TOPRAK VE RUMENDEN İZOLE EDİLEN BAZI CLOSTRIDIUM SP. İZOLATLARINDA SELÜLAZ ETKİNLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 ISSN: e-journal of New World Sciences Academy 2009, Volume: 4, Number: 2, Article Number: 5A0010 ECOLOGICAL LIFE SCIENCES Received: September 2008 Accepted: March 2009 Series : 5A ISSN : Fatih Matyar Ömer Çolak University of Cukurova fmatyar@cu.edu.tr Adana-Turkiye TOPRAK VE RUMENDEN İZOLE EDİLEN BAZI CLOSTRIDIUM SP. İZOLATLARINDA SELÜLAZ ETKİNLİKLERİNİN BELİRLENMESİ ÖZET Bu çalışmada, toprak ve rumenden izole edilen Clostridium suşlarının selülaz etkinlikleri araştırılmıştır. En yüksek selülaz etkinliği gösteren Clostridium sp. CF147 suşundan selülaz izolasyonu yapılarak SDS-PAGE profilleri saptanmıştır. Selülazın sırasıyla Da ve Da moleküler ağırlığa sahip iki banttan, oluştuğu tespit edilmiştir. Bu enzimin ph aralığı ve sıcaklık (termal) kararlılığı belirlenmiştir. Selülazın en uygun ph sı 7.0 olarak bulunmuştur. Selülazın 55 C de %64 oranında kararlı olduğu tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Clostridium sp., Selülaz, SDS-PAGE, Rumen, Toprak DETERMINATION OF CELLULASE ACTIVITIES IN SOME CLOSTRIDIUM SP. ISOLATES WHICH ISOLATED FROM SOIL AND RUMEN ABSTRACT In this study, it was investigated for cellulase activities of Clostridium strains isolated from soil and rumen. Cellulase isolation was performed and SDS-PAGE profiles were determined from Clostridium CF147 strain which showed the highest cellulase activity. It was determined that cellulase consists of two bands with molecular weight of Da and Da, respectively. ph range and thermal stability of this enzyme were determined. Optimum ph value of cellulase was found as 7.0. Cellulase was determined the stable at 55 C upto 64%. Keywords: Clostridium sp., Cellulase, SDS-PAGE, Rumen, Soil

2 1. GİRİŞ (INTRODUCTION) Son yıllarda yeni enerji kaynaklarına olan gereksinim, lignoselülozik bileşiklerin ticari kimyasallara ve enerjiye dönüştürülmesini zorunlu kılmıştır [1]. Bilindiği gibi, birçok bakteri türü selülaz enzim sistemine sahip değildir. Bu enzimi üretme yeteneğinde olan aerobik ve anaerobik bakteriler ise selülozu sellodekstrinlere, daha da önemlisi fosforilen ve sellobiyoza parçalarlar. Bunun yanısıra selülaz enzimi, hayvan beslemesinde de kullanılmaya başlanılmıştır. İlk çalışmalarda, fungal selülazlar üzerinde daha yoğun araştırmalar yapılmış, ancak daha sonra bakteri kökenli selülazların, kristalin selüloz üzerinde daha etkili olduğu tespit edilmiştir [2]. Anaerobik ortamlarda selülozun parçalanması oldukça karmaşık bir işlemdir. Selülozun parçalanması çevresel etkilere bağlı olarak metabolik işlevler kazanmış mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirilir [3]. Clostridium cinsinden olan bakteri hücreleri çomak şekilli olup µm eninde ve µm boyunda, genelde çiftli ya da kısa zincirler yaparak bulunurlar. Genç kültürleri Gram(+) boyanır (eskimiş kültürler Gr (-) boyanabilmektedir) ve peritrik (tek hücreli canlılarda bir çeşit kamçı şekli)kamçılarla hareket ederler. İçlerinden oval veya sferik endosporları olanlar, genellikle hücreyi şişirdikleri gibi, çoğu kemoorganotrof, bazıları ise kemoototrof ya da kemolitotrof bir metabolizmaya sahiptir [4] lerdeki enerji krizi ile birlikte, selülozun biyolojik yoldan parçalanması işlemlerine hız verilmiş ve yapısında bol bulunan bitkisel polimerlerden yakıt elde etme yönündeki araştırmalar arttırılmıştır. Elde edilen yakıtların fosil yakıtların yerine kullanılmasına çalışılmıştır. Rekombinant DNA teknoloji ile nükleik asit baz dizilişi analiz yöntemlerinin gelişmesiyle, selülolitik özelliğe sahip çeşitli organizmalardaki enzim sistemleri konusunda geniş kapsamlı çalışmalar yapılmıştır [5], yine selülozun parçalanması farklı çalışmaların konusunu oluşturmuştur [6 ve 7]. Selülozun %5-10 u anaerobik olarak parçalanır [8]. Anaerobik aktivite; toprak, gübre, kompost, tatlı su ve denizde oksijenin görüldüğü ince bir atmosferik tabakadan hemen sonra başlar [9]. Gübredeki organik maddelerin anaerobik olarak parçalanması doğadaki karbon döngüsünde önemli rol oynar. Gübre, toprağın üst yüzeylerinin barındırdığından yaklaşık iki kat daha çok karbon içerir [10]. Fizyolojik olarak farklı olan mikroorganizma toplulukları selülozun anaerobik olarak parçalanmasından sorumludur. Bu topluluk tek bir türün aktivitesi ile meydana gelen aerobik ayrıştırma ile zıtlıklar oluşturur. Örneğin odunun karbohidrat ve lignin bileşenleri Basidiomycetes sınıfına ait beyaz çomak mantar türü ile tamamen CO 2 ve H 2 O ya ayrıştırılır [10]. Diğer taraftan anaerobik ayrıştırma farklı mikroorganizma birliklerinin ortak çalışması sonucu meydana gelir [10]. 2. ÇALIŞMANIN ÖNEMİ (RESEARCH SIGNIFICANCE) Fosil yakıtlarındaki maliyetinin hızla artışı, organik materyalden anaerobik parçalanma ile açığa çıkan metana karşı ilgiyi de arttırmıştır. Metanın organik materyalden üretilmesi konusunda herhangi bir sorun olmayıp, esas darboğaz bu maddenin oluşum sürecinde ekonomik olup olmamasından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle son yıllarda anaerobik parçalanma işlemlerine önem verilmiştir. Mezofilik (ılık sıcaklıkları seven) Clostridium türlerinin selülozu parçalama işlemi üzerinde, aynı cinsin termofilik özellikte olanlarına göre daha az çalışılmışsa da son yıllarda bu tür bakterilere (termofiliklere) olan ilgide artış vardır. Ayrıca, mezofilik karakterdeki Clostridium 70

3 sp. ların evsel ve endüstriyel atıklarla ya da kimyasal ürünlerin işlenmesinde avantajlı olabileceği yönünde bulgular vardır [11]. 3. DENEYSEL YÖNTEM (EXPERIMENTAL METHOD) 3.1. Bakteri İzolasyonu (Isolation of Bacteria) Clostridium cinsi bakteriler, toprak ve sığır rumeninden izole edilmiştir. Ayrı ayrı 1 er gr toprak ve sığır rumeni içeriği, içinde 9 ml steril saf su bulunan laboratuar tüplerine konularak, ortamda sadece sporlu bakterilerin kalmasını sağlamak için 10dk 85ºC de su banyosunda tutulmuştur [12]. Daha sonra içerisinde 100ml steril Omelianski sıvı besiyeri bulunan 100ml lik laboratuar şişelerine aktarılmıştır. Bu şişelerde aynı zamanda 1x5cm ölçülerinde makas ile doğranmış 2 şer gr filtre kâğıdı da (Whatman No. 1) bulunmaktadır. Şişelerin yüzeyinde boş yer kalmayacak şekilde steril Omelianski sıvı besiyeri eklenip ağız kısımları streç filmle kapatılmış, 37ºC sıcaklıkta, karanlık etüv ortamında 12 gün süreyle bırakılmıştır [13]. Bu besi ortamında aerob bakteriler çoğalarak oksijeni tüketmiş ve anaerob bakteriler çoğalmaya başlamıştır gün sonra ortamdaki Whatman kâğıdını karbon kaynağı olarak kullanan ve selülaz (+) olarak değerlendirilen anaerobik bakteriler filtre kağıdı üzerinde görülebilen delikler oluşturmaya başlamışlardır [13]. Şişe içerisinden steril bir penset yardımı ile çıkarılan filtre kağıtları, Clostridium sp. için seçici besiyeri olan Differential Reinforced Clostridial Medium (DRCM) Agar a tek koloni düşmesi amacıyla azaltma şeklinde ekilip ve üzerine bir kat daha DRCM Agar dökülerek oksijenin yayılımı kısıtlanmıştır. Ayrıca petri kutusu kapağına oturacak şekilde kesilmiş ve %20 pirogallik asit ile %20 NaOH emdirilmiş steril filtre kâğıtları üstüste konulup petri kapatılmış, çevresi streç film ile sarılıp petri kutusunun içinde anaerob ortam oluşturulmuştur (Ott metodu)[14]. 96 saat süreyle 37ºC de yapılan inkübasyon sonunda 2-3mm çaplı siyah koloniler, Clostridium sp. olarak tanımlanmıştır [14], (Şekil 1). Tek düşen koloniler Gram boyama ve spor boyama yapılarak Gram pozitif ve davul tokmağı görünümünde spor yapan bakteriler numaralandırılıp stok olarak yüksek tabakalı Brewer agar a ekilmiş [15] ve sonraki çalışmalar için saklanmışlardır Karboksimetilselülaz (CMCase) Aktivitesinin Saptanması (Determination of Carboxymethylcellulase (CMCase) Activity) CMCase aktivitesi araştırılacak olan suşlar, %0.5 oranında CMC bulunan Pebble-Milled Agar besiyerine ekilmiş ve üzerine yine %0.5 oranında CMC bulunan 50ºC ye kadar soğutulmuş Pebble-Milled Agardan bir kat daha dökülerek ve ortamdaki oksijen kısıtlanmıştır [14). Streç film ile sarılan steril petri kapları 37ºC de 48 saat bırakıldıktan sonra, alınan örnekler %0.1 lik kongo kırmızısı ile 15dk boyanmıştır. Ortamdaki fazla boyanın uzaklaşması için ortama 1 M NaCI eklenerek 15dk. Daha beklenilmiştir [16].Sonuçta yapılan gözlemle, selülaz pozitif kolonilerin etrafında sarı bölgeler oluşurken, negatif suşların etrafında herhangi bir renk değişikliğinin olmadığı görülmüş [16]; ayrıca, oluşan bu selülaz bölgeleri de ayrı ayrı ölçülmüştür [16]. Selülolitik kompleks izolasyonu şu şekilde yapılmıştır. Boş bir serum şişesi içerisine birinde 2ml 1/ lik metilen mavisi çözeltisi bulunan, diğeri boş olan iki adet 11.5x1.5 cm boyutlarındaki laboratuar tüpü ağzı açık şekilde yerleştirilmiştir. Daha sonra %0.5 oranında CMC içeren ve ph:7.0 olarak ayarlanan 250 ml Pebble-Milled Selüloz Broth hazırlanarak serum şişesine konulup 1.2 atmosfer basınç altında, 121ºC de 15dk süre ile sterilizatörde tutulmuştur [17.] Tüplerden birinde metilen mavisi çözeltiyi kullanmaktan amaç, anaerobik koşulların sağlanıp sağlanmadığını anlamaktır. Bilindiği 71

4 üzere bu kimyasal oksijenli ortamda mavi, oksijensiz ortamda renksizdir. Sterilizatörden çıkarılan serum şişesindeki besiyerinin yaklaşık 45ºC ye kadar soğuması beklenmiş ve serum şişesinin tıpası streç film ile yalıtılmıştır. Tıpalı tüp içinde bulunan Brewer Anaerobik Broth ta 48 saat süreyle üretilmiş bakteri kültüründen steril bir enjektör yardımıyla serum şişesindeki içerisindeki Pebble- Milled Selüloz Broth içerisine 5ml aktarılmıştır. Daha sonra serum şişesi içerisindeki içi boş tüpe %20 lik pyrogallol ve aynı derişimdeki NaOH çözeltisinden 5 er ml konularak ortamda bulunabilecek oksijenin reaksiyon sonucu bağlanması amaçlanmıştır. Bu uygulama ile ortamdaki oksijen yaklaşık olarak 2-3 dakika sonra bağlandığı gibi, diğer tüpteki bulunan metilen mavisinin rengide saydamlaşmaktadır. Ekim yapılan serum şişesi 125 devir/dakikada 35 C de sallayıcıda (Edmund Bühler TH15)1 hafta çalkalamak suretiyle inkübasyona bırakılmıştır [18]. Bu sürenin sonunda Sleat ve ark., [18] a göre enzim izolasyonu yapılmış; Bollag ve Edelstein [19] a göre CMC li SDS- PAGE (Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi)uygulanarak selülaz enzim bantları görüntülenmiştir. Kullanılan SDS-PAGE konsantrasyonu ayırıcı jel için %10 luk toplayıcı jel için ise %5 lik [18] olarak hazırlanmıştır. Enzim örnekleri jele yüklendikten sonra 100 miliamper (ma) elektrik akımı verilmiştir. İzleme boyası (Bromfenol mavisi)jel tabanından çıkışına 2-3cm kala elektrik akımı kesilmiştir [19]. Enzim aktivitesinin saptanması Dinitrosalisilik asit (DNS) metodu [20] ile enzim proteinlerinin kantitatif olarak tayin edilmesi için Lowry metodu [21] ile yapılmış; enzimde en uygun ph belirlenmesi için Bilgehan nın [22] tanımına göre Sitrat-Fosfat ve Tris-HCl olmak üzere iki farklı tampon sistemiyle, termal stabilitesi ise Enzimin termal stabilitesinin saptanması için DNS metodu ile spektrofotometrenin 550 nanometre optik yoğunluk okumalarından saptanmıştır. 4. SONUÇLAR (RESULTS) Topraktan ve rumen den izole edilen Clostridium bakterilerin DRCM agar üzerindeki kolonileri morfolojileri Şekil 1 de, Clostridium spp. endosporlarının mikroskobik görüntüsü ise Şekil 2 de görülmektedir. Toprak ve rumen den izole edilmiş toplam 168 adet Clostridium sp. izolatının hepsinin selülaz pozitif oldukları yani selülozu karbon kaynağı olarak kullandıkları saptanarak en yüksek selülaz aktivitesi gösteren suş CF147 olarak belirlenmiştir. Şekil 3 te CF147 suşunun Selülaz bölgesine ait bulgular görülmektedir. Clostridium sp.cf147 izolatından soğuk etanol çöktürmesi ile elde edilen enzimin moleküler ağırlığı CMC li SDS-PAGE ile saptanmıştır [19]. SDS-PAGE e yüklenen protein örneğinden yaklaşık 10 bant elde edilmiş; bunlardan sadece molekül ağırlığı yaklaşık 81000Dalton olan 1. ve Dalton olan 2. bantlarda selülaz enziminin aktivitesine rastlanmıştır (Şekil 4). 72

5 Şekil 1. Clostridium spp. nin DRCM agar üzerindeki siyah renkli kolonileri (Figure 1. Black colonies of Clostridium spp. on DRCM agar) Şekil 2. Clostridium sp. endosporlarının mikroskop görüntüsü(1000x). Oklar endosporlu Clostridium sp. yi göstermektedir. (Figure 2. Microscobic view of Clostridium sp. endospores (1000X)). Arrows showed Clostridium sp. with endospore Şekil 3. Clostridium sp. izolatlarından CF147 ye ait Pebble-Milled CMC li agar üzerinde selülaz hidroliz bölgesi (Figure 3. Cellulase hydrolyse zone of isolates of Clostridium sp. CF147 on Pebble-Milled CMC agar) 73

6 Şekil 4. Clostridium sp. CF147 suşundan elde edilen selülazın %0.1 CMC içeren SDS-PAGE deki bant dizilişi A: Solda Coomassie Brillant Blue R250 ile boyanmış standart(1) bant ile Congo Red ile boyanmış enzim örnekleri 2,3,4,5,6.7 B: Enzim örneğinin Coomassie Brillant Blue R 250 ile boyanmış 2,3 ve 4 no lu bantları. (Figure 4. Clostridium sp. CF147 strain s cellulase SDS-PAGE profile containing 0.1% CMC. A: On the left band 1 stained with Coomassie Brillant Blue R250 and bands 2,3,4,5,6 and 7 stained with Congo Red B: 2, 3 and 4 bands of the enzyme sample stained with Coomassie Brillant Blue R 250. Enzim etkinliğinin saptanması için DNS yöntemi kullanılmıştır [20]. Bu yöntemde enzimin substrat çözeltisi ile reaksiyona girip meydana getirdiği glikoz miktarının kantitatif olarak belirlenmesi için 0.5 µmol dan 10 µmol a kadar hazırlanan standart glikoz çözeltilerinin 550nm optik yoğunluk absorbans değerleri belirlenerek bir regresyon grafiği elde edilmiş, ve bu eğriden elde edilen formülden yararlanarak, reaksiyon sonucu açığa çıkan indirgen glikoz miktarı µmol cinsinden hesaplanmıştır. Glikoz konsantrasyonları ile absorbans arasındaki doğrusal ilişki Şekil 4 te verilmiştir. Selülaz enziminin proteinlerinin kantitatif tayini için yaptığımız çalışmada; enzimin bir ünitesi, bir dakikada serbestleşmiş 1µmol indirgen şeker için, enzimin miligram miktarı olarak tanımlanmaktadır. Bu nedenle enzim örneğindeki miligram enzim miktarı Lowry metoduna [21] göre hesaplanmıştır. Bu standart protein çözeltilerinin 660 nm deki absorbans değerleri saptanarak bir regresyon eğrisi çizilmiş ve bu eğrideki değerlerden geliştirilen formülden yararlanılarak elde edilen ürünün enzim proteini mg/ml ile absorbanslar arasındaki doğrusal ilişki halinde Şekil 5 te verilmiştir. 74

7 Şekil 4. Glikoz konsantrasyonları ile absorbans değerleri arasındaki doğrusal ilişki (Figure 4. The linear relationship between glucose concentrations and absorbance values) Şekil 5. Albümin standartları ile absorbans değerleri arasındaki doğrusal ilişki (Figure 5. The linear relationship between albumin standarts and absorbance values) Clostridium sp. CF147 suşundan elde edilen selülazın farklı ph değerlerindeki tampon bileşikleriyle hazırlanan substrat çözeltileri ile 150 dakika etkileşime sokulduğunda en uygun ph nın bazik yönde ve ph olduğu saptanarak elde edilen bulgular Şekil 6 da verilmiştir. 75

8 Şekil 6. Clostridium sp. CF147 selülazının ph değerleri (Figure 6. ph values of Clostridium sp. CF147 cellulase s) Selülazın farklı sıcaklık derecelerindeki kararlılığını ölçmek amacıyla sırasıyla 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ve 80 C lik dokuz farklı sıcaklık aralığı seçilmiş ve her birinde 10 dakika tutulduktan sonraki 150 dakikalık inkübasyon süresini izleyen oransal etkinlikleri değerlendirilmiştir [22] Buna göre 40 C lik sıcaklık şokundan sonra %100 lük bir oransal etkinlik kaydedilirken; 45 C den sonra %83 lük, 50 C den sonra %67 lik, 55 C den sonra %64 lik, 60 C den sonra %40 lık, 65 C den sonra %32.8 lik, 70 C den sonra %15 lik, 75 C den sonra %11 lik ve 80 C den sonra %7 lik azalan bir oransal etkinlik saptanmıştır. Öte yandan, gözlemlerimize göre, uygulanan sıcaklık değerleri arttıkça oransal aktivitede fark edilir bir düşüşün göze çarptığı izlenimi edinilmiştir ki bu durum ilgili bulguların sunulduğu Şekil 4.7 ile de tam bir paralellik içindedir. Şekil 7. Clostridium sp. CF147 selülazının termal kararlılığı (Figure 7. Thermal stabilization of Clostridium sp. CF147 cellulase s) 76

9 5. TARTIŞMA (DISCUSSION) Clostridium sp. CF147 suşundan izole edilen selülaz enzimi, %0.1 CMC içeren eden SDS-PAGE de yürütülmüş ve elde edilen protein bantları %0.1 lik Commasie Brillant Blue R250 ile görünür hale getirildikten sonra fotoğraflanmış, daha sonra enzimin renatürasyonu için iyileştirme çözeltileri ile (çözelti I: 50mM NaH 2 PO 4, 50mM Na 2 HPO 4, %40 izopropanol; çözelti II: 50mM NaH 2 PO 4, 50mM Na 2 HPO 4 ; çözelti III: 50mM NaH 2 PO 4, 50mM Na 2 HPO 4, 1mM etilendiamintetraasetikasit (EDTA), 5mM β- merkaptoetanol. Tüm çözeltilere son hacmi 200 ml olacak şekilde steril saf su ilr hazırlanmıştır. ph ları HCI ile 7.2 ye ayarlanmıştır. Jel çözelti I ve çözelti II de 1 er saat oda sıcaklığında, çözelti III te ise 4 C de karanlık ortamda 16 saat tutulmuştur) muamele edilen jel %0.1 lik kongo kırmızısıyla boyanarak selülaz bantları araştırılmıştır. Araştırmamıza göre iki farklı selülaz bantı tespit edilmiştir. Standart işaret boyasının (sırasıyla , , 97400, 66000, ve Da moleküler ağırlığa sahip ve bromfenol mavisi eklenmiş, Bovin serum albüminin (Merck) elektrik akımı ile yüklü alanda ilerleme uzaklığı ölçülerek (Rf) değerleri bulunmuş ve selülaz bantlarının moleküler ağırlıkları hesaplanmıştır. Buna göre birinci bandın moleküler ağırlığı Da ve ikinci bantın moleküler ağırlığı ise Da olarak bulunmuştur. Selülaz kompleksinin polipeptid öğeleri SDS-PAGE ile birbirinden ayrılmış ve %0.1 lik Commasie Brillant Blue R250 ile boyanmıştır [22]. Clostridium thermocellum selülaz enziminin yapılan SDS-PAGE analizlerinin sonucunda moleküler ağırlıkları Da ve Da olan iki alt üniteden oluştuğu tespit edilmiştir [23]; bir başka çalışmayla da Clostridium thermocellum un bir suşundaki selülaz enziminin moleküler ağırlığı Da olarak tespit edilmiştir [24]. Desvaux adlı bir araştırmacı ise Clostridium cellulolyticom dan izole ettiği selülazın, 26kb lık bir DNA parçası tarafından kodlandığını ortaya koymuştur [25]. Literatürlerdekinden farklı olan Clostridium cinsine bağlı türlerden izole edilen selülaz enzimlerindeki moleküler ağırlıkları, türler arasında dahi farklılık göstermektedir. Çalışmamızda elde ettiğimiz selülaz ın moleküler ağırlığı, literatür bilgileriyle benzerlik göstermesine karşılık, DNA analiz çalışmalarının yapılamaması nedeniyle elde edilen enzimi kodlayan DNA parçasının uzunluğu hakkında kesin bir sonuca varılamamamıştır. Çalışmamızda izole edilen Clostridium sp. CF147 izolatı Çukurova bölgesi toprağından izole edilmiş olup, yapılan araştırmalar, yöredeki toprak ph sının arasında değiştiğini göstermektedir [26]. Clostridium sp. CF147 suşundan elde edilen selülolitik kompleksin en iyi etkinlik gösterdiği asiditenin 7.0 (Şekil 4.6) ve sıcaklık değerinin 40 C (Şekil 4.7) olduğu belirlenmiş; ancak 55 C de selülolitik kompleksin %64 oranında göreli etkinlik gösterdiği saptanmıştır ki, bu ise enzimin her ne kadar mezofil (ılık sıcaklıklarda C de daha verimli olan) karakterde olsa dahi 55 C de bile kullanılabileceğini göstermektedir. Benzer şekilde, en uygun ph değerinin 7.0 oluşu ise bakterinin izole edildiği ortamın ph sını desteklemesi açısından oldukça önemlidir. Mattiasson ve Marichamy, Clostridium acetobutylicum dan izole ettikleri endoksilanazın enziminin etkinlik gösterdiği en uygun ph yı 5.0 ve sıcaklığı 50 C olarak bulmuşlardır [27]; Romaniec ve arkadaşları selülozom olarak adlandırılan ve sıcağı seven anaerobik bir bakteri olan Clostridium thermocellum un hücredışı selülaz enziminin etkinlik gösterdiği en iyi ph derecesinin 6.6 ve sıcaklığın ise 70 C olduğunu saptamışlardır [24]. Clostridium cellulolyticum selülozu ile yapılan çalışmalarda bu enzimin en iyi etkinlik gösterdiği ph değerlerinin

10 ile 7.2 arasında, sıcaklık aralığının ise C olduğu belirlenmiş [28]; Clostridium bifermentan tan elde edilen ksilanazın etkinlik gösterdiği en uygun ph 4.0 ve optimum sıcaklığın 70 C olduğu görülmüştür [27]. Bu çalışmalarda Clostridium cinsinden olan farklı bakterilerin kullanılmasına rağmen, cinsin aynı türlerindeki değişik suşların kullanıldığı deneylerde ise izole edilen enzimlerin etkinlik gösterdiği en uygun ph ve sıcaklık değerlerinde değişimler gözlenmiştir. Görülen bu farkın bakterinin izole edildiği ortamın (rumen, toprak, kompost) koşulları ile bu ortamların ph ve sıcaklık farklılıklarına karşı bakterinin uyumundan kaynaklandığı açıktır. Geçtiğimiz yüzyılın son çeyreğinde bakteriler arası gen transfer yöntemleri hızla gelişerek, birçok bilim dalında fayda sağlayacak kullanım alanları bulmuştur. Özellikle birçok bakterinin gen haritalarının çıkarılması, enzimlerle kesildikten sonra bir vektör aracılığı ile protoplast transformasyonu, elektroporasyon, biyolistik partikül tabancası gibi çeşitli gen aktarım teknikleri [29,30,31] kullanılarak farklı bakterilere aktarılması gerçekleştirilmektedir. Böylece istenilen gen ürünü bol miktarda ve ucuz bir maliyetle üretilebilmektedir. Günümüzde mikrobiyal enzim üretimi ve satışı bazı ülkeler için ticari anlamda önem taşımaktadır. Özellikle maya endüstrisi ile medikal ve analitik uygulamalar için birçok ülke yurt dışına milyonlarca dolar aktarmaktadır. Bu yüzden çalışmamızın endüstriyel açıdan önemi büyüktür. Ayrıca yapılan çalışmalarla, bu enzimin moleküler büyüklüğü, DNA daki yeri ve nükleik asit baz dizilişi ile üretimi ekonomik olan bakterilere aktarılması gibi alanlardaki çalışmaların ülkemize büyük yararlar getireceği açıktır. TEŞEKKÜR (ACKNOWLEDGMENTS) Çalışmamızı finansal açıdan desteklediği için Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeler Komisyonuna (BAPKOM) teşekkür ederiz (Proje numarası: FBE99D.2). (We would like to thank to BAPCOM, (Cukurova University) for the financially support of our study (Project number: FBE99D.2)). KAYNAKLAR (REFERENCES) 1. Thirumale, S., Rani, D.S., and Nand, K., (2001). Control of cellulase formation by trehalose in Clostridium papyrosolvens CFR-703. Process Biochemistry, (37), pp: Enary, T.M. and Niku-Paavola, M.L., (1987). Enzymatic hydrolisis of cellulose: the current theory of mechanisms of hydrolysis valid? Critical Reviews of Microbiology, (5), pp: Schlesinger, W.H., (1991). Biochemistry an analysis of global change. San Diego Academic Press, pp: Holt, J.G., Krieg, N.R., Snetah, P.H.A., Staley, J.T. and Williams, S.T. (1994). Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition, pp: Szijártó, N., Siika-aho M., Tenkanen, M., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J., Réczey, K., and Viikari, L., (2008). Hydrolysis of amorphous and crystalline cellulose by heterologously produced cellulases of Melanocarpus albomyces. Journal of Biotechnology, (136), pp: Liu, Y.T., Long, C.N., Xuan, S.X., Lin, B.K., Long, M.N., and Hu, Z., (2008). Evaluation of culture conditions for cellulase production by two Penicillium decumbens under liquid fermentation conditions. Journal of Biotechnology, (136), pp:

11 7. Chandra, M., Karla, A., Sangwan N.S., Gaurav, S.S., Darokar, M.P., and Sangwan, R.S., (2009). Development of a mutant of Trichoderma citrinoviride for enhanced production of cellulases.bioresource Technology, (100), pp: Doi, R.H., Goldstein, M., Hashida, S., Park, G-S., and Takagi, M.,(1994). The Clostridium cellulovorans cellulosome. CRC Crictical Reviews in Microbiology, (20), pp : Vogels, G.D., (1979). The global cycle of methane. Antonie Van Leeuwenhook. Journal of Microbiology and Serology, 45: Post, W.M., Emanuel, W.R., Zinkle, P.J. and Stangenberger, A.G., 1982). Soil carbon pools and world life zones. Nature, (298), pp: Leschine, S.B., (1995). Cellulose degradation in anaerobic anvironments. Annual Reviews of Microbiology, (40), pp: Travers, R.S., Martin, P.A.W. and Reichelderfer, C.F., (1987). Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp. Applied and Environmental Microbiology, (53), pp: Omelianski, W., (1902). Uber die gärung der cellulose. Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde und Infektionskrankheiten Abteilung. (8), pp: Gibbs, B.M. and Freame, B., (1965). Methods for the recovery of Clostridia from foods. Journal of Applied Bacteriology, (28), pp: Brewer, J.H., (1940). Clear liquid medium for the "aerobic" cultivation of anaerobes. The Journal of the American Medical Association, (115), pp: Özcan, N., Cunningham, C., and Haris, W.J., (1996). Cloning of a cellulase gene from the rumen anaerobe Fibrobacfer succinogenes SD35 and partial characterization of the gene product. Letters in Applied Microbiology, (22), pp: Erkmen O., (1999). A laboratory manual in general microbiology. Published by the University of Gaziantep, pp: Sleat, R., Mah, R.A., and Robinson, R., (1984). Isolation and characterization of an anaerobic, cellulolytic bacterium Clostridium cellulovorans sp. nov. Applied and Environmental Microbiology,(48), pp: Bollag, D.M. and Edelstein, S.J., (1991). Protein Methods. Villey-Liss Press. pp: Bernfeld, P., (1955). Amylases, α and β. Methods in Enzymology. (1), pp: Lowry, O.H., (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, pp: Bilgehan, İ.H., (1992).Klinik mikrobiyolojik tanı. I. Baskı, Barış Yayınları, İzmir. ss: Hon-Nami, K. Coughlan, M.P., Hon-Nami, H., Ljungdahl L.G.,(1986). Separation and characterization of the complexes constituting the cellulollytic enzyme system of Clostridium thermocellum. Archives of Microbiology, (145), pp: Romaniec, M.P.M., Fauth, U., Kobayashi, T., Huskisson, N.S., Barker, P.J., and Demain, A.L., (1992). Purification and characterization of a new endoglucanase from Clostridium thermocellum. Biochemistry Journal, (283), pp: Desvaux, M., (2005). The cellulosome of Clostridium cellulolyticum. Enzyme and Microbial Technology, (37), pp: Dinç, U., Sarı, M., Şenol, S., Kapur, S., Sayın, M., Derici, R., Çavuşgil, V., Gök, M., Aydın, M., Ekinci, H., Ağca, N., and Schlichting, E., (1995). Çukurova Bölgesi Toprakları. Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları, No: 26, ss:

12 27. Marichamy, S. And Mattiasason, B., (2005). Rapid production of cellulase-free xylanases by solventogenic Clostridia from Rumen. Enzme and Microbial Technology, (37), pp: Fierobe, H.P., Bagnara, C.T., Gaudin, C., Guerlesquin, F., Sauve, P., and Belaich, J.P., (1993). Purification and characterization of endoglucanase C from Clostridium cellulolyticum. European Journal of Biochemistry, (217), pp: Malacinski, G.M., (2003). Essentials of Molecular Biology. Fourth Edition. Jones and Barlett Publishers, USA, pp: Vidal, J.R., Kikkert, J.R., Donzelli, B.D., Wallace, P.G. and Reisch, B.I., (2006). Biolistic transformation of grapevine using minimal gene cassette tchnology. Plant Cell Reports, (25), pp: Sudove, S., Portugal, I.S., Montermann, E., Ross, R., Angelika, B., and Kunz, R., (2006). Prophylactic and therapeutic intervention in IgE responses by biolistic DNA vaccination primarily targeting dendritic cells. Journal of Clinical immunology, (117), pp: