Mesane Tümörlerinde K-Ras ve H-Ras Geni Exon 1 Kodon de Mutasyon Taraması

Transkript

1 Mesane Tümörlerinde K-Ras ve H-Ras Geni Exon 1 Kodon de Mutasyon Taraması Dr.Davut ALPTEKIN 1, Dr.Müzeyyen İZMIRLI 1, Dr.Yıldırım BAYAZIT 2, Dr.H.Ümit LÜLEYAP 1, Dr.Ali İ. GÜZEL 1, Dr.Zühtü TANSUĞ 2 Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji 1 ve Üroloji 2 Anabilim Dalı, 01330, Balcalı, ADANA. ÖZET AMAÇ: Gelişmiş ülkelerin çoğunda kanser ölümlerinin önemli nedenlerinden biri mesane kanserleridir. Mesane kanserinin oluşum nedenlerinin başında ise Ras proto-onkogen ailesindeki (H-ras, K-ras, N-ras) nokta mutasyonları gelmektedir. Bu genlerdeki mutasyonlar da çoğunlukla kodon 12, 13 ve 64 de (sırasıyla H-, K- ve N-ras) oluşmaktadır. Bu çalışmada Ç.Ü. Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı na müracaat eden ve mesane kanseri nedeniyle ameliyat olan hastalarda K-ras ve H-ras genlerinin mesane kanseri ile ilişkisinin araştırılması amaçlandı. YÖNTEM: Bu çalışmada mesane kanseri olan 22 hastanın mesanelerinden alınan ameliyat materyallerinden genomik DNA sı izole edilerek K-ras geninde kodon 12 ve 13 için, H-ras geninde ise kodon 12 için PCR temeline dayalı RFLP (Restriction Fragment Leng Polimorfizm) tekniği ile mutasyon taraması yapıldı. K-ras geninde mutasyon varlığı/yokluğu ayrıca sekans analizi ile de test edildi. H-ras geni kodon 12 için sadece RFLP tekniği uygulandı. SONUÇLAR: RFLP yöntemi ile K-ras geni kodon 12 ve 13 de mutasyon bulunamadı. H-ras geni kodon 12 de ise sadece RFLP yöntemi sonucunda 12 hastada mutasyona rastlandı. Ancak bulunan mutasyonların %13.6 sı homozigot iken %40.9 unun heterozigot olduğu saptandı. YORUM: Mesane kanserinin oluşumunda K-ras geninin sorumlu olmadığını, ancak H-ras geninin sorumlu olabileceğini düşünmekteyiz. Bizim bulgularımız yapılan çalışmalarla da uygunluk göstermektedir. Anahtar Sözcükler: K-ras, H-ras, Mesane tümörü GİRİŞ Kanser oluşumunda ras protoonkogenlerindeki nokta mutasyonlarının önemi oldukça büyüktür. Ras protoonkogen ailesi amino asitlik, 21 kda luk guanin nükleotid bağlayan bir protein kodlar ve H-ras, K-ras, N-ras dan oluşur 2,4,12. K-ras 12. kromozom, H-ras 11. kromozom, N-ras ise 1. kromozom üzerinde haritalanmıştır. K-ras geni 12. kromozomun kısa kolu üzerinde bulunması ve de 21 kda ağırlığında protein kodlaması nedeniyle K-ras proteinine p21 ras da denir. Ras gen ailesi 6 ekzonlu olup ekzonlar genin aktivitesine göre ekzon 0, 1, 2, 3, 4a, 4b olarak isimlendirilmektedir. Ekzon amino asit kodlar. Buna ya ekzon 4a nın kodladığı 38 amino asit, ya da ekzon 4b nin kodladığı 39 amino asit eklenerek 188 veya 189 amino asitli ras proteini oluşur. Ras gen ailesinin K, N ve H-ras olarak isimlendirilmeleri 12. ve 61. kodondaki değişik aminoasitlere göre yapılır. Ras protoonkogeni 12. kodonda glisin, 61. kodonda ise glutamat içerir. 12. kodon arjinine dönüşmüş ise K- ras onkogeni, 61. kodon arjinine dönüşmüş ise N- Geliş Tarihi: Kabul Tarihi:

2 Alptekin ve ark. Ç.Ü. Tıp Fakültesi Dergisi ras onkogeni, 61 kodon lösine dönüşmüş ise H-ras MATERYAL VE METOD onkogeni olarak isimlendirilir 15. Çalışma materyali Ç.Ü. Tıp Fakültesi Üroloji Normal hücrelerde ras onkogenleri bulunmaz, Anabilim Dalı tarafından mesane tümörü saptanan genellikle tümör gelişimi sırasında gerçekleşen 22 hastanın ameliyatla çıkarılan dokularından mutasyonlar sonucunda tümör hücrelerinde ortaya temin edildi. Örneklerin sadece tümör dokusu çıkar. Ras onkogeni ile hücresel protoonkogen olmasına dikkat edildi. Tümörün hangi evrede arasındaki tek fark kritik bölgede gerçekleşen bir olduğuna bakılmadı. Hastalara ameliyat öncesi tek aminoasit değişimidir. Bu değişimin kodon 12, hormon, ışın ve kemoterapi gibi tedavi yöntemleri 13 ve 61 deki değişimlerdir. uygulanmadı. Hastaların tamamı erkek olup Ras gen ailesi insan kanserlerinde en sık yaşları arasında değişmektedir. genetik geçişli onkogen ailesidir ve aktivasyonları Alınan doku örneklerinden Sambrook ve da oldukça değişkendir. Farklı doku veya organa arkadaşlarının yöntemi esas alınarak genomik özgü olarak mutasyonlu genin aktivitesinde de DNA izolasyonu yapıldı 17. Genomik DNA örnekleri farklılıkların olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle -20 o C de saklandı. K-ras geni ekzon 1, kodon 12 hematopoietikten oluşan kanserlerde N-ras geni ve 13 için oligonükleotid primerleri hazırlandı. mutasyonlarının etkili olduğu saptanmıştır 3,10. Forward primer; 5 -ATT ATA AGG CCT GCT GAA Epitel hücrelerden oluşan kanserlerde ve AAT GAC TGA-3, Reverse primer; 5 -ATA TGC pankreatik kanserlerde ise K-ras geni ATA TTA AAA CAA GAT TTA CCT CTA-3. Bu mutasyonlarının etkili olduğu saptanmıştır 1,2,11,19. primerler kullanılarak 155bç lik PCR ürünü elde İnsan tümör örnekleri ile yapılan çalışmalarda aktif edildi. Ayrıca K-ras geni Ekzon 1 deki nokta ras formunda K-ras mutasyonları gözlenmiştir 6. mutasyonlarına dizi analizi ile bakmak için Ras gen ailesinin üç üyesi de (H, K ve N-ras) primerler ayrıca hazırlandı (Forward primer: 5-AAC insan kanserlerinde en sık görülen onkogenlerdir. CTT ATG TGT GAC ATG TTC TAA-3, Rewerse Tüm insan kanserlerinin %20 sinde, akciğer primer: 5-CCT TTA TCT GTA TCA AAG AAT GGT kanserlerinin %25 inde, barsak kanserlerinin C-3). Bu primerler kullanılarak 239bç lik PCR %50 sinde, pankreas kanserlerinin %90 ında K-ras ürünü elde edildi. H-ras geni ekzon 1, kodon 12 geni mutasyonlarının neden olduğu bilinmektedir 7. için Haliassos ve arkadaşlarının oligonükleotid Mutasyonlar en sık olarak H-Ras geninde 12., K- primerleri kullanıldı 9. Forward primer; 5 -GAC GGA ras geninde 12. ve 13., N-ras geninde ise 61. ATA TAA GCT GGT GG-3, Reverse primer; 5 - kodon da oluşmaktadır. Mesane kanserleri ile AGG CAC GTC TCC CCA TCA AT-3. Bu primerler yapılan bir çalışmada ise H-ras genin 12. kullanılarak 420bç lik PCR ürünü elde edildi. kodonunda %84 oranında, K-ras geninin ise 12. PCR reaksiyonu için toplam volüm 50µl olacak kodonunda %5.2 oranında mutasyon olduğu şekilde ayarlandı. 5µl 10X PCR tamponu, 3µl 2.5 bulunmuştur 16. M dntp, 1µl pimer karışımı (içerisinde her bir Bu çalışmada Ç.Ü. Balcalı Hastanesi Üroloji primerden 100ng bulunmakta), 40µl deiyonize su, Anabilim Dalı ameliyat materyallerinden temin 1µl DNA ve 1µl Taq Polimeraz enzimi (MBI edilen mesane tümör örneklerinde K-ras geninin 1. Fermentas) PCR için özel ependorf tüplerine ekzonunun 12. ve 13. kodonunda H-ras geninin konuldu. Santrifüjde karışımı sağlandıktan sonra ise yine 12. kodonunda mutasyon taraması Thermal Cycler (Eppendorf marka) a konuldu. yapılması amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak Thermal Cycler ın PCR koşulları; 94 o C de 5 dakika elde edilen genomik DNA lardan PCR (polimeraz ön denatürasyon, 94 o C de 30 döngü zincir reaksiyonu) temeline dayalı RFLP (parça denatürasyon, 62 o C de 30 saniye yapışma ve uzunluk polimorfizmi) ve dizi analizi yöntemi ile 72 o C de 30 saniye sentezden oluşturuldu. mutasyon taraması yapılmıştır. 30

3 Cilt 32 Yıl 2007 Mesane Tümörlerinde K-Ras ve H-Ras Geni... K-ras için çoğaltılan PCR ürünü kodon 12 (GGT) ve 13 (GGC) de mutasyon varlığını saptamak için Mva I (CC WGG, MBI Fermentas) enzimi ile kesildi. Ayrıca PCR ürünleri; içerisinde 0,5 g/ml Ethidium bromide bulunan %2 lik agaroz jelde Qiagen pürifikasyon kiti ile temizlenip kontrol elektroforezine tabi tutuldu. Her bir örnek Aplied Biosystem 377 otomatik DNA sekans cihazı ile analiz edildi. Örneklere ait elde edilen dizi analizi sonuçları K-ras veri bankasından elde edilen referans diziye göre karşılaştırıldı. H-ras için çoğaltılan PCR ürününde ise sadece kodon 12 de mutasyon varlığı araştırıldı. Çoğaltılan bölge (420bç) Msp I (MBI Fermentas) enzimi ile kesildi. Kodon 12 de mutasyon olmayan örneklerde 355, 35, 30bç uzunluğunda üç bant elde edilirken, mutasyon saptanan örneklerde 385 ve 35bç uzunluğunda iki bant elde edildi. Şekil 1: K-ras geni PCR ürünlerinin MvaI enzimi ile kesimleri (Mutasyon olmadığı için PCR ürünleri ile aynı gözükmektedir). BULGULAR K-ras geninde 155 bç lik PCR ürünü elde edildi. Kodon 12 (GGT) Mva I enzimi ile kesildi. Ancak bu enzim ilgili kodonlarda yani kodon 12 de değişim olduğunda kesim yapması gerekiyordu. Yani mutasyon varlığında kesim olacak, yapılan elektroforezde de 105 ve 50 bç lik iki bant elde etmemiz gerekecekti. Yapılan elektroforezde bu bantların olmayışı K-ras geni kodon 12 de mutasyon olmadığını gösterdi (Şekil 1). Aynı örnekler Aplied Biosystem 377 DNA Sekans cihazı ile analiz edildi. Burada da hem kodon 12, hem de kodon 13 de homozigot/heterozigot mutant örneklere rastlanılmadı (Şekil 2). 31

4 Alptekin ve ark. Ç.Ü. Tıp Fakültesi Dergisi Şekil 2: K-ras geni PCR ürünlerinin Aplied Biosystem 377 DNA Sekans cihazı ile analiz sonucu baz dizilimi (Kodon de mutasyon yok). H-ras geni kodon 12 için ise 420bç lik PCR ürünü elde edildi. Bu ürün kodon 12 de mutasyon taraması için Msp I enzimi ile kesildi. Kodon 12 de mutasyon olmayan örneklerde 355, 35, 30 bç uzunluğunda üç bant elde edilirken mutasyon saptanan örneklerde 385 ve 35bç uzunluğunda iki bant elde edildi. Ancak jel elektroforezinde küçük bantlar belirgin olarak birbirinden ayrılmadığı için 385 ve 355 bç uzunluğundaki bantlar dikkate alınarak değerlendirildi (Şekil 3). Örneklerin elektroforez bantlarının değerlendirilmesi sonucunda 3 örneğin (%13.6) homozigot mutant olduğu, 9 örneğin (%40.9) heterozigot mutant olduğu, 10 örneğin (%45.5) ise sağlam olduğu bulundu. Şekil 3: H-ras geni PCR örneklerinin Msp I enzimi ile kesimleri (PCR: kesilmemiş PCR ürünü, 1:Homozigot mutant, 2,9,10:Sağlam, 3-8:Heterozigot mutant). 32

5 Cilt 32 Yıl 2007 Mesane Tümörlerinde K-Ras ve H-Ras Geni... TARTIŞMA VE SONUÇ Mesane tümörü saptanan 22 hastanın ameliyatla çıkarılan dokularında yaptığımız çalışmadan elde edilen sonuçlara göre K-ras geninde hem RFLP hem de otomatik sekans analizi ile herhangi bir mutasyon bulunamaması mesane kanseri ile bu genin ilişkili olmadığını göstermektedir. Ancak yapılan çalışmalarda epitel hücrelerden oluşan kanserlerde ve pankreatik kanserlerde K-ras geni mutasyonlarının etkili olduğu bildirilmiştir 1,2,11,19. Yine kalın bağırsak kanserlerinde K-ras geni kodon 12 ve 13 deki mutasyonların %11 oranında olması 20, bir başka çalışmada da kolon ve rektum kanserlerinde %76 DNA tamir genlerinin, spesifik kromozom lokuslarının allel kaybının (9q ve 11p) da neden olduğu bildirilmiştir 5,8,12. Yine K-ras ve H-ras genlerinin fosfolipaz D yi aktive ederek insan kanserlerinin oluşumunda önemli rol oynadığı da bildirilmiştir 18. Sonuç olarak daha önce yapılan çalışmalara ve kendi bulgularımıza göre mesane kanserine birçok genin yanında ras gen ailesinden H-ras geninin de neden olabileceğini düşünmekteyiz. SUMMARY Detection of Mutations in Codon 12 and 13 of Exon 1 of K-Ras and H-Ras Genes in Patients with Urinary Bladder Cancers oranında sadece kodon 12 mutasyonunun AIM: In most of the developed countries, olması 21, bu genin kolon kanserlerinden sorumlu urinary bladder cancers are one of the most olabileceğini göstermektedir. Bizim çalışmamızda important causes of death. Primary cause for the mesane dokusunda epitel orijinli kanser urinary bladder cancer formation is the point olabileceği düşünülmesine rağmen, K-ras geninde mutations that occur in Ras proto-oncogene family mesane tümörleri ile yapılan bir çalışmada 12. (H-ras K-ras and N-ras). Mutations in these genes kodon da %5.2 oranında da mutasyon olduğu are generally originated in codons 12, 13, and 64 bildirilmesine rağmen 16, bu geninin mesane of H-ras, K-ras, and N-ras genes, respectively. In tümörleri ile ilişkili olmadığını düşündürmektedir. this study it was aimed to investigate the H-Ras geninde 12. kodonun mutasyonu sonucu relationships between mutations in K-ras and H- glisin amino asidi valin e dönüşümü ile onkogenik ras genes with bladder cancer in patients who form oluşmaktadır. H-ras normalde 21kDa luk were consulted to urology department of Medical guanin nükleotid bağlayan protein olması Faculty at Cukurova University and operated due nedeniyle GTPaz fonksiyonu normaldir. Ancak to urinary bladder cancer. glisinin valin e değişimi nedeniyle proteinde oluşan METHOD: In this study, genomic DNAs of 22 değişiklik sonucu hücre yüzeyine sürekli sinyal patients were isolated from surgically excised göndermesi ile sonuçlanmaktadır. Gönderilen bu bladder samples. PCR-RFLP methods were sinyal ile hücre kanser dokusuna dönüşmektedir 12- performed for detection of mutations in codons H-ras geninde ise K-ras geninden farklı olarak and 13 of K-ras and codon 12 of H-ras genes. In 12. kodonunda %13.6 oranında homozigot mutant, addition, the codons of K-ras gene were inspected %36.4 oranında ise heterozigot mutant olduğunun using sequence analysis for other possible bulunması mesane kanseri ile H-ras geninin ilişkili mutations. olabileceğini düşündürmektedir. Mesane kanserleri RESULT: As a result, we did not detect any ile yapılan bir çalışmada da H-ras genin 12. mutations in codon 12 and 13 of the K-ras gene, kodonunda %84 oranında mutasyon olduğu bildirilmiştir 16 but we detected several mutations in codon 12 of. Yapılan çalışmalarda mesane H-ras gene in 12 patients using PCR-RFLP kanserinin sadece ras gen ailesine bağlı olmadığı, method. Of these, 13.6% were homozygous and bunun yanında tümör süpressör genlerin (p % were heterozygous. inaktivasyonu), hücre siklusu genlerinin (p15, p16), 33

6 Alptekin ve ark. Ç.Ü. Tıp Fakültesi Dergisi COMMENT: We propose that, H-ras gene may be responsible for urinary bladder cancer formation. Our findings are also in accordance with the previous studies. Key Words: K-ras, H-ras, Urinary bladder tumours KAYNAKLAR 1. Almoguera C, Shibata D, Forrester K, Martin J, Arnheim N, Perucho M.Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-k-ras genes. Cell, 53(4):549-54, Barbacid M. Ras genes. Annu Rev Biochem, 56: , Bartram CR, Ludwig WD, Hiddemann W, Lyons J, Buschle M, Ritter J, Harbott J, Frohlich A, Janssen JW. Acute myeloid leukemia: analysis of ras gene mutations and clonality defined by polymorphic X- linked loci. Leukemia, 3(4):247-56, Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res, 49(17): , Brandau S, Böhle A. Bladder cancer. I. Molecular and genetic basis of carcinogenesis. Eur Urol. 39:491-7, Clark GJ, Der CJ. Onkogenic activation of ras proteins. Handbook of Experimental Pharmacology, GTPases in Biology,108(1): , Cooper GM. The Cell (A Molecular Approach). Washington: ASM Pres D C , , Habuchi T, Ogawa O, Kakehi Y, Ogura K, Koshiba M, Hamazaki S, Takahashi R, Sugiyama T, Yoshida O. Accumulated allelic losses in the development of invasive urothelial cancer. Int J Cancer. 53:579-84, Haliassos A, Liloglou M, Likourinas M, Doumas C, Ricci N, Spandidos DA. H-ras oncogene mutations in the urine of patients with bladder tumors: description of a novel noninvasive method for the detection of neoplasia. Int J Oncol 1: , 1992, 10. Hirai H, Kobayashi Y, Mano H, Hagiwara K, Maru Y, Omine M, Mizoguchi H, Nishida J, Takaku F. A point mutation at codon 13 of the N-ras oncogene in myelodysplastic syndrome. Nature, 327(6121):430-2, Hruban RH, van Mansfeld AD, Offerhaus GJ, van Weering DH, Allison DC, Goodman SN, Kensler TW, Bose KK, Cameron JL, Bos JL. K-ras oncogene activation in adenocarcinoma of the human pancreas. A study of 82 carcinomas using a combination of mutant-enriched polymerase chain reaction analysis and allele-specific oligonucleotide hybridization. Am J Pathol, 143(2):545-54, Li C, Teng RH, Tsai YC, Ke HS, Huang JY, Chen CC, Kao YL, Kuo CC, Bell WR, Shieh B. H-Ras oncogene counteracts the growth-inhibitory effect of genistein in T24 bladder carcinoma cells. Br J Cancer. 92:80-8, Öner C. Genetik Kavramlar. 6. Baskı Palme Yayıncılık. (William S. Klug and Michael R.Cummings. Concepts of Genetics, 6 th Edition, Prentice Hall, , New Jersey, USA), 816s, Ankara, Oxford G, Theodorescu D. Ras superfamily monomeric G proteins in carcinoma cell motility. Cancer Lett, 189: , Oxford G, Theodorescu D. The role of Ras superfamily proteins in bladder cancer progression. J Urol, 170: , Przybojewska B, Jagiello A, Jalmuzna P. H-RAS, K- RAS, and N-RAS gene activation in human bladder cancers. Cancer Genet Cytogenet, 121(1):73-7, Samrook J, Fritsch EF and Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manuel. 2 th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 1:3-4, 15, Shi M, Zheng Y, Garcia A, Xu L, Foster DA. Phospholipase D provides a survival signal in human cancer cells with activated H-Ras or K-Ras. Cancer Lett. 258: , Stork P, Loda M, Bosari S, Wiley B, Poppenhusen K, Wolfe H. Detection of K-ras mutations in pancreatic and hepatic neoplasms by non-isotopic mismatched polymerase chain reaction. Oncogene, 6(5):857-62, Wistuba II, Behrens C, Albores-Saavedra J, Delgado R, Lopez F, Gazdar AF. Distinct K-ras mutation pattern characterizes signet ring cell colorectal carcinoma. Clin Cancer Res, 9:3615-9, Yamagata S, Muto T, Uchida Y, Masaki T, Sawada T, Tsuno N, Hirooka T. Lower incidence of K-ras codon 12 mutation in flat colorectal adenomas than in polypoid adenomas. Jpn J Cancer Res, 85:147-51, Yazışma Adresi Prof.Dr.Davut ALPTEKİN Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Balcalı/ADANA 34