4. PowerPlex ESX 17 Sistemini Kullanarak DNA Amplifikasyonu için Protokoller

Transkript

1 4. PowerPlex ESX 17 Sistemini Kullanarak DNA Amplifikasyonu için Protokoller Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Malzemeler GeneAmp PCR Sistemi 9700 veya 2720 thermal cycler (Applied Biosystems) mikrosantrifüj 0,2ml MicroAmp reaksiyon tüpleri veya MicroAmp optik 96 kuyulu reaksiyon plakası (Applied Biosystems) 1,5ml mikrosantrifüj tüpleri filtreli pipet uçları (bkz Bölüm 9.F) 0,5ng örnek DNA yı 25µl reaksiyon hacminde aşağıdaki protokolü rutin olarak kullanarak amplifiye ediyoruz. The PowerPlex ESX 17 Sistemi GeneAmp PCR Sistemi 9700 thermal cycler ı için optimize edilmiştir. GeneAmp PCR Sistemleri 2720 thermal cycler için bir amplifikasyon protokolü sunulmuştur. 4.A. Amplifikasyon Düzeni Çapraz kontaminasyonu önlemek için eldiven ve aerosole dayanıklı pipet uçlarının kullanılması tavsiye edilir. Tüm amplifikasyon öncesi ve amplifikasyon sonrası reaktiflerini ayrı odalarda tutun. Amplifikasyon reaksiyonlarını reaksiyon düzeni için ayrılmış bir odada hazırlayın. Amplifikasyon düzeni için ayrılmış ekipmanı ve malzemeleri kullanın. 9947A DNA'sının konsantrasyonu, absorbansın 260 nm'de ölçülmesiyle belirlenmektedir. Bu kontrol DNA'sının miktarının, qpcr gibi başka yöntemlerle belirlenmesi, farklı bir değerle sonuçlanabilir. Her amplifikasyon seti için yeni seyreltilmiş DNA hazırlayın. Seyreltilmiş DNA yı (örn. 0,25 ng/µl veya daha az) saklamayın. Hücre hattından türevlenen 9947A DNA sı allelik dengesizlik ve STR lokusları arasında dengesizlik gösterecektir. Duyarlılık testi için hücre hattından türevlenen DNA kullanmayın. Duyarlılık çalışmaları için kullanılacak DNA ları kullanımdan önce bir gece 4 C de saklayın.! Başarılı bir amplifikasyon için çok titiz olunmalıdır. Bölüm 7.A da amplifikasyon sorun giderme kılavuzu bulunmaktadır. 1. PowerPlex ESX 5X Master Miksini, PowerPlex ESX 17 10X Primer Çifti Miksini, 9947A DNA yı ve Amplifikasyon Saflığındaki Suyu tamamen eritin. Not: İçeriği dipte toplamak için tüpleri kısaca santrifüj edin, ardından reaktifleri kullanmadan önce 15 saniye vorteksleyin. 10X Primer Çifti miksini ilk santrifüjlemeden sonra santrifüjlemeyin çünkü bu, primerlerin tüpün dibinde toplanmasına neden olabilir. 2. Düzenlenecek reaksiyon sayısını belirleyin. Bu sayı, pozitif ve negatif reaksiyonları da içermelidir. Pipetleme hatalarını bertaraf etmek için bu sayıya 1 veya 2 ekleyin. Bu yaklaşımda her reaktiften az miktarda tüketilse de tüm örnekler için yeterli miktarda PCR amplifikasyon miksi sağlanır. Aynı zamanda her reaksiyonun aynı miktarda PCR amplifikasyon miksi içermesi de sağlanır. Sayfa 2

2 3. Temiz bir 0,2ml reaksiyon tüpünü rack e yerleştirin ve uygun olarak etiketleyin. Alternatif olarak, bir MicroAmp plakası kullanın ve uygun olarak etiketleyin. 4. Her reaktifin Tablo 1 de listelenen son hacmini steril bir 1,5ml tübe ekleyin. Tablo 1 reaksiyon başına düşen bileşen hacimlerini gösterir. Gerekli olan her bir PCR amplifikasyon miksi bileşeni miktarını hesaplamak için Bölüm 9.D de bir çalışma sayfası sunulmuştur (Tablo 5). Tablo 1. PowerPlex ESX 17 Sistemi için PCR Amplifikasyon Miksi. PCR Amplifikasyon Miks Bileşeni 1 Amplifikasyon Saflığında Su PowerPlex ESX 5X Master Miksi PowerPlex ESX 17 10X Primer Çifti Miksi Reaksiyon Başına Hacim son hacim 25,0µl olacak kadar 5,0µl 2,5µl örnek DNA (0,5ng) 2,3 17,5µl ye kadar toplam reaksiyon hacmi 25µl 1 Amplifikasyon saflığındaki suyu ilk tüpe ekleyin ve sonra PowerPlex ESX 5X Master Miksi ve PowerPlex ESX 17 10X Primer Çifti Miksini ekleyin. Örnek DNA Adım 6 da eklenecektir. 2 DNA örneklerini nükleaz içermeyen suda veya TE -4 tamponunda (10mM Tris-HCl [ph 8,0], 0,1mM EDTA) saklayın. DNA örnekleri ph 8,0 olmayan bir tamponda saklanırsa veya daha yüksek EDTA konsantrasyonları içerirse eklenen DNA nın hacmi son reaksiyon hacminin %20 sini geçmemelidir. PCR amplifikasyon etkinliği ve kalitesi; (eklenen Tris-HCl ye bağlı olarak) ph daki değişiklikler, (EDTA nın çelatlamasına bağlı olarak) mevcut olan magnezyum konsantrasyonu veya örnek DNA nın kaynağına ya da kullanılan ekstraksiyon prosedürüne bağlı olarak düşük konsantrasyonlarda mevcut bulunabilecek diğer PCR inhibitörleri nedeniyle değişebilir. 3 DNA miktar tayini yöntemine bağlı olarak bariz DNA konsantrasyonları farklılık gösterebilir (13). Burada önerilen DNA şablonu miktarı, absorbansın 260 nm'de ölçülmesiyle belirlenen DNA konsantrasyonlarını temel almaktadır. DNA miktar tayini yönteminizle optimal DNA miktarını belirlemek için deneyler yapmanızı tavsiye ederiz. 5. PCR amplifikasyon miksini 5-10 saniye vorteksleyin ve daha sonra PCR amplifikasyon miksini her reaksiyon tüpüne pipetleyin. PCR amplifikasyon miksini vortekslemedeki başarısızlık kötü bir! amplifikasyona veya lokuslar arası dengesizliğe neden olabilir. 6. Her örnek için örnek DNA yı (0,5ng) PCR amplifikasyon miksini içeren ilgili tüpe pipetleyin. 7. Pozitif amplifikasyon kontrolü için, 9947A DNA sını istenen örnek DNA hacminde 1,0ng a seyreltin. Seyreltilmiş 1,0ng DNA yı PCR amplifikasyon miksini içeren reaksiyon tüpüne pipetleyin. 8. Negatif amplifikasyon kontrolü için, Amplifikasyon Saflığındaki suyu (örnek DNA yerine) PCR amplifikasyon miksini içeren reaksiyon tüpüne pipetleyin. Sayfa 3

3 4.B. Amplifikasyon Termal Döngüsü Bu kılavuz, PowerPlex ESX 17 Sisteminin GeneAmp PCR sistemi 9700 ve 2720 thermal cycler ları ile kullanım protokollerini içerir. Amplifikasyon ve tespit enstrümantasyonu değişiklik gösterebilir. Her laboratuvar enstrümanı için döngü sayısı ve enjeksiyon süresi de dahil olmak üzere protokolleri optimize etmeniz gerekebilir. Promega Corporation daki testler, 0,5 ng saflaştırılmış DNA örnekleri için 30 döngünün iyi çalıştığını göstermektedir. 1. Tüpleri veya MicroAmp plakayı thermal cycler a yerleştirin. 2. Tavsiye edilen protokolü seçin ve çalıştırın. GeneAmp PCR Sistemi 9700 ve 2720 thermal cycler ları ile kullanım için tercih edilen protokol aşağıda sunulmaktadır. Termal Döngü Protokolü 1 96 C de 2 dakika, sonra: 94 C de 30 saniye 59 C de 2 dakika 72 C de 90 saniye 30 döngü, sonra: 60 C de 45 dakika 4 C ye batırın 1GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler kullanıldığında program, ramp hızı 9600 de çalıştırılmalıdır. Ramp hızı termal döngü çalıştırılması başlatıldıktan sonra ayarlanır. Yöntem Seçeneklerini Seçin ekranı görünür. Rampa hızı olarak 9600 ü seçin ve reaksiyon hacmini girin. 3. Termal döngü protokolünün tamamlanmasından sonra örnekleri ışıktan korunan bir kutuda 20 C de saklayın. Not: Amplifiye edilen örnekleri 4 C de veya daha yüksek sıcaklıklarda uzun süre saklamak degradasyon ürünlerine yol açabilir. Sayfa 4

4 5. Enstrüman Düzeni ve Örnek Hazırlanması 5.A. Amplifiye Edilen Fragmentlerin Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers Kullanımı ile Tespiti!! Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Malzemeler 95 C kuru ısı bloğu, su banyosu veya thermal cycler parçalanmış buz veya buz-su banyosu 96 kuyulu plakalarla uyumlu santrifüj aerosole dayanıklı pipet uçları 3500/3500xL kapiller dizi, 36 cm 96-kuyulu tutucu & taban seti (standart) (Applied Biosystems Cat.# ) Applied Biosystems 3500 veya 3500xL için bir torbada POP-4 polimeri Genetic Analyzer anot tampon konteyneri katot tampon konteyneri Applied Biosystems 3500 veya 3500xL için koşullandırıcı reaktif torbası Genetic Analyzer MicroAmp optik 96 kuyulu plaka (veya dengi) ve septa Hi-Di formamid (Applied Biosystems Cat.# ) PowerPlex 5-Boya Matriks Standartları, 3100/3130 (Cat.# DG4700) Formamidin kalitesi son derece önemlidir. Hi-Di formamid kullanın. Formamidi alikuotlayarak 20 C de saklayın. Çok sayıda dondurma-çözme döngüsü veya 4 C de uzun süreli saklama formamidin parçalanmasına neden olabilir. Kötü kalitede formamid enjeksiyon sırasında DNA ile rekabet edecek iyonlar içerebilir, bu ise piklerin daha alçak olmalarına ve daha az duyarlılığa yol açar. Daha uzun enjeksiyon süresi sinyali yükseltmeyebilir. Formamid tahriş edici ve teratojendir; solumayın ve deri ile temas ettirmeyin. Uyarı etiketini okuyun ve bu maddeyi kullanırken gerekli önlemleri alın. Formamid ile çalışırken daima eldiven ve emniyet gözlüğü takın. Örnek Hazırlanması 1. CC5 Internal Lane Standard 500 ve Hi-Di formamidi aşağıdaki şekilde kombine edip karıştırarak bir yükleme kokteyli elde edin: [(1,0μl CC5 ILS 500) (enjeksiyon sayısı)] + [(10,0μl Hi-Di formamid) (enjeksiyon sayısı)] Not: Yükleme kokteylinde kullanılan dahili şerit standardının hacmi, boyut standart piklerinin yoğunluğunu ayarlamak için iki katına çıkarılabilir. Formamidin hacmini 10,0µl olarak koruyun ve Adım 3 te kuyulara eklenen hacmi buna uygun olarak ayarlayın. 2. Karıştırmak için saniye vorteksleyin. 3. Formamid/dahili şerit standardı karışımından her kuyuya 11µl pipetleyin. Sayfa 5

5 5.A. Amplifiye Edilen Fragmentlerin Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers Kullanımı ile Tespiti (devamı) 4. Amplifiye edilen örnekten (veya 1μl allelik ladder miksinden) 1µl ekleyin. Uygun septa ile kuyuları kaplayın. Not: Enstrüman tespit sınırları değişkendir; bu nedenle enjeksiyon süresinin, enjeksiyon voltajının veya yükleme kokteyli ile karıştırılan ürün miktarının artırılması veya azaltılması gerekebilir. Enjeksiyon süresini veya çalışma modülünde voltajı ayarlamak için veri toplama yazılımındaki Kütüphane menüsünden "Instrument Protocol"ü seçin. Pik yükseklikler istenilenden fazlaysa, istenilen sinyal yoğunluğuna ulaşmak için amplifikasyon reaksiyonlarında daha az DNA şablonu kullanın ve amplifikasyon programındaki döngü sayısını, 2-4 döngü azaltın. 5. Kuyulardaki baloncuklardan kurtulmak için plakayı santrifüj edin. 6. Örnekleri 95 C de 3 dakika denature edin ve hemen kırılmış buzda veya buz su banyosunda 3 dakika süresince soğutun. Örnekleri enstrümana yüklemeden hemen önce denature edin. Sayfa 6

6 Enstrümanın Hazırlanması Kapiller dizini, tamponlar ve polimer torbasını kurmak ve boyutsal kalibrasyon yapmak için Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer Kullanım Kılavuzuna bakın. Örnekler, Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer Kullanım Kılavuzunda anlatıldığı şekilde analiz edilebilir Data Collection Software'ia çın. Gösterge tablosu ekranı açılır (Şekil 2). Sarf malzemesi ve Bakım Bildirimlerinin kabul edilebilir olduğundan emin olun. Fırın sıcaklığını 60 C olarak ayarlayın ve fırını ısıtmak için ilk enjeksiyondan en az 30 dakika önce "Start Pre-Heat"i seçin. 9247TA Şekil 2. Gösterge Tablosu. Sayfa 7

7 5.A. Amplifiye Edilen Fragmentlerin Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers Kullanımı ile Tespiti (devamı) 2. Yeni bir Enstrüman Protokolü oluşturmak için Kütüphaneye gidin ve "Instrument Protocol"ü ve sonra da "Create"i seçin. Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş bir Enstrüman Protokolü de kullanılabilir. Şekil 3, uygulama türü, boya seti, kapiller uzunluğu, polimer, çalıştırma modülü ve uygun protokol bilgisi için Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer için Promega'da kullanılan ayarları göstermektedir. Varsayılan ayardan değiştirilen tek ayar boya setidir. Bir Enstrüman Protokolü oluştururken, Promega 5 spektral kalibrasyon için kullanılan aynı boya setini seçin saniye çalıştırma zamanı ve varsayılan enjeksiyon koşullarını kullanmanızı öneririz.! Çalıştırma zamanı ve diğer enstrüman ayarları, laboratuarınızda optimize edilmeli ve doğrulanmalıdır. Açıklayıcı bir protokol adı atayın. Not: Daha fazla bilgi için Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers Kullanım Kılavuzu'na bakın. 9393TA Şekil 3. Yeni Enstrüman Protokolü penceresi oluşturma Sayfa 8

8 3. QC protokolü için yeni bir Boyut Standardı oluşturmak için Kütüphaneye gidin. "Size Standards" ve "Create"i seçin. Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş bir Boyut Standardı da kullanılabilir. Boyut Standardına PPlex_ILS500 veya başka bir uygun ad atayın. Boya Rengi olarak "Orange"ı seçin. Dahili şerit standardı fragmentlerinin boyutları 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ve 500 bazdır. Bkz. Şekil TA Şekil 4. Yeni Boyut Standardı penceresi oluşturma. Sayfa 9

9 5.A. Amplifiye Edilen Fragmentlerin Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers Kullanımı ile Tespiti (devamı) 4. Yeni bir QC Protokolü oluşturmak için, Kütüphaneye gidin. "QC Protocols" ve "Create"i seçin. Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş bir QC Protokolü de kullanılabilir. Açıklayıcı bir protokol adı atayın. Adım 3'te oluşturulan boyut standardını seçin. QC protokolünün ayarları, Applied Biosystems 3500 veya 3500xL Genetic Analyzer'daki PowerPlex ESX 17 System'ın içsel olarak doğrulanmış koşullarını temel almalıdır. Şekil 5, bu ayarlar için bir seçeneği göstermektedir. 9228TA Şekil 5. Yeni QC Protokolü penceresi oluşturma. Sayfa 10

10 5. Yeni bir Analiz oluşturmak için, Kütüphaneye gidin. "Assays" ve "Create"i seçin. Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş bir Analiz de kullanılabilir. Create New Assay penceresinde (Şekil 6), Adım 2'de oluşturulan enstrüman protokolünü ve Adım 4'te oluşturulan QC protokolünü seçin. Açıklayıcı bir analiz adı atayın. Uygulama türü "HID"ı seçin. Plakadaki adı verilen tüm örnekler için bir analiz gereklidir. 9229TA Şekil 6. Yeni Analiz penceresi oluşturma. Sayfa 11

11 5.A. Amplifiye Edilen Fragmentlerin Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers Kullanımı ile Tespiti (devamı) 6. Yeni Dosya Adı Konvansiyonu (Şekil 7) oluşturmak için Kütüphaneye gidin. "File Name Conventions" ve "Create"i seçin. Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş bir Dosya Adı Konvansiyonu da kullanılabilir. Laboratuar uygulamalarına göre Dosya Adı Niteliklerini seçin ve açıklayıcı bir adla kaydedin. 9252TA Şekil 7. Yeni Dosya Adı Konvansiyonu penceresi oluşturma.. Sayfa 12

12 7. Yeni Sonuç Grubu (Şekil 8) oluşturmak için Kütüphaneye gidin. "Results Group" ve "Create"i seçin. Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş Sonuç Grupları da kullanılabilir. Laboratuar uygulamalarına göre Sonuç Grubu Niteliklerini seçin ve açıklayıcı bir adla kaydedin. 8. Yeni Plaka oluşturmak için Kütüphaneye gidin ve Manage menüsünden, "Plates" ve "Create"i seçin. 9253TA Şekil 8. Yeni Sonuç Grubu penceresi oluşturma. Sayfa 13

13 5.A. Amplifiye Edilen Fragmentlerin Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers Kullanımı ile Tespiti (devamı) 9. Açıklayıcı bir plaka adı atayın. Açılır menüden plaka türü "HID"ı seçin (Şekil 9). Şekil 9. Plaka özelliklerini tanımlama. 10. "Assign Plate Contents"i seçin (Şekil 10). 11. Kuyulara örnek adlar atayın. 12. "Assays"in altında, ekranın sol alt köşesinde, Adım 5'te oluşturulan Analizi seçmek için Add from Library yi veya daha önce oluşturulmuş bir dosyayı seçin. Add to Plate düğmesine tıklayın ve pencereyi kapatın. 9255TA 9254TA Şekil 10. Plaka içeriklerini atama.. Sayfa 14

14 13. "File Name Convention"ın altında, Adım 6'da oluşturulan File Name Convention seçeneğini veya daha önce oluşturulmuş bir seçeneği seçmek için Add from Library seçeneğini kullanın. Add to Plate düğmesine tıklayın ve pencereyi kapatın. 14. "Results Groups"un altında, Adım 7'da oluşturulan Results Group seçeneğini veya daha önce oluşturulmuş bir seçeneği seçmek için Add from Library seçeneğini kullanın. Add to Plate düğmesine tıklayın ve pencereyi kapatın. 15. Örnek kuyuları vurgulayın ve bu örneklere ilişkin Assays, File Name Conventions ve Results Groups kutularını seçin. 16. "Link Plate for Run"ı seçin. 17. Load Plate penceresi görülecektir. "Yes"i seçin. 18. Run information penceresinde (Şekil 11), bir Run Name atayın. "Start Run"ı seçin (gösterilmemektedir). 9256TA Şekil 11. Bir çalıştırma adı atama. Sayfa 15

15 5.B. Amplifiye Edilen Fragmentlerin ABI PRISM 3100 veya 3100-Avant Veri Toplama Yazılımı ile Genetic Analyzer, Sürüm 2.0, ve Applied Biosystems 3130 veya 3130xl Veri Toplama Yazılımı ile Genetic Analyzer, Sürüm 3.0 Kullanımı ile Tespiti!! Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Malzemeler 95 C kuru ısı bloğu, su banyosu veya thermal cycler parçalanmış buz veya buz-su banyosu 96 kuyulu plakalarla uyumlu santrifüj aerosole dayanıklı pipet uçları 3100 veya 3130 kapiller dizi, 36cm 3100 veya 3130 için performansı optimize edilmiş polimer 4 (POP-4 ) EDTA içeren 10X genetic analyzer tamponu MicroAmp optik 96 kuyulu plaka ve septa Hi-Di formamid (Applied Biosystems Kat.# ) PowerPlex 5-Boya Matriks Standartları, 3100/3130 (Kat.# DG4700) Formamidin niteliği son derece önemlidir. Hi-Di formamid kullanın. Formamidi alikuotlayarak 20 C de saklayın. Çok sayıda dondurma-çözme döngüsü veya 4 C de uzun süreli saklama formamidin parçalanmasına neden olabilir. Kötü kalitede formamid enjeksiyon sırasında DNA ile rekabet edecek iyonlar içerebilir, bu ise piklerin daha alçak olmalarına ve daha az duyarlılığa yol açar. Daha uzun enjeksiyon süresi sinyali yükseltmeyebilir. Formamid tahriş edici ve teratojendir; solumayın ve deri ile temas ettirmeyin. Uyarı etiketini okuyun ve bu maddeyi kullanırken gerekli önlemleri alın. Formamid ile çalışırken daima eldiven ve emniyet gözlüğü takın. Örnek Hazırlanması 1. CC5 Internal Lane Standard (Dahili Şerit Standardı) 500 ve Hi-Di formamidi aşağıdaki şekilde kombine edip karıştırarak bir yükleme kokteyli elde edin: [(1,0µl CC5 ILS 500) (enjeksiyon sayısı)] + [(10,0µl Hi-Di formamid) (enjeksiyon sayısı)] Not: Yükleme kokteylinde kullanılan dahili şerit standardının hacmi, boyut standart piklerinin yoğunluğunu ayarlamak için iki katına çıkarılabilir. Formamidin hacmini 10,0µl olarak koruyun ve Adım 3 te kuyulara eklenen hacmi buna uygun olarak ayarlayın. 2. Karıştırmak için saniye vortekleyin. 3. Formamid/dahili şerit standardı karışımından her kuyuya 11µl pipetleyin. 4. Amplifiye edilen örnekten (veya PowerPlex ESX 17 Allelik Ladder Miksinden) 1µl ekleyin. Uygun septa ile kuyuları kaplayın. Not: Enstrüman tespit sınırları değişkendir; bu nedenle enjeksiyon süresinin, enjeksiyon voltajının veya yükleme kokteyli ile karıştırılan ürün miktarının ayarlanması gerekebilir. Enjeksiyon süresini veya çalışma modülünde voltajı ayarlamak için veri toplama yazılımındaki Module Manager'ı kullanın (bkz. Enstrümanın Hazırlanması).. Sayfa 16

16 5. Gerekirse kuyulardaki baloncuklardan kurtulmak için plakayı santrifüj edin. 6. Örnekleri 95 C de 3 dakika denature edin, ve hemen kırılmış buzda veya buz su banyosunda 3 dakika süresince soğutun. Örnekleri enstrümana yüklemeden hemen önce denature edin. Enstrümanın Hazırlanması Temizlik, kapiller dizinin kurulumu, boyutsal kalibrasyon yapma ve polimer ekleme ile ilgili talimatlar için enstrümanın kullanım kılavuzuna bakın. Aşağıdaki istisnalar dışında örnekleri; ABI PRISM 3100 veya 3100-Avant veri toplama yazılımı ile Genetic Analyzer, sürüm 2.0, ve Applied Biosystems 3130 veya 3130xl veri toplama yazılımı ile Genetic Analyzer, sürüm 3.0, kullanım kılavuzunda açıklandığı şekilde analiz edin. 1. Modül Yönetici de New i (Yeni) seçin. Tip açılan listesinde Regular ı (Düzenli) seçin ve Kalıp açılan listesinde HIDFragmentAnalysis36_POP4 ü seçin. Enjeksiyon süresinin 5 saniye, enjeksiyon voltajının 3kV ve çalışma süresinin 1500 saniye olduğunu onaylayın. Çalışma modülünüze açıklayıcı bir isim verin ve OK i seçin. Not: Enstrüman duyarlılıkları değişiklik gösterebilir. Enjeksiyon süresi ve voltajı Modül Yönetici ile ayarlanabilir. Tavsiye edilen enjeksiyon süresi 3-22 saniyedir ve enjeksiyon voltajı 1-3 kv dır. 2. Protokol Yöneticisi nde New i (Yeni) seçin. Protokolünüz için bir isim yazın. Tip açılan listesinde Regular ı (Düzenli) seçin ve Çalışma Modülü açılan listesinde bir adım önce oluşturduğunuz çalışma modülünü seçin. Son olarak boya seti açılan listesinde G5 i seçin. OK i seçin. 3. Plaka Yönetici de, enstrüman kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi yeni bir plaka kaydı oluşturun. Çıkan mesaj kutusunda, Uygulama açılan listesinden GeneMapper Generic i seçin ve uygun plaka tipini seçin (96 kuyulu). Sahip ve operatör pencerelerinde girişleri yapın ve OK i seçin. Not: Eğer örnek verisinin otomatik analizi isteniyorsa talimatlar için enstrümanın kullanım kılavuzuna bakın. 4. GeneMapper plaka kaydında uygun olan hücrelere örnek isimlerini girin. Sağa geçin. Sonuç grubu 1 sütünunda istenen sonuç grubunu seçin. Enstrüman Protokol 1 sütununda, Adım 2 de oluşturduğunuz protokolü seçin. Bu bilginin, örnek ismi içeren tüm satırlar için mevcut olduğundan emin olun. OK i seçin. Not: Yeni bir sonuç grubu oluşturmak için sonuç grup sütununda açılan menüden New i (Yeni) seçin. General Tab seçin ve bir isim girin. Analiz sekmesini seçin ve Analiz açılan listesinden GeneMapper Generic i seçin. 5. Örnekleri enstrümana yerleştirin ve enstrüman kapaklarını kapatın. Sayfa 17

17 5.B. Amplifiye Edilen Fragmentlerin ABI PRISM 3100 veya 3100-Avant Veri Toplama Yazılımı ile Genetic Analyzer, Sürüm 2.0, ve Applied Biosystems 3130 veya 3130xl Veri Toplama Yazılımı ile Genetic Analyzer, Sürüm 3.0 Kullanımı ile Tespiti (devamı) 6. Spektral göstergede G5 boya setini seçin ve aktif olan boya setinin PowerPlex 5-boya kimyası için oluşturulan dosya olduğunu teyit edin. PowerPlex 5-boya kimyası için doğru G5 spektrali seçmek çok önemlidir.! Eğer PowerPlex 5-boya kimyası aktif olan boya seti değilse, PowerPlex 5-boya spektralini Boya Seti G5 için Kalibrasyon Listesinde konumlandırın ve Set i (Ayarla) seçin. 7. Adım 3 ve 4 te oluşturduğunuz plaka kaydını çalışma çizelgesinde konumlandırın ve vurgulamak için ismin üzerine bir kere tıklayın. 8. Plaka kaydı vurgulandıktan sonra amplifiye olan örneklerinizi içeren otomatik örnekleyicideki plakaya karşılık gelen plaka grafiğine tıklayın. 9. Plaka kaydı plakaya bağlandığında, plaka grafiği sarıdan yeşile dönecek ve yeşil renkteki Enstrümanı Çalıştır oku etkinleşecektir. 10. Örnek çalışmasını başlatmak için yeşil renkteki Enstrümanı Çalıştır okuna tıklayın. 11. Elektroforezi; veri toplama yazılımındaki çalıştır, görüntüle, dizi veya kapiller gösterge penceresini gözlemleyerek takip edin.. Her enjeksiyon yaklaşık olarak 40 dakika sürecektir. 5.C. Amplifiye Edilen Fragmentlerin ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Kullanımı ile Tespiti!! Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Malzemeler 95 C kuru ısı bloğu, su banyosu veya thermal cycler parçalanmış buz veya buz-su banyosu 310 kapiller, 47cm 50µm performası optimize edilmiş polimer 4 (POP-4 ) EDTA içeren 10X genetic analyzer tamponu örnek tüpleri ve septa filtreli pipet uçları Hi-Di formamid (Applied Biosystems Kat.# ) PowerPlex 5-Boya Matriks Standartları, 310 (Kat.# DG4600) Formamidin niteliği son derece önemlidir. Hi-Di formamid kullanın. Formamidi eşit parçalar halinde 20 C de saklayın. Çok sayıda dondurma-çözme döngüsü veya 4 C de uzun süreli saklama formamidin parçalanmasına neden olabilir. Kötü kalitede formamid enjeksiyon sırasında DNA ile rekabet edecek iyonlar içerebilir, bu ise piklerin daha alçak olmalarına ve daha az duyarlılığa yol açar. Daha uzun enjeksiyon süresi sinyali yükseltmeyebilir. Formamid tahriş edici ve teratojendir; solumayın ve deri ile temas ettirmeyin. Uyarı etiketini okuyun ve bu maddeyi kullanırken gerekli önlemleri alın. Formamid ile çalışırken daima eldiven ve emniyet gözlüğü takın.. Sayfa 18

18 Örnek Hazırlanması 1. CC5 Internal Lane Standard (Dahili Şerit Standardı) 500 ve Hi-Di formamidi aşağıdaki şekilde kombine ederek bir yükleme kokteyli elde edin: [(1,0µl CC5 ILS 500) (enjeksiyon sayısı)] + [(24,0µl Hi-Di formamid) (enjeksiyon sayısı)] Not: Yükleme kokteylinde kullanılan dahili şerit standardının hacmi, boyut standart piklerinin yoğunluğunu ayarlamak için iki katına çıkarılabilir. Eğer pik yükseklikleri çok fazla ise yükleme kokteylinin 0,5µl CC5 ILS 500 ve 24,5µl Hi-Di formamid içerecek şekilde değiştirilmesini tavsiye ederiz. 2. Karıştırmak için saniye vortekleyin. 3. Hazırlanan yükleme kokteylinden 25,0µl yi ve amplifiye edilen örnekten 1,0µl yi (veya PowerPlex ESX 17 Allelik Ladder Miksinden 1µl yi) kombine edin. Not: Enstrüman tespit sınırları değişkendir; bu nedenle enjeksiyon süresinin, enjeksiyon voltajının veya yükleme kokteyli ile karıştırılan ürün miktarının artırılması veya azaltılması gerekebilir. Enjeksiyon süresini veya çalışma modülünde voltajı ayarlamak için veri toplama yazılımındaki Module Manager ı kullanın (bkz. Enstrümanın Hazırlanması). 4. Gerekirse kuyulardaki baloncuklardan kurtulmak için tüpleri santrifüj edin. 5. Örnekleri ve ladderi 95 C de 3 dakika denature edin ve hemen kırılmış buzda veya buz-su banyosunda 3 dakika süresince soğutun. Örnekleri yüklemeden hemen önce denature edin. 6. Tüpleri uygun otomatik örnekleyici tablasına takın. 7. Otomatik örnekleyici tablasını enstrümana yerleştirin ve enstrüman kapaklarını kapatın. Enstrümanın Hazırlanması Pompa blokunun temizlenmesi, kapillerin kurulması, otomatik örnekleyicinin kalibre edilmesi ve şırıngaya polimer eklenmesi ile ilgili talimatlar için kullanım kılavuzuna bakın. 1. ABI PRISM 310 veri toplama yazılımını açın. 2. Bir GeneScan örnek sayfasını ABI PRISM 310 Genetic Analyzer kullanım kılavuzunda açıklandığı şekilde hazırlayın. Uygun örnek bilgisini Örnek Bilgisi sütununa girin. PowerPlex ESX 17 Allelik Ladder Miksi içeren satırlar için, Örnek Bilgisi sütununa fluorescein, JOE, TMR-ET, CXR-ET ve CC5 boyaları için ladder kelimesini girin. Verinizi PowerTyper ESX 17 Makro kullanarak analiz etmek için bu bilginin başarılı olarak girilmesi gereklidir. 3. Yeni bir GeneScan enjeksiyon listesi oluşturun. Uygun örneği, çekme menüyü kullanarak seçin. Sayfa 19

19 5.C. Amplifiye Edilen Fragmentlerin ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Kullanımı ile Tespiti (devamı) 4. Çekme menüyü kullanarak GS STR POP4 (1ml) G5 Modülünü seçin. Enjeksiyon süresini 3 saniye ve çalışma süresini 28 dakika olarak değiştirin. Geri kalan parametreler için ayarları aşağıdaki şekilde koruyun:! Enj. Sn: 3 Enj. kv: 15,0 Çalışma kv: 15,0 Çalışma C: 60 Çalışma Süresi: 28 Enjeksiyon süresini her enstrüman için optimize etmeniz gerekebilir. 2 5 saniyelik enjeksiyon süreleri 0,5ng örnek DNA içeren örnekler için önerilir. Not: Fragmentlerin hareketi uzun süreli ABI PRISM 310 Genetic Analyzer çalışması sırasında hafif olarak değişiklik gösterebilir. Bu, sıcaklıktaki değişikliklere veya kolondaki değişikliklere bağlı olabilir. Çok sayıda örnek analiz edilirken çalışma sırasında farklı zamanlarda allelik ladder enjeksiyonu, örneklerin doğru olarak genotiplenmesine yardımcı olabilir. 6. Veri Analizi 5. Uygun matriks dosyasını seçin. 6. Veriyi otomatik olarak analiz etmek için, otomatik analiz onay kutusunu uygun analiz parametrelerini ve boyut standardını seçin. Bu seçeneklerle ilgili özel bilgi için ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Kullanım Kılavuzuna bakın. 7. Örnek tablasını yükledikten ve kapakları kapattıktan sonra, kapiller elektroforez sistemini başlatmak için Run ı (Çalıştır) seçin. 8. Elektroforezi; işlenmemiş veriyi ve durum penceresini gözlemleyerek izleyin. Her örnek için şırınga pompalaması, örnek enjeksiyonu ve örnek elektroforezi yaklaşık 35 dakika sürecektir. 6.A. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 3.2 ile PowerPlex ESX Paneli, Bin ve Gölge Piki Setleri PowerPlex ESX 17 Sistemi ile oluşturulan verinin analizi için, GeneMapper ID-X yazılımını kullanarak genotiplerin otomatik atanmasını sağlayan panel ve bin dosyaları oluşturduk. Kendilerini, yazılımın düzgün şekilde çalıştırılmasıyla aşina hale getirmek için kullanıcıların, Applied Biosystems'den, GeneMapper ID-X yazılımıyla ilgili eğitim almalarını öneririz. Not: Burada belirtilen panel ve bin setleri, GeneMapper ID-X yazılımının daha eski sürümleriyle uyumludur. Başlarken 1. PowerPlex ESX 17 System için uygun panel, bin ve piki dosyalarını almak için aşağıdaki adrese gidin: Sayfa 20

20 2. İletişim bilgilerinizi girin ve GeneMapper ID-X i seçin. Submit i seçin. 3. X.x, panel ve bin dosyalarının en güncel sürümünü ifade edecek şekilde, PowerPlex_ESX_Panels_IDX_vX.x.txt, PowerPlex_ESX_Bins_IDX_vX.x.txt ve PowerPlex_ESX_Stutter_IDX_vX.x.txt dosyalarını, bilgisayarınızda bilinen bir konuma kaydedin. Panel ve Bin Dosyalarının Alınması 1. GeneMapper ID-X yazılımını açın. 2. Tools u ve sonra Panel Manager ı seçin. 3. Navigasyon bölmesinin sol üst kısımdaki Panel Yönetici ikonunu vurgulayın. 4. File ı ve sonra Import Panels i seçin. 5. Başlangıç Bölümünde indirilen panel dosyasına gidin. Dosyayı seçin ve sonra Import u seçin. 6. Navigasyon bölmesinde Adım 5 te aldığınız PowerPlex ESX klasörünü vurgulayın. 7. File ı ve sonra Import Bin Sets i seçin. 8. Başlangıç Bölümünde indirilen bin dosyasına gidin. Dosyayı seçin ve sonra Import u seçin. 9. Navigasyon bölmesinde Adım 5 te aldığınız PowerPlex ESX panelleri klasörünü vurgulayın. 10. File ı ve sonra Import Marker Stutter i seçin. Geçerli değerlerin üzerine yazmak isteyip istemediğinizi soran bir uyarı kutusu görülecektir. "Yes"i seçin. 11. Başlangıç Bölümünde indirilen piki dosyasına gidin. Dosyayı seçin ve sonra Import u seçin. 12. Panel Yönetici penceresinin alt kısmında OK i seçin. Bu, panel, bin ve piki dosyalarını kaydedecek ve pencereyi kapatacaktır. 6.B. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile bir Boyut Standardı Oluşturulması Bir boyut standardı oluştururken iki seçenek vardır. Bu protokolü veya Bölüm 6.C deki alternatif protokolü kullanın. 1. Tools u ve sonra GeneMapper ID-X Manager ı seçin. 2. Size Standard sekmesini seçin. 3. New u seçin. 4. Size Standard Editor penceresinde (Şekil 12) Security Group olarak GeneMapper ID-X Security Group u seçin. Bu, yazılımın tüm kullanıcılarına erişim sağlar. Diğer emniyet grupları kullanılabilir. 5. CC5_ILS_500_IDX gibi detaylı bir isim girin. Sayfa 21

21 6.B. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile bir Boyut Standardı Oluşturulması (devamı) 8257TA Şekil 12. GeneMapper ID-X Boyut Standardı Editörü. 6. Size Standard Dye için orange rengi seçin. 7. Dahili şerit standardı fragmentlerinin boyutlarını (60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ve 500 baz) girin. 8. OK i seçin.. Sayfa 22

22 6.C. CC5 ILS 500 IDX Boyut Standardının GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ye Alınması CC5_ILS_500_IDX.xml dosyası aşağıdaki adresten indirilebilir: CC5_ILS_500_IDX.xml dosyasını bilgisayarınızda bildiğiniz bir konuma kaydedin. 1. Tools u ve sonra GeneMapper ID-X Manager ı seçin. 2. Size Standard sekmesini seçin. 3. Import u seçin. 4. Bilgisayarınızda, CC5_ILS_500_IDX.xml dosyasının bulunduğu konuma gidin. 5. Dosyayı vurgulayın ve sonra Import u seçin. 6. Değişiklikleri kaydetmek ve GeneMapper ID-X Manager dan çıkmak için Done ı seçin. 6.D. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile Olgu Çalışma Analiz Yöntemi Oluşturulması Bu talimatlar GeneMapper ID-X yazılımında veri analizi yapmaya başlamak için bir kılavuz görevi görür. GeneMapper ID-X yazılımının kullanımı için kapsamlı bir kılavuz olma görevi yoktur. Kullanıcıların yazılımla ilgili eğitim için Applied Biosystems ile temasa geçmesini tavsiye ederiz. 1. Tools u ve sonra GeneMapper ID-X Manager ı seçin. 2. Analysis Methods sekmesini seçin. 3. New u seçin ve yeni bir analiz yöntemi mesaj kutusu açılacaktır. 4. Analysis Method Editor penceresinde Emniyet Grubu olarak GeneMapper ID-X Security Group u seçin. Bu, yazılımın tüm kullanıcılarına erişim sağlar. Diğer emniyet grupları kullanılabilir. 5. Analiz yöntemi için PowerPlexESX 17 gibi açıklayıcı bir isim girin. 6. Allele sekmesini (Şekil 13) seçin. 7. Bölüm 6.A.8'de alınan bin dosyasını seçin. 8. Use marker-specific stutter ratio if available kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Sayfa 23

23 6.D. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile Olgu Çalışma Analiz Yöntemi Oluşturulması (devamı) 9. PowerPlex ESX 17 Sistemi kullanırken gölge piklerinin düzgün filtrelemesi için Şekil 13 da gösterilen değerleri öneririz. Bu ayarları optimize etmeniz gerekebilir. Kurum içi validasyon gerçekleştirilmelidir. 8258TA Şekil 13. GeneMapper ID-X Alel sekmesi. Bölüm 6.A'da alınan bin dosyasını seçin. 10. Peak Detector sekmesini seçin. Şekil 14, Promega'da kullanılan ayarların bir örneğini göstermektedir. Bu ayarları optimize etmeniz gerekebilir. Kurum içi validasyon gerçekleştirilmelidir. Notlar: 1. Analiz aralığı olarak tüm aralığı veya kısmi aralığı seçin. Kısmi aralığı kullanırken verinize dayanarak uygun bir analiz aralığı seçin. Dahili şerit standardının düzgün boyutlandırmasına yardımcı olmak için birincil pikten sonra ve tanımlı olan ilk dahili standart pikten hemen önce olacak şekilde bir başlangıç noktası seçin. 2. Pik amplitüd eşikleri yazılımın pik olarak adlandıracağı minimum pik yükseklikleridir. Pik amplitüd eşik değerleri, ABI PRISM 310, 3100 ve 3100-Avant Genetic Analyzers ve Applied Biosystems 3130 ve 3130xl Genetic Analyzers'da oluşturulan veriler için genellikle RFU'dur. Pik amplitüd eşikleri yazılımın pik olarak adlandıracağı minimum pik yükseklikleridir. Pik amplitüd eşik. Sayfa 24

24 değerleri, ABI PRISM 310, 3100 ve 3100-Avant Genetic Analyzers ve Applied Biosystems 3130 ve 3130xl Genetic Analyzers'da oluşturulan veriler için genellikle RFU'dur. Life Technologies, Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers için, varsayılan enjeksiyon koşullarını kullanırken 175RFU analiz eşiği önermektedir. Ancak, iç doğrulama araştırmalarından pik amplitüd eşikleri, ayrı laboratuarlar tarafından belirlenmelidir. CC5 ILS 500 için pik yükseklikler, genellikle boyaların pik yüksekliklerinden düşüktür. Bu nedenle, turuncu boyanın eşiği, diğer boyalardan daha düşük olabilir. 3. Normalizasyon kutusu, veri toplama sırasında normalizasyonun kullanılmış olup olmadığına bakılmaksızın işaretlenebilir. 8259TA Şekil 14. GeneMapper ID-X Pik Dedektör sekmesi. 11. Peak Quality sekmesini seçin. Pik kalitesi için olan ayarı değiştirebilirsiniz. Not: Adım 11 ve 12 hakkında daha fazla bilgi için GeneMapper ID-X kullanım kılavuzuna bakın. 12. SQ & GQ Settings sekmesini seçin. Bu ayarları da değiştirebilirsiniz. 13. Yeni analiz yöntemini kaydetmek için "Save"i seçin. 14. GeneMapper ID-X Yöneticisi'nden çıkmak için "Done"ı seçin. Sayfa 25

25 6.D. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile Olgu Çalışma Analiz Yöntemi Oluşturulması (devamı) Olgu Çalışma Örnekleri için Veri İşlenmesi 1. File ı ve sonra New Project i seçin. 2. Edit i ve sonra Add Samples to Project i seçin. 3. Çalışma dosyalarının konumuna göz atın. İstenen dosyaları vurgulayın ve önce Add to list i sonra da Add i seçin. 4. Sample Type sütununda, açılan menüyü kullanarak örnek için uygun olan Allelic Ladder, Sample, Positive Control veya Negative Control ü seçin. Projedeki her klasör, düzgün genotipleme için Sample Type sütununda Allelic Ladder olarak atanan en az bir allelik ladder enjeksiyonunu içermelidir. 5. Analysis Method sütununda bu bölümde daha önce oluşturulan analiz yöntemini seçin. 6. Panel sütununda, Bölüm 6.A. 'den alınan panel dosyasını seçin. 7. Size Standard sütununda, Bölüm 6.B de oluşturulan veya Bölüm 6.C de alınan boyut standardını seçin. 8. ABI PRISM 310 Genetic Analyzer dan bir veri analiz ediliyorsa, Matrix sütununda uygun matriksin seçildiğinden emin olun. 9. Veri analizine başlamak için Analyze ı (yeşil ok düğmesi) seçin. Not: Varsayılan olarak, yazılım, kalite değerlendirmesini gerçekleştirmesinin ardından Analysis Requirement Summary, Allelic Ladder Analysis Summary ve Analysis Summary pencerelerini görüntüler. Her pencere görüldükçe, tüm gerekliliklerin yerine getirildiğinden emin olun. Analysis Requirement Summary penceresini aktif hale getirmediyseniz, ilave manuel sorun giderme gerçekleştirmeniz gerekebilir. 10. Analiz gereklilikleri yerine getirilirse, Save Project penceresi açılacaktır (Şekil 15). 11. Proje adını girin. 12. Açılır menüden uygun güvenlik grubunu ve sonra da "OK"i seçin. 9430TA Şekil 15. Save Project penceresi.. Sayfa 26

26 Analiz bittiğinde, Analysis Summary penceresi görülecektir. Plots görünümünde tüm sarı ve kırmızı markör başlık çubuklarını incelemenizi ve bunları, laboratuar standardı operasyon prosedürlerine uygun olarak işlemenizi önermekteyiz. Genotype sekmesine ve Samples sekmesine gidin. Düşük kaliteli örneklerin değerlendirilmesine yardımcı olmak için varsayılan Veri Yorumlama plot ayarlarını kullanın ve Kalite Değer Ayrıntıları tablosundaki içerikleri inceleyin. Analysis Method Peak Quality ve SQ & GQ Settings sekmelerinde görüntülenen değerler varsayılandır ve plot ayarlarında görüntülenen kalite değerlerini etkileyecektir. Laboratuarınızın veri analizi protokollerine uydurmak için bu değerleri değiştirmenizi önermekteyiz. 6.E. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile Veritabanı veya Paternite Analiz Yöntemi Oluşturulması Bu talimatlar GeneMapper ID-X yazılımında veri analizi yapmaya başlamak için bir kılavuz görevi görür. GeneMapper ID-X yazılımının kullanımı için kapsamlı bir kılavuz olma görevi yoktur. Kullanıcıların yazılımla ilgili eğitim için Applied Biosystems ile temasa geçmesini tavsiye ederiz. 1. Tools u ve sonra GeneMapper ID-X Manager ı seçin. 2. Analysis Methods sekmesini seçin. 3. New u seçin ve yeni bir analiz yöntemi mesaj kutusu açılacaktır. 4. Analysis Method Editor penceresinde Security Group olarak GeneMapper ID-X Security Group u seçin. Bu, yazılımın tüm kullanıcılarına erişim sağlar. Diğer emniyet grupları kullanılabilir. 5. Analiz yöntemi için PowerPlexESX 17 20% Filter gibi açıklayıcı bir isim girin. 6. Allele sekmesini (Şekil 16) seçin. 7. Bölüm 6.A'da alınan bin dosyasını seçin Sayfa 27

27 6.E. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile Veritabanı veya Paternite Analiz Yöntemi Oluşturulması (devamı) 8. PowerPlex ESX 17 Sistemi kullanırken gölge piklerinin düzgün filtrelemesi için Şekil 16 da gösterilen değerleri girin. Bu ayarları optimize etmeniz gerekebilir. Kurum içi validasyon gerçekleştirilmelidir. 8260TA Şekil 16. GeneMapper ID-X Alel sekmesi. Bölüm 6.A'da alınan bin dosyasını seçin. 9. Peak Detector sekmesini seçin. Şekil 14, Promega'da kullanılan ayarların bir örneğini göstermektedir. Bu ayarları optimize etmeniz gerekebilir. Kurum içi validasyon gerçekleştirilmelidir. Notlar: 1. Analiz aralığı olarak tüm aralığı veya kısmi aralığı seçin. Kısmi aralığı kullanırken verinize dayanarak uygun bir analiz aralığı seçin. Dahili şerit standardının düzgün boyutlandırmasına yardımcı olmak için birincil pikten sonra ve tanımlı olan ilk dahili standart pikten hemen önce olacak şekilde bir başlangıç noktası seçin. 2. Pik amplitüd eşikleri yazılımın pik olarak adlandıracağı minimum pik yükseklikleridir. Pik amplitüd eşik değerleri, ABI PRISM 310, 3100 ve 3100-Avant Genetic Analyzers ve Applied Biosystems 3130 ve 3130xl Genetic Analyzers'da genellikle RFU'dur. Life Technologies, Applied Biosystems 3500 ve 3500xL Genetic Analyzers. Sayfa 28

28 için, varsayılan enjeksiyon koşullarını kullanırken 175RFU analiz eşiği önermektedir. Ancak, iç doğrulama araştırmalarından pik amplitüd eşikleri, ayrı laboratuarlar tarafından belirlenmelidir. CC5 ILS 500 için pik yükseklikler, genellikle boyaların pik yüksekliklerinden düşüktür. Bu nedenle, turuncu boyanın eşiği, diğer boyalardan daha düşük olabilir. 3. Normalizasyon kutusu, veri toplama sırasında normalizasyonun kullanılmış olup olmadığına bakılmaksızın işaretlenebilir. 10. Peak Quality sekmesini seçin. Pik kalitesi için olan ayarı değiştirebilirsiniz. Not: Adım 10 ve 11 hakkında daha fazla bilgi için GeneMapper ID-X kullanım kılavuzuna bakın. 11. SQ & GQ Settings sekmesini seçin. Bu ayarları da değiştirebilirsiniz. 12. Yeni analiz yöntemini kaydetmek için "Save"i seçin. 13. GeneMapper ID-X Yöneticisi'nden çıkmak için "Done"ı seçin. Veritabanı ve Paternite Örnekleri için Veri İşleme 1. File ı ve sonra New Project i seçin. 2. Edit i ve sonra Add Samples to Project i seçin. 3. Çalışma dosyalarının konumuna göz atın. İstenen dosyaları vurgulayın ve önce Add to list i sonra da Add i seçin. 4. Sample Type sütununda, açılan menüyü kullanarak örnek için uygun olan Allelic Ladder, Sample, Positive Control veya Negative Control ü seçin. Projedeki her klasör, düzgün genotipleme için Sample Type sütununda Allelic Ladder olarak atanan en az bir allelik ladder enjeksiyonunu içermelidir. Analysis Method sütununda bu bölümde daha önce oluşturulan analiz yöntemini seçin. 5. Panel sütununda, Bölüm 6.A 'dan alınan panel dosyasını seçin. 6. Size Standard sütununda, Bölüm 6.B. de oluşturulan veya Bölüm 6.C de alınan boyut standardını seçin. 7. ABI PRISM 310 Genetic Analyzer dan bir veri analiz ediliyorsa, Matriks sütununda uygun matriksin seçildiğinden emin olun. 8. Veri analizine başlamak için Analyze ı (yeşil ok düğmesi) seçin. Not: Varsayılan olarak, yazılım, kalite değerlendirmesini gerçekleştirmesinin ardından Analysis Requirement Summary, Allelic Ladder Analysis Summary ve Analysis Summary pencerelerini görüntüler. Her pencere görüldükçe, tüm gerekliliklerin yerine getirildiğinden emin olun. Analysis Requirement Summary penceresini aktif hale getirmediyseniz, ilave manuel sorun giderme gerçekleştirmeniz gerekebilir. Sayfa 29

29 6.E. GeneMapper ID-X Yazılımı, Sürüm 1.2 ile Olgu Çalışma Analiz Yöntemi Oluşturulması (devamı) 9. Analiz gereklilikleri yerine getirilirse, Save Project penceresi açılacaktır (Şekil 15). 10. Proje adını girin. 11. Açılır menüden uygun güvenlik grubunu ve sonra da "OK"i seçin. Analiz bittiğinde, Analysis Summary penceresi görülecektir. Plots görünümünde tüm sarı ve kırmızı markör başlık çubuklarını incelemenizi ve bunları, laboratuar standardı operasyon prosedürlerine uygun olarak işlemenizi önermekteyiz. Genotype sekmesine ve Samples sekmesine gidin. Düşük kaliteli örneklerin değerlendirilmesine yardımcı olmak için, varsayılan Veri Yorumlama plot ayarlarını kullanın ve Kalite Değer Ayrıntıları tablosundaki içerikleri değerlendirin. Analysis Method Peak Quality ve SQ & GQ Settings sekmelerinde görüntülenen değerler varsayılanlardır ve plot ayarlarında görüntülenen kalite değerlerini etkileyecektir. Laboratuarınızın veri analizi protokollerine uydurmak için bu değerleri değiştirmenizi önermekteyiz. 6.F. GeneMapper ID Yazılımı, Sürüm 3.2 ile PowerPlex ESX Paneli ve Bin Setleri PowerPlex ESX 17 Sistemi ile oluşturulan verinin analizi için Genotyper ID yazılımı, sürüm 3.2 yi kullanarak genotiplerin otomatik atanmasını sağlayan panel ve bin dosyaları oluşturduk. GeneMapper ID yazılımı, sürüm 3.2 kullanıcılarının yazılımın düzgün olarak kullanımına kendilerini alıştırmaları için Applied Biosystems GeneMapper ID Yazılımı İnsan Tanımlama Analizi Eğitimini tamamlamasını tavsiye ederiz. GeneMapper ID yazılımı, sürüm 3.1, kullanıcıları için sürüm 3.2 ye yükseltme yapmalarını tavsiye ederiz. GeneMapper IDyazılımı sürüm 3.2'yi kullanarak analiz yapmak için, uygun panel ve bin dosyalarına ihtiyaç duyacaksınız: X.x, panel ve bin dosyalarının en güncel sürümünü ifade edecek şekilde, PowerPlex_ESX_Panels_vX.x.txt vepowerplex_esx_bins_vx.x.txt dosyaları. Başlarken 1. PowerPlex ESX 17 System için uygun panel ve bin dosyalarını almak için aşağıdaki adrese gidin: 2. İletişim bilgilerinizi girin ve GeneMapper ID version 3.2"yi seçin. Submit i seçin. 3. PowerPlex_ESX_Panels_vX.x.txt ve PowerPlex_ESX_Bins_vX.x.txt dosyalarını bilgisayarınızda bildiğiniz bir konuma kaydedin.. Sayfa 30

30 Panel ve Bin Dosyalarının Alınması Bu talimatlar genel anlamda Applied Biosystems GeneMapper ID yazılım eğitimi, sayfa 1-4 ü takip eder. 1. GeneMapper ID yazılımı, sürüm 3.2 yi açın. 2. Tools u ve sonra Panel Manager ı seçin. 3. Navigasyon bölmesinin sol üst kısımdaki Panel Yönetici ikonunu vurgulayın. 4. File ı ve sonra Import Panels i seçin. 5. Yukarıdaki Başlangıç Bölümü'nde indirilen panel dosyasına gidin. Dosyayı seçin ve sonra Import u seçin. 6. Navigasyon bölmesinde Adım 5 te aldığınız yeni aldığınız PowerPlex ESX panel klasörünü vurgulayın. 7. File ı ve sonra Import Bin Sets i seçin. 8. Yukarıdaki Başlangıç Bölümü'nde indirilen bin dosyasına gidin. Dosyayı seçin ve sonra Import u seçin. 9. Panel Yönetici penceresinin alt kısmında OK i seçin. Panel Yöneticisi penceresi otomatik olarak kapanacaktır. 6.G. GeneMapper ID Yazılımı, Sürüm 3.2 ile bir Boyut Standardı Oluşturulması Bir boyut standardı oluştururken iki seçenek vardır. Bu protokolü veya Bölüm 6.H deki alternatif protokolü kullanın. 1. Tools u ve sonra GeneMapper Manager ı seçin. 2. Size Standard sekmesini seçin. 3. New u seçin. 4. Basic or Advanced i (Şekil 17) seçin. Seçilen analiz yöntemi, daha önce oluşturulmuş analiz yöntemi türü olmalıdır. OK i seçin. 5725TA Şekil 17. Select Dye ve Analysis Method penceresi. Sayfa 31

31 6.G. GeneMapper ID Yazılımı, Sürüm 3.2 ile bir Boyut Standardı Oluşturulması (devamı) 5. CC5 ILS 500 gelişmiş gibi detaylı bir ismi Size Standard Editor'e girin (Şekil 18). 6. Boyut standart boyası için turuncu rengi seçin. 7. Dahili şerit standardı fragmentlerinin boyutlarını (60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ve 500 baz) girin. 8. OK i seçin. 8199TA Şekil 18. Boyut Standart Editörü. 6.H. CC5 ILS 500 Boyut Standardının GeneMapper ID Yazılımı, Sürüm 3.2 ye Alınması CC5_ILS_500.xml dosyası aşağıdaki adresten indirilebilir: CC5_ILS_500.xml dosyasını bilgisayarınızda bildiğiniz bir konuma kaydedin. 1. Tools u ve sonra GeneMapper Manager ı seçin. 2. Size Standard sekmesini seçin. 3. Import u seçin.. Sayfa 32

32 4. CC5_ILS_500.xml dosyasının konumuna göz atın. 5. Dosyayı vurgulayın ve sonra Import u seçin. 6. Değişiklikleri kaydetmek ve GeneMapper Yöneticisi nden çıkmak için Done ı seçin. 6.I. GeneMapper ID Yazılımı, Sürüm 3.2 ile Olgu Çalışma Analiz Yöntemi Oluşturulması Bu talimatlar genel olarak Applied Biosystems GeneMapper ID yazılım eğitimi, sayfa 5-11 i takip eder. 1. Tools u ve sonra GeneMapper Manager ı seçin. 2. Analiz Yöntemleri sekmesini seçin. 3. New u seçin ve yeni bir analiz yöntemi mesaj kutusu açılacaktır. 4. HID ı ve sonra OK i seçin. Not: HID seçeneğini görmezseniz GeneMapper ID yazılımınız yoktur. Applied Biosystems ile temasa geçin. 5. Analiz yöntemi için PowerPlexESX 17 gibi açıklayıcı bir isim girin. 6. Alel sekmesini (Şekil 19) seçin. 7. Bölüm 6.F'de alınan bin dosyasını seçin. 8123TA Şekil 19. GeneMapper ID-X Alel sekmesi.bölüm 6.F'de alınan bin dosyasını seçin. Sayfa 33

33 6I. GeneMapper ID-X Yazılımı ile Olgu Çalışma Analiz Yöntemi Oluşturulması (devamı) 8. Use marker-specific stutter ratio if available kutusunun işaretli olduğundan emin olun. 9. PowerPlex ESX 17 Sistemi kullanırken gölge piklerinin düzgün filtrelemesi için Şekil 19 da gösterilen değerleri girin. Bu ayarların düzgün kullanımı ve etkileri ile ilgili açıklama için Applied Biosystems in Gene Mapper ID Yazılım 3.2 için Kurulum Prosedürleri ve Yeni Özellikler başlıklı kullanıcı bültenine bakın. Not: Bu ayarların bazıları optimize edilmiştir ve kullanıcı bülteninde tavsiye edilen ayarlardan farklıdır. 10. Pik Dedektör sekmesini seçin. Şekil 20 de gösterilen ayarları tavsiye ederiz. Notlar: 1. Analiz aralığı olarak tüm aralığı veya kısmi aralığı seçin. Kısmi aralığı kullanırken verinize dayanarak uygun bir analiz aralığı seçin. Dahili şerit standardının düzgün boyutlandırmasına yardımcı olmak için birincil pikten sonra ve tanımlı olan ilk dahili standart pikten hemen önce olacak şekilde bir başlangıç noktası seçin. 2. Pik amplitüd eşikleri yazılımın pik olarak adlandıracağı minimum pik yükseklikleridir. Pik amplitüd eşikleri için değerler genellikle RFU dur ve her laboratuvar tarafından belirlenmelidir. CC5 ILS 500 için pik yükseklikler, genellikle boyaların pik yüksekliklerinden düşüktür. Bu nedenle, turuncu boyanın eşiği, diğer boyalardan daha düşük olabilir.. Sayfa 38

34 8187TA Şekil 20. GeneMapper ID-X Pik Dedektörü sekmesi. 11. Pik Kalitesi sekmesini seçin. Pik kalitesi için olan ayarı değiştirebilirsiniz. Not: Adım 11 ve 12 hakkında daha fazla bilgi için GeneMapper ID kullanım kılavuzuna bakın. 12. Kalite İşaretleri sekmesini seçin. Bu ayarları da değiştirebilirsiniz. 13. Ayarlarınızı kaydetmek için OK i seçin. Olgu Çalışma Örnekleri için Veri İşlenmesi 1. File ı ve sonra New Project i seçin. 2. Edit i ve sonra Add Samples to Project i seçin. 3. Çalışma dosyalarının konumuna göz atın. İstenen dosyaları vurgulayın ve önce Add to list i sonra da Add i seçin. 4. Örnek Tipi sütununda, açılan menüyü kullanarak örnek için uygun olan Ladder, Sample, Positive Control veya Negative Control ü seçin. Projedeki her klasör, düzgün genotipleme için Örnek Tipi sütununda Ladder olarak atanan en az bir allelik ladder enjeksiyonunu içermelidir. 5. Analiz Yöntemi sütununda bu bölümde daha önce oluşturulan analiz yöntemini seçin. 6. Panel sütununda, Bölüm 6.F 'den alınan panel dosyasını seçin. 7. Boyut Standart sütununda, Bölüm 6.G de oluşturulan veya Bölüm 6.H de alınan boyut standardını seçin. Sayfa 39

35 6I. GeneMapper ID-X Yazılımı ile Olgu Çalışma Analiz Yöntemi Oluşturulması (devamı) 6.J. 8. ABI PRISM 310 Genetic Analyzer dan bir veri analiz ediliyorsa, Matriks sütununda uygun matriksin seçildiğinden emin olun. 9. Veri analizine başlamak için Analyze ı (yeşil ok düğmesi) seçin.alınan boyut standartını seçin. GeneMapper ID Yazılımı, Sürüm 3.2 ile Veritabanı veya Paternite Analiz Yöntemi Oluşturulması 1. Tools u ve sonra GeneMapper Manager ı seçin. 2. Analiz Yöntemleri sekmesini seçin 3. New u seçin ve yeni bir analiz yöntemi mesaj kutusu açılacaktır. 4. HID ı ve sonra OK i seçin. Not: HID seçeneğini görmezseniz GeneMapper ID yazılımınız yoktur. Applied Biosystems ile temasa geçin. 5. Analiz yöntemi için PowerPlexESX 17_20%filter gibi açıklayıcı bir isim girin. 6. Alel sekmesini (Şekil 21) seçin. 7. Bölüm 6.F 'de alınan bin dosyasını seçin. 8. Use marker-specific stutter ratio if available kutusunun işaretli olduğundan emin olun. 9. PowerPlex ESX 17 Sistemi kullanırken gölge piklerinin düzgün filtrelemesi için Şekil 21 da gösterilen değerleri girin. Bu ayarların düzgün kullanımı ve etkileri ile ilgili açıklama için Applied Biosystems in Gene Mapper ID Yazılım 3.2 için Kurulum Prosedürleri ve Yeni Özellikler başlıklı kullanıcı bültenine bakın. 10. Pik Dedektör sekmesini seçin. Şekil 20 de gösterilen ayarları tavsiye ederiz. Notlar: 1. Analiz aralığı olarak tüm aralığı veya kısmi aralığı seçin. Kısmi aralığı kullanırken verinize dayanarak uygun bir analiz aralığı seçin. Dahili şerit standardının düzgün boyutlandırmasına yardımcı olmak için birincil pikten sonra ve tanımlı olan ilk dahili standart pikten hemen önce olacak şekilde bir başlangıç noktası seçin. 2. Pik amplitüd eşikleri yazılımın pik olarak adlandıracağı minimum pik yükseklikleridir. Pik amplitüd eşikleri için değerler genellikle RFU dur ve her laboratuvar tarafından belirlenmelidir. CC5 ILS 500 için pik yükseklikler, genellikle boyaların pik yüksekliklerinden düşüktür. Bu nedenle, turuncu boyanın eşiği, diğer boyalardan daha düşük olabilir. Sayfa 40