YAĞ DOKUSUNDAN ELDE EDİLEN MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN İZOLASYONU DEVAMLI KÜLTÜRÜNÜN YAPILMASI KARAKTERİZASYONU VE KRİYOPREZERVASYONU

Transkript

1 YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YAĞ DOKUSUNDAN ELDE EDİLEN MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN İZOLASYONU DEVAMLI KÜLTÜRÜNÜN YAPILMASI KARAKTERİZASYONU VE KRİYOPREZERVASYONU Biyolog Serap YEŞİLKIR FBE Biyomühendislik Anabilim Dalından Hazırlanan YÜKSEK LİSANS TEZİ Tez Danışmanı : Yrd. Doç. Dr. Melahat BAĞIROVA İSTANBUL, 2010

2 ii İÇİNDEKİLER Sayfa SİMGE LİSTESİ... vi KISALTMA LİSTESİ... vii ŞEKİL LİSTESİ... vii ÇİZELGE LİSTESİ... xi ÖNSÖZ... xii ABSTRACT... xiv 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Hücreler Öncül Progenitör Hücreler Kök Hücreler Totipotent Hücreler Pluripotent Hücreler Multipotent Hücreler Unipotent Hücreler Hücre Plastisitesi Kök Hücre ve Kullanım Alanları Kök Hücre Kaynakları Hematopoetik Kök Hücreler (HKH) Mezenkimal (Stromal) Kök Hücreler (MKH) Embriyonik Kaynaklı Olmayan (Yetişkin) Kök Hücreler Kordon Kanı ve Plasenta Kaynaklı Kök Hücreler Kemik İliği Kaynaklı Kök Hücreler Periferik Kan Kaynaklı Kök Hücreler Fetüs Kaynaklı Kök Hücreler ii

3 iii Fetal Karaciğer Kaynaklı Kök Hücreler Diş Pulpası Kaynaklı Kök Hücreler Amniyotik Sıvı Kaynaklı Kök Hücreler Epidermal Kök Hücreleri Yağ Dokusu Kaynaklı Kök Hücreler Kadavra Kaynaklı Kök Hücreler Kök Hücre Kültürünün Yapılması DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Serum Antibiyotikler PBS (1X) Solüsyonu Kök Hücre İzolasyon Teknikleri Dansite gradient yöntemi ile izolasyon Diferansiyel santrifügasyon Basit santrifügasyon Hücrelerde manyetik ayırımda uygulanan yöntemler Doğrudan ve Dolaylı seleksiyon Pozitif ve Negatif seleksiyon Kök Hücre Karakterizasyonu Tripan mavisi ile hücre sayımı ve canlılık tayini Mikroskobik inceleme ile kök hücre tayini Kolonijenik inceleme ilee kök hücre tayini İmmünfenotipleme (Flow Sitometrik analiz) İmmünhistokimyasal boyama ile kök hücre tayini Oil Red O boyama ile adipojenik farklılaşma tayini Alizarin Red S boyama ile osteojenik farklılaşma tayini Kriyoprezervasyon Yavaş dondurma Hızlı dondurma Çözme Deneysel Çalışmalar Deneysel çalışmalarda kullanılan cihazlar ve kimyasal maddeler Deneysel çalışmalarda kullanılan cihazlar Kimyasal maddeler.48 iii

4 iv Çözelti ve Besiyerlerinin hazırlanması DMEM besiyerinin hazırlanması PBS solüsyonunun (1X) hazırlanması Adipojenik farklılaştırma medyumunun hazırlanması Osteojenik farklılaşma medyumunun hazırlanması Oil Red O solüsyonunun hazırlanması Alizarin Red S solüsyonunun hazırlanması Tripan mavisi solüsyonunun hazırlanması Kriyoprotektan (dondurma solüsyonunun) hazırlanması Yağ dokusundan kök hücre izolasyonunun yapılması Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin in vitro kültürünün yapılması ve pasajlanması Tripan mavisi ile hücre sayımının yapılması Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin Giemsa boyamasının yapılması Kriyoprezervasyon Farklı Dimetil Sülfoksit (DMSO) konsantrasyonları ve kök hücre miktarları ile kriyoprezervasyonunun yapılması Hızlı dondurma Çözme Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin kök hücre karakterizasyonu Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin mikroskobik olarak kolonijenik özelliğinin incelenmesi Farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi Kontrol kök hücre kültürü Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin adiposite farklılaşması Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin osteosite farklılaşması Histokimyasal yöntemler Alizarin Red S boyama Oil Red O boyama İmmünfenotipleme ile kök hücre tayini (Flow Sitometrik analiz) Hücre yüzey belirteçlerinin flow sitometrik olarak okunması Sonuçların değerlendirilmesi için kullanılan istatistiksel yöntemler Deneysel sonuuçlar ve tartışmalar Farklı ddonörlerin yağ dokusundan mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu ve iv

5 v kültürde adaptasyonununn incelenmesi Donör Donör Donör Donör Donör Donör Giemsa boyama ile AD-MKH morfolojisinin mikroskobik olarak incelenmesi Yağ dokusu MKH'lerinin mikro kültür metodu (MKM) ile izolasyonu ve kültürünün yapılması Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin immünofenotipik olarak incelenmesi Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin histokimyasal olarak incelenmesi Yağ dokusu kök hücrelerinin adipojenik farklılaşmasının Oil Red O ile tayini Yağ dokusu kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasının Alizarin Red S ile tayini İnsan yağ dokusundan elde ediilen mezenkimal kök hücrelerin kriyoprezervasyon sonuçları Tripan mavisi ile sayım sonrası hücre canlılık tayini MTT yöntemi ile hücre canlılık analizi..90 TARTIŞMA..91 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ v

6 vi SİMGE LİSTESİ µl Mikrolitre µm Mikrometre µg Mikrogram mg Miligram ml Mililitre gr Gram ºC Santigrat derece mm Milimolar MA Moleküler ağırlığı atm Atmosfer vi

7 vii KISALTMA LİSTESİ AD-MKH Adipoz dokudan elde edilen mezenkimal kök hücre DMEM Dulbecco nun modifiye Eagle medyumu IMDM Iscove un modifiye Eagle medyumu DMEM/F12 Dulbecco nun modifiye Eagle medyumu: yüksek besinli karışım PBS Fosfat tampon solüsyonu Tripsin/EDTA Etilendiamin tetraasetik asit DMSO Dimetil sülfoksit FBS Fetal sığır serumu TB Tripan Mavisi PLA İşlenmiş lipoasipirat MKH Mezenkimal kök hücre HKH Hematopoetik kök hücre HCl Hidrojen klorür KCl Potasyum klorür KH 2 PO 4 Potasyum dihidrojen fosfat NaCl Sodyum klorür Na 2 HPO 4 Di sodyum hidrojen fosfat MTT 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid MKM Mikrokültür Metodu vii

8 viii ŞEKİL LİSTESİ Şekil 2. 1 Ökaryotik hücre yapısı 5 Şekil 2. 2 Yumurta ve spermin döllenmesi ile meydana gelen zigot... 3 Şekil 2. 3 Progenitör ve kök hücrelerin bulundukları dokulardaki farklılaşma özellikleri..3 Şekil 2. 4 Totipotent evredeki zigot ile embriyo ve pluripotent evredeki blastosist evresi...5 Şekil 2. 5 Multipotent hücrelerin farklılaşmalarını gösteren şema Şekil 2. 6 Kemik iliğinden elde edilen kök hücrelerin farklılaşabileceği hücre serilerinin şematik görünümü Şekil 2. 7 Hematopoetik kök hücrelerin farklılaşma potansiyelini gösteren şema Şekil 2. 8 Kemik iliği kaynaklı hematopoetik kök hücrelerin farklılaşma potansiyellerini gösteren diyagram Şekil 2. 9 Otolog periferik kan transplantasyon işlemlerini gösteren şema Şekil MKH lerin faklılaşmalarını gösteren şema... 2 Şekil Embriyonik kök hücrenin somatik hücreye farklılaşmasını ve farklılaşmış hücrenin yeniden programlanarak kök hücreye indüklenmesini gösteren şema Şekil Kahverengi ve beyaz yağ dokusunun histolojik görünümü Şekil Yağ dokusundan elde edilen kök hücrelerin farklılaştığı hücre tiplerini gösteren şema..35 Şekil Thoma lamı üzerindeki yivler..40 Şekil Kriyoprezervasyon tekniği ile hücrelerin soğuma basamaklarını gösteren şema44 Şekil Yavaş dondurma tekniği ile hücrelerin sıvı azot içerisine alınmasını gösteren şema..45 Şekil Hızlı dondurma tekniğinin oda sıcaklığından (RT) sıvı azot (LN)..46 Şekil 3. 1 İnsan yağ dokusundan yağ emme (lipoasipirasyon, liposuction) yöntemi ile subkütanöz lipid tabakasının alınması..52 Şekil 3. 2 Flask içerisinde yer alan monolayer hücre tabakasının tripsin/edta muamelesi ile kaldırılması ve Falcon tüpe alınması Şekil 3. 3 Santrifüj edilen AD-MKH lerin kriyoprezervasyon işlemi sonucunda kriyotüpe aktarılması ve sıvı azot tankına muhafaza edilmek üzere koyulması. 54 viii

9 ix Şekil 4. 1 Yağ dokusundan izole edilen MKH (AD-MKH) kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, 24. saat, 20X) Şekil 4. 2 Yağ dokusundan izole edilen MKH lerin (AD-MKH) kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, A.3. gün ve B. 7. gün, 10X) 61. Şekil 4. 3 Yağ dokusundan izole edilen MKH lerin (AD-MKH) kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren IMDM, A.3. gün, 10X ve B. 7. gün, 20X) Şekil 4. 4 Yağ dokusundan izole edilen MKH lerin (AD-MKH) kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM F12, A. 3. gün, 10X ve B. 7. gün, 20X).63 Şekil 4. 5 Tripsin eklenen kültür ortamında hücrelerin yüzeyden ayrılmaya başlaması (10X).64 Şekil 4. 6 Yağ dokusundan izole edilen MKH (AD-MKH) kültürünün 4. pasajdan sonraki mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, 10X) Şekil 4. 7 Koloni oluşturan AD-MKHleirn mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, 4. pasaj, 20X) Şekil 4. 8 Uzun süreli kültüür yapılan MKH lerin mikroskobik görüntüsü, (%10 FBS içeren DMEM, (12. pasaj, 20X) Şekil 4. 9 Yağ dokusundan hücre izolasyon sonrası kültürün mikroskobik görüntüsü (48. saat, 10X) 68 Şekil AD-MKH kültürünün mikroskobik görünümü, 10X (A. Pasaj sonrası 3. gün, B. Pasaj sonrası 5. gün konfluent olmuş hücre kültürü) Şekil Tripsin eklenen AD-MKH lerin mükroskobik görünümü, (10X) Şekil AD-MKH lerin uzun süreli kültür sonrasında mikroskobik görünümü, (A. 22. pasaj, B. 23. pasaj, C. 24. Pasaj, 10X) Şekil Donör 3 ten elde edilen AD-MKH lerin izolasyon sonrası kültürdeki görünümü (24 saat sonra, 10X) Şekil. 14 Donör 3 ten elde edilen AD-MKH lerin geniş sitoplazmatik yayılım gösteren hücresel görünümü, (20X) Şekil AD-MKH kültürünün ilerleyen pasajlardaki mikroskobik görünümü (A. B. C. ve D. 20X., E ve F 10X) Şekil Donör 4 ten elde edilen AD-MKH lerin izolasyon sonrası mikroskobik görünümü, (24. Saat, 10X) Şekil Donör 5 ten izole edilen AD-MKH lerin mikroskobik görünümü, (24. saat, 10X)..76 Şekil Donör 5 ten elde edilen AD-MKH lerin ikinci pasaj öncesi mikroskobik ix

10 x görünümü, (10X) Şekil Donör 6 dan izole edilen AD-MKH lerin mikroskobik görünümleri (24. Saat, 10X).78 Şekil Donör 6 dan elde edilen AD-MKH'lerin mikroskobik görünümleri (3. pasaj), 10X büyütme..79 Şekil Donör 6 dan elde edilen AD-MKH'lerin miikroskobik görünümü (A.4. pasaj, B. 5. pasaj, 10X)...79 Şekil AD-MKH lerin mikro tüp içindeki mikroskobik görünümü (1. Saat, 40X) Şekil AD-MKH lerin mikro tüp içerisindeki mikrskobik görünümü (24. saat, 40X..83 Şekil AD-MKH lerin mikro tüp içerisindeki mikrskobik görünümü (A. Kapalı uçlu, B. Açık uçlu, 40X) Şekil AD-MKH lerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü (24. Saat, A. Kontrol grup, 10X, B. adipojenik grup, 20X) Şekil AD-MKH lerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü (A. 4. gün 10X, B. 5. gün, 20X) Şekil AD-MKH lerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü (11. Gün, A. 10X, B. 20X) Şekil AD-MKH lerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü (14. Gün, A. 10X, B. 20X) Şekil AD-MKH lerin adipojenik farklılaşma sonrası Oil Red O boyamasının mikroskobik görünümü, (A. 10X, B, C ve D 20X Şekil AD-MKH lerin osteojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü, (24. Saat, A. Kontrol grup, 10X, B. osteojenik grup, 20X) Şekil AD-MKH lerin osteojenik farklılaştırma sırasında mikroskobik görünümü (48. Saat, A. Kontrol grup, 20X, B. osteojenik grup, 10X) Şekil 4.32 AD-MKH lerin osteojenik farklılaştırmasının mikroskobik görünümü (10. gün, 10X) Şekil AD-MKH lerin osteojenik farklılaştırmasının mikroskobik görünümü (14. gün, A. 20X, B. 10X) Şekil Kriyobanktan çıkarılan AD-MKH lerin MTT yöntemi ile canlılık tayininde formazan kristallerinin mikroskobik görünümü (10X) Şekil AD-MKH lerin Wright-Giemsa boyamasının mikroskobik görünümü, x

11 xi (20X). 94 ÇİZELGE LİSTESİ Çizelge 4. 1 Yağ dokusu MKH lerinin flow sitometrik olarak CD34 analizi Çizelge 4. 2 Yağ dokusu MKH lerinin flow sitometrik olarak CD90 analizi Çizelge 4. 3 Yağ dokusu MKH lerinin flow sitometrik olarak hücre döngüsü analizi (5. pasaj).82 Çizelge 4.4 Kriyoprezervasyon sonrası Tripan mavisi boyama ile hücre canlılık oranları..89 xi

12 xii ÖNSÖZ Lisansüstü eğitimim boyunca akademik bilgisini ve tecrübesini benden esirgemeyen çok değerli danışman Hocam Yrd. Doç. Dr. Melahat BAĞIROVA'ya, çalışmalarım boyunca aynı ilgi ve desteği gösteren değerli Hocam Prof. Dr. Adil M. ALLAHVERDİYEV'e, verdiği mali destekten dolayı TÜBİTAK a ve ek destek sağlayan Devlet Planlama Teşkilatı na teşekkür ederim. Bölümümüzün kurucusu Prof. Dr. Mehmet Mustafa AKDESTE ye ve kurucu üyelerden Prof. Dr. Huriye KUZU ya teşekkürü bir borç bilip yakın zamanda kaybettiğimiz bu iki değerli hocamızı saygı ve minnet ile anıyorum. Kimya-Metalurji Fakültesi Dekanı ve Biyomühendislik Bölüm Başkan vekili Prof. Dr. Sabriye PİŞKİN e, çalışmam boyunca bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan ve kullandığım lipoasipirat örneklerini temin eden sevgili Necati FINDIKLI ya teşekkürü bir borç bilirim. Bununla birlikte bu çalışmanın yerine getirilmesine imkan sağlayan Kimya-Metalurji Fakültesi Dekanlığı na, Fen Bilimleri Enstitüsü ne, Biyomühendislik Bölüm Başkanlığı na ve bütün değerli hocalarıma teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında sonsuz destekleri için Biyomühendislik Bölümü Hücre Kültürü Laboratuvarındaki sevgili arkadaşlarım; Rabia ÇAKIR KOÇ, Serhat ELÇİÇEK, Emrah Şefik ABAMOR, Sezen CANIM ATEŞ, Olga Nehir ÖZTEL, Özlem ŞAHİN, Elif METE, Melike ERSÖZ, Müge YAZICI, Ayça AKSOY ve Zafer Nihat CANDAN a Yüksek lisans hayatıma başladığım ilk günden beri manevi desteği ile bana yol gösteren ve hep yanımda olan çok sevgili arkadaşım Hüseyin BAYDAR a En değerli varlıklarım sevgili babam; Mehmet YEŞİLKIR, annem; Nisbet Yeşilkır ve canlarım; Özge, Yasemin ve Umut Can YEŞİLKIR a teşekkürlerimi sunarım. xii

13 xiii ÖZET Günümüzde adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücreler (AD-MKH) ile ilgili çalışmalara olan ilgi hızla artmaktadır. Bunun nedeni adipoz dokunun kemik iliği (Kİ), periferik kan (PK) ve kordon kanı (KK) ile kıyaslandığında daha fazla mezenkimal kök hücre (MKH) içermesidir. Adipoz doku MKH lerinin uzun süreli kültürü mevcut olan zorluklardan dolayı dünyanın sayılı laboratuarlarında yapılmaktadır. Ülkemizde ise bu konu ile ilgili çalışmalar oldukça sınırlıdır. Buna göre de bu çalışmanın amacı farklı vericilerin adipoz dokusundan MKH izolasyonunu, in vitro kültürde adaptasyonunu, uzun süreli kültürünün yapılmasını ve kriyoprezervasyonunu incelemek olmuştur. Çalışmamızda farklı vericilerin lipoasipirat örnekleri kullanıldı. Deneylerde MKH izolasyonu (kolajenaz tip II ile muamele, basit santrifügasyon ile ayırma), hemasitometre ile hücre sayımı, Tripan mavisi ile hücre canlılık tayini, flow sitometrik immünfenotipleme (CD90 ve CD34), histokimyasal analiz (Oil Red O ve Alizarin Red S), klasik kültür, mikrokültür (MKM) ve kriyoprezervasyon yöntemleri kullanılmıştır. İzole edilen ve uzun süreli kültürü yapılan hücrelerin MKH olmasını belirlemek amacı ile yapılan morfolojik, immüfenotipik (CD90+ %95,98 ve CD34- %98,94), histokimyevi (adipojenik ve osteojenik farklılaştırma) incelemeler elde edilen hücrelerin MKH olduğunu göstermiştir. Çalışmamızda ilk kez olarak MKH lerin farklı besiyerlerinde (%10 FBS içeren DMEM, IMDM ve DMEM/F12) kültürünün yapılması karşılaştırılarak incelendiğinde % 10 FBS içeren DMEM besiyerinin MKH ler için en uygun kültür ortamı olduğu ve kültürü zor yapılan veya az sayıda MKH içeren örneklerin kültürünün yapılmasında mikrokültür yönteminin uygulanmasının, MKH lerin kriyoprezervasyonunda ise hücre sayısının önemli olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca MKH lerin elde edilen uzun süreli kültürü laboratuarımızda polimerlerin toksisitesinin ve enfeksiyon-kök hücre etkileşiminin incelenmesinde uygulanmıştır. Sonuç olarak bu çalışmada elde edilen yeni bilgiler ışığında farklı donörlerden elde edilen MKH lerin devamlı kültürü ve kriyoprezervasyonu optimize edilmiştir. Ayrıca bu çalışmada elde edilen sonuçlar, TÜBİTAK tarafından yayınlanan Teknoloji Öngörü Çalışmasında, Türkiye de kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve kök hücrelerin özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi gerekliliği talebine de uygun olarak yapılmıştır. Anahtar kelimeler: Adipoz doku, mezenkimal kök hücre, mikro kültür yöntemi, flow sitometri xiii

14 xiv ABSTRACT Recent studies about adipose tissue derived stem cells (AD-MSCs) have more concern than usual. Reason of this is that adipose tissue includes more MSCs when compared to bone marrow (BM), peripheric blood (PB) and umbilical cord blood (UCB). The studies of AD- MSCs are performing in a few laboratories around the world because of difficulties in their long term culture. Meanwhile these studies are also so limited in our country. Accordingly, the reason of that study is checking isolation, adaptation as in vitro culture, process a long term culture and cryopreservation of MSCs in the adipose tissue s from different task donors. In our study, we used sample of different donors lipoasipirate. In experiments, MSCs isolation (treat as collagenase type II, separation with simple centrifugation), cell counting with hematocytometer, cell activity designation with Tripan blue, flow cytometric immunphenotyping (CD90 and CD34), histochemical analysis (Oil Red O and Alizarin Red S), classic culture method, micro culture method (MCM) and cryopreservation method were processed. Morphological, immuphenotypic (CD90+ 95,98% and CD34-98,97%), histochemical (Oil Red O and Alizarin Red S stainning for adipojenic and osteojenic differentiation) studies were maintained to make the insulated and long term cultured cells as MSCs. Then all of the cells has obtained as MSCs in these experiments. For the first time, in the experiments, we found that the optimum culture environment for AD- MSCs is DMEM media including 10 % FBS when we compared with DMEM, IMDM and DMEM/F12 media. Also, we demonstrated that MC method is so important for adaptation of cells to long term culture as a first step and number of the cells are so important in cryopreservation of AD-MSCs. Besides, the long term culture that obtained from MSC was used in determination of polymers toxicity and infection-stem cell interaction experiments in our laboratory. As a result, according to the knowledge from this experiments, we optimized long-term culture and cryopreservation of adipose derived stem cells from different donors. Additionally, obtained results from this project have been prepared dependent on the request of Improvement of stem cells technologies and to convert the stem cells as useful cells for regenerative clinic experiments in Study of Technological Predictions which published on xiv

15 xv by TUBITAK. Keywords: Adipose tissue, mesenchymal stem cells, micro culture method, flow cytometer xv

16 1 1. GİRİŞ Son yıllarda doku mühendisliği ve rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılan somatik hücrelerin yerini, farklılaşmadan uzun süre bölünebilme, çoğalabilme ve kendilerini yenileyebilme kapasitesine sahip kök hücreler almıştır. Rejeneratif tıp konusunda yapılan çalışmaların temelini ise kök hücreler kullanılarak, hasar görmüş ya da işlevini yitirmiş doku ve organların tamir edilerek yenilenmesi oluşturur. Ancak, kök hücrelerin rejeneratif tedavi amacıyla kullanılabilmesi için kök hücre miktarının yeterli olması gerekmektedir. Farklı kaynaklardan (kemik iliği, periferik kan, kordon kanı ve adipoz doku) kök hücrelerin izolasyonu yapılsa da elde edilen miktarlar klinik uygulamalar için yeterli değildir. Bu yüzden farklı kaynaklardan izolasyonu yapılan kök hücrelerin karakteristik özelliklerini kaybetmeden, uzun süreli kültürlerde çoğaltılması son derece önemlidir (Atta, 2004). Rejeneratif tıp ve doku mühendisliğinde kullanılan en önemli kök hücreler, kemik iliği, periferik kan, kordon kanı ve adipoz dokudan elde edilebilen, kemik hücreleri (osteositler), kıkırdak hücreleri (kondrositler), yağ hücreleri (adipositler) ve bağ doku hücrelerine farklılaşabilen MKH lerdir (Li, 2008; Schäfer 2008; Huang vd., 2009). Ancak MKH lerin hematopoetik ve hematopoetik olmayan dokulardan izolasyonunda ve uzun süreli kültürlerinin yapılmasında önemli problemler mevcuttur. Klinikte hematopoetik kök hücre transplantasyonlarında kullanılan ve aynı zamanda önemli bir MKH kaynağı olan yetişkin kemik iliğinde MKH oranı oldukça düşük olup % 0,01-0,0001 kadardır (Baddoo, 2003). Bunun yanında, MKH izolayonu için cerrahi müdahele ve genel anestezi gibi zorlukları bulunmaktadır. Ayrıca izolasyonu yapılan kemik iliği MKH lerinin enfeksiyon ve çeşitli fiziksel etkenlere maruz kalması klinik uygulamalarda oldukça önemli problemler arasındadır (Chanda, 2010). Kemik iliğinden izole edilen kök hücrelerin transplantasyonlarında diğer önemli problemlerden biri de Graft versus host hastalığı (GVHD) olarak adlandırılan verici hücrelerinin alıcı doku tarafından reddedilmesidir (Chanda, 2010; Wingard, 2010). Diğer bir MKH kaynağı ise son yıllarda hematopetik kök hücre transplantasyonlarında kullanılan uyarılmış periferik kandır (Ferra, 2010). Ancak, periferal kanda MKH lerin bulunup bulunmadığı hakkında araştırmalar hala devam etmektedir. Bazı araştırmacılar periferik kanda MKH bulunduğunu ancak son derece düşük oranlarda olduğunu tespit etmiştir. Malign hastalıklar dışında sağlıklı yetişkin periferik kanında, MKH olmadığına dair güçlü kanıtlar mevcuttur (Campagnoli, 2001; Romanov, 2003; Roberts, 2004). Tam periferik kanda ise MKH varlığını kanıtlayan herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Ancak transplantasyon

17 2 sonrası engrafmanın sağlanması aşamasında kemik iliğinde MKH varlığı gösterilmiştir. Bunun dışında kanser hastalarında sitokin mobilizasyonu sonrasında periferik kanda MKH varlığı tespit edilmiştir (Romanov, 2003; Jackson, 2007). Hematopoetik kaynaklı MKH kaynaklarından biri de kordon kanıdır. Donörden alınan kordon kanı miktarının da sınırlı olması ve toplama işleminin sadece bir kez yapılabilmesi, MKH izolasyonu açısından önemli bir dezavantajdır. Bu yüzden kordon kanından yapılan MKH izolasyonunda, adaptasyonunda ve uzun süreli kültürünün yapılmasında, 22 donörün sadece 1 tanesinde başarılı olunması konusunda bilgiler bulunmaktadır (Laitinen ve Laine, 2007; Zeddou vd., 2010). Ayrıca şimdiye kadar kordon kanından kök hücre kültürü az sayıda laboratuarda yapılabilmektedir. Bunun diğer nedeni ise şimdiye kadar kordon kanından elde edilen MKH lerin uzun süreli kültürüne ve adaptasyonuna etki eden faktörlerin tam olarak bilinememesidir (Migliaccio vd., 2010; Alvarado vd., 2010; Schuh vd., 2010). Hematopoetik olmayan önemli bir MKH kaynağı da adipoz dokudur. Adipoz doku, insan vücudunun %10-20 sini oluşturması ve yüksek oranda MKH içermesinden dolayı hematopoetik kaynaklara göre birçok avantaja sahiptir (Zwingenberger vd., 2010). Adipoz dokudan elde edilen mezenkimal kök hücreler (AD-MKH), cerrahi operasyon sonrasında atık olarak nitelendirilen lipoasipiratlardan enzimatik ve basit santrifügasyon yöntemleriyle yüksek miktarda izole edilebilirler (Whang vd., 2008). Adipoz doku; donör, alınan bölge ve elde edilen doku miktarı gibi fiziksel özelliklere bağlı olarak farklı miktarda ve kalitede kök hücre içerir (Aksu 2008). Bu yüzden yağ dokusu alternatif bir kök hücre kaynağı olarak çok önemli ve zengin bir kaynak olarak tanımlanabilmektedir. Günümüzde yağ dokusundan elde edilen MKH ler rekonstrüktif cerrahide kullanılmaktadır. Bu amaçla yağ dokusundan izole edilen MKH ler doğrudan aynı donörün deri altına enjekte edilerek cilt gerdirme, yaşlanmayı önleyici gibi çeşitli işlemler için kullanılmaktadır (Ebisawa vd., 2009). Fakat izole edilen bu hücreler hem yetersiz miktarda adipoz kaynaklı MKH hem de adipoz doku MKH dışında diğer hücre tiplerini içermektedir. Bunların yanısıra bu hücrelerin MKH olup olmadığı sadece flow sitometrik olarak analiz edilmektedir. Ancak kök hücrelerin tanımlanması için sadece flow sitometrik yöntemler yeterli olmadığından diğer parametrelerin de (morfolojik, histokimyasal gibi) belirlenmesi önerilmektedir (Vienken, 2008; Khan, 2009). Ayrıca yağ dokusundan elde edilen MKH lerin transplantasyonundan sonra verilen bölgede kök hücrelerin biyolojik özelliklerine ve diğer hücre tiplerine farklılaşıp farklılaşmadığına dair bilgiler bulunmamaktadır. Bu nedenle yağ dokusu MKH lerin in vivo

18 3 şartlardaki özelliklerinin tespit edilebilmesi için in vitro uzun süre kültür ortamında hücrelerin ayrıntılı olarak biyolojik özelliklerine etki eden faktörlerin (kriyoprotektanın türü, kriyoprotektan konsantrasyonu, hücre sayısı gibi) incelenmesi oldukça önemlidir. Ancak, yağ dokusundan elde edilen MKH lerin tam karakterizasyonu, in vitro uzun süreli kültür yapılarak belirlenebilir. Dünyada yağ dokusundan elde edilen MKH lerin uzun süreli kültürünün yapılmasına ait çeşitli çalışmalar az sayıda laboratuarda yapılmaktadır. Buna göre de son yıllarda yağ dokusundan elde edilen MKH lere daha çok önem verilmektedir. Yağ dokusundan elde edilen MKH lerin klinikte uygulanması genellikle deri yanmalarındaki etkinliği ile doku mühendisliği çalışmalarında, antioksidan etkisi ile rekonstrüktif ve estetik cerrahi çalışmalarında kullanımı devam etmektedir (Kim vd., 2009; Jeong, 2009). AD-MKH lerin kriyoprezervasyonu ile ilgili çalışmalar bulunmasına rağmen şimdiye kadar bu MKH lerin kriyoprezervasyonu sırasında hücrelerin canlılığına etki eden faktörlere (hücre sayısı vb gibi) kriyoprezervasyon teknikleri) dair, yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. Şu ana kadar bu konu ile ilgili çalışmaların sınırlı olması yağ dokusundan elde edilen MKH ler uzun süreli kültürünün yapılması ile ilgili sorunların tam olarak çözülememesinden kaynaklanmaktadır. Böyle ki donörlerden alınan yağ dokusunun, yaşa, cinsiyete ve alındığı bölgeye bağlı olarak izole edilen hücre miktarı farklılık gösterir (Aksu, 2008). Ayrıca kültür ortamında gerekli koşulların şimdiye kadar tam olarak optimize edilememesinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle farklı donörlerin yağ dokusundan izole edilen kök hücrelerin in vitro kültürünün optimizasyonu, tüm parametrelere göre karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonunun optimize edilmesi son derece önemlidir. Ülkemizde yapılan yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelere ait çalışmalar az sayıda olup özellikle Kocaeli Üniversitesi Kök Hücre ve Gen Tedavileri Araştırma ve Uygulama Merkezi (KOGEM) nde sayın Prof. Dr. Erdal KARAÖZ başkanlığında yürütülmektedir. Ancak yağ dokusundan elde edilen MKH lerin izolasyonu, devamlı kültürünün yapılmasına yönelik çalışmalar az sayıda yapılmaktadır. Buna göre de bu çalışmanın amacı farklı donörlerden izole edilmiş MKH lerinin izolasyonu, devamlı kültürünün yapılması, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonunun incelenmesi olmuştur. Amaca ulaşmak için aşağıdakiler yapılmıştır;

19 4 Farklı donörlerin yağ dokusundan izole edilen kök hücrelerin adaptasyonunun ve uzun süreli kültürünün yapılmasının karşılaştırmalı olarak incelenmesi, Farklı besiyerlerinin yağ dokusundan elde edilen MKH lerin in vitro kültür ortamında adaptasyonuna ve proliferasyonuna etkisinin incelenmesi Kültürü elde edilen MKH lerin karakterizasyonu; mikroskobik inceleeme ile morfolojik olarak incelenmesi, flow sitometrik olarak immünfenotiplendirilmesi, adipojenik besiyeri kullanarak AD-MKH lerin adipositlere farklılaştırılması, osteojenik besiyeri kullanarak AD-MKH lerin osteositlere farklılaştırılması, Kültürü zor yapılan veya az sayıda KH bulunan örneklerin mikro kültür yöntemi ile adaptasyonunun sağlanması ve uzun süreli kültürünün elde edilmesi, Adipoz kaynaklı MKH lerin kriyoprezervasyonuna hücre sayısı ve kriyoprotektanın etkisinin incelenmesi. Ülkemizde TÜBİTAK tarafından yayınlanan strateji belgesinde de Türkiye de yapılması gereken bilimsel çalışmalar için kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi vurgulanmaktadır.

20 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Hücreler Hücreler tüm canlı organizmaların yapısal birimleridir (Junqueira ve Carneiro, 2006). (Şekil 2.1) Hücre ve hücrenin kısımlarını konu alan hücre biyolojisi son yıllarda çok hızlı ilerlemeler göstermiş ve canlı organizmaların yapı ve fonksiyonlarını araştırmada temel olmuştur (Ozban, 1982). Şekil 2.1 Ökaryotik hücre yapısı İnsan vücudu yaklaşık iki yüz farklı hücre tipinden oluşmuştur. Bu hücrelerin tümü oosit ile spermin döllenmesiyle (fertilizasyonuyla) meydana gelen zigottan oluşur (Junqueira ve Carneiro, 2006). Zigot; yüksek bölünme hızı ve tüm hücre tiplerine farklılaşma kapasitesine sahip olan totipotent embriyonik kök hücredir. Tüm canlı vücudu bu tek hücreden farklılaşarak meydana gelir (Şekil 2.2).

21 6 Şekil 2.2 Yumurta ve spermin döllenmesi ile meydana gelen zigot 2.2 Öncü / Progenitör Hücreler Yetişkin kaynaklı KH ler bulundukları dokuya/organa ait hücrelere tam olarak farklılaşmadan önce ara bir safha geçirirler. Bu ara safhadaki hücrelere öncü veya progenitör hücreler adı verilir. Genel olarak farklılaşmamış hücreler kök hücreler olarak adlandırıldığından bu ara safhadaki öncül hücreler de KH sanılabilmektedir. Bu hücrelerin kendilerini yenileyebilme yetenekleri ve farklılaşmaya başlamadan az önceki hücresel gelişimleri kök hücrelere benzetilmektedir ancak; fetal ve yetişkin dokudaki progenitör hücreler yarı farklılaşmışlardır ve bölünerek olgun hücrelere farklılaşabilirler (Şekil 2.3). Şekil 2.3 Progenitör ve kök hücrelerin bulundukları dokulardaki farklılaşma özellikleri

22 7 Ayrıca progenitör hücrelerin gelişim süreçlerindeki biyokimyasal özellikleri incelendiğinde kök hücre olmadıkları anlaşılmaktadır (Shehab ve Saber, 2009). 2.3 Kök Hücreler Kök hücreler kendilerini yenileyebilme ve bulunduğu dokudaki diğer hücrelere ve pek çok hücre serisine farklılaşabilme yeteneğinde olan özelleşmemiş hücrelerdir (Tapp vd., 2009). Özelleşmemiş hücrelerin özelleşmiş hücrelere kaynaklık etmesine farklılaşma denir. Bir kök hücrenin temel özelliklerinden biri de özelleşmiş herhangi bir dokunun yapısına sahip olmayışıdır. Elde edildikleri kaynaklara bağlı olarak kök hücreler farklı farklılaşma potansiyellerine sahiptirler. Embriyonik ve fetüs kaynaklı kök hücreler sınırsız farklılaşabilirlerken yetişkin doku ve organlardan elde edilen kök hücrelerin farklılaşma potansiyelleri daha sınırlıdır. Bu nedenle hücreler farklılaşma potansiyellerine göre sınıflandırılırlar. Hücre biyolojisinde artan gelişmelere paralel olarak keşfedilen kök hücrelere dair çalışmalar ile kök hücrelere dair bilgiler de giderek artmaktadır. Kök hücreler uzun süre bölünebilme ve kendilerini yenileyebilme yetenekleri ile normalde kendileri çoğalamayan kan, kas veya sinir hücrelerinden farklı olarak çok sayıda bölünebilir ve çoğalabilirler.özel bir hücreye farklılaşmamış ve pek çok hücre tipine farklılaşabilme kapasitesine sahip olan kök hücrelerin biyolojik bilgileri ve elde edildikleri kaynaklar da en sık incelenilen çalışmalar arasındadır. Sınırsız bölünebilme yeteneklerinin belirlenmesi ile, bu alandaki çalışmalar artış göstermektedir (Atta, 2004) Totipotent hücreler Embriyonun döllenmeden sonraki 4. gününe kadar oluşan hücrelere totipotent hücreler adı verilmektedir. Sperm ile yumurta hücresinin döllemesi ile oluşan tek hücreli embriyo (zigot) ilk totipotent hücre olarak kabul edilmektedir. Bu hücreler plasenta gibi ekstraembriyonik yapılar da dahil olmak üzere tüm organizmanın yapılarını ve oluşturabilecek yeteneğe sahiptirler (Mitalipov ve Wolf, 2009) Pluripotent hücreler Bir pluripotent kök hücre embriyonun üç germ tabakası olan endoderm, mezoderm ve ektoderme ait hücrelere farklılaşabilme yeteneğindeki hücrelerdir (Şekil 2.4). Bu hücrelerin sahip oldukları farklılaşma potansiyeli ile ekstraembriyonik tabakalar hariç bir canlıyı tümden

23 8 oluşturabilecekleri kabul edilmektedir. Yapılan çalışmalarda erken dönem insan embriyolarından alınan hücreler ile fetüs dokusunda gonat kaynaklı hücrelerin pluripotent kök hücre oldukları gösterilmiştir (Mitalipov ve Wolf, 2009). Şekil 2.4 Totipotent evredeki zigot ile embriyo ve pluripotent evredeki blastosist evresi Multipotent hücreler Bir multipotent kök hücre içerisinde yer aldığı germ tabakasına ait hücre ve doku gruplarına farklılaşabilme özelliği gösteren hücrelerdir. Örneğin kan kaynaklı kök hücreler sadece kan hücrelerine farklılaşma göstermektedirler (Şekil 2.5). Bu hücreler sınırlı farklılaşabilme kapasitesine sahip olmalarına rağmen çok sayıda hücre türüne farklılaşabilmektedirler (Sarugaser vd. 2009). Şekil 2.5 Multipotent hücrelerin farklılaşmalarını gösteren şema

24 Unipotent hücreler Yalnız bir çeşit hücre grubuna farklılaşabilen hücrelere unipotent hücreler denir. Bulundukları doku ya da organa ait hücre serilerine diferansiye olurlar. Deri kök hücreleri unipotent hücre grubuna örnek verilebilir. Kök hücrelerin sahip olduğu özellikler kaynak aldıkları yerler ile ilişkilidir. Özellikle son yıllarda yapılan çalışmalarla birlikte organizmanın çeşitli gelişim evrelerinden ve çok sayıda organ ve dokudan kök hücre izole edilmesi başarılmıştır (Hong vd., 2004). Erişkin kök hücreler köken aldıkları doku ve organlara göre hematopoetik ve MKH ler olmak üzere temelde 2 gruba ayrılır. Bu iki gruptaki kök hücrelerin temel özellikleri birbirinden farklılık gösterebilmektedir. 2.4 Hücre Plastisitesi Hücre farklılaşmasını açıklayan mekanizma hücre plastisitesi olarak adlandırılan bir teoridir. Bu teori herhangi bir kök hücre ve genomunun yeniden programlanarak istenilen hücre serisine farklılaşabileceğine dayanır (Estrov, 2009). Kök hücre plastisitesini açıklayan 3 ana kriter vardır (Lakshmipathy ve Verfaillie, 2005): 1. Öncelikle yeni oluşan hücreler tek bir hücreden gelişen homojen bir topluluk olmalı ve bunu gösteren genetik bir belirteç bulunmalıdır. 2. Hücrelerin farklı bir hücreye dönüştüğü gösterilebilmelidir. Kök hücrelerin in vivo farklılaşmasından önce in vitro pasajlanma esnasında transforme olasılığı olduğu varsayılmalıdır. 3. Alıcı dokuda oluşan yeni donör hücrelerinin fonksiyonel olup olmadığı ortaya konmalıdır. Hücre plastisitesi sırasında kök hücreler farklılaşırken belirli bir düzen takip ederler. Kök hücre farklılaşma mekanizması olarak adlandırılan bu düzen aşağıdaki 4 yolu içermektedir: 1. Başlatıcı sinyal: Eksternal bir uyarı ile örneğin sitokin, kemokin veya adezyon reseptörleri aracılığı ile transkripsiyon faktörleri kök hücrede farklılaşma olayını başlatır. 2. Kromatinin yeniden yapılanması: Transkripsiyon faktörlerinin etkisiyle kök hücre çekirdek kromatininde yeniden yapılanma gerçekleşir.

25 10 3. Transkripsiyonun aktivasyonu: Çekirdek DNA sına daha fazla transkripsiyon faktörü entegre olur. 4. Yeni gen ekspresyonu: Çekirdek DNA sı tamamen değiştiği için yeni gen ekspresyonu olur ve kök hücre veya progenitor hücreden farklılaşarak oluşturacağı dokuya ait yeni hücre gelişimi başlamış olur. Bu yeni teoriye göre; tüm bu olaylar hücre döngüsü boyunca olmaktadır. Örneğin; kromatinin yeniden yapılanması hücre döngüsünün G1 fazında olmaktadır. Böylece kök hücre farklılaşması hücre döngüsünün değişiklik fazları ve bu dönemde etkisi olan sitokinler, adezyon reseptörleri gibi faktörlere bağlı olarak gelişmektedir (Labar, 2009). Bu teorinin iyice anlaşılması pek çok hastalığın tedavisinde etkin olacak yeni klinik çalışmalara öncülük edeceği düşünülmektedir. 2.5 Kök Hücre ve Kullanım Alanları Kök hücre kullanımının yaygınlaşması ile birlikte, çeşitli alanlarda kök hücreler ile ilgili çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. Bu çalışmaların sonucu olarak yeni branşlar doğmuştur. Bunun yanı sıra, kök hücre temelli gen terapileri ile çeşitli hastalıkların tedavi edilmesi amaçlanmaktadır. Son zamanlarda özellikle dejeneratif hastalıklarda hücre, doku ya da organ kayıplarının tedavisi için kök hücre kullanımının gerekli olduğu anlaşılmış ve rejenerasyonun sağlanması için doku mühendisliği doğmuştur. Doku mühendisliğinin amacı; yaşayan sağlıklı hücreleri vücuttan izole edip, çoğaltıp, onları biyouyumlu taşıyıcı materyallerle birleştirmek ve bunları hastalara yeniden verilmesidir (Salgado vd., 2006). Kök hücrelerin çeşitli dokulara farklılaşma potansiyeli rejeneratif tıp için önemlidir fakat farklılaşma yolları ve bu hücrelerin gelişiminin istenilen dokulara doğru nasıl yönlendirilebileceği konusu henüz tam anlaşılamamıştır. Yapılan bazı preklinik çalışma modellerine göre: yara ve yanık onarımı için keratinositler ve dermal fibroblastlar (Carsin vd., 2000), kıkırdak onarımı için kondrositler (Peterson vd., 2003), miyokard onarımı için miyositler (Tran vd., 2003), yaşa bağlı maküler dejenerasyon için retinal pigment epitelyum hücreleri (Brinder vd., 2002) ve merkezi sinir sistemi lezyonlarında miyelini onarmak için Schwann hücre transplantasyonlarını (Cheng ve Chen, 2002) kullanılır (Şekil 2.6).

26 11 Doku mühendisliği pek çok konuda yapılan kök hücre çalışmaları ile dallara ayrılmıştır: kemik doku mühendisliği, kıkırdak doku mühendisliği, yara iyileşmesi, tendon mühendisliği, kas doku mühendisliği, damar mühendisliği, nöral doku mühendisliği Şekil 2.6 Kemik iliğinden elde edilen kök hücrelerin farklılaşabileceği hücre serilerinin şematik görünümü Kök hücre teknolojisi ile rejeneratif tıp için yeni çalışma alanları doğmuştur. Kök hücreler kanser, sinir sistemi hastalıkları (Alzheimer) ve hasarları, metabolik hastalıklar (diyabet), organ yetmezlikleri, romatizmal hastalıklar, kalp hastalıkları, kemik hastalıkları ve daha birçok alanda kullanıma sahiptirler. Pek çok rejeneratif hastalığın tedavisi özellikle doku mühendisliğinin temelini oluşturmaktadır (Wataya vd., 2008). Kök hücreler ile doku iskeleleri

27 12 oluşturarak kaybedilmiş, hasar görmüş dokuların tamiri ve tedavisi sağlanmaya çalışılmaktadır. Günümüzde nörodejeneratif hastalıkların bazılarının tedavisi için organ veya doku nakilleri yapılmaktadır. Ancak, organ veya doku nakli gerektiren hastaların çokluğu, uygun organ ve dokunun her zaman bulunamaması gibi sorunlarla sürekli karşılaşılmaktadır (Mehta vd., 2010). Bilim ve teknolojideki son gelişmeler doğrultusunda kök hücrelerin bu alanda kullanılması gündeme gelmiştir. Son zamanlarda, kök hücre nakilleri ile yapılan çalışmalar tedavi olarak değil, doku onarımına yardımcı olmak için yapılmaktadır. Bugün için tedavisi mümkün görünmeyen hastalıkların birçoğu, yaşam için vazgeçilmez olan bazı hücre-doku ve organların bir daha asla normal yapı ve işlevlerine dönemeyecek bir şekilde hasar görmüş olmasından kaynaklanmaktadır. Örneğin; tip I diyabet hastalığında pankreasta insulin salgılayan beta hücrelerinin, titremelerle birlikte kas katılaşmalarıyla karakterize olan Parkinson hastalığında ise beyinde dopamin salgılayan sinir hücrelerinin hasarı söz konusudur (Yuan vd., 2010). Bu tür ve benzeri hastalıkların (Alzheimer, Multiple skleroz ve çeşitli kas hastalıkları gibi) kesin tedavisini sağlamak amacıyla araştırmacılar hasar gören hücre, doku veya organların biyolojik işlevlerini yerine koymak (rejeneratif tıp) ya da tamir etmek (reparatif tıp) ile mümkün olabileceğini düşünmektedirler (Tip I diyabet için pankreasın adacık hücreleri buna örnektir). Kök hücre kitabı Hedeflenen doku veya organa, o organın işlevlerini eski haline getirmeye yetecek kadar sayıda ve kalitede izole edilmiş ve özellikleri belirlenmiş olan hücrelerin nakledilmesiyle bu amaca ulaşılabilir. Kök hücreler, bu amaca hizmet edebilecek, yani hücre tabanlı tedavide kullanılabilecek başlıca unsur olarak görünmektedir (Karaöz vd., Diğer taraftan kök hücrelerden yeni ilaç ve toksinlerin araştırılması ve ayrıca hücre tedavisi konularında da yararlanılmaya başlanmıştır (He vd., 2003). Moleküler biyoloji ve embriyolojideki gelişmeler ile insan genom projesinin sonuçları yardımcı üreme tekniklerinde çok önemli gelişmeleri sağlayacak yöntemlerin bulunmasına yol açmıştır. Kök hücrelerden prenatal genetik tanı (PGT) amacıyla da yararlanılmaktadır (Tilesi vd., 2000). PGT, genetik açıdan sağlıklı bebek sahibi olmama ihtimali yüksek çiftler için veya genetik kusurlar nedeniyle çocuk sahibi olamayan çiftler için son yıllarda ortaya çıkan bir yöntemdir. Blastosist evresindeki blastomerlerden bir tanesinin elde edilmesiyle totipotent bir embriyonik kök hücrenin kromozomal analizi yapılmaktadır.

28 13 Prenatal genetik tanı (PGT) ile Cinsiyete bağlı hastalıklarda cinsiyet seçimi, Mikrodelesyon hastalıkları ( DiGeorge, Prader-Willi / Angelman, Smith-Magenis- Miller Dieker, Williams-Beurren, Wolf-Hirschhorn, Cri Du Chat, Kallmann s sendromu, Steroid Sulfataz Gen Delesyonu ( X-linked ichtiyosis), Talasemi, Orak Hücreli Anemi, Kistik Fibroz, Hemofili-A, Hemofili-B, Spinal Kas Atrofisi, Duchenne Kas Distrofisi, Fenilketonüri, Frajil-X, Familyal Meme Kanseri, Familyal Adenomatöz Poliposis Coli, Familyal non-poliposis kolon kanseri, Medüller Tiroid Kanseri, Nörofibromatöz tip I. gibi pek çok tek gen hastalığına sahip olabilecek bebeklerin tanısı erken evrede konulabilmektedir (Ben-Yosef vd., 2007). Pek çok hastalığın tedavisinde kullanılması amaçlanan ve kök hücrelerin uygun sayı ve kalitede elde edilerek tedavi yaklaşımlarında kullanılabilmesi önemlidir. Doku mühendisliği çalışmalarında iskeleler ile yeni doku ve organ oluşturulması da son dönemde hız alan çalışmalardır. Bu amaçla çeşitli kök hücre kaynakları araştırılmaktadır. Elde edilen veriler ile kök hücrelerin elde edildiği kaynaklara göre in vitro olarak optimize edilmesi ise en çok

29 14 yapılan çalışmalar arasındadır. 2.6 Kök Hücre Kaynakları Son yıllarda kök hücre çalışmalarının artış göstermesi ve çok sayıda, kaliteli nitelikte kök hücre ihtiyacının artması ile kök hücre kaynaklarının araştırılması oldukça önem kazanmıştır. İnsan oluşumundaki ilk hücreler, oluşmakta olan organizmadaki kök hücrelerdir. Kök hücreler ne kadar gençse o kadar fazla gelişebilir ve farklı hücrelere dönüşebilirler (Barry ve Murphy, 2004). Yetişkin insan vücudunda hemen hemen her doku ve organ içerisinde farklılaşmamış kök hücrelerin bulunduğu da bilinmektedir. Cilt, kas, kemik, sinir, yağ ve kan dokusu gibi çoğu doku ve organlarda yer alan kök hücreler, hastalıklar ve yaralanmalar nedeniyle oluşan hasarları in vivo olarak onarır ve iyileştirirler. Hangi tip dokuya ihtiyaç varsa ona dönüşürler (Brignier ve Gewirtz, 2010). Doku ve organ içerisinde yer alan kök hücreler bulundukları kaynak ve farklılaştıkları germ tabakasına göre sınıflandırılırlar (Madonna ve De Caterina, 2010). Buna göre de kan hücrelerini oluşturan kemik iliği kaynaklı hücrelere hematopoetik kök hücreler (HKH), bağ (stromal, mezenkimal) dokularda bulunan hücrelere kaynaklık eden kök hücrelere ise mezenkimal kök hücreler (MKH) adı verilir Hematopoetik kök hücreler (HKH) Hematopoetik kök hücreler, sınırsız bölünebilme ve özelleşmiş kan hücrelerine (eritrositler, trombositler ve lökositler) farklılaşma kabiliyetine sahip, farklılaşmamış hücrelerdir. Günümüzde kemik iliği, kordon kanı, periferik kan ve plasentadan elde edilen hematopoetik kök hücreler, hematolojik patolojilerin tedavisi için kullanılmaktadır (Masson vd., 2004). Yüksek kan hücresi kayıplarında kan hücre naklinin yüksek rejeneratif potansiyel göstermesi ve sürekli yenileme ile lenfositlerin yeniden oluşması, hematopoetik kök hücrelerin rejeneratif potansiyelinin güçlü göstergesidir (Şekil 2.7).

30 15 Şekil 2.7 Hematopoetik kök hücrelerin farklılaşma potansiyelini gösteren şema 1867 de Alman patolog Julius Cohnheim tarafında kemik iliğinin enflamatuar yara iyileşme sürecinde, içinde bulunan fibroblastlar da dahil olmak üzere, sirkülasyonda olan hücreleri ürettiği belirtilmiştir (Plytycz ve Seljelid, 2003). Bununla birlikte, kan hücresi türlerinin kolonijenitesi ve kök hücre teorisi kavramı ancak 1961 de kanıtlanmıştır te E. D. Thomas tarafından tanımlanan kemik iliğinden elde edilen kök hücreler, klasik kök hücre kaynağı olarak kabul edilmektedir. Periferal kanın hematopoetik bir kök hücre kaynağı olarak kanıtlanması ise 1981 de olmuştur ve bunu takiben 1988 de kordon kanı yeni bir hematopoetik kök hücre kaynağı olarak tanıtılmıştır (Körbling ve Anderlini, 2001). Kemik iliği hücrelerinin kimliği konusunda oldukça bilgi birikimi olmasına karşın, bunların tam kimliği halen tartışmalıdır ve bu hücreyi doğru bir şekilde tanımlamak için tek bir belirteç bulunmamaktadır. Bazı laboratuvarlar, belli pozitif belirteçlerin gösterilmesini ve farklılaşma ya da dizi belirteçlerinin yokluğunu gerektiren HKH ler bakımından zengin hücre popülasyonları tanımlamıştır.

31 16 Farklı kaynaklardan izole edilen HKH ler, büyük oranda benzer özelliklere sahiptir ancak; elde edilen hücre miktarları önemli ölçüde değişmektedir. HKH ler, miyeloid ve lenfoid dizileri de içerecek şekilde tüm kan hücresi türlerini meydana getirme kabiliyetindedirler (Şekil 2.8). HKH lerin iskelet kası, kalp kası, karaciğer, endotel hücreler ve nöronlara farklılaştığını bildiren çalışmalar da günümüzde mevcuttur (Uğur, 2007). HKH lerin sürdürülebilir simetrik bölünme kabiliyetleri sayesinde, az sayıda HKH nin, boşaldıktan sonra kemik iliğini doldurabildiği görülmektedir. HKH lerin hızlı ve uzun süreli proliferasyom kabiliyeti, bunları biyoprosesler için uygun bir aday hücre haline getirmektedir. kemik iliği Şekil 2.8 Kemik iliği kaynaklı hematopoetik kök hücrelerin farklılaşma potansiyellerini gösteren diyagram İlk zamanlarda allojenik transplantasyon için kullanılan progenitör hücrelerin tek kaynağı olarak belirtilen kemik iliğinin yanı sıra, 1990 ların başında periferik kanın belirli avantajlar sağlayan mobilize (çoğunlukla granülosit koloni stimule edici faktör ile; G-CSF özellikleri de klinik olarak tanıtılmıştır (Moog, 2006), (Şekil 2.9).

32 17 Şekil 2.9 Otolog periferik kan transplantasyon işlemlerini gösteren şema PK dan daha büyük hacimde hücre alınabilmesi ile toplanan hücreler içindeki progenitör ve yardımcı hücrelerin sayısı artmıştır. Transplantasyon için, aşılamayı ve T-hücresi kimerizmini kolaylaştıran daha hızlı miyeloid ve lenfoid geri kazanımını sağlamaktadır. Ek olarak, mobilize PK toplama ve G-CSF kullanımına ilişkin küçük riskler yanında Kİ bağışı ile ilişkili riskler ve yan etkiler de önemli ölçüde daha fazladır (Bojanic vd., 2009). Bununla birlikte, biyoprosesler için hücrelerin büyük bölümü düşük genişleme kabiliyetleri nedeniyle çıkarılmakta ve bu da periferik kan kök hücrelerini (PK-HKH), kemik iliğinden alınan kök hücrelerden daha az uygun hale getirmektedir ların sonunda, kordon kanı (KK), HKH kaynağı olarak kullanılmaya başlanmıştır ve 2004 yılı itibariyle Avrupa'daki toplam allojenik transplantasyonların yüzde üçü ve Dünya daki allojenik transplantasyonların yüzde yedisinde, kordon kanı kullanıldığı bildirilmektedir (Gluckman, 2009). Ancak, düşük toplama hacmi nedeniyle kordon kanı kullanımının önünde klinik engeller vardır. Bu durum naklin başarısız olması ya da relaps gibi komplikasyonlara neden olmaktadır. Bununla birlikte, KK nın terapötik potansiyeli azımsanmamalıdır. İnsandaki düşük lökosit antijen uyumluluk (HLA) kısıtlamaları, donörlerden alınma ile ilgili düşük risk ve alındığında kullanıma hazır halde olması, KK'nin yeterli miktarda alınabildiği takdirde HKH'ler için umut

33 18 vaat eden bir kaynak olarak karşımıza çıkmasına neden olmaktadır (Goldstein vd., 2007). Sonuç olarak, bu durum, çift KK transplantasyonu ve KK nin bir üçüncü taraftan haploidentik hematopoetik progenitör hücreler ya da mezenkimal stroma hücreleri ile birlikte infüzyonu gibi farklı yaklaşımların test edildiği aktif bir araştırma alanıdır (Friedenstein, 1976). Hematopoetik fonksiyon yani hematopoez (kan yapımı) hematopoetik hücreler ile stromal hücreler arasındaki ilişkiyle yakından ilişkilidir (Labar, 2009) MKH ler de kan yapımının meydana geldiği bölge olan kemik iliği mikroçevresinde yer almaktadır. Bu bölgede yer alan hücreler fibronektin, laminin, kollagen ve proteoglikanlar gibi matriks moleküllerini sentezlerler. Kollagen, laminin, fibronektin ve vitronektini içeren hücre dışı matriks komponentleri (EMK) için çeşitli integrin reseptörleri ifade ederler. Hematopoetik seri hücreleri üzerindeki yüzey molekülleri için çeşitli ligandlar (ICAM-1, ICAM-2, vasküler adezyon molekülleri 1,UCAM-1, CD-72, aktive lökosit hücresel adezyon molekülleri gibi(alcam)) eksprese ederler. Hematopoetik kök hücreler için fiziksel destek sağlarlar. Hematopoetik kök hücre farklılaşması için de gerekli olan faktörleri sentezlemektedirler (Whichard vd., 2010) Mezenkimal (Stromal) kök hücreler (MKH) Mezenkimal kök hücreler (MKH); başlıca kemik iliğinde bulunan kemik, kas, kıkırdak, tendon, yağ ve kemik iliği stromal hücrelerine farklılaşma yeteneğine sahip olan multipotent hücrelerdir. İlk olarak Alman patolog Cohnheim tarafından kemik iliğinde yer alan nonhematopoetik hücrelerin varlığı 1880 li yıllarda ileri sürülmüştür. Daha sonra 1976'da Friedenstein ve arkadaşları, fibroblast kolonisi yapan ünitelerde (coloni forming unitfibroblast, CFU-F), nonhematopoetik kemik iliği progenitörleri olan MKH lerini tanımlamıştır. Friedenstein, fetal dana serumu içeren kemik iliği materyalinin ortama yayılması sonucunda, adezyon yeteneği olan, morfolojik olarak fibroblastlara benzeyen, kemik hücreleri ve yağ hücrelerine farklılaşma yeteneğine sahip hücre kolonilerinin varlığını bildirmiştir (Friedenstein vd., 1976) lerden günümüze kadar birçok araştırmacının dikkatini çeken bu hücreler için pek çok isimlendirme yapılmıştır: mesenchymal stem cell, marrow stromal cell gibi. Hepsi için MKH ortak bir kısaltma olarak kullanılmaktadır. Bu konuda karışıklığa yol açmamak için International Society of Cellular Therapy (ISCT) son zamanlarda yeni bir tanımlama önermektedir: multipotent mesenchymal stromal cells (MKH). Birçok araştırmacının ve laboratuvarın ilgisinin MKH üzerine yönelmesi ve klinik-

34 19 preklinik çalışmalarda ortak bir dil oluşturulması için ISCT mezenkimal stromal hücre için tanımlama kriterleri belirlemiştir. Günümüze kadar kemik iliği stromal hücreleri olarak da adlandırılan MKH ler çoğunlukla kemik iliğinden ve ayrıca subkütanöz yağ dokusu ve fetal karaciğer gibi çeşitli dokulardan izole edilirler. İlk zamanlarda bu hücreler, yağ hücresi (adiposit) ve kemik hücresine (osteosit) farklılaşabilme yeteneğinde olan hücreler olarak nitelendirilmiştir (Friedenstein vd., 1976). Takip eden yıllarda yapılan çalışmalarda MKH lerin her üç germ yaprağından köken alan hücre ve/veya dokulara farklılaşabilen hematopoetik olmayan multipotent kök hücreler oldukları anlaşılmıştır (Pittenger vd., 1999; Jiang vd., 2002). Kemik dokusu, kemik iliğinde yer alan MKH ler ve kültüre edilmiş insan kök hücreleri açıklanmış ve insan ile kemirgenlerin kemik iliğinden elde edilen MKH lerin ayırımına izin veren antijenik belirteçler tanımlanmıştır. Araştırmacılar, MKH lerin sadece kemik hücresi ve yağ hücresine değil aynı zamanda kıkırdak hücrelerine, iskelet kası ve düz kas hücrelerine de farklılaştığını göstermişlerdir. Bunlara ek olarak, hayvanlarda MKH transplantasyonu kıkırdak veya kemik defektlerinin in vivo olarak aşılama ile dokuya spesifik farklılaşma gerçekleştirilmiştir. Uluslararası Hücre Tedavileri Topluluğu (UHTT) MKH leri tanımlamak için 3 özellik bildirmiştir: 1. MKH ler standart kültür ortamında plastik yüzeye tutunabilen hücrelerdir, 2. MKH ler yüzeylerinde CD105 (SH2), CD73 (SH3/4)ve CD90 gibi hematopoetik olmayan hücre yüzey belirteçlerini eksprese etmelerine rağmen, CD45, CD34, CD14 veya CD11b, CD79 veya CD19 ve HLA-DR gibi tipik hematopoetik belirteçleri eksprese etmezler, 3. In vitro koşullarda kemik, yağ ve kıkırdak hücrelerine farklılaşabilirler. Kaynaklarına bakılmaksızın, farklılaşmamış MKH ler, fibroblast benzeri morfolojiye ve kendi kendilerini kopyalama kabiliyetine sahip hücrelerdir. Dolayısıyla potansiyel olarak, doku ve organ rejenerasyonu için yeterli sayılara ulaşmak üzere çoğaltılabilirler (Satija vd., 2007). MKH ler kültür ortamında çoğalırken ortama bazı büyüme ve transkripsiyon faktörleri eklenmezse çoğalmaya devam etmekte ama farklılaşma görülmemektedir. Farklılaşma sırasında aktive olacak transkripsiyon programlarını belirleyen ve etkileyen içsel ve dışsal faktörler önemlidir (Mitalipov ve Wolf, 2009 ). In vivo ortamda, bu faktörler (büyüme faktörleri, sitokinler, matriks proteinleri, vb) parakrin veya otokrin olarak salgılanır. In vitro

35 20 koşullarda ise farklılaşma potansiyelinin ortaya çıkarılabilmesi için kültür ortamına bu faktörler eklenmelidir (Yang vd., 2007). Bu da MKH lerin plastisitesi için doku mikroçevresinin ve farklı kültür ortamlarının önemini vurgulamaktadır. Özetle MKH ler kolay elde edilebilen kültür ortamında birçok pasaj boyunca rahatlıkla çoğaltılabilen, morfolojik olarak fibroblastlara benzeyen ve flasklara yapışma özelliği olan, bazı yüzey belirteçleri ile immünfenotiplendirilebilen, uygun koşullar altında birçok dokuya (osteojenik, adipojenik, kondrojenik, vb) farklılaşma özelliği olan hücrelerdir. MKH lerin hangi dokulardan izole edilebileceği, en uygun dokunun seçimi, kültür ortamının koşulları, en uygun immünfenotiplendirme belirteçlerinin belirlenmesi, farklılaşma potansiyelinin ortaya çıkarılabilmesi için kültüre eklenecek büyüme ve transkripsiyon faktörlerinin seçimi, miktarı, in vitro hangi dokulara farklılaşabildiği araştırma konusu olmaya devam etmektedir. Bu konuda diğer bir önemli nokta da MKH lerin hücresel tedavideki yeridir. Mezenkimal kök hücreler (MKH) elde edildikleri kök hücre kaynağının özelliklerine bağlı olarak doğrudan plakalama ya da hücre yüzey belirteçlerinin kullanımı ile elde edilir (Zhang ve Chan, 2010). Her iki yöntemde de belirli sınırlamalar bulunmaktadır. Özgün olarak kültür plastiğine yapışmasıyla elde edilen saflaştırılmış popülasyonun homojenliği, hücrelerin yalnızca % 10-20'sinin multipontent farklılaşma kabiliyetine sahip olması nedeniyle yüksek değildir. MKH lerin kültürü, doku kültüründe telomeraz enzim aktivitesi faaliyetinin kaybı ile telomerin kısalmasının bir sonucu olarak izole hücrelerin topluluğun 40 kez iki katına çıkması (yaşlı donörler için 25 kez) ile sınırlı olduğunu göstermektedir. Ayrıca, klinik uygulamalar için önemli şekilde, kültürdeki hücreler, bu uzatılmış genişleme yöntemi kullanıldığında 250 kez iki katına çıktıktan sonra genetik instabilite göstermişlerdir. Bu da, uzatılmış ex vivo kültür süresi olmaksızın yeterli sayıda hücrenin geliştirilebilmesi için verimli büyütme yöntemleri ve etkin farklılaştırma protokollerinin gerekliliğini göstermiştir (Dahl vd., 2008). Elde edilen MKH ler ışık veya faz kontrast mikroskobu ile morfolojik olarak incelendiğinde kültür ortamında füziform şekilli, iğ şeklinde, bipolar yapıda ve fibroblast benzeri hücre toplulukları olarak görülürler. Morfolojik özellikleri fibroblastlara benzemekle birlikte en önemli farkları nükleus yerleşiminin fibroblastlarda asimetrik olmasına karşın bu hücrelerde dışsal yani sitoplazmaya yakın olmasıdır. MKH lerin fenotipik özelliklerine dayalı çalışmalar genellikle primer kültürde yer alan hücrelerden çok kültürde çoğaltılmış hücrelerde yapılmıştır. Primer MKH lerin fenopik

36 21 özellikleri hakkında sınırlı sayıda çalışma vardır. Kültürde çoğaltılmış MKH lerin antijenik özelliklerine bakıldığında kendilerine has bir belirteç taşımadıkları; endotel, epitel ve kas hücrelerine benzer fenotipik özelliklere sahip oldukları görülmektedir. Kültürde çoğaltılmış MKH ler CD45, CD34, CD14, CD11 gibi hematopoetik belirteçleri ve CD80, CD86, CD40 gibi ko-stimülator molekülleri eksprese etmezler. MKH için tipik olarak kabul edilen belirteçler CD105 (SH2) ve CD73 (SH3/4)'dür. Fibroblast yüzey belirteci olan STRO-1 MKH ler tarafından da eksprese edilmektedir. Ayrıca MKH ler CD71 (transferin reseptör) ve CD90 (Thy-1) taşırlar. Farklı dokulardan elde edilen hücreler genel olarak benzer fenotipik özelliklere sahip olmakla birlikte bazı farklılıklar da göze çarpmaktadır. Örneğin, yağ dokusundan elde edilen MKH ler yüzeylerinde CD49d taşırken, CD106 taşımamaktadır; kemik iliği kaynaklı MKH lerde ise aksine CD49d negatif, CD106 pozitifir. Erişkin MKH lerin, hücre yüzeyinde HLA sınıf I antijenlerini zayıf eksprese ettikleri, HLA sınıf II antijenlerini taşımadıkları, ancak hücre yüzeyinde taşınmayan HLA sınıf II antijenlerin stoplazmada bulunduğu saptanmıştır (Trivedi ve Hematti, 2008). MKH lerin ko-stimülator molekülleri ve HLA sınıf II antijenleri eksprese etmemeleri gibi özellikleri graft versus host hastalığı tedavisinde kullanılmalarına olanak sağlamıştır (Dazzi ve Marelli-Berg, 2008). Fetal karaciğer kaynaklı MKH lerin ise HLA sınıf II antijenleri hem hücre yüzeyinde hem de intrastoplazmik olarak içermedikleri gösterilmiştir (Götherström vd., 2004). Bu bulgular MKH antijen ekspresyonunun fetal yaşamdan erişkin yaşama geçişte değiştiğini düşündürmektedir. MKH ler ve HKH ler bir çok adezyon molekülünü ortak olarak bulundururlar. Bunların başlıcaları fibronektin, laminin ve kolajene bağlanmadan sorumlu olan integrin ailesi ve L- Selektindir (Brooke vd., 2008). MKH lerin granülosit-makrofaj koloni stimülatör faktörü, granülosit koloni stimülatör faktör, kök hücre faktörü ve interlökin-6 (GM-CSF, G-CSF, SCF ve IL-6) salgılama yeteneklerinin, allojenik ve otolog hematopoetik kök hücre nakillerinde hematopoetik kök hücrelerin yerleşim, çoğalma ve farklılaşmalarına katkı sağlayarak nötrofil ve trombosit engrafmanını hızlandırıcı etki gösterdiği düşünülmektedir (Kim vd., 2005; Kögler vd., 2005; D Agostino vd., 2010). Yetişkin kemik iliğinden elde edilen MKH ler farklı dizilere farklılaşabilirler (adiposit, miyofibroblast, osteoblast, endoteliyal hücre, kondrosit, sinir hücresi, kalp kası hücresi, karaciğer hücresi, iskelet kası hücresi, böbrek tübüler hücresi, tenosit). Farklılaşmalarda rol oynayan genlerin bir kısmı yapılan çalışmalarla belirlenmiştir (Sammons vd., 2004), (Şekil 2.10).

37 22 Şekil 2.10 MKH lerin faklılaşmalarını gösteren şema Bu farklılaşmış hücreler CD29, CD44, CD105 ve CD166 için pozitiftir ve yaklaşık iki günde bir iki katına çıkma ömrü vardır, altı kata kadar kültürde gelişebilir ve biyolojik işlevleri yaşlanma ile azalmaz. MKH lerin basit bir kemik iliği aspiratından 10 hafta içinde yaklaşık 50 kez ikiye katlanarak çoğaltılması mümkündür (Baddoo vd., 2003). Herhangi bir telomer kısalması ya da karyotipik bir anormallik olmaksızın, belirli koşullar altında yüzden fazla kez çoğaltılabilen MKH lerin CD133 pozitif hücreler içeren bir alt popülasyonunun, yalnızca mezenkimal hücre türlerine değil (osteoblastlar, kondrositler, adipositler, miyositler); aynı zamanda endotel ve nöroektodermal fenotip ve işleve sahip hücrelere de farklılaşma kabiliyeti kanıtlanmıştır. Bunlar, kalıtsal ya da dejeneratif hastalıkların tedavisi ve kıkırdak, kemik ve miyokardiyum gibi dokuların onarımı için gelecek vaat eden, daha fazla sayıda kaynak sunmaktadır (Caplan, 2007; Pistoria ve Raffaghello, 2010). İnsan MKH lerinin, hücresel tedaviler için kabul edilmesinin nedenleri; hastadan kolayca izole edilmeleri, in vitro koşullarda hızla çoğaltılabilmeleri, genetik mühendisliğine bağlı olarak ilgili genler ile tedavi yapılmasına uygun olması, nontümörojenik olarak kültür ortamında stres koşulları olmaksızın

38 23 geniş yayılma göstermesi ve çeşitli mekanizmalarla doku hasarlarının onarılabilmesidir. Bu onarım mekanizmaları şunlardır; (a) dokuya özgü fenotipe farklılaşma, (b) hasarlı hücrelerin onarımı ve hücrelerin çoğalmasını sağlayan kemokinlerin salgılanmasının sağlanması ve (c) olasılıkla mitokondri veya mitokondri DNA larının transfer edilmesi. Özelleşmemiş bu hücreler elde edildikleri kaynaklara ve sahip oldukları farklılaşma yeteneklerine göre sınıflandırılmıştır. Özellikle, erken evrede elde edilen MKH lerin çoğalma ve farklılaşma özellikleri yetişkin evrede elde edilen kök hücrelerden daha yüksektir. Bir başka deyişle, kök hücrelerin bölünme, çoğalma, farklılaşma ve elde edilen kök hücre miktarı, canlının yaşı ile ters orantılı olarak değişmektedir. Örneğin kemik iliği, her 10 4 çekirdekli hücreye karşın 1 MKH içerir (Bu oran kordon kanında 1/10 8 'e kadar düşebilmektedir) (Shetty vd., 2010; Raoufi vd., 2010). Çocuklarda 29 CFU/1 milyon tek çekirdekli hücre oranı bulunurken; ileri yaşlarda bu oran 3.2 CFU/1 milyon tek çekirdekli hücre oranına kadar düşmektedir (Zhou vd., 2008). Yapılan araştırmalar, fetal MKH'lerin erişkin kök hücrelerden sadece sayısal açıdan değil, doku gelişiminde, hücre bölünmesinde ve immünolojik antijen sunumunda rol oynayan genler açısından da önemli farklılıklar taşıdığını göstermektedir (Jo vd., 2008; Gucciardo vd., 2009). MKH lerin önemli bir özelliği de immune privilege hücreler olmaları yani; vücuda alındığında immün yanıt oluşturmamalarıdır. Bu nedenle in vivo veya in vitro koşullarda özellikle klinik olarak immün baskılayıcılara gerek kalmadan kullanılabilecek olmaları önemlidir. Ancak MKH lerin laboratuvarda farklılaştırılması ve üretilmesi ile bu farklılıklar kaldırılabilmektedir. 2.7 Embriyonik Kaynaklı Olmayan (Yetişkin) Kök Hücre Kaynakları Embriyonik evre sonrasında fetüsün yetişkin dokuları oluşturmaya başlamasından itibaren canlı organizma yetişkin olarak kabul edilebilir. Bu dönemden itibaren elde edilen tüm kök hücreler de embriyonik kaynaklı olmayan kök hücreler olarak sınıflandırılmaktadır. Yetişkin kaynaklı kök hücre terimi yanıltıcıdır çünkü; yeni doğanlarda ve çocuklarda da yetişkin kök hücreler bulunmaktadır. Bu terim yerine postnatal kök hücreler de kullanılabilir. Bu hücreler multipotent hücrelerdir ve canlının dokusunda yer alan dokunun esas hücre serisine farklılaşırlar. Son yıllarda yapılan araştırmalara göre ise, hücre plastisitesi olarak adlandırılan hücre gelişimi ile kök hücrelerin farklı dokularda yer alan hücrelere de dönüşebileceği gösterilmiştir (Shehab ve Saber, 2009). Hatta farklılaşmış bir hücre çeşitli onkogenler ile

39 24 (Oct3/4, Nanog, Sox 2, CMyc gibi) kök hücreye indüklenebilmektedir. Bu tip hücrelere indüklenmiş kök hücre (ips) adı verilir (Şekil 2.11). Şekil 2.1 Embriyonik kök hücrenin somatik hücreye farklılaşması ve somatik hücrenin yeniden programlanarak kök hücreye indüklenmesini gösteren şema Yetişkin kaynaklı bir kök hücre, bir doku veya organdaki farklılaşmış hücreler arasında bulunan farklılaşmamış hücredir. Bunlar, hücre içinde bulunduğu doku veya organın özelleşmiş hücre tiplerine farklılaşabilir. Somatik kök hücresi de denilen yetişkin kök hücrelerinin temel görevleri, bulundukları dokuyu tamir etmek ve dokunun devamlılığını sağlamaktır, ayrıca bu hücreler öncü hücrelere ve daha sonra da özelleşmiş hücrelere faklılaşırlar (Hodgkinson vd., 2009). Ayrıca, yetişkin kök hücreler organizmanın yaşamı boyunca kendini yenileyebilme özelliğini korur. Diğer yandan yetişkin kök hücrelerin farklı germ tabakalarında yer alan hücreler in vitro şartlarda farklılaştırılabileceği de gösterilmiştir. Örneğin, kan hücrelerine kaynaklık eden HKH lerin farklı embriyonik kaynaklı (ektoderm ve endoderm) hücrelere kaynaklık edebileceği ortaya çıkmıştır. Bilinen en yaygın yetişkin kök hücre kaynağının kemik iliği olmasına rağmen, bu hücreler özellikle yağ dokusu olmak üzere karaciğer, diş pulpası, kordon kanı ve plasenta, periferik kan gibi birçok doku ve organda bulunabilirler (Brignier ve Gewirtz, 2010). Yağ dokusundan elde edilen kök hücrelerin kemik iliğinden elde edilen kök hücreler kadar dönüşüm yeteneğine sahip olduğu bildirilmektedir (Madonna ve De Caterina, 2010). Yağ dokusundan kemik iliğine göre daha fazla sayıda hücre elde edilebilir. Bu hücrelerin,

40 25 bulundukları doku ve organlarda küçük hasarların giderilmesinde rol oynadığı düşünülmektedir. Son yıllara kadar bu hücrelerin sadece belirli bir grup hücreye faklılaşabileceği düşünülüyordu. Ancak günümüzde bu hücrelerin başka değişik hücre tiplerine de dönüşebileceği bilinmektedir. Örneğin; kemik iliği hücreleri karaciğer, sinir, kas ve böbrek hücrelerine dönüşebilmektedir. Hatta günümüzde bir yetişkin kök hücrenin değişime uğrayarak pluripotent özellik taşıyan bir kök hücreye dönüşebileceği gösterilmiştir. Bu özellik karşılıklı farklılaşma (transdiferensiyasyon) olarak adlandırılır (Reinecke vd., 2008). Bu hücrelerin farklı doku tiplerine dönüşebilmelerini ve vücut dışında daha uzun süre yaşabilmelerini sağlamak amacıyla günümüzde yoğun bir şekilde çalışmalar devam etmektedir. Burun boşluğunu örten dokudan elde edilen kök hücrelerin, embriyonik kök hücreler gibi yüksek bir farklılaşma yetenekleri olduğu gösterilmiştir (Kim vd., 2009). Bu hücreler, embriyonik kök hücrelere göre daha kolay elde edilebilmeleri açısından önemli bir kök hücre kaynağı olarak değerlendirilmektedir. Yetişkin kök hücrelerin kullanımı etik açıdan sorun oluşturmamaktadır. Bu hücreler kişinin bağışıklık sistemine uyum gösterirler. Araştırmacılar henüz erişkin kök hücrelerin embriyonik kök hücrelerinde olduğu gibi her çeşit doku tipine kaynaklık edebileceği konusunda görüş birliğine varmış değildir. Çünkü yetişkin kök hücrelerin tüm hücre tiplerine dönüşemediklerinden dolayı günümüzde kullanımlarının sınırlı olduğu düşünülmektedir Kordon kanı ve plasenta kaynaklı kök hücreler Göbek kordonu kesilip bebek ayrıldıktan sonra ilk yarım saat içerisinde anne rahminden düşen plasenta ve göbek kordon kanı, yetişkin kök hücreler için önemli bir kaynaktır. Bu hücreler yetişkin vücudundaki hücrelere göre daha genç bir dönemde elde edildiklerinden diğer yetişkin hücreler ile kıyaslandığında kullanım açısından bazı avantajlara sahiptirler (Tse vd., 2008). Alıcıya daha kolay uyum sağlarlar Genç hücrelerdir Yaşayabilme yetenekleri daha yüksektir Daha fazla sayıda elde edilebilirler Doğum sırasında fetüsü ya da anneyi etkilemeden alınır

41 26 Göbek kordonundaki kandan elde edilen kök hücre, herhangi bir kimyasalla henüz karşılaşmamıştır Verici için risk olmaması ve çok düşük enfeksiyöz hastalık taşınma riski vardır Olası bir hastalık durumunda tedavinin kemik iliği nakline göre daha kolay ve ucuzdur Yetişkin kemik iliğinden kök hücre elde etmek, steril cerrahi işlemler gerektirir. Bu işlemlerin belli maddi külfetleri vardır ve bir hastalık durumunda veya ihtiyaç olmadan istek üzerine yapılan işlemler değildir. Ayrıca, dış etkenler nedeniyle ister istemez zarar görmektedirler. Kordon kanı kök hücrelerinin alımında karşılaşılan tek dezavantaj bir vericiden toplanabilen kan miktarının sınırlı olması ve toplama işleminin sadece bir kez yapılabilmesidir. Göbek kordon kanı, kök hücre kaynağı olarak dünyada, özellikle çocuklarda 1988 yılından beri çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır (Raoufi, 2010). Tedavi işlemleri için önemli bir kaynak olan kordon kanını uzun dönemlerde saklamak ihtiyacı doğmuştur. Bu nedenle özel eriyiklerin içerisinde dondurularak sıvı nitrojen içerisinde saklama prensibine dayalı olan kordon kanı bankacılığı geliştirilmiştir (Lubin ve Shearer, 2007). Kordon kanı saklamaktaki amaç; bebeğin ileride, kök hücre tedavisi gerektirebilecek organ/doku yaralanması veya yaşlılığı gibi bir durumla karşılaşıldığında, doku uyumu olan verici aramaya gerek kalmadan, kişinin kendisine ait sağlıklı bebeklik çağı kök hücreleriyle tedavi yapılabilmesidir. Bankada bulundurulan bu kan bebeğin kardeşlerinde ya da yakın akrabalarında çıkabilecek hastalıkların tedavisinde kullanılabilir. Günümüzde kordon kanı ile tedavi edilen hastalıklar: Kanser hastalıkları Kemik iliği hastalıkları Kalıtsal kan hastalıklar Bağışıklık yetersizlikleri Doğuştan gelen metabolik düzensizliklerdir. Diğer taraftan zarar gören organların kök hücre yardımıyla eski haline dönüştürülmesi yani organ yenilenmesi için de pek çok çalışma yapılmaktadır. Ancak kök hücre kullanımının denetim altına alınması ve kötü uygulamalara engel olmak amacıyla kök hücre kullanımında sınırlandırmalar bulunmaktadır.

42 Kemik iliği (Kİ) kaynaklı kök hücreler İnsanlarda hematopoezisin yani kan yapımının gerçekleştiği esas bölge kemik iliğidir. Hematopoezisin gerçekleşebilmesi için hematopoetik kök hücre ve kök hücre kaynaklı hücrelerin kemik iliği stromal bölümü ile iyi bir etkileşim içinde olması gereklidir. Hücreler ve ekstrasellüler matriks ağından oluşan kemik iliği stroması fizyolojik olarak hematopoetik hücreleri desteklemekte ve farklılaşmalarını etkilemektedir. Stromal fibroblastik sistem osteoblastlar, preosteoblastlar, fibroblastlar, retiküler hücreler ve adipositlerden oluşmaktadır (Aerts ve Wagemarker, 2004). Kemik iliği stromal hücrelerinin farklılaşma kapasitesi hücrelerin in situ yapısal ilişkisine bağlı değildir, in vitro olarak da bu farklılaşma kapasitesi gösterilebilmiştir. Az sayıdaki hücreler bile yüksek bir çoğalma ve farklılaşma kapasitesine sahiptir. Yapılan hayvan çalışmalarında kemik iliğinin bir parçasının ektopik olarak nakil edilmesi, stromal hücrelerin yaşayabilmekte, çoğalabilmekte, kemik ve kemik iliği hücrelerine farklılaşabilmekte, olduğunu ve hematopoezis için uygun bir mikroçevre sağladığını göstermiştir (Owen, 1988). Friedenstein tarafından 1970 li yıllarda kemik iliği kaynaklı klonal orijinli, plastisitesi olan yapışkan kök hücrelerin varlığının gösterilmesi ile 1867 de Alman patolog Julius Cohnheim tarafından ilk kez tanımlanmış olan yeniden yapılanma (remodelling) hipotezi tekrar gündeme gelmiştir. Bu hipoteze göre yerel dokuda veya dolaşımda, çoğalma ve farklılaşma kapasitesine sahip hücreler bulunmaktadır. Memelilerdeki doku tamiri de bu hücrelerin varlığına bağlıdır. Daha önceki çalışmalarda, bu hücreler fibroblast colony forming units (F-CFU) olarak adlandırılmıştır. Bu klojenik öncüller farklı birçok stromal seriye farklılaşabilmektedir. Friedenstein (1987) tavşan kemik iliği hücrelerini kullanarak CFU-F (colony forming unitfibroblasts) in kendini yenileme kapasitesinin yüksek olduğunu göstermiştir (Friedenstein vd., 1987; Owen ve Friedenstein, 1988). Daha sonra Owen, Piersma ve birçok araştırmacı yaptıkları çalışmalarla kültür ortamında klonal tek bir hücreden oluşan, kemik iliği kaynaklı, plastisitesi yüksek olan bu yapışkan hücreleri göstermişlerdir ve bu hücreler MKH (MKH) olarak tanımlanmaya başlanmıştır (Bianco vd., 2008). Temel olarak bağ dokusu içeren tüm dokularda MKH bulunabilir. Fakat MKH kaynağı olarak en iyi tanımlanmış doku kemik iliğidir. Çalışmaların çoğunda; elde edilebilme kolaylığı, ayrıca hematopoetik kök hücreler ile yakın ilişkisi nedeniyle hematopoezde önemli rolleri olması da göz önünde bulundurularak, kemik iliği kaynaklı MKH`ler kullanılmaktadır.

43 28 Bununla birlikte kemik iliği dahil bütün bu dokularda çok düşük sayıda bulunmaktadır. Kemik iliğinde bir milyon hücre başına 6-10 MKH olduğu hesaplanmaktadır. Bu hücrelerle laboratuvar ortamında araştırmalar yapmak veya klinik kullanım için hücrelerin in vitro kültür ortamında çoğaltılmaları gerekmektedir (Mosna vd., 2010). Birçok dokudan MKH elde edilebildiğinin gösterilmesi üzerine MKH terminolojisine MKH nin elde edildiği doku tipi de eklenebilmektedir: kemik iliği kaynaklı-mkh, adipoz doku kaynaklı-mkh, kordon kanı kaynaklı-mkh, vb. (Rebelatto vd., 2008). Friedenstein in ilk çalışmalarından itibaren MKHyi doğru ve tam olarak karakterize edebilecek morfolojik ve fenotipik özellikleri çalışma konusu olmuştur. Günümüzde morfolojik olarak MKH nin en önemli özelliği fibroblastlara benzer şekilde iğsi, uzantılı yapısı ve hücre kültürü ortamında flasklara yapışma özelliğidir. Bu hücrelerin immünfenotiplendirme yapılarak diğer hücrelerden ve özellikle hematopoetik kök hücreden ayırt edici belirteçlerin tanımlanması da önemlidir. İmmünoloji ve hematolojide sıklıkla kullanılan yüzey belirteçleri hücre popülasyonunun hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. MKHyi (MKH) tanımlamak için kullanılan pozitif belirteçler CD105 (endoglin, MAb SH2), CD73 (ekto 5 nükleotidaz, MAb SH3 ve SH4) ve CD90 (Thy-1) dır. Hematopoetik belirteçler olan CD45 (pan-lökosit belirteçi), CD34 (hematopoetik kök hücre belirteci), CD14 ve CD11b (monosit ve makrofaj belirteci), CD79α ve CD19 (B hücre belirteçi) açısından negatif olmaları gerekir. HLA-DR molekülü de MKH uyarılmadıkça hücre yüzeyinde eksprese edilmez. Bu yüzey belirteçlerinden laboratuvarlar güvenilir olarak çalışabildiklerini seçip, kültür ortamında çoğalttıkları hücrelerin MKH olduğunu doğrulamak için kullanmaktadır. Bu moleküller adezyon ve stromal özellikleri tanımlamaktadır. Sonuç olarak MKH lerin kendi köken aldığı bağ dokusu hücrelerine ve diğer doku hücrelerine farklılaşma özelliklerinin olması, hasarlı hücre ile füzyon yeteneği olması, solubl faktörler (büyüme faktörleri, sitokin, kemokinler gibi) salgılayarak hasarlı hücre/doku tamirine katkı sağlaması, migrasyon özellikleri sayesinde hasarlı dokuya ulaşabilmeleri, çoğunlukla immünsupresif/non-immünojenik özellikte olmaları, gen transferinin kolay olması ve dayanıklı olmaları nedeniyle gen tedavisi için uygun olmaları, ayrıca enzimler (ör. lizozomal enzim) salgılayarak kalıtsal hastalıklardaki enzim defektlerinin yerine koyulabilme potansiyeli olması önemli avantajlarıdır (Mok vd., 2008).

44 Periferik kan kaynaklı kök hücreler Periferik kan kök hücreleri donörden aferez (hücre ayrıştırma) yöntemi ile elde edilirler de yayınlanan periferik kan kök hücreleri kullanımıyla ilgili ilk detaylı raporun ardından bu kök hücrelerin klinik kullanımı hızla artmıştır. Periferik kan kök hücrelerinin kemik iliğine nazaran daha hızlı elde edilmesi ile kök hücre kaynağı olarak geniş oranda kullanılmaya başlanmıştır (Russel ve Byrne, 2001). Periferik kan kök hücreleri fenotipik ve immünolojik olarak kemik iliği kök hücrelerine benzemezler. Kemik iliği kök hücrelerinden farklı olarak periferik kan kök hücrelerinin içerdiği CD34+ hücre sayısı dört katından fazla olabilmektedir. Periferik kan kök hücreleri CD34+/CD38-, Thy-1 dir ve miyeloid veya lenfoid serilere özgü belirteçleri ifade etmezler yani Lin negatiftirler. Hücre döngü fazlarına bakıldığında ise hareketli periferik kan kök hücrelerinin sentez fazında daha az hücrenin bulunduğu görülür yani hücreler daha az aktiftir. Bunun yanında daha çok seriye özgü farklılaşma antijeni taşır ve metabolik olarak daha az aktiftirler (Pelus, 2008). In vitro özelliklerine bakılırsa periferik kan kök hücreleri kültür ortamında daha uzun yaşayabilir ve kemik iliği kök hücrelerine nazaran daha yüksek kolonijenite gösterirler. Diğer yandan aferez yöntemi ile elde edilen bu hücreler, ayrışma sonrası uygun şekilde elde edilerek nakil tedavilerinde özellikle otolog kullanımı sağladığı, daha az girişimsel teknikleri içerdiği ve ekonomik olduğu için tedavilerde tercih edilmektedir. Periferik kan kök hücrelerinin kemik iliğine göre avantajları şunlardır: Kök hücrelerin toplanması hastaneye yatmayı ya da genel anesteziye maruz kalmayı gerektirmez. Büyüme faktörleri ile hareketlendirilmiş periferik kan kök hücresi kemik iliğine nazaran daha hızlı gelişir. Kemik iliği mililitrede en yüksek CD34+ olan kök hücre kaynağıdır ancak kemoterapi ve büyüme faktörleri ile mobilizasyondan sonra periferik kandan daha yüksek sayıda CD34+ hücre elde edilir. Periferik kan kemik iliğinden daha düşük malign (kötü huylu tümör) hücre içerme olasılığına sahiptir. Periferik kan kemik iliğinden daha düşük malign (kötü huylu tümör) hücre içerme olasılığına sahiptir

45 Fetüs kaynaklı kök hücreler Hamilelik sırasında meydana gelen düşük veya ebeveynlerin izniyle sonlanmış gebeliklerin sonucunda fetüslerden de kök hücreler elde edilebilmektedir. Nöral kök hücreleri, HKH ler ve pankreas öncül hücreleri olmak üzere fetüslerden elde edilen kök hücreler oldukça sınırlıdır yılında Gearhart ve ark.'nın çalışmaları sonucunda, 5 9 haftalık fetüsün gonadal kıvrım ve mezenter bölgesindeki primordial germ hücrelerinin kültürü ile embriyonik germ hücreleri elde edilebilmiştir. Sekiz haftalık gelişimin ardından embriyo fetüs olarak tabir edilir. Bu süreçten sonra insan benzeri (yetişkin tipi) hücreler oluşmaya başlar. Fetüsteki kök hücreler doğum öncesi oluşan tüm dokuların ilk gelişimlerini sağlamaktan sorumludur (Shehab ve Saber, 2009). Fetüsten elde edilen kök hücrelerin araştırma veya tedavide kullanımı, uygun doku gruplarına ait fetüs kaynaklarının oluşturulması gibi etik açıdan ciddi sorunlar doğurabilir. Ancak, kendiliğinden düşük yapmış kişilerde bu hücreler bağışlanarak araştırma ve tedavi amacıyla kullanılabilir. Gerekli fetüs kaynağının az olması nedeniyle fetüs kaynaklı germ hücreleri araştırmaları eski hızını kaybetmiştir. Günümüzde çeşitli kalıtsal hastalıklar fetal karaciğer kaynaklı kök hücre nakilleri ile tedavi edilmektedir Fetal karaciğer kaynaklı kök hücreler Fetüs karaciğeri, hamileliğin 2. ve 7. ayları arasında fizyolojik olarak hematopoetik dokuların bir parçasıdır. Fetal karaciğer hücreleri hem hematopoetik hem de lenfopoietik sistemleri başarıyla yeniden oluşturabilir (Özmen vd., 2006). Bu nedenle içerdiği kök hücreler hematopoetik olarak oldukça yüksek kapasitede olabilirler. Yetişkin insan karaciğerinden izole edilen mezenkimal benzeri hücre popülasyonunun da yüksek seviye proliferasyon göstererek MKH ler gibi geniş bir farklılaşma potansiyeline sahip olduğu gösterilmiştir. Bu hücrelerin MKH lerin immünolojik özelliklerini nasıl taşıdıkları henüz belirlenememiştir (Lysy vd., 2008). Lagasse ve arkadaşları yetişkin fare Kİ nden alınan yüksek derecede saflaştırılmış kök hücrelerin, karaciğerdeki işlevsel hepatositleri üretebildiğini göstermiştir (Sharma vd., 2005). Hematopoiesiste, yani kan oluşumunda, olduğu gibi hepatositlerin gelişimi sırasında da mikroortamda gerçekleşen pek çok biyolojik aktivite mevcuttur. Hücre büyümesinde ve farklılaşmasında rol oynayan en önemli hücre dışı sinyaller; Nodal (aktivin), fibroblast büyüme faktörleri (FGF), BMP, hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve onkostatin M (OSM) dir.

46 31 Hücreler arasında ise, transkripsiyon faktörleri hepatosit nükleer faktör (HNF) 3α,β, HNF4α, HNF1α,β, HNF6, ve CCAAT çoğaltıcı bağlayıcı protein (C/EBP) α,β belli gelişim aşamalarında karaciğere özgü gen ifadesini düzenlerler (Swagell vd., 2007) yılında Wisconsin-Madison Üniversitesi nde James Thomson ın embriyonik kök hücreleri keşfinden beri embriyonik kök hücre teknolojisi, hücre biyolojisi alanında devrim yapmıştır. Embriyonik kök hücreler haricinde organa özgü yetişkin kök hücrelerinin de belirli bir derece kendini yenileme ve plastiklik özelliği vardır. Bu da çeşitli hastalıkların tedavisi konusunda umut vermiştir ve rejeneratif tıp alanında yeni bir çağ açmıştır (Liu ve Chang, 2010) Diş pulpası kaynaklı kök hücreler Diş pulpası kök hücreleri (DP-KH) ilk olarak 2000 yılında Gronthos ve ark. tarafından normal insan dişinde fibröz doku ve kan damarlarının arasında yer alan dentin ve pulpa kompleksine benzer dentin-pulpa benzeri mineralize olmuş tübüller içeren ve odontoblastlar ile birlikte bulunan bir doku içerisinde bulunmuştur. Aynı araştırma grubu daha sonraki çalışmalarında bu hücrelerin yüksek bölünebilme ve multidiferansiyel farklılaşabilme kapasitelerinin olduğunu göstermişlerdir (Gronthos vd., 2002). Diş pulpasından elde edilen hücrelerin dentin üreten odontoblastlara, osteoblastlara, adipositlere, iskelet ya da düz kaslara, endotel hücrelerine, nöral hücrelere ve elastic kıkırdak hücrelere farklılaşabildikleri in vivo ve in vitro olaarak tespit edilmiştir (Karaöz vd., 2009). Laino ve ark (2006) tarafından yapılan bir çalışmada elde edilen hücre popülasyonunda osteoblast, adiposit, miyoblast, endoteliosit ve melanositler ile birlikte öncül nöral hücrelerin de bulunduğu heterojen bir hücre grubu tespit edilmiştir Amniyotik sıvı kök hücreleri Amniyon sıvısı kök hücreleri fetal kök hücrelerdendir. Pluripotent farklılaşma özelliği gösterirler. Yapılan çalışmalarda nöron, kemik, kıkırdak, adiposit ve düz kas hücrelerine farklılaşma kapasitesine sahip oldukları gösterilen amniyon sıvı kök hücrelerinin OCT 4 genini ifade ettikleri tespit edilmiştir (Dobreva vd., 2010; Mauro vd., 2010; Da Sacco vd., 2010; Feng vd., 2009; Siegel vd., 2009; Galende vd., 2009; Gargett, 2007).

47 Epidermal kök hücreleri Kıl folikülleri içeren epidermal dokuda her bir kıl folikülü içerisinde kök hücreler bulunmaktadır. Epidermal dokunun folikül yenilenmesinde, yara iyileşmelerinde ve bunlara bağlı olarak epitel dokunun yenilenmesinde önemli rolleri vardır. Elde edilmesi kolay olan epidermal kök hücrelerinin bir kısmı üst dermal tabakada bulunurken bir kısmı ise daha daha derin tabaka içerisinde yer almaktadır (Li vd., 2010; Reiisi vd., 2009) Yağ dokusu kaynaklı kök hücreler Vücudun hemen hemen her bölgesinde yağ dokusu bulunur. Diğer doku ve organlardan farklı olarak çok geniş bir yerleşime sahiptir. Deri altında subkütan olarak yer alan ve canlı vücudunun boşluklarını dolduran yağ dokusunun ısı kaybına karşı izolasyonu sağlaması, bazı anatomik kısımları tampon gibi desteklemesi, iç organların etrafını sararak dış etkenlere (darbe ve travma gibi) karşı mekanik koruma sağlaması gibi pek çok işlevi vardır. Ayrıca yağ hücresi ve dokusu; pasif enerji deposu ve aktif metabolik bir endokrin organ olarak görev yapar. İnsan vücudundan lipoasipirasyon işlemi ile elde edilen yağ dokusuna işlenmiş lipoaspirat (İLA, processed lipoaspirate (PLA)) denir. İLA fraksiyonu adipoz dokunun temel hücre serisini oluşturan adipositlerin yanı sıra fibroblastik, endotelial hücreler, makrofaj ve düz kas hücreleri gibi heterojen bir hücre gurubu da içerir. Tüm bu hücreler ise bilindiği üzere dokularda yer alan kök hücrelerden meydana gelir. MKH lerden kökenlenen adipositlerin (yağ hücresi) erken evresi olarak bilinen preadipositler gelişimleri sırasında iki farklı yol izlerler (Billon vd., 2008): 1. Beyaz yağ hücrelerine farklılaşma 2. Kahverengi yağ hücrelerine farklılaşma Bu farklı hücre proliferasyonu sonucunda yağ dokusu kahverengi yağ dokusu ve sarı yağ dokusu olmak üzere iki farklı yağ dokusu şeklinde meydana gelir. 1. Beyaz yağ hücreleri: Beyaz yağ dokusu uzun süreli enerji kaynağının ana deposu olarak işlev görür. Sarı yağ olarak da adlandırılan bu hücrelere sarımsı rengi içeriğinde bulunan karoten verir. Karoten yağda eriyen bir maddedir. %95 trigliserid içerir. Bu dokuya kapilerlerden besin gelir.

48 33 2. Kahverengi yağ hücreleri: Kahverengi yağ dokusu vücutta ısı kaybına engel (izolatör) olarak görev yapar. Rengini lipokrom pigmentinden alır. Sitokromlarca zengin mitokondrileri vardır. Sempatik adrejenik sinir lifleri içerir. Ayrıca, kahverengi yağ dokusunda beyaz yağ dokusundan çok daha fazla sayıda kan damarı mevcuttur. Şekil 2.12 Kahverengi ve beyaz yağ dokusunun histolojik görüntüsü Adipositler mikroskobik olarak incelendiklerinde içerdikleri lipid granülleri ile karakterize olurlar. Lipid granüllerinin büyüklük ve miktarları da adipositin yaşı ile ilgili bize ipucu verir. Örneğin; genç adipositler çok sayıda küçük lipid granülleri içerirler, yani multioküler haldedir. Karakteristik unioküler halde bulunan olgun adipositler ise tek ve büyük bir lipid granülden oluşur. Küçük lipid damlalarının birleşmesiyle oluşan olgun adiposit içerisindeki büyük yağ damlası sitosol ile doğrudan temas halinde olup bu hali mühür yüzüğü görünümü alır (Cartwright vd., 2007). Her yıl büyük oranda travmaya bağlı yaralanmalar, tümör çıkarılmaları ve doğuştan olan yumuşak doku hasarlarını onarmak için plastik ve rekonstruktif cerrahi işlemler yapılmaktadır. Bu hasarlar genelde büyük oranda yağ dokusun kaybıyla sonuçlanır. Bu hasar ve kayıpların tedavisi için çeşitli yaklaşımlar uygulanmaktadır. Doku hasarlarında erişkin otolog kaynak olma potansiyeli sebebiyle rejeneratif tıpta farklı biyo-materyaller ile birlikte de kullanılabilmeleri ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır (Flynn vd., 2007). Yirmibeş yılı aşkın süredir kök hücre çalışmalarının temelini, kemik iliği kaynaklı kök hücreler oluşturmaktadır. Bu hücreler, çeşitli rahatsızlıklar için hücresel tedavi yöntemlerinin uygulanabileceği uygun özelliklere sahiptirler. Kemik iliği gibi adipoz doku da in vitro ve in vivo şartlarda multipotent farklılaşma gösteren hücre plastisitesine sahip stromal mezenkimal hücreler içeren mezodermal bir dokudur. Adipoz dokudan elde edilen hücreler, işlenmiş lipoasipirat (PLA), adipoz dokudan elde edilen kök hücreler ve adipoz dokudan elde edilen

49 34 stromal hücreler veya adipoz doku kaynaklı mezenkimal öncül hücreler olarak çeşitli şekillerde adlandırılırlar. Bu tür adlandırmalar ile anılan hücreler aynı hücre popülasyonunu içermektedirler (Aksu vd., 2008). Son yıllarda hasar görmüş ya da kaybedilmiş yağ dokusunun onarılması için yağ doku özellikleri doku mühendisliği ve rejeneratif tıp çalışmaları esas alınarak incelenmeye başlanmıştır. Yağ dokusu tıpkı kemik iliği gibi mezenkimden köken alır ve KI gibi zengin bir stroma içerir. Çeşitli araştırmalar sonucunda yağ dokusunda MKH lerin varlığı tespit edilmiştir ve böylece yetişkin kök hücre kaynaklarına bir yenisi daha eklenmiştir. Yağ dokusu kök hücreleri yağ dokusundan lokal anestezi altında alınır. In vitro kültürü yapılarak elde edilen pluripotent kök hücreler laboratuvar şartlarında fibroblast benzeri hücre toplulukları oluştururlar. Bu kök hücre kaynağından elde edilen hücrelerin adipojenik, kondrojenik, myojenik, ve osteojenik farklılaşma yetenekleri gösterilmiştir (Zuk vd., 2001). Lipoaspirattan elde edilen örnek üzerine kısa süreli kolajenaz muamelesi uygulandıktan sonra santrifüj ile mononükleer hücrelerine ayrıştırılabilmektedir (Zhu vd., 2008). Kolay şekilde hücre izolasyonu sağlanabildiği için yağ dokusu son zamanlarda MKH kaynağı olarak oldukça ilgi çekmektedir. PLA lar uygun stimuluslarla osteojenik, adipojenik, myojenik ve kondrojenik hücrelere diferansiye olur ve o diziye özel gen ve proteinleri içerir, bu da kök hücre fenotipini onaylar. Uzun süreli kültürlerle PLA ların büyüme kinetikleri ve diferansiyasyon kapasiteleri değişmez. Hücre yüzey belirteçleri KI-MKH lere benzer. Her ikisi de Stro-1, SH-3 içerirler, her ikisi de hematopoetik marker olan CD31 ve CD45 içermez. In vitro kültürlerde CD34 gittikçe azalır. CD105/endoglin -TGF-β reseptör tip III MKH lerin TGF-β bağımlı kondrojenik diferansiyasyonunu gösterir. Böylece PLA ve MKH aynı hücre tipinin varyantları olarak bilinir. Seri pasajlarla MKH lere benzeyen homojen fibroblastik bir popülasyon kalır. Bu geri kalan grubun % 80 inin vimentin ve fibroblastik marker AS02 (antisense oligonucleotid) ekspresyonu göstermesi ile bu grubun MKH olduğu anlaşılır (Mizuno ve Hyakusoku, 2003; Mizuno, 2003). Yağ hücresine hormonlar ve sitokinler aracılığı ile endokrin, parakrin ve otokrin sinyaller gelir. Yağ hücresi membranında ve sitoplazmasında çeşitli hormon ve sitokinlere ait reseptörler bulunur. Bu nedenle bu doku mezodermal doku tamirinde kullanılabilir. Yağ dokusundan elde edilen MKH lerin farklılaştırma medyumları ile karaciğer hücresi (hepatosit), kemik hücresi (osteosit), kıkırdak hücresi (kondrosit), yağ hücresi (adiposit) ve

50 35 sinir hücresine (nöron) farklılaştığı da bilinmektedir (Şekil 2.13). Şekil 2.13 Yağ dokusundan elde edilen kök hücrelerin farklılaştığı hücre tiplerini gösteren şema Adipoz doku kaynaklı MKH lerin farklılaşabildiği bu zengin hücre yelpazesi tıp (klinik çalışmalar), doku mühendisliği çalışmaları ve genetik gibi pek çok alanda yeni çalışmalara kucak açmıştır. Tedavisi olmayan Alzheimer, Parkinson vs gibi hastalıklarda rejeneratif tıp çalışmalarını arttırmış ve umut kaynağı olmuştur. MKH lere alternatif olarak, doku mühendisliğinde farklı biyo-materyaller üzerinde farklılaştırılarak çeşitli rejeneratif tedavide kullanımları üzerinde çalışılmaktadır (Sinan ve Özbilgin, 2007) Kadavra kaynaklı kök hücreler Araştırmacılar bu tip hücrelerden elde edilen yeni hücrelerin çoğalma hızlarının ölen kişilerin yaşıyla ters orantılı olduğunu bildirmektedir (Bratanov vd., 2009). 2.8 Kök Hücre Kültürünün Yapılması DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) Hücrelerin üremesi ve devamlılığının sağlanması kullanılan temel bir besiyeridir. Eagle besiyerinin günümüze kadar kullanılagelen en yaygın modifiye edilmiş şeklidir. DMEM

51 36 Besiyeri Eagle ın (Basal Medium Eagle (BME)) aminoasit ve vitaminlerinin ve bunların yanında diğer destekleyici bileşiklerin de fazla bulunduğu modifikasyonudur. Bu besiyerlerinin ticari olarak 1.0 g/l ve 4.5 g/l olacak şekilde düşük ve yüksek glikozlu solüsyon olarak temin edilebilir ve uzun süre saklanabilir. L-glutamin bulunmayan bu besiyerine kullanılmadan önce serum ve glutamax gibi maddeler ilave edilmelidir. Hücre kültürleri için L-glutamin temel bir aminoasittir. Ancak L-glutamin yerine Glutamax eklenerek L-glutaminin meydana getireceği azotlu bileşiklerin besiyeri ph sı üzerine etkisi bertaraf edilmiş olur. Ticari olarak satılan besiyerlerinde hücrelerin üremeleri için gerekli olan aminoasit ve vitaminler bulunmaktadır. Bazı özel çalışmalar için gerekli olduğu durumlarda ticari olarak temin edilen aminoasit karışımları besiyerlerine eklenebilir (Finegold ve Baron, 1986; Isenberg, 1992). İlk zamanlarda fare embriyonik kök hücrelerin gelişimi için kullanılan DMEM formülasyonunun, belirli hücre tipleri için de ideal olduğu belirtilmiştir (Dulbecco ve Freeman, 1959; Smith vd., 1960; Morton, 1970; Rutzky ve Pumper 1974) Serum Albumin, globulin, üreme uyarıcıları ve üreme inhibitörlerinin bulunduğu serum son derece zengin bir kaynaktır. Hücrelerin gelişmesi için önemli olan komponentler serumda α-globulin fraksiyonunda yer alır. Serumda hücrelerin üremesini stimüle eden insülin, glukokortikoidler (hidrokortizon, deksametazon) ve tiroid hormonları gibi hormonal faktörler ile hücrelerin yüzeye tutulmasını ve yayılmasını sağlayan fibronektin, fetuin gibi proteinler, kortizol, hormonlar, Fe +2, Zn +2, Cu +2 gibi mineraller, prostoglandinler, kolesterol ve linoleik asit gibi lipitleri taşıyan albumin ve trasferrin benzeri proteinler bulunur. Serumda DNA sentezini ve hücre bölünmesini stimüle eden fibloblast üreme faktörü ve epidermal üreme faktörü gibi faktörler bulunur. Ayrıca serumun tripsin aktivitesini inhibe etmesi, bakteri toksinleri gibi bazı inhibitör bileşiklerin detoksifikasyonu ve hücre mebranından substratların transportu gibi görevleri vardır (Doyle vd., 1995; Murray vd., 1995). Hanks gibi dengeli tuz solüsyonları içersine sadece serum, laktalbumin hidrolizat ya da diğer bileşenler eklendiğinde hücre üremesini sağlarlar. Serumda esansiyel aminoasitler, nükleikasit prekürsörleri, hormonlar ve yağ asitleri bulunur. Serum hücrelerin ayrıştırılması için kullanılan proteazları da inhibe eder. Hücre üremesi için genellikle %5 15 konsantrasyonlarda, tek tabakalı hücre kültürlerinin devamı için ise %0-2 konsantrasyonlarda fetal ya da yeni doğan dana serumu kullanılır. İnsan, dana ve at serumu en fazla kullanılan

52 37 serumlar arasındadır. Zor üreyen hücreler için Fetal Sığır Serumu (FBS) kullanılması tavsiye edilir. FBS yüksek oranlarda biyotin ihtiva eder. Eagle'ın minimal gerekli besiyeri (EMEM) gibi bazı besiyerlerinde biyotin olmadığından dolayı FBS kullanımı uygun olur (Baker ve Breach, 1980). Doku kültürlerine eklenen serumlar mikoplazma kontaminasyonu açısından en önemli kaynaktır. Bu nedenle serumların kullanılmadan önce sitotoksik etkileri yönünden kontrolünün yapılması gerekmektedir. Satın alınacak hazır serumlar hücreleri üretmesi yönünden test edilmelidir. Serumlar -70 ºC de saklanmalıdır (Freshney, 1987; Shalaby, 1991; Isenberg, 1992). Hücrelerin gelişimleri için besiyerlerine % 7,5 10 FBS (Fetal Bovin Serum) eklenirken, metabolik aktivitelerinin devamı için ise %2 oranında FBS yeterlidir. Genellikle kullanılan serumlar insan veya hayvan serumu olmakla birlikte tercih edilen FBS dur. Erişkin serumlarında hücrelerin çoğalmalarını önleyen birçok enfeksiyöz ajan bulunabileceğinden dolayı tercih sebebi olmayabilir. Ayrıca hayvan serumu kullanılacaksa hayvan genç ve sağlıklı olmalıdır. Serumdaki bazı maddeler ısıtılarak inaktive edilir. Ticari olarak temin edilebilen ve hormonlar ve matriks proteinleri gibi serum yerine geçebilen bazı maddelerin kullanılmasıyla besiyerlerine eklenmesi gerekli olan FBS un miktarı azaltılabilir. Sonuçta bu maddelerin kullanılması FBS un kullanılmasından daha ekonomiktir. İn vitro şartlarda organ ve hücre fonksiyonlarını düzenleyen endokrin faktörleri saptamak ve antikor purifikasyonu için ucuz ve pratik olan serumsuz kültürleri kullanmak oldukça avantaj sağlar. Serumlu besiyerlerinin kullanımının ise sahip olduğu bazı dezavantajları vardır. Serumun yapısında zamanla bozulmalar olabilir ve serumlar en fazla bir yıl saklanabilir. Eğer birden fazla hücre tipi kullanılacaksa bunların her biri için farklı serum gerekebilir. Bu da çok sayıda serumun aynı anda saklanması anlamına gelir. Sonuçta aynı anda birden fazla serum tipinin kullanılması bazı problemler yaratabilir. Serumlu besiyerlerinin kullanımının bir dezavantajı ise serumda hücrelerin üremesi üzerine inhibitör etkileri tam olarak bilinmeyen birçok maddenin bulunmasıdır (Freshney, 1987; Isenberg, 1992) Antibiyotikler Kültür ortamındaki bakteri ve mantar kontaminasyonunu önlemek için besiyerine antibiyotikler ilave edilir. Kontaminasyon amaçlı kullanılan antibiyotikler antibakteriyel ajanlar ve antimikotikler olmak üzere iki grup altında incelenebilir. Bakteri ve mantar

53 38 kontaminasyonunu kontrol edebilmek amacıyla hücre kültürü besiyerine antibakteriyal ve antimikrobiyal ajanlar katılmalıdır. Genellikle kültürlerde antimikrobiyal ajanların çeşitli kombinasyonları kullanılır. Bu antimikrobiyal kombinasyonlar steril olarak ticari şartlarda temin edilebilir. Ancak burada antimikrobiyal ajanların hücreye olabilecek toksik etkilerinide göz ardı etmemek gerekmektedir. Örneğin doku kültürlerinde penisilin kullanımı bakterilerin L-formunun ortaya çıkmasına neden olur (Baker ve Breach, 1980; Koneman vd., 1992; Doyle vd., 1995). Antibiyotik kullanımında bir başka dezavantaj ise bakteri veya mantar infeksiyonunu baskılayarak, kültürde kronik ya da latent bir infeksiyonun sürmesine neden olmaktadır. Antimikrobiyal ajanlar dokulardan hücrelerin ayrıştırılması esnasında ya da klinik numunelerin kültüre inokulasyonu gibi yüksek kontaminasyon riski olan durumlarda kesinlikle kullanılmalıdır. Ancak hücre kültürlerinin subkültürleri esnasında antimikrobiyal ajanların kullanımından kaçınılmalıdır. Böyle durumlarda mikrobiyal risk aseptik teknikler kullanılarak ortadan kaldırılmalıdır. Sonuçta mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için yüksek oranlarda antibiyotik kullanılmamalıdır. Laboratuvarlarda gelişigüzel antibiyotik kullanımı da önlenmelidir. Aksi taktirde bakteri ve mikoplazmaların direçli suşları oluşabilir. Sıklıkla geniş spektrumlu antibiyotiklerin streptomisin, penisilin ve amfoterisin B (fungizone) ya da gentamisin, ampoterisin B ve Nystatin (10U/ml) kombinasyonları kullanılmaktadır (Baker ve Breach, 1980). Laboratuvarlar da antibiyotikler koruyucu ajanlar olarak kullanılmaktadır. Rutin olarak kullanılan antibiyotiklerin kullanımına kontamine olan kültürlerin tespiti için zaman zaman ara verilmelidir PBS (1X) solüsyonu PBS tamponu hücre içi ve dışındaki ozmotik basıncı dengede tutan bir tuz solusyonudur. İçeriğindeki inorganik tuzlar ve su, hücre metabolizmasını destekler. Asit-baz dengesini (ph) tamponlayarak hücreler için uygun bir ortam sağlar. 2.9 Kök Hücre İzolasyon Teknikleri Dansite gradient yöntemi ile izolasyon Androloji laboratuvarlarında sperm hücrelerinin izolasyonu için de kullanılan bu yöntemde hücre karışımını santrifügasyon yöntemi ile ayırmak için tüp içerisinde sükroz gibi bileşiklerle bir konsantrasyon gradienti oluşturulur. Bunun için plastik tüp içerisinde en

54 39 yoğundan en az yoğuna doğru bir sükroz gradienti meydana getirildikten sonra tüpün üzerine hücre karışımı ilave edilir. Bu şekilde hazırlanmış olan tüp yüksek devirde santrifüj edilecek olursa her bir hücre kendi dansitesi ile aynı olan sükroz bölgesine toplanacaktır. Tüp içerisinde farklı bantlar halinde ayrılmış olan hücreler pipet ile alınarak flask içerisine uygun besiyeri ile kültüre alınır (Brunt vd., 2007; Peterbauer-Scherb vd., 2010) Differansiyel Santrifügasyon Differansiyel santrifügasyon ile bir karışımda bulunan partiküller boyutlarındaki farklılıklara bağlı olarak ayrılmaktadır. Homojenat, relatif santrifügal kuvvet (RCF) arttırıldıkça fraksiyonlarına ayrılmaktadır. İstenilen fraksiyonlardan hücreler pipet ile alınarak flask içerisine uygun besiyeri ile kültüre alınır (Pralong vd., 2005) Basit Santrifügasyon Basit santrifügasyon yöntemi ile santrifüj edilen hücre sıvı karışımından oluşan pellet üzerindeki süpernatant uzaklaştırılır. Pellet içerisinde yer alan hücreler alınarak izolasyon sağlanır Hücrelerde Manyetik Ayırımda Uygulanan Yöntemler Manyetik teknikler ile hücre ayırımınını uygulama asamasında çok çeşitli uygulama yöntemleri tercih edilebilir. Bu yöntemlere aşağıda kısaca değinilmiştir Doğrudan ve Dolaylı Seleksiyon Doğrudan ayırım metodunda ortamdan izole edilemesi istenen hücreye özgü primer ligand taşıyan manyetik etiketler ile işaretlenir. Belirli bir inkübasyon süresinden sonra manyetik partiküllere bağlı primer ligand spesifik hücre reseptörü ile etkileşirve etkileşim kompleksi bir mıknatıs kullanılarak ortamdan ayrılır. Dolaylı ayırım metodunda ise ortamdan izole edilmesi istenen hücre uygun bir primer affinite ligandı ile işaretlenir. Bu primer liganda özgün sekonder affinite ligandı taşıyan manyetik partikül inkübasyon süresince primer ligand ile birleşir vemanyetik ayırıcı yardımı ile istenilen hücrenin ortamdan izole edilmesini sağlar (Odabaş, 2006) Pozitif ve Negatif Seleksiyon Pozitif ve negatif seçim metodları ortamda hangi hücrenin önce seçilecegi esasına

55 40 dayanmaktadır. İzolasyonu istenmeyen hücreler negatif seleksiyon şeklinde manyetik olarak işaretlenir ve mıknatıs altında istenmeyen hücreler tutunarak ortamdan seleksiyonu sağlanır. Böylece izolasyonu istenen hücreler manyetik işaretlenmezler ve yıkama işlemleri yapılarak sistemden alınırlar. Hem doğrudan hem de dolaylı ayırım metodları negatif seçim metodu ile kullanılabilmektedir. Ancak izolasyonu istenen hücre ortamda oldukça az bulunuyorsa, negatif seçim metodu izolasyonda yabancı hücre kontaminasyonuna ve dolayısı ile düşük verime neden olabilmektedir (Davies vd., 2000). Pozitif seçim yönteminde ise, negatif seçim yönteminden farklı olarak ortamdan izole edilmesi istenen hücre manyetik olarak işaretlenir ve mıknatıs altında tutulabilir. İstenmeyen hücreler ise yıkama işlemleri sonucunda ortamdan uzaklaştırılır. Sistemden en son çıkan izole edilmesi istenen özgün hücredir (Feller vd., 2008). Bu seçim yönteminde de hem doğrudan hem de dolaylı ayırım yöntemleri ile birlikte kullanılabilmektedir Kök Hücre Karakterizasyonu Tripan Mavisi ile hücre sayımı ve canlılık tayini Hücre süspansiyonunda ml de bulunan hücre sayısını hesaplamak için üzerinde üçlü çizgilerle ayrılmış 16 büyük kareden oluşan, üzerinde yivler bulunan 1mm 2 lik alan ve 0,1 mm derinliğe sahip Thoma lamı kullanıldı (Şekil 2.14). Şekil 2.14 Thoma lamı üzerindeki yivler

56 41 En çok uygulanan hücre sayım yöntemi hücre canlılık yöntemi olarak da uygulanan Tripan mavisi yöntemidir. Tripan mavisi molekül yapısı C 34 H 23 N 6 O 14 S 4 Na 4 olan, canlı hücreleri boyamayıp ölü hücreleri boyayan böylece canlı hücre sayısını tespit etmekte kullanılan vital bir boyadır (Strober, 2001) Mikroskobik inceleme ile kök hücre tayini Kök hücrelerin mikroskobik olarak incelenmesi kök hücre çalışmaları için oldukça önemlidir. Kök hücreler in vitro kültürde tipik fibroblast benzeri bir morfolojiye sahip olmaktadırlar. İğ şekli de denilen ince uzun bipolar bir yapıdadırlar Kolonijenik inceleme ile kök hücre tayini Klonlaşma (kolonijenez) bir kök hücrenin sahip olması gereken önemli özelliklerden birisi olarak değerlendirilmektedir. Klonlaşma bir hücrenin aynı yapıda birden fazla hücreyi üretme kapasitesi olarak adlandırlmaktadır. Klonlaşma özelliği ile hücreler homojen formda hücre grupları oluşturabilmektedir. Bu özellik bir hücre hattı oluşumunda kritik parametredir (Blau vd., 2004). Kültürde bulunan kök hücrelerin kültür ortamında koloni oluşturmalarının mikroskobik olarak incelenmesi yapılmaktadır. Ancak yağ dokusundan elde edilen mezenkimal kök hücreleri koloni oluşturmazlar İmmünfenotipleme (Flow Sitometrik analiz) Flow sitometri yani hücre akım sitometrisi tek hücre seviyesinde analiz olanağı sunan gelişmiş bir tekniktir. Analizin yapılabilmesi için hücrelerin süspanse hale getirilip monoklonal bir antikor ile işaretlenmesi gerekir (Carvalho ve ark., 2008). Flow sitometri analizi ile hücrelerin boyutu, iç yapısı, yüzey morfolojisi ve hücre canlılığı hakkında bilgi edinilmektedir. Bu amaçlarla hazırlanan hücre süspansiyonu öncelikle bir veya daha fazla bağlı monoklonal antikor (FITCH, PE vb.) ile işaretlenir. İşaretlenen hücreler yüksek basınçlı koruyucu bir sıvı içinden geçirilerek akış kabinine getirilir. Bu bölümde tek sıra halinde lazere tabi tutularak görünür hale gelmektedir. Lazer ışını, floresan işaretli antikorlar tarafından ileriye (FS) ve 90 0 yana (SS) doğru yansıtılmaktadır. FS önden açılımı ifade eder ve hücre boyutunu; SS ise yandan saçılımı ifade etmekte ve hücrenin iç yapısını göstermektedir. Bu parametreler kullanılarak hücrelerin ayırt edilmesi sağlanmaktadır. Bu şekilde yansıyan ışınlar lens ve dedektörler aracılığı ile toplanır,

57 42 elektrik sinyallerine çevrilerek bilgisayara aktarılmaktadır Histokimyasal boyama ile kök hücre tayini Oil Red O boyama ile adipojenik farklılaşma tayini Lipid granüllerinin histolojik boyanma mekanizmaları daima boyanın ortam sıvısı yerine lipid içerisinde daha fazla çözünebilir olması temeline dayanır. Lipid granüllerinin boyanması ile hücre içerisinde spesifik boyanma meydana gelir. Lipid spesifik boyaların polyaza grupları Oil Red, Sudan Red ve Sudan black boyama serilerini içerir (Sera ve ark., 2009) Alizarin Red S boyama ile osteojenik farklılaşma tayini Alizarin Red S, bir antrakinon türevi olup doku kesitlerindeki kalsiyum birikintilerini tespit etmede kullanılır. Meydana gelen reaksiyon tamamen kalsiyum için spesifik olmamakla birlikte magnezyum, manganez, baryum, stronsyum ve demir için de kullanılır ancak uygun konsantrasyonlarının kullanılması ile boyama esnasında birbiri ile karışmazlar (Wang ve ark., 2009) Kriyoprezervasyon Kriyoprezervasyon (dondurarak saklama) hücreleri özel koruyucu maddelerle (kriyoprotektan) C lik sıvı azot tanklarında saklamaktır. In vitro devamlı kültür yapılan hücreler laboratuvar şartlarına adapte edildikten sonra kriyoprezerve edilerek uzun zaman boyunca muhafaza edilirler (Berthier, 1983). Kriyoprezervasyonda elde edilmek istenen amaçlar biyolojik kaynak merkezleri (BRC) tarafından aşağıdaki gibi maddelenmiştir: Gazların sıvı faza kompresyonu ve ultra düşük sıcaklıkların kullanımı sayesinde prokaryotik ve ökaryotik organizmaların değişmeyen durdurulmuş animasyon aşamasında tutulabilmesi Endüstriyel işlemlerin geliştirilmesi Biyolojik testler ve yayınlanmış bilimsel makalelerde yer alan referans türlerin saklanması Taksonomik çalışmalar için tip türlerin oluşturulması Biyoçeşitliliğin korunması

58 43 Soyu tükenmekte olan bitki dokuları, tohumlar, hayvan gamet ve embriyololarının saklanması Saflık (başka kontaminant bir tür içermemesi) Özerklik (her bir türün doğru tanımlanmış olması) Stabilite (doğru fonksiyonel özelliklere sahip olması) Organizmanın in vitro ortama adaptasyonu sırasında bazı komplikasyonlar meydana gelebilir. Karşılaşılabilecek durumlar genetik mutasyonlar, kontaminasyon, kültürlerin kaza sonucu kaybı gibi sıralanabilir. Dondurulmuş örnekler C de saklandığı sürece viyabilitelerini (canlılıklarını) korurlar. Bununla birlikte sistemin bakımının iyi yapılmadığı durumlarda nitrojen seviyesinin azalması ve konteyner içindeki sıcaklığın değişmesi saklanan örneklere büyük zarar verir. Kriyoprezervasyon işlemleri ile oluşturulan kriyobankın güvenli bir şekilde muhafaza edilebilmesi için aşağıdaki şartların sağlanması gerekmektedir (Lermen vd., 2009). İyi bakım şartlarının oluşturulması Personel eğitimi Uygun yönetim Personel giriş çıkışının sınırlandırılması Nitrojen saklama tankları için uygun alarm sistemlerinin oluşturulması Nitrojen dolum ve bakımı için uygun formların düzenlenip düzenli doldurulması Devamlı kültürü yapılan hücre serilerinin optimal dondurulması için gerekli bazı kriterler şunlardır: Çözme sonrası maksimum hücre sayısı Minimum intrasellüler kristal oluşumu Minimum derecede yüksek konsantrasyonlu kriyoprotektana maruz kalma Suyun uzaklaşabileceği derecede yavaş soğutma Kristal oluşumunun engellleneceği kadar hızlı soğutma Hidrofilik kriyoprotektan kullanımı Mümkün olan en düşük derecede saklama Hızlı çözme Soğutma oranı (Optimal bir soğutma işlemi için soğutma oranı: 1 C/dak olacak şekilde ayarlanmalıdır. Soğutma eğrisi; ortam sıcaklığı, yalıtım, taşıyıcı sıcaklığı, taşıyıcı

59 44 volümüve dondurma işlemi sırasında dışarıdan ısı alımı gibi çeşitli fiziksel şartlardan etkilenmektedir (Şekil 2.15). Şekil 2.15: Kriyoprezervasyon tekniği ile hücrelerin soğuma basamaklarını gösteren şema Kriyotüpler polipropilen (polypropylene) kriyovial taşıyıcılardır (Berthier ve ark., 1983). Kırılma ve çatlamaya karşı dayanıklı olduklarından işlem için kullanıma çok uygundurlar. Bazı merkezler uzun süreli saklamak için uygun olduklarında cam kriyotüplerin kullanımını tercih etmektedirler. Kriyotüplerin kriyoprezervasyonu işlemi için kullanılması sırasında uygun olarak işaretlenmesi ve haritalanması çok önemlidir. Hücre tipi, tarih, pasaj sayısı ve hücre sayısı muhakkak belirtilmelidir. Ayrıca alkole dayanıklı işaretleyici kullanılmalıdır Yavaş dondurma Kademeli dondurma işlemi adı da verilen yavaş kriyoprezervasyon işleminde dondurma solüsyonu (kriyoprotektan) ile süspanse edilen hücreler kriyotüp içerisinde kademeli olarak soğutulmaya başlanır. Oda sıcaklığından +4 ile -6 0 C arasında soğuk bir dolaba alınan örnek hücre içerisindeki suyun yavaşca dışarı çıkmasını sağlar. Bu esnada buz kristallerinin

60 45 oluşumunu engelleyen ekstra selüler matriks olarak görev yapan serum ve kriyoprotektan ile hücreler daha soğuk ortama alınır ya da içerisinde bulunduğu dondurucunun sıcaklığı zamanla düşer (Şekil 2.16). Son aşama olarak sıvı azot içerisine alınan örnek teorik olarak sonsuza kadar muhafaza edilebilir (Lippens ve ark., 2010). Şekil 2.16 : Yavaş dondurma tekniği ile hücrelerin sıvı azot içerisine alınmasını gösteren şema Hızlı dondurma Hızlı dondurma işleminde hücre süspansiyonuna dondurma solüsyonu eklendikten sonra oda sıcaklığında fazla tutmadan C de yarım saat tutulduktan sonra direkt olarak sıvı azot içerisine yerleştirilir (Şekil 2.17). Vitrifikasyon olarak da adlandırılan hızlı dondurma tekniğinde amaç hücre içi oluşabilecek kristalleri en aza indirmek ve soğutma süreci sırasında oluşabilecek hücre dejenerasyonunu ortadan kaldırmaktır (He ve ark., 2008).

61 46 Şekil 2.17: Hızlı dondurma tekniğinin oda sıcaklığından (RT) sıvı azot (LN) Çözme Kriyobank içerisinde yer alan kriyotüplerdeki hücre çözme işlemi hızlı olmalıdır. Kristal oluşumunu engellemek için 37 C su banyosu içerisinde kriyotüpte bulunan hücrelerin hızla ısıtılarak çözdürülmesi gerekmektedir. Ancak çözme öncesi kontaminasyonu engellemek için taşıyıcı ilk olarak alkol ile temizlenmelidir. Steril şartlarda açılan kriyotüp içerisindeki hücreler yavaşca seyreltilerek kültür kabına alınmalıdır aksi takdirde hızlı yapıldığında kriyoprotektan nedeni ile membranda osmotik şok oluşur ve hücre çeperi zarar görerek hücreler canlılıklarını kaybederler (Kent ve ark., 2009)

62 47 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 3.1 Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Cihazlar ve Kimyasal Maddeler Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Cihazlar Etüv ph Metre (İnolab WTW Level 1) Hassas Terazi (Precisa XB 220A) Santrifüj (Hettich ZENTRIFUGEN EBA20) Vorteks (Heidolph REAX top) Bidistile Su Cihazı Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı (Heildolph MR 3001) Laminar-Hava Akışlı Kabin İnkübatör (37 o C, %5 CO 2 li) Ters Mikroskop - 45 o C Derin Dondurucu Sıvı Azot Tankı Otoklav Flow sitometri ( Beckman Coulter, FC500, USA)

63 Kullanılan Kimyasal Maddeler MADDE ÜRETİCİ FİRMA KATALOG NO Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) 1.0 g/l D- Glucose (1X) Gibco (Invitrogen) Dulbecco s Modified Eagle Medium Nutrient Mixture 12 (DMEM/F12) (500ml) Sigma-Aldrich D621 Iscove s Dulbecco s (IMDM) (1X) Modified Medium Gibco (Invitrogen) DMSO AppliChem A8361 GlutaMAX -I (100X) Gibco (Invitrogen) Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Gibco (Invitrogen) Anti-anti (100X) Gibco (Invitrogen) Tripan mavisi (%0,5) Biologycal Industry Kolajenaz Sigma-Aldrich C6885 FBS Biochrom AG 1038K Oil Red O Sigma-Aldrich 058K0720 Alizarin Red S C.I Hematoksilin Sigma-Aldrich MHS80 %99 izopropanol Riedel Deksametazon Sigma-Aldrich D8893

64 49 Insülin Sigma-Aldrich I5500 L-Glutamin BioXtra G6392 Indometazin Fluka IBMX Sigma I-7018 Askorbik asit Merck β-gliserolfosfat Merck IU PE antihuman CD90 (Thy1) BioLegend FITCH antihuman CD34 (Thy1) BioLegend PE antihuman CD105 (Thy1) BioLegend KH 2 PO 4 Riedel de Haen NaCl Fluka KCl Fluka Pest Biochrom-AG (penisilin/streptomisin: unite /10000 µg/ml) A2213,0337K

65 Çözelti ve Besiyerlerinin Hazırlanması DMEM besiyerinin hazırlanması 50 ml %5 FBS (Biochrom AG, 1038K) içeren DMEM (Gibco-Invitrogen, 31053) besiyerinin hazırlanması için 44 ml stok DMEM, 5 ml FBS, 0,5 ml Glutamax (Gibco-Invitrogen, ) ve 0,5 ml Anti-anti (Gibco-Invitrogen, 15240)50 ml lik santrifüj tüpü içinde karıştırıldı. Soğutucuda +4 0 C de muhafaza edildi PBS solüsyonunun (1X) hazırlanması 8 g NaCl (Fluka, 71376) 0,2 g KCl, (Fluka, 1118) 1,44 g Na 2 HPO 4 (Riedel de Haen) ve 0,24 g KH 2 PO 4 (Riedel de Haen, 04248) tartılıp 900 ml bidistile suda çözdürüldü. ph 7,4 e ayarlandı ve son hacim bidistile su ile 1 L ye tamamlandı. Cam şişelerin içinde 1 atm basınç, C sıcaklığa ayarlanmış otoklavda 20 dakika steril edildi. Soğutucuda +4 0 C de muhafaza edildi Adipojenik farklılaştırma medyumunun hazırlanması 50 ml adipojenik farklılaştırma medyumu hazırlamak için 43,2 ml DMEM, 5 ml FBS, 0,5 ml deksametazon (Sigma-Aldrich, D8893), 0,05 ml insülin (Sigma-Aldrich, I5500) 2 ml indometazin (Fluka, 57413), 0,05 ml IBMX (Sigma, I-7018), 0,5 ml Pest (Biochrom-AG, A2213,0337K) ve 0,5 ml L-Glutamin karıştırıldı. Soğutucuda +4 0 C de muhafaza edildi Osteojenik farklılaştırma medyumunun hazırlanması 50 ml osteojenik farklılaştırma medyumu hazırlamak için 43,4 ml DMEM, 5 ml FBS, 0,05 ml askorbik asit, 0,05 ml dekzametazon, 0,5 ml b-gliserolfosfat, 0,5 ml Pest ve 0,5 ml L- Glutamin (BioXtra, G6392) karıştırıldı C de muhafaza edildi. Soğutucuda +4 0 C de muhafaza edildi Oil Red O solüsyonunun hazırlanması Oil red stok çözeltisinin hazırlanması: Stok çözeltisi olarak kullanılacak solüsyon için 300 mg Oil Red O toz (Sigma-Aldrich, 058K0720) tartıldı ve 100mL %99 luk izopropanol içinde çözdürüldü.oda sıcaklığında muhafaza edildi. Oil Red O çalışma solüsyonunun hazırlanması : Cam bir kap içerisinde 3 birim Oil Red O stok solüsyonu 2 birim distile su içinde çözüldü. Oda sıcaklığında on dakika bekletildi. Daha sonra ise 0,2 µm lik filtreden geçirildi. Raf ömrü iki saat olduğu için solüsyon boyama işleminden hemen önce hazırlandı.

66 51 %60 izopropanol hazırlanması: 6 ml %99,8 lik izopropanol ve 4 ml distile su alınarak cam bir kapta karıştırıldı Alizarin Red S solüsyonunun hazırlanması 2 g Alizarin Red S (C.I ) 100 ml bidistile su ile iyice karıştırıldı. ph 4,1 ile 4,3 aralığında olacak şekilde %10 amonyum hidroksit ile ayarlandı. Oda sıcaklığında muhafaza edildi. Ayrıca boyama işlemi sonrasında hücrelerin fiksasyonunda kullanılmak üzere 50 ml 100% Aseton, 1/1 oranında karıştırılmış 50 ml aseton/ksilen ve 50 ml ksilen hazırlandı Tripan Mavisi (TB) solüsyonunun hazırlanması 100 ml lik ambalajlarda % 0,5 konsantrasyon şeklinde Tripan mavisi solüsyonu (Biologycal Industry, ) ticari olarak satın alındı. Hücre sayımı için 10 µl Tripan mavisi boya, 90 µl distile su ile seyreltilerek sayım solüsyonu hazırlandı. Sayım solüsyonundan 98 µl alındı ve 2 µl hücre süspansiyonu eklenerek 100 µl karışım elde edildi Kriyoprotektan (dondurma solüsyonu) hazırlanması %5 lik dondurma solüsyonu için 0,5 ml DMSO (AppliChem, A8361) 9,5 ml FBS karışımı, %10 dondurma solüsyonu için 1 ml ve DMSO 9 ml FBS karışımı, %15 dondurma solüsyonu için 1,5 ml DMSO ve 8,5 ml FBS karışımı 15 ml Falcon tüp içerisinde hazırlandı Yağ Dokusundan Kök Hücre İzolasyonunun Yapılması Cerrahi müdehale ile yağ emme (lipoasipirasyon) işlemi sonrasında elde edilen ve proses edilmiş lipoasipirat (processed lipoasipirate, PLA) olarak adlandırılan yağ dokusu, steril PBS içeren 50 ml enjektör içerisinde uygun şartlarda laboratuvara getirildi.

67 52 Şekil 3.1: İnsan yağ dokusundan yağ emme (lipoasipirasyon, liposuction) yöntemi ile subkütanöz lipid tabakasının alınması Yağ dokusu 50 ml DMEM (Gibco Invitrogen, 11880) besiyerinde çözünen 100 µg kollejenaz enzimi (Sigma C6885) tip-ii ile hazırlanmış solüsyon ile 1/1 oranında karıştırıldı. Doku 37 0 C lik su banyosunda dakika boyunca 5 dakikada bir karıştırılarak bekletildi dakika sonra; üst yüzeyde bulunan yağ tabakası atıldı. Alt fazda yer alan hücre süspansiyonu steril bir 15mL lik Falcon tüpe alındı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant uzaklaştırıldı ve pellet 10 ml %10 FBS (Biochrom AG, 1038K) içeren, Glutamax (Gibco Invitrogen 35050) ve Anti-anti (Gibco Invitrogen, 100X, 15240) ile zenginleştirilmiş DMEM ile süspanse edilerek 2-3 adet kültür flaskına ekildi C lik %5 CO 2 içeren etüvde inkübasyona bırakıldı.

68 53 Şekil 3.2: Kolajenaz tip II ile muamele edildikten sonra deney tüpü içerinide mezenkimal kök hücre süspansiyonunu gösteren şekil Yağ dokusundan elde edilen MKH ler uygun laboratuvar şartlarında çoğaltıldı. % 5 nem oranına sahip 37 0 C lik %5 CO 2 içeren etüvde steril şartlar altında hücreler inkübe edildi. Yağ dokusundan elde edilen hücreler monolayer olarak plastik kültür kaplarında inkübe edildi. Hücreler çoğaldıktan sonra pasajlama işlemi sonrasında 1x10 5 ila 1,25x10 5 hücre/ml olacak şekilde tekrar kültüre bırakıldı. Kültür kabını kaplayan hücreler 3 4 gün sonra tekrar pasajlandı ve uzun süreli saklama için kriyoprezervasyonu yapıldı. Tabana adhere olan hücreleri yüzeyden ayırmak için kazıma gibi mekanik tekniklerin yanı sıra tripsinizasyon gibi enzimatik yöntemler de kullanılarak kültür kabından ayrılması sağlanabilir. Prosedürler gereği tekrar ekim ve dondurma işlemleri yapılır. Yağ dokusundan alındığında heterojen bir hücre popülasyonuna sahip olan hücre kültürü, inkübasyon sırasında pasajlanarak yabancı hücre gruplarının ortamı terk etmesi sağlandı. Bunun sonunda elde edilen saf kök hücre kültürü çeşitli farklılaştırma medyumları ile kültüre edilerek pluripotent/multipotent hücreler farklılaştırıldı Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin in vitro kültürünün yapılması ve pasajlanması Devamlı kültürü yapılan AD-MKH ler 3 4 günde bir flask tabanını % kapladılar. Monolayer hücre tabakası üzerinde bulunan metabolit uzaklaştırıldı ve üzerine taze besiyeri

69 54 eklendi. Bunun için inkübatörde bulunan kültür flaskı laminar kabine getirildi ve kültürün metaboliti uzaklaştırıldı. Hücreler PBS ile yıkandı. Son olarak 5 ml %10 FBS içeren DMEM ilave edilerek hücreler tekrar inkübasyona bırakıldı. 7 günlük kültürü yapılan AD-MKH lerin kültür kabının tabanını kapladıkları mikroskobik olarak gözlendi. Pasajlama işlemi için kültür flaskının tabanını %70 80 kaplayan hücreler inkübatörden alındı ve laminar kabine getirildi. Hücre metaboliti uzaklaştırıldı. Hücreler Ca +2 - Mg +2 içermeyen PBS (ya da DMEM) ile yıkandı. Yıkama sonrasında hücreler Tripsin/EDTA (Gibco Invitrogen, 1X, %0,05, 25300) ile muamele edilerek 5 10 dakika 37 0 C de %5 CO 2 içeren etüvde bekletildi. Hücreler flask tabanından tamamen ayrıldıktan sonra Tripsin/EDTA hücre solüsyonunun üzerine FBS içeren besiyerinden 5 ml eklenerek hücre süspansiyonu 15mL lik Falcon tüpe aktarıldı ve 1200 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Şekil 3.2: Flask içerisinde yer alan monolayer hücre tabakasının tripsin/edta muamelesi ile kaldırılması ve Falcon tüpe alınması Santrifüj sonrası süpernatant atıldı. Dipte kalan kök hücre pelleti (yaklaşık 250 µl) üzerine besiyeri eklendi ve 1ml hücre süspansiyonunun Thoma lamında sayımı yapıldı. Hücrelerin bir kısmı ( hücre/ml) tekrar 5mL %10 FBS içeren besiyeri bulunan flask içine alındı ve 37 0 C de %5 CO 2 içeren etüvde inkübe edildi. Kalan hücreler ise uygun dilüsyonlarda ( hücre/kriyo tüp) donduruldu.

70 55 Şekil 3.3: Santrifüj edilen AD-MKH lerin kriyoprezervasyon işlemi sonucunda kriyotüpe aktarılması ve sıvı azot tankına muhafaza edilmek üzere koyulması Tripan Mavisi ile hücre sayımının yapılması Hücre süspansiyonunda ml de bulunan hücre sayısını hesaplamak için üzerinde üçlü çizgilerle ayrılmış 16 büyük kareden oluşan yivler bulunan 1mm 2 lik alan ve 0,1 mm derinliğe sahip Thoma lamı kullanıldı. Tripan Mavisi Yöntemi: Tripan Mavisi solüsyonundan (Biologycal Industry, ) 50µL, PBS çözeltisinden 48µL ve hücre süspansiyonundan 2µL alınarak 100µL karışım elde edildi. Hücre-boya süspansiyonundan yaklaşık 20µL alınarak Thoma lamına yayıldı ve sayım yapıldı. Thoma lamının alt ve üst kısmındaki büyük 16şar karedeki hücreler sayılıp aritmetik ortalamalar alındı. Daha sonra aşağıdaki formül ile istenilen dilüsyon yapıldı. Hücre Sayısı (/ml) = Başlangıçtaki Dilüsyon x Sayılan Ortalama Hücre x İçin Katılan Miktar Sayısı (Sabit)

71 Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin Giemsa boyamasının yapılması Kültürde bulunan AD-MKH lerin, pasajlama sonrasında altı kuyucuklu kültür kabı içerisinde 2 ml %10 FBS içeren DMEM ile ekimi yapıldı. %5 CO2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. 48 saat sonra kuyucuk tabanına ve lamel üzerine tutunan hücreler Giemsa boyama için inkübatörden alındı. Hücrelerin üzerinde bulunan metabolit uzaklaştırldı. PBS ile iki kere yıkama yapıldı. Metanol ile hücreler 5 dakika fikse edildi. Metanol uzaklaştırıldıktan sonra Giemsa boya ile hücreler dakika oda sıcaklığında boyamaya bırakıldı. Bu süre sonrasında musluk suyu ile yıkaması yapılan hücreler oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı. Kuruyan örnekler mikroskop altında incelendi. Boyaması yapılan preparatlar immersiyon yağı ile 100X objektif altında mikroskobik olarak incelendi. Hücre sitoplazmasının pembe mor, hücre çekirdeğinin ise mavi mor menekşe rengi ile boyandığı gözlendi Kriyoprezervasyon Farklı dimetilsülfoksit (DMSO) ve yağ dokusundan elde edilen mezenkimal kök hücre miktarları ile kriyoprezervasyonun yapılması: Kültürde bulunan hücreler tripsinize edildi. Tripsinizasyon sonrası hücre süspansiyonu 1200 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant uzaklaştırıldı ve pelletteki hücrelerin Tripan mavisi ile sayım yapıldı. Miktarı bilinen pellet içerisindeki hücreler 0,25x10 6, 0,5x10 6 ve 10 6 hücre/ml olmak üzere kriyotüplere ayrılarak %5, %10, ve %15 DMSO içeren kriyoprotektanlar ile hızlı dondurma tekniği uygulanarak kriyoprezerve edildi Farklı DMSO ve adipoz doku kökenli kök hücre konsantrasyonları ile kriyoprezervasyonun yapılması: Kültürde bulunan hücreler Bölüm te anlatıldığı gibi tripsinize edildikten sonra % 10 FBS içeren DMEM ile süspanse edilerek 15 ml santrifüj tüpüne alındı rpm de 10 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen yaklaşık 250 µl lik pellet 1 ml ye tamamlanarak pipetlendi ve hücre süspansiyonunun Tripan mavisi ile sayımı yapıldı. %5, %10, %15 DMSO içeren FBS ile kriyoprotektanlar hazırlandı. Beşinci pasajda bulunan hücreler Tripsin/EDTA ile kaldırıldı. Sonrasında 0,25x10 6, 0,5x10 6 ve 10 6 hücre/ml olacak şekilde kriyoprotektanlar ile süspanse edildi. Kriyoprotektan ile muamele edilen hücreler sıvı azot buharında yarım saat bekletildikten sonra sıvı azot tankının içine yerleştirildi.

72 Hızlı dondurma Kültürde bulunan hücreler Bölüm te anlatıldığı gibi tripsinize edildikten sonra % 10 FBS içeren DMEM ile süspanse edilerek 15 ml santrifüj tüpüne alındı rpm de 10 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen yaklaşık 250 µl lik pellet 1 ml ye tamamlanarak pipetlendi ve hücre süspansiyonunun Tripan mavisi ile sayımı yapıldı. Sayım sonucunda 1 ml de hücre olacak şekilde 250 µl lik bir hücre süspansiyonu kriyotüp içerisine alındı ve üzerine aynı hacimde % 10 DMSO içeren kriyoprotektan ilave edilerek karıştırıldı. Kriyopreotektan hücre süspansiyonunun üzerine damla damla alındı ve nazikçe pipetlenerek hücre/kriyoprotektan karışımı elde edildi. Kriyotüp oda sıcaklığında fazla bekletilmeden sıvı azot buharında yarım saat tutulmak üzere alındı. Daha sonra sıvı azot tankında belirlenen raflara yerleştirildi Çözme Kriyobankta (sıvı azot tankında) bulunan kriyotüpler hızlı bir şekilde sıvı azottan çıkarılarak 37 0 C su banyosunda saniye içinde çözdürüldü. Kriyotüp içerisindeki hücrelerin üzerine besiyeri eklenerek içerisinde 5 ml %5 FBS içeren DMEM besiyeri bulunan 15ml lik santrifüj tüpüne aktarıldı ve 1200 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant uzaklaştırıldı ve Tripan mavisi solüsyonu ile boyanan canlı hücrelerin sayımı yapılarak canlılık oranı belirlendi. Pellet, flask başına hücre düşecek şekilde içerisinde 5ml %10 FBS içeren DMEM bulunan flasklara bölündü. Hücreler 37 0 C %5 CO 2 içeren etüvde inkübasyona bırakıldı Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin karakterizasyonu Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin mikroskobik olarak kolonijenik özelliğinin incelenmesi Dokudan hücre izolasyonunun yapılmasından itibaren her pasaj sonrası flask tabanına tutunan hücreler morfolojik olarak incelendi. Tipik kök hücre morfolojisi olan fibroblast benzeri hücrelerin varlığı ve devamlılığı takip edildi. Flask tabanında tutunan soliter (tek) hücrelerin CFU (colony forming unit) mikroskobik gözlemi ile 7 gün boyunca kültürde meydana gelen kolonilerin varlığı tespit edildi.

73 Farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi Kültür flaskı içinde konfluent olmuş (tabanı tamamen kaplamış) hücreler Tripsin/EDTA ile kaldırıldı. Flask tabanından ayrılan hücreler santrifüj edildi. Kontrol grubu, adipojenik farklılaşma grubu ve osteojenik farklılaştırma grupları için üçer adet center well kullanıldı. Öncelikle her bir center well içerisine hücre gelecek şekilde 2 ml kontrol medyumu ile ekim yapıldı. Hücrelerin kültür kabı tabanına tutunmaları ve çoğalmaları için üç gün 37 0 C de %5 CO 2 etüvünde inkübe edildi. İnkübasyon sonucunda hücrelerin üzerindeki kontrol medyumu uzaklaştırıldı ve iki kere PBS ile yıkama yapıldı. Adipojenik farklılaştırma grubu için 1mL adipojenik farklılaştırma medyumu, osteojenik farklılaştırma için 1mL osteojenik farklılaştırma medyumu ve kontrol grubu için 1mL kontrol medyumu ile hücrelerin besiyeri değiştirildi ve 37 0 C de %5 CO 2 etüvünde farklılaşma süresi boyunca inkübe edildi. Üç günde bir mikroskop altında takip edildi ve her gruba ait medyumlar ile besiyerlerinin değişimi yapıldı. Farklılaşma süresince bu işlemlere devam edildi Kontrol kök hücre kültürü Beşinci pasajdan elde edilen hücreler aynı fiziksel ve kimyasal şartlar altında ve farklılaştırılması yapılan hücre grubu ile aynı süre zarfında %10 FBS içeren DMEM ile kültüre edildi. Hergün mikroskobik olarak morfolojileri incelendi Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin adiposite (yağ hücresine) farklılaşması Yağ dokusundan hücre izolasyon işleminin ardından beşinci pasajdan elde edilen hücreler adipojenik farklılaştırma medyumu ile 2 hafta boyunca 3 günde bir besiyeri değiştirilerek inkübe edildi. 2 haftalık inkübasyon sonrasında hücrelerin üzerindeki medyum uzaklaştırıldı ve hücreler PBS ile 2 kere yıkandıktan sonra Oil Red O boyama solüsyonu ile boyamaları yapıldı. Boyama sonuçları mikroskobik olarak incelendi. Farklılaşmış kök hücrelerden oluşan adipositlerdeki lipid granüllerinin kırmızı renk ile boyadığı gözlendi Yağ dokusundan elde edilen hücrelerin osteosite (kemik hücresine) farklılaşması Yağ dokusundan hücre izolasyon işleminin ardından beşinci pasajdan elde edilen hücreler osteojenik farklılaştırma medyumu ile 4 hafta boyunca 3 günde bir besiyeri değiştirilerek

74 59 inkübe edildi. Kültürde kalın / sıkı bir hücre tabakasının oluştuğu mikroskobik olarak gözlendi. Üçüncü haftadan itibaren hücreleri üzerinde kalsiyum fosfat oluşumları nodüller şeklinde görülmeye başlandı İmmünhistokimyasal Yöntemler Alizarin Red S boyama Kültürde bulunan hücreler inkübatörden alındı. Kültür kabının tabanına tutunan hücrelerin üzerindeki osteojenik medyum uzaklaştırıldı. Hücreler PBS ile 2 kere yıkandı. Hücrelerin bulunduğu plak üzerine Alizarin Red S boyası eklendi ve 30 saniye 5 dakika (genellikle 2 dakika) oda sıcaklığında bekletildi. Mikroskobik olarak reaksiyon takip edildi. Boyama esnasında boyanın her yöne yayılması ve boyama reaksiyonunun hızlı gerçekleşmesi için hücrelerin bulunduğu plak çalkalandı. Ardından boya uzaklaştırıldı ve hücrelerin üzeri aseton ile kaplandı. Daha sonra aseton hücrelerin üzerinden uzaklaştırıldı ve 1/1 oranında aseton/ksilen karışımı ilave edildi. Bu karışım da uzaklaştırıldıktan sonra ksilen ile hücreler tekrar muamele edildi. Oda sıcaklığında kurutulan preparatın üstü gliserol ile kaplanarak mikroskobik olarak incelendi. Boyama sonunda kalsiyum birikintileri (oksalat dışında) portakal-turuncu bir renk aldı Oil Red O boyama Kültürde bulunan hücreler inkübatörden alındı. Nemlendirilmiş kurutma kağıdı üzerinde hücre üzerindeki adipojenik farklılaştırma medyumu uzaklaştırıldı. 2 ml PBS ile hücreler yıkandı. PBS uzaklaştırıldıktan sonra hücrelerin üzerine 2 ml %10 luk formalin eklendi ve oda sıcaklığında dakika bekletildi. Sonrasında formalin uzaklaştırıldı ve hücreler 2 ml distile su ile yıkandı. Hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa 2 ml %60 izopropanol eklendi ve 5 dakika beklendi. İzopropanol uzaklaştırıldıktan sonra kuyucuklara 2 ml Oil Red O çalışma solüsyonu eklendi. Tüm hücre yüzeyi boya ile kaplandı. Yaklaşık dakika sonra Oil Red O uzaklaştırıldı ve tüm yüzey musluk suyu ile renksizleşinceye kadar yıkandı. Ardından her bir kuyucuk 2 ml hematoksilin boya ile oda sıcaklığında 1 dakika bekletildi. Hematoksilin uzaklaştırıldıktan sonra hücreler musluk suyu ile renksizleşinceye kadar yıkandı. Kuyucuklar 2 ml musluk suyu ile doldurularak faz kontrast mikroskopta lipid granüllerinin kırmızı, genetik materyalinin ise mavi renk ile boyandığı gözlendi.

75 İmmünfenotipleme ile kök hücre tayini (Flow sitometrik analiz) Hücre yüzeyinde yer alan hücre belirteçleri analizi için flow sitometri kullanılarak MKH ler için CD90+ ve CD34- belirteçleri tespit edildi. Pasaj sonrası hücrelerin sayımı yapılarak 0,5x10 6 hücre üzerine 10 µl boya eklendi ve cihazda okutuldu Hücre yüzey belirteçlerinin flow sitometrik olarak okunması Kültürün 5. pasajında tripsinize edilerek flask tabanından kaldırılan AD-MKH ler kullanıldı. AD-MKH ler pasaj sonrası PBS ile yıkandı ve 5x10 5 hücre için CD 34 Mouse Anti-Human ve CD 90 Mouse Anti-Human dan 10 ar µl kullanıldı. 30 dakika oda sıcaklığında inkübasyondan sonra CellLab Quanta cihazı ile ölçümleri yapıldı Sonuçların değerlendirilmesi için kullanılan istatiksel yöntemler Elde edilen veriler SPSS istatistik programında değerlendirildi. Uyguladığımız farklı dondurma ve çözme sonrası tekniklerin birbiriyle olan ilişkilerini değerlendirmede eşli t-test kullanıldı. Anlamlılık seviyesi 0,05 olarak kabul edildi.

76 61 4. DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMALAR 4.1. Farklı Donörlerin Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin (AD-MKH) İzolasyonu ve Kültürde Adaptasyonunun İncelemesi Bu amaçla farklı zamanlarda farklı donörlerden elde edilen 6 doku örneğinden izole edilen ve kültürü yapılan hücreler aşağıda belirtildiği gibi incelenmiştir Donör 1: tarihinde Özel Medicana Hastanesinden laboratuvarımıza yağ dokusu örneği Bölüm 3.2 de belirtildiği gibi getirildi. 50 ml enjektör içinde 15 ml lipoasipirat steril şartlarda 50 ml falcon tüpe alındı. Örnek 1:1 oranında kolajenaz tip II (Sigma-Aldrich, C6885) solüsyonu ile karıştırılarak enzimatik reaksiyon başlatıldı. İzolasyon prosedürüne göre kolajenaz tip II solüsyonu ile dokunun enzimatik olarak parçalanması için dakika 37 0 C su banyosunda tutuldu. 50 ml falcon tüpün alt tabakasında oluşan hücre fazı pipet ile alınarak 15 ml falcon tüpe aktarıldı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen hücre pelleti süspanse edilerek Tripan mavisi ile sayım yapıldı. Flask içerisinde hücre olacak şekilde 3 farklı besiyeri ile (5-7 ml % 10 DMEM F12, IMDM ve DMEM) %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. 24 saatlik inkübasyon sonrasında hücrelerin kültür flaskı yüzeyine tutundukları mikroskobik olarak tespit edildi (Şekil 4.1) Şekil 4.1: Yağ dokusundan izole edilen hücre kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, 24. saat, 20X)

77 62 Şekil 4.1 de mikroskobik incelemede, flask yüzeyine tutunan hücrelerin fibroblast benzeri, sitoplazmalarının bipolar uzanan morfolojileri görülmektedir. Morfolojik inceleme sonucunda tutunan hücrelerin literatürde belirtilen AD-MKH morfolojisine benzer olduğu tespit edildi (Mizuno, 2009). % 10 FBS içeren DMEM (Şekil 4.2), IMDM (Şekil 4.3) ve DMEM/F12 (Şekil 4,4) ile kültürü yapılan yağ dokusundan elde edilen hücrelerin 3. ve 7. günde PBS ile yıkama sonrasında mikroskobik olarak incelendi. A B Şekil 4.2: Yağ dokusundan izole hücre kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, A.3. gün ve B. 7. gün, 10X) A B Şekil 4.3: Yağ dokusundan izole edilen hücre kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren IMDM, A. 3. gün, 10X ve B. 7. gün, 20X)

78 63 A B Şekil 4.4: Yağ dokusundan izole edilen hücre kültürünün mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM/F12, A. 3. gün, 10X ve B. 7. gün, 20X) Böylece %10 FBS içeren DMEM besiyeri kullanılan kültürde hücrelerin daha sağlıklı bir morfolojiye sahip olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.2). DMEM/F12 ve IMDM içerisinde kültürü yapılan hücrelerde ise daha az sayıda ve atipik morfolojiye sahip hücreler görünmektedir (Şekil 4.3 ve 4.4). Buna göre yağ dokusundan izole edilen MKH kültürünün % 10 FBS içeren DMEM besiyerinde yapılması uygun görülmüştür. Devamlı kültürü yapılmaya başlanan yağ dokusundan izole edilen hücrelerinin proliferasyonu sonucu flask yüzeyini kaplayan hücreler tripsinize edilerek pasajlandı (Şekil 4.5). Şekil 4.5: Tripsin eklenen kültür ortamında hücrelerin yüzeyden ayrılmaya başlaması (10X)

79 64 Şekil 4.5 te yağ dokusundan elde edilen hücrelerin kültür flask yüzeyini kapladıktan sonra tripsinize edilirken flask tabanından ayrıldıkları görülmektedir. Sitoplazmik uzantılarını kaybederek toparlanan, globüler bir yapı alarak yüzeyden ayrılan homojen bir hücre süspansiyonu elde edilmiştir. Heterojen bir hücre popülasyonu içeren yağ dokusundan izole edilen hücre kültürü yıkama, besiyeri değişimi ve pasajlamalar ile diğer heterojen hücre gruplarından arındırıldı. Özellikle 4. pasajdan sonra kültür flaskında homojen bir hücre grubunun olduğu görüldü. (Şekil4.6) Şekil 4.6: Yağ dokusundan izole edilen MKH (AD-MKH) kültürünün 4. pasajdan sonraki mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, 10X) Şekil 4.6 de görüldüğü gibi dördüncü pasajdan itibaren kültür içerisinde farklı hücre tiplerine rastlanılmamaktadır. Kültür flaskı içerisinde benzer morfolojiye ve sitoplazmik uzantılara sahip hücrelerin varlığı tespit edildi. Dördüncü pasajda ise yağ dokusundan izole edilen hücre kültüründe oluşan agregratlar gözlendi (Şekil 4.7).

80 65 A B Şekil 4.7: Yağ dokusundan izole edilen hücre kültüründe oluşan agregratların mikroskobik görüntüsü (%10 FBS içeren DMEM, 4. pasaj, 20X) Donör 1 den izole edilen yağ dokusundan izole edilen hücre lerin uzun süreli kültüründe hücrelerin morfolojik özelliklerini kaybettiği gözlendi (Şekil 4.8). Şekil 4.8: Uzun süreli kültürü yapılan yağ dokusundan izole edilen hücrelerin mikroskobik görüntüsü, (%10 FBS içeren DMEM, 12. pasaj, 20X) Böylece adipoz dokudan izole edilen hücrelerin devamlı kültürünün yapılması için en uygun besiyeri ortamının %10 FBS içeren DMEM besiyer olduğu, kültüre devam eden hücrelerin tipik kök hücre morfolojileri sergiledikleri ve koloni oluşturan hücrelerin varlığı ile kolonijenik özelliğe sahip olduğu gösterildi.

81 Donör 2: tarihinde Özel Medicana Hastanesinden yağ dokusu örneği laboratuvarımıza Bölüm 3.2 de belirtildiği gibi getirildi. 50 ml lik enjektör içinde 15 ml lipoasipirat steril şartlarda 50 ml falcon tüpe alındı. Örnek 1:1 oranında kolajenaz tip II (Sigma-Aldrich, C6885) solüsyonu ile karıştırılarak enzimatik reaksiyon başlatıldı. İzolasyon prosedürüne göre kolajenaz tip II solüsyonu ile dokunun enzimatik olarak parçalanması için dakika 37 0 C su banyosunda tutuldu. 50 ml falcon tüpün alt tabakasında oluşan hücre fazı pipet ile alınarak 15 ml falcon tüpe aktarıldı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen hücre pelleti süspanse edilerek Tripan mavisi ile sayım yapıldı. İçerisinde hücre olacak şekilde % 10 FBS içeren 5-7 şer ml DMEM ile flasklara alındı. Daha sonra %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. İzolasyon sonrası 48. saatte kültüre bakıldığında heterojen hücre grupları gözlendi. Yıkama sonrası flask yüzeyine tutunan fibroblast benzeri hücrelerin yanısıra adipositlerin varlığı da lipid granüllerinin gözlenmesiyle mikroskobik olarak tespit edildi (Şekil 4.9). Şekil 4.9: Yağ dokusundan hücre izolasyonu sonrası kültürün mikroskobik görüntüsü, oklar kültürde bulunan yağ hücrelerini göstermektedir (48. saat, 10X) Flask yüzeyine tutunmayan farklı hücre tipleri, yıkama ve pasajlama işlemleri sonrasında uzaklaştırıldı. Böylelikle tipik kök hücre morfolojisine sahip bipolar uzanan, fibroblast benzeri hücreler flask tabanına tutunarak proliferasyonlarına devam ettiler (Şekil 4.10). Prolifersayon hızı yüksek, düzgün morfolojiye sahip bir kültür elde edildi.

82 67 A B Şekil 4.10: Yağ dokusundan izole edilen hücre kültürünün mikroskobik görünümü, 10X (A. Pasaj sonrası 3. gün, B. Pasaj sonrası 5. gün konfluent olmuş hücre kültürü) Kültür flaskının yüzeyini kaplayan yağ dokusundan izole edilen hücreler pasajlanmak üzere Tripsin/EDTA ile tripsinize edildi. (Şekil 4.11). Şekil 4.11: Tripsin eklenen yağ dokusundan izole edilen hücrelerin mükroskobik görünümü, (10X) Donör 2 nin yağ dokusundan elde edilen hücrelerin 24 pasaja kadar devamlı kültürü yapıldı. Uzun süreli pasajı yapılan adipoz dokudan izole edilen hücrelerin kültüründe mikroskobik olarak atipik hücre morfolojileri gözlendi (Şekil 4.12). Hücre proliferasyonunda ise azalma olduğu tespit edildi.

83 68 A B C Şekil 4.12: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin uzun süreli kültür sonrasında mikroskobik görünümü, (A. 22. pasaj, B. 23. pasaj, C. 24. Pasaj, 10X) Donör 3: tarihinde Özel Medicana Hastanesinden laboratuvarımıza yağ dokusu örneği Bölüm 3.2 de belirtildiği gibi getirildi. 50 ml enjektör içinde 15 ml lipoasipirat steril şartlarda 50 ml falcon tüpe alındı. Örnek 1/1 oranında kolajenaz tip II (Sigma-Aldrich, C6885) solüsyonu ile karıştırılarak enzimatik reaksiyon başlatıldı. İzolasyon prosedürüne göre kolajenaz tip II solüsyonu ile dokunun enzimatik olarak parçalanması için dakika 37 0 C su banyosunda tutuldu. 50 ml falcon tüpün alt tabakasında oluşan hücre fazı pipet ile alınarak

84 69 15 ml falcon tüpe aktarıldı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen hücre pelleti süspanse edilerek Tripan mavisi ile sayım yapıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu flask içerisinde hücre olacak şekilde 5-7 ml % 10 DMEM içerisinde flasklara alındı. Daha sonra %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. 24 saat sonra izole edilmiş hücrelerin kültür flaskı tabanına adezyonları mikroskobik olarak tespit edildi. Bu donörden fazla sayıda hücre izolasyonu sağlandı. Elde edilen hücreler düzgün morfolojili fibroblast benzeri hücreler olup kültür ortamında 24 saat sonra belirgin şekilde gözlemlendi (Şekil 4.13) A B Şekil 4.13: Donör 3 ten elde edilen yağ dokusundan izole edilen hücrelerin izolasyon sonrası kültürdeki görünümü (24 saat sonra, 10X) Diğer donörlerden elde edilen yağ dokusundan izole edilen hücreler ile aynı şartlarda kültürü yapılan bu hücrelerin morfolojileri diğerlerine göre daha yaygın sitoplazma içeriyordu. İlerleyen pasajlarda Donör 3 ten elde edilen hücrelerin sitoplazmalarının daha geniş, nükleuslarının daha belirgin olduğu mikroskobik olarak gözlemlendi (Şekil4.14). Böylece buradan anlaşılacağı gibi farklı donörlerden elde edilen hücreler farklı az da olsa farklı morfoloji gösterdikleri tespit edildi.

85 70 A B Şekil 4.14: Donör 3 ten elde edilen AD-MKH lerin mikroskobik görünümü, (20X) Donör 3 ten elde ettiğimiz hücrelerin ilerleyen pasajlarında diğer donörlerden elde ettiğimiz yağ dokusundan izole edilen hücre kültürlerine benzer olarak atipik hücre morfolojileri mikroskobik olarak gözlendi (Şekil 4.15).

86 71 A B C D E F Şekil 4.15: Yağ dokusundan izole edilen hücre kültürünün ilerleyen pasajlardaki mikroskobik görünümü (A. B. C. ve D. 20X., E ve F 10X)

87 Donör 4: tarihinde Özel Medicana Hastanesinden laboratuvarımıza basen bölgesinden yağ dokusu örneği Bölüm 3.2 de belirtildiği gibi getirildi. 50 ml enjektör içinde 20 ml lipoasipirat steril şartlarda 50 ml falcon tüpe alındı. Örnek 1/1 oranında kolajenaz tip II (Sigma-Aldrich, C6885) solüsyonu ile karıştırılarak enzimatik reaksiyon başlatıldı. İzolasyon prosedürüne göre kolajenaz tip II solüsyonu ile dokunun enzimatik olarak parçalanması için dakika 37 0 C su banyosunda tutuldu. 50 ml falcon tüpün alt tabakasında oluşan hücre fazı pipet ile alınarak 15 ml falcon tüpe aktarıldı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen hücre pelleti süspanse edilerek Tripan mavisi sayım yöntemi ile Thoma lamında 3 milyon/ml hücre sayıldı. Daha sonra süspanse edilen hücreler flask içerisinde hücre olacak şekilde 5-7 ml % 10 FBS içeren DMEM ile flasklara alındı. Daha sonra %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. 24 saat sonra izole edilmiş hücrelerin kültür flaskı tabanına adezyonları mikroskobik olarak tespit edildi. Yüksek sayılı ve düzgün morfolojili fibroblast benzeri hücreler kültür ortamında 24 saat sonra belirgin şekilde gözlemlendi (Şekil 4.16). Diğer donörlerden elde edilen AD-MKH ler ile aynı şartlarda kültürü yapılan bu hücrelerin morfolojileri diğerlerine göre daha düzgündü. Proliferasyon hızları fazla ve kültüre adaptasyonları yüksekti. Şekil 4.16: Donör 4 ten elde edilen yağ dokusundan izole edilen hücrelerin izolasyon sonrası mikroskobik görünümü, (24. Saat, 10X).

88 Donör 5: tarihinde Özel Medicana Hastanesinden laboratuvarımıza göbek gölgesinden yağ dokusu örneği Bölüm 3.2 de belirtildiği gibi getirildi. 50 ml enjektör içinde 20 ml lipoasipirat steril şartlarda 50 ml falcon tüpe alındı. Örnek 1/1 oranında kolajenaz tip II (Sigma-Aldrich, C6885) solüsyonu ile karıştırılarak enzimatik reaksiyon başlatıldı. İzolasyon prosedürüne göre kolajenaz tip II solüsyonu ile dokunun enzimatik olarak parçalanması için dakika 37 0 C su banyosunda tutuldu. 50 ml falcon tüpün alt tabakasında oluşan hücre fazı pipet ile alınarak 15 ml falcon tüpe aktarıldı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen hücre pelleti süspanse edilerek Tripan mavisi sayım yöntemi ile Thoma lamında 4 milyon/ml hücre sayıldı. Daha sonra süspanse edilen hücreler flask içerisinde hücre olacak şekilde 5-7 ml % 10 DMEM içerisinde flasklara alındı. Daha sonra %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. 24 saat sonra izole edilmiş hücrelerin PBS ile yıkaması yapıldı, besiyeri eklendi ve kültür flaskı tabanına adhere olmuş hücreler mikroskobik olarak tespit edildi (Şekil 4.17). Şekil 4.17: Donör 5 ten izole edilen yağ dokusundan izole edilen hücrelerin izolasyon sonrası mikroskobik görünümü, oklar mezenkimal kök hücre morfolojisine sahip hücreleri göstermektedir (24. saat, 10X) Kültürde tipik morfoloji gösteren hücrelerin Donör 4 e benzer olarak yüksek proliferasyon gösterdikleri saptandı. İkinci pasaj öncesi konfluent olan hücrelerin mikroskobik görünümü Şekil 4.18 da verilmiştir. Donör 5 ten elde edilen AD-MKH ler 2. pasajlarında kriyoprezerve edildi.

89 74 Şekil 4.18: Donör 5 ten elde edilen yağ dokusundan izole edilen hücrelerin ikinci pasaj öncesi mikroskobik görünümü, (10X) Donör 6: tarihinde Özel Medicana Hastanesinden laboratuvarımıza yağ dokusu örneği Bölüm 3.2 de belirtildiği gibi getirildi. 50 ml enjektör içinde 17 ml lipoasipirat steril şartlarda 50 ml falcon tüpe alındı. Örnek 1/1 oranında kolajenaz tip II (Sigma-Aldrich, C6885) solüsyonu ile karıştırılarak enzimatik reaksiyon başlatıldı. İzolasyon prosedürüne göre kolajenaz tip II solüsyonu ile dokunun enzimatik olarak parçalanması için dakika 37 0 C su banyosunda tutuldu. 50 ml falcon tüpün alt tabakasında oluşan hücre fazı pipet ile alınarak 15 ml falcon tüpe aktarıldı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve elde edilen hücre pelleti süspanse edilerek Tripan mavisi sayım yöntemi ile Thoma lamında 2,6 milyon/ml hücre sayıldı. Daha sonra süspanse edilen hücreler flask içerisinde hücre olacak şekilde 5-7 şer ml % 10 FBS içeren DMEM ile flasklara alındı. Daha sonra %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. 24 saat sonra izole edilmiş hücrelerin kültür flaskı tabanına adezyonları mikroskobik olarak tespit edildi (Şekil 4.19). Elde edilen hücreler 24 saat sonra mikroskobik olarak incelendiğinde kültür flaskında lipid granüllerinin ve farklı hücrelerin yer aldığı görüldü. Mevcut olan bu heterojenite yıkama ve pasajlama işlemleri sonrasında giderildi.

90 75 A B Şekil 4.19: Donör 6 dan izole edilen yağ dokusundan izole edilen hücrelerin mikroskobik görünümü, oklar izolasyon sonrası kültürde yer alan lipid granüllerini göstermektedir (24. Saat, 10X) Yapılan flow sitometrik analiz sonucunda mezenkimal kök hücre yüzey belirteci olan CD90 ekpresyonunun % 95,97 pozitif, hematopoetik kök hücre yüzey belirteci olan CD34 ekspresyonunun ise %98,95 negatif olduğu belirlendi. Morfolojik olarak da homojen bir hücre grubu gözlendi (4.20, 4.21). A B Şekil 4.20: Donör 6 dan elde edilen yağ dokusundan izole edilen hücrelerin mikroskobik görünümü (3. pasaj, 10X)

91 76 A B Şekil 4. 21: Donör 6 dan elde edilen yağ dokusundan izole edilen hücrelerinin mikroskobik görünümü (A.4. pasaj, B. 5. pasaj, 10X) Donörlerin lipoasipirat örneklerinden izole edilen hücrelerin devamlı kültürü yapılarak mikroskobik olarak incelendi. Farklı donörlerden elde edilen hücrelerin morfolojik olarak farklılıklar göstredikleri ve proliferasyon yeteneklerinin de kültürden kültüre farklı kapasiteye sahip oldukları tespit edildi. Hücrelerin fibroblast benzeri, iğ şeklinde kök hücre karakterize şekilleri gözlendi. Elde edilen hücreler ile immünfenotipik ve farklılaşma potansiyellerinin tayini için diğer kök hücre karakterizasyon çalışmaları yapıldı Giemsa Boyama ile AD-MKH Morfolojisinin Mikroskobik Olarak Incelenmesi: Adipoz dokudan elde edilen MKH lerin Giemsa boyama ile morfolojileri incelendi. Altı kuyucuklu kültür kapları içerisine materyal metotta belirtildiği gibi AD-MKH ekimi yapıldı ve 2 günlük inkübasyon sonrasında tutunan hücreler Giemsa boyama tekniği ile boyandı. Örnekler invert mikroskop altında incelendi. AD-MKH sitoplazmasının pembe mor, hücre çekirdeğinin ise mavi mor menekşe rengi ile boyanması tipikti. AD-MKH lerin tipik denilebilecek kök hücre morfolojisi gösterdiği, fibroblast benzeri şeklinde olduğu Giemsa boyama ile de tespit edilmiş oldu. (Şekil 4.22)

92 77 Şekil 4.22: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin Giemsa boyamasının mikroskobik görünümü, (20X) Böylece insan adipoz dokusundan elde edilen MKH lerin morfolojileri Giemsa boyama ile de tespit edildi Yağ Dokusu mezenkimal kök hücrelerinin (AD-MKH) Mikrokültür Metodu (MKM) ile İzolasyonu ve Kültürünün Yapılması: Donör 2 den elde edilen AD-MKH ler ile daha az miktarda hücre gerektiren ve diğer hücre kültür metotlarından farklı olarak daha ucuz olan mikrokültür metodu (MKM) ile kültürü yapıldı. Materyal metotta belirtildiği gibi 25 cm 2 yüzey alanına sahip kültür flasklarında kültürü yapılan AD-MKH ler tripsinizasyon sonrasında ekim için 60 µl alınarak steril şartlar altında kapiler tüplere enjekte edildi (Şekil 4.23).

93 78 Şekil 4.23: AD-MKH lerin mikrokapiler içindeki mikroskobik görünümü (1. Saat, 40X) AD-MKH lerin kapiler tüp içinde 24. saatte yüzeye tutundukları ve prolifere oldukları görüldü (Şekil 4.24). Şekil 4.24: Yağ dokusu kök hücrelerin mikrokapiler tüp içindeki mikroskobik görünümü (24. saat, 40X) Bir sonraki MKM çalışmasında kapiler tüpün uçlarını açık bırakmak ve kapatmak üzere iki deney grubu hazırlandı. Materyal metotta belirtildiği gibi hücrelerin kapiler tüp içine ekimi gerçekleştirildi. Daha sonra deney gruplarından birinin tüp uçları bal mumu ile kapatılırken diğer grubun her iki ucu da açık bırakıldı.

94 79 Böylece mikroskobik olarak hücrelerin kültürdeki durumu incelendiğinde; kapalı uçlu kapiler tüpteki hücreler kapiler tüp yüzeyine tutunduğu gözlendi. Ancak uçları açık bırakılan tüpteki AD-MKH kültüründe hücrelerin tüp çeperine tutundukları görüldü (Şekil 4.25). Şekil 4.25: Yağ dokusu kök hücrelerinin mikrokapiler tüp içinde mikroskobik görünümü (A. Kapalı uçlu, B. Açık uçlu, 40X) Donörün yağ dokusundan izole edilen AD-MKH lerin in vitro kültürüne adaptasyonu yaş, cinsiyet ve lipoasipiratın elde edildiği bölgeye bağlı olarak farklılık göstermektedir (Aksu vd., 2008). Bu ise bazen AD-MKH lerin izolasyonu, adaptasyonu ve uzun süreli kültüre alınmasında problemlere yol açmaktadır. Buna göre de; biz bu çalışmamızda klasik kültür yöntemi ile kültürü zor yapılan donörlerden elde edilen kök hücreleri aynı zamanda mikrokültür yöntemi ile inceledik. Bu yöntem Allahverdiyev ve ark. (2005) tarafından ökaryot hücrelerin kültürünün yapılmasında kullanılmıştır. Bu yöntemin temeli, CO 2 ile zengin mikroaerofil ortamın olmasına, az sayıdaki hücrelerin salgıladıkları metabolit veya CO 2 nin hücre adaptasyonuna ve gelişmesine optimal ortamı temin etmesine dayanmaktadır. Buna göre de; biz çalışmamızda AD-MKH lerin mikro tüp içerisinde mikrokültürünü gerçekleştirdik. Bir hafta boyunca inkübe ettikten sonra daha büyük bir kültür kabına transfer ettik ve orada da çoğalan hücreleri flask içerisine aldık. Böylece çalışmamızda ilk kez olarak kültürü zor yapılan AD-MKH lerin adaptasyonu ve kültüre alınması için ilk aşamada mikro kültüre alınan hücrelerin uygun olduğunu belirledik.

95 Yağ Dokusundan İzole Edilen Hücrelerin İmmünfenotipik Olarak İncelenmesi: Yağ dokusundan elde edilen mononükleer hücrelerin materyal metotta belirtildiği gibi kültürü yapıldı. Kültürde bulunan hücrelerin immünfenotipik olarak karakterize edilmesi için flow sitometrik analiz yapıldı. Flow sitometri ile CD34 ve CD90 floresan antikorları kullanılarak hücrelerin immünofenotipik analizi yapıldı. Sayım sonrası 0,5x10 6 hücre/ml alınarak üzerine CD34 Mouse Anti-Human ve CD90 Mouse Anti-Human dan 10 ar µl eklendi. 30 dakika oda sıcaklığında inkübasyonundan sonra CellLab Quanta cihazı ile ölçümleri yapıldı. Analiz sonucunda AD-MKH lerin %98,94 ünün CD34 açısından negatif olduğu tespit edildi (Çizelge 4.1). Çizelge 4.2 de ise CD90 hücre yüzey belirteci bakımından yağ dokusundan elde edilen kök hücrelerin %95,97 sinin pozitiflik gösterdiği belirlendi. Çizelge 4.1: Yağ dokusu MKH lerinin flow sitometrik olarak CD34 analizi

96 81 Çizelge 4.2: Yağ dokusu MKH lerinin flow sitometrik olarak CD90 analizi Böylece insan adipoz dokusundan elde edilen hücrelerin MKH yüzey belirteci olan CD90 ekpresyonunun oldukça yüksek pozitif, hematopoetik kök hücre yüzey belirteci olan CD34 bakımından ise yüksek negatif ekpresyonu olduğu tespit edildi. bu çalışma için 0,5x10 6 hücre/ml kullanıldı. Morfolojik incelemelerde kök hücre özelliği gösteren bu hücre serisinin flow sitometrik olarak yüksek oranda MKH olduğu belirlenmiştir. Hematopoetik kök hücreler için pozitif sonuç veren CD34 bakımından AD-MKH ler oldukça zayıf çıkmıştır. Diğer taraftan MKH ler için pozitif olması gereken CD90 için ise yüksek oranda pozitiflik gösterdi. Bu çalışma için 0,5x10 6 /ml hücre kullanıldı. Hücre döngüsü sonuçlarına bakıldığında ise % 42,27 sinin G0/G1 fazında olduğu, %4,6 sının S fazında olduğu, %9,39 unun ise G2 fazında olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 4.3).

97 82 Çizelge 4.3: Yağ dokusu MKH lerinin flow sitometrik olarak hücre döngüsü analizi (5. pasaj) 4.5. AD-MKH lerin Histokimyasal Olarak İncelenmesi İnsan adipoz dokusundan elde edilen hücreler farklılaşmaya stimüle edildikten sonra histokimyasal yöntemler hücrelerin farklılaşmaları tespit edildi Yağ Doku Kök Hücrelerinin (AD-MKH) Adipojenik Farklılaşmasının Oil Red O ile Tayini: Yağ Dokusundan izole edilen MKH lerin dördüncü pasajında adipojenik farklılaştırma çalışması yapıldı. Elde edilen hücrelerin materyal metotta anlatıldığı gibi kültür flasklarından tripsinize edilerek 15 ml falcon tüpüne alındı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant uzaklaştırıldı ve pellet süspanse edilerek Tripan mavisi ile sayım yapıldı. Sayım sonrası içerisinde kolajen kaplı lamel bulunduran 3 adet center well içerisine hücre ekildi. % 10 FBS içeren DMEM ile üç gün %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. Üç gün sonra PBS ile 2 kere yıkaması yapılan hücrelerin üzerine 2 ml adipojenik farklılaştırma medyumu eklendi ve %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübasyona bırakıldı. Adipojenik inkübasyondan 24 saat sonra kültür içerisinde lipid granülü oluşumu mikroskobik olarak tespit edildi (Şekil 4.25).

98 83 A B Şekil 4.25: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü, ok lipid granülü oluşturan farklılaşmaya başlamış bir hücreyyi göstermektedir (24. Saat, A. Kontrol grup, 10X, B. adipojenik grup, 20X) Daha sonraki günlerde kontrol grubunda bir değişiklik olmazken adipojenik farklılaştırma besiyeri içeren gruptaki hücrelerde lipid granülleri oluşarak adipojenik diferansiyasyonun başladığı mikroskobik olarak gözlemlendi (Şekil 4.26). Şekil 4.26: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü, oklar adipositleri göstermektedir (A. 4. gün 10X, B. 5. gün, 20X). Adipojenik besiyeri ile 3-4 günde bir besiyeri değiştirilen kültürlerin inkübasyonuna devam edildi. Hücreler inkübe edildikçe kültürde bulunan adipositlerin (yağ hücresi) sayıları da arttı.

99 84 Şekil 4.27: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü, oklar adipositleri göstermektedir (11. Gün, A. 10X, B. 20X) Şekil 4.28: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin adipojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü (14. Gün, A. 10X, B. 20X) İnsan yağ dokusundan elde edilen MKH lerin adipojenik farklılaşma besiyeri ile kültürü sırasında 14 gün boyunca lipid granülleri oluşumu her gün artarak devam etti. 14. günde Oil Red O ile adipojenik kültürün histokimyasal boyaması yapıldı (Şekil 4.29).

100 85 Şekil 4.29: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin adipojenik farklılaşma sonrası Oil Red O boyamasının mikroskobik görünümü, (A. 10X, B, C ve D 20X) Oil Red O boyama sonrasında kültürde bulunan farklılaşmış hücrelerdeki lipid granülleri kırmızıya boyandılar. Hematoksilen ile boyanan nükleusların mavi-mor menekşe renk aldıkları mikroskobik olarak görüldü. Böylece insan AD-MKH lerin adipojenik farklılaşma besiyeri ile adiposite farklılaşma gösterdikleri ve oluşan lipid granüllerinin Oil Red O boyama ile karakterize edildiği tespit edildi Yağ Dokusundan İzole Edilen Hücrelerin Osteojenik Farklılaşmasının Alizarin Red S ile Tayini: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin dördüncü pasajından elde edilen hücreler ile osteojenik farklılaştırma yapıldı. Elde edilen hücrelerin materyal metotta anlatıldığı gibi kültür flasklarından tripsinize edilerek 15 ml falcon tüpüne alındı rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant uzaklaştırıldı ve pellet süspanse edilerek Tripan mavisi ile sayım yapıldı. Sayım sonrası içerisinde kolajen kaplı lamel bulunduran 3 adet her bir center well denilen hücre kültür kabı içerisine hücre ekildi. % 10 FBS içeren DMEM ile üç gün %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübe edildi. Üç gün sonra PBS ile 2 kere yıkaması yapılan hücrelerin üzerine 2 ml osteojenik farklılaştırma medyumu eklendi ve %5 CO 2 içeren 37 0 C lik etüvde inkübasyona bırakıldı. Osteojenik inkübasyondan 24 saat sonra kültürde bulunan hücreler mikroskobik olarak incelendi (Şekil 4.25).

101 86 Şekil 4.30: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin osteojenik farklılaşma sırasında mikroskobik görünümü, (24. Saat, A. Kontrol grup, 10X, B. osteojenik grup, 20X) Şekil 4.31: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin osteojenik farklılaştırma sırasında mikroskobik görünümü (48. Saat, A. Kontrol grup, 20X, B. osteojenik grup, 10X) Osteojenik farklılaşma grubunda yer alan hücreler gün gün mikroskobik olarak incelendiğinde sıkı bir hücre tabakası halinde görüldü (Şekil 4.32). Kültürde hücreler üzerinde kristal yapılar belirmeye başladı (Şekil 4.33).

102 87 Şekil 4.32: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin osteojenik farklılaştırmasının mikroskobik görünümü (10. gün, 10X ) Şekil 4.33: Yağ dokusundan izole edilen hücrelerin osteojenik farklılaştırmasının mikroskobik görünümü (14. gün, A. 20X, B. 10X) Böylece insan yağ dokusundan izole edilen hücrelerin osteojenik farklılaşma besiyeri ile osteojenik kalsiyumfosfat nodülleri oluşturduğu mikroskobik olarak görüldü. Alizarin Red S boyama ile görüntü alınamadı. Yağ dokusundan elde edilen kök hücrelerin karakterize edilmesi için çeşitli parametreler incelenmektedir. Bu parametrelerin incelenmesi için morfolojik, immünfenotipik yöntemler kullanılmakta ve hücrelerin farklılaşma potansiyelleri belirlenmektedir. Biz de çalışmamızda elde ettiğimiz hücrelerin MKH olup olmadığını belirlemek amacıyla bu kriterleri kullandık.

103 88 İncelenen bütün kriterlere göre elde ettiğimiz devamlı hücre kültürlerinin bütün çalışma süresinde AD-MKH olduğunu belirledik. Böyle ki ; morfolojik incelemede 6 farklı donörden elde edilen tüm kültürlerde aynı tipik kök hücre morfolojileri gösterdikleri belirlendi. Flow sitometrik analizde CD90 pozitif ve CD34 negatif sonuçlar elde edildi. Bu veriler de literatürde MKH ler için verilen bilgileri desteklemektedir Diğer önemli kriterlerden birisi de elde edilen MKH lerin adiposit ve osteositlere farklılaşma potansiyellerinin belirlenmesidir (Dicker vd., 2005; Bunnel vd., 2008). Biz de çalışmamızda yağ dokusundan elde ettiğimiz hücrelerin adiposite ve osteosite farklılaşma potansiyellerini inceledik. Bu konu ile ilgili literatürde çeşitli çalışmalar bulunmaktadır (Bunnel vd., 2008). Yapılan çalışmalar uygun olarak deneylerde yağ dokusundan elde ettiğimiz hücreleri kültürden alarak adipojenik ve osteojenik farklılaşma medyumları ile kültüre ettik. Adipojenik farklılaşma kültürün ikinci gününden itibaren mikroskobik olarak gözlenmeye başladı. Böylece literatürde belirtildiği üzere yağ dokusundan elde edilen hücrelerin adipositlere farklılaşmaları sonuçlarını onayladı (Mosna vd., 2010; Lin vd., 2010; Tremolada vd., 2010; Su ve 2010) Bir başka çalışmada osteosite farklılaştırmak için osteojenik medyum ile hücrelerin kültürü yapıldı (Gastaldi vd., 2010). Oluşan kalsiyum fosfat nodülleri mikroskobik olarak görüldü. Bu sonuçlar uzun süreli kültürü yapılan hücrelerden elde edildi. Böylece yağ dokusundan izole edilmiş ve uzun süreli kültürü yapılmış hücrelerin çeşitli parametrelere göre incelenmesi ile elde edilen sonuçlar, diğer araştırmacıların sonuçları ile desteklenmektedir İnsan Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin (AD-MKH) Kriyoprezervasyon Sonuçları: Yağ dokusundan elde edilen AD-MKH ler % 10 FBS içeren DMEM ile kültürü yapılırken 5. pasajda iken tripsinize edilerek 15 ml falcon tüp içerisine alındı ve santrifüj edildi. Bölüm da belirtildiği üzere ktriyoprezervasyonu yapıldı. AD-MKH ler 5 hafta sıvı azot içerisinde kriyoprezerve edildikten sonra çözdürüldü. Çözdürülen hücrelerin hücre canlılıkları Tripan Mavisi (TB) ve MTT yöntemleri ile belirlendi.

104 Tripan Mavisi ile Sayım Sonrası Hücre Canlılık Tayini: İnsan yağ dokusundan elde edilen MKH ler (AD-MKH) Bölüm 3.2 de anlatıldığı gibi izole edildikten sonra kültürü yapılmaya başlandı. Kültürde bulunan Farklı DMSO (%5, %10, %15) konsantrasyonları ve hücre sayıları (0,25x10 6, 0,5x10 6 ve 10 6 ) ile kriyoprezerve edilen yağ dokusundan elde edilmiş MKH ler (AD-MKH) 5 hafta sonra kriyobanktan çıkarıldı. Materyal metotta belirtildiği gibi yapılan çözdürme işlemi sonrasında Tripan mavisi hücre sayım yöntemi ile canlı hücre sayıları belirlendi (Çizelge 4.1). % 5 DMSO % 10 DMSO % 15 DMSO 0,25x10 6 hücre/ml % 66,66 % 80 % 66,66 0,5x10 6 hücre/ml % 75 % 100 % 83, hücre/ml % 94,73 % 94,4 % 89,47 Çizelge 4.1: Kriyoprezervasyon sonrası Tripan mavisi boyama ile hücre canlılık oranları. Tripan mavisi ile hücrelerin sayımı yapıldığında canlı hücreler hücre zarından boya geçirmeyerek parlak görünürken, ölü hücrelerin hücre zarından geçen boya ile ölü hücreler mavi-mor renk ile boyandılar. Sayım sonucu elde edilen değerler Çizelge.1 de verilmiştir.

105 90 Çizelge 4.1: Kriyoprezervasyon sonrası AD-MKH lerin Tripan mavisi yöntemi ile sayım sonuçları MTT yöntemi ile hücre canlılık analizi Farklı DMSO (%5, %10, %15) konsantrasyonları ve hücre sayıları (0,25x10 6, 0,5x10 6 ve 10 6 ) ile kriyoprezerve edilen yağ dokusundan elde edilmiş MKH ler (AD-MKH) 37 gün sonra kriyobanktan çıkarıldı. Çözdürme işlemi sonrasında elde edilen AD-MKH ler materyal metotta belirtildiği gibi MTT yöntemi için alındı ve hücrelerin canlılık analizi yapıldı. Çizelge.2 de AD-MKH canlılık oranları verilmiştir.

106 91 Şekil 4.34: Kriyobanktan çıkarılan AD-MKH lerin MTT yöntemi ile canlılık tayininde formazan kristallerinin mikroskobik görünümü (10X) Çizelge 4.2: Kriyoprezervasyon sonucunda AD-MKH lerin MTT sonuçları