Teredinobacter turnirae den Proteaz Üretiminde Farklı Stratejilerin Araştırılması

Transkript

1 Fırat Üniv. Fen ve Müh. Bil. Dergisi Science and Eng. J of Fırat Univ. 19 (4), , (4), , 27 Teredinobacter turnirae den Proteaz Üretiminde Farklı Stratejilerin Araştırılması Şule BULUT Fırat Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü, 23279, Elazığ sbulut2@firat.edu.tr (Geliş/Received: ; Kabul/Accepted: ) Özet: Bu çalışmada, marinal bakteri Teredinobacter turnirae den ekstraselular alkali proteaz enzim üretimi kesikli işletilen 1 L lik biyoreaktörde incelenmiştir. Araştırmada proteaz enzim miktarının arttırılması amaçlanmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında, karbon kaynağının ve indükleyici ilavesinin proteaz üretimi üzerine etkisi incelenmiş ve bu amaçla karbon kaynağı olarak glikoz ve sakkaroz, indükleyici olarak da kazein kullanılmıştır. Karbon kaynağı olarak sakkarozun kullanıldığı biyoproses ortamında enzim aktivitesinin daha yüksek olduğu görülmüştür. İndükleyici etkisini incelemek amacıyla ortama ilave edilen kazeinin, enzim üretimini yaklaşık 3 kat arttırdığı gözlenmiştir. Çalışmanın diğer aşamasında ise, Teredinobacter turnirae nin tekrar kullanılabilirliğini incelemek amacıyla Repeated-Batch sistemi kullanılmış ve besiyeri belirli aralıklarla değiştirilmiştir. Mikroorganizma 5 saat aktif bir şekilde proteaz üretimini sürdürmüştür. Anahtar Kelimeler: Serin alkali proteaz, Teredinobacter turnirae, Kesikli fermantasyon, Tekrar kullanılabilirlik. Investigation of Different Strategies on Protease Production by Teredinobacter turnirae Abstract: The production of extracellular alkaline protease by a shipworm bacterium Teredinobacter turnirae was studied with batch culture in 1 L bioreactor. The research was focused on the improvement of protease level. In the first part of the study, some fermentation conditions such as carbon source and inducer on protease production were investigated, glucose and sucrose were used as a sole carbon sources, casein was used as a inducer. The medium where sucrose was used as a sole carbon has give highest yield for protease production. The inclusion of casein as a inducer in the medium resulted in a 3-fold higher protease production. In another stage of the study, Repeated-batch experiments were also performed in 1 L bioreactor using T. turnirae. In these experiments, the spent medium was replaced with sterile fresh medium. The microorganism continued production of enzyme over a 5 h period. Keywords: Serine alkaline protease, Teredinobacter turnirae, Batch fermentation, Repeated-batch. 1. Giriş Proteaz enzimi, tüm canlı varlıklarda bulunan, büyüme ve çoğalma için gerekli olan bir enzimdir. Proteinlerin hidrolizinde spesifik olarak katalitik rol oynayan, fizyolojik ve ticari açıdan oldukça önemli enzimlerden biridir. Günümüzde elde edilen değişik özellikteki proteazlar, deterjan ve gıda endüstrisi başta olmak üzere; tekstil, deri, fotoğraf, ipek ve yem sanayileri ile çeşitli klinik uygulamalar ve eczacılık gibi bir çok alanda kullanılmaktadır [1,2]. Dünyada, yılda üretilen ve çeşitli endüstrilerde kullanılan enzimlerin % 8 den fazlasının hidrolazlar grubuna ait olduğu ve perboratlar ve oksitleyici maddelere karşı oldukça hassastırlar ve bu maddelerin varlığından olumsuz yönde etkilenirler. T. bununda yaklaşık % 6 ını proteazların oluşturduğu bilinmektedir [3]. Endüstriyel birçok firma, sürekli olarak katalitik aktiviteyi artıracak yeni enzimleri bulmaya, onları tanımlamaya ve büyük ölçekli proseslerde elde etmeye çalışmaktadır. Bunlardan bir tanesi de, ilk olarak 1983 yılında Ruth Turner ın izole ettiği, marinal bir bakteri olan Teredinobacter turnirae tarafından üretilen oldukça aktif proteaz enzimidir. Subtilin gibi proteaz enzimleri deterjan sanayinde istenen birçok özelliğe sahiptir. Ancak deterjan formülasyonunda sıkça kullanılan turnirae den elde edilen proteazın bu maddelerin varlığında bile kararlılık göstermesi, diğer enzimlere kıyasla bu enzimi bir adım öne

2 Ş. Bulut çıkarmaktadır. Elde edilen bu enzim, oksitleyici ajanların varlığında kararlılığını devam ettirmesi yanında, aktivitesini de artırmaktadır. Bu çalışmada, kesikli işletilen biyoreaktörde, T. turnirae den proteaz üretiminde, karbon kaynağı ve indükleyici etkisinin yanında mikroorganizmanın enzim üretiminde tekrar kullanılabilirliği araştırılmıştır. 2. Materyal ve Metod 2.1. Mikroorganizma Teredinobacter turnirae bakterisi USDA(United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois) den temin edilmiştir. Marinal bakteri olan mikroorganizma, simbiotik olarak yaşadığı shipworm Teredinidae familyasından ve Deshayes salgı bezlerinden izole edilmiştir. T. turnirae anaerobik, mikroaerobik ve aerobik ortamlarda canlı kalabilmektedir [4]. Bakteri normal şartlarda Gram-negatif, rijitrod şeklinde (.5 µm x 5 µm) ve gelişmesi esnasında sarı renkli pigment salgılamaktadır. Bir diğer önemli özelliği de çok uzun süre canlı halde kalabilmesidir (5 yıldan fazla) Mikroorganizma büyüme ortamı ve şartları Mikroorganizmanın büyüme ortamı olarak Plackett-Burman metoduyla optimize edilmiş besi ortamı (PB) kullanılmıştır [5]. Tablo 2.1. de bileşimi verilen PB besi ortamından 5 ml alınarak 25 ml lik erlenlere konulmuştur. Başlangıç ph sı 1 N HCl ve 1 N NaOH kullanılarak 8 e ayarlanmıştır. Hazırlanan besiyeri 121 o C de ve 1.2 bar basınçta 2 dakika süre ile otoklavda (Prior Clave 129) sterillenmiştir. Sterillenen besiyerleri laminer flowda ortam sıcaklığına kadar soğutulmuştur. Kriyojenik tüplerde -26 o C de stoklanan mikroorganizmadan steril şartlarda 5 µl alınarak 5 ml lik besiyerine ilave edilmiştir. Mikroorganizma gelişimi erlenlerde, 3 o C ve 125 rpm de çalışan inkübatör çalkalayıcıda (Selecta Rotabit) 24 saat süre ile sağlanmıştır. Ön gelişme periyodunu tamamlayan mikroorganizmalar % 1 (v/v) oranında enzim üretim ortamına eklenmiş ve fermantasyona tabii tutulmuştur. Üretim ortamı olarak da yine PB besiyeri kullanılmıştır Biyoreaktör işletim şartları Biyoreaktör olarak 8 ml çalışma hacminde ısıya dayanıklı pyreks camdan yapılmış, 1 l hacimli silindirik bir biyoreaktör kullanılmıştır. Kullanılan biyoreaktör düzeneği Şekil 2.1 de görülmektedir. Biyoproses süresince elektrotlar ve kontrol sistemi yardımıyla karıştırma hızı, çözünmüş oksijen derişimi, sıcaklık ve ph değerleri izlenmiştir. Hava akış hızı rotametreden kontrol edilmekte olup, hava.2 µ gözenekliliğindeki filtrelerden geçirildikten sonra karıştırıcının alt kısmındaki hava dağıtıcısından biyoreaktöre gönderilmektedir. Besi ortamına, aşı ekleme ve numune alma işlemleri sterilliği bozmayacak şekilde yapılmıştır. Repeated-Batch çalışmalarında, kullanılmış besi yeri laminer flow içerisinde steril şartlarda mavi bantlı filtre kağıdı ile süzülmüştür. Mikroorganizma yüzeydeki enzimin uzaklaştırılması amacıyla steril saf su ile iki kez yıkanan mikroorganizma, biyoreaktöre eklenen taze besi yeri yardımıyla filtre kağıdından ortama tekrar alınmıştır Analitik yöntemler Biyoproses süresince, farklı kalma sürelerinde alınan örneklerde, mikroorganizma ve toplam protein derişimi belirlenmiştir. Fermantasyon ortamından alınan örnekler, 7 rpm de 15 dakika santrifüjlenmiş (Hettich Eba21), mikroorganizmadan ayrılan sıvı kısımda ise, proteaz aktivitesi ve substrat derişimi belirlenmiştir Mikroorganizma Derişimi Mikrorganizma gelişimi türbidimetrik olarak UV-spektrofotometrede absorbans ölçümüyle takip edilmiştir. Kalibrasyon doğrusu, belirli derişimde hücre içeren ortam için 6 nm de 562

3 Teredinobacter turnirae den Proteaz Üretiminde Farklı Stratejilerin Araştırılması Tablo 2.1. Plackett-Burman besi ortamı (PB) Bileşen Miktar (g/l) Sakkaroz 5 NH 4 Cl 1 KCl.4 MgSO 4.7H 2 O 1.9 MgCl 2.6H 2 O 1.5 CaCl 2.2H 2 O.4 HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine- 4.9 N-2-ethanesulfonic acid) Antifoam 24 1 ml/l Çözelti A 1 ml/l Tuz çözeltisi 1 ml/l Çözelti A (g/l) Tuz çözeltisi (g/l) K 2 HPO 4.3H 2 O 24 H 3 BO Na 2 CO 3 12 MnCl 2.4H 2 O 7.2 Fe 2 (SO 4 ) 3.3 ZnSO 4.7H 2 O.2 Na 2 MoO 4.2H 2 O.4 CoSO 4.7H 2 O.5 CuSO 4.5H 2 O.8 hazırlanmıştır. Absorbans değerleri hazırlanan standart doğrudan faydalanılarak, kuru ağırlık olarak ifade edilmiştir. Referans çözelti olarak mikroorganizma içermeyen biyodönüşüm ortamları kullanılmıştır Proteaz aktivitesi Üretilen proteaz enziminin aktivitesi, azokazeinin enzimatik hidrolizi sonucunda açığa çıkan hidrolizatların absorbansının spektrofotometrik olarak ölçülmesiyle belirlenmiştir. Proteolitik aktivite substrat olarak %.8 (w/v) azokazeinin kullanıldığı ve Cotta ve Hespell [6] tarafından verilen metot ile bulunmuştur..5 ml azokazein çözeltisi (1 mm potasyum fosfat tamponunda hazırlanmış, ph:7) ile.5 ml mikroorganizmadan ayrılmış enzim kaynağı, 1.8 ml kapasiteli Eppendorf tipi mikrosantrifüj tüplerde karıştırılmıştır. Karışım 39 o C de 3 saat süre ile inkübe edilmiştir. Bu süre sonunda,.5 ml soğuk 1.5 M HClO 4 ilave edilerek reaksiyonun durması sağlanmış ve buz banyosu içerisinde 3 dakika bekletilmiştir. Çöken protein, N=12 dk -1 hızında 5 dakika süresince santrifüjlenmiştir. Üstte kalan sıvı kısımdan alınan 1 ml numune, 1 ml 1 N NaOH ile karıştırılmıştır. Elde edilen bu karışımın 44 nm de absorbansı ölçülmüştür. Bu metoda göre, 1 OD (Optical density) = 32 µg/ml azokazein yada 64 U/ml olarak alınmıştır [7] DNS yöntemi ile indirgenmiş şeker derişimi Mikroorganizmanın tüketmediği toplam indirgen şeker (glikoz ve früktoz) derişimi DNS (dinitrosalisilik asit) yöntemi ile ölçülmüştür [8]. Bunun için önce derişimi bilinen miktarlarda glikoz içeren ortamlar kullanılarak kalibrasyon doğrusu hazırlanmıştır Sakkaroz derişimi Mikroorganizmanın tüketmediği sakkarozu belirlemek için, mikroorganizmadan ayrılmış sıvı kısımdan 1 ml alınmış, üzerine 5 µl % 37 lik HCl ilave edilmiş, 1 dakika kaynayan su banyosunda bekletilerek hidroliz tepkimesi gerçekleştirilmiştir.daha sonra üzerine 2 µl 5 N 563

4 Ş. Bulut Şekil 2.1. Biyoreaktör Düzeneği 1.Reaktör 2.Karıştırıcı motor 3.Oksijen probu 4.pH probu 5.Sıcaklık sensörü 6.Kondensör 7.Oksijen metre 8.Karıştırma hızı kontrol ünitesi 9.Sıcaklık kontrol ünitesi 1.pH metre KOH ilave edilmiştir. Bu şekilde ortamdaki sakkarozun hidrolizi ile oluşan glikoz ve fruktoz derişimleri DNS yöntemi ile belirlenerek inversiyon tepkimesine göre sakkaroz derişimi hesaplanmıştır Protein derişimi Üretim ortamında toplam protein miktarını belirlemek için, Lowry ve diğ. [9] tarafından verilen yöntem modifiye edilerek kullanılmıştır. Örneklerdeki toplam protein derişimini belirlemek için bovine serum albuminin (BSA) derişimi bilinen örneklerinden yararlanılarak derişim-absorbans kalibrasyon eğrisi hazırlanmıştır. Kalibrasyon eğrisinden yararlanılarak, örnekteki protein miktarı aşağıdaki formüle göre mg/ml olarak hesaplanmıştır. Protein (mg/ml)= (A 66 /eğim) x seyreltme faktörü 3. Bulgular 3.1. Karbon kaynağının etkisi Fermantasyon ile enzim üretimini etkileyen en önemli parametrelerden biri ortam bileşimidir. Ortam bileşenleri içerisinde karbon kaynağı ortam maliyetinin yaklaşık % 6-8 ini oluşturmaktadır [1]. Anaerobik mekanizmaya 564 sahip mikroorganizmalar besi yerindeki karbonun yaklaşık % 1 unu aerobik mekanizmaya sahip olanlar ise % 5-55 ini hücre yapısını oluşturmada kullanırlar. Karbon kaynakları mikroorganizmanın gelişmesi, çoğalması ve biyosentezi için gerekli olan, aynı zamanda mikroorganizmaya metabolik enerji sağlayan bileşiklerdir. Daha önceki çalışmalarda 25 ml lik erlenlerde yapılan deneylerde, T.turnirae den proteaz üretiminin gerçekleştirildiği optimum proses şartları belirlenmiştir [11]. Elde edilen sonuçlar ışığında bu çalışmada da, glikoz ve sakkaroz içeren ortamlarda maksimum aktivitenin elde edildiği 5 g/l derişiminde oluşturulan fermantasyon ortamında proteaz üretimi endüstriyel sistemlere daha yakın olan biyoreaktörde (8 ml çalışma hacmine sahip 1 l lik kesikli biyorektör) gerçekleştirilmiştir. 5 g/l sakkaroz ve 5 g/l glikozdan oluşan fermantasyon ortamında elde edilen enzim aktivitesinin zamanla değişimi Şekil 3.1. de karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Şekil 3.1 den görüldüğü gibi, karbon kaynağı olarak sakkarozun kullanıldığı biyoproses ortamında enzim aktivitesi daha yüksektir. Maksimum enzim aktivitesi 5 g/l sakkaroz derişiminde 167 U/ml, 5 g/l glikoz derişiminde ise 944 U/ml olarak belirlenmiştir.

5 Teredinobacter turnirae den Proteaz Üretiminde Farklı Stratejilerin Araştırılması Aktivite (U/ml) Şekil 3.1. Biyoreaktörde kesikli sistemde enzim aktivitesinin zamanla değişimi (ph:8, Aşı oranı: % 1 v/v, Karıştırma hızı: 5 rpm, Hava giriş hızı:.6 vvm, T: 3 o C, : 5 g/l Sakkaroz, : 5 g/l Glikoz) Şekil 3.4. de sakkaroz ve glikoz derişimlerinin zamanla değişimleri verilmiştir. Şekil 3.4 den görüldüğü gibi glikoz içeren ortamda karbon kaynağının tüketim hızı, sakkarozlu ortama göre daha yüksektir. Bu da ortamda bulunan glikozun mikroorganizma tarafından daha kolay tüketilebildiğini göstermektedir. Ayrıca biyoproseslerde glikoz gibi kolay tüketilen karbon kaynakları ürün oluşumunu baskılayabilmektedir, bu durum elde edilen deney sonuçlarında görülmektedir [13]. Biyoreaktörde kesikli sistem ile PB ortamında T. turnirae den proteaz üretiminde, karbon kaynağı etkisini incelemek amacıyla, karbon kaynağı olarak glikozun veya sakkarozun kullanıldığı deneylerde, sakkaroz içeren biyoproses ortamının proteaz üretimi için daha uygun olduğu belirlenmiştir. Fermantasyon ortamında, karbon kaynağı olarak sakkarozun veya glikozun kullanılması sonucu mikroorganizma derişimindeki değişim incelenmiş; sonuçlar Şekil 3.2. de her iki karbon kaynağı için karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Şekil 3.2 den görüldüğü gibi, sakkaroz kullanılan ortamda mikroorganizma derişiminin daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 5 g/l sakkarozlu ortamda maksimum mikroorganizma derişimi 1.62 g/l olarak ölçülürken, bu değer 5 g/l glikozlu ortamda 1.43 g/l olarak bulunmuştur. T. turnirae den proteaz üretiminde daha önce yapılan optimum proses şartlarını belirleme çalışmalarında olduğu gibi bu çalışmada da proteaz üretimi, mikroorganizmanın büyümesi ile paralel ilerlemiş, dolayısıyla bu durum üretimin biokütle ile ilişkili (growth-associated) olduğunu ortaya çıkarmıştır [11, 12]. Sakkaroz ve glikoz içeren ortamlarda yapılan çalışmalar sonucunda, belirlenen toplam protein derişimleri Şekil 3.3. de verilmiştir. Maksimum protein derişimi sakkarozlu ortamda 1.27 mg/ml, glikoz içeren ortamda ise 1.16 mg/ml olarak ölçülmüştür. Elde edilen sonuçlara göre sakkaroz içeren ortamda ölçülen enzim aktivitesi ve mikroorganizma derişimi, glikozlu ortama göre daha yüksek olduğundan ortamda bulunan toplam protein derişiminin de yüksek olması beklenen bir sonuçtur İndükleyici etkisi Biyoproseslerde besiyerine katılan bazı maddeler mikroorganizmayı uyararak enzim sentezini başlatabilir ya da hızlandırabilir. Özellikle mikroorganizmadan üretilecek enzim substratının besiyerine konulması ile söz konusu enzimin biyosentezi hızlandırılabilir [14]. Bu çalışmada T. turnirae den serin alkali proteaz enzim üretiminde bir indükleyici Mikroorganizma derişimi (g/l) 1,8 1,6 1,4 1,2 1,,8,6,4,2, Şekil 3.2. Biyoreaktörde kesikli sistemde mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi (ph:8, Aşı oranı: % 1 v/v, Karıştırma hızı: 5 rpm, Hava giriş hızı:.6 vvm, T: 3 o C, : 5 g/l Sakkaroz, : 5 g/l Glikoz)

6 Ş. Bulut Toplam protein (mg/ml) 1,4 1,2 1,,8,6,4,2, Şekil 3.3. Biyoreaktörde kesikli sistemde toplam protein derişiminin zamanla değişimi (ph:8, Aşı oranı: % 1 v/v, Karıştırma hızı: 5 rpm, Hava giriş hızı:.6 vvm, T: 3 o C, : 5 g/l Sakkaroz, : 5 g/l Glikoz) Sakkaroz (g/l), Glikoz (g/l) Şekil 3.4. Biyoreaktörde kesikli sistemde substrat derişiminin zamanla değişimi (ph:8, Aşı oranı: % 1 v/v, Karıştırma hızı: 5 rpm, Hava giriş hızı:.6 vvm, T: 3 o C, : 5 g/l Sakkaroz, : 5 g/l Glikoz) karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Şekil 3.5. den görüldüğü gibi, ilave edilen kazein miktarı arttıkça enzim aktivitesi de artmaktadır. Kazein ilave edilmeden 5 g/l sakkaroz derişiminde ulaşılan maksimum aktivite 167 U/ml iken,.1,.2 ve.3 g/l kazein ilavesiyle sırasıyla maksimum aktiviteler 264, 353 ve 3239 U/ml değerindedir..3 g/l kazein ilavesiyle maksimum aktivite, ilave edilmemiş duruma göre yaklaşık 3 kat artmıştır. Bu durumda, kazeinin mikroorganizma tarafından kolaylıkla tüketilebildiği ve enzim sentezinde indükleyici görevi yaptığı sonucuna varılabilir. Elde edilen bu sonuç, daha önce yapılan çalışmalarla da (lipaz üretiminde ortama çeşitli yağların ilave edilmesi) benzerlik göstermiştir [15, 16]. Yapılan deneyler sonucunda, enzim aktivitesi ve substrat tüketiminde elde edilen sonuçlar düzenli bir eğilim gösterirken, mikroorganizma ve protein derişiminde elde edilen sonuçlar düzensiz bir eğilim göstermektedir. Bu nedenle mikroorganizma ve protein derişim sonuçları verilmemiştir. Şekil 3.6. da görüldüğü gibi, ortama kazein ilavesi ile karbon kaynağı olarak bulunan sakkaroz mikroorganizma tarafından, kazein içermeyen duruma göre, daha hızlı bir şekilde tüketilmiştir. Aktivite (U/ml) ilavesiyle elde edilen enzim aktivitesinin daha da arttırılacağı düşünülmüş ve bu amaçla karbon kaynağı denemelerinde, en yüksek aktivitenin elde edildiği 5 g/l sakkaroz içeren besiyerine.1,.2 ve.3 g/l derişiminde kazein ilave edilmiştir. Bu şartlarda enzim aktivitesinin zamanla değişimi Şekil 3.5 de, sakkaroz derişiminin zamanla değişimi de Şekil 3.6 da, kazein içermeyen ortam sonuçları ile 566 Şekil 3.5. Farklı kazein derişimlerinde enzim aktivitesinin zamanla değişimi (ph:8, Aşı oranı: % 1 v/v, Karıştırma hızı: 5 rpm, Hava giriş hızı:.6 vvm, T: 3 o C, : 5 g/l sakkaroz +.1 g/l kazein, : 5 g/l sakkaroz +.2 g/l kazein, : 5 g/l sakkaroz +.3 g/l kazein, : 5 g/l sakkaroz )

7 Teredinobacter turnirae den Proteaz Üretiminde Farklı Stratejilerin Araştırılması Sakkaroz (g/l) Şekil 3.6. Farklı kazein derişimlerinde sakkaroz derişiminin zamanla değişimi (ph:8, Aşı oranı: % 1 v/v, Karıştırma hızı: 5 rpm, Hava giriş hızı:.6 vvm, T: 3 o C, : 5 g/l sakkaroz +.1 g/l kazein, : 5 g/l sakkaroz +.2 g/l kazein, : 5 g/l sakkaroz +.3 g/l kazein, : 5 g/l sakkaroz ) Çalışmanın diğer aşamasında,t. turnirae nin tekrar kullanılabilirliğini incelemek amacıyla mikroorganizma tarafından kullanılan besi yeri her 3 günde aynı özellikte ki taze besi yeri ile steril koşullarda değiştirilmiştir. Biyoproses ortamında, zamanla enzim aktivitesindeki değişim Şekil 3.7 de verilmiştir. Şekil 3.7 den görüldüğü gibi 7 kez uygulanan değiştirme işlemi sonucunda mikroorganizma aktif bir şekilde proteaz üretimini sürdürmüştür. Başlangıçta maksimum aktivite 3. gün sonunda elde edilirken, 4 ve 5. değiştirmeden sonra maksimum enzim aktivitesine çok daha kısa sürede ulaşılmıştır. Bu durum, mikroorganizmanın ilk değişimlerde gelişim evresini tamamlaması ve daha kısa sürede enzim üretimini gerçekleştirmesi ile açıklanabilir. Elibol ve Özer [17] tarafından, R. arrhizus dan lipaz enzimi üretiminde de benzer sonuçlar gözlenmiştir. 4. Sonuçlar 1. Biyoreaktörde kesikli sistem ile PB ortamında T. turnirae den proteaz üretiminde, karbon kaynağı etkisini incelemek amacıyla, karbon kaynağı olarak sakkarozun kullanıldığı deneylerde proteaz üretiminin daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Her iki karbon kaynağında proteaz üretimi, mikroorganizmanın büyümesi ile paralel ilerlemiştir. Toplam protein miktarı da benzer bir eğilim göstermiştir. 2. Sakkaroz içeren fermantasyon ortamına indükleyici olarak.3 g/l kazeinin ilave edilmesi proteaz üretimini yaklaşık olarak 3 kat arttırmıştır. 3. T. turnirae nin tekrar kullanılabilirliğinin incelendiği çalışmalarda, mikroorganizma 7 kez uygulanan besi yeri değişikliği sonucunda yaklaşık 5 saat aktif bir şekilde proteaz üretimini gerçekleştirebilmiştir. Aktivite (U/ml) Şekil 3.7. T. turnirae nin tekrar kullanılabilirliği (Repeated-Batch) 567

8 Ş. Bulut 5. Kaynaklar 1. Taylor, J.M., Richardson, T. (1979). Applications of microbial enzymes in food ssystems and in biotechnology. Advences in Applied Microbiology. 25, Kalisz, M.H. (1988). Microbial Proteinases. Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. 36, Sheppard, G. (1986). The production and uses of microbial enzymes in food processing. progress in industrial microbiology. Elvesier Science Publishers B.V., New York, 23: Imam, S.H., Grene, R.V., Grifin, H.L.(199). Adhesive properties of a symbiont bacterium from a wood-boring marine shipworm. Appl. Environ. Microbiol., 56, Ahuja, S.K.(2). Bioprocess engineering of Teredinobacter turnirae: Effect of morphology on metabolic activities on a marine bacterium. PhD Thesis, University of Maryland, Baltimore County, Dept. Of Chem. And Biochem. Eng., Baltimore, USA. 6. Cotta, M.A., Hespell, R.B.(1986). Proteolytic activity of the ruminal bacterium Butyrivibrio fibrisolvens., Appl. Environ. Microbiol., 52, Grene, R.V., Cotta, M., Griffin, H.L. (1989). A novel symbiotic bacterium isolated from marine shipworm secretes proteolytic activity. Current Microbiology, 19, Miller, G.L.(1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Analytical. Chemistry., 31, Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent., J. Biol. Chem., 193, Rehm, J., Reed, G., Kennedy, J.F.(1987). Biotechnology, 7a, 5-1, Vch. New York. 11. Bulut, Ş. (27). Marinal bakteri Teredinobacter turnirae den proteaz üretimi. Doktora Tezi. Fırat Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 176s. 12. Shuler M., Kargı, F. (22). Bioprocess Engineering, Prentice Hall, 166s. 13. Aunstrup, K., Andresen, O., Falch, E.A., Nielsen, T.K. (1979). Production of microbial enzymes. In: Microbial Technology, Pepler HJ. Perlman D (eds) Vol 1, Academic Press, New York, pp Pimentel M.C.B, Krieger N., Coelho L.C., Fontana J.O., Melo E.H.M., Ledingham W.M., Lima Filho J.L.(1994). Lipase from a Brazilian strain of Penicillium citrinum. Appl Biochem Biotechnol, 49, Bulut, Ş., Tanyıldızı, M.Ş., Özer, D., Elibol, M.,26, Use of different carbon sources in lipase production by Rhizopus oryzae, J. Food Sci. Technol., 43(6), Valero, F., Ayats, F., Lopez-Santin, J., Poch, M. (1988). Lipase production by Candida rugosa: Fermentation behaviour. Biotechnology Letters. 1, Elibol M., Ozer, D. (2). Lipase production by immobilised Rhizopus arrhizus. Process Biochem, 36,