ANAEROBİK FUNGUSLARIN FİBROLİTİK ENZİM SİSTEMLERİ

Transkript

1 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI ANAEROBİK FUNGUSLARIN FİBROLİTİK ENZİM SİSTEMLERİ A. SELEN AKINALP YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Eylül-2006

2 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI ANAEROBİK FUNGUSLARIN FİBROLİTİK ENZİM SİSTEMLERİ A. SELEN AKINALP YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Eylül-2006

3 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI ANAEROBİK FUNGUSLARIN FİBROLİTİK ENZİM SİSTEMLERİ A. SELEN AKINALP YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No : Bu Tez 14/09/2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir Doç. Dr. Prof. Dr. Doç. Dr. Mehmet Sait EKİNCİ M. İhsan SOYSAL Emin ÖZKÖSE DANIŞMAN ÜYE ÜYE Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Özden GÖRÜCÜ Enstitü Müdürü Bu çalışma Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: 2005/1-2 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

4 İÇİNDEKİLER A. SELEN AKINALP İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... I ÖZET.. IV ABSTRACT... V ÖNSÖZ... VI ÇİZELGELER DİZİNİ.... VII ŞEKİLLER DİZİNİ.. VIII SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... X 1. GİRİŞ Rumen ve Rumenin Mikrobiyal Ekosistemi Anaerobik Fungusların İzolasyonu ve Sınıflandırılması Anaerobik Funguslarda Monosentrik ve Polisentrik Yaşam Bitki Hücre Duvarının Yapısı Selüloz Ksilan Hemiselüloz Pektin Lignin Anaerobik Fungusların Bitki Hücre Duvarını Yıkımı Tezin Amacı ve Kapsamı ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Anaerobik Funguslarla Yapılan Önceki Çalışmalar Tanımlanmalarına Yönelik Çalışmalar Neocallimastix sp Piromyces sp Caecomyces sp Orpinomyces sp Anaeromyces sp Cyllamyces sp Hücre Duvarı Yıkımı Selülazlar ve Glikosidazlar.. 13 I

5 İÇİNDEKİLER A. SELEN AKINALP Ksilanazlar Pektinazlar Lignin Parçalayıcı Enzimler Proteolitik Enzimler MATERYAL VE METOD Materyal Kimyasallar Aletler Hayvanlar Metod Anaerobik Besi Yeri Anaerobik Besi Yerinin Hazırlanması Anaerobik Besi Yerinde Bakteriyel Büyümeyi Engelleyici Antibiyotik 20 İlavesi Anaerobik Fungusların İzolasyonu ve Saflaştırılması Anaerobik Fungusların İzolasyonu Anaerobik Fungusların Saflaştırılması Saf Kültürlerin Sıvı Azotta Stoğa Alınması Anaerobik Fungusların Fibrolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi Enzim Aktivitelerinin Petri Kaplarında Belirlenmesi Enzim Aktivitelerinin Kantitatif Olarak Belirlenmesi Hücre Ekstraktları ve Süpernatantlarının Hazırlanması Enzim Testi (Assay) Protein Tayini BULGULAR VE TARTIŞMA Bulgular Anaerobik Fungusların İzolasyonu Anaerobik Fungusların Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi Enzim Aktivitelerinin Petri Kaplarında Belirlenmesi Enzimlerin Çalışma Şartlarının Belirlenmesi Enzimlerin Optimum Sıcaklıklarının Belirlenmesi Enzimlerin Optimum ph larının Belirlenmesi II

6 İÇİNDEKİLER A. SELEN AKINALP Anaerobik Fungusların Fibrolitik Enzimlerinin Kantitatif Ölçümü SONUÇ ve ÖNERİLER 37 KAYNAKLAR.. 38 ÖZGEÇMİŞ.. 45 III

7 ÖZET A. SELEN AKINALP T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET ANAEROBİK FUNGUSLARIN FİBROLİTİK ENZİM SİSTEMLERİ A. SELEN AKINALP Danışman: Doç. Dr. M. Sait EKİNCİ Yıl : 2006, Sayfa : 45 Jüri : Doç. Dr. M. Sait EKİNCİ (Başkan) Prof. Dr. M. İhsan SOYSAL Doç. Dr. Emin ÖZKÖSE Farklı bölgelerden toplanan ruminant hayvan dışkı örneklerinden anaerobik fungus izolasyonu yapılmış ve izolasyonu yapılan funguslardan Neocallimastix, Piromyces ve Anaeromyces cinsleri saflaştırılmıştır. Neocallimastix, Piromyces ve Anaeromyces cinslerinin enzim aktiviteleri için optimum ph ve sıcaklık değerleri incelenmiş ve bu değerlerin sırasıyla ph 6-7 ve C arası olduğu tespit edilmiştir. Her 3 cins fungusun ürettiği enzimlerin hücre içerisine salgılandığı tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Anaerobik rumen fungusları, izolasyon, saflaştırma, enzim aktivitesi IV

8 ABSTRACT A. SELEN AKINALP T.R. UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF ANIMAL SCIENCE MSc THESIS ABSTRACT FIBROLYTIC ENZYME SYSTEMS OF ANAEROBIC FUNGI A. SELEN AKINALP Supervisor: Assoc. Prof. Dr. M. Sait EKİNCİ Year : 2006, Page : 45 Jury : Assoc. Prof. Dr. M. Sait EKİNCİ Prof. Dr. İhsan SOYSAL Assoc. Prof. Dr. Emin ÖZKÖSE Feacal samples from different regions were used to isolate anaerobic rumen fungi. 3 different species, Neocallimastix, Piroyces and Anaeromyces were isolated and purified. Enzymetic activities of these 3 species were performed. Optimum ph and tempareture for CMCase, celulase and xylanase of these 3 species were found 6-7 and o C respectively. All 3 enzymes of these species were found to be cell associated. Key Words : Anaerobic rumen fungi, isolation, purification, enzyme activity V

9 ÖNSÖZ A. SELEN AKINALP ÖNSÖZ Tez konusunun belirlenmesi, çalışmanın yürütülmesi ve yazım aşamasında beni yönlendiren danışman hocam sayın Doç. Dr. Mehmet Sait EKİNCİ ye ve hocam Doç. Dr. Emin ÖZKÖSE ye, katkılarından dolayı Yrd. Doç. Dr. İsmail AKYOL a, farklı bölgelerden dışkı örneklerinin toplanması ve ulaştırılmasındaki yardımlarından dolayı Ar. Gör. Selahattin KİRAZ a, enzim denemelerindeki yardımlarından dolayı Ar. Gör. Uğur ÇÖMLEKÇİOĞLU na, tez yazım aşamasındaki yardımlarından dolayı Ar. Gör. Serhan CANDEMİR e teşekkür ederim. Ayrıca çalışma arkadaşlarım; başta Ar. Gör. Bülent KAR olmak üzere, tüm Biyoteknoloji ve Gen Mühendisliği Laboratuarı elemanlarına teşekkür ederim. Projeyi maddi olarak destekleyen KSÜ, BAPYB Başkanlığı na teşekkür ederim. 15/08/2006 KAHRAMANMARAŞ A. Selen AKINALP VI

10 ÇİZELGELER DİZİNİ A. SELEN AKINALP ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1. Anaerobik fungusların cins düzeyinde morfolojik özellikleri... 2 Çizelge 2. Anaerobik fungus cinsleri, türleri ve izolasyon kaynakları... 3 Çizelge 3. Anaerobik fungus besi yeri içeriği Çizelge 4. Anaerobik fungusların sıvı azot stok listesi Çizelge 5. Neocallimastix sp., Piromyces sp. ve Anaeromyces sp. nin CMCaz aktivite tablosu Çizelge 6. Neocallimastix sp., Piromyces sp. ve Anaeromyces sp. nin selülaz aktivite tablosu Çizelge 7. Neocallimastix sp., Piromyces sp. ve Anaeromyces sp. nin ksilanaz aktivite tablosu VII

11 ŞEKİLLER DİZİNİ A.SELEN AKINALP ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1. Anaerobik fungusların yaşam döngüsü... 4 Şekil 2. Selülozun diyagramatik yapısı... 6 Şekil 3. Ksilanın diyagramatik yapısı... 6 Şekil 4. Graminaceous hemiselülozun diyagramatik yapısı... 7 Şekil 5. Pektinin Diyagramatik yapısı... 7 Şekil 6. Ligninin diyagramatik yapısı... 8 Şekil 7. K.S.Ü. Zootekni Bölümü Hayvancılık Ünitesi nden örnek toplama Şekil 8. Anaerobik fungusların izolasyonunda kullanılan düzenek Şekil 9. İnkübatör içindeki sıvı ve katı besi yerlerinden görünüm Şekil 10. Anaerobik fungus ekimi Şekil 11. Anaerobik fungusların karyovialler içinde sıvı azotta stoğa alınması Şekil 12. Dışkı örneklerinin toplanması Şekil 13. Saf anaerobik fungus kültürleri Şekil 14. Neocallimastix sp Şekil 15. Piromyces sp Şekil 16. Anaeromyces sp Şekil 17. Petri kutularında CMCaz, selülaz ve ksilanaz aktiviteleri Şekil 18. Neocallimastix sp. nin hücre içi CMCaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği Şekil 19. Neocallimastix sp. nin hücre dışı CMCaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği Şekil 20. Neocallimastix sp. nin hücre içi selülaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği Şekil 21. Neocallimastix sp. nin hücre dışı selülaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği Şekil 22. Neocallimastix sp. nin hücre içi ksilanaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği Şekil 23. Neocallimastix sp. nin hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum sıcaklık grafiği Şekil 24. Neocallimastix sp. nin hücre içi CMCaz aktivitesinin optimum ph grafiği Şekil 25. Neocallimastix sp. nin hücre dışı CMCaz aktivitesinin optimum ph grafiği Şekil 26. Neocallimastix sp. nin hücre içi selülaz aktivitesinin optimum ph grafiği Şekil 27. Neocallimastix sp. nin hücre dışı selülaz aktivitesinin optimum ph grafiği VIII

12 ŞEKİLLER DİZİNİ A.SELEN AKINALP Şekil 28. Neocallimastix sp. nin hücre içi ksilanaz aktivitesinin optimum ph grafiği Şekil 29. Neocallimastix sp. nin hücre dışı ksilanaz aktivitesinin optimum ph grafiği IX

13 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ A. SELEN AKINALP SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ CMC CMCaz DNA EC EDTA f/sn g L LB mg/ml ml mm μg/ml μm nm OD PZR rpm rrna SDS sp w/v : Carboxymethylcellulose : Carboxymethylcellulase : Deoksiribonükleik Asit : Enzime code : Ethylendinitrilotetraasetat : Frekans/saniye : Gram : Litre : Loura Broth : Miligram/mililitre : Mililitre : Milimetre : Mikrogram/mililitre : Mikromol : Nanometre : Optical density : Polimeraz zincir reaksiyonu : Rotary per minute : Ribozomal RNA : Sodium Dodesil Sülfat : Species : Weight/volume X

14 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP 1. GİRİŞ 1.1. Rumen ve Rumenin Mikrobiyal Ekosistemi Ön mideli ruminantlarda sindirim sistemi 4 bölümden meydana gelmektedir. İlk 3 ön mide bölümü özefagusun değişimi ile oluşmuştur. Dördüncü bölüm olan abomasum gastrik sindirimin gerçekleştiği yerdir ve monogastrik memelilerdeki mideye karşılık gelmektedir. Rumen, ruminant sindirim sisteminin hacim olarak en büyük kısmını teşkil eder ve retikulumla beraber, sığırlarda l, koyunlarda 10 l hacmine ulaşan (Hobson ve Wallace, 1982) ve yoğun bir mikroorganizma populasyonu içeren, büyük bir fermentasyon kabı vazifesi görür. Yeni doğmuş ruminantların temel besin maddesini süt oluştur ve besinin sindirimini, rumende o dönemin ana mikroorganizması olan Lactobacilli, Streptococci ve Clostridium yapmaktadır. Bununla beraber, genç hayvanlar otlatılmaya başlandıklarında hayatlarında başlıca gereksinim duydukları temel mikroorganizmaları alırlar. Rumen bakterilerinin yetişkinlerden yavrularına; salya, emzirme ya da ortak kullanılan su aracılığıyla taşındığı düşünülmektedir. Yetişkin hayvanların geviş getirmeleri sırasında rumen içeriği ağıza taşınmakta ve burada salyayla temas ederek, rumen içeriğinde bulunan bakteri ve protozoalar salyaya geçmektedir (Hobson, 1971). Anaerobik fungusların yetişkin ruminantlardan yavrularına geçişinin ise salya ve yemlerine bulaşmış olan dışkılarıyla olduğu düşünülmektedir (Lowe ve ark., 1987b; Milne ve ark., 1989) Sıvı fazdaki bakteri, protozoa ve fungusların ulaşacağı rakamlar, rumen iç epiteline bağlanan bitki parçacıkları ile ilişkilidir (Latham, 1980). Rumen sıvısındaki bu popülasyonların konsantrasyonları bakteriler için ml -1, protozoalar için ml -1 (Hungate, 1966), ve fungal zoosporlar için yaklaşık olarak ml -1 dir (Theodorou ve ark., 1990). Davies ve ark. (1993), anaerobik fungusları rumen, omasum, abomasum, ince bağırsak, sekum ve kalın bağırsaktan izole etmişlerdir. Bu sonuç, anaerobik fungusların ağızdan anüse kadar ruminantların tüm sindirim kanalında ve dışkıda bulunabileceğini göstermektedir Anaerobik Fungusların İzolasyonu ve Sınıflandırılması Orpin (1975), spor kesesi gibi çok yönlü üretken bir fazla yaşam döngüsü olan Callimastix frontalis in (bugünkü adlandırılmasıyla, Neocallimastix frontalis) ve Monas communis in (Piromonas communis) yaşam döngülerini incelemiştir. Böylelikle daha önce protozoa olduğu sanılan kamçılı hücrelerin aslında zorunlu anaerobik fungusların zoosporları olduğunu göstermiş ve bu tarihten itibaren anaerobik funguslar üzerine yapılan çalışmalar yoğunlaştırılmıştır. Sonraki yıllarda Orpin, koyun rumeninden her biri hareketli evre (zoospor) ve hareketsiz zoospor keseli 3 anaerobik fungus tanımlamış ve bunları Neocallimastix frontalis, Sphaeromonas communis, Piromonas communis olarak adlandırmıştır (Orpin, 1975; 1976; 1977). Böylece uzun yıllar varlığı bilinen fakat protozoa oldukları varsayılan anaerobik fungusların keşifleri gerçekleştirilmiştir. 1

15 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP Orpin ve Munn (1986), koyun sekumundan izole ettikleri monosentrik Neocallimastix cinsinin yapısal tanımlamasını yapmış ve Neocallimastix frontalis (Orpin, 1975) olarak bilinen fungusun doğru adlandırmasını Neocallimastix patriciarum olarak yapmıştır. Munn ve ark. (1988), anaerobik fungus cinslerinin; temelde tallus morfolojisi (monosentrik ya da polisentrik), rizoid tipi (filament ya da küresel) ve her zoospordaki kamçı sayısına göre ayırmış ve türleri de temelde zoosporların ince yapı detaylarına göre ayırmışlardır. Breton ve ark. (1989), koyun rumeninden izole ettikleri polisentrik talluslu, çok kamçılı zoosporlarıyla teşhis ettikleri anaerobik fungus türünü Orpinomyces joyonii olarak adlandırmışlardır. Ozkose ve ark. (2001), sığır dışkısından izole ettikleri, tek kamçılı ve küresel zoosporlara sahip olan, hem ana gövdesinin hem spor kesesinin hem de gövdenin farklı noktalarından gelişmiş olan spor kesesi boyunlarının çekirdek ihtiva etmesi nedeniyle birden fazla üreme bölgesine sahip olan bu yeni türü polisentrik olarak tanımlamış ve Cyllamyces aberensis olarak isimlendirmişlerdir. Morfolojik yapıları itibariyle Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces, ve Anaeromyces dallanmış rizoid yapısına sahip olduklarından oldukça sınırlı ve küresel rizoid yapısına sahip cinsler olan Caecomyces ve Cyllamyces cinslerinden oldukça faklıdırlar. Neocallimastix ve Piromyces monosentrik yaşam, Orpinomyces ve Anaeromyces cinsleri polisentrik yaşam halkasına sahiptirler. Neocallimastix ve Orpinomyces in zoosporları çok kamçılı (>4 kamçı) iken Piromyces ve Anaeromyces cinslerinin zoosporları tek kamçılıdır (<4 kamçı). Küresel rizoid yapısına sahip olan Cyllamyces ve Caecomyces cinsleri arasındaki farklılık ise Caecomyces cinslerine ait türler monosentrik, Cyllamyces cinsine ait bireyler ise polisentrik yaşam göstermesinden ileri gelir (Çizelge 1.) Çizelge 1. Anaerobik fungusların cins düzeyinde morfolojik özellikleri Cins Spor Kesesi Rizoid Yapısı Zoospor Kamçı Sayısı Neocallimastix Tek (Monosentrik) Dallanmış rizoid Çok (>4 ) Piromyces Tek (Monosentrik) Dallanmış rizoid Tek (<4 ) Caecomyces Tek (Monosentrik) Küresel rizoid Tek (<4 ) Anaeromyces Çok (Polisentrik) Dallanmış rizoid Tek (<4 ) Orpinomyces Çok (Polisentrik) Dallanmış rizoid Çok (>4 ) Cyllamyces Çok (Polisentrik) Küresel rizoid Tek (<4 ) Işık mikroskobu altında yapılan çalışmaların yanı sıra, zoospor kesitleri alınarak ve bu kesitlerin elektron mikroskobu altında ince yapı karakteristiklerine bakılarak, morfolojik verilerle elde edilen bulgular daha sağlam temellere oturtulmuştur. Zoosporların ince yapı karakteristiklerinin incelenmesi, kamçıların zoosporlara kepçe ve mahmuz şekilli bağlantı noktalarındaki (kinetozomlar) farklılıklar göz önünde bulundurularak yapılmaktadır. 2

16 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP Taksonomik çalışmalarda, fungusların morfolojik karakterleri ve zoospor kesitlerinin elektron mikroskobuyla incelenmesi sonucu elde edilmiş olan veriler kullanılmıştır. Heath (1988), bu verilerin çevresel faktörlerden etkilenebiliyor olmalarının anaerobik fungusların sınıflandırılmalarında karşılaşılan problemin kaynağını teşkil ettiğini belirtmektedir. Li ve Heath (1992), 18 rrna ve ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1) bölgelerinden sekans verilerini kullanarak anaerobik fungusları ayırmış ve kendi içinde karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar Neocallimastix, Piromyces ve Orpinomyces cinslerinin birbirine oldukça yakın ancak Anaeromyces ve Caecomyces cinsleriyle oldukça uzak ilişkili olduğunu tespit etmişlerdir. Fakat bu 2 uzak grup arasındaki farklılığı tayin edememişlerdir. Li ve ark. (1993) takip eden çalışmalarında, anaerobik fungusların filogenetik ilişkilerini incelemek üzere 42 morfolojik, ince yapı ve mitotik karakteri ele alarak kladistik analize (karakteristik özelliklerin ele alınarak birbiri ile karşılaştırılması) tabi tutmuşlardır. Bir önceki çalışmalarına nazaran daha iyi sonuçlar almalarına rağmen, 5 fungal cinsin kendi içlerindeki ilişkileri tartışmalı olarak kalmıştır. James ve ark. (2000), toplam 54 chytride ait verilere 18S rrna sekans analizi uygulamışlardır. Sekans sonuçları Chytridiomycota şubesinin (phylum) filogenetik ilişkisini ortaya koymuştur. Araştırıcılar, bu şube içinde yer alan Orpinomyces, Caecomyces, Piromyces, Neocallimastix cinslerinin, grup içerisindeki diğer chytridlerden ayrılarak kendi aralarında grup oluşturduğu sonucuna varmışlardır. Brookman ve ark. (2000) tarafından yapılan çalışmada, farklı coğrafik bölgelerden ve farklı hayvanlardan elde edilen 16 monosentrik, 4 polisentrik anaerobik fungus izolatı PZR ile amplifiye edilmiş ve sekans analizi yapılmıştır. N. frontalis ve N. hurleyensis arasında yakın bir ilişki gözlenirken, N. patriciarum da diğer 2 türden oldukça bariz bir farklılık saptamışlardır. Günümüzde anaerobik fungusların 6 cins altında 18 türü tanımlanmış ve sınıflandırılmıştır (Çizelge 2.). Çizelge 2. Anaerobik fungus cinsleri, türleri ve izolasyon kaynakları Cins Tür İzolasyon Kaynağı Referans Caecomyces communis 1 Koyun Gold ve ark. (1988) equi At Gold ve ark. (1988) Piromyces communis 2 Koyun Gold ve ark. (1988) mae At Li ve ark. (1990) dumbonicus 7 Fil Li ve ark. (1990) rhizinflatus 7 Fil Breton ve ark. (1991) minutus Geyik Ho ve ark. (1993c) spiralis Keçi Ho ve ark. (1993d) citronii At Gaillard-Martinie ve ark. (1995) Neocallimastix frontalis Koyun Heath ve ark. (1983) patriciarum 3 Koyun Orpin ve Munn (1986) hurleyensis Koyun Webb ve Theodorou (1991) variabilis Sığır Ho ve ark. (1993a) Anaeromyces elegans 4 Sığır Ho ve ark. (1993b) mucronatus Koyun Breton ve ark. (1990) 3

17 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP Orpinomyces joyonii 5 Koyun Breton ve ark. (1989) Cyllamyces intercalaris aberensis Sığır Sığır Ho ve ark. (1994) Ozkose ve ark. (2001) Orijinal isimleri; 1 Sphaeromonas communis (Orpin, 1976); 2 Piromonas communis (Orpin, 1977); 3 Neocallimastix frontalis (Orpin, 1975); 4 Ruminomyces elegans (Ho ve ark., 1990); 5 Orpinomyces bovis (Barr ve ark., 1989); 6 Neocallimastix joyonii (Breton ve ark., 1989); 7 Piromyces dumbonicus, 7 Piromyces rhizinflatus (Ho ve Barr, 1995). 1.3.Anaerobik Funguslarda Monosentrik ve Polisentrik Yaşam Monosentrik fungusların yaşam döngüsü hareketli zoosporik evre, vejetatif zoosporangil evreleri ve bu evreler arasındaki değişimlerden oluşur. Kamçılı zoosporlar spor kesesinden serbest bırakılır ve kamçılarını dökerek kist oluşturur (encystment). Kistin çimlenmesi bir germ tüpün üretimi ile olur daha sonra rizoidler gelişir (Orpin, 1977). Hücre gövdesi büyümesi spor kesesi içindedir ve döngü tamamlanınca spor kesesinden serbest bırakılır (Şekil 1.). Şekil 1. Anaerobik fungusların yaşam döngüsü. 1. Zoospor 2. Zoosporun çimlenmesi 3. Spor kesesi 4. Vejetatif rizomiselyum. Zoosporlar, spor kesesinden boşaldıktan sonra genel olarak rumen sıvısında birkaç saat yüzerler ve bu arada rumendeki bitki parçalarına tutunurlar. Zoosporlar taze bitki parçalarına tutunmalarından hemen önce çoğunlukla kamçılarını kaybederler (Heath ve ark., 1986). Oluşan bu kistler bitki hücre duvarlarını yıkarak hücre içinde rizoidleri filizlendirirler. Böylece vejetatif büyüme dönemi başlamış olur. Bu dönemle birlikte çekirdeğin (nükleus) nükleer bölünme ile çoğalması sonucu spor kesesi içerisinde çok sayıda zoosporun oluşumu söz konusu olur (Munn, 1994). Anaeromyces, Orpinomyces, Piromyces ve Neocallimastix cinslerinin rizoidleri yüksek oranlarda dallanmalar gösterirken, Cyllamyces ve Caecomyces cinsleri çoğunlukla dallanmamış tek bir rizoid yapısına sahiptir. Gelişmiş durumdaki zoosporlar sporkesesi içerisindeki kese zarından ayrılırlar. Daha sonraki aşamada sporkesesi kamçının tam karsısındaki bir noktadan sindirilir ve zoosporlar serbest halde yüzmeye başlarlar (Munn, 4

18 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP 1994; Ozkose ve ark., 2001). Böylece monosentrik bir fungusun yaşam döngüsü (Şekil 1) tamamlanmış olur. Wubah ve ark. (1991a), Georgia ineğinden izole edilen Neocallimastix sp. üzerinde yaptıkları morfolojik çalışmalarında, bu türün gelişmiş tallustan büyüyen zoosporlarının geriye yönlenmiş 9 16 kamçılarının olduğunu ve bunların şekillerinin sıvı ortamda oval iken agarda şekilsiz form tipinde olabildiklerini belirtmişlerdir. Monosentrik funguslarda ya kist oluşturmuş ve çekirdek içeren zoosporlar spor kesesi içerisinde gelişirler ki bu büyüme şekline endojenyus zooporangial büyüme denir ya da nükleus zoospor dışına göç ederek orada spor kesesi oluşturur ve bu şekilde olan büyümeye de ekzojenyus büyüme denir. Her iki halde de monosentrik funguslarda her bir birey için bir tek spor kesesi oluşur ve sadece spor kesesi çekirdek içerir (Barr ve ark., 1989). Dolayısıyla monosentrik funguslarda tek bir noktadan çoğalma söz konusudur. Polisentrik funguslarda çekirdek kist oluşturmuş zoosporun dışına yani rizoidlere göç eder ve nükleer bölünmeyle her bir birey için fungusun değişik bölgelerinde birkaç tane spor kesesi şekillenir (Barr ve ark., 1989). Dolayısıyla, polisentrik funguslar çoğalmaları için zoosporlarının salınmasına ihtiyaç duymazlar. Bu nedenle bu fungusların zoosporları nadir olarak gözlenebilmektedir. Polisentrik funguslar, monosentrik funguslardan farklı olarak, teoride sonsuz bir yaşam döngüsüne sahiptir ve yaşamaya devam etmek için zoospor salınımına bağlı değildirler. Büyüme modelleri yüksek fungusları andırır, flament (lif) ile ürerler (Ho ve Bauchop, 1991). Monosentrik (tek bir merkezden üreyen) funguslarla karşılaştırıldıklarında çok az sayıda zoospor üretirler (Phillips ve Gordon, 1989) Bitki Hücre Duvarının Yapısı Bitki hücre duvarını oluşturan başlıca polimer grupları; selüloz, hemiselüloz, pektin, lignin ve az miktarda proteindir Selüloz Bitki hücre duvarı yapı taşı olan selüloz, bir çok lignoselülozun başlıca bileşeni olup, ß- 1,4 glikozidik bağlı glikoz moleküllerinden oluşan bir homopolisakkarittir (Şekil 2.). Selülozun şekilsiz formu daha az molekül içi hidrojen bağına sahip olması nedeni ile nispeten kolay yıkılır ancak kristal formdaki selüloz fiziksel yapısı nedeniyle biyolojik yıkıma karşı daha dayanıklıdır (Beguin, 1990). Bu kristal yapı selülozun hidrolizinde selüloz fibrillerine göreceli olarak elastikiyet ve dayanıklılık kazandırır (Yamanaka ve ark., 1989). Selülozun glikoza kadar yıkımı için başlıca 3 enzim sınıfı gerekmektedir; endoglukanazlar (endo-1,4-β-glukanaz EC ), sellobiyohidrolazları da içeren ekzoglukanazlar (1,4-β-D-glukan sellobiyohidrolaz EC ) ve ekzoglukohidrolaz (1,4-β-D-glukan glukohidrolaz EC ) ve β-glukosidazlar EC Bu enzimler molekül içi glikozidik bağlarını poliglukan halka boyunca kırarlar. Ekzoglukanazlar 5

19 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP (Sellobiyohidrolaz ve ekzoglukohidrolaz) poliglukan halkanın uçlarına saldırır ve bu uçlardan sellobiyoz ya da glikoz ünitelerini kopartır (Coughlin ve Ljungdahl, 1988; Goyal ve ark., 1991). Şekil 2. Selülozun diyagramatik yapısı Ksilan Selülozun yanı sıra ksilanlar bitkinin başlıca yapısal polisakkaritlerindendir ve ruminant beslemede önemli bir enerji kaynağıdır. Ksilanlar β-1,4 bağlı D-ksilopiranosil şekerlerinin oluşturduğu omurgaya eklenmiş α-2,3 bağlı L-arabinoz, α-1,2 glukuronik asit ya da 4-0-metil D-glukuronik asit ve ester bağları üzerinden bağlanmış ferulik, p-kumarik ya da asetik asitten oluşur (Marinsek Logar ve ark., 1998) (Şekil 3.). Bazı ksilanların özelliği, bilhassa tahıl türlerinde, arabinosil kısımları üzerinden kovalent bağlı fenolik alt ünitelerin bulunmasıdır. Ksilanların yıkımı için, endo 1,4-β-Dksilanaz, β-ksilobiaz, β-ksilosidaz ve yan grupların yıkılması için gereken enzimlerin bileşiminin gerektiği belirtilmektedir (Orpin ve Letcher, 1979). Şekil 3. Ksilanın diyagramatik yapısı Hemiselüloz Hemiselülozlar alkali çözünen genel olarak heteropolisakkarit yapısında olan polisakkaritlerdir (Wilkie, 1983). Düz ya da dallanmış yapıda, D-ksiloz, L-arabinoz ya da D-galaktoz veya bunların kombinasyonundan oluşan, farklı cinslerde polisakkarit gruplarını içerirler (Zimmermann, 1992) (Şekil 4.). Birçok hemiselüloz ksilanca zengin bir yapı teşkil eder; β-1,4-ksilopiranosidaz gruplarından oluşan omurgaya, α-d-glukuronik asit ya da 4-0-metil-α-D-glukuronik asit ve α-l-arabinofuranoz birimleri bağlanır (Joseleau ve ark., 1992). 6

20 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP Şekil 4. Buğdaygil hemiselülozun diyagramatik yapısı Pektin Pektinler genel olarak birbirlerine α-1,4-glikozidik bağlarla bağlanmış D- poligalakturonatlar ile asidik polisakkaritlerden meydana gelmişlerdir (Şekil 5.). Ana zincire α-1,2 bağlarıyla bağlanan L-ramnoz dalları polimere helikal bir yapı kazandırmaktadır (Nordkvist, 1987). Pektin yıkımı hemiselüloz ve lignin arasındaki bağların kırılması sonucu gerçekleşir ve bu biyolojik yıkımda anaerobik funguslar da görev alır. Şekil 5. Pektinin diyagramatik yapısı Lignin Lignin bir karbonhidrat olmamasına karşın doğada daha çok selüloz ve hemiselüloz ile bir arada bulunduğundan karbonhidratlar içinde incelenenir. Lignin, pektin ve hemiselüloz gibi bir heteropolisakkarittir (Şekil 6.). Lignin molekülünün büyük kısmı merkez lignin molekülüne direkt C-C dan bağlanan ya da eter üzerinden bağlanan fenilpropanoid alt ünitelerinden oluşur. Yaygın bağlantı fenilgliserol-β-aril eter bağları ile olur ve fenilkumaran, diarilpropan ve bifenil bağları bunu takip eder. Kendine özgü bir şekilde ama düşük oranda da difenil eterleri ve pinoresinol bağlantıları da bulunmaktadır. Tüm bu bağlar hidrolizin imkansız ya da oldukça zor olmasını sağlamaktadır (Bresnak ve Brune, 1994). Lignin, karbonhidrat polimerleri ile çok yakın ilişkili olduğundan ve hemiselülozla kovalent bağlı olduğundan kısmi denatürasyon olmadan lignoselülozdan izole edilemez. Bu kovalent bağlar hücre duvarındaki polimerizasyon işlemi boyunca oluşur, oluşan tepkime sadece diğer oligolignoller ile değil eterlerin ve esterlerin benzeri olan hemiselülozların ürünlerinde glukuronik asidin karboksi ve hidroksi grupları ile de gerçekleşir (Freudenberg ve Neish, 1968; Higuchi, 1990). 7

21 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP Doğada en çok bulunan biyolojik materyallerin başında selüloz ve lignin gelir. Bunların, doğada mikrobiyolojik olarak sürekli parçalanması söz konusudur. Her yıl milyonlarca ton biyolojik molekül çeşitli organizmalar tarafından kimyasal olarak yıkılmakta ve yapılmaktadır. Ancak ligninin parçalanmasında moleküler oksijene ihtiyaç duyulur ve bunun da rumende eser miktarda bulunan oksijenin kullanılarak gerçekleştirilmesi mümkün olmamaktadır (Theodorou ve ark., 1996). Şekil 6. Ligninin diyagramatik yapısı 1.5. Anaerobik Fungusların Bitki Hücre Duvarını Yıkımı Lifli beslenmede, rumendeki bitki parçacıklarının büyük bölümü anaerobik funguslar tarafından hızlı ve kapsamlı şekilde kolonize edilir. Günümüzde anaerobik fungusların rumen biyokütlesindeki başlıca kolonize edici olduğu fikri kabul görmüştür (Bauchop, 1979). Davies (1991), anaerobik fungusların değişik büyüklükteki bitki parçacıklarını benzer oranlarda ve benzer boyuta kadar parçalayabildiklerini göstermiştir. Zorunlu anaerobik fungusların rumen metabolizmasına katkısı, özellikle de bitki hücre duvarını parçalaması ve takip eden fermentasyondaki dikkat çekici bir etkisi bulunmaktadır. Rumen fungusları rizoidler veya rizomiselyalar meydana getirerek bitki hücre duvarının içine girer ve gerek fiziksel olarak ve enzimatik olarak hücre duvarını parçalarlar (Borneman ve ark., 1993). Anaerobik funguslar bitki biyokütlesini parçalayabilmek için kapsamlı faaliyet alanı olan enzimler üretirler. Selülaz (Lowe ve ark., 1987c; Barichevich ve Calza 1990), hemiselülaz (Lowe ve ark., 1987c; Mountfort ve Asher, 1989), ksilanaz (Teunissen ve ark., 1991), glikosidaz ve ksilosidaz (Hebroud ve Fevre, 1988; Chen ve ark., 1994) anaerobik fungusların ürettiği fibrolitik enzimlerin başlıcalarıdır Tezin Amacı ve Kapsamı Bu tezin amacı, herbivorların sindirim sistemindeki mikrofloranın önemli bir grubunu teşkil eden ve biyoteknolojik uygulamalarda yüksek öneme sahip olan anaerobik fungusların çeşitli herbivorlardan izole edilmeleri, saflaştırılmaları, kültüre alınmaları ve bu mikroorganizmalar tarafından üretilen enzimlerin aktivitelerinin ve karakterizasyonunun gerçekleştirilmesidir. 8

22 1. GİRİŞ A. SELEN AKINALP Bu amaçla çalışma planı şöyledir; 1. Ruminantların (sığır, koyun, keçi vs.) ve diğer herbivorların (at, eşek vb.) dışkı örneklerinden anaerobik fungus izolasyonu 2. İzole edilen anaerobik funguslardan saf kültürler elde edilmesi 3. İzole edilen anaerobik fungusların sahip oldukları enzim aktivitelerinin belirlenmesi ve enzimlerin karakterize edilmesi. 9

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Anaerobik Funguslarla Yapılan Önceki Çalışmalar Tanımlanmalarına Yönelik Çalışmalar Barr (1980), Chytridiales (Kitritler) in filojenisinde ve sınıflandırılmasının temelinde; tallus büyümesi, zoospor boyutu, zoospor ince yapı karmaşıklığı ve organizasyonuyla, kamçı uzunluğunun gösterge olduğunu belirtmiştir. Chytridiomycetes in Spizellomycetales cinsi, Barr (1980) tarafından rapor edilmiş, Chytridiomycetes in alt bölümünün farklı zoospor ince yapıları hesaba katılarak, her 2 cinsin (Spizellomycetales ve Chytridiales) familya ve cinsleri arasında birçok benzerlikler olduğu sonucuna varılmıştır. Anaerobik fungusların içinde yer aldığı Spizellomycetales te familyalar, fungusların morfoloji ve tallus büyümesine göre sınıflandırılmakta iken cins sınıflandırılması öncelikle zoosporların ince yapıları göz önünde bulundurularak yapılmaktadır (Barr, 1980; 1988). Barr (1988), Eumycotina bölümünün alt bölümüne Mastigomycotina yı yerleştirmiş ve bu fungusu Chytridiomycetes sınıfına atamıştır. Chytridiomycetes yeniden sınıflandırılmış ve yeni order Spizellomycetales, anaerobik fungus içine sokulmuştur. Bununla beraber Munn (1994), net yapısal karakteristiğe dayanarak Neocallimasticales in, tek kamçılı ve çok kamçılı özelliklerine bakılarak Spizellomycetales takımında değil de Anaeromyces takımında olmaları gerektiğini önermiş fakat bu öneri kabul görmemiştir Neocallimastix sp. Barr (1981), Neocallimastix cinsinin yapısal tanımlamasında özellikle kamçı kaide cisimciği ya da dip taneciği olarak tanımlanan kinetozomların yapı şeklinin zoosporik fungusların geçerli taksonomisin temeli olduğunu belirtmiştir. Heath ve ark. (1983), Neocallimastix cinsinin yapısal tanımlamasını N. frontalis in zoosporlarının ince yapılarına dayandırarak yapmış ve N. frontalis olarak adlandırmıştır. Orpin ve Munn (1986), N. patriciarum u da kapsayan Neocallimastix cinsinin ilk tanımlamasını düzeltmiş ve Neocallimastix patriciarum un zoosporlarının, N. frontalis inkinden farklı olduğunu belirterek, yeni tür olarak tanımlamasını yapmışlardır. Buna göre, Neocallimastix frontalis (Orpin, 1975) olarak bilinen fungus türünün adlandırması, N. patriciarum olarak değiştirilmiştir. Webb ve Thedorou (1988), koyun dışkısından izole ettikleri anaerobik fungusu, monosentrik oluşu ve tek kamçılı zoosporlarıyla karakterize etmişler ve adlandırmasını Neocallimastix hurleyensis olarak saptayarak, fungus taksonomisine dahil etmişlerdir. 10

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP Barr ve ark., 1989 yılında yayınladığı çalışmasında, ince yapı farklılıklarına dayanarak anaerobik fungusları Spizellomycetales takımının yeni familyası Necallimasticacae ye atamıştır. Gold ve ark. (1988), bu familyanın altbölümlerinin içinde monosentrik türleri içeren 3 cinsin bulunduğunu ileri sürmüştür; Neocallimastix, Piromyces (Piromonas) ve Caecomonas (Sphaeromonas). Ho ve ark. (1993d), sığırdan izole edip, karakterize ettikleri Neocallimastix variabilis i tanımlamışlardır Piromyces sp. Barr ve ark. (1989), sığır rumeninden; monosentrik ve spor keseleri üzerinde endojenyus ve ekzojenyus büyüme gösteren Piromyces communis i izole etmişlerdir. Li ve ark. (1990), at dışkısından Piromyces mae yi, fil dışkısından P. dumbonicus (dumbonica) ve P. rhizinflatus (rhizinflata) izole etmiş, ışık ve elektron mikroskobu ile inceleyerek; monosentrik yapısı ve tek kamçılı zoosporları vejetatif tallusları ile karakterize etmişlerdir. Ho ve ark. (1993a), geyikten küçük spor kesesi, sağlam spor kesesi duvarları, düzdallanmamış ana rizoidleri, seyrek dallanmış rizoidal sitemleri ile karakterize ettikleri Piromyces minutus u izole etmişlerdir. Ho ve ark. (1993c) keçi rumeninden, endojenyus spor kesesiyle monosentrik olarak tanımladıkları Piromyces spiralis i izole etmişlerdir Caecomyces sp. Orpin, koyun rumeninden izole ettiği fungusları Neocallimastix frontalis (1975), Sphaeromonas communis (1976), Piromonas communis (1977) olarak adlandırmıştır. Gold ve ark. (1988), at sekumundan izole ettikleri bir anaerobik fungus türünü ışık ve elektron mikroskobunda incelemiş ve bu yeni fungus türünü Caecomyces equi olarak adlandırmışlardır. Aynı çalışmalarında, Orpin in adlandırmasını yaptığı monosentrik Sphaeromonas communis (1977) in, adlandırılmasını Caecomyces communis olarak düzeltmişlerdir. Wubah ve ark. (1991b), Caecomyces communis in büyümesi ve morfolojisi ile ilgili yaptıkları çalışmalarında; bu türün monosentrik bir fungus olduğunu, vejetatif hücre ya da miseloid tallusa eklenmiş bir yada daha fazla spor kesesi içeren tallus formunda büyüdüğünü belirtmişlerdir Orpinomyces sp. Orpinomyces cinsinin ilk tanımlanması Barr ve ark. (1989) tarafından yapılmış ve araştırıcılar Orpinomyces bovis türünü tiplendirmişlerdir. 11

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP Breton ve ark. (1989), koyun rumeninden izole ettikleri polisentrik talluslu, çok kamçılı zoosporlarıyla teşhis ettikleri anaerobik fungus türünü Neocallimastix joyonii olarak adlandırmış, daha sonradan polisentrik tallus, geniş ve kapsamlı polinükleer bir rizomiselyum, gama parçacıklarına benzer yapısıyla çok kamçılı zoosporları ile karakterize edilen ve kendilerinin Neocallimastix joyonii olarak tanımladıkları fungus cinsinin doğru isimlendirilmesinin Orpinomyces joyonii olduğunu bildirmişlerdir Anaeromyces sp. Breton ve ark. (1990), koyun rumeninden izole ettikleri yeni suşu polisentrik tallusu, polinükleer rizomiselyumu, mucronat zoospor kesesi (spor kesesinin üst kısmında yer alan çıkıntı) ve çok kamçılı zoosporları ile karakterize etmiş bu tanımladıkları yeni cinse Anaeromyces mucronatus ismini vererek, bu cinsi ilk kez tanımlamışlardır. Ho ve ark. (1990) yaptıkları çalışmalarında, bu cinsin Ruminomyces ile sinonim olduğunu belirtmişlerdir. Ho ve ark. (1993d) yayınladıkları düzeltme makalesinde, tanımlanmasını daha önceden Ruminomyces elegans (Ho ve ark., 1990) olarak yaptıkları fungusun adlandırmasının Anaeromyces elegans olduğunu rapor etmişlerdir Cyllamyces sp. Ozkose ve ark. (2001), sığır dışkısından elde ettikleri anaerobik fungusu polisentrik yaşam döngüsü, küresel rizoidleri ve tek kamçılı zoosporlarıyla karakterize etmişler ve bu yeni türü Cyllamyces aberensis olarak tanımlamışlardır Hücre Duvarı Yıkımı Bauchop (1979), anaerobik fungusların rumen biyokütlesindeki başlıca kolonize edici olduğu fikrini yaptıkları çalışmada belirtmişlerdir. Joblin (1989), Caecomyces spp. nin sahip olduğu küresel misel nedeniyle bu cinsin bitki hücre duvarını parçalayabilme yeteneğinin olduğunu ve bu suretle bitki dokularının içine girip parçalayabildiklerini belirtmişlerdir. Gordon ve Phillips (1989) yayınladıkları çalışmalarında, fermente olabilir C kaynağı olarak % 1 (w\v) buğday samanı ya da saf selüloz ihtiva eden sıvı besi yerinde Neocallimastix sp., Piromyces sp. ve Caecomyces sp. suşları kültüre almışlardır. Suşların içinden Neocallimastix sp., Piromyces sp. suşları, selülozda üremiş olan Caecomyces sp. suşunda herhangi bir gelişme gözlenmemiştir. Araştırıcılar, 3 fungus türünün buğday samanı üzerinde en aktif olanının Neocallimastix, daha sonra sırasıyla Piromyces sp. ve Caecomyces sp. suşları olduğunu belirtmişlerdir. Theodorou ve ark. (1989), N. hurleyensis in, çavdar samanının hücre duvarının yapısal polisakkaritlerini yaklaşık % 75 oranında parçaladığını belirtmişlerdir 12

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP Borneman ve ark. (1989), anaerobik fungusların yıkıma direnç söz konusu olduğunda, koloni haline getirilen dokuları (dayanıklı sıklerenkima ve vasküler dokular gibi) tercih ettiğini bildirmişlerdir. Akin ve ark. (1990), Caecomyces in tropikal çimende % 60 kuru madde kaybına neden olduğunu belirtmişlerdir. Davies (1991), anaerobik fungusların değişik büyüklükteki bitki parçacıklarını benzer oranlarda parçalayabildiklerini rapor etmiştir. Joblin ve Naylor (1993), palmiye lifleri ve odun gibi oldukça sağlam kolonize olmuş bitki materyallerinde bile anaerobik fungusların doku içlerine girebildiklerini rapor etmişlerdir. Sijtsma ve Tan (1993) tarafından yapılan bir çalışmada, çok yıllık otların hücre duvarının %65 ve % 90 civarının sırasıyla Piromyces sp. ve Neocallimastix sp. tarafından parçalandığı tespit etmişlerdir. Zhu ve ark. (1996) nın çalışmalarında, rumen benzeri büyüme koşulları ile devamlı kültür kullanmışlardır. Ruminal çıkış oranları ile sulandırma oranları karşılaştırılabilir olduğundan, monosentrik ve polisentrik anaerobik fungusların her ikisinde de % 8 10 buğday samanı içeren devamlı akan kültürde, substratın % 60 lık oranda substrat gideriminin olduğunu ancak yine %8 10 buğday samanı içeren sıradan grup kültüründe ise, substrat gideriminin yalnızca %12 olduğunu bildirmişlerdir. Gordon ve Phillips (1998) yaptıkları çalışmalarda, Caecomyces cinsinin üyelerinin, anaerobik fungusların içinde bitki hücre duvarını en az parçalayabilenler olduğunu rapor etmişlerdir Selülazlar ve Glikosidazlar Bisaria ve Ghose (1981), anaerobik fungusların ürettiği ekstraselüler enzim kompleksinin klasik etkisinin, endoglukanazlar tarafından ilk etapta doğrusal selüloz zincirindeki kırıkların meydana getirilmesi ve bunu takiben, ekzoglukanazların β- glukosidaz (sellobiaz) tarafından hidrolize edilen glukozlardan uzaktaki kırık bölgelerdeki selülozların serbest kalması olduğunu belirtmişlerdir. Wood ve ark. (1986), anaerobik fungusların bazı selülazlarının dikkate değer özelliklere sahip olduğunu belirtip, N. frontalis in saf tür kültürlerinden elde edilen süpernatanlarının pamuk liflerini 72 saat içinde %16 ya dek çözebildiğini, bununla birlikte rumen metanojenlerinin varlığında karışık kültürün selülazının çok daha aktif olduğunu, benzer rumen periyotları içinde yüksek sıralı pamuk selülazlarının %98 ini etkileyip çözdüğünü belirtip, anaerobik fungus rumen metanojen karışık kültürünün içerdiği selülaz aktivitesinin, bu aktivitenin önceden bilinen en aktif selülaz kaynağı T. reesei (C 30 suşu) nun selülazından çok daha iyi olduğunu göstermişlerdir. Lowe ve ark. (1987a), Neocallimastix sp. e ait bir fungus suşuyla yaptıkları çalışmalarında, anaerobik fungusların selülolitik enzimlerinden CMCaz, sellobiaz ve 13

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP ksilanaz enzimlerinin optimum ph larının sırasıyla; 6.0, 5.5, ve 6.0 olduğunu, enzimler için optimum sıcaklığın ise 50ºC olduğunu bildirmişlerdir. Hebraud ve Fevre (1988) yaptıkları çalışmalarında, N. frontalis, P. communis in selülaz aktivitesi, Aviselaz, filtre kağıdı aktivitesi, karboksimetilselülaz (CMCaz) ya da endo-glukanaz ve β-glukosidaz ya da sellobiaz aktivitelerini de içerdiğini ve enzimin optimum ph sının , optimum sıcaklığının da 45-55ºC olduğunu belirtmişlerdir. Araştırıcılar, bazıları intraselüler olsa da birçok selülolitik enzimin ekstraselüler olarak üretildiğini eklemişlerdir. Barichevich ve Calza (1990), glikozda büyümüş kültürlerin selüloz aktivitesinin düşük olduğunu bulmuşlardır. Wood ve Garcia-Campayo (1990), genel olarak selülazların hücre dışı enzim komplekslerinin, ekzo 1,4-β-D-glukanaz (sellobiohidrolaz), endo 1,4-β-D-glukanaz ve β- D-glukosidaz içeren kristal selülozu hidrolize ettiğini belirtmişlerdir. Wilson ve Wood (1992), N. frontalis in selüloz enzimlerinin küçük bir parçasının (%4) selülaz kompleksi benzeri bir yapıda sakladığını ve bu enzimin selüloza adsorbe olduğunu (tutunduğunu) rapor etmişlerdir. Araştırıcılar, N. frontalis tarafından selüloz yıkım mekanizmasının C. thermocellum unkine benzeyebildiğini ancak N. frontalis in selülozomunun (700 kda ) C. thermocellum unkinden ( kda) çok daha küçük ve diğer özellikleri ile de farklılıklar taşıdığını belirtmişlerdir. Xue ve ark. (1992a), sellobiyohidrolaz ve 2 endoglukanaz enzimleri için sırasıyla cela, celb ve celc genlerinin kodlandığını ve bu enzim genlerinin ekspresyonun selüloz tarafından teşvik edildiğini belirttikleri çalışmalarında, N. patriciarum un selüloz genlerini E.coli ye klonlamışlar ve rekombinant bakterinin eksprese ettiği cela enziminin şekilsiz ve kristal selüloz üzerine celb ve celc enzimlerinin ise CMC üzerinde oldukça yüksek aktivite gösterdiğini rapor etmişlerdir. Xue ve ark. (1992b), E.coli içinde N. patriciarum un cdna ekspresyon arşivini oluşturmuş ve anaerobik fungal genomda diğer polisakkarit parçalanmalarını ve selülozların kodlandığı 2 tip genin varlığını kanıtlamışlardır. Bir önceki çalışmalarında belirttikleri, kristal ve şekilsiz selüloza (cela) ve karboksimetilselüloza (celb, celc) karşı yüksek aktiviteli selülazı kodlayan birçok kopya içinden (cela, celb, celc) bir tip bulmuşlardır. Genin (celd) 3 katalitik etki alanı ile çok farklı bir polisakkaridaz kodlayan ve her biri endoglukanaz, sellobiohidrolaz ve ksilanaz aktivitesine sahip bir başka türü tek kopya halinde bulunduğunu belirtmişlerdir. Araştırıcılar, celd enziminin selüloz bağlarına ilgisi olduğunu belirtmişlerdir. Chen ve ark. (1994), aviselde büyüyen bir Orpinomyces sp. den ekstraselüler bir β- glukosidaz saflaştırmış, fakat çok az ürün elde edebilmişlerdir. Araştırıcılar, enzimin 86 kda moleküler kütlede bir monomerlik glukoprotein olduğunu (%85 (w/v) karbonhidrat), optimum aktiviteyi ph 6.2 ve 50ºC de gösterdiğini belirtmişlerdir. Saflaştırılan enzim, 40ºC de sıcaklığa dayanıklı olup, Mg 2+, Mn 2+, Co 2-, Ni 2+ ile uyarılmış ve Ag 2+, Fe 2+, Cu 2+, Hg 2-, SDS, p-kloromerküribenzoat ile yavaşlatılmıştır. 14

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP Zhou ve ark. (1994), N. patriciarum dan cdna dizayn edip, E. coli ye klonladıkları çalışmalarında, anaerobik rumen bakterilerinin birkaç endoglukanazının ve celb nin katalitik etki alanı arasında homoloji gözlenmesi, selülozun ökaryot ve prokaryotlar arasında gen transferini de içeren evrimine delil addedilebileceğini bildirmişlerdir Ksilanazlar Lowe ve ark. (1987a), ksilanaz üretimini en çok etkileyen ksilan olsa da, ksilanazların buğday samanı, selüloz, sellobiyoz, glukoz ya da ksilozda büyümüş anaerobik funguslar tarafından da üretileceğini bildirmişlerdir. Bunun, anaerobik funguslar tarafından sürekli olarak üretilen ksilanazın temel seviyesi olduğunu ve üretimi ksilanın varlığını artırdığını da eklemişlerdir. Lowe ve ark. (1987c) ve Mountfort ve Asher (1989) yaptıkları çalışmalarında ksilanlı ortamda, ksilanaz ve ksilobiaz enzimlerinin her ikisinin de kültür sıvısında ksilanın parçalanarak; ksiloz, ksilobioz ve ksilo-oligosakkaritlerin oluşması süresine dek görev aldığını belirtmişlerdir. Mountfort ve Asher (1989), ksilanazın esasen ekstraselüler ya da kısmen hücre bağlantılı olarak salgılanabildiğini ve enzimin optimum ph sının arası, optimum sıcaklığının ise 50ºC olduğunu bildirmişlerdir. Gilbert ve ark. (1992), rekombinant bir ksilanazı (XYLA), N. patriciarum un mrna sından elde edilen bir E. coli nin barındırdığı xyla dan saflaştırmış, bu enzimin çavdar ksilanından ksilobioza kadar etkin olduğunu saptamışlardır. Ancak bu enzimin katalitik etki alanının farklı olması sebebiyle selülotik substratlara ve bu yapıların birimlerine etkili olmadığını eklemişlerdir. Gilbert ve Hazlewood (1993) çalışmalarında selülaz celb geni gibi, N. Patriciarum ve bazı bakteriyel ksilanaz enzimlerinin sekanslarının karşılaştırmış ve bu enzimler arasındaki belirgin homolojiyi açığa çıkarıp, rumen prokaryotları ve düşük ökaryotlar arasında horizontal gen transferinin olabilirliğini ve ortak bir evrimsel orijininin olabileceğini rapor etmişlerdir. Garcia-Campayo ve Wood (1993), N. frontalis ten B-D-ksilosidazı saflaştırmışlardır. Enzimin 2 polipeptit alt ünitesinin moleküler ağırlığının 83 kda ve 53 kda olduğunu belirtmişlerdir. İzole edilen enzimin optimum sıcaklığı 37ºC, optimum ph sı 6.4 olup, enzim, ksilo-oligosakkaritler ve ksilobioz üzerinde tipik bir ekzo-aktiviteye sahiptir ve D- ksiloz varlığında enzim aktivitesi ciddi miktarda azalır. Katalitik aktivitelerin polipeptit alt ünitelerinin biri ya da her ikisine bağlı olup olmadığı net değildir ancak enzimin Cu 2+, Ag 2+, Zn 2+, EDTA ve SDS tarafından yavaşlatıldığını ve Ca 2+, Mg 2+ varlığında uyarıldığını da eklemişlerdir. Tamblyn Lee ve ark. (1993), N. patriciarum un endo aktiviteli β-1,4-ksilanaz genini, faj ve plazmid vektörlerle E.coli içine klonlamışlardır. Rekombinant enzimin ksilanaz aktivitesinin muhtemelen kendi promotoru vasıtasıyla hücrenin periplazmik boşluğunda eksprese edilmiştir. Bu E. coli yapay sisteminin, N. patriciarum promotorunu kabul ettiğini göstermiştir. Periplazmik enzimin optimum sıcaklığı 40ºC, optimum ph sı 6.2 dir ve 15

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP enzim ksilana karşı aktivitesinin yanı sıra karboksimetilselülaza karşı da bir miktar aktivite göstermiştir Pektinazlar Orpin (1984), Orpin ve ark. (1985) yaptıkları çalışmalarında, buğday samanında bulunan pektinin anaerobik funguslar tarafından parçalanma miktarının %20-40 ından daha az olduğunu bildirmiştir. Pearce ve Bauchop (1985), Gordon ve Phillips (1992) in yaptığı çalışmalarda, monomer galakturonik asit deneme susbstratı olarak poligalakturanat kullanıldığında metilesteraz ve endo-poligalakturanat lysa oluşamadığı ortaya konmuştur. Williams ve Orpin (1987), N. frontalis ve N. patriciarum un kültür filtratlarındaki pektin bağlayıcı enzimlerin düşük seviyelerde olduğunu göstermişlerdir. Bununla beraber Phillips ve Gordon (1988), ne pektin ne de alt ürünleri D- galaktronik asit ve poligalakturonik asidin, karbonun tek kaynağını sağlamak için anaerobik funguslar tarafından fermente edemediğini belirtmişlerdir. Jeffries (1990) çalışmasında, anaerobik fungusların, büyümek için pektin yıkımı sonrası oluşan ürünleri kullanma yeteneğinin olmadığı bilinse de pektini parçalayabildiğini, fenolik asitler gibi pektinin lignin ve hemiselüloz ile eter ve ester bağları yapısında olabildiğini ve ligninin hemiselüloza bağlanmasında önemli bir rol oynayabildiğini belirtmiştir. Gordon ve Phillips (1992), Neocallimastix sp. nin pektinolitik enzimlerini rapor etmişlerdir. Optimum ph sı 8.4 olan ve Ca 2+ ile uyarılan turunçgiller pektinine karşı bir enzim tespit etmişler, bu enzimin, aerobik fungus türünden Blastocladia ramosa tarafından üretilen endopektin lysa a benzer bir aktivitede olduğunu eklemişlerdir. Lawrence (1993) ın yaptığı çalışmasında, Malezya su aygırı dışkısından elde edilen birkaç Neocallimastix de önceden yıkanmış elma pektini üzerinde büyüyebildiği, bu izolantlardan bazılarının tek karbon ve enerji kaynağı olarak poligalakturanat üzerinde büyüdüğünü göstermiştir Lignin Parçalayıcı Enzimler Orpin (1981) ve Akin ve ark. (1983) nın yaptığı çalışmalarda bulunan bazı sonuçlar ligninin anaerobik funguslar tarafından kısmen parçalanabildiğini işaret etmiştir. Ancak Gordon ve Ashes (1984), Windham ve Akin (1984), Theodorou ve ark. (1989) nın çalışmalarında, anaerobik fungusların ürettiği enzimlerin lignin parçalama yeteneği olmadığını belirtilmişlerdir. Kivaisi ve ark. (1990) a göre, lignin yıkımı moleküler oksijen gerektirir ve anaerobların lignini yıkma olasılığı yoktur. Yine de yapay rumen reaktörünün süpernatant 16

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR A. SELEN AKINALP solüsyonları, muhtemelen rumen mikroorganizmaları tarafından serbest bırakılan ligninden sağlanan bileşikleri içermektedir Proteolitik Enzimler Wallace ve Joblin (1985), tripsin benzeri özgüllük ve hücreye bağlı ve hücreden bağımsız her 2 aktivitesi ile N. frontalis in yüksek metalloproteaz aktivitesini gösterdiğini belirtmişlerdir. Aynı araştırıcılar, N. frontalis proteazlarının çok aktif proteolitik rumen bakterileri ile karşılaştırılabileceğini ancak bazı aerobik funguslarla karşılaştırıldığında pek göze çarpan sonuçlar vermediğini belirtmişlerdir. Bu yazarlar fungusların proteazlarının büyümek için amino asit sağlamak, bitki materyalinin içine girmeye yardım etmek ya da diğer ekstraselüler enzimlerin bu aktivitelerini modifiye etmeyi sağladığı görüşündedirler. Her zaman proteolitik olmayan, oldukça aktif selülotik rumen bakterilerinin olduğu gözlense de, bu proteolitik ve selülolitik enzimler anaerobik fungusların kendine has bir özelliği olabilir. Yazarlar tek ya da bakteri ile ilişkili anaerobik fungal proteazın, rumendeki besinsel proteinlerin yıkımına dikkat çekici katkıda bulunduğunu ileri sürmüşlerdir. Asoa ve ark. (1993) nın yaptıkları bir çalışmada, Piromyces ve Neocallimastix in metalloproteaz, sistein, proteaz ve serin proteazlarını araştırmış ve optimal ph larının arası olduğunu bildirmişlerdir. Çalışmanın sonuçlarına göre; EDTA, 1,10 0- phenetrolin, p-kloromerküribenzoat, merthiolate ve fenilmetilsülfonilflorid proteazları inhibe edip ve izolatlara karşı etkin olup, proteaz aktivitesinin %50 70 inhibe olmasına yol açmıştır. Michel ve ark. (1993), Piromyces, Orpinomyces, Neocallimastix ve Caecomyces cinslerinden anaerobik fungusların 7 suşunun proteaz aktivitesini incelemiş, tüm suşlarda aminopeptidaz aktivitesi, 2 suşta da endopeptidaz aktivitesi gözlemlemişlerdir. 17