T.C. İZMİR KÂTİP ÇELEBİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ

Transkript

1 T.C. İZMİR KÂTİP ÇELEBİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ 3D DOKU KÜLTÜRÜ / MİKRO ELEKTROT DİZİ HİBRİT BEYİN- MAKİNE ARAYÜZ PLATFORMLARIN GELİŞTİRİLMESİ Proje No: MÜH-21 ÖNAP SONUÇ RAPORU Proje Yürütücüsü: Emel Sokullu Mühendislik Bilimleri Biyomühendislik A.B.D. Aziz Kolkıran Mühendislik Bilimleri Fizik A.B.D. Mayıs 2016 İZMİR

2 ÖZET Bu calışmada 3D Doku Kültürü / Mikro-Elektrot-Dizi - Hibrit Beyin-Makine Arayüz Platformlarının Geliştirilmesine yönelik sinir hücrelerinin üzerinde üreyebileceği, yüzeyleri iyon implantasyonu ile modifiye edilmiş ve elmasa benzer (DLC) ince film karbon ile kaplanmış polimerik malzemelerin uygunluğu ve 3D jellerin geliştirilmesi araştırılmıştır. Çalışma 3 ana bölümden oluşmaktadır: 1) polimer numunelerin yüzey modifikasyonu, 2) modifiye edilmiş bu yüzeylerde hücre çalışmaları (in-vitro çalışmalar), 3) 3D jellerin geliştirilmesi. Sonuç olarak, Au ve C ile gerçekleştirilen implantasyonlarda, yüzeydeki O miktarında artış ve karbonizasyon seviyesindeki düşüş hücre tutunmasını tetiklemiştir. Cam ve polimer malzemelerden iyi hücre tutunması ve nörit gelişimi Au ve C iyonlarıyla doz değeri aralığında izlenmiştir. PLA ve silikon örneklerde de iyi sonuçlar tesbit edilmesine karşın polimer tüp yapımı bakımından en optimize malzeme PLC olarak tesbit edilmiştir. Anahtar sözcükler: Biyomalzemeler, 3D jeller, Sinir Doku Mühendisliği, İyon İmplantasyonu, Elmasa Benzer Karbon Filmler, DLC, Sinir Hücre Kültürü, PLA, PDLG, PLC, Au, C ABSTRACT In this study, we carried out a directed research and development program to explore the suitability of various kinds of ion implantation and of plasma deposition for the selective, enhanced growth of neuronal cells on substrates that could be applied to human surgical/medical needs. A specific goal of the thesis is to develop short lengths of smalldiameter polymer tubing, the inside surface of which is plasma DLC coated /ion modified so as to selectively enhance the growth of nerve cells within the tube, thus serving as a vehicle for the regeneration and repair of broken elements of nervous system. This work consists of three main sections ; 1) Surface modification of polymeric samples and their surface characterisations 2) Cell study, in-vitro tests, with modified polimeric surfaces, 3) 3D hydrogel compartements for in-vivo studies by comparing in-vitro results. In-vitro studies is not the aim of this this work but have potentials for future research work. As a result of that, both Au and C ion implantation, effected to O concentration increase and C concentration decrease on the surface. This effect stimulate the cell growth on polymeric surfaces. Best neural cell atachment and cell growth properties have been observed with the ion fluency of ion /cm 2 both with Au and C ions. Although PLA and silicone materials after ion beam modification representing very good properties in order to biocompatibility for neural cells, most appropriate material for processing the poylmeric tubes as neural conduits are PLC. Keywords: Biomaterials, 3D hydrogels, Neural Tissue Engineering, Ion Implantation, Diamond Like Carbon Films, DLC, Nerve Cell Culture, PLA, PDLG, PLC, Au, C

3 GİRİŞ: Bu calismada, sinir dokusu rejenerasyonu ve desenli yaygın sinir ağ ları uygulamalarına yönelik, tıbbi ve cerrahi ihtiyaçlara hizmet vermek üzere, sinir hücrelerinin üzerinde üreyebileceği, yüzeyleri iyon implantasyonu ile modifiye edilmiş ve elmasa benzer (DLC) ince film karbon ile kaplanmış polimerik malzemelerin uygunluğu araştırılmıştır. Çalışmanın belirgin amacı, modifiye edilmiş polimerik yüzeylerde desenli yaygın sinir ağlarının oluşturulması ve bu yüzeylerin proje kapsamında satın alınan UV fotopolimerizasyon cihazı ile oluşturulan 3D jeller ile kombine edilmesi suretiyle 3D Doku Kültürü / Mikro-Elektrot-Dizi Hibrit Beyin-Makine Arayüz Platformlarının Geliştirilmesi dir.

4 Malzeme ve Metot Malzeme: Bu çalışma için Omnicure S2000 UV kaynağı jel oluşturmak için kullanılmıştır. PEGDA polimeri Sigma-Aidrich firmasından, jelleşmeyi başlatan Irgacure BASF firmasından, polimerin hazırlandığı PBS solüsyonu ise Gibco firmasından satın alınmıştır. Metot: 1. 3D Jellerin Hazırlanması: Polimerleşme öncesi solüsyon hazırlamak amacıyla PBS içerisinde ağırlıkça %10 PEGDA ve %0,5 Irgacure çözdürülmüştür. Bu solüsyon pipetle hidrofobik polisitren yüzeye aktarılıp UV altında ışıkla indüklenerek jelleşme sağlanmıştır. En uygun jelleşmenin tespiti için çeşitli süre aralıklarıyla jelleştirme uygulaması gerçekleştirilmiştir. Desenli jeller oluşturmak amacıyla ışık maskeleri kullanılmıştır. Resim 1. Omnicure S2000 UV kaynağı ile yapılan jelleştirme denemeleri. Bu denemelerde 20 µl polimer solüsyonu hidrofobik polisitren yüzeye aktarılmış ve soldan sağa doğru saniye UV uygulamalarıyla jelleşme ve jel kalitesi karakterize edilmiştir. Oluşan jellerin stabiliteleri ve jel çapları göz önünde bulundurularak en iyi jelleşmenin saniye UV uygulamalarında görüldüğü tespit edilmiştir.

5 Resim 2. Polimer solüsyonuna ağırlıkça % 0,1 kırmızı boya karıştırılarak renkli jeller hazırlanmış ve çeşitli sürelerde jelleştirme denemeleri yapılmıştır. Ardından desenli jeller oluşturmak amacıyla ışık maskeleri kullanılmış ve jelleşme süreleri karşılaştırılmıştır. Işık maskesi olmadan yapılan jelleştirmelerde 20 saniyeden itibaren jel oluşumu gözlenirken ışık maskesinin kullanıldığı denemede 35 saniyeden itibaren jel oluşumu gözlenmiş ve stabil jeller 50 ve 55 saniye denemelerinde gözlenmiştir. Maskesiz yapılan denemede yine en stabil jel oluşumu 30 ve 35 saniye denemelerinde gözlenmiştir.

6 Resim 3. Farklı ışık maskelerinin jelleşme süresine etkisi. Işık maskesinin jelleşme süresine etkisinin olduğu tespitinin ardından farklı ışık maskelerinin jelleşme üzerine etkisi incelenmiştir. Üstteki ışık maskesinde jel oluşumu 35 saniyeden itibaren (resim 2) gözlenirken alttaki maskede tam jel oluşumu 55 saniyede gözlenmiş ve 60 saniye uygulanmasında jelleşmenin bozulduğu gözlenmiştir. Bu deneme bize kullanılacak her maskenin önceden jelleşme parametrelerinin belirlenmesi ve karakterize edilmesi gerekliliğini göstermiştir. 2. Au kaplanmış Polimer Yüzeylerin Hazırlanması İyon implantasyonunun biyouyumlu ve biyobozunur polimer malzemelere etkilerini, bu polimer malzemelerin sinir hücre tutunması ve çoğalmasını incelemek üzere PLC (Poli-L Lactide ECaprolactone) numuneler ile çalışılmıştır. Granül halindeki numuneler PURAC firmasından temin edilmiştir. Çözücü olarak Kloroform (MERCK) kullanılmıştır. Yüzey modifikasyonları için kullanılan 0,61 mm çapında ve 40mmuzunluğunda saf altın (Au) katod Işık Kuyumculuk (Kemeraltı-İzmir) tarafından özel olarak hazırlanmıştır. Yüksek saflıktaki Oksijen gazı ise BOS firmasından temin edilmiştir. İyon implantasyon parametreleri: İyon türü: Au ve Au+O İyon enerjisi: 20 kv, 30 kv İmplantasyon dozajı :1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016iyon/cm2

7 İyon implantasyon işlemi, 250µs tekrarlama hızı ile darbe frekansı 1-2 ye göre ayarlanmıştır. 3. Hücre tutunma testi materyalleri İnsan nöroblastom Kellyhücre dizisi (Dokuz EylülÜniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Biyoloji ve GenetikBölümü) Dulbecco hücre üretme ortamı (DMEM; Biochrom, Almanya) %20 FCS (Fetal Calf Serum) (Biochrom,S0125) 2mM L-Glutamin (Biological Industries, C) 0,1mg/mlstreptomisin (Biological Industries, C) % 1 esansiyelolmayan aminoasit karışımırpmi-1640 (Biological Industries, A) PBS (Phosphate buffered saline)(biological Industries, C) Tripsin-EDTA (Biological Ind., B) 37oC de, % 5 CO li inkübatör (Hera Cell, Heraeus, Almanya) Etanol (Merck ) 2N HCl (MerckK ) %1 BSA (Amresco )

8 BULGULAR: Resim 17. PLC üzerine Au implante edilmiş yüzeyde tutunmuş B35 Sinir Hücrelerinin ve nörit uzantılarının görüntüsü (1000X, 3500X) Resim 14. de görülen SEM görüntülerinden izlenebileceği gibi implante edilmiş PLC örnekte hücrelerin çevresinde matix benzeri bir yapı oluşumu dikkat çekmektedir. Hücrelerarası matriks olarak isimlendirilen bu yapı hücrelerin canlılığının bir işaretidir ve bu yapı özellikle Au implantasyonu ile işlem görmüş numunede belirginleşmektedir. Özellikle kontrol numunelerde varolmayan bu yapının implante edilmiş örneklerde göze çarpması, hücrelerin büyümesi ve gelişimi için uygun ortamın oluşmuş olduğunun bir göstergesi olarak ele alınabilir. Karşılaştırmalı Hücre Çalışması: Nöronal farklılaşma kapasitesine sahip hücre dizilerinin iyon implantasyonuna maruz kalmış biyobozunur polimer örnekler üzerinde davranış karakteristiklerini izlemek amacıyla, N2A ve B35 hücre dizileriyle hücre kültürü çalışması gerçekleştirilmiştir. Her iki hücre dizisi için uygulanan kültür ortamı ve herbir malzeme için iyon implantasyonu parametreleri birebir aynı tutulmuştur. Literatürde, merkezi sinir sistemi çalışmalarında sıkça kullanılan, sıçan nöroblast - B35 (CRL2754) model hücre dizisi, neonatal sıçanlara ait tümör dokusundan türetilmiştir ve hücre büyümesi, toksikoloji, farklılaşma çalışmalarında sıkça kullanılır. Bu çalışmada, in vivo denemeler için yüzey seçiminde homolog sistem oluşturmak amacıyla seçilmiştir. Fare adrenal medulladan türetilen N2A hücre dizisi ise, özellikle sinir hücresi farklılaşması için model sistem olarak kullanılmaktadır [X, Y]. Örnekler 37 de, 7. Gün kültive edildikten sonra SEM ile alınan görüntüler Resim 18. de sunulmuştur. C implantasyonu PLA, PLC (E=30keV. Doz= 1x10 16 ) ve Kitosan (E=20keV. Doz= 1x10 15 ) örnekler

9 üzerine uygulanmıştır. Resim 18.de görülen N2A (a, c, e) ve B35 (b, d, f) Sinir Hücre Tutunması çalışmalarına ait SEM fotoğraflarında izlendiği gibi her iki tip hücrede yüzeylere iyi tutunmuştur. Her iki tip hücre için de bütün yüzeylerde nörit uzantıları belirgindir. Sonuç: Yapılan çalışmalar göstermektedir ki hem Au ve hem C iyon implantasyonları belirli doz ve enerji değer aralıklarında hücre tutunmasını inhibe ederken belirli değerlerde aktive edici rol oynamaktadırlar. Bu çalışmaya göre C implantasyonu için en elverişli yüzey 1x10 16 değerinde elde edilirken Au implantasyonu için bu değer dolaylarıdır. Her iki yüzey için ve aşağıdaki dozlar ile ve üzerindeki dozlar hücre tutunmasını inhibe etmektedir. Diğer yandan implantasyon sırasında gönderilen iyonlara ait enerji değerinin tek başına hücre tutunmasına elverişli yüzey oluşturmak bakımından önemli bir parametre olmadığı sonucuna ulaşılmıştır. DLC ve C ve Au implantasyonlarına maruz bırakılmış yüzeyler arasında yaptığımız karşılaştırmalara göre bu yüzey işlemlerinden hangisinin daha etkin olduğu tam olarak açık değildir. Cam yüzeylerde belirli kalınlık derecelerinde DLC kaplamanın son derece etkili olduğu sonucuna varılırken C ve Au implantasyonları özellikle polimerlerde hücre tutunmasına elverişlilik bakımından daha aktif yüzeyler oluşturmuştur. Buradan, polimer üzerine gerçekleşen kaplamanın tutunma bakımından camla gerçekleştirdiğimiz kaplamanın kalitesine ulaşmadığı ve değerlerin optimizasyonuna ihtiyaç duyduğu sonucuna varılabilir. Ayrıca 3D Jeller proje kapsamında başarıyla oluşturulmuştur. Sonuç olarak proje kapsamında 3D Doku Kültürü / Mikro-Elektrot-Dizi - Hibrit Beyin-Makine Arayüz ler başarı ile oluşturulmuştur. 3D jeller ve iletken yüzeylerin kombine edilmesi için uygun maske dizaynına ve ayrı bir platforma ihtiyaç vardır. Bu proje bütçesi içinde geliştirilen 3D jeller ve iletken yüzeylerin ileride gerçekleştirilecek projeler kapsamında kombine edilerek kullanıma uygun hale getirilmesi planlanmaktadır.

10 Yayınlar: 1. Ersoy F., Oztarhan A., Nikolaev, AG, Oks, EM, Yalçın E., Sokullu E., Biodegradation Behaviour of Magnesium Implanted Poly(-L-Lactide/Caprolactone) Films, Surface and Coatings, October 2016 Submitted 2. Sokullu E., Optogenetic Strategies for Neurodegenerative Diseases, An International Journal of Experimental and Clinical Anatomy, Volume 9, Issue 3, December Sokullu E., Ersoy F., Oztarhan A., Brown I.G., Controlling Cell Morphology on Ion Beam Textured Polymeric Surfaces, An International Journal of Experimental and Clinical Anatomy, Volume 9, Issue 3, December 2015 (In print)