanır.

17 Yüksek Sıcaklığa Duyarlı Olan Bileşikler Bazı bileşikler yüksek sıcaklıktan olumsuz etkilendikleri için filtre sterilizasyonuna tabi tutulurlar. Aşağıdaki tabloda, hangi bileşiklerin ne şekilde sterilize edilmesi gerektiği gösterilmiştir. Bileşik Tip Sterilizasyon Yöntemi Çözücü Kullanım dozu (mg/l) Açıklama IBA Otoklav, ETOH / Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir. 2,4-D Otoklav ETOH / Picloram Oksinler Otoklav Su ,4-D ye göre aktivitesi 2-4 kat daha düşüktür. NAA Otoklav IAA Otoklav, ETOH / Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir.

18 BA Otoklav, Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir. Zeatin Otoklav, Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir. Zeatin riboside Kinetin Sitokininler Otoklav, Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir. Kinetin Riboside iP Otoklav, Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir. IPA Otoklav, Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir. GA 3 GA 4 Gibberellin ETOH ETOH Otoklavlama sırasında etkinliği %90 oranında azalabilir. GA 7 ETOH

19 Thiamine (B 1 ) Otoklav 500-5,000 ph 5.5 un çok üzerinde olduğunda hızla bozulabilmektedir. Pyridoxine (B 6 ) Otoklav Nicotinic acid (niacin) Vitaminler Otoklav 500- Cyanocobal amin (B 12 ) Calcium pantothenat tca (transcinnamic acid) Antioksin Otoklav ETOH / Otoklavlama sırasında etkinliği bir miktar azalabilir. Coconut water Kompleks yapılı bileşik Otoklav, filtre 10-20% Aktif Karbon (Activated Charcoal) Otoklav 0.2% Sakaroz (Sukroz) Karbon Kaynağı Otoklav Su 2-3%

20 Laminar akışlı kabinler Steril kabinler (Laminar Flow Cabinets) in dikey veya yatay hava akımı sağlayan tipleri bulunmaktadır. Doku kültüründe eksplantların dikimi ve ortam hazırlamanın son aşamaları, steril koşullar sağlayan bu cihazlarda gerçekleştirilir.

21 Laminar akışlı kabinlerde çalışma öncesi hazırlıklar Steril aktarma veya dikim işlemlerine başlamadan önce, çalışacak kişi ellerini ve dirseklerine kadar olacak şekilde kollarını temiz olacak şekilde sabunla yıkamalıdır. Kabinin tüm iç yüzeyi, %70 lik etil alkol kullanılarak (püskürtülerek) yüzeysel sterilizasyona tabi tutulmalıdır. Alkolün derecesi, yanabilecek kadar yüksek olmamalı, %70 lik alkoldan daha derişik konsantrasyonlar bu amaçla kullanılmamalıdır. Aktarma veya dikime başlamadan önce cihaz en az dakika çalıştırılmalıdır, Kaline girmeden önce bir kez daha alkolle yüzeysel setirizasyon yapılmalıdır. Kabin içinde sadece gerekli malzemeler bulundurulmalıdır.

22 Kallus ve hücre süspansiyonlarının aseptik koşullarda aktarımı Küçük bir kaşıklı spatula, önce %80 lik alkole daldırılır, ardından aleve tutulur. (Önce alkol, sonra alev!!) A kültür kabının kapağı çıkartılır ve boğaz kısmı aleve tutulur. A kabı yatay pozisyona yakın bir şekilde tutulur ve spatula ile kültür kabının içindenkallus dokusu çıkartılır. Spatulanın kenar yüzeylere değdirilmemesi gerekir. A kabının boynu aleve tutulur ve kapağı kapatılır. B kabının kapağı çıkartılır, boğaz kısmı aleve tutulur ve aktarılacak doku, B kabının içine bırakılır. Spatula alkolün içine bırakılır. B kabının boynu aleve tutulur ve kapağı yeniden kapatılır.