LACTOBACİLLUS VE BİFİDOBACTERİUM CİNSİ BAKTERİLERİN BETA GALAKTOSİDAZ ENZİM AKTİVİTELERİ YASEMİN KILIÇ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ

Transkript

1 LACTOBACİLLUS VE BİFİDOBACTERİUM CİNSİ BAKTERİLERİN BETA GALAKTOSİDAZ ENZİM AKTİVİTELERİ YASEMİN KILIÇ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ŞUBAT 2013 ANKARA

2 Yasemin KILIÇ tarafından hazırlanan LACTOBACİLLUS VE BİFİDOBACTERİUM CİNSİ BAKTERİLERİN BETA GALAKTOSİDAZ ENZİM AKTİVİTELERİ adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Doç. Dr. Zehra Nur YÜKSEKDAĞ Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı.. Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Belma ASLIM Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi.. Doç. Dr. Zehra Nur YÜKSEKDAĞ Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi.. Yrd. Doç. Dr. Selcen BABAOĞLU AYDAŞ Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, Gazi Üniversitesi.. Tez Savunma Tarihi: 14/02/2013 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Şeref SAĞIROĞLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü..

3 TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Yasemin KILIÇ

4 iv LACTOBACİLLUS VE BİFİDOBACTERİUM CİNSİ BAKTERİLERİN BETA GALAKTOSİDAZ ENZİM AKTİVİTELERİ (Yüksek Lisans Tezi) Yasemin KILIÇ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Şubat 2013 ÖZET Bu çalışmada, Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoteknoloji Laboratuvarı kültür koleksiyonunda bulunan insan, gıda ve hayvan kaynaklı olmak üzere 39 adet Lactobacilllus cinsine ait ve yenidoğan gaitasından izole edilmiş olan 3 adet Bifidobacterium cinsine ait toplam 42 adet bakteri kullanılmıştır. O-nitrofenilbeta-D-galaktosid (o-npg) substrat olarak kullanılarak, kültürlerin β- galaktosidaz enzim aktiviteleri belirlenmiştir. Suşların enzim aktiviteleri değerlendirildiğinde, Lactobacillus cinsine ait kültürlerden L. fermentum ZYN17 (2,468±0,000 U/mg), L. acidophilus BAZ36 (0,947±0,052 U/mg), L. rhamnosus GD11 (1,034±0,027 U/mg) ve L. casei LB65 (1,116±0,036 U/mg) suşlarının, Bifidobacterium cinsine ait kültürlerden de Bifidobacterium breve A26 (0,726±0,032 U/mg) suşunun en yüksek spesifik enzim aktivitesi yeteneğine sahip oldukları belirlenmiştir. Yüksek spesifik β-galaktozidaz enzim aktivitesi gösterdiği belirlenen kültürlerde farklı ph, sıcaklık ve tamponların enzim aktivitesi üzerinde etkisinin belirlenmesi ile, optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Kültürlerin ph 6,8, 37ºC ve potasyum fosfat tamponunda en yüksek spesifik enzim aktivitesi yeteneğine sahip oldukları gözlenmiştir. Suşların farklı konsantrasyonlarda substrat (laktoz) içeren besiortamlarında geliştirilmesi durumunda, en yüksek enzim aktivitesi %6 laktoz içeren besiortamında belirlenmiştir. Yapay mide suyunda, ph 7,0 da Lactobacillus fermentum ZYN17 suşu 2,262±0,000 U/mg ile en yüksek spesifik enzim aktivitesine sahipken, ph

5 v 7,5 te 1,686±0,000 U/mg ile L. fermentum ZYN17 suşu yapay bağırsak sıvısında en yüksek β-galaktozidaz spesifik enzim aktivitesi göstermiştir. β-galaktozidaz spesifik aktivitesi üzerine, enzim ekstraksiyon yöntemlerinden kimyasal yöntemlerden Triton X-100 ün en etkili yöntem olduğu belirlenmiştir. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Lactobacillus, Bifidobacterium, β-galaktosidaz Sayfa Adedi : 103 Tez Yöneticisi : Doç. Dr. Zehra Nur YÜKSEKDAĞ

6 vi BETA GALACTOSIDASE ENZYME ACTIVITIES OF LACTOBACILLUS AND BIFIDOBACTERIUM GENUS (M.Sc. Thesis) Yasemin KILIÇ GAZİ UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY February 2013 ABSTRACT In this study, human-being, nutritional and animal originated 39 Lactobacillus species and 3 Bifidobacterium isolated from new-born faeces were used. Total 42 bacteria were all from the culture collection of Biotechnology Laboratory of Faculty of Science in Gazi University. β-galactosidase enzyme activities of the cultures were identified by using o-nitrophenyl-b-d-galactopyranoside (o-npg) as a substrate. L. fermentum ZYN17 (2.468±0.000 U/mg), L. acidophilus BAZ36 (0.947±0.052 U/mg), L. rhamnosus GD11 (1.034±0.027 U/mg) and L. casei LB65 (1.116±0.036 U/mg) strains, from Lactobacillus family and Bifidobacterium breve A26 (0.726±0.032 U/mg) strain from Bifidobacterium family had the highest spesific enzyme activity. Optimization studies were carried out with these cultures with high β-galactosidase enzyme activity. Different ph, temperature, buffer and nutritional environment conditions had an effect on the enzyme activity. It is observed that, cultures had the highest spesific enzyme activity at ph 6.8, at 37 C and in potassium phosphate buffer. As the strains were grown up in different concentrations of substrate (lactose) containing nutritional environment, 6 % lactose served for the highest enzyme activity. In the artificial gastric juice, at ph 7.0, Lactobacillus fermentum ZYN17 strain (2.262±0.000 U/mg) showed the highest spesific enzyme activity, while in the artificial intestinal fluid, at ph 7.5, L. fermentum ZYN17 strain (1.686±0.000 U/mg) showed the highest spesific β-galactosidase enzyme activity. Among the chemical

7 vii extraction methods, Triton X-100 was determined as the most effective β- galactosidase enzyme extraction method. Science Code : Key Words : Lactobacillus, Bifidobacterium, β-galactosidase Page Number : 103 Adviser : Assoc. Prof. Dr. Zehra Nur YUKSEKDAG

8 viii TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren, her türlü bilgi ve desteğini benden esirgemeyen saygı değer hocam Doç. Dr. Zehra Nur YÜKSEKDAĞ a sonsuz teşekkür ederim. Ayrıca tez çalışmamın her aşamasında desteğini ve yardımını esirgemeyip geç saatlere kadar beni laboratuvarda yalnız bırakmayan Sayın Berat ÇINAR a çok teşekkür ederim. Araştırmalarım sırasında öneri ve fikirleriyle çalışmalarımın gelişmesine büyük katkısı olan değerli hocalarım Prof. Dr. Yavuz BEYATLI ya, Prof. Dr. Belma ASLIM a, Prof. Dr. Selma ATEŞ e ve Prof. Dr. Elif DEMİRKAN a teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmalarım süresince bilgi birikimi ve yardımlarını esirgemeyen Arş. Gör. Betül AYDIN a, desteklerini benden esirgemeyen tüm Biyoteknoloji Laboratuarı çalışma arkadaşlarıma ve elektroforez deneyinin yapılışında yardımını gördüğüm Uzman Biyolog Sema YİĞİT DOĞAN a teşekkür ederim. Tez dönemim boyunca arkadaşlıkları ile destek olan yakın dostlarıma sonsuz teşekkürler. Bugüne kadar attığım her adımda sonsuz sevgisiyle yanımda olan maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen canım aileme en içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Hayatım boyunca manevi desteğini hep içimde hissedeceğim dayım Mehmet Emin KILIÇ a sonsuz teşekkür ederim. Bu tez kapsamında yapılmış olan çalışmalar, Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri 05/ kodlu projesiyle desteklenmiştir. Maddi desteklerinden dolayı Gazi Üniversitesi Rektörlüğü ne teşekkür ederim.

9 ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... vi TEŞEKKÜR... viii İÇİNDEKİLER... ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ... xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ... xiv RESİMLERİN LİSTESİ... xvi SİMGELER VE KISALTMALAR... xvii 1. GİRİŞ KAYNAK ARAŞTIRMASI Laktoz İntoleransı Laktozun kolonda fermantasyonu Laktoz intolerans semptomları Laktoz intolerans tanısı Probiyotik Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Laktik Asit Bakterileri Lactobacillus cinsi bakterilerin genel özellikleri Bifidobacterium Cinsi Bakterilerin Genel Özellikleri Probiyotiklerin Laktoz İntoleransında Kullanılması Enzimler ve Genel Özellikleri Enzimlerin sınıflandırılması... 18

10 x Sayfa Enzim aktivitesini etkileyen faktörler Enzim aktiflik birimleri β-galaktozidaz Enziminin Genel Özellikleri Beta-galaktozidaz enziminin bulunduğu kaynaklar β-galaktozidaz ın etki mekanizması β-galaktozidaz ın kullanım alanları MATERYAL ve METOT Materyal Araştırmada kullanılan besiyerleri Araştırmada kullanılan tampon ve çözeltiler Enzimin ekstraksiyon yöntemlerinde kullanılan kimyasallar SDS-PAGE için kullanılan çözeltiler Enzimin ekstraksiyon yöntemlerinde kullanılan kimyasallar Metot Bakterilerin aktifleştirilmesi ve gelişme ortamları Bakterilerin muhafazası β-galaktozidaz aktivitesinin X-gal ile belirlenmesi β-galaktozidaz enzim ekstraktının hazırlanması Protein konsantrasyonlarının belirlenmesi β-galaktozidaz enzim aktivitesinin belirlenmesi β-galaktozidaz enziminin optimizasyonu Farklı laktoz (substrat) konsantrasyonlarının enzim aktivitesine etkisi... 43

11 xi Sayfa Yapay mide suyu ve bağırsak sıvısında β-galaktozidaz aktivitesinin belirlenmesi β-galaktozidaz aktivitesi üzerine enzim ekstraksiyon yönteminin etkisi β-galaktozidaz enziminin kısmi saflaştırılması Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) İstatistiksel analiz DENEYSEL BULGULAR β-galaktozidaz Aktivitesinin Belirlenmesi β-galaktozidaz Aktivitesinin X-gal İle Belirlenmesi β-galaktozidaz Enziminin Optimizasyonu Laktobasillerin β-galaktozidazına Farklı Substrat (laktoz) Konsantrasyonunun Etkisi β-galaktozidaz Aktivitesine Yapay Mide Sıvısı ve Bağırsak Sıvısının Etkisi β-galaktozidaz Aktivitesi Üzerine Enzim Ekstraksiyon Yönteminin Etkisi β-galaktozidaz Enziminin Stoklanması β-galaktozidaz Enziminin Kısmi Saflaştırılması Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ..103

12 xii ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Probiyotik olarak kullanılan bakterilerin insan sağlığı üzerindeki yararlı etkileri... 8 Çizelge 2.1. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar... 9 Çizelge 2.3. Probiyotik türlerin seçilmesinde etkili kriterler Çizelge 2.4. Beta-Galaktozidaz Enziminin Bulunduğu Kaynaklar Çizelge 2.5. Farklı kaynaklardan saflaştırılan β-galaktozidazların özellikleri Çizelge 2.6. Beta galaktozidaz tarafından bazı galaktooligosakkaritlerin üretimi Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan suşlar, izolasyon kaynakları ve gelişme sıcaklıkları Çizelge 3.2. SDS-PAGE için kullanılan çözeltiler Çizelge 3.3. Ayırma ve yığma jelinin hazırlanışı Çizelge 4.1. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun beta galaktozidaz enzim aktiviteleri, protein miktarları ve spesifik aktiviteleri Çizelge 4.2. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı tamponlardaki enzim aktiviteleri Çizelge 4.3. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı tamponlardaki protein miktarları Çizelge 4.4. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı tamponlardaki spesifik enzim aktiviteleri Çizelge 4.5. Laktobasillerden ve Bifidobacterium breve A26 suşundan farklı yöntemle elde edilen enzim ekstraktının enzim aktiviteleri Çizelge 4.6. Laktobasillerden ve Bifidobacterium breve A26 suşundan farklı yöntemle elde edilen enzim ekstraktının protein miktarları Çizelge 4.7. Laktobasillerden ve Bifidobacterium breve A26 suşundan farklı yöntemle elde edilen enzim ekstraktının spesifik enzim aktiviteleri... 71

13 xiii Çizelge Sayfa Çizelge 4.8. Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen β-galaktozidaz enziminin kısmi saflaştırma basamaklarında elde edilen bulgular... 74

14 xiv ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. İnce bağırsakta laktoz metabolizması... 3 Şekil 2.2. Kolonik laktoz metabolizması... 4 Şekil 2.3. Enzim substrat ilişkisi Şekil 2.4. E. coli bakterisine ait Beta-galaktozidaz enziminin üç boyutlu yapısı Şekil 2.5. ONPG substratının beta galaktozidaz ile hidroliz reaksiyonu Şekil 2.6. β-galaktozidaz enziminin X-gal substratı ile reaksiyonu Şekil 2.7. Beta-Galaktozidaz tarafından laktozun hidrolizi Şekil 2.8. Beta-Galaktozidaz tarafından katalizlenen galaktooligosakkarit oluşumu 29 Şekil 3.1. ONP standart eğrisi Şekil 4.1. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı ph değerlerinde enzim aktiviteleri Şekil 4.2. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı ph değerlerinde protein miktarları Şekil 4.3. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı ph değerlerinde spesifik aktiviteleri Şekil 4.4. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı sıcaklık değerlerinde enzim aktiviteleri Şekil 4.5. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı sıcaklık değerlerinde protein miktarları Şekil 4.6. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı sıcaklık değerlerinde spesifik enzim aktiviteleri Şekil 4.7. Laktobasilerin farklı laktoz oranlarındaki enzim aktiviteleri Şekil 4.8. Laktobasilerin farklı laktoz oranlarındaki protein miktarları Şekil 4.9. Laktobasilerin farklı laktoz oranlarındaki spesifik enzim aktiviteleri... 63

15 xv Şekil Sayfa Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay mide suyunda enzim aktiviteleri Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay mide sıvısında protein miktarları Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay mide suyunda spesifik enzim aktiviteleri Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay bağırsak sıvısında enzim aktiviteleri Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay bağırsak sıvısında protein miktarları Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay bağırsak sıvısında spesifik enzim aktiviteleri Şekil Spesifik aktiviteye enzim ekstraksiyon yönteminin etkisi Şekil Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen β-galaktozidaz enziminin stoklanma durumu Şekil Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen β-galaktozidaz enziminin kısmi saflaştırma basamaklarındaki spesifik enzim aktivitesi 74

16 xvi Resim RESİMLERİN LİSTESİ Sayfa Resim 2.1. Laktobasillerin elektron mikroskop görüntüsü Resim 2.2. Bifidobacterium bifidum türünün elektron mikroskop görüntüsü Resim 2.3. Reaksiyon tüpünde farklı tür bakterilerin β-galaktozidaz aktivitesi Resim 2.4. L. plantarum suşlarında, X-gal bulunan besiyerinde β-galaktozidaz aktivitesi Resim 4.1. Lactobacillus fermentum ZYN17 suşunda ONPG (substrat) eklenerek reaksiyon sunucunda ONP nin (ürün) açığa çıkması ile sarı renk oluşan tüp (solda) ve ONPG eklenmeyen tüp (sağda) Resim 4.2. L. fermentum ZYN17 suşunun aktivite ölçümünde kullanılan kullanılan örnekler ve körvler Resim 4.3. β-galaktozidaz aktivitesine sahip suşların X-gal substratı bulunan agar besiyerinde mavi-yeşil renk oluşturması Resim 4.4. L. acidophilus BAZ36 suşunun MRS agar ve X-gal içeren MRS agardaki koloni morfolojisi Resim 4.5. L. fermentum ZYN17 suşunun β-galaktozidaz ekstraktlarının SDS-PAGE profilleri... 75

17 xvii SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama ºC Santigrat derece g Gram L Litre µl Mikrolitre µm Mikrometre µg Mikrogram M Molar mm Milimolar nm Nanometre ph Asitlik Bazlık Birimi Kısaltmalar β Cfu dak LAB MRS rpm Sf spp subsp TPY Açıklama Beta Koloni oluşturan birim Dakika Laktik Asit Bakterileri Man-Rogosa Sharpe Devir Sayısı Serum fizyolojik Species (Türleri) Subspecies (Alttürleri) Trpticase Phytone Yeast Extract

18 1 1. GİRİŞ Laktoz temel olarak sütte bulunan disakkarit bir şekerdir. Sindirim sistemine girdiğinde laktoz, laktaz (β-galaktozidaz) enzimi tarafından hidroliz edilerek glikoz ve galaktoza ayrılmaktadır. Vücutta bulunan ve laktozun parçalanmasını sağlayan beta galaktozidaz enziminin vücuttaki eksikliği ile veya işlevini tam görmemesi durumunda laktoz intoleransından söz edilmektedir. Laktoz intoleransı süt ya da süt ürünlerini sindirememek ya da sindirilmesinde zorlanmak anlamına gelir ve dünyada en sık karşılaşılan sindirim bozuklukları içerisinde yer alır. Bu hastalıkta vücutta bulunan beta galaktozidaz enzimi seviyesi doğum sırasında yüksek iken 2 yaşından sonra giderek azalmaktadır. Laktoz intolerans tedavisi, laktoz içeren gıdaların diyetten çıkarılmasına dayanmaktadır. Bunun için en etkili metot süt ve süt ürünleri üretiminde laktozun, laktaz enzimi kullanılarak ya da laktaz enzim aktivitesine sahip probiyotik mikroorganizmalar ile hidrolizinin sağlanmasıdır. Yüksek β-galaktozidaz enzim aktivitesine sahip olan laktik asit bakterilerinin özellikle süt ve süt ürünlerinde laktozun sindirimini arttıracağından probiyotik olarak kullanımlarına avantaj sağlayacaktır. Bu amaçla, bu çalışmada, Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Laboratuvarı kültür koleksiyonunda bulunan ve çeşitli proje ve tezlerle probiyotik özellikleri belirlenen farklı izolasyon kaynaklı suşların β-galaktozidaz aktivitesi onpg (o-nitrofenil-beta-d-galaktosid) ile ölçülmektedir. Yüksek aktiviteye sahip suşlarda β-galaktozidaz enzim optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca, suşlardan enzimin elde edilmesindeki uygun enzim ekstraksiyon yönteminin belirlenmesi ve elde edilen enzimin stoklanabilme durumunun araştırılması hedeflenmiştir. Bunun yanında suşlardan elde edilen kararlı ve yüksek ativiteye sahip olan enzimin kısmı saflaştırılması ve moleküler ağırlığının belirlenmesi amaçlanmıştır.

19 2 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Laktoz İntoleransı Laktoz intoleransı etnik kökenli laktaz eksikliğine dayanmaktadır [Beermann ve Hartung, 2012]. Laktozun vücut tarafından absorbsiyonu için önce monosakkaritlerine yani glikoz ve galaktoza parçalanması gerekir. Bu olayda rol oynayan enzim ince bağırsaklarda bulunan laktaz (β-galaktozidaz) enzimidir. Düşük beta galaktozidaz aktivitesi sindirim yetersizliğine neden olur ve çoğu durumda laktoz intoleransı olarak adlandırılır [Gheytanchi ve ark., 2010; Karasova ve ark., 2002; Vasiljevic ve Jelen, 2001]. Bu insanlarda enzim yeterli miktarda bulunmadığından laktoz monosakkaritlerine parçalanamadığından absorbe edilememektedir. Bunun sonucunda insanlarda karın ağrısı, gaz, ishal vb bazı rahatsızlıklar oluşmaktadır. Laktoz intolerans olarak nitelenen bu kişilerin oranı Amerika ve Afrika zencileri arasında %70, Asya da ise %95 dir. Sözü edilen enzimin noksanlığı bir hipoteze göre kalıtsal, diğer bir hipoteze göre de sonradan oluşan bir durumdur. Yetersiz beslenen insanlarda, süt içme alışkanlığı olmayan toplumlarda semptom daha sık görülmektedir. Örneğin süt tüketimi fazla olan Danimarka, Kanada, Amerika (beyaz ırk) ve Finlandiya gibi ülkelerde laktoz intoleransı %3-15 arasında bulunmaktadır [Sezgin, 2012]. Laktoz intoleransından bahsedilirken birçok terim kullanılmaktadır. Bu terimlerden Laktoz Maldigestion (laktaz enziminin düşük aktivitede olmasından dolayı laktoz sindiriminin azalması), Laktaz Nonpersistans (normal laktaz aktivitesinde yaşla ilişkili azalma) ve Laktoz İntoleransı (laktoz tüketiminden kaynaklanan gastrointestinal belirtilerin görülmesi) ile çok sık karşılaşılmaktadır [Wooten ve ark., 2010]. Bu tanımlardan en çok kullanılanı laktoz intoleransıdır. Laktoz direk olarak bağırsaktan absorbe edilemediğinden, glikoz ve galaktoz gibi basit şekerlere hidrolize olması gerekmektedir. Hidroliz, ince bağırsak kanalının iç yüzeyinde bulunan β-galaktozidaz enzimiyle veya probiyotik bakterilerce sağlanır (Şekil 2.1). İnsanlarda laktaz enzimiyle ilgili olarak ortaya çıkan problemler, bu

20 3 enzimin salgılanmamasından veya doğumdan itibaren ince bağırsakta yetersiz miktarda bulunmasından kaynaklanmaktadır. Bu durumda laktoz yeterince sindirilemez ve ince bağırsaktaki sindirim veya kalın bağırsakta fermantasyon değişikliğinden dolayı klinik semptomlar açığa çıkar [Vonk ve ark., 2012]. Şekil 2.1. İnce bağırsakta laktoz metabolizması. (1) Laktoz ince bağırsağa girer. (2) Laktoz konağa ait laktaz enzimi ile veya (3) probiyotikler tarafından değişikliğe uğratılır. (4) Fazla miktarda laktoz kolona geçer [Vonk ve ark., 2012].

21 Laktozun kolonda fermantasyonu Kolona geçen laktoz, kolonik bakterilerin β-galaktozidaz enzimleri tarafından hidrolize uğrar ve sonuçta glikoz ve galaktoz oluşur. Glikoz ve galaktoz daha sonra laktatın yanı sıra kısa zincirli yağ asitleri (SCFA), propionat ve bütirata çevrilir. Ayrıca mikrobiyal biyokütle oluşumunda kullanılır (Şekil 2.2). Orijinal substrat laktoz, ara ürünlerden glikoz ve galaktoz ve son ürünler kolon içinde osmatik yük oluşturur. Bu durum kolonik transit zamanında artışa (dışkının kolonda ilerleme durumu), fermantasyon profilinin değişmesine ve sonuçta dokulardaki sıvının ince bağırsağa çekilmesine ve diyareye neden olur [Vonk ve ark., 2012; Heyman ve ark., 2006]. Şekil 2.2. Kolonik laktoz metabolizması. (1) Laktoz kolona girer ve miktobiyota tarafından gilikoz ve galaktoza fermente edilir. (2) Örneğin, hidrojen, metan ve karbondioksit gibi gazlar oluşturulmuştur. (3,4) Aynı zamanda laktat oluşturulmuş ve kısa zincirli yağ asitlerine (SCFA) dönüştürülmüştür, (5) ayrıca bu aşamada gazlar da oluşturulmaktadır. SCFA epitelyum hücreleri tarafından içeri alınabilir veya mikrobiota tarafından kullanılabilir ya da dışkı ile atılır [Vonk ve ark., 2012].

22 5 Laktozun sindirimi ve fermantasyonunun fizyolojik yönleri göz önüne alındığında, laktoz intoleransı semptomlarının tüketilen laktoz dozu ile ilişkili olduğu ve ince bağırsakta yeterli düzeyde hidroliz ile semptomların önlenebileceği çok açıktır. İnce bağırsakta laktaz aktivitesinin yetersiz olması durumunda, kolon içine geçiş meydana gelir. Osmotik etki oluşturan moleküllerin yeterli olarak kaldırılmasıyla klinik semptom olan diyarenin oluşması önlenebilir [Vonk ve ark., 2012] Laktoz intolerans semptomları Laktoz intoleransı durumunda bağırsak rahatsızlıkları, karın ağrısı ve diyare gibi belirtiler oluşabilir. Bu şikayetler vardır, ancak spesifik değildir ve aynı zamanda bazı klinik koşullarda da oluşabilir (Örneğin; irritabl bağırsak sendromu, çölyak hastalığı ve Crohn s hastalığı). Uygun tedavi ve doğru müdahale için tanı çok önemlidir [Vonk ve ark., 2012]. İnce bağırsaktan kolona geçen laktozun iki fizyolojik etkisi vardır. İlk olarak bağırsak duvarı boyunca bir osmotik gradient duvarı kurulur ve bu durum diyare semptomuna neden olur. İkinci olarak potansiyel rahatsızlık, şişkinlik ve gaz oluşmaktadır [Ingram ve Swallow, 2009]. Karın ağrısı ve şişkinliğe genellikle, emilmeyen laktozun bakteriyel mikroflora tarafından kolon fermantasyonu ile oluşturulan kısa yağ asit zincirleri (SCFA), hidrojen, metan, karbondioksit gazları, bağırsak transit zamanında artış ve intrakolonik basınç oluşumu neden olmaktadır [Ingram ve Swallow, 2009; Lomer ve ark., 2008]. Ayrıca laktoz intoleranslı çocuklarda daha ağır durumlarda su kaybı ve elektrolit düzensizlikleri meydana gelebilmektedir [Wilson, 2005]. Mide bulantısı, kramp, şişkinlik, gaz ve ishal olarak rahatsızlığa sebep olan laktoz intolerans belirtileri hafif ya da çok şiddetlidir. Belirtiler laktoz içeren gıdaların kullanımından 30 dak ve 2 saat içerisinde başlar. Semptomların şiddetinde birçok faktör etkilidir. Bunlar [Wooten ve ark., 2010]; Kişi tarafından tolere edilebilecek laktoz miktarı Kişinin yaşı ve etnik kökeni Sindirim oranı

23 6 Semptomları aynı olsa da laktoz intoleransı, inek sütü intoleransı ile karıştırılmamalıdır. İkisi aynı rahatsızlık değildir. İnek sütüne intolerans, bağışıklık sistemi tarafından tetiklenen alerjik bir reaksiyondur. Laktoz intoleransı ise sindirim sistemi problemlerine neden olan bir sorundur [Wooten ve ark., 2010] Laktoz intolerans tanısı En doğrudan tanı laktaz aktivitesinin tespitidir. Enzim aktivitesinin analizinde bağırsak biyopsisi genel bağırsak aktivitesini yansıtmaz, çünkü laktaz enzimi bağırsak epiteli boyunca homojen olarak bulunmamaktadır [Vonk ve ark., 2012]. Kuzey Avrupa da yıl önce oluşan bir mutasyon Kuzey Avrupa ırkını süte tolerant hale getirmiştir. Kuzey Avrupalılarda laktoz florizin hidrolaz geninde (LCH) oluşan bir mutasyon laktaz aktivitesinin erişkin yaşlara kadar taşınabilmesini sağlamıştır [Coşkun, 2007]. Laktoz intoleransı semptomlarına sahip kişlerde genetik eleme yapılması laktoz intoleransında doğru tanının yapılmasına yardımcı olur. Laktaz geninin promotor bölgesinde tek nükleotit polimorfizminin (SNP) bulunması laktozun yüksek kapasitede sindirilebilmesini sağlar. En yaygın SNP C/T-13910, Kuzeybatı Avrupa insanlarının birçoğunda bulunur. Bu en yaygın SNP nin tespiti için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir [Jarvela ve ark., 2009]. Semptomlar ve laktoz intoleransı arasında zayıf bir ilişki bulunmadığından yalnızca genetik tanının yapılması yetişkin laktoz intoleransında doğru bir tanı için yeterli değildir [Vonk ve ark., 2012]. Yetişkin laktoz intoleransı tanısında hastanın laktoz ve kan şekeri veya üflemeyle H 2 ölçümü laktoz tolerans testi ile desteklenebilir. Beta galaktozidaz varlığında laktozun hidrolizi sağlanacağından kan şekerinde artış olması beklenmektedir. Bu sebeple kan şekerinin ölçümü önemlidir. Ayrıca beta galaktozidaz enzim eksikliği sonucunda kolon bakterileri tarafından laktozun parçalanmasıyla hidrojen gazının açığa çıkması beklenmektedir. Bu şekilde oluşan hidrojen gazı üç yollu vanası bulunan bir torbaya bağlı ağızlık içine şırınga ile hava üflenmesi ile elde edilmektedir [Mattar ve ark., 2008, Ridefelt ve Hakansson, 2005].

24 Probiyotik Probiyotik terimi, Latince pro ve bios kelimelerinden türetilen ve yaşam için anlamına gelen bir terimdir [Prabhu ve ark., 2012; Schrezenmeir ve de Vrese, 2001]. Probiyotik terimi ilk kez Lilly ve Stillwell tarafından (1965) bir mikroorganizma tarafından salgılanarak diğer bir mikroorganizmanın çoğalmasını teşvik eden maddeler anlamında ve antibiyotik teriminin zıttı olarak kullanılmıştır. Probiyotik kelimesi bugün kullanıldığı anlamı ile ilk kez 1974 yılında Parker tarafından intestinal mikroflora üzerinde yararlı etkileri olan tamamlayıcı yiyecekler olarak tanımlanmıştır. Dr. R. Fuller ve Dr. C.B. Cole tarafından 1989 da probiyotikler, konak hayvanın yararına intestinal mikrobiyal dengesini iyileştiren canlı mikrobiyal besin katkısı olarak ifade edilmiştir. [Yeşilova, 2010; Yiğit, 2009; Çakır ve Çakmakçı, 2004]. Günümüzde, probiyotik bakteriler, yeterli miktarda alındığında konak üzerinde sağlığa yararlı etkileri olan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlanmaktadır [Dianawati ve Shah, 2011]. Ross ve ark., na göre fagosit teorisi ile 1903 yılında nobel ödülü alan Rus biyolog Elie Metchnikoff, yaşlanmanın bağırsaklardaki bakterilerin neden olduğu kronikpütreaktif aktif bir zehirlenme olduğunu ileri sürmüştür. Metchnikoff, günlük diyetlerinin düzenli bir parçası olarak Lactobacillus cinsi bakteriler içeren yoğurt yiyen Bulgar köylülerin fark edilir derecede uzun ömürlü olduklarını gözlemlemiş, bununla ilgili laktik asit bakterilerinin ömrü uzattıkları teorisini ileri sürmüştür [Yeşilova ve ark., 2010; Ross ve ark., 2002]. Probiyotik olarak kullanılan laktik asit bakterilerinin sağlığa yararlı etkileri Çizelge 2.1 de görülmektedir.

25 8 Çizelge 2.1. Probiyotik olarak kullanılan bakterilerin insan sağlığı üzerindeki yararlı etkileri [Ceyhan ve Alıç, 2012; Seçkin ve Baladura, 2011] Sağlığa faydalı oldukları alanlar Laktoz intoleransının azalması Barsak florası üzerine etki Bağışıklık sisteminin güçlendirilmesi Alerjik reaksiyonların azaltılması Kolon kanseri riskinin azaltılması Kan lipitleri ve kalp hastalık riskinin azaltılması Ürogenital enfeksiyonlar Helicobacter pylori enfeksiyonu Hipertansiyonu önleyici etki Öne sürülen mekanizma Bakteriyal β-galaktozidazın laktoz üzerine etki ederek laktozun sindirimi Toksik metabolit üretiminin azaltılması yoluyla floranın aktivitesinin etkilenmesi Kolonizasyon direnci intestinal sistemin patojenleri için uygun olmayan koşullara değişimi (ph, kısa zincirli yağ asitleri ve bakteriyosinler) İntestinal flora populasyonları üzerindeki etki İntestinal mukozada agregasyon oluşturarak patojenlerin bağlanmasını engelleme İntestinal müsin üretimini düzenleyerek patojenleri epitel hücrelere tutunmasını önlemek Enfeksiyon ve tümör oluşumuna karşı spesifik olmayan savunma mekanizmasını güçlendirmek Antijene özgü immün yanıta yardımcı etki IgA üretiminin arttırılması Akyuvar hücrelerinin fagositik aktivitelerinin arttırılması Antijen etkiye sahip maddelerin dolaşım sistemine geçişinin engellenmesi Bağışıklık sisteminin dengesinin yeniden düzenlenmesi Mutajen bağlama Karsinojenlerin aktivitesini engelleme (inaktif hale getirme) Bağırsak mikroorganizmalarının ürettiği kasinojen üreten enzimlerin inhibisyonu Bağışıklık sistemini güçlendirme Safra tuzu hidrolaz enzim aktivitesi ile safra tuzlarının atılımını arttırmak Antioksidasyon etkisi Kolesterol asimilasyonu Ürinar ve vajinal bölge hücrelerine adhesyon Kolonizasyon direnci H. pylori inhibitörlerinin (laktik asit, bakteriyosin v.b.) üretimi H. pylori nin üreaz aktivitesinin azaltılması Peptidazın süt proteinleri üzerine etkisi sonucu oluşan tripeptitler Hücre duvarı komponentlerinin angiotensin 1 enzim inhibitörleri gibi davranması

26 Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Sıklıkla kullanılan probiyotik suşlar arasında Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. bulgaricus, L. reuteri, L. plantarum, L. rhamnosus, L. salivarius, L. casei, Bifidobacterium bifidum, B. lactis, B. longum ve B. infantis sayılabilir [Coşkun, 2006]. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Çizelge 2.2 de verilmiştir. Çizelge 2.2. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar [Prabhu ve ark., 2012; Ceyhan ve Alıç, 2012]. Lactobacillus Türleri Bifidobacterium Türleri Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus lactis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus gasseri Lactobacillus cellebiosus Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus reuteri Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve Bifidobacterium adolescentis Lactobacillus curvatus Lactobacillus fermentum Lactobacillus plantarum Lactobacillus johsonlii Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus helveticus Lactobacillus salivarius Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum Bifidobacterium thermophilum Enterococcus Türleri Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Bacillus Türleri Streptococcus Türleri Pediococcus Türleri Bacteriodes Türleri Propionibacterium Türleri Leuconostoc Türleri Bacillus subtilis Bacillus pumilus Bacillus lentus Streptococcus cremoris Streptococcus thermophilus Streptococcus intermedius Pediococcus cerevisiae Pediococcus acidilactici Bacteriodes capillus Bacteriodes suis Propionibacterium shermanii Leuconostoc mesenteroides Bacillus licheniformis Bacillus coagulans Streptococcus lactis Streptococcus diacetilactis Streptococcus salivarius Pediococcus pentosaceus Bacteriodes ruminicola Bacteriodes amylophilus Propionibacterium freudenreichii Küfler Aspergillus niger Aspergillus oryzae Mayalar Candida torulopsis Candida pintolopesii Saccharomyces cerevisiae

27 10 Probiyotik olarak kullanılan bakterilerin önemli bazı özellikleri sahip olması gereklidir. Bu nedenle probiyotik türlerin seçilmesinde de bazı kriterler önem taşımaktadır. Bu kriterler Çizelge 2.3 te belirtilmiştir. Çizelge 2.3. Probiyotik türlerin seçilmesinde etkili kriterler [Klaenhammer ve Kullen, 1999]. Uygunluk Doğru taksonomik seleksiyon Hedef türlerin bulunduğu ortamda doğal olarak bulunma: insanlar için orijinli olmaları Toksik ve patojenik etki göstermeme Teknolojik uyum Toplu üretime ve depolamaya uygunluk: uygun sıcaklık, konsantrasyon, donma, dehidrasyon, depolama ve dağıtım, Yüksek populasyon seviyelerinde canlılık (tercihen ) Kültür hazırlanma sürecinde istenilen özelliklerin korunması Gıdalarda veya fermantasyon işlemlerinde kullanıldığında arzu edilen organoleptik özellikleri taşıması veya istenmeyen özellikler taşımaması. Genetik açıdan stabil Genetik açıdan uysal Yarışmacı özellikler İn vivo şartlarda, hedef bölgede canlılıklarını devam ettirebilme, çoğalabilme ve metabolik aktivitelerini gerçekleştirebilme yetenekleri Safraya dayanıklılık Aside dayanıklılık Normal mikroflorada aynı veya yakın türlerle yarışmacı özelliklere sahip olma, mikrofloranın ürettiği asit, bakteriyosin ve diğer antimikrobiyallare karşı dayanıklı olmaları Tutunma ve kolonileşme yetenekleri Performans ve fonksiyonalite özellikleri Klinik olarak doğrulanmış bir veya daha çok sağlık yararları ( ör: laktoz toleransı) Patojenik/karyogenik bakterilere karşı antagonistik etki Antimikrobiyal madde üretme yeteneği (bakteriyosinler, hidrojen peroksit, organik asitler veya diğer inhibe edici bileşikler) Bağışıklığı uyarıcı etkiler Antimutajenik özelliğe sahip olma Antikarsinojenik etkiye sahip olma Biyoaktif bileşikler üretebilme yetenekleri

28 Laktik Asit Bakterileri Laktik asit bakterileri (LAB) endüstriyel açıdan önemli mikroorganizmalar olup, endüstriyel gıda fermantasyonlarında çeşitli şekillerde kullanılmaktadırlar. Özellikle gelişme ortamındaki karbonu metabolize etmeleri sonucu ara ürün olarak laktik asit üretmeleri, bu mikroorganizmaların gıda üretiminde kullanımının yaygınlaşmasına neden olmaktadır. LAB nin bu özellikleri gıda hammaddelerinde asitliğin yükselmesine yol açmakta ve bu durum gıdaların raf ömrünü uzatmak açısından yararlı olmaktadır. LAB asit oluşturmalarının yanı sıra gıdalarda starter kültür olarak kullanıldıklarında tat, doku, besleyici değer gibi bazı ürün karakteristiklerine de katkıda bulunmaktadırlar [Karaca ve ark., 2010; Hylckama ve Hugenholtz, 2007; Kleerebezem ve Hugenholtz, 2003]. Laktik asit bakteri grubunda yer alan suşların insan gastrointestinal sistemi boyunca hayatta kalmaları ve probiyotik yetenekleri nedeniyle insan sağlığına yararlı etkileri vardır [Lievin-Le Moal ve Servin, 2006]. Laktik asit bakterileri; fazla türe sahip ve basil, kok ve kokobasil, Gram pozitif, hareketsiz, spor oluşturmayan (Sporolactobacillus inulinus hariç), sitokrama sahip olmayan, katalaz negatif, aside dayanıklı, kuvvetli fermentatif, nitratları indirgemeyen, büyüme ve gelişimleri için glikoz ve amonyum yanında bazı vitamin ve aminoasitlere ihtiyaç duyan mikroorganizmalardır [Singh ve Prakash, 2009; Holzapfel ve ark., 2007]. Bütün LAB anaerobik koşullar altında gelişim gösterebilmektedir. Ancak, çoğu anaerobik bakterinin tersine oksijen varlığında da gelişim göstermektedirler. Bu nedenle de aerotolerant anaerob organizmalar olarak adlandırılmaktadırlar. Fermantasyon sonucu ana ürün olarak laktik asit üreten bu bakteriler sitokrom içermemekte ve elektron taşıma sistemi taşımamaktadırlar. Bu nedenle laktik asit bakterilerinde enerji eldesi yalnızca substrat düzeyinde fosforilasyon ile gerçekleştirilmektedir [Sümengen, 2011; Dinçer ve ark., 2009]. Laktik asit bakterileri laktik asit fermantasyonuyla oluşturdukları ürünlerin cinsine göre homofermentatif laktik asit bakterileri ve heterofermentatif laktik asit bakterileri olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Homofermentatif laktik asit bakterileri: Glikozu, Fruktoz Di Fosfat (FDP) yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 99 oranında

29 12 laktik asit, %1 oranında diğer bileşikleri meydana getirirler. Heterofermentatif laktik asit bakterileri: Glikozu Heksoz Mono Fosfat (HMF) yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 70 laktik asit, %30 oranında da diğer bileşikleri, özellikle asetik asit, etil alkol ve karbondioksiti oluştururlar [Kleerebezm ve Hugeholz, 2003]. Gıda endüstrisinde, LAB ların gelişimi ile birlikte oluşan asidifikasyon ve enzimatik işlemler çeşitli fermente gıdaların tat, koku, teksür özelliklerine etki etmektedir [Kıran ve Osmanağaoğlu, 2011; Kleanhammer, 1988]. Laktik asit bakterileri (LAB); et, süt ve sebze gibi gıdaların işlenmesi ve korunması için yoğun olarak kullanılmaktadır [Iqbal ve ark., 2011]. LAB ler aynı zamanda sindirim enzimleri ve aşı antijenleri için oral araç olarak geliştirilmede güçlü adaylardır. LAB lerin doğal asit toleransı, gastrik yolda yaşayabilme kabiliyetleri ve insan tüketimi sırasındaki güvenilirlik kaydı, biyolojik moleküllerin hedef lokasyonlara ve dokulara etkili olarak ulaşmalarında kullanılan anahtar özellikleridir [Kıran ve Osmanağaoğlu, 2011]. Laktik asit bakterilerinin laktoz metabolizması, iyi karakterize edilmiştir [Wood ve Warner, 2003]. Laktoz kullanımı bu bakteri grubunda iki farklı yol aracılığı ile olmaktadır. Birinci yolu daha çok karakteristik laktobasiller kullanır. Bu yolda karbonhidrat-spesifik permeaz yapılar kullanılır. İntraselüler β galaktozidaz ile disakkarit laktoz, galaktoz ve glikoza hidroliz olur. Galaktoz Leloir yolu ile metabolize edilirken glikoz, glikolize gider. Laktoz kullanımının ikinci yolunda spesifik fosfoenolpiruvat bağımlı fosfotransferaz sistemi (PTS) kullanılır [Francl ve ark., 2012]. Bu sistemde laktoz hücre içine fosforile formda alınmakta ve fosfo-βgalaktozidaz enzimi aktivitesi ile glikoz ve galaktoz 6-fosfata parçalanmaktadır. Bu aşamadan sonra glikoz Embden-Mayerhof-Parnas (EMP), galaktoz 6-fosfat ise tagatoz 6-fosfat yolu ile katabolize edilmektedir [Tükel ve Akçelik., 2000].

30 Lactobacillus cinsi bakterilerin genel özellikleri Lactobacillus cinsi bakteriler, Lactobacillaceae familyasına ait ve laktik asit bakterileri grubundadırlar. Laktobasil suşları aerotolerant, Gram pozitif, katalaz negatif ve spor oluşturmayan bakterilerdir. Çoğu Lactobacillus suşu basil olmasına karşın bazı türleri kokobasil şeklindedir (Resim 2.1). Bu mikroorganizmaların gelişebilmesi için aminoasit, peptit, nükleik asit türevi vitamin, tuz, yağ asidi veya yağ asidi esterleri ve fermente edebilecekleri besin maddelerine ihtiyaç duyarlar [Salminen ve ark., 2004]. Laktobasil türleri, ince bağırsakta yaşayabilir ve çok sayıda bulunurlar [Doğan, 2012]. (a) Resim 2.1. Laktobasillerin elektron mikroskop görüntüsü [Ceyhan ve Alıç, 2012]. a. Lactobacillus acidophilus, b. Lactobacillus casei (b) Laktobasil türleri aynı zamanda gıdalarda en yaygın olarak kullanılan probiyotik bakterilerdir [Turgut ve ark., 2012; Ouwehand ve ark., 2002]. Laktobasillerin enzim üretimi gibi yeni uygulamalarda potansiyel kullanımı dikkat çekicidir [Akolkar, 2005]. Bazı laktobasil suşları laktozu kullanarak laktoz intoleransını hafifletir [Honda ve ark., 2012].

31 Bifidobacterium Cinsi Bakterilerin Genel Özellikleri İlk kez 1899 yılında Tissier tarafından izole edilen Bifidobacterium lar Actinomycetaceae familyasına dâhildir [Özer, 2006]. Bifidobakterilerin karakteristik morfolojik ve fizyolojik yapısı vardır. Bifidobakteriler hareketsiz, spor yapmayan, değişken görünümde, genellikle biraz kavisli çubuklar şeklinde dallanan bakterilerdir. Taze izole edilen suşlar uniform dallı, Y ve V formlarında çatallı olabilir (Resim 2.2). Doğal ortamlarında genellikle çubuk şeklinde olmasına rağmen, olumsuz ortam koşullarında dallanma ve pleomorfizm gözlenir. Bazı suşlar oksijeni tolere etmesine rağmen bifidobakteriler anaerobik olarak tanımlanırlar. Çoğu insan bifidobakteri suşlarının optimum gelişme sıcaklığı o C iken hayvan suşlarının optimum gelişme sıcaklığı o C olarak daha yüksektir. Bifidobakteriler asite karşı dayanıklıdırlar ve ph 6,5-7 de optimum gelişme gösterirler. Heterofermentatiftirler ve glikoz fermantasyon yolu olarak fruktoz-6-fosfat yolunu kullanarak asetik asit ve laktik asit üretirler [Leahy ve ark., 2005]. Bu mekanizmadaki fruktoz-6-fosfat fosfoketolaz (F6PKK) enzimi bifidobakterleri diğer mikroorganizmalardan ayırmada kullanılır [Ceyhan ve Alıç, 2012]. Resim 2.2. Bifidobacterium bifidum türünün elektron mikroskop görüntüsü [Ceyhan ve Alıç, 2012].

32 15 Bifidobacterium cinsi üyelerinin yenidoğan bebeklerde önemli rolü olduğu kabul edilmektedir. Bifidobakteriler anne sütüyle beslenen sağlıklı bebeklerin total bağırsak bakteri nüfusun % 95'i oluşturmaktadır [Favier ve ark., 2002; Harmsen ve ark., 2000]. Bifidobakterler kalın bağırsakta koloni oluşturabilirler [Doğan, 2012]. Bebeklerde en yaygın Bifidobacterium türlerinin Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum ve Bifidobacterium infantis olduğu bildirilmiştir [Wall ve ark., 2008] Probiyotiklerin laktoz intoleransında kullanılması Laktoz intolerantlıların, laktoz içeren gıdalardan sakınmaları gerekmektedir. Ancak, laktoz içeren gıdalardan sakınmak beslenme açısından risk yaratabilir. Süt, diyete fazla miktarda kalsiyum, fosfor, magnezyum, riboflavin, Vitamin D ve protein sağlar. Fosfor, magnezyum, riboflavin, Vitamin D laktoz içermeyen gıdalarda da bulunmasına rağmen, kalsiyumun %74 i laktoz içeren ürünlerden sağlanır. Yetersiz kalsiyum alınması; iskeletin yavaş büyümesi, hipertansiyon, hamilelikte toksemiya, kolon kanseri ve osteoporoz gibi sorunlara neden olur [Bayhan ve Yentür, 1993]. Bu nedenle laktoz içeren gıdaların kullanımının kısılması yerine bu tür ürünlerin nasıl kullanılabileceği konusu araştırılmalıdır. Probiyotiklerin bütün yararlı etkileri arasında laktoz intoleransını düzenleyici etkisi önem taşımaktadır. Laktoz intoleransı probiyotik ürün kullanımı ile tedavi edilebilecek çok önemli bir sağlık sorunudur. Cerrahi operasyon, bağırsak düzensizlikleri ve antibiyotik tedavisi gibi faktörler vücudun laktaz üretimini azaltabilmektedir. Lactobacillus, Bifidobacterium ve Streptococcus gibi laktaz pozitif probiyotik bakteri türleri, genellikle pastörize süt ürünlerine ilâve edildiklerinde bu ürünlerdeki laktoz sindirimini arttırmaktadırlar [Rolfe, 2000; Sanders, 1999; Murray, 1998]. Probiyotik suşlar, hidrolitik kapasiteleri ile yoğurt gibi süt ürünlerinde laktoz miktarının azaltılmasında kullanılabilir. Aynı zamanda, ince bağırsakta genel hidrolitik kapasiteyi arttırmak için de kullanılabilir. Probiyotikler canlı olabilir veya bağırsakta liziz olarak etki gösterebilir. Safra tuzuna karşı toleranslı olan Lactobacillus acidophilus laktoz sindirimini arttırır. Lactobacillus delbrueckii süt

33 16 ürününde β-galaktozidaz aktivitesi gösterir [Vonk ve ark., 2012; De Vrese ve ark., 2001]. Kinova ve ark., (2008) Lactobacillus içeren fermente süt ürünlerinin olumlu etkilerinin olduğunu bildirmiştir. Lactobacillus casei Shirota ve Bifidobacterium breve Yakult kombinasyonunun gastrointestinal geçiş sırasında hayatta kaldığı ve laktoz intolerans semptomlarını azalttığı bildirilmiştir [Almeida ve ark., 2012]. Gheytanchi ve arkadaşları tarafından probiyotik laktobasil suşlarının salgıladıkları beta galaktozidaz enzimi ile sütteki laktozun tüketilerek süt ve süt ürünlerinin kullanımının arttırılabileceği bildirilmiştir [Beermann ve Hartung, 2012; Gheytanchi ve ark., 2010]. Ouwehand ve ark., [2002] yoğurt ile alınan ve ince bağısakta liziz olan bakterilerin beta galaktozidazının serbest kaldığını ve bu enzimin laktozu metabolize ettiğini bildirmişlerdir. Heyman ve ark., [2002] B. longum ve Enterococcus durans ın laktoz intoleranslı hastalarda kullanılmasıyla semptomların azaldığını bulmuşlardır [Gürsoy ve ark., 2005]. Süt ürünlerine probiyotik bakteri ilave edilmesinin laktoz intoleransına yararlı etkileri iki olası mekanizma ile açıklanmaya çalışılmaktadır. Bunlardan birincisi, fermantasyon ile süt ürünlerinde bulunan laktozun parçalanması, ikincisi ise laktaz enzimi üreten probiyotik mikroorganizmaların gastrointestinal bölgelerdeki çoğalmasıdır [Çakır, 2003; Çakır ve Çakmakçı 2002; Rolfe 2000]. Düşük laktoz veya laktozsuz gıda üretimi, laktoz intoleransı olan insanlarda ciddi doku dehidrasyonları, ishal ve bazen de ölümlerin önlenmesi açısından önem taşımaktadır [Er ve Sarımehmetoğlu, 2009]. Bu şekildeki uygulamalarla laktoz intoleransı tedavisi için probiyotiklerin umut verici olduğu görülmektedir Enzimler ve Genel Özellikleri Enzimler, biyolojik reaksiyonları katalizler ve dengeye ulaştırır. Biyolojik katalizör olan enzimler hücre içerisinde üretilmelerine rağmen birçoğu hücre dışına salınarak aktivitelerine devam ederler. Biyolojik katalizör olan enzimlerin çoğunluğu hücre dışına salınırken bazı enzimlerin aktiviteleri hücre içerisinde sürdürülür. Enzimlerin bazı özellikleri endüstriyel uygulamalarda kullanılmalarının yolunu açmıştır.

34 17 Enzimin aktivasyonu, reaksiyon esnasında enzim tüketilmeksizin gerçekleşir. Doğada metabolik reaksiyonlar enzimler tarafından kontrol edilir. Enzim, reaksiyon sırasında yapısal değişikliğe uğramadan başka bir substrat ile reaksiyona girer. Kimyasal katalizörler özgül ve seçici olmadan birçok reaksiyonu katalizler. Biyolojik katalizörler ise oldukça selektif olup spesifik reaksiyonları katalizler. Enzimler özgül oldukları substrat ile etkileşerek enzim-substrat yapısını oluştururlar. Enzim substrat ilişkisi genellikle 1894 te Emil Fischer tarafından ileri sürülen anahtar-kilit uyumu ile açıklanmaktadır (Şekil 2.3) [Akpolat ve ark., 2012; Aehle, 2004] yılında ise Daniel Koshland anahtar- kilit modelinin bir modifikasyonunu olan uyum meydana getirme modelini ileri sürmüştür. Daniel Koshland a (1958) göre; enzimlerde bulunan aktif merkezin esnek yapıda olması sonucunda, substrat varlığında proteinin yapısında oluşan değişiklik ile reaksiyon için en uygun etkileşim sağlanabilmektedir (Şekil 2.3). (a) (b) Şekil 2.3. Enzim substrat ilişkisi a. Anahtar-kilit modelinin şematik gösterimi [Akpolat ve ark., 2012], b. Koshland modelinin şematik gösterimi. Enzimin aktivitesini düşüren veya durduran maddelere inhibitör, arttıran maddelere ise aktivatör maddeler denir [Aehle, 2004]. Enzimlerin çoğu yapı ve görev bakımından farklı Apoenzim ve Koenzim/Kofaktör olmak üzere iki gruptan oluşur. Apoenzim, enzimin belirli reaksiyonları katalizlemesini sağlayan kısaca enzimin spesifikliğini belirleyen kısmıdır. Apoenzim protein yapısında olması

35 18 nedeniyle ısı ile denatüre olabilmektedir. Bazı enzimler kofaktör olarak adlandırılan ek kimyasal komponente ihtiyaç duyarlar. Kofaktör, ya Fe +2, Mg +2, Mn +2, Zn +2 gibi bir veya daha fazla inorganik iyonlardır. Ya da koenzim denen organik ve inorganik maddelerden meydana gelmiş enzimin yardımcı ve etkin biçimidir. Koenzim apoenzim varlığında etkinlik göstermektedir ve ikiside tek başına etkin değildir. Enzimin yapısında koenzim (Prostetik grup) ve apoenzim birlikteyse enzime Holoenzim (aktif enzim) denir [Pandey ve Ramachandran, 2006]. Enzimlerin yapıları ph ve sıcaklıktaki değişmeler ile bozulabildiğinden enzimin aktivitesi ph ve sıcaklığa duyarlıdır. Sıcaklığın yükselmesi, reaksiyona girecek moleküllerin kinetik enerjilerinin artmasını sağlar. Kinetik enerjileri artan moleküllerin etkileşime girme şansları da artar. Enzimlerin katalitik aktivitesinin en yüksek düzeyde olduğu sıcaklığa optimal sıcaklık denir. Optimal sıcaklıktan daha yüksek sıcaklıklar molekül içi ve moleküller arası bağların kopmasına sebep olur. Bunun sonucunda enzimin yapısı bozulmaya başlar. Enzimlerin en iyi çalıştığı bir ph aralığı (optimum ph) vardır. Bu durum enzimin moleküler yapısının ph değişiminden etkilenmesiyle oluşur [Aehle, 2004]. Mikrobiyal enzimler, optimizasyon ve modifikasyon süreçlerindeki kolaylık, katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri nedeniyle bitki ve hayvan enzimlerinden daha çok tercih edilmektedirler. Mikroorganizmalar seçilirken enzim üretme yetenekleri yanında patojen ve toksik olmamasına da önem verilir. Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin büyük bir çoğunluğu mikrobiyal kökenlidir [Kıran ve ark., 2006; Barredo, 2005] Enzimlerin sınıflandırılması Bilinen enzimlerin sayısı 1950 lerin sonuna kadar çok hızlı bir şekilde artmış ve birçok kişinin aynı enzime farklı isimler vermelerinden dolayı adlandırmada karmaşa ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda adlandırılması yapılan birçok enzimin katalizlediği reaksiyonun tabiatı hakkında herhangi bir bilgi içermemesi de bu karmaşayı

36 19 artırmaktaydı. Bu karışıklığın düzenlenmesi amacı ile 1956 yılında bir Uluslararası Enzim Komisyonu (International Comission on Enzyme) kurulmuştur. IUBMB (Uluslararası Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Birliği), enzimleri katalizledikleri reaksiyon tipine göre adlandılmakta ve sınıflandırmaktadır yılında Enzim Komisyonu tarafından yayınlanan rapora göre enzimler 6 sınıfa ayrılırlar. Enzimler, aralarında nokta bulunan dört numaradan oluşan kod numaraları kullanılarak tanımlanmıştır. EC (Enzim komisyonu) numarasının kapsadığı dört rakamdan ilki enzimin altı ana sınıftan hangisine ait olduğunu, ikinci rakam enzimin alt sınıfını, üçüncü rakam grubunu ve dördüncü rakam ise kendine özgü sıra numarasını ifade eder. Bu sisteme göre ilk rakamın ifade ettiği sınıflar aşağıdaki gibi altı ana sınıfa ayrılmaktadır [Aehle, 2007; Aehle; 2004; Telefoncu ve Dinçkaya, 1997]. 1. Oksidoredüktazlar: Redoks reaksiyonlarını katalizlerler. Dehidrogenazlar elektron kazandırıcı tepkimeleri, oksidazlar elektron kaybeden tepkimeleri katalizler. Redüktazlar substratı bir redüktör aracılığıyla indirgeyen enzimlerdir. Transhidrogenazlar bir molekülden diğerine hidrojen taşıyarak onu redüklerler. Hidroksilazlar substratlarına bir hidroksil ya da su molekülü katan enzimlere denir. Sistematik ismin oluşturulmasında donör: akseptör oksidoredüktaz seklinde bir düzenleme yapılır. 2. Transferazlar: Hidrojenin dışında bir atomun veya atom grubunun (metil, açil, amino, glikozil yada fosfat grupları) bir molekülden diğerine transferini sağlayan enzimlerdir. Dekarboksilazlar karboksilik asitlerden CO 2 çıkmasını sağlarlar. Sistematik ismin oluşturulmasında donör: akseptör grup transferaz seklinde bir düzenleme yapılır. 3. Hidrolazlar: Bir molekül su eklemek suretiyle ya da su molekülü aracılığıyla moleküllerin yıkılmasını sağlayan enzimlerdir. C-O, C-N, C-C gibi bağların hidrolitik yıkımını katalizler. Sistematik ismin oluşturulmasında substrat grup hidrolaz sekinde bir düzenleme yapılır. 4. Liyazlar: Su molekülü çıkarmadan molekülleri yıkan enzimlerdir. C-C, C-O, C-N gibi bağların eliminasyon yoluyla yıkımını katalizler. Sistematik ismin oluşturulmasında substrat grup liyaz sekinde bir düzenleme yapılır.

37 20 5. İzomerazlar: İzomerazlar bir molekül içindeki geometrik ya da yapısal yeniden düzenlenmeyi katalizlerler. Molekül içinde değişiklik yaparak onun uzayda dizilisini değiştirler. Sistematik ismin oluşturulmasında substrat grup izomeraz sekinde bir düzenleme yapılır. 6. Ligazlar: Ligazlar ATP ya da diğer bir nükloezit trifosfatdaki bir pirofosfat bağının hidrolizi yardımıyla yani enerji kullanarak iki molekülü birbirine bağlayarak sentez gerçekleştiren enzimlerdir. Sistematik ismin oluşturulmasında X:Y ligaz (ADP) seklinde bir düzenleme yapılır Enzim aktivitesini etkileyen faktörler Enzim aktivitesi ve stabilitesi enzimin elde edildiği suş tipi, kültüvasyon koşulları (sıcaklık, ph, havalandırma, ajitasyon ve inkübasyon zamanı) ve büyüme ortamının kompozisyonu (özellikle karbon ve azot kaynakları) tarafından etkilenir [Jurado ve ark., 2004]. Enzimatik reaksiyonların aktivitesi sıcaklık, ph, enzim ve substrat konsantrayonu, iyon şiddeti, aktivatör ve inhibitörlerin varlığı gibi faktörlerden de etkilenmektedir [Yıldırım, 2010]. Enzimler ile katalizlenen reaksiyonlarda bir değer aralığında reaksiyon hızı yükselir. Fakat belli bir sıcaklıkta enzim zarar görmeye başlar. Böylece reaksiyon yavaşlar ve yüksek sıcaklıkta enzim tamamen bozulur. Enzimin zarar görmeye başladığı ve aynı zamanda en yüksek reaksiyon hızına sahip olduğu sıcaklık optimum sıcaklıktır. Her enzim için aktivitelerinin maksimum olduğu ph değerleri vardır. Bu değerlerin üzerinde ve altında aktivite düşer. Bununla beraber bütün enzimlerin ph aktivite eğrileri aynı şekilde değildir [Bhat, 2000]. Substrat konsantrasyonu enzim aktivitesine etki eden önemli bir parametredir. Reaksiyon hızı, substrat konsantrasyonundaki artış ile maksimuma ulaşır. Bir değerden sonra substratın daha fazla arttırılması ile enzimatik reaksiyonun hızı attırılamaz, çünkü enzim substratına doymuştur ve maksimum hızla çalışmaktadır. Enzim aktivitesinin ölçülmesinde zaman önemli bir diğer faktördür. Çünkü reaksiyon hızı belirli bir zamanda üretilen ürün miktarı ile belirlenebilir. Reaksiyon ortamında bulunan

38 21 aktivatörler enzim aktivitesini arttırırken inhibitörler enzim aktivitesini azaltan maddelerdir [Yıldırım, 2010] Enzim aktiflik birimleri Enzimler biyolojik ortamda çok az miktarda bulundukları için miktar ölçümleri yerine aktivite ölçümleri yapılmaktadır. Enzimin aktivitesi çeşitli birimlerle ifade edilebilir. Dünya genelinde karşılaştırabilmek için Uluslararası Biyokimya Birliği Komisyonunun tarafından uluslar arası ünite (IU) veya enzim ünitesi olarak ifade edilen standart bir birim tanımlanmıştır. Enzim Ünitesi (IU): Optimum koşullarda, bir dakikada 1 mikromol ürün oluşumunu katalizleyen enzim miktarıdır. Spesifik Aktivite (U/mg): 1 miligram protein başına düşen enzim ünite sayısına denir. Bu birim enzim saflığının kontrolünde de kullanılır. Katal (Kat): Optimum koşullarda 1 katal, 1 saniyede 1 molsubstratı reaksiyona sokan enzim miktarıdır. Katal çok büyük bir birimdir (1 kat=6,109 U). Bu nedenle pratikte, mikrokatal (μkat) veya nanokatal (nkat) birimleri kullanılır. Uluslararası birim sisteminde (SI) madde miktarı birimi mol, zaman birimi saniyedir. Bu birimlere göre katal SI tarafından belirlenen yeni bir birimdir [Yıldırım, 2010; Telefoncu, 1986] β-galaktozidaz Enziminin Genel Özellikleri Beta-galaktozidaz (β-d-galaktositgalaktohidrolaz, EC ), yaygın adıyla laktaz, laktozdan glikoz ve galaktoz oluşumunu katalizleyen hidrolitik bir enzimdir [Verma ve ark., 2012; Panesar ve ark., 2011; Puri ve ark., 2010]. β-galaktozidaz β-1,4-dglikozidik bağların hidrolizini katalizler. β-galaktozidaz iki veya daha fazla karbonhidrat arasında veya bir karbonhidrat ile diğer bir bileşik arasındaki glikozidik bağlarını kıran enzim olarak bilinen glikozil hidrolazların (EC ) bir üyesidir [Güven, 2011]. Bu enzim sütteki temel karbonhidrat olan laktozu, bağırsak

39 22 epiteli boyunca emilen glikoz ve galaktoza hidrolize eder [Gheytanchi ve ark., 2010; Heyman, 2006]. Na + ve Mg +2 iyonları içeren bir metalo enzim olan β-galaktozidazın yapısı Şekil 2.4 de gösterilmiştir. Beta galaktozidaz süt endüstrisinde çoğunlukla süt karbonhidratı laktozun hidrolizini sağlaması yönüyle kullanılmaktadır. Bu hidroliz reaksiyonu sonucunda, fizikokimyasal olarak laktoz ile karşılaştırıldığında daha çözünebilir, daha tatlı ve daha sindirilebilir monomerler oluşur [Beermann ve Hartung, 2012; Neri ve ark., 2009]. İnsanların büyük bir kısmının bağırsaklarında β galaktozidaz enziminin faaliyetsizliğinden dolayı laktoz sindirilememekte ve bu durumdan dolayı insanlar muzdarip olmaktadır. Süt içeriğindeki laktozun hidrolizi ile bu sorunun üstesinden gelinebilir [Akgül ve ark., 2012]. Beta galaktozidaz aktivitesinin iyonik çevreden etkilendiği rapor edilmiştir. β galaktozidaz enziminin inhibitörü olarak bilinen Ca +2 iyonları sütte bulunan kazeine bağlı olduğundan (toplam Ca +2 iyonlarının %75 i kasein miselleri ile ilişkili) β-galaktozidazın aktivitesini inhibe edememektedir [Hidalgo-Morales, 2005; Garman ve ark., 1996]. Şekil 2.4. E. coli bakterisine ait β-galaktozidaz enziminin üç boyutlu yapısı [Jacobson ve ark., 1994].

40 23 Beta-galaktozidaz, laktozun dışında orto-nitrofenil-β-d-galaktopiranosit (ONPG) molekülüyle de reaksiyona girmektedir. Beta-galaktozidaz enzimi, ONPG substratı ile hidroliz reaksiyonuna girdiğinde galaktoz ve orto-nitrofenol (ONP) oluşmaktadır. Renksiz bir bileşik olan ONPG substratına enzimin etki etmesiyle oluşan ortonitrofenolün çözeltiye sarı renk vermesiyle enzim aktivitesi değerlendirilir (Chandler ve ark., 1998). Resim 2.3 te reaksiyon sonucunda tüpte sarı renk oluşumu görülmektedir. Ayrıca sarı renk oluşumu ile sonuçlanan reaksiyon Şekil 2.5 de görülmektedir. Resim 2.3. Reaksiyon tüpünde farklı tür bakterilerin β-galaktozidaz aktivitesi [Wen ve ark., 2012]. Şekil 2.5. Laktoz ve ONPG substratının beta galaktozidaz ile hidroliz reaksiyonu [Wozei ve ark., 2006].

41 24 Beta-Galaktozidaz enzimi, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktoside (X-GAL) substrat bileşiğiyle de reaksiyona girmektedir. Reaksiyon sonucunda oluşan 5- bromo-4-chloro-indoxyl molekülleri arasındaki oksidasyon reaksiyonu sonucunda mavi renkli 5,5 -dibromo-4,4 -dichloro-indigo ürününün oluşumuyla da enzim aktivitesinin varlığı değerlendirilmektedir [Kumar ve ark., 2004]. Resim 2.4 de reaksiyon sonucunda petride mavi-yeşil renk oluşumu görülmektedir. Ayrıca maviyeşil renk oluşumu ile sonuçlanan reaksiyon Şekil 2.5 te görülmektedir. Resim 2.4. L. plantarum suşlarının, X-gal bulunan besiyerinde beta galaktozidaz aktiviteleri [Kara, 2004].

42 25 Şekil 2.6. β-galaktozidaz enziminin X-gal substratı ile reaksiyonu [Kumar ve ark., 2004] Beta-galaktozidaz enziminin bulunduğu kaynaklar β-galaktozidaz bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalar da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklarda mevcuttur. Potansiyel endüstriyel uygulamalarda mikroorganizmalar en uygun β-d-galaktozidaz kaynağı olarak kabul edilir. β-galaktozidaz fungal, maya ve bakteri gibi çeşitli kaynaklarda tespit edilmiştir [Kumar ve ark., 2012]. Çizelge 2.4 de beta galaktozidaz enziminin bulunduğu bazı kaynaklar bulunmaktadır.

43 26 Çizelge 2.4. Beta-Galaktozidaz Enziminin Bulunduğu Kaynaklar [Gekas ve Lopez- Leiva 1985]. Bitkiler Şeftali, kayısı, badem, kefir taneleri, yaban gülü, kahve, elma Hayvan Organları İnce bağırsak, beyin ve deri dokusu Mayalar Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotropical Bakteriler Escherichia coli, Bacillus megaterium, Thermus aquaticis, Streptococus lactis, Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactabacillus helvenous Mantarlar Neurospora crassa, Asperigillus foetidus, Asperigillus niger, Asperigillus flavus, Asperigillus oryzeae, Asperigillus phoenicis, Mucur pucillus, Alternaria palmi, Mucur mieheri Farklı kaynaklardan saflaştırılan β-galaktozidazlar farklı özellikler göstermektedirler. Çizelge 2.5 te farklı kaynaklardan saflaştırılan β-galaktozidazların çeşitli özellikleri verilmektedir [Gekas ve Lopez-Leiva, 1985]. Çizelge 2.5. Farklı kaynaklardan saflaştırılan β-galaktozidazların özellikleri [Gekas ve Lopez-Leiva, 1985]. Kaynak Optimum ph Optimum sıcaklık Molekül kütlesi (kda) Aktivatörler ve diğer durumlar A. niger 3,0-4, A. oryzae 5, Mn +2, K +2 K. fragilis 6,9-7, Mn +2, Na +2 K. lactis 7, K +2, Na +2 E. coli 6,2-7, C. inaegualis 6, Yağsız süt için B. circulans 6, yüksek aktivite Bacillus sp. 6,5-7,5 65 L. bulgaricus S. thermophilus

44 β-galaktozidaz ın etki mekanizması Laktoz hidrolizi Laktoz, diğer adıyla süt şekeri sütün başlıca karbonhidratıdır. Süt kuru maddesinin miktarca en önemli kısmını teşkil etmektedir. Sütte yaklaşık %4,5-4,7 oranında bulunan laktoz, toplam kuru maddenin ortalama %37 sini oluşturmaktadır [Sezgin, 2012]. Laktoz diğer şekerlerden farklı olarak fizyolojik üstünlüğe sahiptir. Laktozun yapısındaki galaktozun beyin dokusundaki glikolipitlerin kaynağını teşkil etmesi ve özellikle gençlerde sinir dokusunun sentezinde önemli olması nedeniyle de beslenmede büyük öneme sahiptir [Tekinşen ve Atasever, 1994]. Laktozun hidrolizinde enzimatik ve asidik olmak üzere iki yöntem uygulanmaktadır. Asidik hidrolizin aksine enzimatik hidrolizde işlem koşulları daha kolaydır ve enzimatik hidrolizde yan reaksiyon ve ürünleri oluşmaz. Bu nedenle enzimlerin kullanımı ile seçici hidroliz sağlanır ve potansiyel olarak daha güvenli ve daha fazla ürün üretilir [Akgül ve ark., 2012]. Wallenfels ve Malhotra [1962], E. coli den elde edilen beta galaktozidazının kullanılmasıyla laktozun hidroliz mekanizmasını tanımlamışlardır. Çeşitli literatürlerde de beta galaktozidazın hidroliz mekanizması tanımlanmaktadır [Zhou ve Chen, 2001; Richmond ve ark., 1981]. E. coli ve K. fragilis den izole edilen beta galaktozidaz, aktif bölgesinde proton alıcı olarak sülfidril grubu içermekte ve nükleofil görevini yüklenen proton verici olarak bulunan imidazol grubu aracılığıyla glikozid bağının parçalanmasını sağlamaktadır. Reaksiyonun ilk basamağında enzim galaktozil kompleksi oluşur ve eş zamanlı olarak glikoz ayrılır. İkinci basamakta enzim galaktozil kompleksi hidroksil grubu ihtiva eden akseptöre aktarılır (Şekil 2.7) [Zhou ve Chen, 2001].

45 28 Şekil 2.7. Beta-Galaktozidaz tarafından laktozun hidrolizi [Richmond ve ark., 1981]. a. Beta galaktozidazın aktif bölgesinde laktoz b. Beta galaktozidaz kompleks + glikoz c. Beta galaktozidaz-galaktoz molekülü d. Beta galaktozidazın aktif bölgesinde galaktoz Bazı literatürlerde mikrobiyal kökenli beta galaktozidaz enziminin aktif bölgesinde glutamik asit artığının bulunduğu öne sürülmektedir. Enzim aktif bölgesinde proton alıcı ve proton verici olmak üzere iki glutamik asit artığı (Glu 482 ve Glu 551 gibi) bulunmaktadır [Zhou ve Chen, 2001]. Enzimin reaksiyon mekanizmaları aynı olmakla birlikte sadece proton alıcı ve proton verici moleküllerde farklılık bulunmaktadır.

46 29 Galaktooligosakkarit oluşumu Yüksek laktoz konsantrasyonu, yüksek sıcaklık ve düşük su miktarının sağlandığı reaksiyon koşullarında beta galaktozidaz transgalaktozilasyon yani geri dönüşüm reaksiyonu ile bağırsakta yararlı bakterilerin gelişmesini sağlayan galaktooligosakkaritlerin oluşumunu katalizlemektedir [Alagöz, 2007; Brena ve ark., 2003]. Oluşan galaktooligosakkaritler önemli prebiyotik özelliklere sahiptir [Macfarlane ve ark., 2008]. Beta-Galaktozidaz tarafından katalizlenen galaktooligosakkarit oluşumunun mekanizması Şekil 2.8 da verilmiştir. Şekil 2.8. Beta-Galaktozidaz tarafından katalizlenen galaktooligosakkarit oluşumu [Richmond ve ark., 1981]. a. Beta galaktozidaz-galaktoz molekülü b. Beta galaktozidazidazın aktif bölgesinde oligosakkarit Enzim, galaktozu hidroksil grup içeren nükleofilik akseptöre transfer etmektedir. Transfer suya olursa galaktoz, eğer başka bir karbonhidrata olursa di, tri ve daha büyük galaktooligosakkaritler yani yaygın adıyla GOS ler oluşmaktadır. Çoğu koşullarda ortamdaki yüksek su varlığından dolayı hidrolitik yön daha baskındır ve bundan dolayı GOS üretimi ve verimi düşüktür. Verimi artırmak için su içeriği azaltılmalı ve/veya şeker konsantrasyonu artırılmalıdır. GOS ler glikoz ve galaktoz ünitelerinden meydana gelmiş şekerler olup, kimyasal/enzimatik hidrolizle ya da sentezle ve mikroorganizmalar tarafından üretilebilmektedirler [Aykut ve ark., 2008].

47 30 Çizelge 2.6 da β-galaktozidaz üreticilerinin ürettiği GOS ve yan ürünleri bulunmaktadır. Çizelge 2.6. Beta galaktozidaz tarafından bazı galaktooligosakkaritlerin üretimi [Asraf ve Gunasekaran, 2010]. Beta galaktozidaz üreticileri Lactobacillus sp. B. longum BCRC Galaktooligosakkaritler (GOS) ve yan ürünleri β-d-galp-(1 6)-D-Glc, β-d-galp-(1 6)-D-Lac, β-d-galp-(1 6)-D-Gal, β-d-galp-(1 3)-D-Lac, β-d-galp-(1 3)-D-Gal tri-, tetrasakkarit, laktoz, galaktoz, glikoz L. reuteri β-d-galp-(1 6)-D-Glc, β-d-galp-(1 6)-D-Gal, β-d-galp-(1 3)-D-Gal β-d-galp-(1 6)-D-Lac β-d-galp-(1 3)-D-Lac L. delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus plantarum Galaktoz, laktik asit, asetik asit, etanol β-d-galp-(1 6)-D-Lac, β-d-galp-(1 6)-D-Glc β-galaktozidaz ın kullanım alanları Beta galaktozidaz (β-galaktozidaz, EC süt endüstrisinde yaygın olarak kullanılır. Yoğurt ve süt ürünlerinde beta galaktozidaz tatlılığı arttırmak için kullanılmıştır [Beermann ve Hartung, 2012]. Beta-D-galaktozidazın gıda endüstrisi, biyoremediasyon, biyosensör, çeşitli hastalıkların tanı ve tedavisi gibi bir dizi uygulama alanı vardır. Mikrobiyal beta galaktozidazlar biyosensör, laktoz hirolize süt ve etanol gibi çeşitli endüstriyel ürünlerin üretimindeki rolleri açısından önemli bir konuma sahiptir [Asraf ve Gunasekaran, 2010]. Marrakchi ve ark., [2008] ticari süt örneklerinde laktozun kantitatif tayini için uygulanan beta galaktozidaz ve glikoz

48 31 oksidaz olan iki ayrı enzimatik faaliyeti ilişkilendirerek bir biyosensör geliştirmişlerdir. Laktozun hidrolizi, yiyecek ve içecek endüstrisinde içeriğinde laktoz olmayan yeni ürünlerin üretimi için kullanılır. Dünya daki insanların çoğunda bağırsakta bulunması gereken β-galaktozidaz bazı insanlarda hiç aktivite göstermez veya aktivitesini zamanla kaybeder. Bu nedenle laktoz intolerans problemi bulunan insanlarda sütteki laktozun uzaklaştırılması için beta galaktozidaz enzimi kullanılmaktadır [Pivarnik ve ark., 1995]. Laktoz kolay kristalize olan bir yapıya sahip olduğundan dondurma gibi donmuş gıdalarda kristalleşmeyi önlemek amacıyla beta galaktozidaz kullanılır [Fadıloğlu ve Erkmen, 2004; Pivarnik ve ark., 1995; Ogunrınola ve ark., 1988]. Son yıllarda pre- ve probiyotik ile yapılan fonksiyonel gıdalar üzerine birçok araştırma yapılmıştır. Peynir altı suyu sahip olduğu proteinler, laktoz, mineraller ve değerli süt besinleri açısından yapısı nedeniyle çok büyük terapotik uygulamaya sahiptir [Asraf ve Gunasekaran, 2010]. Mikrobiyal beta galaktozidaz üretimi peynir altı suyu kullanımında önemli bir alana sahiptir. Şekerleme üretiminde tatlılık oranını arttırmak için laktoz, beta galaktozidaz enzimi ile tatlılık oranı daha fazla olan, glikoz ve galaktoza hidroliz edilmektedir [Pivarnik ve ark., 1995]. Ayrıca fermente ve alkolsüz içkilerin üretiminde [Pivarnik ve ark., 1995] ve fırıncılıkta mayanın gelişmesi için [Pomeranz, 1964] β-galaktozidaz enziminden faydalanılmaktadır.

49 32 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Çalışmada kullanılan 39 adet tavuk, peynir, yoğurt ve yeni doğan izolatı olan Lactobacillus spp. ve 3 adet yenidoğan gaitası izolatı olan Bifidobacterium spp. olmak üzere toplam 42 adet suş, Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Laboratuvarı kültür koleksiyonundan temin edilmiştir. Çalışmada kullanılan suşlar, izolasyon kaynakları ve gelişme sıcaklıkları Çizelge 3.1 de gösterilmektedir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan suşlar, izolasyon kaynakları ve gelişme sıcaklıkları Bakteri Suşları İzole Edildiği Kaynak Gelişme Sıcaklığı Lactobacillus acidophilus BAZ54 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ51 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ59 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ63 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ29 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ43 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ22 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ61 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus ZYN13 Tavuk 37 ºC Lactobacillus acidophilus BAZ36 Tavuk 37 ºC Lactobacillus salivarius ZYN9 Tavuk 37 ºC Lactobacillus salivarius ZYN15 Tavuk 37 ºC Lactobacillus salivarius ZYN23 Tavuk 37 ºC Lactobacillus fermentum ZYN17 Tavuk 37 ºC Lactobacillus rhamnosus BAZ78 Tavuk 37 ºC Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii BAZ32 Tavuk 37 ºC Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii ZYN33 Tavuk 37 ºC Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii ZYN31 Tavuk 37 ºC Lactobacillus rhamnosus SMP6-5 Peynir 42 ºC Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BKS20 Peynir 42 ºC Lactobacillus acidophilus ACS6 Peynir 42 ºC Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B3 Yoğurt 37 ºC

50 33 Çizelge 3.1. (Devam) Çalışmada kullanılan suşlar, izolasyon kaynakları ve gelişme sıcaklıkları Bakteri Suşları İzole Edildiği Kaynak Gelişme Sıcaklığı Lactobacillus brevis LB63 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB65 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB68 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LE4 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LE7 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB17 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB19 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB6 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB23 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB49 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB61 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB83 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB64 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus casei LB74 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus fermentum LB16 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus rhamnosus GD11 Yenidoğan gaitası 37 ºC Lactobacillus rhamnosus LP2 Yenidoğan gaitası 37 ºC Bifidobacterium breve A26 Yenidoğan gaitası 37 ºC Bifidobacterium breve A28 Yenidoğan gaitası 37 ºC Bifidobacterium longum BASO15 Yenidoğan gaitası 37 ºC Araştırmada kullanılan besiyerleri Çalışmada kullanılan besiyerleri için, maddeler distile su ile 1 L ye tamamlanmıştır. Besiyerinin agar formunun hazırlanılması durumunda %1,5 g Agar (Merck) eklenilmiştir. 1 M HCl ve/veya 1 M NaOH ile uygun ph ya ayarlanarak, otoklavda 121ºC da 15 dak sterilizasyonu yapılmıştır. Çalışmada Laktobasillerin geliştirilmesinde Man & Rogosa ve Sharp (MRS) besiyeri, enzim üretim ortamı olarak ise MRS-Lac kullanılmıştır [De Man ve ark., 1960]. Bifidobakterilerin

51 34 aktifleştirilmesinde ise Trypticase Phytone Yeast Extract (TPY) besiyeri, enzim üretim ortamı olarak TPY-Lac besiyeri kullanılmıştır [Scardovi, 1986]. Man & Rogosa ve Sharp (MRS) Pepton Yeast Ekstrakt Beef Ekstrakt Glikoz K 2 HPO 4 Sodyum Asetat MgSO 4 x 7H 2 O MnSO 4 x H 2 O Amonyum Sitrat Tween 80 (ph 6,2) 10 g/l 5 g/l 10 g/l 20 g/l 2 g/l 5 g/l 0,2 g/l 0,05 g/l 2 g/l 1,08 ml/l MRS-Lac Lactobasillerin enzim üretimi amacıyla Man & Rogosa ve Sharp-Lactose (MRS-Lac) besiyeri kullanılmıştır. MRS-Lac besiyeri, MRS içeriğinde bulunan glikoz yerine aynı oranda laktozun (%2) kullanılması ile hazırlanmıştır (ph 6,2). MRS X-gal agar Otoklavda glikoz çıkartılarak hazırlanan ve steril edilen MRS agar besiyeri 65ºC ye kadar soğuduktan sonra 40 μg/ml olacak şekilde X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolylbeta-D-galaktopiranosid, 20 mg/ml DMSO, Sigma) eklenmiştir (ph 6,2).

52 35 Sisteinli Man & Rogosa ve Sharp-Lac (MRSC-Lac) MRSC-Lac besiyeri, Man & Rogosa ve Sharp-Lac besiyeri (MRS-Lac) içeriğine 0,5 g/l L-sistein (Merck) eklenmesiyle hazırlanmıştır (ph 6,2). Trpticase Phytone Yeast Extract besiyeri (TPY) Pepton Soya pepton Yeast Ekstrakt Glikoz L-sistein K 2 HPO 4 MgCl 2.6H 2 O ZnSO 4.7H 2 O CaCl 2 FeCl 3.6H 2 O Tween 80 Glasiyel Asetik Asit (ph 6,0) 7 g/l 5 g/l 5 g/l 15 g/l 0,5 g/l 2 g/l 0,5 g/l 0,25g/L 0,15 g/l 0,01 g/l 1 ml/l 1 ml/l TPY-Lac Bifidobakteriler için enzim üretimi amacıyla Trpticase phytone yeast extract-lactose (TPY-Lac) besiyeri kullanılmıştır. TPY-Lac besiyeri, TPY içeriğinde bulunan glikoz yerine aynı oranda laktozun (%2) kullanılması ile hazırlanmıştır (ph 6,2) Araştırmada kullanılan tampon ve çözeltiler Potasyum fosfat tamponu (0,03 M, ph 6,8) 0,03 M dipotasyum hidrojen fosfat (K 2 HPO 4, Merck)

53 36 0,03 M potasyum dihidrojen fosfat (KH 2 PO 4, Merck) Sodyum fosfat tamponu (0,03 M, ph 6,8) 0,03 M disodyum hidrojen fosfat (Na 2 HPO 4, Merck) 0,03 M sodyum dihidrojen fosfat (NaH 2 PO 4, Merck) TRİS-HCl tamponu (0,03 M, ph 6,8) 0,03 M Tris (Trisma Base, Sigma) 0,03 M HCl (Merck) TRİS-NaCl tamponu (0,03 M, ph 6,8) 0,03 M Tris (Trisma Base, Sigma) 0,03 M NaCl (Sodyum klorür, Merck) TRİS-sodyum fosfat Tamponu (0,03 M, ph 6,8) 0,03 M Tris (Trisma Base, Sigma) 0,03 M sodyum dihidrojen fosfat (NaH 2 PO 4, Merck) Serum fizyolojik (SF) Sodyum klorür (NaCl, Merck) 8,75 g/l Enzimin ekstraksiyon yöntemlerinde kullanılan kimyasallar Kloroform/SDS 1 ml bakteri kültürü için 50 µl kloroform (Merck) ve 0,1% SDS (Sigma) kullanılmıştır [Miller, 1972].

54 37 Toluen/Aseton Toluen (Merck)/aseton (Merck) solüsyonu 1:9 (v/v) oranında hazırlanmıştır [Meira ve ark., 2012]. Triton X-100 %0,1 lik triton X-100 (Sigma) solüsyonu hazırlanmıştır [Lapierre ve ve ark., 2002] SDS-PAGE için kullanılan çözeltiler Akrilamid stok solüsyonu Çizelge 3.2 de verilen oranlarda Akrilamid ve Bis akrilamid, 75 ml distile suda çözülerek, son hacim 100 ml olacak şekilde saf su ile tamamlanmıştır. Whatman No:1 filtre kağıdından süzülerek, renkli cam şişelerde +4 C da en fazla 1 ay muhafaza edilmiştir. Ayırma jel tamponu Ayırma jelinin hazırlanmasında kullanılan kimyasal maddeler (Çizelge 3.2), 75 ml distile suda çözüldükten sonra, 6 M HCl (Merck) ile ph 8,6'ya ayarlanmıştır. Son hacim 100 ml olacak şekilde saf su ile tamamlanmıştır. Otoklavda 121 C'da 15 dak sterilizasyonu yapılmış ve +4 C'de muhafaza edilmiştir. Yığma jel tamponu Çizelge 3.2 de verilen oranlarda, yığma jelinin hazırlanmasında kullanılan kimyasal maddeler, 75 ml distile suda çözüldükten sonra, HCl (Merck) ile ph 6,8'e ayarlanmıştır. Son hacim 100 ml olacak şekilde saf su ile tamamlanmıştır. Otoklavda 121 C'da 15 dak sterilizasyonu yapılmış ve +4 C'de muhafaza edilmiştir.

55 38 Koşturma tamponu Koşturma tamponu hazırlanmasında kullanılan kimyasal maddeler (Çizelge 3.2), 1000 ml distile suda çözülmüştür. Örnek tamponu Çizelge 3.2 de verilen karışımların hacmi 20 ml'ye saf su ile tamamlanmış ve renkli cam şişede oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. Boyama Çözeltisi Boya çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan kimyasal maddeler (Çizelge 3.2) 880 ml distile suda çözündükten sonra Whatman No: l filtre kağıdından süzülerek, renkli cam şişelerde oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. Boya Giderici Çözelti Çizelge 3.2 de verilen oranlarda hazırlanan çözelti oda sıcaklığında renkli cam şişede muhafaza edilmiştir.

56 39 Çizelge 3.2. SDS-PAGE için kullanılan çözeltiler Akrilamid+N, N'-Metilen Bis Akrilamid Stoğu (%30'luk) Akrilamid (Sigma) 28,80 g Bis akrilamid (Sigma) 1,20 g Ayırma Jel Tamponu (1,5 M Tris-HCl, ph: 8,6) Trizma base (Sigma) 18,16 g SDS (Sigma) 0,40 g Yığma Jel Tamponu (0,5 M Tris-HCl, ph 6,8) Trizma base (Sigma) SDS (Sigma) Koşturma Tamponu Trizma base (Sigma) Glisin (Sigma) SDS (Sigma) Örnek Tamponu (4x) 0,5 M Tris-HCl, ph:6,8 Gliserol (Merck) Bromo fenol blue (Sigma) SDS (Sigma) 2-β ME (Sigma) Distile su Boyama Çözeltisi Glasiyel Asetik Asit (Merck) Metanol (Merck) Coomassie Brillant Blue R250 (Sigma) Distile su Boya Giderici Çözelti Glasiyel Asetik Asit (Merck) Metanol (Merck) Distile su 6,05 g 0,40 g 6,05 g 5,76 g 0,40 g 5,12 ml 8,00 ml 4,00 mg 2,00 g 4,00 ml 3,00 ml 70,00 ml 50,00 ml 1,50 g 880 ml 70,00 ml 50,00 ml 880,00 ml 3.2. Metot Bakterilerin aktifleştirilmesi ve gelişme ortamları Deney çalışmalarında Laktobasiller için uygun besiyeri olarak MRS (Man-Rogosa Sharpe) ve MRS-Lac kullanılmıştır. Gıda kaynaklı Laktobasillerin 42ºC de diğer Laktobasillerin, aerobik koşullarda saatlik ikinci defa aktifleştirilmiş kültürleri kullanılmıştır [De Man ve ark., 1960].

57 40 Çalışmada Bifidobakterilerin geliştirilmesi ve aktifleştirilmesinde TPY (Trypticase Phytone Yeast Extract) besiyeri kullanılmıştır. Ayrıca tüm deneysel çalışmalar, anaerobik jar (Oxoid, Anaerojar) içerisinde 37 C de saat, ortama %10 CO 2 salınımını sağlayan anaerobik kit kullanılarak (Oxoid, Anaerobic generating kit) geliştirilmiş ve tüm çalışmalarda iki kere aktifleştirilmiş kültürler kullanılmıştır [Beerens, 1990] Bakterilerin muhafazası Bakteriler uygun sıvı besi ortamında iki kez ard arda aktifleştirilip, aktif kültürlerden 300 µl gliserol (Merck) içeren steril cryo tüplere paralelli olarak aktarılmıştır. Derin dondurucuda (-30 o C ve -80 o C) depolanarak, muhafaza edilmiştir [Okereke ve Montville, 1991] β-galaktozidaz aktivitesinin X-gal ile belirlenmesi DMSO (dimetilsülfoksit, Sigma) içerisinde 20 mg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-d-galactopyranoside, Sigma) hazırlanmıştır. 60 μl X-gal substratı MRS agar üzerine dökülmüş daha sonra petri 37ºC'de 1 saat inkübasyona bırakılmıştır. X- gal içeren MRS agar üzerine Densimat (Biomerioux) ile Mcfarland 0,5 e ayarlanan bakteri kültürlerinden 20 μl konulmuştur. Paralel olarak 50 µl bakteri kültürü X-gal içeren MRS agara drigalsi özesi ile ekilmiştir. Besyerinde renk oluşumu için Laktobasiller saat Bifidobakteriler ise saat 37ºC'de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda mavi-yeşil renk oluşumu, kültürün β- galaktozidaz aktivitesine sahip olduğu şeklinde yorumlanmıştır [Gheytanchi, 2010] β-galaktozidaz enzim ekstraktının hazırlanması Bakteri kültürlerinin enzim aktivitelerini belirlemek amacıyla, kültürler uygun besiortamında iki kez aktifleştirildikten sonra 5000 rpm de 20 dak +4ºC'da santrifüj yapılmıştır (Sigma 2-16 KC). Enzimin hücre içi enzim olması sebebiyle enzim aktivitesinin belirlenmesinde hücre pelleti kullanılmıştır. Hücre pelleti serum

58 41 fizyolojik (SF) ile iki kez yıkanmıştır. Kültürlerin optikal yoğunlukları, içinde 5 ml SF bulunan cam tüplerde Densimat (Biomerioux) ile Mc Farland 6 ya ( ~ 18 log cfu/ml) ayarlanmıştır. Mc Farland 6 ya ayarlanan kültür, 5000 rpm de 10 dak +4ºC' da santrifuj (Sigma 2-16 KC) kullanılarak SF uzaklaştırılmıştır. 0,03 M potasyum fosfat tamponuyla (ph 6,8) yıkanmış ve tampondan 1 ml eklenerek enzim ekstraksiyon basamağına hazırlanmıştır. Bakterilerden hücre duvarını parçalamak amacıyla, 50 MHz frekansına ayarlanan ultrasonikasyon (Vibra-Cell, Sonics&Materials Inc. Danbury, CT USA marka) cihazı kullanılmıştır. Buz içerisinde bulunan örnekler 5 dak sonikasyona maruz bırakılmıştır. Hücre atıklarının uzaklaştırılması amacıyla 1000 rpm de 10 dak +4ºC'da santrifüj işlemi uygulanmıştır ve süpernatant ham enzim ekstraktı olarak kullanılmıştır [Zhang ve ark., 2012] Protein konsantrasyonlarının belirlenmesi Kültürlerin protein konsantrasyonu, Bradford Reagent Kit (Amresco) kullanılarak belirlenmiştir. 0,0025-0,05 mg/ml arasında değişen konsantrasyonlarda Bovine serum albumin (BSA) standart olarak kullanılmıştır β-galaktozidaz enzim aktivitesinin belirlenmesi β-galaktozidaz aktivitesinin ölçümünde Shah ve Otieno (2007) nun metodu kullanılmıştır. Aktivitenin belirlenmesinde o-nitrofenil-β-d-galaktopiranozit (o- NPG, Sigma) substrat olarak kullanılmıştır. 0,03 M potasyum fosfat tamponu (ph 6,8) içinde, 0,2 ml 15 mm o-nitrofenil-β-d-galaktopiranozit (o-npg) içeren karışıma, enzim ekstraktından 1 ml ilave edilerek reaksiyon başlatılmıştır. 37ºC da 15 dak inkübasyona bırakılmış, 1 M 0,5 ml sodyum karbonat (Merck) solüsyonu ilavesiyle reaksiyon durdurulmuştur rpm de 10 dak +4ºC'da santrifüj işlemi uygulanmıştır ve spektrofotometre cihazı ile (Hitachi UV-1800, Japonya) 420 nm dalga boyunda absorbans değeri okunmuştur. Aynı işlem ham ekstrakt yerine 1 ml 0,03 M potasyum fosfat tamponuyla (ph 6,8) tekrarlanarak körv hazırlanmıştır. 1

59 420 nm Absorbans 42 ünite β-galaktozidaz aktivitesi dakikada 1 μmol o-nitrofenolü serbest bırakan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Bir miligram (mg) proteinde bulunan enzim ünite sayısı ise spesifik aktivite olarak kabul edilmektedir. β-galaktozidaz aktivitesi, 420 nm dalga boyunda okunan absorbans değerleri ve kalibrasyon eğrisinin eğiminden (Şekil 3.1) faydalanarak aşağıda belirtildiği gibi hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi ( U OD ml) k V t t V Dil e Enzim aktivitesi ( U / ml) Spesifik aktivite ( U / mg) Protein miktarı ( mg / ml) OD 420 = 420 nm de ölçülen absorbsiyon Vt = Tüpte hazırlanan toplam reaksiyon hacmi (1,7 ml) Ve = Küvette okutulan reaksiyon karışımındaki enzim hacmi (1 ml) k = Standart eğrinin eğimi t = Reaksiyon zamanı (15 dak) Dil = Dilüsyon faktörü 2,5 2 ONP Standart Eğrisi y = 1,734x + 0,016 R² = 0,9985 1,5 1 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 ONP (μmol/ml) Şekil 3.1. ONP standart eğrisi

60 β-galaktozidaz enziminin optimizasyonu β-galaktozidaz aktiviteleri belirlenen kültürlerden, en yüksek spesifik aktiviteyi gösteren 4 adet laktobasil (L. fermentum ZYN17, L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11 ve L. casei LB65) ve 1 adet bifidobakteri (Bifidobacterium breve A26) suşu seçilerek farklı ph, sıcaklık, tampon ve besiortamındaki enzim aktivitelerinin optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Farklı ph lardaki aktivitelerin belirlenmesi için, reaksiyon ortamında kullanılan 0,03 M potasyum fosfat tamponunun ph sı 5,5; 6,0; 6,8; 7,0; 7,5 ve 8,0 değerlerine ayarlanmıştır. Bu ph değerlerinde enzim aktivitesi te belirtildiği şekilde ölçülerek, ph ın aktivite üzerindeki etkisi belirlenmiştir [Kara, 2004]. 0,03 M potasyum fosfat tamponu (ph 6,8) içinde, 15 mm 0,2 ml o-nitrofenil-β-dgalaktopiranozit (o-npg, Sigma) içeren karışıma hücre süspansiyonundan 1 ml eklendikten sonra, farklı reaksiyon sıcaklıklarında (30 o C, 35 o C, 37 o C, 40 o C ve 45 o C) ürün oluşumu sağlanmıştır. Sarı renkli ürün oluşumundan yararlanarak enzim aktivitesi ölçülerek, sıcaklığın aktivite üzerindeki etkisi tespit edilmiştir [Ismail ve ark., 2010]. Enzim aktivitesinin belirlenmesinde 0,03 M ve ph sı 6,8 olan potasyum fosfat, sodyum fosfat, Tris-HCl, Tris-NaCl ve Tris-potasyum fosfat tamponlarının reaksiyon ortamında kullanılmasıyla, tamponların enzim aktivitesi üzerindeki etkisi belirlenmiştir [Citti ve ark., 1965] Farklı laktoz (substrat) konsantrasyonlarının enzim aktivitesine etkisi Laktobasillerden β-galaktozidaz enziminin üretiminde uygun laktoz (substrat) konsantrasyonunun belirlenmesi için, MRS sıvı besiyeri içine %2 oranında glikoz (Merck) yerine, %1, %2, %4, %6, %8 ve %10 oranlarında laktoz (Merck) kullanılarak, enzim aktiviteleri belirlenmiştir [Hsu ve ark., 2005].

61 Yapay mide suyu ve bağırsak sıvısında β-galaktozidaz aktivitesinin belirlenmesi Yüksek spesifik aktiviteye sahip suşlar, farklı ph lardaki yapay mide suyunda ve yapay bağırsak sıvısında geliştirilerek β-galaktozidaz enzim aktiviteleri te belirtildiği şekilde tespit edilmiştir. Yapay mide suyu: %0,5 lik serum fizyolojik içinde son konsantrasyon 3 g/l olacak şekilde pepsinin (Sigma, 1:10000 ICN) çözülmesiyle hazırlanmıştır. Hazırlanan mide sıvısının ph sı 2,0, 3,0, 4,0 ve 7,0 ye 4 M HCl (Merck) ve 0,1 M NaOH (Merck) ile ayarlanmıştır. 0,45 µm çaplı disposable filtre ile steril edilmiştir. Yapay ince bağırsak sıvısı: %0,5 lik serum fizyolojik içinde son konsantrasyon 1 g/l olacak şekilde pankreatinin USP (Sigma, P-1500) çözülmesiyle hazırlanmıştır. Hazırlanan yapay ince bağırsak sıvısı %0,30 safra tuzu (Sigma) ile süspanse edilmiş ve ph sı 0,1 M NaOH ile 5,5, 6,5, 7,5 ve 8,0 e ayarlanmıştır. 0,45 µm çaplı filtreden geçirilerek steril edilmiştir β-galaktozidaz aktivitesi üzerine enzim ekstraksiyon yönteminin etkisi β-galaktozidaz laktik asit bakterilerinde intrasellüler enzim olduğundan, enzim aktivitesinin belirlenmesinden önce hücre geçirgenliğini arttırmak veya hücreleri parçalamak gerekmektedir. Bu amaçla 4 farklı enzim ektraksiyon yöntemi kullanılarak enzimin hücre dışına çıkarılması sağlanarak bu yöntemlerin karşılaştırılması sağlanmıştır. Enzim ekstraksiyonunda fiziksel veya kimyasal yöntemler kullanılmıştır. Fiziksel yöntem olarak ultrasonikasyon kullanılırken kimyasal yöntemlerden triton X-100, toluen/aseton ve kloroform/sds solüsyonları kullanılmıştır. Hücre atıklarının uzaklaştırılması amacıyla 1000 rpm de 10 dak +4ºC'da santrüfüj işlemi uygulanmış ve süpernatant enzim ekstraktı olarak β- galaktozidaz enzim aktivitesi tayininde kullanılmıştır.

62 45 Ultrasonikasyon Bakterilerin hücre duvarını parçalamak için, 50 MHz frekansına ayarlanan ultrasonikasyon (Vibra-Cell, Sonics&Materials Inc. Danbury, CT USA marka) cihazı kullanılarak te belirtilen metoda göre enzim ekstraktı hazırlanmıştır. β- galaktozidaz enzim aktiviteleri te belirtildiği şekilde tespit edilmiştir [Zhang ve ark., 2012]. Kloroform/SDS Mc Farland 6 ya ( ~ 18 log cfu/ml) ayarlanmış örnek 0,03 mol/l potasyum fosfat (ph 6,8) tamponuyla yıkanarak aynı tamponla süspanse edilen örnek üzerine 50 μl kloroform (Merck) ve 50 μl %0,1 SDS (Sigma) eklenerek 10 saniye düşük hızda vortekslenmiş, 1 dak 37 o C de su banyosunda bekletilmiştir. Böylece hücrelerin geçirgenliği sağlanarak enzim ekstraktı elde elde edilmiş olur [Miller, 1972]. Toluen/Aseton Mc Farland 6 ya ( ~ 18 log cfu/ml) ayarlanmış örnek 0,03 mol/l potasyum fosfat (ph 6,8) tamponuyla yıkanarak aynı tamponla süspanse edilen örnek üzerine toluen (Merck)/aseton (Merck) (1:9 v/v) solüsyonundan 50 μl ilave edilerek 7 dak düşük hızda vortekslenmiştir [Meira ve ark., 2012]. Triton X-100 Mc Farland 6 ya ( ~ 18 log cfu/ml) ayarlanmış örnek 0,03 mol/l potasyum fosfat (ph 6,8) tamponuyla yıkanarak aynı tamponla süspanse edilen örnek üzerine distile su içerisinde hazırlanan 0,2 ml %0,1 lik triton X-100 (Sigma) solüsyonu eklenerek 30 dak oda sıcaklığında bekletilmiştir (Lapierre ve ark., 2002).

63 β-galaktozidaz enziminin kısmi saflaştırılması β-galaktozidaz aktivitesi gösterdiği belirlenen bakteri kültürlerinin sahip oldukları enzimin saflık derecesini belirlemek için saflaştırma işlemi uygulanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucu en yüksek β-galaktozidaz enzim aktivite yeteneği gösteren Lactobacillus fermentum ZYN17 suşu kullanılmıştır te belirtilen metoda göre elde edilen ham enzim ekstraktı saflaştırma basamaklarında örnek olarak kullanılmıştır. Ham enzim ekstraktı dahil bütün basamakların sonunda protein miktarı ve enzim aktivitesi (3.2.4 te belirtilen metoda göre) tayin edilmiştir. β- galaktozidaz enziminin saflaştırılmasının ilk basamağında, ham enzim ekstraktı %60-80 konsantrasyonunda amonyum sülfat (Merck) ile çöktürülmüş ve daha sonra tuzun ortamdan uzaklaştırılması için diyaliz işlemi uygulanmıştır [Sarıkaya, 1995]. Diyalizat ultrafitrasyon ile konsatre edilerek elde edilen çözeltiye 10 dak 70ºC lik ısı ile muamele edilmiştir [Keskineğe ve Sunguroğlu, 1999]. Amonyum sülfat ile çöktürme Ham enzim ekstraktı içerisinde manyetik balık bulunan steril şişe içerisine alınmış, şişe manyetik karıştırıcı üzerindeki buz dolu bir beherin içine yerleştirilmiştir. %20 oranında olacak şekilde tartılan amonyum sülfat (Merck) soğuk havanda toz haline getirilip, sürekli karıştırılarak çözeltiye yavaş yavaş eklenmiştir. Tuzun çözünmesinin ardından, dak daha karıştırılan çözelti 10000xg de 10 dak santrifüjlenerek çözeltinin üst sıvısı alınmıştır. %20 oranında amonyum sülfat bulunan çözeltiye aynı şekilde, amonyum sülfat eklenerek konsantrasyonu %40 a ayarlanmış ve 10000xg de 10 dak santrifüjlenerek çözeltinin üst sıvısı atılmıştır. Çökelti, 0,03 M potasyum fosfat tamponunda (ph 6,8) süspanse hale getirilmiştir. Aynı yöntemler ile %40-60 ve %60-80 konsantrasyonlarında da çöktürülmüştür. [Temizkan ve ark., 2008]. Amonyum sülfat konsantrasyonunun sağlanması için gereken amonyum sülfat miktarı aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır.

64 ( S 1 S2 ) X 1 0,285 S2 X= 1 L çözeltiye eklenecek gram amonyum sülfat miltarı S 1 = Amonyum sülfatın ilk konsantrasyonu (% kesirli) S 2 = Amonyum sülfatın son konsantrasyonu (% kesirli) Diyaliz Amonyum sülfat tuzu ile çöktürülen enzim çözeltisi amonyum sülfat tuzunun uzaklaştırılması amacıyla diyaliz kasetine (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes (20K MWCO)) doldurulmuştur. Diyaliz kaseti, manyetik karıştırıcı ile +4 C da 1 gece çok yavaş bir şekilde karıştırılarak 0,03 M potasyum fosfat tamponuna (ph 6,8) karşı diyaliz edilmiştir. Diyaliz tamponu birkaç kez değiştirilmiştir. Diyaliz işlemi ile çözeltiden (NH 4 ) 2 SO 4 ın giderilip giderilmediği, kullanılan tampon çözeltisine, doygun baryum klorür ün (BaCl 2 ) eklenmesiyle tespit edilmiştir. 0,03 M potasyum fosfat tampon (ph 6,8) çözeltisinden alınan 10 ml örnek üzerine, BaCl 2 ün tampon çözelti ile etkileşimini önlemek amacıyla, 0,1 M HCl çözeltisinden birkaç damla eklenmiştir. Çözeltide sülfat anyonunun varlığını tespit etmek için, çözeltiye 2 ml doygun BaCl 2 eklenmiştir. Çözeltide bulanıklılık gözlenmemesi, çözelti içinde sülfat anyonunun bulunmadığının göstergesi olarak yorumlanmıştır [Sarıkaya, 1995]. Elde edilen diyalizatın, protein ve enzim aktivite tayinleri yapılmıştır. Konsantre edilmesi Diyalizat, ultra santrifüj filtrasyon tüpüne (Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units, 100K) aktarılmıştır. Daha sonra örnek 5000 rpm de 20 dak santrifüj edilerek konsantre hale getirilmiştir.

65 Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Lactobacillus fermentum ZYN17 suşunun sahip olduğu β-galaktozidaz enziminin kısmi olarak saflaştırılıp saflaştırılmadığının belirlenmesi amacıyla sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) yöntemi kullanılmıştır. Sodyum dodesil sülfat poli akrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE), saflaştırma basamaklarını takip etmede ve saflaştırılmaya çalışılan enzimin molekül ağırlığının belirlenmesinde kullanılmıştır. SDS-PAGE Laemmli'ye [1970] göre yapılmıştır. Ayırma jeli hazırlanarak (Çizelge 3.3) 1 mm aralığa sahip iki cam arasına belli bir mesafeye kadar aktarılmıştır. Üst kısım hava temasını önlemek ve jelin düzgün polimerleşmesini sağlamak amacıyla distile su ile kaplanmıştır. Ayırma jelinin polimerleşmesinin ardından jel üzerindeki saf su uzaklaştırılmıştır. Yığma jeli hazırlanarak (Çizelge 3.3) ayırma jeli üzerine eklenmiştir. Tarak yerleştirilerek jel polimerizasyonu beklenmiştir. Tarak dikkatlice çıkarılıp oluşan kuyucuklar koşturma tamponuyla yıkanmıştır. Jel tanka yerleştirilmiş ve tank koşturma tamponuyla doldurulmuştur. Marker (Page Ruler TM Plus Prestained Protein Ladder, Thermo) ve örnekler kuyucuklara yüklenmiştir. Proteinler 30 ma de yaklaşık 120 V ta ortalama 3 saat koşturulmuştur. Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jeller, Coomasie Brillant Blue R-250 içeren boyama çözeltisi içinde 24 saat bekletilerek boyanmıştır. Daha sonra boya giderici solüsyonda bırakılarak jellerin zemininde bulunan boyanın uzaklaştırılması sağlanmıştır. %7 lik asetik asit içerisinde muhafaza edilen jellerin, fotoğrafları çekilmiştir. Proteinlerin moleküler ağırlıklarının hesaplanışı Ayırma jelde proteinin koştuğu mesafenin izleme boyasının bulunduğu mesafeye oranı Rf değerini vermektedir. Moleküler ağırlığı bilinen standart proteinlerin Rf değerleri hesaplanmıştır. Yarı logaritmik kâğıtta Rf değeri apsise, proteinlerin moleküler ağırlıkları da ordinata konarak Rf değerine karsı MW (Molekül ağırlığı) grafiği çizilerek standart eğri (en az üç noktadan geçen bir doğru) oluşturulmuştur. Daha sonra örnek proteinin molekül ağırlığı da hesaplanmıştır. Molekül ağırlığı

66 49 bilinmeyen protein örneklerinin Rf değerleri hesaplanmış ve eğriden Rf değerine karşılık gelen protein molekül ağırlığı belirlenmiştir. Rf değeri aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır. ğ ğ ışı ı ı ğ ğ Çizelge 3.3 Ayırma ve yığma jelinin hazırlanışı Ayırma Jelin Hazırlanışı (%4) Acrylamide/Bis Acrylamid (%30'luk) Distile su 1,5 M Tris-HCl ph:8,6 % 10'luk APS (Sigma) TEMED (Sigma) Yığma Jelin Hazırlanışı (%10) Acrylamide/Bis Acrylamide (%30'luk) Distile su 1,5 M Tris-HCl ph:6,8 % 10'luk APS (Sigma) TEMED (Sigma) 5,78 ml 7,13 ml 4,33 ml 86,70 µl 8,16 µl 0,82 ml 2,93 ml 1,25 ml 30,00 µl 5,00 µl İstatistiksel analiz Tüm çalışmalar 3 paralelli ve 3 tekerrürlü olarak yapılmış ve çalışmaların ortalama sonuçları verilmiştir. İstatistiksel analizlerde SPSS Inc. Software (16.0 versiyonu, SPSS Inc., Chicago, IL) kullanılmıştır. Parametrik testlerden Pearson korelasyonuna göre, bütün suşların enzim aktivitesi ve spesifik aktiviteleri arasında korelasyon olup olmadığı araştırılmıştır. Farklı ph, sıcaklık, tampon, laktoz (substrat) konsantrasyonları ve farklı enzim ekstraksiyon yöntemleri ile elde edilen spesifik aktivite değerleri arasında anlamlı bir fark olup olmadığını belirleyebilmek için nonparametrik testlerden Friedman testi kullanılmıştır.

67 50 4. DENEYSEL BULGULAR 4.1. β-galaktozidaz Aktivitesinin Belirlenmesi Lactobacillus ve Bifidobacterium cinsine ait suşların enzim aktiviteleri, protein miktarları ve spesifik aktiviteleri Çizelge 4.1 de gösterilmiştir. β-galaktozidaz enzimi ONPG (o-nitrofenil-beta-d-galaktosid) substratına etki ederek sarı renkli ONP (ortonitrofenol) ürününün açığa çıkmasını sağlamıştır. Reaksiyon tüplerinde sarı renk oluşumu Resim 4.1 de görülmektedir. Kültürlerin pelletinde β-galaktozidaz enzim aktiviteleri 0,153±0,000 U/mL (L. fermentum ZYN17) ve 0,004±0,001 U/mL (L. delbrueckii subsp. delbrueckii ZYN31) arasındaki değerlerde belirlenirken, kültür süpernatantlarında ise enzim aktivitesine rastlanılmamıştır. Resim 4.1. Lactobacillus fermentum ZYN17 suşunda ONPG (substrat) eklenerek reaksiyon sunucunda ONP nin (ürün) açığa çıkması ile sarı renk oluşan tüp (solda) ve ONPG eklenmeyen tüp (sağda)

68 51 Çizelge 4.1. Laktobasillerin ve Bifidobakterilerin β-galaktozidaz enzim aktiviteleri, protein miktarları ve spesifik aktiviteleri Suşlar Enzim Aktivitesi (U/mL) Protein Miktarı (mg/ml) Spesifik Aktivite (U/mg) L. acidophilus BAZ54 0,023±0,002 0,043±0,006 0,535±0,025 L. acidophilus BAZ51 0,019±0,003 0,053±0,004 0,359±0,036 L. acidophilus BAZ43 0,017±0,001 0,048±0,000 0,354±0,015 L. acidophilus BAZ22 0,021±0,005 0,047±0,002 0,447±0,059 L. acidophilus BAZ63 0,021±0,004 0,041±0,001 0,512±0,048 L. acidophilus BAZ29 0,022±0,001 0,054±0,001 0,407±0,026 L. acidophilus ZYN13 0,030±0,003 0,046±0,002 0,652±0,047 L. acidophilus BAZ59 0,018±0,001 0,049±0,003 0,367±0,023 L. acidophilus BAZ61 0,021±0,000 0,050±0,001 0,356±0,000 L. acidophilus BAZ36* 0,036±0,003 0,038±0,001 0,947±0,052 L. acidophilus ACS6 0,039±0,006 0,059±0,001 0,661±0,064 L. rhamnosus BAZ78 0,015±0,001 0,041±0,000 0,366±0,019 L. rhamnosus GD11* 0,061±0,001 0,059±0,000 1,034±0,027 L. rhamnosus LP2 0,048±0,002 0,059±0,002 0,814±0,037 L. rhamnosus SMP6-5 0,038±0,001 0,071±0,001 0,535±0,026 L. fermentum ZYN17* 0,153±0,000 0,062±0,003 2,468±0,000 L. fermentum LB16 0,037±0,004 0,078±0,001 0,474±0,046 L. salivarius ZYN15 0,014±0,000 0,043±0,002 0,326±0,000 L. salivarius ZYN9 0,056±0,002 0,062±0,003 0,903±0,036 L. salivarius ZYN23 0,008±0,000 0,102±0,005 0,078±0,000 L. paracasei subsp. paracasei BKS20 0,043±0,000 0,078±0,003 0,551±0,000 L. delbrueckii subsp. delbrueckii BAZ32 0,020±0,002 0,049±0,002 0,408±0,023 L. delbrueckii subsp. delbrueckii ZYN31 0,004±0,001 0,062±0,007 0,065±0,008 L. delbrueckii subsp. delbrueckii ZYN33 0,035±0,012 0,063±0,002 0,556±0,084 L. delbrueckii subsp. bulgaricus B3 0,033±0,002 0,075±0,002 0,440±0,024 L. casei LB65* 0,048±0,001 0,043±0,001 1,116±0,036 L. casei LE4 0,051±0,005 0,071±0,001 0,718±0,060 L. casei LE7 0,050±0,003 0,071±0,004 0,704±0,052 L. casei LB17 0,040±0,001 0,072±0,003 0,556±0,029 L. casei LB19 0,042±0,006 0,075±0,002 0,560±0,068 L. casei LB68 0,054±0,005 0,075±0,002 0,720±0,057 L. casei LB63 0,042±0,000 0,066±0,004 0,636±0,000 L. casei LB6 0,051±0,003 0,077±0,006 0,662±0,035 L. casei LB23 0,062±0,007 0,101±0,002 0,614±0,079 L. casei LB49 0,050±0,000 0,079±0,003 0,633±0,000 L. casei LB61 0,048±0,001 0,073±0,001 0,658±0,024 L. casei LB64 0,042±0,005 0,088±0,002 0,477±0,046 L. casei LB74 0,047±0,002 0,078±0,003 0,603±0,033 L. casei LB83 0,037±0,005 0,081±0,006 0,457±0,047 Bifidobacterium breve A26* 0,045±0,002 0,062±0,000 0,726±0,032 Bifidobacterium breve A28 0,029±0,004 0,069±0,002 0,420±0,046 Bifidobacterium longum BASO15 0,026±0,001 0,053±0,001 0,491±0,017 *Yüksek spesifik aktiviteye sahip suşlar

69 52 En yüksek protein miktarı L. salivarius ZYN23 (0,102±0,005 mg/ml) suşunda tespit edilirken, en düşük protein miktarı L. acidophilus BAZ36 (0,038±0,001 mg/ml) suşunda belirlenmiştir. Suşların β-galaktozidaz spesifik aktiviteleri 2,468-0,065 U/mg arasında değişiklik göstermiştir. L. fermentum ZYN17 (2,468±0,000 U/mg), L. acidophilus BAZ36 (0,947±0,052 U/mg), L. rhamnosus GD11 (1,034±0,027 U/mg) ve L. casei LB65 (1,116±0,036 U/mg) suşlarında yüksek spesifik aktivite yeteneği tespit edilirken, L. delbrueckii subsp. delbrueckii ZYN31 (0,065±0,008 U/mg) ve L. salivarius ZYN23 (0,078±0,000 U/mg) suşlarında ise düşük spesifik aktivite yeteneği belirlenmiştir. Resim 4.2 de L. fermentum ZYN17 suşunun protein miktarı ve aktivite ölçümünde kullanılan örnekler ve körvleri verilmiştir. (a) (b) Resim 4.2. L. fermentum ZYN17 suşunun aktivite ölçümünde kullanılan kullanılan örnekler ve körvler a. Protein miktarı ölçümü b. Enzimin aktivite ölçümü Çizelge 4.1. de, yüksek enzim aktivitesine sahip ancak protein miktarı düşük olan suşlarda (B. breve A26, L. casei LB65, L. rhamnosus GD11, L. acidophilus BAZ36) spesifik aktivitenin yüksek olduğu gözlenmiştir. Spesifik aktivitenin yüksek olmasında enzim aktivitesinin de etkili olduğu düşünülmüş ve bu durumu desteklemek amacıyla Pearson ın korelasyon testi uygulanmıştır. İstatistiksel analiz

70 53 sonucunda spesifik aktivite ile enzim aktivitesi arasında çok yüksek pozitif doğrusal ve istatistiksel olarak anlamlı bir ilişkinin olduğu belirlenmiştir (r=0,927, p<0,01) β-galaktozidaz Aktivitesinin X-gal İle Belirlenmesi Suşlardan en yüksek spesifik enzim aktivitesine sahip 5 suşun (L. fermentum ZYN17, L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11, L. casei LB65 ve Bifidobacterium breve A26) β-galaktozidaz aktivitesi MRS agar içeriğine eklenen X-gal (5-bromo-4-kloro- 3-indolyl-β-D-galaktopiranosid, Sigma) substratı ile desteklenmiştir. Mavi-yeşil renk oluşumuyla suşların β-galaktozidaz aktivitesine sahip olduğu desteklenmiştir (Resim 4.3 ve Resim 4.4). (a) (b) Resim 4.3. β-galaktozidaz aktivitesine sahip suşların X-gal substratı bulunan agar besiyerinde mavi-yeşil renk oluşturması a. L. fermentum ZYN17, L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11 ve L. casei LB65 suşlarının X-gal bulunan MRS agarda mavi-yeşil renk oluşturması b. Bifidobacterium breve A28 suşunun X-gal bulunan TPY agarda maviyeşil renk oluşturması

71 54 Resim 4.4. L. acidophilus BAZ36 suşunun MRS agar ve X-gal içeren MRS agardaki koloni morfolojisi 4.3. β-galaktozidaz Enziminin Optimizasyonu β-galaktozidaz aktivitesi belirlenmiş olan Laktobasillerden en yüksek spesifik aktiviteye sahip 4 adet (L. fermentum ZYN17, L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11 ve L. casei LB65) ve Bifidobakterilerden en yüksek spesifik aktiviteye sahip 1 adet (Bifidobacterium breve A26) olmak üzere toplam 5 adet suşun enzim optimizasyonu çalışılmıştır. L. fermentum ZYN17, L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11, L. casei LB65 ve Bifidobacterium breve A26 suşlarının, farklı ph değerlerine (5,5; 6,0; 6,8; 7,0; 7,5 ve 8,0) ayarlanan potasyum fosfat tamponu kullanılarak enzim aktiviteleri, protein miktarları ve spesifik aktiviteleri belirlenmiştir. L. acidophilus BAZ36 suşu ph 8,0 de (0,020±0,000 U/mL) en düşük enzim aktivitesi, L. fermentum ZYN17 suşu ise ph 6,8 de (0,153±0,000 U/mL) en yüksek enzim aktivitesi göstermiştir. Suşların ph 5,5 dan kontrol grubu olan ph 6,8 e (L. acidophilus BAZ36 hariç) kadar olan ph değerlerinde enzim aktivitesinde yükselme daha sonra ise enzim aktivite değerlerinde düşme gözlenmiştir. L. acidophilus BAZ36 suşu hariç diğer Laktobasillerde en yüksek enzim aktivitesi ph 6,8 de tespit edilirken, L. acidophilus BAZ36 ve Bifidobacterium breve A26 suşunda en yüksek enzim aktivitesi ph 6,0 da belirlenmiştir (Şekil 4.1). Bütün sonuçlar dikkate alındığında β-galaktozidaz enzim aktivitesi için en uygun ortamın ph 6,8 de

72 Protein (mg/ml) Enzim aktivitesi (U/mL) 55 (kontrol) sağlandığı belirlenmiştir. Farklı ph değerlerinde suşların protein miktarları 0,038±0,001 mg/ml (L. acidophilus BAZ36, ph 6,8) ve 0,096±0,001 mg/ml (L. rhamnosus GD11, ph 8,0) değerleri arasında değişmektedir (Şekil 4.2). 0,2 ph 0,16 0,12 0,08 0,04 0 ph 5,5 ph 6 ph 6,8 (Kontrol) ph 7 ph 7,5 ph 8 L. fermentum ZYN 17 0,149 0,151 0,153 0,151 0,15 0,084 L. acidophilus BAZ 36 0,024 0,04 0,036 0,033 0,033 0,02 L. rhamnosus GD11 0,038 0,055 0,061 0,046 0,045 0,036 L. casei LB 65 0,04 0,047 0,048 0,044 0,04 0,029 B. breve A 26 0,067 0,076 0,045 0,035 0,031 0,028 Şekil 4.1. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı ph değerlerinde enzim aktiviteleri 0,12 0,1 ph 0,08 0,06 0,04 0,02 0 ph 5,5 ph 6 ph 6,8 (Kontrol) ph 7 ph 7,5 ph 8 L. fermentum ZYN 17 0,083 0,072 0,062 0,073 0,089 0,075 L. acidophilus BAZ 36 0,051 0,051 0,038 0,065 0,07 0,051 L. rhamnosus GD11 0,079 0,081 0,059 0,088 0,093 0,096 L. casei LB 65 0,072 0,077 0,043 0,064 0,088 0,072 B. breve A 26 0,06 0,065 0,062 0,07 0,068 0,065 Şekil 4.2. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı ph değerlerinde protein miktarları

73 Spesifik aktivite (U/mg) 56 3 ph 2,5 2 1,5 1 0,5 0 5,5 6 6,8 (Kontrol) 7 7,5 8 L. fermentum ZYN 17 1,795 2,097 2,468 2,069 1,685 1,12 L. acidophilus BAZ 36 0,471 0,784 0,947 0,508 0,471 0,392 L. rhamnosus GD11 0,481 0,679 1,034 0,523 0,484 0,375 L. casei LB 65 0,556 0,61 1,116 0,688 0,455 0,403 B. breve A 26 1,117 1,169 0,726 0,5 0,456 0,431 Şekil 4.3. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı ph değerlerinde spesifik aktiviteleri En yüksek β-galaktozidaz spesifik aktivitesi ph 6,8 de L. fermentum ZYN17 (2,468±0,000 U/mg) suşunda belirlenirken, en düşük spesifik enzim aktivitesi ise ph 8,0 de L. rhamnosus GD11 (0,375±0,000 U/mg) suşunda belirlenmiştir. Genel olarak suşlar değerlendirildiğinde, Bifidobacterium breve A26 suşu hariç tüm suşlarda spesifik aktivitenin ph 6,8 de yüksek, ph 8,0 de düşük olduğu tespit edilmiştir. Bifidobacterium breve A26 suşunda ise spesifik aktivitenin ph 6,0 da en yüksek olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.3). Bu çalışmada kullanılan ph lardaki β-galaktozidaz spesifik enzim aktiviteleri arasında anlamlı bir fark olduğu Friedman testi uygulanarak (p<0,005) belirlenmiş ve β-galaktozidaz aktivitesinin ph 6,8 de en yüksek olduğu doğrulanmıştır. β-galaktozidaz enzim optimizasyonu çalışılan toplam 5 adet suşun (L. fermentum ZYN17, L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11 ve L. casei LB65, B. breve A26) 0,03 M potasyum fosfat tamponu (ph 6,8) içinde, 15 mm 0,2 ml o-nitrofenil-β- D-galaktopiranozit (o-npg) içeren karışıma 1 ml süpernatant eklendikten sonra, karışım 30ºC, 35ºC, 37ºC ve 40ºC da inkübasyona bırakılarak, farklı sıcaklıkların β-

74 Enzim aktivitesi (U/mL) 57 galaktozidaz aktivitesine etkisi belirlenmiştir. Suşların farklı sıcaklıklardaki enzim aktivitesi Şekil 4.4 te verilmiştir. L. acidophilus BAZ36 suşu hariç (35 o C) diğer suşlarda en yüksek β-galaktozidaz enzim aktivitesi 37 o C (kontrol) sıcaklıkta tespit edilmiştir. En yüksek β-galaktozidaz enzim aktivitesi 37 o C de L. fermentum ZYN17 (0,153±0,000 U/mL) suşunda belirlenirken en düşük enzim aktivitesi ise 30 o C de L. acidophilus BAZ36 (0,020±0,000 U/mL) suşunda tespit edilmiştir. Genel olarak bütün suşlarda kontrol grubuna (37 o C) göre düşük sıcaklık (30 o C) ve yüksek sıcaklıkta (45 o C) belirlenen aktivitelerde azalma tespit edilmiştir. Suşların protein miktarları 0,034±0,003 mg/ml (Bifidobacterium breve A26 ve L. acidophilus BAZ36) ve 0,088±0,003 mg/ml (L. rhamnosus GD11) değerleri arasında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.5). 0,2 0,16 Sıcaklık 0,12 0,08 0, C 35 C 37 C (Kontrol) 40 C 45 C L. fermentum ZYN 17 0,147 0,151 0,153 0,15 0,149 L. acidophilus BAZ 36 0,02 0,039 0,036 0,031 0,024 L. rhamnosus GD11 0,053 0,058 0,061 0,053 0,041 L. casei LB 65 0,036 0,044 0,048 0,043 0,037 B. breve A 26 0,024 0,029 0,045 0,023 0,021 Şekil 4.4. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı sıcaklık değerlerinde enzim aktiviteleri

75 Spesifik aktivite (U/mg) Protein (mg/ml) 58 Sıcaklık 0,12 0,09 0,06 0, C 35 C 37 C (Kontrol) 40 C 45 C L. fermentum ZYN 17 0,068 0,067 0,062 0,083 0,086 L. acidophilus BAZ 36 0,053 0,042 0,038 0,034 0,061 L. rhamnosus GD11 0,065 0,062 0,059 0,058 0,088 L. casei LB 65 0,074 0,059 0,043 0,053 0,064 B. breve A 26 0,034 0,041 0,062 0,04 0,059 Şekil 4.5. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı sıcaklık değerlerinde protein miktarları 3 Sıcaklık 2,5 2 1,5 1 0, C 35 C 37 C (Kontrol) 40 C 45 C L. fermentum ZYN 17 2,162 2,254 2,468 1,807 1,733 L. acidophilus BAZ 36 0,377 0,929 0,947 0,912 0,393 L. rhamnosus GD11 0,815 0,936 1,034 0,914 0,466 L. casei LB 65 0,487 0,746 1,116 0,811 0,578 B. breve A 26 0,706 0,707 0,726 0,575 0,356 Şekil 4.6. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı sıcaklık değerlerinde spesifik enzim aktiviteleri

76 59 Farklı sıcaklıklardaki spesifik aktivite 0,356±0,067 U/mg (B. breve A26) ve 2,468±0,000 U/mg (L. fermentum ZYN17) değerleri arasında olduğu ve bütün suşlarda spesifik aktivitenin 37 o C de en yüksek olduğu tespit edilmiştir. L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11 ve L. casei LB65 suşlarında spesifik aktivite 30 o C de en düşük iken L. fermentum ZYN17 ve Bifidobacterium breve A26 suşlarında spesifik aktivite 45 o C de en düşük olarak tespit edilmiştir. Genel olarak spesifik aktivite 30 o C gibi düşük sıcaklıkta veya 45 o C gibi daha yüksek bir sıcaklıkta düşmektedir (Şekil 4.6). Yapılan istatistiksel analiz sonucu farklı sıcaklıklardaki enzim aktivitesinin 37 o C de yüksek olduğu Friedman testi ile doğrulanmıştır (p<0,01). L. fermentum ZYN17, L. acidophilus BAZ36, L. rhamnosus GD11 ve L. casei LB65, B. breve A26 suşlarının ph 0,03 M potasyum fosfat tamponu, 0,03 M sodyum fosfat tamponu, 0,03 M Tris-HCl, 0,03 M Tris-NaCl ve Tris-potasyum fosfat (ph 6,8) tamponlarında β-galaktozidaz aktivitesi belirlenmiştir (Çizelge 4.2, Çizelge 4.3 ve Çizelge 4.4). Çalışmada L. fermentum ZYN17 (0,153±0,000 U/mL) ve B. breve A26 suşları (0,045±0,002 U/mL) potasyum fosfat tamponunda kullanılan diğer tamponlara göre yüksek enzim aktivitesi göstermiştir. L. acidophilus BAZ36 (0,039±0,002 U/mL), L. rhamnosus GD11 (0,064±0,000 U/mL) ve L. casei LB65 (0,062±0,001 U/mL) suşları ise Tris tamponunda diğer tamponlara göre yüksek enzim aktivitesi göstermiştir. Suşların en düşük enzim aktivitesi (L. fermentum ZYN17 suşu hariç) sodyum fosfat tamponunda tespit edilmiştir (Çizelge 4.2). Protein miktarı Bifidobacterium breve A26 suşunda (0,075±0,002 mg/ml) sodyum fosfat tamponu kullanıldığında en yüksek değerde olduğu belirlenmiştir. Protein miktarı L. acidophilus BAZ36 (0,058±0,000 mg/ml) ve L. casei LB65 (0,061±0,000 mg/ml) suşlarında ise Tris-sodyum fosfat tamponu kullanıldığında en yüksek değerdedir. Tris tamponu kullanıldığında ise L. fermentum ZYN17 (0,072±0,000 mg/ml), L. rhamnosus GD11 (0,068±0,002 mg/ml) ve L. casei LB65 (0,061±0,002

77 60 mg/ml) suşlarının diğer tamponlara göre daha yüksek protein miktarına sahip olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.3). Çizelge 4.2. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı tamponlardaki enzim aktiviteleri Enzim Aktivitesi (U/mL) Suşlar Potasyum Fosfat (Kontrol) Tris Tris-NaCl Tris Sodyum Fosfat Sodyum Fosfat L. fermentum ZYN17 0,153±0,000 0,147±0,000 0,148±0,000 0,150±0,002 0,150±0,001 L. acidophilus BAZ36 0,036±0,003 0,039±0,002 0,034±0,003 0,030±0,000 0,028±0,001 L. rhamnosus GD11 0,061±0,001 0,064±0,000 0,046±0,000 0,041±0,002 0,028±0,000 L. casei LB65 0,048±0,000 0,062±0,001 0,055±0,002 0,050±0,005 0,044±0,000 B. breve A26 0,045±0,002 0,040±0,000 0,031±0,002 0,030±0,000 0,029±0,000 Çizelge 4.3. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı tamponlardaki protein miktarları Protein Miktarı (mg/ml) Suşlar Potasyum Fosfat (Kontrol) Tris Tris-NaCl Tris Sodyum Fosfat Sodyum Fosfat L. fermentum ZYN17 0,062±0,003 0,072±0,000 0,070±0,002 0,065±0,002 0,069±0,001 L. acidophilus BAZ36 0,038±0,001 0,044±0,000 0,046±0,003 0,058±0,000 0,052±0,002 L. rhamnosus GD11 0,059±0,000 0,068±0,002 0,061±0,000 0,062±0,002 0,047±0,001 L. casei LB65 0,043±0,001 0,061±0,002 0,058±0,001 0,061±0,000 0,056±0,003 B. breve A26 0,062±0,000 0,052±0,001 0,054±0,001 0,073±0,002 0,075±0,002 Çizelge 4.4. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı tamponlardaki spesifik enzim aktiviteleri Suşlar L. fermentum ZYN17 L. acidophilus BAZ36 L. rhamnosus GD11 L. casei LB65 Potasyum Fosfat (Kontrol) Spesifik Aktivite (U/mg) Tris Tris-NaCl Tris Sodyum Fosfat Sodyum Fosfat 2,468±0,000 2,042±0,000 2,114±0,000 2,308±0,036 2,174±0,022 0,947±0,052 0,886±0,036 0,739±0,052 0,517±0,000 0,539±0,023 1,034±0,027 0,941±0,000 0,754±0,000 0,661±0,034 0,596±0,000 1,116±0,036 1,016±0,025 0,948±0,033 0,820±0,075 0,786±0,000 B. breve A26 0,726±0,032 0,769±0,000 0,574±0,031 0,411±0,000 0,387±0,000

78 61 Çalışılan tüm Laktobasillerde en yüksek spesifik enzim aktivitesi potasyum fosfat (Kontrol) tamponunda belirlenmiştir. En yüksek spesifik enzim aktivitesi 2,468±0,000 U/mg ile L. fermentum ZYN17 suşunda belirlenmiştir. Bifidobacterium breve A26 suşunda spesifik aktivitenin tris tamponunda (0,769±0,000 U/mg) diğer tamponlara göre yüksek olduğu ve potasyum fosfat tamponunda (Kontrol, 0,726±0,032 U/mg) ise bu değere yakın olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 4.4). Elde edilen sonuçlara göre potasyum fosfat kullanılarak belirlenen spesifik aktivitenin diğer tamponlara göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu durumun istatistiksel analizi Friedman testi ile yapılarak tamponlar arasında spesifik aktivite açısından anlamlı bir fark olduğu görülmüş (p<0,05) ve spesifik aktivitenin potasyum fosfat tamponunda daha yüksek olduğu doğrulanmıştır Laktobasillerin β-galaktozidazına farklı substrat (laktoz) konsantrasyonunun etkisi Besiortamındaki farklı laktoz konsantrasyonlarında (%2 laktoz, %4 laktoz, %6 laktoz, %8 laktoz ve %10 laktoz içeren MRS) β-galaktozidaz aktivitesi belirlenmiştir. L. rhamnosus GD11 suşu hariç diğer suşlarda %1 den %4 e kadar artan konsantrasyonlarda enzim aktivitesinde bir artış gözlenirken, %4 konsantrasyonundan sonraki artan konsantrasyonlarda enzim aktivitesinde düzenli bir azalma tespit edilmiştir. L. rhamnosus GD11 suşunda ise %2 laktoz konsantrasyonuna kadar artış tespit edilirken %4 - %10 konsantrasyonlarında ise konsantrasyon artışına bağlı olarak bir azalma gözlenmiştir (Şekil 4.8). Suşların, protein miktarı 0,046±0,009 mg/ml (L. casei LB65, %2 laktoz) ve 0,074±0,000 mg/ml (L. fermentum ZYN17, %10 laktoz) aralığında değiştiği gözlenmiştir. Konsantrasyon artışı ile protein miktarları arasında herhangi bir ilişki tespit edilememiştir (Şekil 4.9).

79 Protein (mg/ml) Enzim aktivitesi (U/mL) 62 % Laktoz 0,18 0,15 0,12 0,09 0,06 0,03 0 %1 Laktoz %2 Laktoz %4 Laktoz %6 Laktoz %8 Laktoz %10 Laktoz L. fermentum ZYN 17 0,149 0,154 0,155 0,154 0,147 0,146 L. acidophilus BAZ 36 0,031 0,051 0,059 0,045 0,043 0,042 L. rhamnosus GD11 0,023 0,055 0,051 0,05 0,036 0,03 L. casei LB 65 0,027 0,053 0,054 0,043 0,04 0,037 Şekil 4.7. Laktobasillerin farklı laktoz oranlarındaki enzim aktiviteleri % Laktoz 0,08 0,06 0,04 0,02 0 %1 Laktoz %2 Laktoz %4 Laktoz %6 Laktoz %8 Laktoz %10 Laktoz L. fermentum ZYN 17 0,062 0,06 0,06 0,057 0,056 0,074 L. acidophilus BAZ 36 0,063 0,051 0,052 0,053 0,052 0,065 L. rhamnosus GD11 0,071 0,052 0,053 0,057 0,052 0,057 L. casei LB 65 0,055 0,046 0,055 0,051 0,063 0,06 Şekil 4.8. Laktobasillerin farklı laktoz oranlarındaki protein miktarları

80 Spesifik aktivite (U/mg) 63 % Laktoz 3 2,25 1,5 0,75 0 %1 Laktoz %2 Laktoz %4 Laktoz %6 Laktoz %8 Laktoz %10 Laktoz L. fermentum ZYN 17 2,403 2,567 2,583 2,702 2,625 1,973 L. acidophilus BAZ 36 0, ,135 0,849 0,827 0,646 L. rhamnosus GD11 0,324 1,058 0,962 0,877 0,692 0,526 L. casei LB 65 0,497 1,152 0,982 0,843 0,635 0,617 Şekil 4.9. Laktobasillerin farklı laktoz oranlarındaki spesifik enzim aktiviteleri %1 laktoz bulunan besiyerinde geliştirilen L. rhamnosus GD11 suşunda spesifik aktivite (0,324±0,000 U/mg) en düşük değerde olduğu tespit edilmiştir. En yüksek spesifik β-galaktozidaz aktivitesi %6 laktoz bulunan besiyerinde geliştirilen L. fermentum ZYN17 suşunda (2,702±0,028 U/mg) belirlenmiştir. Suşların her birinin farklı laktoz oranlarında yüksek spesifik aktiviteye sahip oldukları dikkatimizi çekmiştir. L. fermentum ZYN17 suşunda %1-%6 ya kadar L. acidophilus BAZ36 suşunda %1-%4 e kadar, L. rhamnosus GD11 ve L. casei LB65 suşlarında ise %1-2 konsantrasyonlarında, konsantrasyon artışına bağlı olarak spesifik aktivitelerinde bir artış, daha sonra konsantrasyon artışına bağlı olarak spesifik aktivitede azalma tespit edilmiştir. Bu nedenle, suşlar için konsantrasyon artışına bağlı olarak spesifik aktivitede de bir artış gözlenmiştir gibi bir genelleme yapılamamıştır. Farklı oranlarda laktoz içeren besiyerlerindeki spesifik aktiviteler arasında anlamlı bir fark olduğu Friedman testi ile doğrulanmıştır (p<0,05).

81 Enzim aktivitesi (U/mL) β-galaktozidaz aktivitesine yapay mide sıvısı ve bağırsak sıvısının etkisi Yapay mide sıvısında farklı ph değerlerindeki β-galaktozidaz enzim aktivitesi 0,026-0,147 U/mL değerleri arasında değişmektedir. L. fermentum ZYN17 (0,147 U/mL) ve L. rhamnosus GD11 (0,048 U/mL) suşlarında en yüksek enzim aktivitesi nötral ph da (ph 7) belirlenirken diğer suşlarda asidik ortamlarda aktivitenin yükseldiği dikkat çekmektedir. L. casei LB65 ve Bifidobacterium breve A26 suşlarında en yüksek enzim aktivitesi ph 4 de (sırasıyla 0,043 U/mL ve 0,038 U/mL) belirlenirken L. acidophilus BAZ36 suşunda ise en yüksek enzim aktivitesi ph 3 te (0,033 U/mL) belirlenmiştir (Şekil 4.11). Yapay mide sıvısıyla farklı ph değerlerindeki enzim aktivitesinin belirlenmesinde kullanılan suşların protein miktarları 0,051±0,001 mg/ml (L. acidophilus BAZ36, ph 4) ve 0,083±0,004 mg/ml (L. rhamnosus GD11, ph 2) değerleri arasında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.12). 0,2 0,16 0,12 0,08 0,04 Yapay mide 0 ph: 2 ph: 3 ph: 4 ph: 7 Kontrol L. fermentum ZYN 17 0,145 0,145 0,145 0,147 0,153 L. acidophilus BAZ 36 0,026 0,033 0,031 0,031 0,036 L. rhamnosus GD11 0,039 0,04 0,043 0,048 0,061 L. casei LB 65 0,031 0,033 0,043 0,038 0,048 B. breve A 26 0,033 0,037 0,038 0,034 0,045 Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay mide suyunda enzim aktiviteleri

82 Spesifik aktivite (U/mg) Protein (mg/ml) 66 0,12 Yapay mide 0,08 0,04 0 ph: 2 ph: 3 ph: 4 ph: 7 Kontrol L. fermentum ZYN 17 0,079 0,068 0,068 0,065 0,062 L. acidophilus BAZ 36 0,07 0,056 0,051 0,063 0,038 L. rhamnosus GD11 0,083 0,067 0,059 0,057 0,059 L. casei LB 65 0,067 0,061 0,057 0,067 0,043 B. breve A 26 0,072 0,058 0,063 0,057 0,062 Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay mide sıvısında protein miktarları 3 2,5 2 1,5 1 0,5 Yapay mide 0 ph: 2 ph: 3 ph: 4 ph: 7 Kontrol L. fermentum ZYN 17 1,835 2,132 2,132 2,262 2,468 L. acidophilus BAZ 36 0,371 0,589 0,608 0,492 0,947 L. rhamnosus GD11 0,47 0,597 0,729 0,842 1,034 L. casei LB 65 0,463 0,541 0,754 0,567 1,116 B. breve A 26 0,458 0,638 0,603 0,597 0,726 Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay mide suyunda spesifik enzim aktiviteleri

83 67 Yapay mide sıvısında en yüksek spesifik aktivite L. fermentum ZYN17 (2,262±0,000 U/mg) ve L. rhamnosus GD11 (0,842±0,022 U/mg) suşlarında ph 7 de tespit edilmiştir. En düşük spesifik aktivite ise ph 2 de L. acidophilus BAZ36 (0,371±0,022 U/mg) suşunda belirlenmiştir. L. fermentum ZYN17 ve L. rhamnosus GD11 suşlarında ph 2 den ph 7 ye doğru spesifik aktivitede bir artış tespit edilmiştir. L. acidophilus BAZ36, L. casei LB65 ve B. breve A26 suşlarında ph 2 den ph 4 e artış görülürken, ph 7 de spesifik aktivitede düşüş gözlenmiştir (Şekil 4.13). Suşların mide sıvısı bulunmayan kontrol ortama göre farklı ph değerlerindeki yapay mide sıvısında spesifik aktivitelerinde azalma görülse bile, genel bir değerlendirme yapıldığında aktivite değerlerinin yüksek olduğu dikkatimizi çekmiştir. Yapay bağırsak sıvısında farklı ph değerlerindeki en yüksek enzim aktivitesi ph 7,5 te L. fermentum ZYN17 (0,118±0,000 U/mL) suşunda belirlenirken en düşük aktivite ise ph 5,5 de L. acidophilus BAZ36 (0,025±0,004 U/mL) suşunda belirlenmiştir. β-galaktozidaz enzim aktivitesi L. fermentum ZYN17 (0,118±0,000 U/mL), L. rhamnosus GD11 (0,032±0,002 U/mL) ve L. casei LB65 (0,052±0,001 U/mL) suşlarında ph 7,5 te en yüksek olduğu gözlenmiştir. L. acidophilus BAZ36 suşunda en yüksek aktivite ph 8 de (0,032±0,002 U/mL), B. breve A26 suşunda ise, ph 6,5 da (0,034±0,002 U/mL) belirlenmiştir. Bütün suşlarda β-galaktozidaz enzim aktivitelerinin kontrole göre farklı ph değerlerindeki bağırsak sıvısı bulunan ortamlarda düşük olduğu görülmektedir (Şekil 4.14). Suşların, yapay bağırsak sıvısında farklı ph değerlerindeki protein miktarları 0,044 mg/ml ve 0,072 mg/ml değerleri arasında değişmektedir (Şekil 4.15).

84 Protein(mg/mL) Enzim aktivitesi (U/mL) 68 0,2 0,16 0,12 0,08 0,04 Yapay bağırsak 0 ph: 5,5 ph: 6,5 ph: 7,5 ph: 8 Kontrol L. fermentum ZYN 17 0,096 0,114 0,118 0,117 0,153 L. acidophilus BAZ 36 0,025 0,025 0,029 0,032 0,036 L. rhamnosus GD11 0,026 0,031 0,032 0,028 0,061 L. casei LB 65 0,048 0,052 0,052 0,048 0,048 B. breve A 26 0,033 0,034 0,026 0,019 0,045 Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay bağırsak sıvısında enzim aktiviteleri 0,08 Yapay bağırsak 0,06 0,04 0,02 0 ph: 5,5 ph: 6,5 ph: 7,5 ph: 8 Kontrol L. fermentum ZYN 17 0,058 0,068 0,07 0,07 0,062 L. acidophilus BAZ 36 0,05 0,044 0,045 0,06 0,038 L. rhamnosus GD11 0,062 0,072 0,066 0,072 0,059 L. casei LB 65 0,057 0,061 0,06 0,06 0,043 B. breve A 26 0,06 0,062 0,06 0,06 0,062 Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay bağırsak sıvısında protein miktarları

85 Spesifik aktivite (U/mg) ,5 2 1,5 1 0,5 Yapay bağırsak ph 0 ph: 5,5 ph: 6,5 ph: 7,5 ph: 8 Kontrol L. fermentum ZYN 17 1,655 1,677 1,686 1,671 2,468 L. acidophilus BAZ 36 0,5 0,568 0,644 0,53 0,947 L. rhamnosus GD11 0,42 0,431 0,485 0,389 1,034 L. casei LB 65 0,842 0,853 0,867 0,8 1,116 Bifidobacterium breve A 26 0,55 0,548 0,433 0,317 0,726 Şekil Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun yapay bağırsak sıvısında spesifik enzim aktiviteleri Yapay bağırsak sıvısında farklı ph değerlerindeki en yüksek ve en düşük β- galaktozidaz spesifik enzim aktivitesi sırasıyla ph 7,5 te L. fermentum ZYN17 (1,686±0,000 U/mg) ve ph 8 de Bifidobacterium breve A26 (0,317±0,000 U/mg) suşlarında belirlenmiştir. Yapay bağırsak sıvısında farklı ph değerlerindeki β- galaktozidaz spesifik enzim aktivitesi Laktobasillerde ph 7,5 te en yüksek değerde olduğu, Bifidobacterium breve A26 suşunda ise ph 5,5 te en yüksek değerde olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.16). Yapay bağırsak sıvısı bulunmayan (Kontrol) ortama göre farklı ph değerlerindeki yapay mide sıvısının bulunduğu ortamda suşların spesifik aktivitelerinde azalma görülmüş olsa da aktivite değerlerinin yüksek olduğu dikkatimizi çekmiştir.

86 β-galaktozidaz aktivitesi üzerine enzim ekstraksiyon yönteminin etkisi β-galaktozidaz enzimi, farklı ekstraksiyon yöntemleriyle hücre dışına çıkartılarak enzim aktivite sonuçları Çizelge 4.6 de verilmiştir. L. fermentum ZYN17 (0,153±0,000 U/mL) ve L. acidophilus BAZ36 (0,036±0,003 U/mL) suşları için optimum aktivite hücre duvarının sonikasyon ile parçalanması ve enzimin açığa çıkarılması ile elde edilmiştir. L. rhamnosus GD11 ( 0,091±0,003 U/mL) ve L. casei LB65 (0,067±0,004 U/mL) suşları toluen/aseton metodu sonucu daha yüksek aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Bifidobacterium breve A26 suşunun ise sonikasyona göre kimyasal metodlarda daha yüksek aktiviteye sahip olduğu ve en yüksek aktivite kloroform/sds (0,133 U/mL) ve triton X-100 (0,133 U/mL) metodlarında görülmüştür (Çizelge 4.6). Farklı enzim ektraksiyon yöntemlerinde suşların protein miktarları 0,002±0,001 mg/ml ve 0,062±0,003 mg/ml değerleri arasında değişmektedir. Sonikasyon yöntemiyle (fiziksel yöntem) karşılaştırıldığında diğer enzim ekstraksiyon yöntemlerinde (kimyasal yöntemler) protein miktarında ciddi bir düşüş söz konusudur (Çizelge 4.7). Bütün suşlarda protein miktarının düşük olması kullanılan kimyasalların etkisiyle proteinlerin denatüre olduğunu düşündürmüştür. Çizelge 4.5. Laktobasillerden ve Bifidobacterium breve A26 suşundan farklı yöntemle elde edilen enzim ekstraktının enzim aktiviteleri Suşlar Enzim Aktivitesi (U/mL) Sonikasyon (Kontrol) Kloroform/SDS Toluen/Aseton Triton X-100 L. fermentum ZYN17 0,153±0,000 0,133±0,001 0,113±0,003 0,071±0,001 L. acidophilus BAZ36 0,036±0,003 0,024±0,004 0,024±0,000 0,011±0,000 L. rhamnosus GD11 0,061±0,001 0,076±0,010 0,091±0,003 0,048±0,004 L. casei LB65 0,048±0,000 0,046±0,007 0,067±0,004 0,036±0,003 B. breve A26 0,045±0,002 0,133±0,001 0,131±0,002 0,133±0,000

87 71 Çizelge 4.6. Laktobasillerden ve Bifidobacterium breve A26 suşundan farklı yöntemle elde edilen enzim ekstraktının protein miktarları Suşlar Protein Miktarı (mg/ml) Sonikasyon (Kontrol) Kloroform/SDS Toluen/Aseton Triton X- 100 L.fermentumZYN17 0,062±0,003 0,011±0,000 0,018±0,000 0,005±0,001 L. acidophilusbaz36 0,038±0,001 0,002±0,001 0,007±0,001 0,005±0,000 L. rhamnosusgd11 0,059±0,000 0,030±0,001 0,026±0,001 0,016±0,000 L. caseilb65 0,043±0,001 0,007±0,001 0,015±0,001 0,011±0,000 B. brevea26 0,062±0,000 0,024±0,003 0,021±0,001 0,011±0,000 Çizelge 4.7. Laktobasillerin ve Bifidobacterium breve A26 suşunun farklı yöntem ile elde edilen enzim ekstraktının spesifik enzim aktiviteleri Suşlar Spesifik Aktivite (U/mg) Sonikasyon (Kontrol) Kloroform/SDS Toluen/Aseton Triton X- 100 L. fermentum ZYN17 2,468±0,000 12,091±0,146 6,278±0,315 14,200±0,141 L. acidophilus BAZ36 0,947±0,052 12,000±0,395 3,429±0,000 2,200±0,000 L. rhamnosus GD11 1,034±0,027 2,533±0,195 3,500±0,145 3,000±0,177 L. casei LB65 1,116±0,036 6,571±0,556 4,467±0,284 3,273±0,378 B. breve A26 0,726±0,032 5,542±0,247 6,238±0,305 12,091±0,000 Çalışılan tüm suşlarda sonikasyon yöntemi kullanıldığında en düşük spesifik aktivitesine ulaşılmıştır. Kullanılan kimyasal yöntemlerde protein miktarında azalma spesifik aktivitenin yükselmesini sağlamıştır. Çünkü spesifik aktivite, enzim aktivitesinin toplam proteine oranıyla elde edilmektedir. En yüksek spesifik aktivite Triton X-100 kullanılarak L. fermentum ZYN17 suşunda (14,200±0,141 U/mg) elde edilmiştir. En düşük spesifik aktivite ise sonikasyon metodunun kullanılmasıyla Bifidobacterium breve A26 suşunda (0,726±0,032 U/mg) elde edilmiştir (Çizelge 4.8). Bütün suşlar dikkate alınarak yapılan istatistiksel analize göre (Friedman testi) enzim ekstraksiyon metodları arasında spesifik aktivite açısından anlamlı bir fark olduğu görülmüş (p<0,05) ve sonikasyon metoduyla elde edilen spesifik aktivitenin en düşük olduğu doğrulanmıştır (Şekil 4.17).

88 Triton X-100 Toluen/Aseton Kloroform/SDS Sonikasyon Sonikasyon Kloroform/SDS Toluen/Aseton Triton X-100 Şekil Spesifik aktiviteye enzim ekstraksiyon yönteminin etkisi 4.7. β-galaktozidaz Enziminin Stoklanması En yüksek aktivite ve stabiliteye sahip L. fermentum ZYN17 suşu kullanılarak β- galaktozidaz enziminin farklı sıcaklıklarda bir ay içerisindeki stoklanma durumu kontrol edilmiştir (Şekil 4.18). Veriler karşılaştırıldığında birinci haftanın sonunda enzim aktivitesinin üç sıcaklık koşulunda (+4 o C, -20 o C ve +25 o C) da yaklaşık aynı oranda (%3-4) azaldığı belirlenmiştir. +4 o C de saklanan enzimin bir ay sonunda aktivitesinde %16 oranında kayıp belirlenirken, -20 o C de saklanan enzimin aktivitesinin hala korunduğu tespit edilmiştir. Oda sıcaklığında bir ay stoklanan β- galaktozidaz enziminin aktivitesinde ise %51 oranında bir azalış söz konusu olmuştur (Şekil 4.18).

89 Enizm aktivitesi (U/mL) 73 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 Oda sıcaklığı (25 C) 4 C 20 C 0,153 0,147 0,149 0,15 0,155 0,129 0, Gün 7. Gün 31. Gün Şekil Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen β-galaktozidaz enziminin stoklanma durumu 4.8. β-galaktozidaz Enziminin Kısmi Saflaştırılması Kısmi saflaştırma ve SDS-PAGE elektroforezi çalışmalarında; yüksek aktivite ve stabilite gösteren, enzim aktivitesi 0,153 U/mL, protein miktarı 0,062 mg/ml ve spesifik aktivitesi 2,458 U/mg olan Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen β-galaktozidaz enzimi kullanılmıştır. Enzimin kısmi saflaştırılmasının ilk basamağında ham enzim ekstraktı % konsantrasyon aralığında amonyum sülfat ile çöktürülmüştür. En yüksek spesifik aktivitenin (12,583 U/mg) elde edildiği %60-80 konsantrasyonunda amonyum sülfat ile çöktürülen enzim ekstraktı (Şekil 4.19), potasyum fosfat tamponuna (ph 6,8) karşı diyaliz edilmiştir. Diyaliz sonucu elde edilen diyalizatın enzim aktivitesi 0,152 U/mL, protein miktarı 0,012 mg/ml ve spesifik aktivitesi 12,667 olarak belirlenmiştir. Elde edilen diyalizat Amicon 100 K ile konsantre edilmiştir. Konsantre edilen örneğin protein miktarı 0,027 mg/ml olarak belirlenirken spesifik aktivitesi 5,593 U/mg olarak belirlenmiştir. Konsantre edilen çözelti yabancı proteinlerin denatüre edilmesi amacıyla 70ºC de 10 dakika bekletilmiştir. Dentüre olan proteinler santrifüj yöntemi ile ortamdan uzaklaştırılmıştır. Isıl işlem sonucunda enzim aktivitesi 0,152 U/mL, protein miktarı 0,023 mg/ml ve spesifik aktivitesi 6,609 U/mg olarak tespit edilmiştir. Kısmi saflaştırma işlemi sonucu elde edilen enzim aktivitesinin, ham ezimin enzim

90 Spesifik aktivite U/mg 74 aktivitesine oranı ile kurtarma faktörü; spesifik aktivitesinin ham enzimin spesifik aktivitesine oranı ile saflaştırma oranı tespit edilmiştir. Bütün saflaştırma basamakları sonunda uygulanan bu bağıntı ile enzimin korunma durumu ve hangi oranda saflaştırıldığı belirlenmiştir. Ham enzimde kayıp oluşturacak ve saflaşmasına sebep olacak herhangi bir işlemin olmamasından dolayı kurtarma faktörü %100 olarak belirlenirken saflaştırma katsayısı 0 olarak tespit edilmiştir. Bütün saflaştırma basamakları sonucunda elde edilen örneğin 2,678 kat saflaştırıldığı ve enzimin %99,4 ünün korunduğu belirlenmiştir. Kısmi saflaştırma basamaklarında elde eldilen veriler Çizelge 4.9 da belirtilmiştir. Çizelge 4.8. Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen β-galaktozidaz enziminin kısmi saflaştırma basamaklarında elde edilen bulgular Saflaştırma Basamakları Enzim Aktivitesi (U/mL) Protein ( mg/ml) Spesifik Aktivite (U/mg) Saflaştırma Oranı Kurtarma Faktörü Ham Enzim 0,153 0,062 2, ,0 Amonyum Sülf. Çöktürme (%60-80) 0,151 0,013 12,583 5,099 98,7 Diyaliz 0,152 0,012 12,667 5,133 99,4 Konsantre 0,151 0,027 5,593 2,266 98,7 Isıl işlem 0,152 0,023 6,609 2,678 99,4 L. fermentum ZYN Ham %0-20 % ,067 8,5 9 12,583 12,667 5,593 6,609 %40-60 %60-80 Diyaliz 1 2,468 Filtrasyon Şekil Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen β-galaktozidaz enziminin kısmi saflaştırma basamaklarındaki spesifik enzim aktivitesi

91 Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) Lactobacillus fermentum ZYN17 suşundan elde edilen ham enzim ekstraktı ve kısmi saflaştırma basamaklarının (amonyum sülfat ile çöktürülmesi, diyaliz, konsantre edilmesi ve ısıl işlem) uygulanması sonucunda elde edilen β- galaktozidaz enziminin SDS-PAGE jelinde görülmesi hedeflenmiştir. Lactobacillus fermentum ZYN17 suşunun SDS-PAGE elektroforez sonuçlarına göre elde edilen protein bantları Resim 4.6 da görülmektedir. Beta galaktozidaz enziminin kısmi saflaştırma basamakları sonucu elde edilen örneklerin SDS-PAGE profiline bakıldığında ham enzim ekstraktının safsızlıklar içerdiği görülmektedir. %60-80 amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemi ile 240 K ve 46 K ağırlığındaki proteinlerin ortamdan uzaklaştırılmıştır. Konsantrasyon işlemi (Amikon 100K) ile elde edilen örneğin bantlarının daha koyu olarak boyandığı görülmektedir. Isıl işlem (70ºC de 10 dak muamele) uygulamasından sonra da 121 K ve 63 K ağırlığındaki proteinler de uzaklaştırılabilmiştir (Resim 4.6). Resim 4.5. Lactobacillus fermentum ZYN17 suşunun β-galaktozidaz ekstraktlarının SDS-PAGE profilleri (M, Marker proteini (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder); H, Ham enzim ekstraktı; A, Amonyum sülfat çöktürmesi; D, Diyalizat; K, Amicon 100K ile konsantre edilmesi; I, Isıl işlem (70ºC de 10 dak).