MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ ve YENİLİKLER

Transkript

1 MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ ve YENİLİKLER Doç.Dr.Yasemin BULUT Fırat Üniversitesi,Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD. Elazığ

2

3 Tüberküloz tüm dünyada özellikle Asya ve Afrika da önemli bir hastalık ve ölüm sebebi Mycobacterium tuberculosis, tek bir infeksiyöz ajana bağlı ölümlerin sebebi olarak ilk sıralarda

4 TÜBERKÜLOZ (TB) LABORATUVARLARI TB yayılımını önlemede ve kontrol altına alabilmede Örnekte M.tuberculosis tespiti İzolasyon İdentifikasyon Anti-tüberküloz ilaç duyarlılığı önemli role sahiptir

5 TANI SÜRESİ Konvansiyonel yöntemlerle 2-8 hafta Moleküler yöntemlerle 2-8 saat Hasta takibi ve halk sağlığı yönünden; Tanısal mikobakteriyolojide mevcut en hızlı metodların kullanımı önerilmektedir Tenover et al. 1993; JCM 31,767

6 TB Laboratuar Tanısında Kullanılan Geleneksel Yaklaşımlar Hızlı yöntemler: Mikroskopi Mikobakteriyofaj Gama interferon Moleküler testler Yavaş yöntemler: In vivo testler - Tüberkülin testi - Hayvan inokülasyonu. Kültür - L.J. - Bactec 460 -MGIT 7H11 Midlebrook

7 Kültür Yöntemleri Klasik katı besiyerleri - Yumurta bazlı besiyerleri - Agar bazlı besiyerleri besiyerleri Hızlı kültür sistemleri - Tam otomatize - Yarı otomatize - Manuel

8 MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ TB nin rutin laboratuvar tanısında moleküler yöntemlerin kullanımı halen tartışmalı bir konu Birçok merkezde tanı amacıyla mikroskopik inceleme ve kültür kombinasyonu Özellikle son yıllarda dirençli olgu sayındaki artış,tedaviye bir an önce başlayabilmek ve yeni bulaşları önleyebilmek amacıyla, Duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek Hızlı sonuç veren Uygulaması kolay Pahalı olmayan yöntemlerin günlük kulanıma girmesi önemli bir gereksinim haline gelmiştir.

9 Tüberkülozun tanısında moleküler testler neden gerekli??? Tüberkülozun doğru ve kısa sürede tanısı M. tuberculosis ilaç direncinin erkenden saptanması Mikobakterilerin tür düzeyinde tanımlanması M. tuberculosis suşlarının genotiplendirilmesi ve tüberkülozun epidemiyolojisine katkıda bulunmak Bunlar; uygun tedavinin başlaması ve etkin kontrol önlemlerinin alınmasında çok önemli..

10 MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ Nükleik Asit Amplifikasyonu Nükleik Asit Hibridizasyonu PCR-DNA Dizi Analizi DNA Microarray Analizi PCR-RFLP Analizi Spoligotyping PFGE RAPD Analizi MIRU-VNTR.....

11 AMAÇ; Tüberkülozun doğru ve kısa sürede tanısı M. tuberculosis ilaç direncinin saptanması Mikobakterilerin tür düzeyinde tanımlanması M. tuberculosis suşlarının genotiplendirilmesi ve tüberkülozun epidemiyolojisine katkıda bulunmak I. Nükleik asit hibridizasyon yöntemleri II. Nükleik asit çoğaltma yöntemleri (genel amplifikasyon yöntemleri)

12 Nükleik Asitlerin Saptanması Hibridizasyon Yöntemleri 1-Amplifikasyon yöntemleri Sıvı fazda Katı fazda A-Hedef NAA amplifikasyonu PCR ve modifikasyonları TMA (transkripsiyon aracılı çoğaltma) SDA (İplikçik uzaklaştırarak çoğaltma Dot Blot Hibridizasyon Southern Blot Northern Blot Western Blot In Situ Hibridizasyon B- Probun amplifikasyonu Ligaz Zincir Reaksiyonu (LCR) QB replikaz C-Sinyalin amplifikasyonu b-dna ve Hybrid Capture

13 Amplifikasyon Yöntemleri PCR ve Modifikasyonları Heteroduplex PCR Multipleks PCR Nested PCR RealTime PCR Spoligotyping MIRU-VNTR NASBA TMA SDA Hedef DNA ya da RNA nın çoğaltılması

14 MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ Hasta örneklerinden M.tuberculosis aranması NAA esaslı ticari sistemler. Kültürden tür düzeyinde tanımlaması Prob Hibridizasyon esaslı ticari sistemler, PCR- DNA dizi analiz kitleri, DNA Microarray ve PCR- RFLP, Spoligotyping, Antibiyotik direnci ile ilgili mutasyon analizi PCR-DNA dizi analizi, Line-Probe Assay, DNA Microarray, Floresans rezonanslı enerji aktarımı (FRET-FluorescenceResonance Energy Transfer) 6. Ulusal Mikobakteri Semp. Ankara Doç.Dr.Mustafa ÖZYURT

15 Hedef Çoğaltma I. NAA Esaslı Yöntemler-1 PCR (Cobas Amplicor MTB System-Roche) Hedef, 16S rrna geni. TMA (Mycobacterium tuberculosis Direct Test, MTD- Gen- Probe) Amplifikasyon hedefi 16S rrna - NASBA (GenoType Mycobacteria Direct testi, Haın Lıfescıence) Amplifikasyon hedefi 16S rrna SDA (BD ProbeTec ET- Becton Dickinson) Hedef özgül IS6110 insersiyon sekansı Real-Time PCR (icycler-bıo-rad, ABI PRISIM 7000-Applied Biosystem) Hedef özgül 16S rrna geni

16 Prob Çoğaltma I. NAA Esaslı Yöntemler-2 LCR (LCx MTB Assay-Abbott Laboratories) Hedef, 35-kDa luk protein antijen b (Pab) kromozomal geni - Q-Beta Replicase amplification assay (Galileo versiyonu) (Vysis, Downers Grove IL) Hedef, bakterinin 23S rrna sı

17 II.NÜKLEİK ASİT HİBRİDİZASYON-A The AccuProbe System (Gen-Probe) - Hedef, Mikobakterilerin tür spesifik rrna larıdır - Yaklaşık 1-2 saat içerisinde tür düzeyinde tanımlama (6 patojen mikobakteri) (M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae) - Duyarlılığı %92-99, Özgüllüğü %87-99 DDH Mycobacteria (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co) Hedef, 16S rrna gen dizileri (18 patojen mikobakteri )

18 II.NÜKLEİK ASİT HİBRİDİZASYON-B Line-Probe Assay (LİPA-DNA STRİP TEKNİĞİ) *INNO-LİPA Mycobacteria v2; (Inno-Genetics NV, Ghent, Belgium ) -Hedef, 16S-23S rrna spacer bölgesidir - 3 saatte (amplifikasyonu takiben) tür düzeyinde tanımlama (16 patojen/ntm mikobakteri) - Duyarlılığı ve Özgüllüğü %100, Laboratuvar identifikasyon testleri ile uyum % 99.6 **GenoType MTBC, Mycobacterium CM/AS,(Haın Lıfescıence) -Hedef, 16S-23S rrna spacer bölgesidir saatte (amplifikasyonu takiben) tür düzeyinde tanımlama ( patojen/ntm mikobakteri) ***INNO-LIPA Rif.TB (Inno-Genetics NV, Ghent, Belgium )- RIF Direnci ****GenoType MTBDR (Haın Lıfescıence)- RIF ve INH direnci

19 M.tuberculosis complex Moleküler Tekniklerle Aranması Sistem Hedef Metod Tanımlama Kullanım Amplicor 16S rrna PCR Kolorimetrik Smear(+)balgam MTD 16S rrna TMA Kemilüminesen Smear(+/-)balgam GTMD 16S rrna NASBA Görsel-strip Smear (+) balgam ProbeTec ET IS 6110 insersiyon SDA Floresan ET Smear(+)balgam Clinical Chemistry 47(8); (2001)

20 1- MIRU-VNTR (Variable number tandem repeats of mycobacterial interspersed repetitive units- Mikobakterilerde tekrarlayan ünitelerin değişken sayıda tekrarları) Son yıllarda geliştirilen PZR bazlı moleküler yöntemde her izolat, genomda dağılmış bulunan 12 bağımsız bölgedeki tekrarlayan ünitelerin kopya sayıları ile tiplendirilmektedir. 52 ile 77 nükleotit uzunluğunda olan tekrarlayan ünitelerin sayıları tüm bölgelerin çoğaltılması ile elde edilen ürün büyüklüğü ile belirlenmekte Bu yöntem IS6110 kopya sayısının düşük olduğu M. tuberculosis kompleks kökenlerinde olduğu gibi sayının yüksek olduğu kökenlerde de grup çeşitliliğini artırmaktadır

21 2- Spoligotyping (Spacer oligonucleotide typing)-i Direkt tekrarlayan kromozomal bölgelerin amplifikasyonu hedeflenerek M. tuberculosis kompleks kökenlerinin ayrımında kullanılan PZR bazlı moleküler yöntemlerdendir. Bu bölgelere yönelik PZR sonrası ortalama 36 baz çiftlik amplifiye ürünler 43 set oligonükleotit içeren membran ile hibridize edilmektedir. Farklı epidemiyolojik kökenli izolatlarda bölgeler ve sayılarda değişilik görülmektedir.

22 Spoligotyping (Spacer oligonucleotide typing)-ii Bu yöntem direkt olarak canlı M. tuberculosis organizmasına uygulanabileceği gibi parafin bloklardan veya arkeolojik örneklerden de çalışılabilmekte IS6110 kopya sayılar 5 den az olan M. tuberculosis kompleks izolatlarının tanımlanmasında spoligotyping, IS6110 profiline dayanan yöntemlerden üstün En az 20 kez tekrar kullanılabilen membranlarda 43 örnek birlikte çalılabilmekte ve değerlendirilmesi ve uygulaması kolay, nispeten ekonomik bir yöntem

23 3- Gerçek zamanlı PCR (Real-time PCR) Amplifikasyon esnasında ürün oluşumunun izlenmesi ve kalıp DNA miktarının tahmini temeline dayanmakta.. Çoğaltma ile birlikte ve eş zamanlı olarak gerçekleşen saptama, DNA ya bağlanan boyalar veya floresan veren boyalar ve işaretli problar ile gerçekleştirilmekte ve deteksiyon sinyallerin ölçülmesi ile değerlendirilir PCR ürünlerinin miktarındaki ilk önemli artış (CT - threshold cycle) hedef template in başlangıç miktarı ile orantılıdır

24 Real-Time PCR Tüp içinde oluşan fluorescence saptanır Amplifikasyon sırasında saptama yapılır

25 (www)

26 Real-time PCR ın avantajları Spesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyor Reaksiyon boyunca veri toplanarak aynı anda analiz imkanı PCR sonrası ürünlerin ikincil bir işlemi gerekmiyor (yüksek verimlilik,düşük kontaminasyon riski) ultra-rapid siklus (30 dak.-2 saat) İki kat değişikliği hızla tanımlayabilmekte Spesifik erime eğrisi analizleri ile spesifik amplifikasyonların tanımlanması Duyarlılığı, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği yüksek Konvensiyonel PCR dan daha pahalı değil

27 Real-time PCR ın dezavantajları teknik donanım, alt yapı, beceri ve tecrübe gerektiriyor Yüksek ekipman ihtiyacı Aynı ve farklı laboratuvar lar arasında sonuçlar arası faklılıklar Standardizasyon problemi

28 Günümüzde Real-time PCR da; TaqMan prob sistemi, SYBR Green prob sistemi ve Beacon prob sistemi kullanılmaktadır. Gerçek zamanlı çok sayıda ticari sistem bulunmaktadır; Roche Diagnostic Systems(LightCycler) BIO-RAD (icycler) Abbott Diagnostic (ABI Prism 7000) Applied Biosystems (ABI Prism 7700) - Bu sistemlerin çoğunda bakterinin 16S rrna yı kodlayan gen kısmı (rdna) veya IS6110 gen bölgesi hedef alınır.

29 Corbett Research Rotor-Gene 3000 BioRad icycler

30 SmartCycler MJ Research Chromo4

31 Idaho Technology Rapid Cycler Roche LightTyper & LightCycler Stratagene

32 4. Ligaz Zincir Reaksiyonu-LZR (Ligase Chain Reaction-LCR) PCR dan sonra geliştirilen NAA temelli bir teknik,görüntülemede prob kullanılır.yani prob hibridizasyon-ligasyon yöntemi.. Termostabil DNA ligaz enzimi ve dört primer kullanılarak gerçekleştirilir Bu yakın primerler arasında 1-3 nükleotitlik bir aralık mevcuttur DNA ligaz enziminin ligasyonu için bu bölge gereklidir Elde edilen amplikonlar sadece iki primer boyu kadar ve proplar ile hibridize edilerek görüntüleme DNA ligaz enzimi yüksek oranda spesifiktir ve yanlış baz eşlemelerine tolerans göstermez

33 Ligaz Zincir Reaksiyonu

34 LZR ın bir varyasyonunda hem polimeraz, hem de ligaz enzimleri kullanılmaktadır (Gap- LCR) LZR nin major avantajı yüksek özgüllüğüdür. Bu teknikte özgüllük dört kat daha artmaktadır Buna ilaveten otomatize tespit sistemlerinin entegre edilmesi ile beraber LZR tanı laboratuvarları için daha cazip Önemli bir dezavantajı,kontaminasyon kontrol sisteminin olmayışıdır.

35 -Ticari olarak mevcut sistemlerden biri: LCx MTB Assay (Abbott Lab., USA) MTBC nin protein antijen b geni - Duyarlılık ve özgüllükleri.klinik tanıyla kıyaslamada yaklaşık % 70-90,.kültür sonuçlarıyla kıyaslamada % direk bakı pozitif örneklerle kıyaslamada % olarak belirlenmiştir

36 Son yıllarda,canlılığı gösteren ve çok kolay parçalandıkları için kros kontaminasyon riski daha az olan RNA ya yönelik amplifikasyon çalışmaları yapılmış ve yeni sistemler geliştirilmiştir. Bu sistemlerin ortak prensibi rrna dan, RNA polimeraz enzimi için başlatıcı özelliği olan bir primer yardımıyla cdna elde etmek, cdna dan karşıt zinciri sentezletecek olan ikinci primerle de dsdna elde ederek amplifikasyonu sürdürmektir. Bu yöntemler içinde 3SR/NASBA ve TMA yer almaktadır.

37 5- Self-sustained sequencereplication (3SR) - Self-sustained sequence-replication (3SR) transkripsiyon (RNA) temelli NAA yöntemlerinden birisidir - NAA temelli çoğaltma metodu (nucleic acid sequence-based amplification; NASBA) olarak da isimlendirilmektedir - Bu teknik Retrovirusların replikasyon döngüsünü taklit eder -Metot üç enzim aktivitesine bağlıdır (retrovirus kökenli RT enzimi, faj kökenli T7 RNA polimeraz ve bakteri kökenli ribonuclease H)

38

39 Bu tekniğin en önemli avantajı - izotermik ve sabit ısıda (41 C) reaksiyonun gerçekleşmesi, - PCR a kıyasla oldukça kısa sürede sonuç vermesi - Duyarlılığının standart RT-PCR a kıyasla yüksek (Çoğalan hücrede hedef RNA kopyalarının DNA dan daha fazla sayıda)

40 Bu tekniğin dezavantajları; Diğer amplifikasyon metotlarında olduğu gibi 3SR de kontaminasyon riskine açık Bunun yanısıra bu metotta kullanılan enzimler de termostabil değil Eğer termostabil RNA polimerazlar veya reverz transkriptazlar kullanım alanına girebilirse, 3SR hedef amplifikasyonunda PZR ın yerine seçilebilir

41 6- Transkripsiyon Aracılığıyla Çoğaltma (Transcription Mediated Amplification; TMA) TMA; transkripsiyon bazlı, otokatalitik bir diğer izotermal RNA amplifikasyon yöntemidir 3SR yada NASBA metoduna benzemektedir Farklılık RT enziminin RNaseH aktivitesinin kullanılmasıdır Kullanılan enzimler RNA polimeraz ve reverse transcriptase enzimleridir Amplifikasyonun adımında kullanılan primerler RNA polimeraz için promotor bölgeleri de beraberinde bulundurur

42 Transkripsiyon Aracılığıyla Çoğaltma (TMA)

43 PCR a veya LCR a göre en önemli avantajı; bu method da RNA amplikonların oluşması TMA ile her siklusta üretilen amplikonların sayısı arasında değişmekte,sentezlenen amplikon sayısı PCR ve LCR a kıyasla milyon kat daha fazladır Son derece hızlı ve duyarlı olan yöntem, RNA nın DNA ya göre daha labil olması nedeniyle,kontaminasyon riskini azaltarak özgüllükte artış sağlamaktadır MTD (Gen-Probe, San Diego California) MTD kullanılarak gerçekleştirilen çalışmalarda duyarlılık ve özgüllüğünün yaklaşık %85-100, %75-99 arasında olduğu ifade edilmektedir

44 7- Zincir Ayrıştırma Çoğaltma (Strand displacement amlification;sda) Yöntemi - NASBA ile eş zamanlı geliştirilmiş olan izotermal bir reaksiyon - Ekzonükleaz aktivitesi yetersiz DNA polimeraz (Klenow fragmenti), hemifosforothiot ve RE tanıma bölgesine sahip iki farklı primer setinin aktivitesi ile gerçekleşir - İlk set primer RE tanıma bölgesine sahip - Diğer ikinci primer seti ise ilk primerlerin açıkladığı RE tanıma bölgesine hızla bağlanır - M.tuberculosis komplekse özgül IS6110 ve tüm mikobakterilerde bulunan 16S rrna hedef dizileri birlikte çoğaltıldığından M.tuberculosis tür tayini yapabilmekte - Toplam test süresi yaklaşık 3 saat

45 Bu sistemle 3 saat gibi bir sürede sonuçlar alınabilmektedir. MTBC çalışmalarında direk solunum yolu örneklerinden sistemin duyarlılığı yaklaşık % özgüllüğü % arasında bulunmuştur BD probetec ET (Becton Dickinson Biosciences) Bu sistem floresan deteksiyon sistemi ile birleştirilmiştir Bu sistemde M. tuberculosis complex in IS6110 geni ile 16S rrna geni (rdna) birlikte çoğaltılır

46 Yeni geliştirilen bir yöntem; İlmiğe Dayalı İzotermal Çoğaltma Yöntemi (Loop-Mediated Isothermal Amplification: LAMP) Sabit bir sıcaklıkta (65 C) nükleik asit çoğaltma yöntemidir. Dört adet primer kullanılır. Duyarlılık ve özgüllük PCR dan daha yüksektir. Birkaç DNA kopyası, bir saat içinde milyarlarca kopya halinde çoğaltılabilir.

47 Yeni geliştirilen bir yöntem; LAMP Yöntemi; Kapalı bir sistem olduğu için kontaminasyon riski azdır Farklı miktarlardaki yabancı DNA, yöntemin duyarlılığını etkilemez. Dört primerle altı farklı bölgenin tanınması gerektiği için, özgüllük ve duyarlılık yüksektir. Uygulanması kolaydır. Sıcaklık değişiklikleri için zaman kaybı olmadığından, daha hızlı sonuç alınan bir yöntemdir.

48 8- Prob Hibridizasyon ve Sinyal Amplifikasyon Teknikleri Bu yöntemlerin bir çoğunda propların sinyallerle işaretli olması nedeniyle, bu metotlara sinyal amplifikasyon yöntemleri de denmektedir Bu sistemlerde genel olarak iki farklı prob kullanılmakta ve problardan biri hedef nükletotit dizilimlerine bağlanırken sinyal taşıyan diğer prob ise birinci proba bağlanmaktadır Sonuç olarak ortaya sinyal gücü ölçülerek sonuçlar değerlendirilir

49 Bu yöntemin modifikasyonlarından biri branched DNA (bdna)dır ve ELISA yı anımsatmakta Katı bir faza bağlı ve hedef DNA ya spesifik olan probların olduğu ortama hedef DNA lar ilave edilmekte Sonra sırasıyla, spesifik problar, bdna lar ve alkalen fosfataz bağlı problar ilave edilerek bunların da bdna lara bağlanması sağlanır. En son olarak sisteme alkalen fosfatazla reaksiyona giren kromojen ilave edilerek renkli ürünler oluşturulur.

50

51 Bir diğer sinyal amplifikasyon ve prob hibridizasyon tekniği de hibrid yakalama (hybrid capture) yöntemidir. Bu yöntem de bir çok bakımdan ELISA ya benzerlik gösterir. Yöntemde prob olarak hedef spesifik bölgeyi tanıyan RNA lar kullanılır. Elde edilen DNA-RNA lar bu yapıya spesifik olan antikorların bulunduğu katı faza ilave edilir. Ortama enzim bağlı olan anti- DNA-RNA ları ve en son olarak da kromojen ilave edilir

52 Son yıllarda geliştirilen diğer bir prob hibridizasyon yöntemi peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA-FISH) yöntemidir. Bu yöntemde Mycobacterium tuberculosis complex in 16S RNA larını hedef alan floresanla işaretli peptit nükleik asit probları kullanılarak doku ve klinik örneklerde tür düzeyinde deteksiyon ve identifikasyon yapılabilmektedir

53 Nükleotit amplifikasyonları yapılmadan prob teknikleri, kültürde üretilmiş bakterilerin identifiye edilmesinde kullanılmaktadır (The AccuProbe System; Gen-Probe, San Diego California). Ancak bunların direkt klinik örneklerde kullanımları durumunda duyarlılıkları düşüktür. Nükleik asit amplifikasyonla birlikte prob tekniğinin kullanımı metodun duyarlılığını oldukça artırmaktadır.

54 Ticari olarak, Cobas Amplicor MTB ve Line Probe Assay sistemleri mevcuttur. Bakterinin 16S veya 23S RNA genine özgül ve biyotinle de işaretli primerler kullanılarak amplifikasyon sağlanır. Amplikorlar M. tuberculosis e özgül probların bağlı olduğu manyetik partiküller tarafından yakalanır. Görüntüleme biyotine güçlü bağlanan yabanturpu ile işaretli avidin ve kromojen (TMB) kullanılır. İnternal kontrol sistemde mevcutdur.

55 Sonuçlar fotometrik ölçümlerle değerlendirilir. Sistemler yaklaşık 4 saatte sonuç vermektedir. Duyarlılığının ve özgüllüğü klinik örneklerin tipine göre farklılık gösterir. Kültür sonuçları ile kıyaslandığı zaman solunum sisteminde duyarlılığı % 60-86, özgüllüğü ise yaklaşık % arasındadır

56 9- DNA Microarray Dot blot hibridizasyon yöntemine benzerlik göstermektedir İşaretli amplikonların, farklı oligonükleotid prob içeren dar bir alanda yüzlerce spesifik probla hibridize olması temin edilir İşaretli sinyaller gerçek zamanlı PCR da değerlendirildiği gibi miktar olarak ölçülür Mikroorganizmaların genetik dizilimlerinin hızla ortaya konması çip sayısı artmaktadır

57 Klinik örneklerde kullanılmakla birlikte, daha sıklıkla ilaç dirençlerinin belirlenmesi çalışmalarında tercih edilmektedir M. tuberculosis genomu için ticari olarak üretilmiş (Operon/Qiagen) microarray çipleri bulunmaktadır

58 Yeni geliştirilen bir yöntem; 10- LabMAB sistem (Luminex, Austin, TX) LabMAB sistem, flow sitometri tipi enstürmanların kullanıldığı bir tekniktir. Bu sistemde çift renkli floresan polisitren mikro küreler, lazer sistem ve taşıyıcı sistemler mevcuttur Hedef bakterilerin 23S rrna korunmuş dizilimlerine karşılık gelen yakalama probları PCR ürünlerini yakalanır ve yakalanan PCR ürünlerinin miktar tayini ölçülebilir

59 Geliştirilmekte olan diğer moleküler yöntemler; Elektriksel Biyoçip -Tek iplikli yakalama probları bir elektrod üzerinde depolanır ve daha sonra hedef DNA lar hibridizasyon ile problar tarafından yakalanır Pyrosequencing -Bakterilerin sınıflandırılması, identifikasyonu ve alt tiplendirme için yeni bir yaklaşımdır. Kısa DNA dizinlerinin tespit edilmesi için hızlı gerçek zamanlı bir yöntemdir

60 Bu teknik kısa DNA dizilimlerinin sekanslanması için hızlı gerçek zamanlı metot olarak değerlendirilmektedir. Metotta öncelikle sekanslanacak DNA kısmı PCR ile çoğaltılır. PCR dan sonra tek tiplikli PCR ürünleri purifiye edilir ve bu ürünler sekanslama primerleri, polimeraz ve dört dntp nin her biri ile karıştırılır.

61 Her bir dntp nin başarılı olarak eklenmesi bir pirofosfatı serbest bırakır. Bu reaksiyon sonucunda ATP ler luciferinin oksiluciferine dönüşümünü sağlanır ve reaksiyonlar CCD kameralarla belirlenir.

62 Farklı klinik örnekler için NAA testlerinin özgüllük ve duyarlılıkları Mikroskopi (+) pulmoner ör. Duyarlılık Özgüllük Mikroskopi (-) pulmoner ör Duyarlılık Özgüllük Ekstrapulmoner ör. Duyarlılık Özgüllük Amplicor > > > 95 AMTD > > > 95 BD ProbeTec > 90 Real-Time PCR Dr. MTBC Screen LCx Piersimoni C & Scaudio C.J Clin Micobiol 2003;41: (Review) J Clin Microbiol 2004:42: Fegou et al. Clin Microbiol Infect 2005;11:593-6.

63 Moleküler tanı testleri hangi durumlarda kullanılmamalıdır? Mikroskopi negatif ve klinik şüphe düşükse Hasta anti-tuberküloz tedavi alıyor ise NAA testleri canlı/ölü basil ayrımı yapamaz. FDA, NAA testlerini, 7 günden daha fazla anti-tüberküloz ilaç almamış veya son 12 ay içerisinde ilaç almamış hastalar için önermektedir Expert Rev Mol Diagn. 2006;6(3): Nahid et al. Proc Am Thorac Soc. 2006;3: Pai M. National Med J Indian 2004;17:

64 NAA testleri hangi durumlarda yararlı olabilir? Mikroskopi pozitifliğinin M. tuberculosis e ait olduğunu doğrulama. Bu uygulama,» TB tedavisinde mikroskopi sonuçlarının baz alındığı, TB insidensinin yüksek olduğu ülkeler için geçerli değil. Fakat,» Tüberküloz dışı mikobakteriyel infeksiyonların yaygın olduğu alanlar ile bazı hastalarda (AIDS) faydalı olabilir TB açısından yüksek riske sahip ciddi bir hastalığı olanlar Tüberküloz şüphesi yüksek, fakat mikroskopi negatif olgulardaki TB tanısı Ağır immun yetmezliği olan AIDS veya organ transplantasyonu yapılmış olan hastalar ile pürülan olmayan menenjitli hastalar Biyopsi, cerrahi veya diğer invaziv işlemlerle alınmış materyallerde Orijini bilinmeyen pulmoner hastalığı olan bir hastada, TB elimine etmek amacıyla kullanılabilir Roth et al. Eur Respir J 1997;10:

65 NAA testlerinin sonuçlarının kliniğe yansıması Mikroskopi ve NAA testlerinin her ikisi birlikte (+)ise; Hasta TB olarak değerlendirilebilir Mikroskopi ve NAA testlerinin her ikisi birlikte (-)ise; Büyük bir olasılıkla TB değil, fakat; Klinik bulgular çok önemli, negatif NAA testleri aktif TB elimine etmede yetersiz olabilir İki testin sonuçları farklı ise; TB tanısı klinik bulgulara veya tekrarlanan test sonuçlarına göre konulmalıdır

66 Tüberküloz PZR Sonuçlarının Değerlendirilmesi PZR NEGATİF PZR NEGATİF PZR POZİTİF PZR POZİTİF ARB NEGATİF ARB POZİTİF ARB POZİTİF ARB NEGATİF RAPOR NEGATİF Yeni bir örnekle tekrar RAPOR POZİTİF Yeni bir örnekle tekrar PZR POZİTİF PZR NEGATİF PZR POZİTİF PZR NEGATİF RAPOR POZİTİF Yeni bir örnekle tekrar ŞÜPHELİ POZİTİF Yeni bir örnekle tekrar PZR POZİTİF PZR NEGATİF PZR POZİTİF PZR NEGATİF RAPOR POZİTİF Atipik mikobakter i ŞÜPHELİ POZİTİF RAPOR NEGATİF

67 TB Tanısında Moleküler Ticari Sistemlerin Avantajları Hızlı (saatler içerisinde) ve güvenilir tanı sağlaması Uygulama kolaylığı (otomatize veya yarı otomatize) Duyarlılık ve özgüllüklerinin yüksek olması Pozitif ve Negatif prediktif değerlerinin yüksek olması Birçok patojene uygulanabilir olması Patojenleri tür düzeyinde ayırt edebilmesi Etkene ait daha fazla bilgi verebilmesi FDA onaylı ve /veya CE sertifikası olması Prosedür ve reaktiflerin standardize olması

68 TB Tanısında Moleküler Ticari Sistemlerin Dezavantajları Maliyet yüksek Sistemin kurulmasında ve effektif kullanımında önem arzeden kriterlerin doğru analizi gerekir Kurumda yıllık smear (+) örnek sayısı smear (+) örnekli hastalar arasında yıllık relatif pulmoner tbc prevalansı, Günlük Hasta Solunum izolasyon ve Tedavi maliyeti Test reagentlarının maliyeti Journal of Clinical Microbiology, Mar.2003, p

69 Sonuç olarak, Laboratuvar tanıda moleküler yöntemler ve ticari sistemler; TB şüpheli hastaların,özellikle smear (+) solunum örneklerinde Hastalığın eradikasyonu için mücadelede, Tedavinin yönlendirilmesinde, etkili görünmektedir. Mevcut ticari ürünler tek başına tarama amaçlı kullanılmamalı, Konvansiyonel yöntemlerin altın standart olduğu unutulmamalı

70 TEŞEKKÜRLER