DOĞAL (YEREL) Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ve Lactobacillus

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ DOĞAL (YEREL) Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SUŞLARINDA ENDÜSTRİYEL ÖNEME SAHİP ÖZELLİKLERİN ARAŞTIRILMASI ŞEYDA ÖZYURT GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2005 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi DOĞAL (YEREL) Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SUŞLARINDA ENDÜSTRİYEL ÖNEME SAHİP ÖZELLİKLERİN ARAŞTIRILMASI Şeyda ÖZYURT Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Nezihe TUNAİL Bu çalışmada, 43 adedi pastörize, 30 adedi çiğ sütlerden izole edilmiş ve 10 adedi endüstriyel olmak üzere toplam 83 adet Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (S. thermophilus) ve 12 adedi pastörize sütlerden, 22 adedi çiğ sütlerden izole edilmiş Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb. bulgaricus) yerel suşları ile 5 adet miks yoğurt kültürü kökenli ve 1 adet referans suş olmak üzere toplam 40 adet Lb. bulgaricus suşu ile çalışılmıştır. Bu suşların fajlara direnç, asit üretim yeteneği, antibakteriyel aktivite, asetaldehit üretimi ve proteolitik aktivite gibi endüstriyel öneme sahip özellikleri belirlenerek alternatif starter olarak kullanılabilmeleri araştırılmıştır. Yerel S. thermophilus suşlarının test edilen çiğ süt orijinli 9 adet yerel faja karşı çok dirençli olmaları suşların starter olma potansiyellerinin yüksek olduğunu göstermiştir. Yerel ve endüstriyel Lb. bulgaricus suşları ise kendi türünün yerel fajlarına çok duyarlı iken Lb ve Lb suşları yerel fajlara karşı tam direnç göstermiştir. Ayrıca 73 S. thermophilus suşundan sadece St. MR27a, yerel ve endüstriyel Lb. bulgaricus suşlarında ise sıklıkla cinsler arası heterolog konakçı özelliğinin sergilendiği saptanmıştır. S. thermophilus suşlarından hem asitlik gelişimi hem de faja dirençlilik ele alınınca St. TH-3, St 217, St 229, St 545, St 411, St 481, St. 3.3, St. 23.1, St. 24b, St suşları dikkati çekerken; pastörize süt kökenli Lb. bulgaricus suşlarının faja duyarlılıkları ve düşük ph değeri sergilemeleri starter potansiyeline sahip olamadıklarını gösterirken çiğ süt kökenli suşlardan Lb. 2001, Lb. 3702, Lb ve referans suşun (Lb ) kısmen de olsa bu iki özellik bakımından starter olabileceği sonucuna varılmıştır. Endüstriyel S. thermophilus suşlarından St.V1, St.V2, St. Y1, St. Y4 üstün nitelikli starter olarak tanımlanırken Lb. bulgaricus endüstriyel suşlarından Ch-Lb-12 ile Lb. 231 kısmen starter potansiyeli sergilemişlerdir. Bu çalışmada antimikrobiyel aktivite, suşların sıvı kültürlerinin kullanıldığı kuyu difüzyon ve suşların kültür süpernatantlarının kullanıldığı agar difüzyon testleri ile iki duyarlı suş kullanılarak yürütülmüş olmasına karşın sonuçlar tatmin edici bulunmamış ve suşların antibakteriyel aktivitelerini zaman içinde kaybettikleri veya büyük oranda yitirdikleri saptanmış ve aktivitesi belirlenen suşların probiyotik amaçlı bakteriyosin çalışmalarında denemeye alınabileceği sonucuna varılmıştır. Antibakteriyel aktivite gibi suşların asetaldehit üretimlerini de zaman içinde yitirdikleri belirgin şekilde gözlenmesine rağmen hem S. thermophilus hem de Lb. bulgaricus suşları arasında ihtiyaca cevap verecek nitelikte suşlar bulunmuştur. Lb. 2001, Lb ve Lb suşlarının sırası ile 22,00 ppm, 14,30 ppm ve 22,00 ppm asetaldehit üretim değerleri ile starter kültür olma potansiyellerini korudukları görülmektedir. Lb. bulgaricus suşlarından çok küçük değerler gösterenlerin dışında hepsinin proteolitik yetenek açısından starter potansiyeline sahip olduğu; S. thermophilus suşlarında da en düşük ve en yüksek 0,001 ve 0,453 mg tirozin/5ml değerleri dışında tüm suşların kombinasyonlarında kullanılabileceği belirlenmiştir. Sonuç olarak yerel S. thermophilus suşlarından St 229 un tüm kriterlere yanıt verdiğini ve St. 3.3 ün ise antibakteriyel aktivite hariç diğer kriterlere uyduğunu; yerel Lb.bulgaricus suşlarından da Lb. 2001, Lb ve Lb suşlarının starter olmaya en uygun suşlar olduğunu söylemek mümkündür. 2005, 109 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, starter i

3 ABSTRACT Master Thesis INVESTİGATİON ON NATİVE (DOMESTİC) Streptococcus salivarius subsp. thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, STRAİNS REGARDİNG THEİR İNDUSTRİALLY İMPORTANT CHARACTERİSTİCS Şeyda ÖZYURT Ankara Universıty Graduate School of Natural and Applied Sciences Department Of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Nezihe TUNAİL In this study, 83 Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (S. thermophilus) (43 isolated from pasteurised milk samples, 30 isolated from raw milk samples and 10 industrial strains) and 40 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb. bulgaricus) (12 isolated from pasteurised milk, 22 isolated from raw milk, 5 originated from mix yoghurt culture and 1 reference strain) were used. Starter culture potentials of these strains were investigated by determining some industrially important properties such as phage resistance, acid production ability, antimicrobial activity, acetaldehyde production and proteolytic activity. High resistance of native S. thermophilus strains against to 9 native phages isolated from raw milk showed that these strains have high starter culture potential. Native and industrial Lb. bulgaricus strains were very sensitive to native phages of the same species, where as Lb 2001 and Lb 6007 strains displayed exact resistance to native phages. Additionally, it was determined that of the 73 S. thermophilus strains only St. MR27a and most of the industrial Lb. bulgaricus strains have heterologous host property between the genera. Evaluation of the acid production ability and phage resistance results showed that 10 S. thermophilus strains (St. TH-3, St.217, St 229, St 545, St 411, St 481, St.3.3, St.23.1, St. 24b, St.26.5) have high starter culture potential for these properties, whereas Lb. bulgaricus strains isolated from pasteurised milk were not found as potential starter cultures due to their sensitivity to phages and low ph values. On the other hand, of the raw milk originated strains Lb 2001, Lb 3702, Lb 5002 and the reference strain (Lb 11842) showed starter culture potential partially for these two properties. Of the industrial strains, St.V1, St.V2, St. Y1, St. Y4 were described as high-qualified starter cultures, in contrast, of the industrial Lb. bulgaricus strains Ch-Lb-12 and Lb 231 showed partially starter potential. Although the antimicrobial activity tests were performed with 2 sensitive strains by well diffusion assay using whole cultures and agar diffusion assay using cell-free supernatants, the results were not found satisfying and it was determined that the strains lost their antimicrobial activity on a grate rate. Therefore, it was concluded that the strains showed antimicrobial activity could be used in the investigations related to bacteriocin. Similarly to antimicrobial activity, it was observed that the strains lost their acetaldehyde production ability gradually. However, there were found some strains, which can produce enough acetaldehyde both in S. thermophilus, and Lb. bulgaricus strains. The acetaldehyde amounts produced by Lb 2001, Lb 3702 and Lb 5002 strains were measured as 22.00, and ppm, respectively. It was revealed that most of the Lb. bulgaricus strains have starter culture potential for proteolytic activity, except the several strains that showed very low values. On the other hand, all of the S. thermophilus strains could be used in starter culture combinations, except the ones that showed the lowest (0.001 mg tyrosine/5ml) and the highest (0.453 mg tyrosine/5ml) values. As a conclusion, S. thermophilus St.229 strain was found suitable for all of the criteria, where St. 3.3 was found proper for the criteria except the antimicrobial activity. Also, it could be said that Lb 2001, Lb 3702 and Lb 5002 native Lb. bulgaricus strains are the most convenient strains for using as starter. 2005, 109 pages Key Words: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, starter ii

4 TEŞEKKÜR Tez çalışmamın her aşamasında, tüm vaktini ve desteğini esirgemeden bana yardımcı olan değerli hocam Prof. Dr. Nezihe TUNAİL e, manevi desteğini her zaman hissettiren sevgili hocam Prof.Dr. Kamuran AYHAN a, tüm bu yoğun zamanlarımdaki yardımları için Emel KAHRAMAN a, Serap COŞANSU ya, Esra ACAR a ve Mustafa GAYRETLİ ye, anlayışları, dostlukları ve destekleri için Osman Bukan FİLİZ, Erol ARIK, Serhat KARACA ve her zor zamanımda varlığını hiç esirgemeyen sevgili Can ATEŞ e ve maddi manevi sekiz yılın her anında desteklerini, yardımlarını esirgemeyen sevgili annem, babam ve ablama; çok değerli teyzem ve enişteme sonsuz sevgi ve saygılarımı sunmayı bir borç bilirim. Şeyda ÖZYURT Ankara, Ekim 2005 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii ŞEKİLLER DİZİNİ... v ÇİZELGELER DİZİNİ... vi 1.GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Yoğurt Starter Kültürlerinin İşlevi ve Simbiyotik İlişki S.thermophilus ve Lb.bulgaricus un Genel Özellikleri Yoğurt Starter Bakterilerinin Endüstriyel Açıdan Önemli Özellikleri MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bakteriler Bakteriyofajlar Yöntem Faja direncin belirlenmesi Lb.bulgaricus suşlarında faja direnç S.thermophilus suşlarında faja direnç Lb.bulgaricus suşlarının ve fajlarının saklanması S.thermophilus suşlarının ve fajlarının saklanması Bakterilerin asidifikasyon aktivitelerinin saptanması Bakterilerin antibakteriyel aktivitelerinin belirlenmesi Kuyu difüzyon testi Agar difüzyon testi Kontrollerin hazırlanması İndikatör bakterilerin hazırlanması Bakterilerin asetaldehit üretim yeteneklerinin belirlenmesi Bakterilerin proteolitik aktivitelerinin belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Suşların Fajlara Dirençleri Asit Aktivitesi Antibakteriyel Aktivite Asetaldehit Üretimi Proteolitik Aktivite SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR EK-1 ARAŞTIRMADA KULLANILAN BESİYERLERİ ÖZGEÇMİŞ iv

6 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1 Agar Difüzyon Testi ile St 219 ve St 239 suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.2 Kuyu Difüzyon Testi ile St. 1.2 suşunun M. luteus üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.3 Agar Difüzyon Testi ile St. 1.2 suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.4 Kuyu Difüzyon Testi ile St. 7.1 suşunun M. luteus üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.5 Agar Difüzyon Testi ile St suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.6 Agar Difüzyon Testi ile Lb.5006 ve Lb.6007 suşlarının Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.7 Agar Difüzyon Testi ile St ve 1.2 suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.8 Agar Difüzyon Testi ile St. 1.2 ve St.7.7 suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.9 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. Y4, Lb 132 ve Lb suşlarının S.enteritidis üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.10 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. 406, Lb. 4603, Lb ve Lb suşunun S.enteritidis üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.11 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb suşlarının S.enteritidis üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.12 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. 406, Lb. 4603, Lb ve Lb suşunun S.aureus üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.13 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb suşunun L. monocytogenes üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.14 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb. 6007suşunun L. monocytogenes üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.15 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb suşunun E.coli O157 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.16 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb.4007 suşunun E. coli O157 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.17 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. 406 ve Lb.4603 suşunun E. coli O157 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri v

7 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Finlandiya peynir işletmelerinden izole edilen S. thermophilus fajlarının homolog ve heterolog konakçıları ile adsorbsiyon ve plak etkinliği ilişkileri Çizelge 2.2 S. thermophilus fajlarının endüstriyel suşlara karşı gösterdikleri litik aktivite Çizelge 2.3 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ve Lb. delbrueckii subsp. lactis fajları, konakçıları ve diğer konakçılara özgüllükleri Çizelge 4.1 Pastörize sütler (43 adet) ile çiğ sütlerden (30 adet ) izole edilen ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının çiğ süt orijinli S. thermophilus ve Lb. bulgaricus fajlarına duyarlılıkları Çizelge 4.2 Pastörize (12 adet) ve çiğ sütlerden (22 adet) izole edilen ve endüstriyel Lb.bulgaricus suşlarının çiğ süt orijinli S.thermophilus ve Lb.bulgaricus fajlarına duyarlılıkları 47 Çizelge 4.3 Pastörize sütlerden izole edilen (43 adet) ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının asit aktivite test sonuçları Çizelge 4.4 Çiğ sütlerden izole edilen (30 adet) ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının asit aktivite test sonuçları Çizelge 4.5 Pastörize sütlerden izole edilen (12 adet) ve endüstriyel kökenli (5 adet) Lb. bulgaricus suşlarının asit aktivite test sonuçları Çizelge 4.6 Çiğ sütlerden izole edilen (22 adet) ve endüstriyel kökenli (5 adet) Lb. bulgaricus suşlarının asit aktivite test sonuçları Çizelge 4.7.Pastörize sütlerden izole edilen ve endüstriyel S. thermophilus suşlarının Micrococcus luteus ve yerel Lactobacillus bulgaricus 6301 üzerindeki antibakteriyel aktiviteleri Çizelge 4.8 Çiğ sütlerden izole edilen ve endüstriyel S. thermophilus suşlarının Micrococcus luteus ve yerel Lactobacillus bulgaricus 6301 üzerindeki antibakteriyel aktiviteleri Çizelge 4.9 Pastorize sütlerden (12 adet), çiğ sütlerden (22 adet) izole edilen ve endüstriyel kökenli (5 adet) Lb. bulgaricus suşunun antibakteriyel aktivitesi Çizelge 4.10 S. thermophilus suşlarının Gram pozitif ve Gram negatif patojen bakteriler üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Çizelge 4.11 Lb. bulgaricus suşlarının Gram pozitif ve Gram negatif patojen bakteriler üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Çizelge 4.12 Pastörize sütlerden (14 adet) ve çiğ sütlerden (10 adet) izole edilen yerel S. thermophilus suşları ile endüstriyel kökenli (7 adet) S. thermophilus suşlarının asaetaldehit üretimleri Çizelge 4.13 Pastörize sütlerden (12 adet) ve çiğ sütlerden (10 adet) izole edilen yerel Lb. bulgaricus suşlarının asaetaldehit üretimleri Çizelge 4.14 Pastörize (St 216- St 545) ve çiğ süt (St St. TH-3) orijinli yerel ve endüstriyel S. thermophilus suşlarının proteolitik aktiviteleri Çizelge 4.15 Pastörize (Lb 132-Lb 1472) ve çiğ süt (Lb. 412-Lb.6502) orijinli yerel ve endüstriyel Lb. bulgaricus suşlarının proteolitik aktiviteleri vi

8 1. GİRİŞ Yoğurtta aranan en önemli özellikler yapı, tat, aroma, koku ve görünüş olarak sıralanabilir ve bu özellikleri etkileyen faktörler arasında; ham maddenin kalitesi, toplam kuru madde, ham maddedeki protein içeriği, asitlik, katkı maddeleri, kullanılan starter kültürlerin özellikleri ve inokülasyon oranları yer alır. Değişik fermente ürünlerin üretiminde olduğu gibi yoğurt sanayiinde de starter kültür kullanımı modern teknolojinin vazgeçilmez bir uygulamasıdır. Yoğurt, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (S. thermophilus) ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb. bulgaricus) laktik asit bakterilerinin (LAB), sütü fermente etmesiyle oluşan bir süt ürünüdür. Ülkemizde ileri teknoloji uygulayan işletmeler yoğurt üretimi sırasında starter kültür olarak yurt dışı kaynaklı ticari yoğurt kültürlerini, küçük işletmeler ve aile işletmeleri ise modern işletmelerin ürettikleri yoğurtları, starter olarak kullanmaktadır. Yurt dışı kaynaklı ticari starter kültürler farklı özelliklere sahip suşlardan oluşmakta ve suş farklılıkları yoğurt kalitesine önemli ölçüde yansımaktadır. S. thermophilus yoğurdun dışında pıhtısına ısıl işlem uygulanan İtalyan ve İsviçre tipi peynirlerin yapımında da başka türlerle kombine edilerek kullanılır. Yoğurt starterlerini oluşturan suşların asit üretim yeteneklerinin yüksek, asit oluşturmalarının da hızlı olması arzulanır. Ürün oluşumu sırasında oluşan laktik asit, kazein misellerinin kararlılığına bir başka ifade ile kazeinin koagülasyonuna etkili olduğu gibi mikroorganizmaların üretimleri olan antimikrobiyel maddeler eşliğinde, patojenlerin, enterik patojenlerin ve bozulmaya neden olan mikroorganizmaların gelişmelerini de engeller veya baskılar. Yoğurt tat, koku ve aromasının oluşmasına yoğurt bakterileri tarafından ortama salınan metabolitler etkendir. Yoğurdun son tadına asetaldehit yanında; serbest yağ asitleri, aminoasitler, aseton, diasetil, ketohidroksi asitlerin de katkı yaptığı kabul edilmekle beraber 1

9 içlerinden hiçbiri asetaldehit kadar önemli değildir. Yoğurda karakteristik aromasını kazandıran asetaldehit genellikle ortam ph sı 5,0 e ulaştığında oluşmaya başlar. Yoğurtlarda asetaldehit miktarı, starter olarak seçilen suşların asetaldehit üretim yeteneklerine bağlı olarak 2-40 ppm (mg/kg) düzeyinde bulunur. Yoğurtta asetaldehit üretiminden daha fazla Lb. bulgaricus sorumlu tutulmaktadır. Yoğurtlarda asetaldehit miktarına ilişkin çeşitli veriler olmakla birlikte genellikle kaliteli bir yoğurdun ppm arasında asetaldehit içermesi arzulanır. Starter suşlar hem asit üretim yeteneği, hem de asetaldehit üretimi açısından tasnif edilmektedir. Farklı ağız lezzetlerine göre orta hızda asitlik geliştiren suşlar veya orta kuvvetle yoğurt tadı için daha düşük asetaldehit üreten suşlar da starter firmalarının sunumları arasında bulunmaktadır. S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşları yoğurt starteri olarak seçilirken bir başka kriter de onların proteolitik aktiviteleridir. Olgunlaşma süresi uzun süren sert peynirlerin yapımında proteolitik aktivitesi yüksek suşlar tercih edilirken yoğurt yapımında yüksek proteolitik aktiviteli suşlardan, yoğurtlarda acı lezzete neden olabilecekleri için kaçınılır. Yoğurt üretiminde kullanılan S. thermophilus ve Lb. bulgaricus arasında simbiyotik bir ilişki vardır. Bu simbiyotik ilişki de en fazla proteoliz sürecinde görülür. Yoğurt yapılacak sütte iki bakteri oranı çoğunlukla korunmasına karşın ortamda öncelikle çok daha düşük proteoliz yeteneğine sahip S. thermophilus gelişir. Bu bakteri gelişimi için gerekli azot kaynağını sütte doğal olarak bulunan ve sıcaklık uygulaması nedeniyle hidroliz sonucu miktarları biraz daha artan aminoasitlerinden sağlar. Ancak bazı aminoasitlerin düzeyi S. thermophilus un gelişimine yetecek düzeyde değildir. Bu eksikliği Lb. bulgaricus giderir. S. thermophilus bir miktar asitliği geliştirerek kendisine uygun ortam hazırladığından Lb. bulgaricus gelişmeye başlar ve özellikle β-kazeini peptitlere hidrolize eder, bu hidrolizasyon için partiküle bağlı proteinaz enzimine sahiptir. Ancak Lb. bulgaricus un da eksiği sınırlı peptidaz aktivitesi göstermesidir. Bu aşamada S. thermophilus devreye girerek peptidaz aktivitesiyle serbest aminoasitlerini hem kendisi için oluşturur hem de gerektiğinde Lb. bulgaricus un hizmetine sunar. Görüldüğü gibi suşlarda aranan proteoliz yeteneği daha fazla suşların simbiyoz yaşamını kolaylaştırmak içindir. Yüksek proteoliz gösteren suşlar acı lezzet veren bazı pepetidlerin fazlaca oluşmasına neden olacağından güçlü proteoliz yeteneğindeki suşlardan kaçınılır. Sonuç olarak yoğurt starteri olarak suş seçiminde yüksek asidifikasyon, yüksek asetaldehit 2

10 üretimi, kuvvetli antibakteriyel aktivite istenirken, düşük-orta düzeyde proteoliz yeteneği aranır. Ülkemizde yoğurt işletmeleri dış kaynaklı ticari kültürlere yönelmişken neden yerel alternatif suşlara gereksinme duymaktadır? Sorunun yanıtı faj (Φ) problemiyle ilgilidir. Endüstriyel öneme sahip özelliklerden birisi ve belki de en önemlisi suşların fajlara direnç durumlarıdır. Fajlara duyarlı suşlar ürün kalitesini düşürdüğü gibi kuvvetli faj ataklarında ürünü oluşturamazlar ve işletmelerin ekonomik kayıplara uğramalarına neden olurlar. Starter kültür üreten firmalar işletmelerde kullanılacak kültür rotasyon programı için, faj akrabalığı olmayan dirençli suşları belirleyip yoğurt işletmelerine öneriyorlarsa da bazen bu suşlar işletmelerde yerleşik dominant yerel fajlar tarafından enfekte edilebilmekte dolayısıyla işlevlerini yapamamaktadırlar. Bunun nedeni dış firma koleksiyonunda bulunan faj çeşidine göre dirençliliğin saptanmış olması ve faja dirençli suşların yerel fajlara karşı aynı direnci gösterememeleridir. O nedenle yerel faj koleksiyonuna göre faj dirençlilikleri saptanmış ve faj akrabalığı olmayan yerel kültürlerin işletmelerin sürekli faj atakları sürecinde alternatif kültürler olarak rotasyona sokulmaları önem kazanmaktadır. Rotasyona girecek bu suşların fizyolojik verimliliklerinin ise önceden kanıtlanmış olması gerekmektedir. Yapılan bu tez çalışması A. Ü. Biyoteknoloji Enstitüsü 67 nolu Doğal (yerel) Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (S. thermophilus) ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb. bulgaricus) suşlarında endüstriyel öneme sahip özelliklerin araştırılması konulu projenin bir bölümüdür. Projede; 30 u çiğ, 43 ü pastörize sütlerden izole edilmiş, 10 u endüstriyel starter kökenli 83 adet S. thermophilus ve yine 22 si çiğ süt, 12 si pastörize sütlerden izole edilmiş, 5 i endüstriyel starter kökenli ve 1 adet referans suşun da (Lb. bulgaricus ATCC) dahil olduğu 40 adet Lb. bulgaricus olmak üzere toplam 123 suş ile çalışılmaktadır. Faj spektrumlarının belirlendiği çalışmalarda; yoğurt, bulk, ayran, peynir altı suyu (PAS) örneklerinden izole edilmiş 23 adet S. thermophilus fajı, 25 adet Lb. bulgaricus fajı ve son olarak çiğ sütlerden izolasyonları başarılan 9 adet faj (2 adedi S. thermophilus fajı, 3

11 7 adedi Lb. bulgaricus fajı) olmak üzere 57 adet faj kullanılmaktadır. Projede ayrıca tüm suşlarda lizogeni araştırılmakta, faj parametreleri belirlenmekte ve fajların moleküler düzeyde tanımlanmaları yapılmaktadır. 123 suşun, endüstriyel öneme sahip özelliklerinden; faja direnç, asit üretimi, proteolitik aktivite, asetaldehit üretimi ve antibakteriyel aktivitenin belirlenmesi sunulan bu tezin konusunu oluşturmaktadır. 123 suşun yaklaşık yarısını oluşturan çiğ süt izolatı olan 65 suşun bu özellikleri daha önce Tübitak-Tarp 2106 nolu proje kapsamında belirlenmiştir. Yaklaşık diğer yarısını oluşturan pastörize süt kökenli 58 suştan ise sadece 30 unda asitlik ve proteolitik aktivite değerleri belirlenmiş, bazı seçilen suşlarla oluşturulan starter kombinasyonlarında da asetaldehit üretimlerine bakılmıştır. Bu tezde bazı özellikler belirlenmiş olsun veya olmasın koleksiyona alınan tüm yoğurt bakterilerinin (123 suş) standart koşullarda standart yöntemlerle endüstriyel öneme sahip özelliklerinin saptanması ve daha önce belirlenmiş olanlarda da zamana bağlı kayıpların ortaya konması amaçlanmıştır. Faj-konakçı özgüllüklerinin belirlenmesi çalışmaları projede çok geniş tutulduğundan bu tez kapsamında 123 suşun yalnızca; 2 si S. thermophilus fajı ve 7 si Lb. bulgaricus fajı olan ve faj koleksiyonuna en son katılan 9 adet çiğ süt kökenli faja dirençleri araştırılmıştır. Suşların faj direnç durumları ve alternatif starter potansiyelleri değerlendirilirken doğal olarak onların Tübitak-Tarp 2106 nolu projede belirlenen litik şablonlarından ve diğer özelliklerinden de yaralanılmış, faj dirençlilikteki ve diğer fizyolojik değişimler de dikkate alınarak daha geniş bir bakış açısı ile değerlendirilmeye gidilmiş, daha gerçekçi sonuç ve öneriler ortaya konmuştur. Endüstriyel öneme sahip özelliklerden olan antibakteriyel aktivite tüm LAB de aranan bir özellik olmakla birlikte suşların bu yönden araştırılması, onların alternatif starter potansiyellerinin ortaya çıkarılmasının yanı sıra ileride yapılacak olan bakteriyosin çalışmalarına dolayısıyla probiyotik potansiyellerine ışık tutmak amacını da taşımaktadır. 4

12 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Yoğurt Starter Kültürlerinin İşlevi ve Simbiyotik İlişki Değişik fermente ürünlerin üretiminde olduğu gibi yoğurt sanayiinde de starter kültür kullanımı modern teknolojinin vazgeçilmez bir uygulamasıdır. Yoğurt, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (S. thermophilus) ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb. bulgaricus) laktik asit bakterilerinin (LAB), sütü fermente etmesiyle oluşan bir süt ürünüdür (Rasic and Kurmann 1978, Sozzi and Smiley 1980, Mitchell and Sandine 1984, Raya et al. 1986, Abu-Tarboush 1996, Shihata and Shah 2000, Sodini et al. 2000, Navarini et al. 2001, Binetti et al. 2002, Chaves et al. 2002). Sütün starter kültürle inoküle edilmesinden sonra paketlenip inkübasyona bırakılmasıyla SET tipi, starter kültürle inokülasyon ve inkübasyon sonrasında karıştırılmasıyla da STİRRED tipi yoğurt elde edilmektedir (Riemelt et al. 1996, Tekinşen 1997, Sezgin 2000). Ülkemizde ileri teknoloji uygulayan işletmeler yoğurt üretimi sırasında starter kültür olarak yurt dışı kaynaklı ticari yoğurt kültürlerini, küçük işletmeler ve aile işletmeleri ise modern işletmelerin ürettikleri yoğurtları, starter olarak kullanmaktadır. Yurt dışı kaynaklı ticari starter kültürler, farklı özelliklere sahip suşlardan oluşmakta ve suş farklılıkları yoğurt kalitesine önemli ölçüde yansımaktadır (Yılmaz 2002). Süt endüstrisinde yoğurt starteri olarak kullanılan Lb. bulgaricus ve S. thermophilus, termofilik karakterli olup uygun şartlarda süte aşılandıklarında sütteki laktozu fermente ederek oluşturdukları laktik asitle sütün asitliğini geliştirir ve ph yı düşürürler. Gelişen 5

13 asitlik süt kazeininin koagulasyonuna ortam hazırladığı gibi, yoğurt aroma maddelerinin oluşumunu da başlatır. Yoğurdun karakteristik tat ve aromasına, başta asetaldehit ve laktik asit yanında aseton, etanol, diasetil ve diğer organik asitler de etkendir. Aroma maddelerinin oluşumu ph 5.0 de başladığından laktik asit gelişimi önemlidir. Laktik asit ayrıca gıda kökenli enfeksiyon etmeni kontaminantların gelişimini de inhibe eder (Auclair and Accolas 1983, Tamime 1983, Riemelt et al. 1996). LAB nin GRAS (Generally Regarded As Safe) mikroorganizmalar statüsünde olmaları onların gıda teknolojisinde canlı olarak kullanılmalarına izin verir (Gorris 1994, Ayad vd. 2002). Bu bakteriler, fermentasyon sonucu oluşturdukları laktik asit ve antimikrobiyel maddelerle gıda patojenlerini ve gıdaları bozan mikroorganizmaları inhibe etmeleri nedeniyle insan sağlığına yararlı mikroorganizmalar olarak kabul edilirler (Ray 1996). Klasik yoğurt üretiminde Lb. bulgaricus ve S. thermophilus, çubuk:kok oranı 1:1 veya 1:2 olacak şekilde karıştırılarak kullanılır. Yoğurt kültüründe Lb. bulgaricus fizyolojik açıdan istenmeyen D (-) laktik asit, S. thermophilus ise metabolize olduğu için arzulanan L (+) laktik asit oluşturur (Bottazzi 1988, Robinson 1999). Kültürde bakteri oranlarının korunmasına özen gösterilmesi gerekir. Çünkü insanlar D-Laktat-DH (D- Laktat-dehidrogenaz) enzimine sahip olmadıklarından D (-) laktik asidin günlük alımı sınırlandırılmıştır. Fazla miktarda D (-) laktik asit insanlarda asetoz adı verilen kanda ph düşüşüne yol açar. Bu durum özellikle süt çocukları için tehlike yaratır. O nedenle WHO (World Health Organisation, Dünya Sağlık Örgütü) L (+) laktatın günlük alımı için hiçbir sınırlama getirmezken, D-izomeri için erişkinlerde 100 mg/kg vücut ağırlığı ve süt çocukları için de 20 mg/kg vücut ağırlığı limitlerini önermiştir. Kültürlerin oranına veya metabolik aktivitelerine bağlı olarak az asitli (% 0,8 laktik asit), yumuşak lezzetli veya yüksek asitli (% 1,3 laktik asit), kuvvetli tat ve aromaya sahip yoğurtlar üretilebilir. Yoğurdun lezzeti kültüre bağlı olarak düzenlenebilir. Yüksek inokülasyon miktarı, uzun inkübasyon süresi ve yüksek inkübasyon sıcaklığı ile laktobasiller ortama hakim olur ve buna bağlı olarak da laktik asit miktarı artar; düşük inokülasyon, düşük sıcaklık ve kısa süreli inkübasyonda ise ortama streptekoklar hakim olup az asitli ürünler elde edilir (Riemelt et al. 1996, Robinson 1999). 6

14 Yoğurt bakterileri arasında simbiyotik bir ilişki bulunmaktadır (Rajogapol and Sandine 1990, Robinson 1999, Sezgin 2000). S. thermophilus, yoğurt fermentasyonunun başlangıcında ortamda dominanttır (Weinbrenner et al. 1997) ve Lb. bulgaricus dan önce gelişmeye başlayarak ortamdaki oksijeni kullanır, laktozu fermente ederek geliştirdiği laktik asit yanında, oluşturduğu formik asit ve üreden üreazla meydana getirdiği az miktardaki karbondioksit ile Lb. bulgaricus un gelişimini uyarır (Tunail vd. 2002). Lb. bulgaricus ise laktoz fermentasyonunun yanı sıra proteolitik aktivitesi sayesinde oluşturduğu peptidler ve valin, histidin, methionin, glutamik asit, lösin gibi amino asitlerle (Abu-Tarboush 1996) hem kendinin hem de S. thermophilus un besin gereksinimini karşılar (Robinson 1999). Devam eden asit üretimi, yoğurt ph sını 4,6 ya kadar düşürür (Weinbrenner et al. 1997). Koagülasyonun gerçekleşmesinde, konsistensin sağlanmasında, aroma oluşumunda ve ürünün dayanıklı hale gelmesinde asitlik gelişimi esastır (Kaleli 2001). Simbiyoz yaşamın sonucu olarak, her iki bakterinin de laktozu laktik aside kadar metabolize etmesiyle fermentasyon 3-4 saat içinde tamamlanır, ortama salınan metabolitler yoğurdun tat ve aromasını kazanmasını sağlar ve yoğurt kıvamını bulur. Yoğurtta konsistenz düzeltmesi önemli bir teknolojik basamak olup genellikle sütün yağ içeriğine göre % oranında süt tozu katılarak kuru maddenin arttırılmasıyla gerçekleştirilir. Daha pürüzsüz bir konsistensi sağlamak için vakum altında suyun uçurulması diğerine oranla daha üstün bir yöntemdir. Bu yöntemlerin yanı sıra katılan kültürler de konsistensi bizzat düzeltebilirler. Hem streptokoklar hem de laktobasiller suşlara bağlı olarak viskozite arttırıcı polisakkaritler salgılarlar. Simbiyoz yaşamın bir sonucu olarak Lb. bulgaricus sakız benzeri bir polisakkarit sentezlerken S. thermophilus yapışkan, glikan benzeri bir polimer üretmektedir (Riemelt et al. 1996, Robinson 1999, Chaves et al. 2002). Yoğurdun tipik aromasından sorumlu asetaldehit ise yaygın olarak Lb. bulgaricus tarafından treoninin, treonin aldolaz enzimi ile asetaldehit ve glisine parçalanmasıyla üretilir. Her ne kadar asetaldehit üreticisi Lb. bulgaricus ise de 7

15 simbiyotik ilişki içerisinde S. thermophilus un partnerine üremesi için uygun koşullar yaratamaması durumunda aromanın tam oluşumu sağlanamaz. 2.2 S. thermophilus ve Lb. bulgaricus un Genel Özellikleri S. thermophilus, yuvarlak veya oval formlu, hücreleri ikili veya zincir halinde bulunan homofermentatif laktik asit bakterisidir (Mitchell and Sandine 1984). Çapları 0,7-0,9 µm olan hücreler Gram pozitif ve katalaz negatif özelliğe sahiptir. Optimum olarak C de gelişen S. thermophilus un minumum ve maksimum gelişme sıcaklıkları sırasıyla 20 C ve 52 C dir. Bu mikroorganizma termodurik karakterdedir ve pastörizasyon sıcaklığına dayanabildiğinden (65 C de 30 dk veya 75 C de 15 dk) pastörize sütlerde bulunabilir (Tunail ve Köşker 1989, Robinson 1999). Proteolitik aktivitesi zayıf olan S. thermophilus (Oberg and Broadbent 1993, Robinson 1999) termofil karakterli peynir kültürlerinin de bileşenidir. S. thermophilus yoğurt dışında Emmental, Cheddar gibi pıhtısı pişirilen peynirler ile bazı İtalyan tipi peynirlerin üretiminde kullanılır (Hayaloğlu ve Erginkaya 2001). Proteolitik karakterli termofil laktobasiller ve propiyonik asit bakterileriyle birlikte özellikle Emmental peynirlerinin yapımında S. thermophilus dan yararlanılır (Riemelt et al. 1996). Lb. bulgaricus ise düz ya da hafif kıvrık çubuk şekilli morfolojiye sahip olup homofermentatiftir (Aslım 1994, Robinson 1999). Hareketsiz olan bakteri tek tek veya zincir şeklinde görülür. Laktobacillus biyokimyasal ve fizyolojik özellikleri açısından fazla çeşitlilik içeren üyelere sahip bir cinstir. Beslenme istekleri de oldukça karmaşıktır (Yılmaz 2002). Optimum gelişme sıcaklığı C olan bu bakteri, minumum 22 C, maksimum 62 C de gelişebilir. Proteolitik aktivitesi zayıf olmakla beraber S. thermophilus un proteolitik aktivitesinden daha yüksektir (Hegazi 1987, Rajagopal and Sandine 1990). Lb. bulgaricus, yoğurt dışında Bulgar tipi yayıkaltı, kefir, kımız ve İtalyan ve İsviçre tipi peynirlerin üretiminde de kullanılmaktadır (Abraham et al. 1993, Riemelt et al. 1996, Hayaloğlu ve Erginkaya 2001). Yüksek sıcaklığa oldukça dirençli 8

16 olmakla beraber yüksek asetaldehit üretimi nedeniyle Lb. bulgaricus, Emmental peynirlerinin üretiminde kullanılmaz (Riemelt et al. 1996). 2.3 Yoğurt Starter Bakterilerinin Endüstriyel Açıdan Önemli Özellikleri Yoğurtta aranan en önemli özellikler yapı, tat, aroma, koku ve görünüş olarak sıralanabilir ve bu özellikleri etkileyen faktörler arasında; ham maddenin kalitesi, toplam kuru madde, ham maddedeki protein içeriği, asitlik, katkı maddeleri, kullanılan starter kültürlerin özellikleri ve inokülasyon oranları yer alır. Fermente süt ürünlerinin standart ve yüksek kalitede üretilebilmesi, önemli ölçüde starter kültürlerinin kullanımına bağlıdır. Starterler ürüne istenen yapı, tat, koku ve aroma gibi özellikleri kazandırmak, standart kalitede ürün elde etmek amacıyla kullanılan ve bilinen özelliklere sahip mikroorganizma kültürleridir (Ayad vd. 2000, Yılmaz 2002). Süt sanayii açısından starter kültürlerin endüstriyel özelliklerinin belirlenmesi çok yararlı bir uygulamadır. Termofilik starter kültürlerin tam tanımlanabilmesi için onların öncelikle kesin identifikasyonları gerekir. Bu kapsamda genel morfolojik ve fizyolojik özellikleri belirlenir. Şeker fermentasyon profilleri, optimal gelişme koşulları, üretilen laktik asitin konfigürasyonu gibi daha fazla identifikasyona yönelik olanlar yanında; fajlara duyarlılıkları, asit üretim yetenekleri, aroma maddeleri oluşturma kabiliyetleri, proteoliz ve bakteriyosin potansiyelleri, tuza toleransları, ekzopolisakkarit üretimleri gibi endüstriyel öneme sahip özelliklerin ayrıntılı olarak araştırılması ve belirlenmesi suş seçme ve starter kombine etme programlarının esasını oluşturur (Thunell 1986, Hebert et al. 2000, Tunail vd. 2002). 9

17 Termofilik laktobasiller ile streptokokların NaCl e tolerans gösterebilmeleri onların peynir üretiminde kullanılmaları açısından önem taşır. Birçok S. thermophilus suşu % 1,5 oranında NaCl içeren ortamda 6 saat boyunca hiç gelişme göstermemiş, % 2,5 tuz içeren ortamlarda da ancak 24 saat sonra gelişme gösterebilmiştir. S. thermophilus suşlarının diğer LAB ne göre daha duyarlı oldukları ve tuzun ancak % 2 oranına kadar dayanabildikleri belirtilmektedir (Oberg and Braoadbent 1993, Riemelt et al. 1996). Oberg and Braoadbent (1993) bu özelliğin özellikle salamura işlemi uygulanan İtalyan tipi peynir üretiminde sorun yaratabileceğine dikkat çekmektedir. Termofilik laktobasiller ise tuza daha dirençlidir. Tunail (1982) 20 termofilik laktobasilin tamamının % 3 oranında NaCl ü tolere ettiğini belirlemiştir. Ancak tuza tolerans yoğurt sanayii açısından önemli değildir. S. thermophilus ve Lb. bulgaricus un gelişme sıcaklıkları ve aside toleransları üzerinde yürütülen bir çalışmada S. thermophilus un optimum 39,3-46,1 C aralığında ortalama 42,7 C de, Lb. bulgaricus un ise 44,2 C de optimum gelişebildiği saptanmıştır. Genelde daha fazla asitlik geliştiren laktobasil türlerinin streptokoklara oranla asitliğe daha fazla tolerans gösterdikleri ve ph 4,5 da laktobasillerin streptokoklardan 10 kat daha hızlı geliştikleri belirtilmiştir (Brothersen 1986). S. thermophilus kültürü geliştirdiği asitlikle ortam ph sını 4,0-4,5 a kadar düşürürken, Lb. bulguricus ortamında ph 3,2-3,5 a kadar iner. Lb. bulgaricus % 1,8 oranında laktik asit oluşturur (Rasic and Kurmann 1978, Riemelt et al. 1996). Starter kültürlerde aranan en önemli özelliklerden biri onların fajlarına karşı dirençli olmalarıdır. Fajlara duyarlı suşlar tembel fermentasyonlara neden olur ve asitliğin çok yavaş gelişmesi veya gelişememesine bağlı olarak ya ürün kalitesi düşer, ya da kuvvetli faj atakları sonucu ürün oluşumu tamamen engellenebilir. Bu prosesin durması anlamına gelir ve işletmenin ekonomik olarak zorlanması, müşterinin yitirilmesi söz konusudur. Faj dirençliliğin (faj-konakçı özgüllüğüne göre belirlenen litik şablonun) işletmelerde kullanılan kültür rotasyon programları için önemi fazladır (Olsen 1990, Neve 1996, Durlu-Özkaya vd. 1999, Tunail vd. 2000, Tunail vd. 2002). 10

18 Termofilik fajlara ilişkin bilgiler, laktokok fajları ile kıyaslandığında hayli sınırlıdır. Bunun nedenlerinden biri; laktokok fajlarının uzun yıllar öncesinden başlayarak Avrupa Ülkeleri, ABD ve Yeni Zellanda da peynir işletmelerinde çok daha sıklıkla sorun yaratmaları, White-head ve Cox tarafından keşfedildikleri 1935 yılından beri yoğun bir şekilde araştırılmalarıdır. Oysa S. thermophilus a özgül ilk faj 1952 de Pette ve Kay tarafından, Lb. bulgaricus a özgül faj da ancak 1974 yılında Reinbold ve Reddy tarafından oldukça geç keşfedilmiştir (Tunail vd. 2000). İkinci neden olarak da özellikle laktobasil fajlarının izolasyonunda faj plaklarının görünür kılınmasındaki zorluklar (Reinbold and Reddy 1973) gösterilebilir. Yoğurt işletmelerindeki faj sorunları da peynir işletmelerindekilere oranla çok daha geç tarihlerde ortaya çıkmıştır. Ülkemizde faj problemi peynir işletmelerinde hemen hemen hiç yaşanmamış, faj atakları yoğurt sanayiinde kendini göstermiştir. İlk sorunun görüldüğü 1996 dan başlayarak; termofilik fajların izolasyonu ve bir koleksiyon oluşturulması, doğal suşlarla alternatif kültür yaratılması, faj-konakçı özgüllükleri, suşlarda lizogeni varlığı ve faj direnç sistemlerinin genetik determinantları ve aktarılabilirlikleri, faj parametreleri, fajların EM unda morfolojik tanısı ve moleküler düzeyde karakterizasyon konularında çalışmalar A.Ü. Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji Birimi nde yürütülmektedir (Durlu-Özkaya vd. 1999, Tunail vd. 2000, Kaleli 2001, Acar 2002, Tunail vd. 2002, Tükel vd. 2003, Tükel vd. 2004, Ayhan vd. 2005). Dünya da termofilik fajlara ilgi 1980 lerde başlamıştır. Termofilik kültürlerle çalışan Thunell ve Sandine (1985) kültürlerin iyi üremesi için besi ortamlarının geliştirilmesi yanında bunların fajlarının izole edilerek karakterizasyonunun yapılmasını ve faja dirençli termofilik starterlerin geliştirilmesini önermiştir. Takip eden yıllarda termofilik faj konusu laktokok fajları kadar olmasa da araştırılmaya başlanmıştır. Son yıllarda ise konuya ilgi giderek artmış, çalışmalar daha fazla fajların genetiği ve moleküler düzeyde tanımlanması üzerinde yoğunlaşmıştır (Brüssow et al. 1994, Neve 1996, Le Marrec et 11

19 al. 1997, Moineau et al. 1997, Allison and Klaenhammer 1998, Desiere et al. 1998, Yoon et al. 2001, Tunail vd. 2002, Tükel vd. 2004). Termofilik fajların izolasyonları başlangıçta daha fazla İtalyan tipi peynir üreten işletmelerde peynir altı sularından (PAS) gerçekleştirilmiştir. 7 ayrı işletmeden 48 PAS örneği toplayan Baranch et al. (1987) örneklerin 33 ünde termofilik faj belirlemiştir. Rajagapol and Sandine (1990) de yine İtalyan tipi peynir üreten 6 işletmeden sağladıkları çok yavaş asitlik geliştiren PAS örneklerinin 5 inden termofilik faj izole etmişlerdir. Termofilik kültürlerin kullanıldığı Mozzerella ve İsviçre tipi peynir üretiminde de termofilik fajlara sıklıkla rastlanmıştır (Oberg and Broadbent 1993). Faja dirençli suşları belirlemek adına çıkarılan litik şablonlar (fajların konakçı özgüllüklerinin belirlenmesi), faj tanısına ve karakterizasyonuna önemli bir katkı sağlamadığı gibi taksonomide de bir kriter oluşturmaz. Buna karşılık işletmelerde özellikle faj atakları başladığında bilinçli bir rotasyon programı için kültürlerin litik şablonlarına çok gereksinilir. Zaten starteri ticari olarak üreten firmalar da bunu yaparak kendi faj koleksiyonlarına göre belirledikleri dirençli suşları pazarlamaktadır (Tunail vd. 2000). Termofilik fajların konakçı özgüllüğüne ilişkin çalışmalar kültür firmalarının laboratuvarlarında veya yoğurt işletmelerinin mikrobiyologları tarafından o işletmelerde yürütülmektedir. Ancak Türkiye için her ikisi de söz konusu değildir. İsviçre, Almanya ve Fransa da çeşitli yoğurt ve İsviçre tipi peynirlerden izole edilmiş 90 adet virülent S. thermophilus fajına karşı, yine bu ülkelerden izole edilmiş 70 den fazla S. thermophilus suşunun duyarlılığını test eden Krusch et al. (1987) bakteri ve fajların ülkeye göre spesifiklik gösterdiklerini belirlemişlerdir. Bir ülkeye ait fajların o ülkeye ait suşlara konakçı özgüllüğü gösterdikleri ve diğer ülke suşlarını lize etmedikleri saptanmıştır. Bunun aksine Larbi et al. (1990) endüstriden ve çeşitli kültür koleksiyonlarından 19 S. thermophilus suşu sağlayarak, coğrafi orijini çok farklı 9 adet S. thermophilus fajı ile karşılaştırdıkları denemelerinde, fajların tamamının aynı litik 12

20 şablonu verdiğini görmüşlerdir. Fajlar 19 suştan yalnızca NST 3 ve NST 5 suşlarını lize etmiş, 17 suşa karşı litik etki sergileyememiştir. Bir diğer çalışmada ise Finlandiya peynir işletmelerinden 6 endüstriyel suş kullanılarak izole edilen 9 adet S. thermophilus fajının homolog ve heterolog konakçıları, adsorbsiyon yüzdeleri ve plak oluşturma etkinliklerine göre belirlenmiştir. Çizelge 2.1. den de anlaşılacağı üzere fajlar denenen konakçılara adsorbsiyon açısından geniş bir spektrum göstermişler, plak etkinliğinde ise kendi konakçılarının dışında sınırlı konakçıya spesifik bulunmuşlardır. Fajlardan ΦFK10 ve ΦFK o 74, kendi konakçılarından başka birbirlerinin konakçılarına ve 101 konakçısına, bir diğer deyiş ile heterolog konakçılara da yüksek plak etkinliği göstermiştir (Kivi et al. 1987). Çizelge 2.1 Finlandiya peynir işletmelerinden izole edilen S. thermophilus fajlarının homolog ve heterolog konakçıları ile adsorbsiyon ve plak etkinliği ilişkileri Faj Kodu ΦFku 101 ΦFy 101 ΦFA 101 ΦFK 10 ΦFK 11 ΦFK o 74 ΦFL o 140/76 ΦFL o Ths ΦFE Ths Konakçı Kodu /76 Ths/41 Ths/ Adsorbsiyonun Gerçekleştiği Konakçılar 74 Ths/ Ths/ Ths/ Ths/ /76 140/76 140/76 140/76 Plak Etkinliğinin Gerçekleştiği Konakçılar * * 140/ Ths/41 Ths/41 * : yüksek plak etkinliği 1996 yazında ülkemizde şiddetli faj problemi yaşayan bir yoğurt işletmesinden farklı zamanlarda izole edilen S. thermophilus fajları (16 adet faj) 28 adet endüstriyel yoğurt kültürüne karşı denenmiştir. Farklı zamanlarda yapılan testlere göre; V1, V4, V2, 105, 13

21 632 (Wiesby), B14, YC-380 (Chr. Hansen s Lab.), FYE-11, FYE-41 (Marshall) kültürlerinin denenen fajlara karşı faj-konakçı spektrumunun oldukça geniş olduğu, buna karşılık 709 (Wiesby), B12, CH-1 (Chr. Hansen s Lab) kültürlerinin fajların çoğuna karşı dirençli oldukları saptanmıştır (Durlu-Özkaya vd. 1999). Kaleli (2001) Ankara da çeşitli yoğurt işletmelerine ait yoğurt, bulk, ayran ve bazı peynir işletmelerinin PAS örneklerinden izole ettiği 23 adet S. thermophilus fajını 30 yerel (doğal) ve 9 endüstriyel S. thermophilus suşu ile karşılaştırmış ayrıca tüm suşlarda lizogeniyi araştırmıştır. Suşlardan hiç birinin lizogen karakterli olmadığını saptayan araştırıcı, yerel suşların tüm fajlara tam direnç gösterdiğini, endüstriyel suşların ise 2 litik şablona [( ) ve ( )] göre 3 grupta (tam dirençliler, tam duyarlılar ve oldukça fazla duyarlılar) toplandığını belirlemiştir (Çizelge 2.2). Mata et al. (1986) tarafından Lb. bulgaricus ile ona akraba kabul edilen Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Lb. lactis) in fajlarının litik etkinlikleri araştırılmıştır. Çizelge 2.3 de görülen 16 fajda ilk ikisi (Φmv1 ve Φmv4) temperent faj olup lizogen suşlar olan LT1 ve LT4 den indüklenerek indikatör suş LKT nin konakçı olarak kullanılmasıyla elde edilmiştir. Diğer suşların tamamı virülent karakterli olup tüm fajlar 5 suşa karşı 3 ayrı litik şablon [( ), ( ) ve ( )] göstermiştir. 14

22 Çizelge 2.2 S. thermophilus fajlarının endüstriyel suşlara karşı gösterdikleri litik aktivite Suş Kodu Faj Kodu B3 CH Y1 Y4 V1 V2 Φ709-X Φ709-X Φ709-X Φ709-X Φ709-X Φ231-X Φ231-X7 - a Φ231-X Φ231-X Φ231-X ΦB3-X x ΦB3-X x ΦB3-X ΦB3-X ΦB3-X ΦB3-X ΦB3-X ΦB3-X ΦB3-X x ΦB3-X Φ231-X Φ231-X Φ231-X x a : liziz görülmedi 15

23 Çizelge 2.3 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ve Lb. delbrueckii subsp. lactis fajları, konakçıları ve diğer konakçılara özgüllükleri Fajlar Konakçılar LKT LL23 LB 4 LT 1 LT 4 Φmv1 Lb. lactis LKT Φmv4 Lb. lactis LKT Φlv Lb. lactis LKT Φllh Lb. lactis LL Φp1 Lb. bulgaricus LB5 (+) (+) Φp2 Lb. bulgaricus LB9 (+) (+) Φp3 Lb. bulgaricus LB12 (+) Φp18 Lb. bulgaricus LB42 (+) (+) Φp19 Lb. bulgaricus LB42 (+) (+) Φp20 Lb. bulgaricus LB42 (+) (+) Φp21 Lb. bulgaricus LB42 (+) (+) Φp22 Lb. bulgaricus LB42 (+) (+) Φp23 Lb. bulgaricus LB35 (+) (+) Φc3 Lb. bulgaricus LT1 (+) Φc5 Lb. bulgaricus LT4 (+) Φlb4 Lb. bulgaricus LB4 (+) (+) : plak etkinliği < 10 4 pfu/ml + : plak etkinliği > < 10 pfu/ml - : plak oluşumu yok Yoğurt fabrikalarında faj probleminin çözümüne yönelik araştırmalar kapsamında; hem alternatif starter oluşturmak hem de bakteride faj direnç sistemlerini çalışmak amacıyla 7 adet endüstriyel ve 24 adet yerel (doğal) Lb. bulgaricus suşunun 24 adet Lb. bulgaricus fajına karşı duyarlılıkları araştırılmış, S. thermophilus suşlarının aksine hem yerel suşlar hem de endüstriyel suşlar fajlara karşı çok duyarlı bulunmuştur. Test edilen suşlardan yalnızca 6 adedi, endüstriyel suşlardan da yalnızca H709 diğer tüm fajlara direnç göstermiştir. Fajlar tam dirençli ve tam duyarlı iki temel Lb. bulgaricus gurubunu oluşturan litik şablon dışında farklı düzeyde duyarlı suşlara işaret eden 6 şablon daha 16

24 vermiştir. Sonuçlar işletmelerdeki faj probleminin daha fazla Lb. bulgaricus fajlarından kaynaklanabileceğini de göstermiştir (Tunail vd. 2002, Tükel vd. 2003). Yoğurt bakterilerinin laktik asit üretimleri endüstriyel öneme sahip özelliklerin başında gelmektedir. Çünkü yoğurt üretimi sırasında kültürün oluşturduğu laktik asit kazein misellerinin kararlılığına yani protein koagülasyonuna ve yoğurt jelinin oluşumuna yardımcı olur. Yoğurda işlenen sütün pıhtılaşması ph 5,3 de başlar ve ph 4,6-4,7 de tamamlanır (Yılmaz 2002). Laktik asit gelişimi sonucu ph daki düşüş sütün koagülasyonunu sağlayan enzimlerin aktiviteleri için uygun koşulları oluşturur. Ayrıca olgunlaşma, aroma oluşumu ve konsistensin sağlanmasında ph daki değişim önemlidir. Aynı zamanda, yoğurt aromasında son derece önemli olan laktik asit, yoğurdun asidik, keskin ve hoşa giden tat kazanmasını sağlar (Aslım 1994). Tüm bu faktörlerin yanı sıra laktik asit, kontaminantların gelişimini inhibe eder (Riemelt et al. 1996, Durlu-Özkaya 2001). Bu bakımdan Lb. bulgaricus ve S. thermophilus un asit üretim yetenekleri, suşların selekte edilmesinde pek çok araştırıcı tarafından kullanılmıştır. Ancak araştırıcılar değişik yöntem ve deneme desenleriyle genelde kendi çalışmaları için doğru ve tutarlı bulgulara ulaştıkları halde, elde edilen sonuçlar çoğunlukla birbirleriyle kıyaslanır olmaktan uzaktır. Bazı araştırıcılar standart laktik asit eğrisinden yararlanarak oluşan laktik asidi, renk ayracı katılmasından sonra spektrofotometrik olarak belirleyen Steinholt and Calbert (1960) yöntemini kullanmışlar ve oluşan laktik asidi mg/ml olarak belirtmişlerdir (Tunail 1978, Beyatlı ve Tunail 1991, Aslım 1994). Kültürün SM e % 1 oranında inokülasyonundan sonra belli bir süre inkübasyona bırakılan örneklerin başlangıç ve bitiş saatlerinde ölçülen ph farkına dayanan IDF yöntemi de (Anonymous 1988) hem işletmelerde hem de bilimsel çalışmalarda (Durlu-Özkaya 2001, Rechinger and Siegumfeld 2002) kullanılmaktadır. Kültürlerin geliştirdiği laktik asidin gösterilmesinde en fazla kullanılan yöntem ise titrasyon yöntemi olup uygun besiyerine % 2 oranı ile inoküle edilen aktif kültürün inkübasyon süresine bağlı olarak geliştirdiği asitlik, fenol fitaleyn indikatörü kullanılarak 0,1 NaOH ile titre edilir ve % asitlik bir formüle göre hesaplanır (Demirci ve Gündüz 1994 ). Bu yöntemi Aslım vd. (2000) ve Badis et al. (2004) araştırmalarında kullanmışlardır. 17

25 Araştırma bulgularının birbirleriyle kıyaslanabilir olmaması yalnızca yöntemlerin farklılığından değil seçilen besiyeri, inokülüm oranı, inkübasyon sıcaklığı ve süresinden de kaynaklanmaktadır. Yapılan birçok araştırma S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşlarının ayrı ayrı kullanılmaları yerine miks (karışık) olarak birlikte kullanıldıklarında yoğurtta veya denemelerin SM de yürütülmesi durumunda SM kültürlerinde aynı sürede teorik olarak hesaplanandan daha fazla asitlik geliştirdiklerini ortaya koymuştur (Beyatlı 1982, Ashour et al. 1985, Marchall 1987, Oberg and Broadbent 1993, Tekinşen 1997). Örneğin Lb. bulgaricus ve S. thermophilus un tek kültürlerinin asit üretimleri % 0,73-0,86 arasında saptanırken, karışık kültürlerinde bu değerler % 1,02-1,20 aralığına yükselmiştir (Ashour et al. 1985). Bir başka çalışmada 5 adet Lb. bulgaricus ve 5 adet S. thermophilus, % 10 kuru madde içerikli SM besiyerine % 1 oranıyla ayrı ayrı inoküle edilmiş ve 41 C de 24 saat süre ile inkübasyona bırakılmıştır. Lb. bulgaricus suşlarının % asitlikleri 0,60-1,20 değerleri arasında, S. thermophilus suşlarınınki ise % 0,53-0,60 arasında bulunmuştur. Aynı çalışmada Lb. bulgaricus ve S. thermophilus un rastgele seçilen suşlarıyla kombine edilen miks kültürlerinde % asitlikleri 0,82-1,41 değerlerine yükselmiştir (Aslım vd. 2000). Badis et al. (2004) ise S. thermophilus ve termofilik laktobasiller ile yürüttükleri çalışmalarında SM besiyerini kullanarak % 0,2 oranı ile inoküle ettikleri ortamı 30 C de 6 saat inkübasyona bırakmışlardır. Sonuçta S. thermophilus 16TMC suşunun % 0,56, Lb. bulgaricus 11TMC suşunun % 0,49, Lb. lactis 26TMC in % 0,32 ve Lb. helveticus 20 TMC nin de % 0,36 asitlik geliştirdiğini saptamışlardır. İnkübasyon süresi uzayınca (12. saatten itibaren) değerler % 0,58-0,76 aralığında belirlenmiştir. Özellikle Lb. bulgaricus 11TMC inkübasyonun 18. saatinden itibaren daha fazla asitlik geliştirmiş ve suşların tamamının 24 saat sonunda asitliklerinin % 0,69-0,81 değerleri arasında olduğu saptanmıştır. 18

26 Asitlik gelişimini ph değeriyle belirleyen Rechinger and Siegumfeldt (2002) ise Lb. bulgaricus NCFB 2772 suşunu kullanarak ürettiği kültürü % 10 kuru madde içeren SM besiyerine % 1 oranı ile inoküle ederek 42 C de 24 saat inkübasyona bırakmış ve çoklu paraleller halinde yürüttüğü denemeler sonucunda kültürlerin ph değerlerinin ortalama 3,65 ± 0,05 değerine kadar düştüğünü tespit etmiştir. Yoğurt üretiminde kullanılan Lb. bulgaricus ve S. thermophilus arasındaki simbiyotik ilişkiyi proteoliz sürecinde de görmek mümkündür. Ortamda öncelikle gelişen S. thermophilus, proteince zengin ortama karşın çok daha sınırlı proteolitik yeteneğe sahiptir. Bu bakteri nitrojen kaynağı olarak sütte doğal olarak bulunan ve sıcaklık uygulaması nedeniyle ortama salınan aminoasitlerinden yararlanır. Ancak glutamik asit, histidin, sistin, metionin, valin ve lösin gibi aminoasitler sütte S. thermophilus un gelişimini sağlayacak düzeyde değildir. Bu eksikliği Lb. bulgaricus giderir. Lb. bulgaricus partnerinden farklı olarak kazeini özellikle ß-kazeini, partiküle bağlı proteinaz enzim sistemi ile polipeptitlere hidrolize eder. Ne var ki Lb. bulgaricus un da peptidaz aktivitesi sınırlıdır. Bu aşamada S. thermophilus devreye girerek kısa zincirleri hücre içine alır ve serbest aminoasitlerine hidrolize eder. Hem kendi ihtiyacını karşılar, hem de bu aminoasitlerin daha sonra bazı durumlarda Lb. bulgaricus tarafından kullanılmasına da olanak sağlar (Riemelt et al. 1996, Robinson 1999). Gerek S. thermophilus gerekse Lb. bulgaricus suşları çok farklı proteolitik aktiviteye sahiptirler. Her ne kadar proteolitik aktiviteyi belirlemede kullanılan yöntemler çeşitlilik gösterse de, her araştırma kendi içinde tutarlı bir şekilde bu önemli farklılıkları yansıtmaktadır (Tunail and Hadi El-Beyati 1982, Singh and Sharma 1983, Oberg et al. 1991, Oberg and Broadbent 1993, Ayhan vd. 2005). Tunail and Hadi El-Beyati (1982), starter oluşturmak amacıyla izole ettikleri 20 adet Lb. bulgaricus suşunda proteolitik aktiviteyi 0,13-0,79 mg tirozin/5 ml değerleri arasında 19

27 saptarken, S. thermophilus un yine 20 suşunda proteolitik aktivite değerlerini 0,02-0,1 mg tirozin/5 ml arasında belirlemiştir. Singh and Sharma (1983), suşların proteoliz yeteneğini önce Kazein agar besiyerinde proteolitik zon oluşumu ile saptadıkları çalışmalarında; 10 adet S. thermophilus suşundan yalnızca 3 ünün, 10 adet Lb. bulgaricus suşundan da 4 ünün yüksek düzeyde proteoliz sergilediklerini tespit etmişler ve bu suşları % 1 oranıyla ayrı ayrı SM e aşılayarak 10 gün inkübe etmişlerdir. Lb. bulgaricus suşlarının 10. gün sonunda ulaştığı en yüksek değer 0,615 mg tirozin/g bulunurken, S. thermophilus suşlarının da aynı sürede gösterdikleri en yüksek değer 0,410 mg tirozin/g olmuştur. 33 adet ticari Lb. bulgaricus kültürünün proteoliz yeteneklerinin OPA (O-phytaldehyde) yöntemi kullanılarak, 6 kez araştırıldığı denemelerde en düşük ve en yüksek aktiviteye sahip suşlar arasında her denemede farklı sonuçlar elde edilmiştir. Sonuçta endüstriyel Lb. bulgaricus suşlarında proteolitik aktivite, nedeni belli olmayan çeşitli etkenlerden dolayı stabil değerler göstermemiştir (Oberg et al. 1991). Oberg and Broadbent (1993) yine farklı Lb. bulgaricus suşlarında proteoliz sonucu açığa çıkan aminoasitlerin tirozin cinsinden belirlenmesinde oldukça farklı değerler bulmuştur. Ayhan vd (2005), araştırdıkları 30 adet yerel S. thermophilus suşunda proteolitik aktiviteyi 0,09-1,25 mg tirozin/2 ml değerleri arasında belirlerken, 9 adet endüstriyel S. thermophilus suşunun proteoliz değerlerini de 0,02-0,30 mg tirozin/2 ml arasında oldukça düşük bulmuşlardır. Doğal suşlardan 24 adet Lb. bulgaricus un proteolitik aktivite değerleri 0,10-0,86 mg tirozin/2 ml saptanırken yine 7 adet endüstriyel Lb. bulgaricus suşu için bu değerler 0,00-0,90 mg tirozin/2 ml arasında belirlenmiştir. Farklı bölgelere ait köy ve kasaba yoğurtlarından izole edilen 73 adet Lb. bulgaricus suşunun metabolik ürünlerini araştıran Aslım ve Beyatlı (1997), suşların 24 saatlik inkübasyonları sonucu proteolitk aktivite değerlerini 0,007-1,273 mg tirozin/ml arasında tespit etmişlerdir. Bu sonuçlar proteolitik aktivitenin suşlara göre değiştiğinin açık bir göstergesidir. Genel olarak Lb. bulgaricus un, S. thermophilus a oranla daha güçlü proteolitik aktiviteye sahip olduğu belirtilir. Hegazi (1987), çeşitli laktokok, laktobasil suşları ile 20

28 birlikte S. thermophilus ve Lb. bulgaricus un da proteolitik aktivitesini belirlediği çalışmasında; önce suşları SM besiyerine ayrı ayrı inoküle ederek 30 C de 17 saat inkübasyona bırakmıştır. Sonra bu kültürleri 100 ml taze inek sütlerinin % 3 oranıyla inokülasyonunda kullanıp sütleri 30 C de 2 gün inkübe etmiştir. Sürenin bitiminde sütteki proteinleri triklorasetik asit (TCA) ile çökeltip filtrasyondan sonra filtratta proteoliz ürünlerini (aminoasitleri) hem tirozin hem de lösin eşdeğeri olarak belirlemiştir. S. thermophilus için bu değerleri 108,7 µg tirozin/ml ve 192,4 µg lösin/ml olarak saptayan araştırıcı, Lb. bulgaricus için proteoliz göstergesi olan bu değerleri çok daha yüksek, sırasıyla 380,5 µg tirozin/ml ve 553 µg lösin/ml olarak belirlemiştir. Hegazi (1987) gibi aynı sonuçlara varan veya aynı kanaati paylaşan birçok araştırmacı vardır (Tamime and Robinson 1985, Beyatlı ve Tunail 1991, Abu-Tarboush 1996, Hayaloğlu ve Erginkaya 2001, Ayhan vd 2005). Bu kabul edilmiş genel görüşün aksini belirten bir yayına da rastlanmıştır. Çeşitli S. thermophilus ve Lactobacillus suşlarının proteolitik aktivitelerini araştıran Shihata and Shah (2000) tarafından; 6 adet S. thermophilus ile 5 adet Lb. bulgaricus, 13 adet Lb. acidophilus, 12 adet Bifidobacterium ssp. suşunun proteolitik aktiviteleri SM besiyerinde ilk tür için 37 C ve diğerleri için 42 C de 6 saatlik bir inkübasyon sonrası belirlenmiştir. Ticari S. thermohilus suşlarını da test eden araştırıcılar; 5 S. thermophilus suşundan üçünün (S. thermophilus T1, T4, Y1) proteolitik aktivite göstermediğini belirtmişlerdir. Ama içlerinden S. thermophilus 2014 ün 52,6 µm aminoasit değeriyle proteolitik Lb. bulgaricus suşlarından daha güçlü proteoliz yeteneğinde olduğu ortaya konmuştur. Çünkü en yüksek proteolitik aktiviteye sahip Lb. bulgaricus 2515 suşu bile ancak 25 µm serbest aminoasit değeri göstermiştir. Diğer türlerden 10 adet Bifidobacterium ssp. ve 2 adet Lb. acidophilus da proteolitik aktiviteden yoksun bulunmuştur. Yoğurt starter kültürleri Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Enterococcus cinsleri ile kıyaslandığında genelde zayıf proteolitik aktiviteye sahiptir (Abu-Tarboush 1996, Riemelt et al. 1996). Ancak bu aktivite bile ürünün fiziksel yapısına ve aroma oluşumuna katkı sağlaması açısından yeterli olmaktadır (Yılmaz 2002). Süt ve ürünlerinde gerçekleşen proteolizin derecesine bağlı olarak ya arzulanan ya da hiç istenmeyen lezzet ortaya çıkabilir. Sert ve yarı sert peynirlerde kullanılan starterlerin 21

29 proteinaz aktivitelerine bağlı olarak veya yoğurtta depolama sırasında proteolitik aktivitesi S. thermophilus dan çok daha yüksek olan Lb. bulgaricus suşlarının gerçekleştirdiği proteoliz sonucu açığa çıkan peptidler nedeni ile yoğurtlarda acı lezzet oluşur (Rajagopal and Sandine 1990). Bu konuda ayrıntılı bir çalışma yürüten Beyatlı ve Tunail (1991) asit ve proteolitik aktivitelerini belirledikleri doğal izolatlardan 20 adet karışık kültür oluşturmuşlardır. Bunların 16 sı, asit üretimi yüksek ve düşük proteolitik aktiviteye sahip suşlardan (S. thermophilus için 0,03-0,04 mg tirozin/5 ml, Lb. bulgaricus için 0,13-0,16 mg tirozin/5 ml) kombine edilmiş, diğer 4 miks kültür ise yine asit üretimi yüksek veya oldukça yüksek ancak proteoliz yeteneği de güçlü suşlardan (S. thermophilus için 0,07-0,1 µg tirozin/5 ml, Lb. bulgaricus için 0,70-0,74 µg tirozin/5 ml) oluşturulmuştur. Sonuçta miks kültürlerle üretilen yoğurtların organoleptik testlerinde; I. grup (16 miks kültür) yüksek puan toplarken II. grup (4 miks kültür) rahatsız edici düzeyde acı lezzet oluşturduğundan düşük puan almıştır. Yoğurt üretiminde miks kültürlerin kullanılması halinde asit gelişiminde olduğu gibi simbiyotik etki proteolitik aktiviteye de artış olarak yansır. Rajagopal and Sandine (1990) SM de 42 C de 4 saat geliştirdikleri kültürlerin proteolitik aktivitelerini S. thermophilus için 2,4-14,8 µg tirozin/ml ve Lb. bulgaricus için ,6 µg tirozin/ml değerleri arasında belirlemiştir. Miks kültürlerde ise proteolitik aktivite, teorik olarak her iki suşun değerlerinin toplamı olması gerekirken, çok daha fazla artmış ve 92,6-419,0 µg tirozin/ml değerlerine ulaşmıştır. Diğer fermente süt ürünlerinden tamamen farklı yapı ve lezzete sahip olan yoğurdun tadına S. thermophilus ve Lb. bulgaricus tarafından ortama salınan metabolitler etkendir. Yoğurdun son tadına asetaldehit yanında; serbest yağ asitleri, aminoasitler, aseton, diasetil, ketohidroksi-asitlerin de katkıda bulunduğu kabul edilirse de asetaldehit dışında diğerlerinin yoğurdun aroması açısından önemi tam anlaşılamamıştır. Asetaldehit üretiminde temel yol threonin-aldolaz enzimi ile threoninin asetaldehit ve glisine dönüşümüdür. Ancak bu esas yoldan başka diğer metabolik yollar da asetaldehit üretimine katılabilir (Riemelt et al. 1996, Robinson 1999). 22

30 Yoğurt aromasının üretilen asetaldehitten kaynaklandığı ve özellikle laktobasillerin bu metaboliti ürettikleri 1950 yılında belirtilmiş (Pette and Lolkema 1950), daha sonra yapılan çalışmalar da (Schulz and Hingst 1954, Gorner vd 1968, Veringa and Davelaar 1970) bu ilk bilgileri destekler nitelikte olmuştur. Sadek et al. (1972), de SM ortamında 30 C de 18 saat ayrı ayrı inkübe edilen 10 adet S. thermophilus suşunda asetaldehit miktarını 1,0-3,0 ppm düzeyinde, 10 adet Lb. bulgaricus suşunda ise 3,3-12,2 ppm arasında saptamıştır. Hem laktobasillerde hem de S. thermophilus suşlarında threonin-aldolaz aktivitesini belirleyen ve yoğurtta asetaldehit üretimine yoğurt bakterilerinin birlikte katıldıklarını öne süren Lees and Jago (1978) nun aksine Raya et al. (1986) yoğurttaki asetaldehitin sadece Lb. bulgaricus tarafından oluşturulduğunu ileri sürmüştür. Çünkü araştırmacılar Lb. bulgaricus ATCC suşunda ve yoğurt izolatı olan Lb. bulgaricus YOP 12 de threonin-aldolaz enzim aktivitesini saptadıkları halde S. thermophilus ATTC suşunda ve yine yoğurttan izole edilen S. thermophilus YOP 9 da enzimin varlığını belirleyememişlerdir. Oluşumu ph 5,0 de başlayan ve inkübasyonunu tamamlayan olgun yoğurtlarda 40 mg/kg (40 ppm) düzeyine kadar yükselebilen asetaldehitin (Riemelt et al. 1996) bugün S. thermophilus tarafından da threonin-aldolaz enzimi ile oluşturulduğu bilinmektedir (Chaves et al. 2002). Bununla beraber üretilen asetaldehitin miktarı enzimin inkübasyon sıcaklığına dayanıklılığı ile ilişkilendirilmiştir. Lb. bulgaricus ta enzim 30 C nin üzerindeki sıcaklıklara dayanıklı olduğu halde, S. thermophilus ta enzim 30 C üzerinde aktivitesinden yitirmektedir. O nedenle Lb. bulgaricus ticari yoğurtlardaki asetaldehitin esas kaynağı olarak kabul edilir (Riemelt et al. 1996, Robinson 1999). Yoğurtta diasetil ouşumu üzerine de karşıt görüşler ortaya çıkmıştır. Rasic and Kurmann (1978) diasetil oluşumunun sadece S. thermophilus dan kaynaklandığını belirtirken, aksine Lb. bulgaricus suşlarının da en az partneri düzeyinde diasetil ürettikleri gösterilmiştir (Beyatlı ve Tunail 1991, Beshkova et al. 1998). 23

31 Üstün kaliteli normal yoğurtlarda asetaldehit miktarını 27,6 ppm saptayan Robinson vd (1977) ne karşılık Rasic ve Kurmann (1978) bu değerin ppm arasında olması gerektiğini belirtmiştir. Ashour et al. (1985), Lb. bulgaricus ve S. thermophilus tek kültürlerinin asetaldehit üretimlerini 1,5-1,9 ppm arasında saptarken, karışık kültürlerinin ise 4,6-10,30 ppm aralığında asetaldehit ürettiklerini belirlemiştir. Beyatlı ve Tunail (1991), içlerinde kaliteli ve standart dışı yoğurtların yer aldığı 20 piyasa örneğinde asetaldehiti 12,28-34,72 ppm, ortalama 22,60 ppm olarak saptamışlar, diasetili de 1,01-7,12 ppm değerleri arasında ortalama 2,95 ppm belirlemişlerdir. Aynı araştırıcılar yerli (doğal) suşları, asit üretim yeteneklerine ve proteolitik aktivitelerine göre seçip oluşturdukları miks kültür yoğurtlarında asetaldehit miktarını 19,14-32,21 ppm değerleri arasında ortalama 25,85 ppm olarak bulmuşlar, diasetili de 1,14-2,88 ppm arasında ortalama 2,08 ppm olarak tespit etmişlerdir. Organoleptik değerlendirmede en yüksek puanı paylaşan 4 kombine kültür yoğurdunda asetaldehit miktarlarını 23,43 ppm; 29,77 ppm; 19,77 ppm ve 31,68 ppm; diasetil miktarlarını da 2,18 ppm; 2,88 ppm; 1,95 ppm ve 2,06 ppm düzeyinde belirleyen araştırıcılar kaliteli ve aromalı normal yoğurtlarda ppm asetaldehit, 2,0 ppm diasetil düzeyinin yeterli olduğunu belirtmişlerdir. Koyun ve inek sütleri ile üretilmiş ev yoğurtlarından izole ettikleri 2 adet Lb. bulgaricus (2-11 ve 1-9 kodlu suşlar) ve 2 adet S. thermophilus (13a ve 15a kodlu suşlar) u kullanarak oluşturdukları iki kombine yoğurt kültüründe asetaldehit ve diasetil miktarını belirleyen Beshkova vd (1998), aynı zamanda Lb. bulgaricus 2-11 ve Lb. bulgaricus 1-9 tek kültürlerinde de aynı metabolitlerin düzeyini saptamıştır. Lb. bulgaricus 1-9 suşu inkübasyonun 31. saatinde 1223 µg/100 g (=12,23 ppm) asetaldehit ve 185 µg/100 g (=1,85 ppm) diasetil, Lb. bulgaricus 2-11 suşu ise inkübasyonun 22. saatinde 1101 µg/100 g (=11,01 ppm) asetaldehit ve 125 µg/100 g (=1,25 ppm) diasetil oluşturmuştur. Kombinasyonlardan 1. si (Lb. bulgaricus S. thermophilus 13a) inkübasyonun 22. saatinde 1734,2 µg/100 g (=17,34 ppm) asetaldehit ve 165 µg/100 g (=1,65 ppm) diasetil üretimi gösterirken, 2. kombinasyon (Lb. bulgaricus S. thermophilus 15a) yine inkübasyonun 31. saatinde 1506 µg/100 g (15,06 ppm) ve 220 µg/100 g (2,20 ppm) diasetil oluşturmuştur. Miks kültürlerin ürettikleri asetaldehit miktarları tek Lb. 24

32 bulgaricus kültürlerinden biraz daha yüksek bulunurken, diasetil miktarı sadece 2. kombine kültürde daha yüksek değere ulaşmıştır. Dolayısı ile miks kültürlerde kombinasyonda yer alan Lb. bulgaricus suşlarının metabolit düzeylerine çok daha etkili oldukları anlaşılmaktadır. Simbiyotik etki de bir miktar bu metabolitlerin düzeyine yansımıştır. % 10 kuru maddeli SM besiyerlerine % 1 oranıyla ayrı ayrı inoküle edilen 5 er adet Lb. bulgaricus ve S. thermophilus suşları 41 C de 24 saat süren inkübasyona bırakılmış ve asetaldehit tayinleri yapılmıştır (Aslım vd. 2000). Araştırıcılar Lb. bulgaricus suşlarının asetaldehit üretimlerini 6,76-11,75 µg/ml aralığında saptarken, S. thermophilus suşlarından dördünden asetaldehit üretimi belirlenememiş, sadece birinde 0,26 µg/ml düzeyinde üretilmiştir. İki türün rastgele seçilen suşları ile kombine edilen miks kültürlerinde ise aynı deneme koşullarında asetaldehit üretimleri Lb. bulgaricus suşlarının ürettiklerinin çok az üzerinde 6,76-13,54 µg/ml düzeylerinde belirlenmiştir. Yılmaz (2002) ise araştırmasında öncelikle endüstriyel suşlardan Lb. bulgaricus 12 ile S. thermophilus 20 yi kombine ederek bu miks kültürle bir kontrol yoğurdu yapmış ve bu yoğurtta asetaldehit miktarını mg/kg (= ppm) olarak saptamıştır. Kendi izolatları olan Lb. bulgaricus ve S. thermophilus suşlarıyla hazırladığı ikili miks kültür yoğurtlarında asetaldehiti 8-10 mg/kg (=8,0-10,0 ppm) düzeyinde belirlemiş ve kıyaslamaları kontrol yoğurda göre yapmıştır. Yine son yapılan bir çalışmada (Ayhan vd. 2005) yerel (doğal) ve endüstriyel yoğurt bakterilerinin asetaldehit üretimleri, suşların alternatif starter olabilme potansiyellerini belirlemek amacıyla saptanmıştır. 30 adet yerel S. thermophilus suşunda asetaldehit miktarı 2,73-55,92 ppm arasında, ortalama 27,80 ppm düzeyinde belirlenirken 9 endüstriyel suşta da 15,00-43,65 ppm arasında, ortalama 28,95 düzeyinde bulunmuştur. Aynı metabolit 24 adet Lb. bulgaricus ta 8,18-47,74 ppm, ortalama 25,18 ppm olarak; 6 adet endüstriyel Lb. bulgaricus suşunda ise 3,64-73,66 ppm değerleri arasında, ortalama 35,06 ppm düzeyinde saptanmıştır. Endüstriyel suşlardan Lb. Y1 73,66 ppm lik asetaldehit üretimi ile endüstriyel suşların ortalama değerinin yükselmesine neden olmuştur. Bu denemeler 25

33 tek kültürlerin türe özgül optimum sıcaklık derecelerinde yürütüldüğünden S. thermophilus un asetaldehit düzeyinin beklenenden yüksek olduğu bir olasılık olarak görülebilirse de S. thermophilus ve Lb. bulgaricus un alkol-dehidrogenaz enzimini içermemeleri durumunda asetaldehitin bu bakterilerde diğer metabolik yollara bağlı olarak daha yüksek düzeylere kadar yükselebileceklerini, örneğin piruvatın dekarboksilasyonu ile de asetaldehit oluşabileceğini (Riemelt et al. 1996, Robinson 1999) unutmamak gerekir. Yoğurt starter kültürü olarak kullanılacak suşların antimikrobiyel aktiviteleri de önemlidir. Birçok araştırmacıya göre antimikrobiyel aktivite, organik asitler (laktik asit, asetik asit, formik asit), diasetil, hidrojen peroksit ve karbondioksit gibi maddelerin birinden veya birkaçından ileri gelir (Abdel-Bar et al. 1987, Daeschel 1989, Spelhaug and Harlender 1989, Larsen et al. 1993, Skyttä vd 1993, Casla et al. 1996, Zamfir et al. 1999, Guerra and Pastrana 2002). İnhibisyon ayrıca, yakın türlere karşı bakterisidal veya bakteriostatik etkili peptid veya protein yapıdaki bakteriyosinlerden de kaynaklanır (Larsen et al. 1993, Paavola et al. 1999). Yoğurttaki bu antimikrobiyel metabolitler pek çok enterik patojenin canlılığını zayıflatıp gelişimini baskılayabilmektedir. S. thermophilus düşük moleküllü bakterisidal etkiye sahip bileşikler üretirken; Lb. bulgaricus hidrojen peroksit ve aynı türün bazı suşları tarafından salgılanan "bulgarican" adlı bakteriyosin üretmektedir (Robinson 1999). Bakteriyosinler, LAB tarafından üretilen ve gıdalarda bozulmaya neden olan mikroorganizmalar ile gıda kaynaklı patojenlere karşı inhibisyon etkili antimikrobiyel maddeler olarak tanımlanabilir (Larsen et al. 1993, Martinez-Cuesta et al. 1997). Oldukça geniş ph aralığında aktif, fakat proteolitik enzimlere duyarlı olan bakteriyosinler toksik etkili değildir. Yüksek sıcaklık uygulamalarında birçok özelliklerini koruyup birkaç aydan fazla buzdolabı sıcaklığında stabil kalabilen bu maddeler gıdalarda koruyucu olarak kullanılma potansiyeline sahiptir (Klaenhammer 1988, Malik et al. 1994). Lactococcus lactis tarafından üretilen, otoklav uygulamasında stabil kalabilen ve Listeria monocytogenes ve Staphylococcus aureus gibi önemli Gram pozitif patojen 26

34 bakterilere karşı inhibisyon etkisine sahip olan nisin, aynı zamanda Clostridium ve Bacillus sporlarının da gelişimini engelleyen bir bakteriyosindir. Nisin dışında bakteriyosin üreten diğer LAB leri arasında pediokoklar tarafından üretilen pediosin, Lactobacillus sake, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus ve Lactobacillus plantarum tarafından üretilen sırasıyla sakasin, helvetisin, asidofilin ve plantarisin yer almaktadır (Gorris 1994). Bu organizmalarla kıyaslandığında S. thermophilus suşlarının bakteriyosinlerine ilişkin çalışmaların çok daha sınırlı olduğu görülmektedir. Feta peynirinden izole edilmiş ve bakteriyosin üreticisi olarak belirlenmiş olan S. thermophilus ACA-DC 0040 suşunun ürettiği bakteriyosin saflaştırılmış, karakterize edilmiş ve termofilin T olarak isimlendirilmiştir (Aktypis et al. 1998). Mathot et al. (2003) tarafından yapılan bir çalışmada, çiğ sütten izole edilen ve peynir üretiminde kullanılacak olan S. thermophilus Adria 91L580 suşunun ürettiği bakteriyosinin, çeşitli indikatör bakterilere ve özellikle sert peynirlerde bozulmalara neden olan Clostridium tyrobutyricum a karşı inhibisyon spektrumu araştırılmış; Lb. lactis, Lb. helveticus H7 ve Lb. acidophilus starter kültürleri ve Lb. bulgaricus L18, Micrococcus luteus, L. monocytogenes 7838, S. aureus 156 ve E. coli bakterileri üzerinde herhangi bir inhibisyon etki saptanmazken oldukça duyarlı olduğu bilinen S. thermophilus NG40Z ve Clostridium sporogenes 60531, C. tyrobutyricum 6018 ile Clostridium butyricum 5291 bakterilerine karşı ortalama 15 mm çaplı inhibisyon zonları elde edilmiştir. Lb. bulgaricus ATCC 7994 suşunun, S. aureus ATCC 9144 ve Pseudomomas fragi ATCC 4973 test suşlarına karşı antimikrobiyel aktivitesini araştıran Abdel-Bar vd (1987), çalışmalarında test suşları ile inoküle (% 0,2) edilmiş besiyeri yüzeyine yerleştirilen steril disk kullanmışlardır. SM de geliştirilen Lb. bulgaricus ATCC 7994 suşunun supernatantı (ph 3,85) diskler üzerine inoküle (30 µl) edilip 22 C de 24 saat süre ile inkübe edilmiştir. Kontrol olarak aynı işlemlerin uygulandığı sadece Lb. bulgaricus ATCC 7994 ile inoküle edilmemiş ve ph sı 3,85 e ayarlanmış besiyeri kullanılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda Lb. bulgaricus ATCC 7994 ün, test edilen 27

35 her iki bakteriye karşı antimikrobiyel aktiviteye sahip olduğu ve P.fragi ye karşı elde edilen inhibisyon zon çapının daha büyük olmasından Lb. bulgaricus ATCC 7994 ün bu test suşunu daha kuvvetli inhibe ettiği ve saptanan inhibisyonun laktik asitten kaynaklanmadığı tespit edilmiştir. Agar difüzyon testi kullanılarak S. thermophilus ve Lb. bulgaricus yerel suşlarının M. luteus üzerine antimikrobiyel aktivitelerinin araştırıldığı bir çalışmada, test bakterisine karşı ortalama 8-8,5 mm inhibisyon zon çapı ile yerel S. thermophilus suşlarından St. 7.1, St. 7.8 ve St. MR27a suşları zayıf etki gösterirken, 23 mm inhibisyon zon çapı ile en yüksek antimikrobiyel aktiviteyi St suşu sergilemiştir. Lb. bulgaricus suşları ise ortalama 18 mm inhibisyon zon çapı oluşturmuşlardır. Suşlardan Lb ve Lb. 2004, 14 mm ile en düşük, Lb mm zon çapı ile en yüksek antimikrobiyel aktiviteye sahip suş olarak belirlenmiştir (Ayhan vd. 2005). 28

36 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3. 1 Materyal Bakteriler Bu tez kapsamında; faja direnç, asit aktivitesi ve antibakteriyel aktivite testlerinde Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji biriminde yürütülmüş Tübitak/ TARP 2106 nolu Yoğurt fabrikalarında faj probleminin çözümüne yönelik araştırmalar adlı projede Türkiye nin farklı bölgelerine ait çiğ süt örneklerinden izole edilen 30 adet S. thermophilus ve 22 adet yerel Lb. bulgaricus suşu ile yine aynı projede ticari liyofilize miks yoğurt kültürlerinden izole edilen 9 adet St. 632, St. B3, St. 231, St. 709, St. CH-1, St. Y1, St. Y4, St. V1, St. V2 kodlu endüstriyel S. thermophilus, 4 adet Lb. 231, Lb. Y4, Lb. V1, Lb. V2 kodlu endüstriyel Lb. bulgaricus suşuna ek olarak Lb. bulgaricus ATCC suşu kullanılmıştır. Ayrıca şu an Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji Birim inde yürütülmekte olan Biyoteknoloji Enstitüsü 67 no lu projede materyal olarak kullanılan, Dr. Remziye Yılmaz ın pastörize sütlerden izole ettiği 43 adet S. thermophilus, 12 adet Lb. bulgaricus suşu ve ticari liyofilize formda Chr-Hansen Lab. Inc. Kuruluşundan sağlanmış S. thermophilus Ch-St-20.1 ve Lb. bulgaricus Ch-Lb-12-1 bakteri kültürleri (Yılmaz 2002) olmak üzere toplam 123 suş ile çalışılmıştır. Asetaldehit üretimi ve proteolitik aktivite testlerinde ise suş sayısı azaltılarak 31 adet S. thermophilus ve 22 adet Lb. bulgaricus olmak üzere toplam 53 suş kullanılmıştır. Antimikrobiyel aktivite testinde kullanılan indikatör mikroorganizmalardan Micrococcus luteus, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji ABD ndan, Bacillus cereus, Salmonella enteretidis, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus ve Listeria monocytogenes ile ön denemeler sırasında 29

37 antimikrobiyel aktiviteye sahip suşlara duyarlı olduğu gözlenen ve Tübitak/TARP 2106 nolu projede izole edilmiş olan Lb kodlu Lb. bulgaricus suşu Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji Birimi Kültür Koleksiyonu ndan sağlanmıştır Bakteriyofajlar Faj konakçı özgüllüğünün belirlenmesinde; Esra Acar tarafından St. B3 endüstriyel S. thermophilus konakçısı kullanılarak çiğ sütlerden izole edilen 2 adet S. thermophilus fajı (Acar 2002) ile Biyoteknoloji 67 nolu proje çalışmalarında Lb. bulgaricus ATCC referans suşu (Lb R) ve endüstriyel Lb V1, Lb V2, Lb Y4, Lb 231 Lb. bulgaricus konakçılarıyla çiğ sütlerden izolasyonları gerçekleştirilen 7 adet Lb. bulgaricus fajı olmak üzere toplam 9 faj ile çalışılmıştır. Çiğ süt kökenli bu 9 faj aşağıda kodları ile verilmiştir. S. thermophilus Fajları Φ St 1B3A Φ St 2B3A Lb. bulgaricus Fajları Φ Lb R + A Φ Lb R + Z Φ Lb V1 + A Φ Lb V2 + A Φ Lb V2 + Z Φ Lb Y4 + A Φ Lb Y4 + Z St. B3: B3 miks yoğurt kültüründen izole edilmiş S. thermophilus suşu Lb R: Konakçı Lb. bulgaricus ATTC referans suşu Lb V1, Lb V2, Lb Y4: V1, V2, Y4 miks yoğurt kültürlerinden izole edilmiş Lb. bulgaricus suşları A, Z: Çiğ sütün Afyon veya A. Ü. Zootekni Bölümü işletmesine ait olduğunu göstermektedir. 1, 2: Aynı kökenli sütten değişik zamanlardaki izolasyonu belirtmektedir. 30

38 Yöntem Faja direncin belirlenmesi Bakterilerin fajlara dirençlerinin belirlenmesinde çift tabaka agar yöntemi (Terzaghi and Sandine 1975) kullanılmıştır (Aydar ve Tunail 1995, Acar 2002, Kaleli vd. 2004) Lb. bulgaricus suşlarında faja direnç Lb. bulgaricus suşlarının fajlarla karşılaştırılmasında Sozzi et al. (1976) tarafından yapılan çalışmaya dayanılarak, bileşimi ve hazırlanışı Ek. 1 de verilen MRS broth, MRS yumuşak agar (% 0,45 agar) ve MRS agar (% 1,5 agar) kullanılmış ve fajların adsorbsiyonunu olanaklı kılmak için her üç besiyerine CaCl 2 (10 mmol. l -1 ) ilave edilmiştir (Foschino et al. 1995). Bu yönteme göre MRS broth besiyerinde geliştirilen 4 saatlik aktif Lb. bulgaricus kültüründen 0,3 ml alınarak içinde 3 ml MRS yumuşak agar içeren (% 0,6 agar) tüplere aktarılıp karıştırılmış ve bir gün önceden hazırlanmış olan MRS agarlı (% 1,5 agar) petriler üzerine dökülerek homojen olarak yayılmıştır. Katılaşan agar üzerine titreleri pfu/ml ye yükseltilen faj filtratlarından mikropipet yardımıyla 10µl damlatılmış ve petriler C de saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda damlatılan alanlardaki berrak plak oluşumu (liziz), karşılaştırılan bakterinin damlatılan faja karşı duyarlı olduğunu, plak oluşmaması ise bakterinin test edilen faja direncini göstermiştir. Faj zenginleştirmesi, titrenin belirlenmesi ve titre yükseltilmesi işlemleri Acar (2002) a göre yapılmıştır.

39 S. thermophilus suşlarında faja direnç S. thermophilus suşlarında faja direncin belirlenmesinde, modifiye M17 broth (th M17) besiyerinde geliştirilen 4 saatlik aktif S. thermophilus kültüründen 0,3 ml alınmış, içinde 3 ml thm17 yumuşak agar (% 0,6 agar) (Ek-1) ve 0,1 ml Skim Milk (SM) bulunan tüplere aktarılarak karıştırılmış ve bir gün önceden hazırlanmış olan thm17 agar (% 1,5 agar) (Ek-1) içeren petri plaklarına dökülüp homojen olarak yayılmıştır (Krusch et al. 1987, Neve et al. 1989). Diğer işlemlere de anlatıldığı gibi devam edilmiştir Lb. bulgaricus suşlarının ve fajlarının saklanması Lb. bulgaricus suşları MRS broth içerisinde geliştirildikten sonra % 15 gliserol eklenerek 18 ºC de stoğa alınmıştır (Chow et al. 1988). Titreleri yükseltilen fajlar ise önce 0,45 µm porlu filtreden geçirilip % 15 gliserol ilave edilerek 18 ºC de saklanmıştır S. thermophilus suşlarının ve fajlarının saklanması S. thermophilus suşları, M17 broth içerisine % 15 gliserol katılarak 18 ºC de stoğa alınmıştır (Krusch et al. 1987). Fajlar ise titreleri artırıldıktan sonra 0,45 µm porlu filtreden geçirilip % 15 gliserol ilave edilerek 18 ºC de muhafaza edilmiştir.

40 Bakterilerin asidifikasyon aktivitelerinin saptanması Bakterilerin asidifikasyon aktivitelerini belirlemek amacıyla, 18 C de korunan Lb. bulgaricus suşları MRS broth (Merck, Germany); S. thermophilus suşları ise M17 broth (Merck, Germany) besiyerlerinde ikişer kez aktifleştirildikten sonra inokülasyon oranı % 1 olacak şekilde 10 ml Skim Milk (SM) besiyeri içeren tüplere ayrı ayrı ekilmiş ve C de inkübasyona bırakılmışlardır. Kültürlerin ph ları; inkübasyon başlangıcında, 6. ve 24. saatlerde ölçülerek (NEL 890) ph değerleri hesaplanmıştır (Anonymous 1988) Bakterilerin antibakteriyel aktivitelerinin belirlenmesi Bakterilerin antibakteriyel madde üretim yeteneklerinin belirlenmesinde kuyu difüzyon (Andersson et al. 1988, Krier et al. 1988, Kuleaşan 2002) ve agar difüzyon (Tramer and Fowler 1964, Kuleaşan 2002) testi olmak üzere iki ayrı yöntem kullanılmıştır Kuyu difüzyon testi Lb. bulgaricus suşlarında kuyu difüzyon testi Bu testte, 18 saat uygun sıcaklıkta inkübe edilmiş indikatör mikroorganizma kültüründen 100 µl alınarak 8 ml % 0,6 agar içeren ve 45 C su banyosunda bekletilen yumuşak Tryptic Soy agar (TSA) (Merck, Germany) besiyeri içeren tüplere aktarılmış ve tüp karıştırıcıda homojen şekilde karıştırılmıştır. İndikatör mikroorganizma olarak kullanılan Lb. bulgaricus 6301 için ise MRS yumuşak agar (% 0,6 agar) kullanılmıştır. Tüplerde bulunan yumuşak agarlı besiyerinin katılaşmasına izin verilmeden tüp içeriği bir gün önceden hazırlanmış MRS agarlı (% 1,5 agar) petri kutularına boşaltılmıştır. Bu

41 34 işlemden sonra petri kutuları, indikatör mikroorganizmanın bir miktar üremesini sağlamak amacıyla uygun sıcaklıkta 1 saat süreyle inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında petri kutularında 6 mm çapında steril olarak açılan 5 veya 6 adet kuyucuğa 50 µl antibakteriyel aktivitesi test edilecek aktif Lb. bulgaricus suşlarının süspansiyonları ve kontrol örneği konulmuştur. Petriler, difüzyonun gerçekleşmesi için 4 C de 1 saat bekletildikten sonra kullanılan indikatör mikroorganizma için gerekli optimum gelişme sıcaklığında 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresinin sonunda oluşan zon çapları kumpasla ölçülmüştür. S. thermophilus suşlarında kuyu difüzyon testi Antibakteriyel aktivitesi belirlenecek S. thermophilus suşları için M17 agar (% 1,5 agar) kullanılmış ve diğer işlemler de açıklandığı gibi tekrarlanmıştır Agar difüzyon testi Lb. bulgaricus suşlarında agar difüzyon testi Aktif Lb. bulgaricus suşları, % 1 oranında MRS broth besiyerlerine inoküle edilmiş ve 18 saat C de inkübasyona bırakılmışlardır. İnkübasyon süresinin sonunda, kültürlerin ph değerleri ölçülmüş ve hücrelerin ortamdan ayrılması amacıyla 5000 devir/dakika hızda 10 dakika süreyle santrifüj (Hettich, EBA 12) işlemi uygulanmıştır. Elde edilen süpernatantlar 0,45 µm por çaplı filtrelerden (Sartorious) geçirilerek sterilize edilmiştir. İnhibitör etkinin belirlenmesi amacıyla bir gün önceden hazırlanan TSA (% 1,5 agar) besiyerleri hava akımlı steril kabin içerisinde petri kutularının kapakları yarı açık olacak şekilde 1 saat bekletilerek yüzeylerinin kuruması sağlanmıştır. Bu kurutma işleminin amacı katı besiyerinin sonradan damlatılacak olan süpernatant sıvısını kolayca çekmesini sağlamaktır. Her bir petri kutusunda iki veya üç farklı bölgeye 25 er µl süpernatant ve kontrol örneği damlatılmıştır. Damlatma işleminin ardından besiyerinin süpernatant sıvısını absorbe etmesi için yine 1 saat

42 35 kurutma işlemi uygulanmış ve süre sonunda damlatılan bölgeye 25 µl daha süpernatant sıvısı damlatılmıştır. 1 saat daha süren kurutma işleminin ardından 45 C lik su banyosunda bekletilen, % 0,6 agar içeren 8 ml TSA yumuşak agara 100 µl indikatör mikroorganizma eklenip karıştırılmış ve yüzeyleri kurutulan petri kutularına dökülerek yayılmıştır. Yayılan yumuşak agar katılaştıktan sonra petriler inkübasyona bırakılmıştır. İndikatör mikroorganizma olarak kullanılan Lb. bulgaricus 6301 için MRS agar (% 1,5 agar) ve MRS yumuşak agar (% 0,6) ; M. luteus ve patojen mikroorganizmalar için ise TSA (% 1,5 agar) ve TSA yumuşak agar (% 0,6) kullanılmıştır. S. thermophilus suşlarında agar difüzyon testi S. thermophilus suşları, % 1 oranında M17 broth besiyerlerinde geliştirilmiş ve diğer işlemlere de anlatıldığı gibi devam edilmiştir Kontrollerin hazırlanması Lb. bulgaricus suşlarının kontrollerinin hazırlanması Antimikrobiyel aktivitesi belirlenecek Lb. bulgaricus suşlarının MRS broth besiyerinde 18 saat inkübasyonlarından sonra ph değerleri ölçülmüş ve en düşük ph değeri esas alınarak 10 ml lik MRS broth besiyerinin ph sı % 10 luk laktik asit çözeltisi ile ayarlanmış ve filtreden geçirilerek kontrol olarak kullanılmıştır. S. thermophilus suşlarının kontrollerinin hazırlanması S. thermophilus suşları için M17 broth besiyeri kullanılmış ve de anlatıldığı gibi kontrol tüpleri hazırlanmıştır.

43 İndikatör bakterilerin hazırlanması İndikatör olarak kullanılan bakteriler (Micrococcus luteus, Bacillus cereus, Salmonella enteretidis, Echerichia coli, Yersinia enterocolytica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes ) ile bunlara eklenen, ön denemeler sonucunda tesadüfen seçilen bir laktobasil suşu kullanılmıştır. Bu bakterilerden M. luteus 30 C, Lb. bulgaricus C ve geri kalan bakterilerse 37 C de 18 saat süreyle inkübe edilip antimikrobiyel aktivite testlerinde kullanılmıştır. Ön denemeler sonucunda duyarlı olduğu saptanan bir laktobasil suşu da dahil olmak üzere tüm indikatör bakteriler ve optimum gelişme sıcaklıkları aşağıda verilmiştir. Bu bakterilerden M. luteus ve patojen mikroorganizmalar Tryptic Soy broth besiyerinde, Lb. bulgaricus MRS broth besiyerinde optimum gelişme sıcaklıklarında 18 saat inkübe edilmiş, kuyu difüzyon ve agar difüzyon testlerinde yumuşak agara karıştırılarak kullanılmıştır. İndikatör Bakteriler Optimum gelişme sıcaklığı ( C) Micrococcus luteus 30 Bacillus cereus 37 Salmonella enteretidis 37 Echerichia coli 37 Yersinia enterocolitica 37 Staphylococcus aureus 37 Listeria monocytogenes 37 Lactobacillus bulgaricus

44 Bakterilerin asetaldehit üretim yeteneklerinin belirlenmesi Asetaldehit miktarının ölçülmesinde Neish (1952) tarafından önerilen destilasyon esasına dayalı bir yöntem kullanılmıştır (Beyatlı 1982, Aslım 1994, Tunail vd. 2002). 20 ml lik steril SM besiyerine % 1 oranında aktif kültürden aşılama yapılmış C de 24 saat süreyle inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda örnekler 1:1 oranında destile su ile seyreltilerek, destilasyon aletinin hazne kısmına konmuş ve 10 ml destilat toplanıncaya kadar destilasyon işlemine devam edilmiştir. Toplanan bu destilat bir behere alınmış ve üzerine 1 ml 0,25 M NaHSO 3 (Merck, Germany) ve 0,1 N NaOH (Merck, Germany) ilave edilerek ph 9 a ayarlanmıştır. ph sı ayarlanan örneklerin ağzı alüminyum folyo ile kapatılarak 15 dakika oda sıcaklığında bekletilmiş, bu sürenin sonunda örneğin üzerine 1 ml nişasta indikatörü damlatılarak derişik iyot çözeltisi (0,1 N) ile koyu mor renk oluşana kadar titrasyon yapılmıştır. Burada iyot çözeltisinin harcanan miktarı önemli değildir. Oluşan koyu mor renkli çözelti üzerine 1-2 gram NaHCO 3 (Merck, Germany) eklenip karıştırılmıştır. Karışım berraklaşınca, seyreltik iyotla (0,005 N) titre edilip, harcanan iyot miktarına göre aşağıdaki formülden oluşan asetaldehit miktarı hesaplanmıştır. Asetaldehit (ppm) : 44x A x B x 1000 C 44: Asetaldehitin mol ağırlığı (g) A: İyottan Harcanan Miktar (ml) B: İyot Çöz. Kesin Normalitesi C: Örnek miktarı(ml)

45 38 Kullanılan çözeltiler Nişasta çözeltisi (% 1 lik): 0,259 gram Nişasta (Sigma) 25 ml destile suda berraklaşıncaya kadar kaynatılmış ve her çalışmada taze olarak hazırlanmıştır. 0,1 N İyot çözeltisi: 40 gram KI ve 12,8 gram resublime iyot (Merck, Germany) üzerine destile su ilave edilip karıştırılmış ve iyice çözüldükten sonra hacim 1000 ml ye tamamlanmıştır. 0,005 N İyot çözeltisi: Hazırlanan 0,1 N iyot çözeltisinden N 1.V 1 = N 2.V 2 formülünden hesaplanan miktar kadar alınarak 1000 ml ye destile su ile tamamlanmış ve 0,005 N iyot çözeltisi hazırlanmıştır. İyot çözeltileri, ağızları kapalı koyu renkli şişelerde muhafaza edilmiştir. 0,25 N NaHSO 3 çözeltisi: 2,6 gram NaHSO 3 (Merck, Germany) veya 2 gram Na 2 S 3 O 3 (Riedel-de Haën) tartılarak 100 ml destile suda çözülmüştür. Bu çözelti denemelerden hemen önce hazırlanmış ve taze olarak kullanılmıştır Bakterilerin proteolitik aktivitelerinin belirlenmesi Bakterilerin SM besiyerindeki proteolitik aktiviteleri, bu mikroorganizmaların süt proteinini hidroliz etmeleri sonucu ortaya çıkan parçalanma ürünlerinin Hull (1947) metoduna göre spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile belirlenmiş ve tirozin ekivalenti cinsinden ifade edilmiştir (Citti vd 1963). Burada Hull (1947) yönteminden farklı olarak

46 39 spektrofotometrik ölçümden hemen önce 5000 dv/dk hızla 15 dk santrifüj işlemi uygulanmıştır (Tunail 1978). Aktif kültürler, % 1 oranıyla 5 ml lik SM besiyerine inoküle edildikten sonra 42 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda örneklere 1 ml destile su ve 10 ml 0,72 N TCA ilave edilerek karıştırılmış ve 10 dakika bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda karışım, Whatman 42 nolu filtre kağıdı ile süzülmüştür. Elde edilen filtrattan 5 ml alınıp, 50 ml lik erlene konmuş ve üzerine 10 ml Na 2 CO 3 - Na 4 P 2 O 7 çözeltisinden ilave edilip karıştırılmıştır. Örneklerin üzerine 3 ml fenol ayıracı eklenip maksimum mavi rengin gelişmesi için 5 dakika beklenmiştir. Bu işlem sonunda örnekler 5000 devir/dakika hızda 15 dakika santrifüj edilmiş ve santrifüj sonunda üstte elde edilen süpernatantların, spektrofotometrede (MILTON ROY COMPANY, Spectronic 20D) 650 nm dalga boyunda absorbansları (OD) ölçülmüştür. Ölçümlerde şahit olarak, steril 5 ml SM besiyerine yukarıda belirtilen işlemler uygulanarak elde edilen sıvı kullanılmıştır. Kullanılan çözeltiler Triklorasetik asit: 0,72 N TCA (Riedel-de Haën) hazırlanmıştır. Na 2 CO 3 - Na 4 P 2 O 7 çözeltisi : 75 g Na 2 CO 3 (Scharlau) ve 10 g Na 4 P 2 O 7 (Sigma) 500 ml destile suda çözülerek hazırlanmıştır. Fenol ayıracı: Bir birim Folin ciocalteus (Fluka) çözeltisi, iki birim destile suyla karıştırılarak ve kullanmadan önce taze olarak hazırlanmıştır. Tirozin standart kurvesinin hazırlanışı 100 mg tirozin (Amresco) 500 ml destile suda çözülmüş, bu çözeltiden 0,02; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ve 1,0 mg tirozin/5 ml SM olacak şekilde standart oluşturularak deki işlemler uygulanıp standart kurve çizilmiştir.

47 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1 Suşların Fajlara Dirençleri Bu çalışmada; 43 adedi pastörize sütlerden, 30 adedi çiğ sütlerden izole edilmiş ve 10 adet endüstriyel olmak üzere toplam 83 S. thermophilus suşunun, çiğ süt kökenli 2 adet S. thermophilus ve 7 adet Lb. bulgaricus fajına (φ) karşı dirençleri (faj-konakçı özgüllüğüne dayanan litik şablonları) belirlenmiş, ayrıca aynı fajlara karşı pastörize sütlerden izole edilmiş 12 adet, çiğ sütlerden izole edilmiş 22 adet, miks yoğurt kültürü kökenli 5 adet ve 1 adet de referans suş olmak üzere toplam 40 Lb. bulgaricus suşunun da direnç durumları araştırılmıştır. Çizelge 4.1' den de izlenebileceği gibi pastörize sütlerden izole edilen 43 adet S. thermophilus suşu (St 216-St 652) ile çiğ süt kökenli 30 adet S. thermophilus suşunun (St.1.2-St.TH-3) kendi türünün 2 fajı ile (φst. 1B3A ve φst. 2B3A) liziz plağı vermemiştir. Yine tüm suşlar St. MR27a suşu hariç Lb. bulgaricus fajlarından 7' sine de tam direnç göstermiş, içlerinden yalnızca St. MR27a suşu kendi türünün fajları olmayan bu fajlardan üçüne (φlbv1+a, φlby4+a, φlby4+z) duyarlı bulunmuş bir başka ifade ile cinsler arası heterolog konakçı olarak davranmıştır. 10 adet endüstriyel S. thermophilus suşundan (Ch-St-20.1-St. B3) 7 adedi hem streptokok hem de laktobasil fajlarına karşı dirençli bulunurken, St. 231 suşu tüm fajlara karşı duyarlı olup liziz göstermiştir. St. B3 ve St. 709 suşları kendi fajlarına duyarlı oldukları gibi Lb. bulgaricus fajlarından ikisi (φlbv2+a, φlbv2+z) ile de liziz plakları oluşturmuşlardır. Genellikle her bakteri cinsi için spesifik fajların olabileceği düşünülmüş ise de bu fikir şimdiye değin tam sonuç vermemiştir (Arda 2000). Bakteriyofajların genelde türlere özgül olduğu kabul görmektedir. Bununla beraber o türün bireyleri arasında da türe özgül fajlara karşı direnç gösterenler vardır. Belli bir türe ait suş, o türe özgül bir çok faj tarafından infekte edilebileceği gibi bir faj da kendi homolog konakçısının dışında o türe ait bir çok duyarlı suşu infekte edebilir (Aydar ve Tunail 1995). 40

48 Çizelge 4.1 Pastörize sütler (43 adet) ile çiğ sütlerden (30 adet ) izole edilen ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının çiğ süt orijinli S. thermophilus ve Lb. bulgaricus fajlarına duyarlılıkları Suş kodu Faj kodu φst 1B3A φst 2B3A φlb R+A φlb R+Z φlb V2+A φlb V2+Z φlb V1+A φlb Y4+A St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St φlb Y4+Z 41

49 Çizelge 4.1 Pastörize sütler (43 adet) ile çiğ sütlerden (30 adet ) izole edilen ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının çiğ süt orijinli S. thermophilus ve Lb. bulgaricus fajlarına duyarlılıkları (devam) Suş kodu Faj kodu φst 1B3A φst 2B3A φlb R+A φlb R+Z φlb V2+A φlb V2+Z φlb V1+A φlb Y4+A St St St St St St St St St St St St St St. 3.2.i St St. 5.3.i St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St. 24b St St St. MR27a St. TH φlb Y4+Z 42

50 Çizelge 4.1 Pastörize sütler (43 adet) ile çiğ sütlerden (30 adet ) izole edilen ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının çiğ süt orijinli S.thermophilus ve Lb. bulgaricus fajlarına duyarlılıkları (devam) Suş kodu Faj kodu φst 1B3A φst 2B3A φlb R+A φlb R+Z φlb V2+A φlb V2+Z φlb V1+A φlb Y4+A Ch-St St. Y St. Y St. V St. V St St St St. CH St. B φlb Y4+Z Bir türün spesifik fajının izolasyonunda her bir faj için önce bir konakçı ortaya çıkar, fajın bu homolog konakçısının dışında farklı suşlar da faja konakçı olarak hizmet edebilirler. Faj plak etkinliği (pfu/ml) farklı olan bu suşlar heterolog konakçılardır. Aynı tür içinde heterolog konakçılar olduğu gibi (Kivi et al. 1987, bakınız Çizelge 2.1 ; Kaleli vd. 2004, bakınız Çizelge 2.2) türler arası heterolog konakçılara da rastlanmaktadır. Örneğin Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Streptococcus diacetilactis suşlarına özgül fajlardan bazılarının her üç bakteriyi de lize ettiği gösterilmiştir (Öner 1986). Bununla beraber bugün yukarıda belirtilen her üç türün Lactococcus lactis suşunun alt türleri olduğu bilindiğinden bu üç alt türün birbirlerinin özgül fajlarına heterolog konakçı olarak davranmaları fazlaca hayret uyandırmamaktadır. Diğer taraftan Mata et al. (1986) de Lb. bulgaricus ve Lactobacillus lactis konakçıları ile izole ettikleri 14 virülent ve 2 temperent fajı, 2' si Lb. lactis (LKT, LL23) 5 suşla karşılaştırarak fajların litik şablonunu çıkardıkları çalışmalarında; Lb. bulgaricus suşları ile izole edilen fajlardan 11' inin Lb. lactis LKT suşunu, 8' inin ise Lb. lactis LKT ile birlikte Lb. lactis LL23 suşunu da lize ettiğini göstermişlerdir. Lb. lactis suşlarında plak etkinliği düşük olsa da bu suşlar heterolog konakçı olarak davranmıştır (bakınız Çizelge 2.3). Ayrıca aynı çalışmada lizogen özellikteki LT 1 ve LT 2 Lb. bulgaricus suşlarından φmv1 ve φmv4 temperent fajlarının profaj indüksiyonu indikatör Lb. lactis LKT kullanılarak başarılmıştır. Benzer şekilde 43

51 Cluzel et al. (1987), Lb. bulgaricus LT 4 (0448) suşundaki profajı mitomisin C (MC) ile indükleyerek 0448 temperent fajını Lb. lactis CNRZ 326 indikatör bakterisiyle elde etmiştir. Ne var ki her iki laktobasil türü akraba kabul edildiğinden (Tunail ve Köşker 1989, Riemelt et al. 1996) aynı faja türler arası heterolog konakçı bulunması veya temperent faj izolasyonlarında diğer türün temperent fajına indikatör bakteri görevi üstlenmesi anlaşılır bir durumdur. Ancak akraba olmayan türler arasında da heterolog konakçılara ender de olsa rastlanmıştır. Ekşi hamurdan izole edilen Lactobacillus fermentum' a özgül 2 virülent fajdan birinin türün konakçılarının dışında, test edilen Lactobacillus brevis ve Lactobacillus buchneri türlerinden birincisine konakçı özgüllüğü gösterdiği, ikincisine ise dirençli bulunduğu gösterilmiştir (Foschino et al. 1995). Fajlar, genellikle bakteri türlerine özeldir. Diğer bir deyimle örneğin B. anthracis fajı sadece kendi türünün konakçılarını lize eder. Diğer tür ve cinslere etkisizdir. Ancak bu kuralın da değişmez olmadığı, E. coli kökenli temperent P2 fajının çoğunlukla E. coli ve Shigella suşlarıyla üremesi, ancak Serratia suşlarında da çoğalabilmesiyle (Bertani et al. 1967), ayrıca Pastörella fajlarının da Shigella ve Salmonella bakterilerini lize etmeleriyle gösterilmiştir (Arda 2000). Bugüne kadar S. thermophilus suşlarının kendi fajları dışında, simbiyoz partneri olan Lb. bulgaricus fajlarına heterolog konakçı olarak davrandıklarına veya tersi duruma işaret eden bir yayına rastlanmamıştır. Nitekim bu çalışmada kullanılan çiğ süt ve endüstriyel miks kültür kökenli suşları; yoğurt, PAS, ayran, bulk' tan izole edilen 23 adet S. thermophilus ve 25 adet Lb. bulgaricus fajına karşı test eden Kaleli vd. (2004) tarafından S. thermophilus suşlarının denenen tüm laktobasil fajlarına karşı dirençli oldukları, aynı şekilde endüstriyel suşların da heterolog konakçı olarak davranmadıkları gösterilmiştir. Üzerinde en fazla çalışılan laktokoklara özgül bazı fajların tür içindeki konakçı dizgelerinde görülen değişimlerin nedenleri olarak; bakterilerde bulunan restriksiyon/modifikasyon (R/M) faj direnç sistemleri, faj almaç bölge değişimleri, faj mutasyonları, faj proteinlerinin modifikasyonları ve suşların lizogeniye geçişleri ile duyarlı oldukları fajlara karşı direnç oluşturmaları gösterilmektedir (Akçelik 1996). Görüldüğü gibi faj-konakçı özgüllüğü pek çok nedenle değişebilmekte o nedenle de faj sınıflandırması ve taksonomik çalışmalar için önem taşımamakta ve bir kriter oluşturmamaktadır (Mata and Ritzenthaler 1988, 44

52 Benbadis et al. 1990). Bu çalışmada saptanan cinsler arası heterolog konakçı özelliğinin S. thermophilus suşlarında ender de olsa varlığı saptanan yeni bir özellik mi olduğunu, yoksa laktokoklarda olduğu gibi konakçı dizge değişikliği nedenlerinden birine bağlı olarak mı geliştiğini yanıtlamak veya bu konuda yorum yapmak ne yazık ki eldeki yetersiz verilerle mümkün gözükmemektedir. Yapılan bu tez çalışmasında faja direncin saptanması için kullanılan fajlar, özellikle S. thermophilus fajları oldukça sınırlı sayıdadır. Bununla birlikte test sonuçları daha önceki araştırma bulgularıyla karşılaştırıldığında sınırlı faj sayısı bile yerel suşların faja çok dirençli karakterlerinin ortaya çıkması için yeterli olmuştur. Çizelge 4.1' in incelenmesinden açıkça görüldüğü gibi tüm yerel suşlar türe özgül fajlarına dirençli bulunmuş, ayrıca St. MR27a suşu hariç, beklendiği üzere 7 laktobasil fajına da direnç göstermiştir. Endüstriyel suşlar ise hem kendi fajlarına hem de laktobasil fajlarına 7/10 oranıyla dirençli bulunmuş, St. B3, St. 709 ve St. 231 ise streptokok fajları ile lize vermiştir. Tüm fajlar dikkate alındığında endüstriyel suşlarla iki litik şablon [( + ), ( + + +)] ortaya çıkmış ve buna göre endüstriyel suşlar; tam dirençli (7 adet), oldukça duyarlı (2 adet) ve tam duyarlı (1 adet) olmak üzere 3 grupta toplanmıştır. Bu çalışmada kullanılan çiğ süt kökenli 30 yerel S. thermophilus suşunu (St. 1.2-St. TH- 3) ve endüstriyel kökenli, Ch-St-20.1 hariç, 9 suşu daha önce çalışmalarında kullanan ve yoğurt, ayran, bulk ve PAS örneklerinden izole ettikleri 23 S. thermophilus ve 25 Lb. bulgaricus fajına karşı test eden Tunail vd. (2002), yerel suşlarda dirençliliği bu çalışmada olduğu gibi % 100 oranıyla saptarken, endüstriyel suşlarda dirençliliği 6/9 (% 66,7) oranıyla belirlemiştir. Suşlardan St. 231 ve St. B3 tam duyarlı, St. 709 da çok duyarlı suş olarak dikkat çekmiştir. Bu çalışmada ilk kez test edilen pastörize süt kökenli yerel S. thermophilus suşlarının da faj direnç özelliğini paylaşması yerel suşların tartışmasız endüstriyel suşlardan üstün olduğunu göstermiştir. Genellikle fajlar homolog konakçı yüzeylerine % 90 veya daha yüksek etkinlikle adsorbe olurlar. Fajların bağlanamamaları veya çok zayıf tutunmaları dirençli suşların ortaya çıkması demektir. Ancak fajlarda başka direnç sistemleri de mevcuttur (Neve 45

53 1996). Yerel ve endüstriyel S. thermophilus suşlarında görülen faja direnç, büyük olasılıkla fajların konakçı yüzeyine tutunamaması, zayıf tutunması veya sahip oldukları faj direnç sistemleri ile ilgilidir. Faj direnç sistemleri çok iyi tanımlanan Lactococcus suşlarının aksine S. thermophilus suşlarında faj direnç sistemleri yeterince araştırılmamış ve bu suşlarda tanımlanan çok az direnç sistemi bulunmuştur. Benbadis et al. (1990) tarafından yoğurt kültürlerinin S. thermophilus suşlarında restriksiyon/modifikasyon (R/M) faj direnç sisteminin bulunduğu ileri sürülmüş, Sebastian and Jäger (1992) de inceledikleri 6 adet S. thermophilus suşunun beşinde; GATC sekansını hedef alan, bu sekansı tanıyarak kesebilen ve sekanstaki sitosinleri metilleyen bir R/M sisteminin olduğunu göstermiştir. S. thermophilus ta konakçı içinde faja ait geç gen proteinlerinin sentezinin engellendiği abortif infeksiyon tipinde direnç mekanizmasına benzer bir sistemin varlığına da işaret edilmiş ancak bu sistem henüz kesinlik kazanmamıştır (Moineau vd. 1995). Son olarak da Tükel vd. (2004) tarafından bu çalışmada da yer alan dirençli suşlardan St. MR27a ve St. 7.6 suşlarında faj adsorbsiyonunun engellenmesi veya inhibisyonu tipinde faj direnç sistemi tanımlanmıştır. Bu direnç sisteminde faj tipine özgül konakçı almaç bölgelerinde oluşan değişimlerle, fajların bakteri yüzeyine tutunmaları bloke edilmektedir. Bu sisteme sahip St. MR27a ve St.7.6 suşlarında faj direnç özelliğinin sırasıyla 40.7 kb ve 44.3 kb büyüklükte plazmidlerde kodlandığı gösterilmiştir. Faj injeksiyonun engellenmesi tipindeki faj direnç sistemi ise şimdiye değin S. thermophilus suşlarında tanımlanmamıştır. Çok sınırlı sayıdaki bu araştırmalarla S. thermophilus suşlarının direnç sistemleri henüz aydınlatılabilmiş değildir. Kaleli vd. (2004) doğal suşlarda lizogen karakterin bulunmamasını ve suşların güçlü faj direncini, onların endüstriyel kullanımda olmamalarına, çiğ sütlerdeki faj titre düşüklüğü (Neve 1996) nedeni ile homolog fajlarıyla rastlaşmadıklarına ve henüz fajlarına karşı duyarlılık geliştirmediklerine bağlamışlardır. Sonuç olarak; faj mutasyonlarına veya bakterilerdeki faj direnç sistemlerinin varlığına, mekanizmanın tipine ve sistemlerin korunmasına veya kaybedilmesine bağlı olarak faj-konakçı özgüllüğünün değişebildiği, faj akrabalıklarının sabit olmadığı unutulmamalıdır. O nedenle işletmelerde faj kontrolü için rotasyon sisteminde kullanılacak suş veya kültür seçiminde suşun veya miks kültürün işletmenin dominant yerel fajlarından oluşan bir koleksiyona karşı test edilerek dirençli 46

54 bulunanların kullanılması gerekmektedir. Starter firma bildirimlerine ise fazlaca itibar edilmemelidir (Daly 1983, Daly et al. 1996, Durlu-Özkaya vd. 1999, Tunail vd. 2002). İzolasyonları ve identifikasyonları yapılmış olan; pastörize süt orijinli 12 suş (Lb 132 Lb 1472), çiğ süt orijinli 22 suş (Lb.406 Lb.7006), 1 adet referans suş (Lb.11842), 1 adet tek yoğurt kültürü (Ch-Lb12) ile miks yoğurt kültürlerinden izole edilmiş 4 endüstriyel suş (Lb. Y4, Lb. V1, Lb. V2, Lb. 231) olmak üzere toplam 40 Lb.bulgaricus suşu 9 faja karşı test edilmiş ve sonuçlar Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelge 4.2 Pastörize (12 adet) ve çiğ sütlerden (22 adet) izole edilen ve endüstriyel Lb.bulgaricus suşlarının çiğ süt orijinli S.thermophilus ve Lb.bulgaricus fajlarına duyarlılıkları Suş kodu φst 1B3A φst 2B3A φlb R+A φlb R+Z Faj kodu φlb V2+A φlb V2+Z φlb V1+A φlb Y4+A Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb φlb Y4+Z 47

55 Çizelge 4.2 Pastörize (12 adet) ve çiğ sütlerden (22 adet) izole edilen ve endüstriyel Lb.bulgaricus suşlarının çiğ süt orijinli S.thermophilus ve Lb.bulgaricus fajlarına duyarlılıkları (devam) Suş kodu φst 1B3A φst 2B3A φlb R+A φlb R+Z Faj kodu φlb V2+A φlb V2+Z φlb V1+A φlb Y4+A Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Endüstriyel Suş kodu Ch.Lb Lb. Y Lb. V Lb. V Lb φlb Y4+Z Bilindiği gibi ΦSt. 1B3A ve ΦSt. 2B3A S. thermophilus fajlarıdır ve Lb. bulgaricus yerel suşları, beklendiği üzere, bu fajlara genelde dirençli bulunmuştur. Bununla beraber S. thermophilus suşlarında görüldüğü gibi cinsler arası heterolog konakçı davranışı Lb. 48

56 bulgaricus suşlarında da sergilenmiştir. Çiğ süt kökenli Lb. bulgaricus suşlarından 8 i (8/22), ΦSt. 1B3A ya ve 9 u da (9/22), ΦSt. 2B3A ya heterolog konakçı vazifesi görmüş ve bu fajlarla liziz göstermiştir. Her iki faj ile lize olan suşlar; Lb. 412, Lb. 3701, Lb. 4902, Lb. 4007, Lb. 5006, Lb ve Lb tür. Tüm yerel Lb. bulgaricus suşları, yerel S. thermophilus suşlarının aksine kendi fajlarına karşı genelde aşırı duyarlı bulunmuştur. Test edilen suşlardan sadece Lb suşu 9/9 direnç özelliği ile en dirençli suş olarak belirlenmiştir. Ayrıca Lb suşu da 8/9 dirençlilik özelliği göstererek Lb suşunu takip etmiştir. Bu iki suşun dışında birkaç suşun daha kısmen dirençli oldukları saptanmıştır. Referans suş (Lb ) da 7/9 direnç oranıyla 3. dirençli suş konumundadır. Çalışmada kullanılan endüstriyel kökenli 5 adet Lb. bulgaricus suşunun kendi fajlarına duyarlılıkları incelendiğinde içlerinden iki suşun (Ch-Lb-12 ve Lb. 231) tam dirençli, diğerlerinin de faja direnç spekturumlarının oldukça geniş olduğu anlaşılmıştır. Ancak çoğunun S. thermophilus fajlarına heterolog konakçı konumunda olması, içlerinden sadece Ch-Lb -12 suşunu seçkin kılmaktadır. Lb.bulgaricus suşlarının kendi fajlarına genelde çok duyarlı oldukları daha önce de saptanmıştır. Bu çalışmada kullanılan çiğ süt kökenli 22 suşu ve endüstriyel suşlardan da 4 ünü içeren toplam 24 yerel ve 7 endüstriyel suşun; yoğurt, PAS, bulk ve ayran örneklerinden izole edilen 25 Lb.bulgaricus fajına karşı direncinin araştırıldığı bir çalışmada hem endüstriyel suşların (Tunail vd. 2002) hem de yerel suşların (Tükel vd. 2003) çok duyarlı oldukları, ancak yine de 24 yerel suştan 6 sının (Lb. 406, Lb. 412, Lb. 2001, Lb. 2004, Lb. 4007, Lb. 6502) kendi fajlarına karşı 24/24 direnç oranıyla tam direnç gösterdikleri Lb ve Lb nin de oldukça dirençli oldukları saptanmış, endüstriyel suşlarda ise hepsinin duyarlı olduğu belirlenmiştir. Yukarıda kodları verilen dirençli suşlardan seçilen Lb ve Lb de faj direnç sistemleri araştırılmış, bu iki suşta faj injeksiyonunun engellenmesi tipinde faj direnç siteminin varlığı belirlenmiş ve bu özelliği determine eden genin kromozomal DNA kökenli olduğu anlaşılmıştır (Tunail vd. 2002). Bu iki suştan Lb zaman içinde yitirildiğinden bu çalışmaya dahil edilmemiş ancak Lb ve diğer dirençli suşlar 9 faja karşı araştırılmıştır. Lb. 49

57 406, Lb. 412, Lb. 4007, Lb nin faja karşı direnç özelliğini koruyamadıkları, buna karşın faj injeksiyonunun engellenmesi tipinde faj direnç sistemine sahip olduğu belirlenen Lb in faja dirençlilik özelliğini koruduğu Çizelge 4.2 den anlaşılmaktadır. LAB de özellikle de Lactococcus cinsi üyelerinde plazmid veya kromozomal DNA üzerinde kodlanmış 4 farklı faja direnç sistemi gösterilmiştir. Bunlar faj infeksiyon sürecinin aşamaları ile örtüşme sırasıyla; faj adsorbsiyonunun inhibisyonu, faj injeksiyonunun engellenmesi, konakçı restriksiyon/modifikasyon aktiviteleri ve abortif infeksiyon tipindeki faj direnç sistemleridir (Akçelik ve Tunail 1992, Hill 1993, Neve 1996, Moineau et al. 1997, Allison and Klaenhammer 1998). Faj direnç sistemleri Lb. bulgaricus ve S. thermophilus suşlarında da araştırılmaya başlanmış, plazmid veya kromozomal DNA kodlu bazı faj direnç sistemlerinin varlığı da bazı suşlarda gösterilmiştir (Sechaud et al. 1988, Bruttin et al. 1997, Tunail vd. 2002, Tükel vd. 2004). Bununla birlikte genetik doneler henüz yeterli düzeyde değildir. Ancak genel bir ifadeyle faja duyarlı suşlarda faj direnç sistemlerinin bulunmadığı veya var olan sistemleri kaybeden suşların duyarlı hale dönüşebilecekleri olasılıklar arasındadır. Lizogeni de her ne kadar bir direnç sistemi değilse bile profaj hücreye bir bağışıklık kazandırdığı ve suş artık kendi fajı veya çok yakın akraba fajlar tarafından infekte edilemediği için (Neve 1996) faja duyarlı bir suşun dirençli hale geçmesine neden olabilir. Bakteride lizogenizasyona geçiş duyarlı suşların kendi fajına direnç kazanmasına olanak sağlar (Akçelik 1996). 4.2 Asit Aktivitesi Çeşitli pastörize ve çiğ süt örneklerinden izole edilmiş 73 yerel S. thermophilus ve 34 Lb. bulgaricus ile 9 u miks yoğurt kültürlerinden izole edilmiş 10 endüstriyel S. thermophilus ve 4 ü aynı miks kültürlerden izole edilmiş 5 endüstriyel Lb. bulgaricus suşu ve 1 adet de referans suş (Lb 11842) olmak üzere toplam 123 suşun asit aktivitesi; suşların aktif kültürlerinin SM besiyerine % 1 inokülasyonundan sonra inkübasyonun başlangıcında, 6. ve 24. saatlerinde ölçülen ph değerlerinin farkı ( ph) alınarak 50

58 belirlenmiş ve sonuçlar Çizelge 4.3, Çizelge 4.4, Çizelge 4.5 ve Çizelge 4.6 da verilmiştir. Suşların asit aktivitelerinin belirlenmesinde araştırıcılar kullandıkları yöntemlere göre sonuçları; ph, % asitlik, mg laktik asit/ ml olarak verdiklerinden ve denemelerinde değişik inkübasyon sıcaklıkları, inkübasyon oranları ve süreleri kullanıldıklarından ayrıca suş farklılıkları da sonuçları etkilediğinden araştırma bulgularının birbirleriyle karşılaştırılması pek mümkün olamamaktadır. O nedenle bu çalışmada yöntem ve deneme parametreleri sabit tutularak endüstriyel ve yerel suşlarda saptanan asit aktivitelerinin karşılaştırılması yoluna gidilmiştir. Pastörize sütlerden izole edilen ve endüstriyel kökenli S. thermophilus suşlarının asit aktivitelerini topluca gösteren Çizelge 4.3 ün sonunda yer alan 10 adet endüstriyel S. thermophilus suşundan 4 ünün asit aktivitesi yüksek ( ph:1,08-1,54), 4 ünün orta ( ph:0,60-0,97), 2 sinin ise düşük ( ph:0,09-0,11) bulunmuş ve buna göre suşlar aşağıda gösterildiği gibi 3 grup içinde toplanmıştır. I. GRUP Yüksek asit üretimi II. GRUP Orta asit üretimi III. GRUP Düşük asit üretimi Suş Kodu ph Suş Kodu ph Suş Kodu ph St. Y1 1,54 Ch-St ,85 St. CH-1 0,09 St. Y4 1,43 St ,60 St. B3 0,11 St. V1 1,08 St ,97 St. V2 1,25 St ,79 51

59 Çizelge 4.3 Pastörize sütlerden izole edilen (43 adet) ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının asit aktivite test sonuçları Suş kodu Başlangış 6 saatlik ink. ph 24 saatlik ink. ph ph ph (6 saat) ph (24 saat) St 216 6,55 5,84 0,71 5 1,55 St 217 6,51 5,55 0,96 4,17 2,34 St 218 6,53 6,03 0,5 5,5 1,03 St 219 6,51 6,13 0,38 4,89 1,62 St 229 6,46 5,68 0,78 4,58 1,88 St 235 6,44 5,83 0,61 4,93 1,51 St 236 6,42 5,88 0,54 5,13 1,29 St 238 6,43 6,07 0,36 5,41 1,02 St 239 6,42 6,04 0,38 5,65 0,77 St 411 6,45 5,71 0,74 4,74 1,71 St 412 6,44 6,02 0,42 5,23 1,21 St 413 6,42 6,04 0,38 4,92 1,5 St 421 6,41 6,07 0,34 4,88 1,53 St 422 6,41 5,8 0,6 4,86 1,55 St 432 6,4 5,84 0,56 4,81 1,59 St 435 6,37 5,81 0,56 4,82 1,55 St 436 6,36 6,1 0,26 5,13 1,23 St 437 6,39 6,1 0,29 4,98 1,41 St 440 6,43 6 0,43 5,7 0,73 St 447 6,39 6,11 0,28 5,7 0,69 St 481 6,39 5,66 0,73 4,68 1,71 St 525 6,36 5,74 0,62 4,79 1,57 St 526 6,37 5,67 0,7 4,81 1,56 St 533 6,42 5,84 0,58 5,22 1,2 St 534 6,4 5,84 0,56 5,27 1,13 St 535 6,43 6,17 0,26 6,03 0,4 St 537 6,41 5,89 0,52 5,08 1,33 St 542 6,4 5,78 0,62 5,16 1,24 St 543 6,36 5,76 0,6 4,97 1,39 St 545 6,32 5,55 0,77 4,93 1,39 St 552 6,31 5,87 0,44 5,41 0,9 St 553 6,29 5,87 0,42 4,98 1,31 St 614 6,34 5,94 0,4 4,97 1,37 St 622 6,3 5,98 0,32 5,13 1,17 St 624 6,34 5,97 0,37 5,78 0,56 52

60 Çizelge 4.3 Pastörize sütlerden izole edilen (43 adet) ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının asit aktivite test sonuçları (devam) Suş kodu Başlangıç 6 saatlik ink. ph 24 saatlik ink. ph ph ph (6 saat) ph (24 saat) St 626 6,35 5,96 0,39 5,77 0,58 St ,31 5,93 0,38 5,8 0,51 St ,31 5,86 0,45 4,85 1,46 St 641 6,3 5,75 0,55 4,94 1,36 St 643 6,34 5,88 0,46 5,08 1,26 St 645 6,22 5,98 0,24 5,72 0,5 St 646 6,3 6,04 0,26 5,81 0,49 St 652 6,25 5,98 0,27 5,46 0,79 Ch-St ,2 5,35 0,85 4,47 1,73 St. Y1 6,35 4,81 1,54 4,08 2,27 St. Y4 6,36 4,93 1,43 4,22 2,14 St. V1 6,35 5,27 1,08 4,32 2,03 St. V2 6,32 5,07 1,25 3,83 2,49 St ,35 5,75 0,6 4,41 1,94 St ,35 5,38 0,97 4,19 2,16 St ,34 5,55 0,79 4,26 2,08 St. CH-1 6,34 6,25 0,09 5,59 0,75 St. B3 6,33 6,22 0,11 4,1 2,23 Endüstride miks yoğurt kültürleri içinde sıklıkla kullanılan bu suşlar yıllarında bir proje kapsamında (Tunail vd. 2002) izole edildiklerinden, aradan geçen uzun sürenin, suşlarda asit aktivite kaybına neden olup olmadığı proje sonuçlarıyla karşılaştırılarak tespit edilmiştir. Proje kapsamında 5. saatte saptanan 1. grubun değerlerinin; ph:1,10-1,50 arasında, 2. grubun değerlerinin; ph: 0,60-1,00 arasında ve 3. grubun değerlerinin de 0,15-0,40 arasında bulunduğu görülmüştür. Bu çalışmada 6 saatlik inkübasyon süresi, proje çalışmasında ise 5 saatlik inkübasyon süresi esas alındığından endüstriyel suşlarda çok az da olsa bir miktar asit üretim düşüşlerinin olduğu söylenebilir. En fazla düşüş 3. grupta kendini göstermiştir. Bununla beraber genel olarak endüstriyel S. thermophilus suşlarının değerleri, yerel suşların değerlendirmelerine ışık tutacak düzeyde aktivitelerini korumuşlardır. 53

61 Pastörize sütlerden izole edilen 43 S. thermophilus suşundan 6 saatlik inkübasyon sonuçlarına göre yüksek asit üretimine sahip olan suş saptanamazken, orta derecede asitlik geliştiren 12 suş ( ph:0,60-0,96) belirlenmiştir. İçlerinden St 217, St 229, St 545, St 411 ve St 481 suşları sırasıyla 0,96; 0,78;0,77; 0,74 ve 0,74 ph değerleriyle ilk 5 sırayı almıştır. 43 adet pastörize süt orijinli S. thermophilus suşundan 18 adedinin yoğurt kültürlerine uygunluğunun araştırıldığı daha önce yapılan çalışmada (Yılmaz 2002) bu suşların 6 saatlik inkübasyon sonucunda SM ph sını bu çalışmaya oranla daha fazla düşürdükleri anlaşılmıştır. Ancak Yılmaz (2002) ın çalışmasında suşların inokülüm oranlarının % 2-3, bu çalışmada ise % 1 olduğu dikkate alınırsa farklılığın buradan kaynaklandığı anlaşılır. O nedenle pastörize süt orijinli S. thermophilus suşlarının asit aktivitelerinde geçen süreye karşın fazlaca kayıpların olduğu düşünülmemektedir. Çiğ sütlerden izole edilen 30 S. thermophilus suşunun asit aktivitesi sonuçlarının yer aldığı Çizelge 4.4 den; yerel suşlardan ph:1,06 değeriyle sadece St. TH-3 suşunun yüksek asit aktivitesi gösteren 1. grupta, St. 3.3, St. 23.1, St. 24.b ve St kodlu suşların ise ph:0,63-0,70 değerleriyle orta derecede asitlik geliştiren 2. grupta yer aldığı anlaşılmıştır. St. TH-3 suşu, 24. saat sonunda da suşlar arasında en yüksek olan ph:2,34 değerine ulaşarak en aktif ve en hızlı asitlik geliştiren suş olduğunu göstermiştir. Aynı yerel S. thermophilus suşlarını aynı amaçla test eden Tunail vd. (2002), elde ettikleri asit aktivitesi değerleriyle buradaki sonuçlar kıyaslandığında; suşların çoğunun asit üretimlerinde zamana bağlı bazen % 50 ye varan düşüşler görüldüğü gibi bazılarında da (5 adedinde) en fazla % 24 e varan artışlar olduğu dikkati çekmiştir. 54

62 Çizelge 4.4 Çiğ sütlerden izole edilen (30 adet) ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının asit aktivite test sonuçları Suş kodu Başlangış 6 saatlik ink. ph 24 saatlik ph ph ph (6 saat) ink. ph (24 saat) St ,39 6,07 0,32 4,94 1,45 St ,41 5,82 0,59 4,78 1,63 St ,34 6,12 0,22 5,03 1,31 St. 3.2.i 6,35 6 0,35 4,61 1,74 St ,35 5,71 0,64 4,53 1,82 St. 5.3.i 6,33 5,94 0,39 4,67 1,66 St ,33 5,88 0,45 4,84 1,49 St ,4 5,92 0,48 4,57 1,83 St ,38 5,99 0,39 4,84 1,54 St ,36 6,03 0,33 5 1,36 St ,36 5,92 0,44 4,57 1,79 St ,36 6,03 0,33 4,95 1,41 St ,32 6 0,32 4,93 1,39 St ,36 6,15 0,21 4,97 1,39 St ,34 5,93 0,41 4,79 1,55 St ,35 5,94 0,41 4,78 1,57 St ,31 6,03 0,28 4,54 1,77 St ,34 5,89 0,45 4,73 1,61 St ,32 5,86 0,46 4,63 1,69 St ,34 5,82 0,52 4,63 1,71 St ,35 5,9 0,45 4,76 1,59 St ,34 5,71 0,63 4,67 1,67 St ,36 5,78 0,58 4,73 1,63 St ,39 5,7 0,69 4,79 1,6 St ,36 5,82 0,54 4,69 1,67 St. 24.b 6,37 5,67 0,7 4,44 1,93 St ,35 5,77 0,58 4,73 1,62 St ,37 5,71 0,67 4,69 1,68 St. MR27a 6,32 6,02 0,3 4,3 2,02 St. TH-3 6,32 5,26 1,06 4,17 2,15 55

63 Çizelge 4.4 Çiğ sütlerden izole edilen (30 adet) ve endüstriyel kökenli (10 adet) S. thermophilus suşlarının asit aktivite test sonuçları (devam) Suş kodu Başlangıç 6 saatlik ink. ph 24 saatlik ink. ph ph ph (6 saat) ph (24 saat) Ch-St ,2 5,35 0,85 4,47 1,73 St. Y1 6,35 4,81 1,54 4,08 2,27 St. Y4 6,36 4,93 1,43 4,22 2,14 St. V1 6,35 5,27 1,08 4,32 2,03 St. V2 6,32 5,07 1,25 3,83 2,49 St ,35 5,75 0,6 4,41 1,94 St ,35 5,38 0,97 4,19 2,16 St ,34 5,55 0,79 4,26 2,08 St. CH-1 6,34 6,25 0,09 5,59 0,75 St. B3 6,33 6,22 0,11 4,1 2,23 Pastörize sütlerden izole edilen 12 adet ve endüstriyel kökenli 5 adet Lb. bulgaricus suşunun asit aktivite test sonuçları Çizelge 4.5 te görülmektedir. Ayrıca referans suş Lb de bu çizelgede yer almaktadır. Endüstriyel Lb. bulgaricus suşlarının tamamı yüksek asit aktivitesi göstermiştir. 5 suşun 6 saat sonunda ph değerleri 1,13-1,43 arasında, ortalama ph değerlerinin 1,26 olduğu bulunmuştur. Bu değerler daha önceki çalışmalarda (Tunail vd. 2002, Yılmaz 2002) aynı suşlar için saptanan ph: 0,75-1,50, ortalama ph:1,15 değerleriyle karşılaştırıldığında suşların asit aktivitelerini koruduğu söylenebilir. Çünkü önceki çalışmalarda 4 suş için 5 saatlik, 1 suş için 6 saatlik inkübasyon sonucu alınan değerler, doğal olarak ortalama değerin biraz daha düşük çıkmasına neden olmuştur. Endüstriyel suşlara oranla pastörize süt orijinli yerel Lb. bulgaricus suşlarının 6 saat sonunda belirlenen asit aktiviteleri ( ph: 0,59-0,89) düşük bulunmuştur. Bu suşlarda saptanan ortalama ph:0,7 değeri, endüstriyel suşların ortalama ph: 1,26 ve çiğ süt orijinli Lb. bulgaricus suşlarından 3 ü hariç 19 unun ortalama ph:1,27 değerleriyle (Çizelge 4.6) kıyaslanmayacak denli düşüktür. Her ne kadar 6. saat sonunda düşük aktiviteli olan bu suşlar 24. saat sonunda SM besiyerinde ph yı endüstriyel suşlar kadar, bazıları da daha fazla düşürseler ve aradaki farkı kapatsalar da bu suşlar 24 saat sonunda ortalama ph:3,89 değeriyle endüstriyel suşlardan (3,78) ve çiğ süt kökenli suşlardan (3,72) (Çizelge 4.6) daha düşük aktiviteye 56

64 sahiptirler. Zaten fajlara tamamen duyarlı bulunan bu suşların, asit aktivite değerleriyle de, starter potansiyellerinin bulunmadığı anlaşılmıştır. Çizelge 4.5 Pastörize sütlerden izole edilen (12 adet) ve endüstriyel kökenli (5 adet) Lb. bulgaricus suşlarının asit aktivite test sonuçları Suş kodu Başlangış 6 saatlik ink. ph 24 saatlik ink. ph ph ph (6 saat) ink. PH (24 saat) Lb 132 6,59 5,99 0,60 4,09 2,50 Lb ,46 5,87 0,59 3,85 2,61 Lb ,60 5,91 0,69 3,88 2,72 Lb ,54 5,84 0,70 3,88 2,66 Lb ,48 5,75 0,73 3,74 2,74 Lb ,69 5,80 0,89 3,82 2,87 Lb ,56 5,94 0,62 4,01 2,55 Lb ,53 5,75 0,78 3,89 2,64 Lb ,46 5,70 0,76 3,79 2,67 Lb ,50 5,87 0,63 3,96 2,54 Lb ,52 5,72 0,80 3,85 2,67 Lb ,48 5,78 0,70 3,88 2,60 Lb ,20 4,84 1,36 3,82 2,38 Ch-Lb ,47 5,34 1,13 3,79 2,68 Lb Y4 6,19 4,76 1,43 3,70 2,49 Lb V1 6,20 5,03 1,17 3,78 2,42 Lb V2 6,18 4,91 1,27 3,67 2,51 Lb 231 6,18 4,90 1,28 3,98 2,20 Lb 11842: Referans suş Pastörize süt kökenli yerel Lb. bulgaricus suşlarının aksine çiğ süt orijinli yerel Lb. bulgaricus suşları gerek 6. saat gerekse 24. saat ph değerleriyle endüstriyel suşlarla boy ölçüşür durumdadır (Çizelge 4.6). İçlerinden yalnızca 3 suş (Lb. 4601, Lb ve Lb. 6503) 6. saat sonunda sırasıyla 1,07; 0,59; 0,70 ph değerleri göstermiş ve düşük asit aktiviteli suşlar olarak tanımlanmıştır. Çiğ süt orijinli aynı suşların kullanıldığı bir projede (Tunail vd. 2002) inkübasyonun 5. saatinde saptanan ph değerlerinin Çizelge 4.6. da saptanan 6. saat değerlerinden çok düşük olduğu dikkati çekmiştir. Önceki çalışmalarda (Tunail vd. 2002) en yüksek asit aktivitesi gösteren 10 suşta 5. saat sonundaki ph 0,70-0,90, diğer 12 suşta da 0,05 0,55 arasında saptanmıştır. Bu çalışma ile ortaya çıkan bu önemli farklılığın, inkübasyon süresinin 5 saat yerine 6 saat 57

65 olmasından kaynaklandığı düşünülmemektedir. Çünkü aynı inkübasyon farklılığı endüstriyel suşlar için de geçerli olduğuna ve endüstriyel suşlarda yaklaşık değerler alındığına göre bu durumu suşların denemeye alındıkları zaman periyodundaki metabolik aktivitelerine bağlamak daha doğru olur. Nitekim Durlu Özkaya (2001) da 6 saatlik ph değerlerini laktobasiller için 0,00-0,20 arasında, 24 saatlik en yüksek ph değerlerini de 1,60 olarak saptamış ve bu düşük asit aktivitesine neden olarak da bazı araştırıcıların da ileri sürdüğü gibi suş farklılıklarını (Rajagopal and Sandine 1990, Aslım 1994) göstermiştir. Bu araştırmada suş farklılıkları devre dışı bırakıldığına göre sonuçlar zamana bağlı asit aktivite değişimlerinin hep negatif yönde olmadığını, asit üretiminde kayıplar olabileceği gibi suşların metabolik aktivitelerinin pozitif yönde canlanmasıyla asit üretimlerinde artışlar da olabileceğini göstermiştir. Çizelge 4.6 Çiğ sütlerden izole edilen (22 adet) ve endüstriyel kökenli (5 adet) Lb. bulgaricus suşlarının asit aktivite test sonuçları Suş kodu Başlangıç 6 saatlik ink. ph 24 saatlik ink. ph ph ph (6 saat) ph (24 saat) Lb ,3 5,09 1,21 3,84 2,46 Lb ,21 4,96 1,25 3,8 2,41 Lb ,23 4,88 1,35 3,65 2,58 Lb ,27 4,91 1,36 3,63 2,64 Lb ,23 4,87 1,36 3,69 2,54 Lb ,25 5,18 1,07 3,69 2,56 Lb ,29 4,98 1,31 3,65 2,64 Lb ,2 5,03 1,17 3,68 2,52 Lb ,23 4,95 1,28 3,68 2,55 Lb ,27 5,68 0,59 3,78 2,49 Lb ,25 4,87 1,38 3,66 2,59 Lb ,26 4,97 1,29 3,89 2,37 Lb ,16 4,85 1,31 3,72 2,44 58

66 Çizelge 4.6 Çiğ sütlerden izole edilen (22 adet) ve endüstriyel kökenli (5 adet) Lb. bulgaricus suşlarının asit aktivite test sonuçları (devam) Suş kodu Başlangıç 6 saatlik ink. ph 24 saatlik ink. ph ph ph (6 saat) ph (24 saat) Lb ,21 4,98 1,23 3,7 2,51 Lb ,24 5,03 1,21 3,73 2,51 Lb ,16 4,9 1,26 3,68 2,48 Lb ,21 5,51 0,7 3,71 2,5 Lb ,2 5,07 1,13 3,74 2,46 Lb ,2 4,89 1,31 3,72 2,48 Lb ,18 4,8 1,38 3,85 2,33 Lb ,23 4,97 1,26 3,73 2,5 Lb ,2 5,04 1,16 3,71 2,49 Lb ,2 4,84 1,36 3,82 2,38 Lb ,47 5,34 1,13 3,79 2,68 Lb. Y4 6,19 4,76 1,43 3,7 2,49 Lb. V1 6,2 5,03 1,17 3,78 2,42 Lb. V2 6,18 4,91 1,27 3,67 2,51 Lb ,18 4,9 1,28 3,98 2,2 Çiğ süt kökenli yerel Lb. bulgaricus suşlarından, 6 saatte düşük asit üretimi ( ph: 0,59-1,07) gösteren 3 suşun dışında, geri kalan 19' u, 6 saatlik ortalama ph:1,27 değeriyle ve 24 saatte sağladığı ortalama ph: 3,72 değeriyle de endüstriyel suşlardan (sırasıyla ph: 1,26, ortalama ph: 3,78) üstün bulunmuştur. İçlerinden Lb. 3701, Lb. 2001, Lb. 4603, Lb. 5002, Lb. 6502, Lb. 4008, Lb. 4902, 24 saatlik inkübasyon sonucu ulaştıkları ph değerleri (sırasıyla 3,63; 3,65; 3,65; 3,66; 3,68; 3,68; 3,68) Rechninger and Siegumfeld (2002)' in Lb. bulgaricus NCFB 2772 suşu ile ulaştığı ortalama ph: 3,65 ± 0,05 değerlerine çok yakın bulunmuş ve asit aktivitesi en yüksek suşlar olarak tanımlanmıştır. Şimdiye kadar bir çok araştırmada Lb. bulgaricus suşlarının S. thermophilus suşlarına oranla daha fazla asit ürettiklerine ilişkin bulgular (Rasic and Kurmann 1978, Beyatlı 1990, Bautista et al. 1996, Aslım vd. 2000, Ayhan vd. 2005) bu araştırmada da belirgin olarak kendini göstermiştir. 59

67 4.3 Antibakteriyel Aktivite Suşların antibakteriyel aktivitelerinin belirlenmesinde toplam 122 S. thermophilus ve Lb. bulgaricus suşu, Micrococcus luteus (M. luteus) ve ön denemeler sırasında çok duyarlı olduğu saptanan Tübitak-TARP 2106 no lu projede (Tunail vd. 2002) izole edilmiş Lb kodlu indikatör mikroorganizmalara karşı denenmiştir. Endüstriyel Lb. bulgaricus suşlarından Ch-Lb-12.1 suşu çalışmaların bu aşamasında yitirildiğinden antibakteriyel aktivite testlerinde yer almamıştır. Pastörize süt kökenli 43, çiğ süt kökenli 30 ve endüstriyel kökenli 10 suş olmak üzere toplam 83 S. thermophilus un antibakteriyel aktivite testlerinde; de anlatıldığı üzere kuyu difüzyon testi (KDT) ve agar difüzyon testi (ADT) gibi iki ayrı yöntemden yararlanılmıştır. Daha sonraki denemelere ise sadece KDT ile devam edilmiştir. Çalışmada antibakteriyel aktiviteye sahip suşların oluşturdukları inhibisyon zonlarının, üretilen laktik asitten kaynaklanıp kaynaklanmadığını kontrol etmek amacı ile, suşların 18 saatlik aktif broth kültürlerinde geliştirdikleri en düşük ph değeri baz alınarak inoküle edilmemiş besiyerinin ph sı laktik asit ile ayarlanmış ve petrilere antibakteriyel aktivitesi belirlenecek suşlarla beraber her defa aynı miktarda pipetlenmiştir (Abdel-Bar et al. 1987). Her iki yöntemde de kontrol örneklerinde inhibisyon zonu belirlenmemiştir. Çizelge 4.7 den izlendiği gibi antibakteriyel aktiviteleri ilk kez test edilen pastörize süt orijinli 43 S. thermophilus suşundan sadece St 218, St 219, St 239, St 533 indikatör bakterilerden Lb üzerinde sınırlı bir inhibisyon göstermiştir. Kuyu difüzyon testi ile saptanan antibakteriyel etki agar difüzyon testi ile de teyit edilmiştir. Antibakteriyel aktivite testlerinin, duyarlılığı nedeni ile, vazgeçilmez indikatörü olan M. luteus (Durlu- Özkaya 2001) a karşı beklenilenin aksine hiçbir inhibisyon zonu alınamaması dikkat çekmiştir. Lb suşunun M.luteus a oranla daha duyarlı olabileceği düşünülmüştür. 60

68 Çizelge 4.7 Pastörize sütlerden izole edilen ve endüstriyel S. thermophilus suşlarının Micrococcus luteus ve yerel Lactobacillus bulgaricus 6301 üzerindeki antibakteriyel aktiviteleri Suş Kodu Kuyu Difüzyon Testi Agar Difüzyon Testi M.luteus Lb 6301 M.luteus Lb 6301 St St St St St St St St St 239-8,5 - + St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St

69 Çizelge 4.7 Pastörize sütlerden izole edilen ve endüstriyel S. thermophilus suşlarının Micrococcus luteus ve yerel Lactobacillus bulgaricus 6301 üzerindeki antibakteriyel aktiviteleri (devam) Suş Kodu Kuyu Difüzyon Testi Agar Difüzyon Testi M.luteus Lb 6301 M.luteus Lb 6301 St St St St St St St St St St St Ch-St St. Y St. Y St. V St. V St St St St. CH St. B

70 St 219 ve St 239 suşlarının agar difüzyon testi ile Lb indikatör suşuna karşı oluşturduğu inhibisyon zonları Şekil 4.1 de görülmektedir. Şekil 4.1 Agar Difüzyon Testi ile St 219 ve St 239 suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktivitesi Endüstriyel S.thermophilus suşlarından hiçbiri denenen iki bakteriye karşı inhibisyon zonu oluşturmamıştır (Çizelge 4.7). Çiğ süt orijinli 30 S. thermophilus suşunun antibakteriyel aktiviteleri incelendiğinde (Çizelge 4.8) antibakteriyel etkisi saptanan toplam 10 suştan St ile St in sadece M.luteus a, 5 suşun (St. 1.4, St. 7.7, St. 23.3, St ve St. 26.5) sadece Lb e ve St. 1.2, St. 7.1 ve St in de her iki indikatör bakteriye birden etkili olduğu görülmüştür. M.luteus a inhibisyon etkisi kuyu difüzyon testi ile saptanan 5 adet S.thermophilus suşunun bu etkisi agar difüzyon testi ile gösterilememiştir. Buna karşın 8 suşun Lb üzerindeki antibakteriyel aktivitesi (Çizelge 4.8) agar difüzyon testi ile de belirlenebilmiştir. 83 suş ile alınan bu sonuçlardan sonra denemelere sadece kuyu difüzyon testi ile devam edilmesine karar verilmiştir. Duyarlı suşlardan Lb ile daha fazla sayıda S. thermophilus suşunun antibakteriyel aktivitesinin ortaya konmasına karşın denemelerin M. luteus ile birlikte yürütülmesine devam edilmiştir. Çünkü St ve St in antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu yalnızca M. luteus ile anlaşılmıştır. Çiğ süt kökenli ve antibakteriyel aktiviteye sahip S. thermophilus 63

71 suşlarının 2 indikatöre ve 2 yönteme göre saptanan inhibisyon zonlarından bazı fotoğraf örnekleri aşağıda verilmiştir(şekil 4.2, Şekil 4.3, Şekil 4.4, Şekil 4.5, Şekil 4.7). Çizelge 4.8 Çiğ sütlerden izole edilen ve endüstriyel S. thermophilus suşlarının Micrococcus luteus ve yerel Lactobacillus bulgaricus 6301 üzerindeki antibakteriyel aktiviteleri Kuyu Difüzyon Testi Agar Difüzyon Testi Doğal Suşların M.luteus Lb 6301 M.luteus Lb 6301 Kodu ( zon çapı mm) ( zon çapı mm) ( zon çapı mm) ( zon çapı mm) St St St St. 3.2.i St St. 5.3.i St St St St St St St St St St St St St St St St St St St St. 24.b St St St. MR27a St.TH Ch-St St.Y St.Y St.V St.V Çizelge 4.8 Çiğ sütlerden izole edilen ve endüstriyel S. thermophilus suşlarının Micrococcus luteus ve yerel Lactobacillus bulgaricus 6301 üzerindeki antibakteriyel aktiviteleri (devam) 64

72 Doğal Suşların Kodu M.luteus Kuyu Difüzyon Testi ( zon çapı mm) Lb 6301 ( zon çapı mm) M.luteus ( zon çapı mm) Agar Difüzyon Testi Lb 6301 ( zon çapı mm) St St St St. CH St. B Kuyucuk çapı : 6mm (kuyucuk çapı zon çapına dahil) * : zon çapı (mm) - : zon yok +: zon var Kuyu difüzyon testinde inhibisyon zon çaplarının mm olarak ölçülmesine karşılık agar difüzyon testinde zonlar sadece izlenmiştir. Şekillerde de görülebileceği gibi aslında yöntem olarak agar difüzyon testi, daha belirgin ve daha geniş zonlar göstermesi ile daha iyi bir yöntem izlenimi vermektedir. Bunun nedeni kurutulmuş agar yüzeyinde, kuyuya konulanlara göre, süpernatantın daha iyi difüze olması ve yayılması olabilir. Bununla beraber tekrarlanan testlerde her zaman aynı sonuçların alınamaması ve yukarda belirtildiği gibi M. luteus üzerinde kuyu difüzyon testi ile 5 S. thermophilus suşunda saptanan antibakteriyel etkinin agar difüzyon testi ile belirlenememesi bu yöntemin terk edilmesine neden olmuştur. Ayrıca literatür verileri de kararımıza etkili olmuştur. 142 adet Lactobacillus sake suşunda antibakteriyel aktiviteyi araştıran Schillinger and Lücke (1989) uyguladıkları spot testte suşların aktif kültürlerini, kuyu difüzyon testinde ise suşların kültür supernatantlarını kullanmışlar ve ilk yöntemle 16, ikinci yöntemle sadece 6 suşta antibakteriyel aktivite belirlemişlerdir. Araştırıcılar antibakteriyel aktivitenin sıvı besiyerinde kendini daha iyi gösterdiği sonucuna varmıştır. Kuleaşan (2002) ise antibakteriyel aktiviteye sahip laktobasil suşlarının seçiminde bu tez çalışmasında olduğu gibi KDT de aktif kültürleri, ADT de ise kültür süpernatantlarını kullanmış, sonuçta 162 izolattan antibakteriyel aktiviteli 86 suşu KDT ile belirlerken ancak 32 suşu ADT ile saptayabilmiştir. S. thermophilus suşlarında genel olarak antibakteriyel aktivite gösteren suş sayısı düşük bulunmuştur. Gerçi laktik streptokoklarda nisin üretim özelliğinin genetik determinantlarının belirlenmesi ve aktarım olanaklarının araştırılması için ön taramanın 65

73 yapıldığı bir projede ( Tunail vd. 1995) de 142 Lactococcus lactis subsp. lactis (LL) suşundan belirgin antibakteriyel aktivite gösteren ancak 4 suş seçilebilmiştir. Şekil 4.2 Kuyu Difüzyon Testi ile St. 1.2 suşunun M. luteus üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.3 Agar Difüzyon Testi ile St. 1.2 suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktivitesi 66

74 Şekil 4.4 Kuyu Difüzyon Testi ile St. 7.1 suşunun M. luteus üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.5 Agar Difüzyon Testi ile St suşunun Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktivitesi 67

75 Şekil 4.6 Agar Difüzyon Testi ile Lb.5006 ve Lb.6007 suşlarının Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktivitesi Şekil 4.7 Agar Difüzyon Testi ile St ve St. 1.2 suşlarının Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri 68

76 Şekil 4.8 Agar Difüzyon Testi ile St. 1.2 ve St.7.7 suşlarının Lb.bulgaricus 6301 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Araştırıcılar önce agar difüzyon testini (Tramer and Fowler 1964) kullanmışlar uzun süren taramalarda negatif sonuç aldıkları için daha sonra Geis ve arkadaşlarının kullandığı tüp dilüsyon yönteminden yararlanarak 142 suştan ancak 4 LL suşu seçebilmişlerdir. Çalışmamız bu araştırma ile kıyaslandığında elde edilen antibakteriyel aktiviteye sahip suş sayısı düşük gözükmese de bu çalışmada yer alan çiğ süt kökenli S. thermophilus suşlarının antibakteriyel aktivitelerini daha önce belirleyen araştırıcılar (Tunail vd. 2002, Ayhan vd. 2005) tarafından çok farklı sonuçlar elde edilmiştir. Sadece Tramer ve Fowler in kuyu difüzyon testinin kullanıldığı denemelerde, 30 S. thermophilus suşunun hepsi 6 mm kuyucuk çapı dahil M. luteus suşuna karşı çapları 7-23 mm arasında değişen inhibisyon zonları oluşturmuş, ortalama inhibisyon zon çapı 13 mm bulunmuştur. Bu sonuçlar 4-5 yıl içinde antibakteriyel aktivitenin büyük oranda yitirildiğine işaret etmektedir. Çizelge 4.9 da toplanan pastörize süt kökenli 12 adet, çiğ süt kökenli 22 adet ve endüstriyel kökenli 4 adet ve 1 adet de referans suş olmak üzere toplam 39 adet Lb.bulgaricus suşunun yalnız kuyu difüzyon yöntemiyle belirlenen antibakteriyel 69

77 aktivite test sonuçları da suşların antibakteriyel aktivite yönünden yetersizliğini ortaya koymaktadır. Pastörize süt kökenli 12 suştan yarısı her iki indikatör bakteriye inhibisyon etki göstermezken yarısı da sadece Lb suşu ile çapları 7-8 mm arasında değişen inhibisyon zonları vermiştir. Kuyucuk çapının 6 mm olduğu düşünülürse bu oldukça düşük bir antibakteriyel aktivitedir. Çiğ sütlerden izole edilen 22 Lb. bulgaricus ve 4 endüstriyel Lb. bulgaricus ve referans Lb. bulgaricus suşunun da durumu çok farklı değildir. Suşların hiçbiri M. luteus üzerine etkili bulunmazken 3 yerel suş hariç diğerleri Lb 6301 üzerine çapları 7-10 mm arasında değişen inhibisyon zonları oluşturarak oldukça kısıtlı antibakteriyel aktivite sergilemiştir. En yüksek aktivite, 9,5 ve 10 mm çaplı inhibisyon zonlarını oluşturan sırasıyla Lb ve Lb belirlenmiştir (Şekil 4.6). Oysa çiğ süt kökenli aynı 22 Lb. bulgaricus suşu ile birlikte 24 suşun aktivitelerinin Nutrient Agar (NA) besiyeri kullanılarak belirlendiği çalışmada tüm suşların oldukça yüksek antibakteriyel aktiviteye sahip oldukları M.luteus a karşı mm çaplı, ortalama 13 mm çaplı zonlar oluşturmalarından anlaşılmaktadır (Ayhan vd. 2005). 70

78 Çizelge 4.9 Çiğ sütlerden (22 adet), pastorize sütlerden (12 adet) izole edilen ve endüstriyel kökenli (5 adet) Lb. bulgaricus suşlarının antibakteriyel aktiviteleri Suş Kodu Kuyu Difüzyon Testi Suş Kodu Kuyu Difüzyon Testi Suş Kodu Kuyu Difüzyon Testi (Çiğ süt M. luteus Lb (Past. Süt M. luteus Lb (Endüst. M. luteus Lb kökenli) (zon çapı mm) (zon çapı mm) kökenli) (zon çapı mm) (zon çapı mm) suşlar) (zon çapı mm) (zon çapı mm) Lb Lb 132-7,5 Lb. Y4-9 Lb Lb ,5 Lb. V1-7 Lb ,5 Lb Lb. V2-8,5 Lb ,5 Lb Lb ,5 Lb ,5 Lb Lb Lb Lb ,5 Lb Lb ,5 Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb ,5 Lb Lb Lb Lb ,5 Lb ,5 Lb ,5 Lb Lb Lb Lb Lb Lb ,5 71

79 Tüm suşların antibakteriyel test bulgularından şu sonuçlara varmak mümkündür. Antibakteriyel aktivitenin belirlenmesinde kullanılan iki yöntemden kuyu difüzyon testi ile daha istikrarlı ve daha sağlıklı sonuçlar alındığı söylenebilir. Kullanılan indikatör bakterilerden Lb suşunun M. luteus a oranla çok daha duyarlı olduğu anlaşılmıştır. Özellikle burada olduğu gibi zaman içinde antibakteriyel aktivitedeki kayıplar saptanmak istendiğinde M. luteus yanında bu suşa da yer verilmesi uygun olur. Çünkü daha önce M. luteus a oldukça yüksek antibakteriyel aktivite gösteren Lb. bulgaricus un tüm suşlarında bu aktivitenin yitirildiği, ancak yine de bir kısmının korunduğu ve bu sınırlı aktivitenin çok daha duyarlı suş olan Lb ile ortaya konulabildiği anlaşılmıştır. Lb. bulgaricus suşlarında zamana bağlı olarak antibakteriyel aktiviteyi kaybeden suş sayısı çok daha sınırlıdır. S. thermophilus suşlarında antibakteriyel aktivitenin tamamen kaybedilmesine daha sık rastlanmıştır. Sınırlı da olsa antibakteriyel aktivite gösteren, çiğ süt ve pastörize süt kökenli toplam 14 adet S. thermophilus suşundan seçilen 9 adet bakterinin tamamı Gram pozitif ve Gram negatif indikatör patojenler üzerine inhibisyon etki göstermemiştir (Çizelge 4.10). S. thermophilus suşlarının aksine antibakteriyel aktiviteye sahip Lb. bulgaricus suşlarından seçilen 9 bakteri, Yersinia enterocolitica hariç diğer Gram negatif (Salmonella enteritidis, Escherichia coli O157) ve Gram pozitif (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes) bakterilere çapları 9-24 mm arasında değişen inhibisyon zonları oluşturarak etkili olmuştur (Çizelge 4.11). KDT ile saptanan bu inhibisyon zonları Şekil 4.9- Şekil 4.17 arasında yer alan fotoğraflarda görülmektedir. Saptanan antimikrobiyel aktivitenin laktik asit dışında bir etkenden kaynaklandığı kontrol örnekleriyle gösterilmiştir. Ancak etkili maddenin; asetik asit, diasetil, formik asit, CO 2, H 2 O 2 veya bakteriyosinden kaynaklandığını söyleyebilmek için konunun daha fazla araştırılması gerekir. Genelde Lb. bulgaricus un özellikle oluşturduğu H 2 O 2 veya bulgarican adlı bakteriyosin nedeniyle inhibisyona neden olduğu bilinmektedir (Robinson 1999). Hangi etkenden kaynaklanırsa kaynaklansın Çizelge 4.11 de yer alan Lb. bulgaricus suşlarının yoğurt ve pıhtısı ısıl işlem gören peynirlerin üretiminde kullanıma elverişli oldukları ayrıca probiyotik amaçlı bakteriyosin çalışmalarına da materyal oluşturabilecekleri açıktır. Genellikle laktobasillerin, S. thermophilus suşuna 72

80 oranla hem bakteriyosin hem de antibakteriyel aktivite yönünden daha fazla potansiyele sahip oldukları (Gorris 1994) bilinmekle beraber ender de olsa S. thermophilus un bakteriyosin üreten suşlarına da rastlanmaktadır (Aktypis et al. 1998, Mathot et al. 2003). Ancak bu çalışmada zamana bağlı olarak antibakteriyel aktivitelerinde büyük düşüşler olduğuna veya aktivitenin tamamen yitirildiğine kanaat getirilen S. thermophilus suşlarının, bu özellik açısından starter ve probiyotik olma potansiyelleri bulunmamaktadır. Çizelge 4.10 S. thermophilus suşlarının Gram pozitif ve Gram negatif patojen bakteriler üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Suş Bacillus Salmonella Staphylococcus Yersinia Listeria E.coli O157 Kodu cereus enteritidis aureus enterocolitica monocytogenes K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T St St St St St St St St St Çizelge 4.11 Lb. bulgaricus suşlarının Gram pozitif ve Gram negatif patojen bakteriler üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Suş Kodu Bacillus cereus Salmonella enteritidis Staphylococcus aureus Yersinia enterocolitica Listeria monocytogenes E.coli O157 K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T K.D.T A.D.T Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb Lb. Y

81 Şekil 4.9 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. Y4, Lb 132 ve Lb suşlarının S.enteritidis üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.10 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. 406, Lb. 4603, Lb ve Lb suşunun S.enteritidis üzerine antimikrobiyel aktiviteleri 74

82 Şekil 4.11 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb suşlarının S.enteritidis üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.12 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. 406, Lb. 4603, Lb ve Lb suşlarının S.aureus üzerine antimikrobiyel aktiviteleri 75

83 Şekil 4.13 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb suşularının L. monocytogenes üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.14 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb suşlarının L. monocytogenes üzerine antimikrobiyel aktiviteleri 76

84 Şekil 4.15 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb suşlarının E.coli O157 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Şekil 4.16 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb ve Lb.4007 suşlarının E. coli O157 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri 77

85 Şekil 4.17 Kuyu Difüzyon Testi ile Lb. 406 ve Lb.4603 suşlarının E. coli O157 üzerine antimikrobiyel aktiviteleri Tezde bu aşamaya kadar yapılan test sonuçları genel olarak irdelenmiş, değerlendirmeye gitmenin zorluğu görülmüş ve bundan sonraki proteolitik aktivite ve asetaldehit üretim yeteneğinin belirlenmesine rastlantısal olarak seçilen daha az suşla devam edilmesine karar verilmiştir. Suşların faj direnç özelliğindeki kararlılık diğerlerine oranla daha belirgin olmasına karşın yine de bazı suşların faj özgüllük şablonlarında hiç beklenmeyen cinler arası heterolog konakçı özgüllüğünün ortaya çıkışı, asit aktivitesinde özellikle çiğ sütlerden izole edilen S. thermophilus suşlarında hem negatif hem de pozitif yönde değişikler görülmesi ve genelde yerel S. thermophilus suşlarının orta derecede asit üretimi üzerine çıkamamaları, diğer taraftan hem S. thermophilus hem de Lb. bulgaricus suşlarının antibakteriyel aktivitelerinde belirgin düşüşler veya kayıplar olması, proteolitik aktivite değerlerinin ve asetaldehit miktarlarının da zamana bağlı olarak kayıplar ve değişimler gösterebileceğine işaret sayılmış; zaman, emek ve sarf malzemesi israfını önlemek amacıyla asetaldehit miktarının ve proteolitik aktivitenin belirlenmesi çalışmalarında toplam 53 suş kullanılmıştır. 78