POLMERAZ ZNCR REAKSYONU (PCR) VE ENDODONTK MKROBYOLOJ POLYMERASE CHAN REACTION (PCR) AND ENDODONTIC MICROBIOLOGY

Transkript

1 POLMERAZ ZNCR REAKSYONU (PCR) VE ENDODONTK MKROBYOLOJ POLYMERASE CHAN REACTION (PCR) AND ENDODONTIC MICROBIOLOGY Dt. Özgür lke Atasoy ULUSOY* Prof. Dr. Güliz GÖRGÜL** ÖZET Bu makale polimeraz zincir reaksiyonunun (Polymerase Chain Reaction-PCR) endodontide kullanmn, endodontik mikroorganizmalarn varl6nn ve prevalanslarnn belirlenmesinde sa6lad6 avantajlar gözden geçirmektedir. Kültür yöntemiyle üretilemeyen mikroorganizmalarn 16S rrna bölgelerinin PCR kullanlarak ço6altlmas moleküler mikrobiyolojide ç6r açmtr. PCR kültür yöntemlerine göre daha hassas, özgül, hzldr ve daha kesin sonuçlar sa6lar. Bu metodlarn yerinde kullanm, endodontik hastalklarn nedenlerinin belirlenmesine, anlalmasna ve tedavi stratejilerinin gelitirilmesine önemli katklar sa6layacaktr. Anahtar sözcükler: PCR, virulans, mikroorganizma, kök kanal ABSTRACT This article reviews the use of polymerase chain reaction (PCR) in endodontics and the advantages in detecting the presence and prevalence of endodontic microorganisms. Amplification of 16S rrna gene regions of the uncultivable and fastidious microorganisms by PCR has blazed a trail in molecular microbiology. PCR is more specific, accurate, rapid and sensitive than culture methods. The well-directed use of these methods will provide additional valuable information regarding the identification and understanding of the causative factors associated with endodontic diseases, and may contribute to the development of improved treatment strategies. Key Words: PCR, virulence, microorganism, root canal POLMERAZ ZNCR REAKSYONU VE ENDODONTK MKROBYOLOJ Endodontik tedavinin amac, kök kanal sistemini mikroorganizmalardan temizlemek ve tekrar enfekte olmasn önlemektir. Bu amaçla biyomekanik preparasyon, irrigasyon ve szdrmaz bir biçimde kök kanal dolgusu yaplarak tedavi tamamlanmaldr. Ancak kök kanallarnda bulunabilen dirençli ve inatç mikroorganizmalarn varl6, prognozu olumsuz yönde etkileyebilmektedir. Kök kanallarnda bulunan mikroorganizmalar a6rl alevlenmeler, periapikal ykm ve inatç enfeksiyonlara sebep olabilmektedir 1-6. Bu mikroorganizmalarn identifikasyonu tedavinin baars bakmndan önemlidir. Kültür çalmalar ile mikroorganizmalarn büyük ço6unlu6u laboratuvar koullarnda üretilememektedir. >nsan vücudu, oral kavite ve kök kanalndaki mikrobiotann da kültüre edilemeyen bir çok türü oldu6u söylenebilir. Son yllarda mikrobiyal patojenler ve spesifik hastalklar arasndaki iliki konusunda moleküler biyolojik çalmalar yo6unluk kazanmtr 7. Mikrobiyolojik kültür ve biyokimyasal metodlar zaman alcdr ve zaman zaman çelikili sonuçlar verebilmektedir ylnda Kary Mullis tarafndan ilk kez bilim dünyasna sunulan PCR (Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu) modern bilme önemli katklar sa6lamtr 9. Biyolojik ve tbbi artrmalarn geliimine PCR n etkisi oldukça fazladr. Yöntem, gen ve genom çalmalarnda önemli bir arta neden olmutur. PCR kullanarak herhangi bir organizmadan herhangi bir gen izole etmek mümkündür 7. * Gazi Üniversitesi Di Hekimli6i Fakültesi, Di Hastalklar ve Tedavisi Anabilim Dal, Aratrma Görevlisi ** Gazi Üniversitesi Di Hekimli6i Fakültesi, Di Hastalklar ve Tedavisi Anabilim Dal, Ö6retim Üyesi 61

2 PCR yöntemi moleküler teknolojideki en önemli gelimelerden biridir. Yöntem, belli bir uzunluktaki DNA fragmannn invitro replikasyonuna ve siklusta DNA polimeraz enziminin hedef DNA y in vitro ço6altmas esasna dayanr 9. PCR reaksiyonu aratrlacak örnekteki DNA nn iki zincirinin yüksek s ile birbirinden ayrlmasn (denatürasyon), daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA ya ba6lanmasn (hibridizasyon), sonra zincirin uzamasn (polimerizasyon) ve bu sikluslarn belirli sayda tekrarlanmasna dayanr 9. Tüm bu basamaklara amplifikasyon ilemi denir. Bu ilemden sonra amplifikasyon ürününün saptanmas, kopyalar çkarlan primerler arasnda kalan belli baz çifti büyüklü6ündeki bölgenin jel üzerinde veya amplifikasyon yaplan bölgeye uygun tamamlayc prob ile hibridizasyon sonras belirlenmesi ile gerçeklemektedir. PCR yönteminde temel bileenler ise ; hedef DNA, hedef DNA nn dizilerini tamamlayan tek zincirli oligonükleotidler (primerler), 4-deoksiribonükleotid trifosfat (dntpler) ve sya dayankl DNA polimerazdr. En çok kullanlan DNA polimeraz Thermus aquaticus ad verilen termofilik bakteriden izole edilir ki buna Taq DNA polimeraz ad verilir 7. Bakteri tanmlanmas için genellikle basit bir PCR turu kullanlmakla birlikte baz durumlarda nested PCR, multiplex PCR, RT-PCR gibi farkl PCR yöntemleri de kullanlabilir 7,10. Di hekimli6inde moleküler genetik metodlar, genellikle klinik örneklerdeki mikroorganizmalar tanmlama ve birbirine yakn türleri ayrmada kullanlmaktadr. Endodontik çalmalarda DNA ekstraksiyonu için örnekler, genellikle sorunlu dilerin kök kanallarndan ve periapikal lezyonlarndan elde edilir. Diler önce pomza ile temizlenir, rubberdam izolasyonu yaplr. Operasyon sahasnn dekontaminasyonu, sodyum hipoklorit veya oksijenli su ile sa6lanr. Giri kavitesi tamamlannca pulpa kavitesi de dahil olmak üzere tüm operasyon sahas %2.5 lik sodyum hipoklorit ile ykanr. 15 numaral K tipi e6e ile preparasyon yaplr ve ardk iki paper point kanal içine yerletirilerek örnek alnr. Paper pointler daha sonra kriotüplere (cryotube) yerletirilir. Abse örnekleri, oral mukozann %2 lik klorheksidin ile yaplan dezenfeksiyonunun ardndan steril bir rnga kullanlarak püyün aspire edilmesi yoluyla alnr 11. Daha sonra alnan örnek PCR laboratuvarna gönderilir Moleküler yöntemlerde örnek hazrlanrken kontaminasyonu önlemek önemlidir 7,11. Yine de eksuda varl6 PCR yöntemini kültür yöntemindeki kadar etkilemez. Böyle durumlarda PCR kontaminasyona ra6men daha kesin sonuçlar verir 7. Kök kanallarnda bulunan en az saydaki bakteri hücreleri bile periapikal lezyon oluturabilme potansiyeline sahiptir. PCR yöntemi ile örnek bana 1-10 bakteri hücresi bile saptanabilmektedir; bu da kök kanallarndan örnek almann güç oldu6u ve az sayda bakterinin identifiye edilebildi6i durumlarda büyük yarar sa6lamaktadr. a) PCR Yöntemi ile Yeni Mikroorganizmalar6n Ke7fedilmesi Di hekimli6i ve endodontide PCR n yaygn kullanm alanlarndan biri kültür yöntemleriyle tespit edilemeyen yeni bakteri türlerinin varl6nn aratrlmasdr. Ayrca daha önce kök kanallarndaki varl6 kesinletirilmi çeitli mikroorganizmalar PCR sayesinde tanmlanm ve prevalanslar belirlenmitir. Siqueira ve arkadalar 11 kültür yöntemleriyle belirlenmesi çok zor olan Bacteroides forsythusun varl6n endodontik enfeksiyona sahip 50 diten 26 snda PCR ile saptamlardr. Tian Xia ve arkadalar 12 tekrarlayan tedavi gerektiren vakalarla ilikilendirilen Actinomyces türlerini abse ve selülitlerden aldklar örnekler yoluyla incelemilerdir. Vakalarn %32.1 inde A.viscosus, %23.7 sinde A.israelii, %8.5 inde A.naeslundii saptanmtr. Siqueira ve arkadalar 13 kök kanallarnda Treponema socranskiinin varl6n PCR yöntemi ile aratrmlar, primer enfeksiyona sahip dilerin %35 inde bu mikroorganizmann bulundu6unu bildirmilerdir. Siqueira ve arkadalar 14, Dialister pneumosintes ad verilen mikroorganizmann enfekte kök kanallarndaki yüksek prevalansna iaret etmilerdir. PCR ile yaptklar çalma sonunda bu bakterinin potansiyel endodontik patojen olabilece6ini düünmülerdir. Siqueira ve arkadalar 15 abse oluumundan sorumlu oldu6u düünülen Pseudoramibacter alactolyticusu 21 örnekte PCR metodu ile incelemi ve vakalarn %75 inde saptamlardr. Xia ve arkadalar 16, DNA bazl PCR kullanarak Prevotella tanneraenn kök kanallarnda yüksek prevalansta bulundu6una ilk dikkati çeken aratrmaclardr. Siyah pigmentli gram(-) anaerobik rodlar, a6r ve periapikal abselerle ilikili endodontik enfeksiyonlarn dominant karakterleridir. Bu mikroorganizmalar; Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens gibi türleri içermektedir Bunlar, ykc periodontal 62

3 hastalklarn da major patojenleridir 5,21,22. Ancak bu mikroorganizmalarn rutin kültür yöntemleriyle üretilmesi çok zor hatta kimi zaman mümkün olmamaktadr. PCR ile bu mikroorganizmalarn kök kanallarnda bilinenden daha fazla prevalansta bulunduklar gösterilmitir 17,23,24. PCR n, kültür yönteminden farkl olarak mikroorganizmalar ölü olarak da saptayabiliyor olmas bu yüksek prevalansn nedeni olabilir 7. Baarsz endodontik tedavi görmü ve periapikal lezyona sahip dilerde a6rlkl olarak bulunan mikroorganizma türü de6imektedir. Bogen ve arkadalar 17, kapal periapikal lezyonlu dilerdeki siyah pigmentli mikroorganizmalar incelemiler, P.endodontalis, P.intermedia ve P.nigrescensin hiç bir örnekte bulunmad6, yalnzca bir örnekte P.gingivalisin bulundu6unu ifade etmilerdir. Siqueira ve arkadalar 18, 22 adet tekrarlayan tedavi gerektiren vakada, %77 orannda Enterococcus faecalise rastlamlardr. Bunu Pseudoramibacter alactolyticus ve Propionibacterium propionicum izlemektedir. Primer endodontik enfeksiyonlarda mantar türlerine çok seyrek rastlanrken, baarsz endodontik tedavili dilerde C.albicansa %18 orannda rastlanlmaktadr 18. Tekrarlayan tedavi vakalarnda daha önce varl6 kesinletirilmemi olan Pseudoramibacter alactolyticus, Propionibacterium propionicum, Dialister pneumosintes ve Fusobacterium alocis de örneklerin yarsnda saptanmtr 18. b) Virulans Faktörleri PCR n endodontik mikrobiyolojide kullanlmas ile endodontik enfeksiyonlarla ilikili mikroorganizmalarn virulans genlerinin önemi daha iyi anlalmtr. Bu virulans faktörleri, endodontik mikroorganizmalarn pulpal ve periapikal patojenitesini arttrrken, vücudun di6er bölgelerinde de hasara neden olabilmektedir. Bate ve arkadalar 25, enfekte kök kanallarnda bulunan stafilokok ve streptokoklarn FnBp ve FgBp ad verilen virulans genlerini PCR ile saptamlardr. Bu genlere sahip olan bu bakterilerin enfektif endokardite neden olabilece6ini bildirmilerdir. Odell ve arkadalar 8, P.gingivalis ve P.endodontalisi kollajenaz geni açsndan incelemek için PCR kullanmlar ve P.gingivalis türlerinin büyük ço6unlu6unun ykc periapikal lezyon geliimine katkda bulunan kollajenaz genine sahip oldu6unu saptamlardr. Norris ve arkadalar 26, periodontal hasarl kedilerde yaptklar bir çalmada Porphyromonas gingivalisin iki rekombinant proteinaz geni arasndaki ilikiyi PCR kullanarak incelemilerdir. Dupre ve arkadalar 27, Creti ve arkadalar 28 Enterococcus faecalisin antibiyotiklere direnç mekanizmas, epitel hücrelerine tutunma, biyofilm oluturma potansiyeli ile çeitli virulans genleri arasndaki ilikiyi incelemilerdir. Chi Yuan Hang ve arkadalar 29 F.nucleatum, P.endodontalisin LPS geninin periapikal lezyonlardaki kemik rezorpsiyonundaki rolünü incelemilerdir. c) Enzim Ekspresyonu ve Periradiküler Y6k6m Spesifik baz bakteri türleri ve ürünleri, inflamasyon basamaklarnda mediatör olarak görev yapan baz enzimlerin ekspresyonunu belirgin ekilde arttrmaktadr. Bu olay organizmada doku ykmna yol açmaktadr. Yu-Chao Chang ve arkadalar 30, özellikle siyah pigmentli bakteri ürünlerinin COX-2 ad verilen mediatör enzim ekspresyonunu arttrd6n PCR yöntemi ile saptamlardr. COX-2 bir baka enflamasyon mediatörü olan prostoglandin E-2 sentezini düzenlemektedir. Yaptklar çalmann sonunda P.endodontalisin, P.gingivalis ve P.intermedia ya göre daha potansiyel bir COX-2 indüktörü oldu6unu bildirmilerdir. Yang ve arkadalar 31-32, siyah pigmentli bakteroidlerin yan ürünlerinin interlökin-6 ve interlökin-8 geninin ekspresyonunu arttrd6n göstermilerdir. Böylece periradiküler ykm hzlanmaktadr. Yang ve arkadalar 20, siyah pigmentli bakteri yan ürünlerinin VEGF geninin ekspresyonunun artmasna ve bu ekilde pulpal ve perirapikal hasara neden olabileceklerine dikkati çekmilerdir. Kök kanallarnda bulunan siyah pigmentli mikroorganizmalarn yan ürünlerinin konak dokudaki matrix metalloproteinazlarn (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8) salglanmasn arttrarak da ykma yol açtklar gösterilmitir d) Virüsler PCR ile yalnzca kök kanal sistemindeki bakteri türleri de6il, virüsler de aratrlabilmektedir. Heling ve arkadalar 36, enfekte kök kanallar ve periapikal lezyonlarda Herpes Simplex Virüsünü PCR ile incelemiler, bu virüsün potansiyel bir endodontik patojen olamayaca6n bildirmilerdir. Bu virüsün AIDS li insanlarn periapikal dokularnda bulunmad6 düünülse de Glick ve arka- 63

4 dalar 37 PCR ile yaptklar çalmada, bu bölgedeki fibroblastlarn bu virüsü barndrd6 ve HIV için rezervuar olabilece6ini bildirmilerdir. Elkins ve arkadalar 38 seropozitif hastalarn perirapikal lezyonlarndan aldklar örneklerde HIV virüsünün varl6n saptamlardr. Sabeti ve arkadalar 39 periapikal lezyonlardan aldklar örneklerde Cytomegalovirus ve Epstein Barr Virüslerinin varl6n PCR kullanarak aratrmlardr. Geni çapl periapikal lezyonlarn % 79.2 inde bu iki virüs de saptanrken, küçük çapl lezyonlarn %10 unda virüslerden herhangi birine rastlanmtr. SONUÇ PCR kullanlarak yaplan bu çalmalarn birço6u kültür yöntemiyle de yaplabilmektedir. Ancak PCR n tp ve dihekimli6ine girmesi ile mikrobiyolojik çalmalarn says önemli ölçüde artmtr. PCR ile herhangi bir organizmadan herhangi bir gen izole etmek mümkündür. Kültür yöntemlerine göre daha hzl, daha etkin ve daha kesin sonuçlar sa6layan bir yöntem oldu6u söylenebilir. PCR sayesinde endodontik mikroorganizmalarn ve davranlarnn daha iyi tannmas ile daha etkin tedavi yöntemlerinin gelitirilmesi sa6lanabilir. KAYNAKLAR 1. Sjögren U, Hanström L, Happonen RP, Sundqvist G. Extensive bone loss associated with periapical infection with Bacteroides gingivalis: a case report. Int Endod J 1990 Sep; 23(5): Oliveira JCM, Siqueira JF, Alves G, Hirata RJ, Andrade AFB. Detection of Porpyromonas endodontalis in infected root canals by 16S rrna gene-directed polymerase chain reaction. J Endod 2000; 26(12): Griffee MB, Patterson SS, Miller CH, Kafrawy AH, Newton CW. The relationship of Bacteroides melaninogenicus to symptoms associated with pulpal necrosis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1980; 50: Sundqvist G, Johansson E, Sjögren U. Prevalence of black-pigmented bacteroides species in root canal infections. J Endod 1989; 15: Yoshida M, Fukushima H, Yamamoto K, Ogawa T, Toda T, Sagawa H. Correlation between clinical symptoms and microorganisms isolated from root canals of teeth with periapical pathosis. J Endod 1987;13: Fouad AF, Barry J, Caimano M, Clawson M, Zhu Q, Carver R, Hazlett K, Radolf JD. PCR-based identification of bacteria associated with endodontic infections. J Clin Microbiol 2002; 40(9): Siqueira JF, Roças IN. PCR methodology as a valuable tool for identification of endodontic pathogens. J Dent 2003; 31(5): Odell LJ, Baumgartner JG, Xia T, David LL. Survey for collagenase gene prtc in Porphyromonas gingivalis and Porphyromonas endodontalis isolated from endodontic infections. J Endod 1999; 25(8): McPherson MJ, Moller SG. The Basics. New York: Cromwell Press ; 2000, Siqueira JF, Roças IN. Simultaneous detection of Dialister pneumosintes and Filifactor alocis in endodontic infections by 16Sr DNA-directed multiplex PCR. J Endod 2004; 30(12): Siqueira JF, Roças IN. Bacteroides forsytus in primary endodontic infections as detected by nested PCR. J Endod 2003; 29(6): Xia T, Baumgartner C. Occurence of Actinomyces in infections of endodontic origin. J Endod 2003; 29(9): Siqueira JF, Roças IN. Treponema socranskii in primary endodontic infections as detected by nested PCR. J Endod 2003; 29(4): Siqueira JF, Roças IN. Dialister pneumosintes can be a suspected endodontic pathogen. 2002; 94: Siqueira JK, Roças IN. Pseudoramibacter alactolyticus in primary endodontic infections. J Endod 2003; 29(11): Xia T, Baumgartner JC, David LL. Isolation and identification of Prevotella tannerae from endodontic infections. Oral Microbiol Immunol Aug; 15(4): Bogen G, Slots J. Black-pigmented anaerobic rods in closed periapical lesions. Int Endod J 1999; 32: Siqueira JF, Roças IN. Polymerase chain reactionbased analysis of microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2004; 97: Sorsa T, Ingman T, Suomalainen K, et al. Identification of proteases from periodontopathogenic bacteria as activators of latent human neutrophil and fibroblast-type interstitial collagenases. Infection and Immunity 1992 Nov; 60(11):

5 20. Yang LC, Tsai CH, Huang FM, et al. Induction of vascular endothelial growth factor expression in human pulp fibroblasts stimulated with blackpigmented Bacteroides. Int Endod J 2004; 37: Beikler T, Ehmke B, Wittstock M, Schmidt H, Karch H, Flemmig TF.Serum antibody reactivity against recombinant prtc of Porpyromonas gingivalis following periodontal theraphy. J Periodont Res 2003; 38: Kawada M, Yoshida A, Suzuki N, et al. Prevalence of Porpyromonas gingivalis in relation to periodontal status assessed by real-time PCR. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: Siqueira JF. Jr, Roças IN, Alves FR, Santos KR. Selected endodontic pathogens in the apical third of infected root canals: a molecular investigation. J Endod Sep; 30(9): Yung IY, Choi B, Kum KY, et al. Identification of oral spirochetes at the species level and their association with other bacteria in endodontic infections. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod Sep; 92(3): Bate AL, Ma JKC, Pitt Ford TR. Detection of bacterial virulence genes associated with infective endocarditis in infected root canals. Int Endod J 2000; 33: Norris JM, Love DN. The association of two recombinant proteinases of a feline strain of Porpyromonas gingivalis with periodontal disease in cats. Vet Microbiol 2000; 71: Dupre I, Zanetti S, Schito AM, Fadda G, Sechi LA. Incidence of virulence determinants in clinical Enterococcus faecalis isolates collected in Sardinia (Italy). J Med Microbiol 2003; 52: Creti R, Imperi M, Bertuccini L, et al. Survey for virulence determinants among Enterococcus faecalis isolated from different sources. J Med Microbiol 2004; 53: Hong CY, Lin SK, Kok SH, et al. The role of lipopolysaccharide in infectious bone resorption of periapical lesion. J Oral Pathol Med 2004; 33: Chang YC, Huang FM, Yang SF, et al. Induction of cyclooxygenase-2 mrna and protein expression in human pulp cells stimulated with blackpigmented bacteroides. J Endod 2003; 29(4): Yang LC, Tsai CH, Huang FM, Liu CM, Lai CC, Chang YC. Induction of interleukin-6 gene expression by pro-inflammatory cytokines and black-pigmented Bacteroides in human pulp cell cultures. Int Endod J 2003; 36: Yang LC, Huang FM, Lin CS, Liu CM, Lai CC, Chang YC. Induction of interleukin-8 gene expression by black-pigmented Bacteroides in human pulp fibroblasts and osteoblasts. Int Endod J 2003; 36: Nakata K, Yamasaki M, Iwata T, Suzuki K, Nakane A, Nakamura H. Anaerobic bacterial extracts influence production of matrix metalloproteinases and their inhibitors by human dental pulp cells. J Endod 2000; 26(7): Chang YC, Lai CC, Yang SF, Chan Y, Hsieh YS. Stimulation of matrix metalloproteinases by blackpigmented bacteroides in human pulp and periodontal ligament cell cultures. J Endod 2002; 28(2): Pattamapun K, Tiranathanagul S, Kuwatanasuchat J, Pavasant P. Activation of MMP-2 by Porpyromonas gingivalis in human periodontal ligament cells. J Periodontal Res 2003; 38: Heling I, Morag-Hezroni M, Marva E, Hochman N, Zakay-Rones Z, Morag A. Is herpes simplex virus associated with pulp/periapical inflammation? Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod Mar; 91(3): Glick M, Trope M, Bagasra O, Pliskin ME. Human immunodeficiency virus infection of fibroblasts of dental pulp in seropositive patients. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Jun; 71(6): Elkins DA, Torabinejad M, Schmidt RE, Rossi JJ, Kettering JD. Polymerase chain reaction detection of human immunodeficiency virus DNA in human periradicular lesions. J Endod Aug; 20(8): Sabeti M, Slots J. Herpesviral-bacterial coinfection in periapical pathosis. J Endod 2004; 30(2): Özgür lke Atasoy ULUSOY- Gazi Üniversitesi Di Hekimli6i Fakültesi Di Hastalklar ve Tedavisi Anabilim Dal 8. Cadde 82. Sokak Emek/ ANKARA Tel: / ilkeatasoy@yahoo.com Fax: