T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ

Transkript

1 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Sonuç Raporu Proje No: 2011/08 Projenin Başlığı Ubikitin Proteozom Sistemine Ait p97/valosin-containing protein (VCP) Ve Etkileşimde Olduğu Proteinlerin Gelişmekte Olan Sıçan Testisi Ve Epididimisindeki Lokalizasyonlarının Ve Ekspresyonlarının Belirlenmesi Proje Yöneticisi Doç.Dr. Sevil ÇAYLI Birimi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD Araştırmacılar ve Birimleri Uzm. Hakan Kesici Uzm. Zafer Karaca Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD (ARALIK / 2012) 1

2 ÖZET Ubikitin Proteozom Sistemine Ait p97/valosin-containing protein (VCP) Ve Etkileşimde Olduğu Proteinlerin Gelişmekte Olan Sıçan Testisi Ve Epididimisindeki Lokalizasyonlarının Ve Ekspresyonlarının Belirlenmesi Bone morfogenetik protein ailesi (BMP) ve ubikütin proteazom sistem (UPS) üyelerinin sıçan testis ve epididimis gelişimi boyunca farklı biyolojik fonksiyonlarının olduğu bilinmektedir. Bizim son çalışmalarımızdan bir tanesinde, fare ve insan hücrelerinde Jab1/CSN5 in p97/vcp ye direk olarak bağlandığı ve Jab1/CSN5 in p97/vcp ye bağlanmış ubikütinlenmiş proteinleri kontrol ettiği gösterilmiştir. Fakat p97/vcp nin Jab1/CSN5 ile olan ilişkisi ve p97/vcp nin Jab1/CSN5 harici diğer başka proteinlerle olan ilişkisi bugüne kadar çalışılmamıştır. Smad1, BMP sinyal yolağında çalışan UPS deki birçok proteinlerle etkileşebilen bir proteindir. Valosin-containing protein (p97/vcp), UPS substratlarının proteasomda parçalanmasını sağlayan şaperon bir proteindir. p97/vcp nin birçok hücresel yolakta farklı fonksiyon gördüğü bilinse de, BMP sinyal yolağı ile olan ilişkisi postnatal sıçan testisinde gösterilmemiştir. Bu çalışmanın amacı UPS proteinlerinin (p97/vcp, ubiquitin, Jab1/CSN5) ve BMP ailesine ait proteinlerin (Smad1 ve fosfo Smad1) in postnatal sıçan testis ve epididimisinde hücresel lokalizasyonlarının belirlenmesi ve Smad proteinleri ile UPS proteinleri arasındaki etkileşimin araştırılmasıdır. Postnatal 5-, 15-, 30- and 60-günlük sıçan testis ve epididimisleri üzerinde immunohistokimya, immunofloresan, Western blot ve immunopresipitasyon teknikleri uygulandı. 5 günlük sıçan testisinde, Smad1, fosfo-smad1, p97/vcp, Jab1/CSN5 and ubiquitin gonosit ve Sertoli hücrelerinde ekspre edilmektedir. 15-, 30- and 60-günlük sıçan testisinde, p97/vcp ve Jab1/CSN5 and p97/vcp ve fosfo-smad1 proteinlerinin spermatogonia, Sertoli hücreleri ve spermatositlerde birlikte kolokalize olduğu bulunmuştur. Sertoli hücre markerları ile p97/vcp ve Smad1 proteinlerinin Sertoli hücrelerindeki spesifik lokalizasyonu gelişmekte olan sıçan testisinde belirlendi. Epididimisde, bu proteinlerin ekspresyonlarının 5. Günden 60. güne doğru arttığı gösterildi. Smad1 ekspresyonunda epididimisin farklı bölgelerinde aynı tip dağılım gözlenirken, p97/vcp immunoreaktivitesinin kaput epididimisinde korpus ve kauda epididimise göre daha yüksek olduğu 15 ve 60 günlük sıçan epididimisinde bulundu. Koimmunopresipitasyon deneyleri, Smad1-p97/VCP ve p-smad1- p97/vcp etkileşimini sıçan testisinde doğruladı. Sonuç olarak, postnatal sıçan testisi ve epididimisindeki bazı Smad proteinleri (Smad1 ve p-smad1) ve UPS proteinleri (p97/vcp, JAb1/CSN5, ubiquitin) arasındaki etkileşimin bulunması, UPS in BMP sinyal yolağını spermatogenez boyunca kontrol edebileceğini göstermektedir. Anahtar kelimeler: p97/vcp, Jab1/CSN5, UPS, Smad, sıçan testis, epididimis ii

3 ABSTRACT The determination of localization and expression of Ubiquitin Proteasome System protein, p97/valosin-containing protein (VCP) and its interacting partners in the developing rat testis and epididimis Members of the bone morphogenetic proteins (BMPs) and ubiquitin proteasome system (UPS) family are known to have different biological functions during rat testicular and epididymal development. Recently published data show that Jab1/CSN5 interacts with p97/vcp and controls the ubiquitination status of proteins bound to p97/vcp in mouse and human cells. However, coexpression of p97/vcp and Jab1/CSN5 in the developing rat testis and epididymis has not previously been studied. Smad1 is one of the signal transducers of BMP signaling and binds to several proteins involved in ubiquitin proteasome system (UPS). Valosin-containing protein (p97/vcp) is required for the degradation of some UPS substrates. Although p97/vcp has been indicated in different cellular pathways, its association with BMP signaling in male reproductive system has not been elucidated. The aim of the present study was to investigate the cellular localization of Smads (Smad1 and psmad1), the UPS proteins (p97/vcp, ubiquitin, Jab1/CSN5) and the interaction of proteins in the postnatal rat testis and epididymis. Testicular and epididymal tissues from 5-, 15-, 30- and 60-day-old rats were examined by immunohistochemistry, immunofluorescence, Western blotting, and immunoprecipitation techniques. In 5-day-old rat testis, Smad1, phospho-smad1, p97/vcp, Jab1/CSN5 and ubiquitin were mainly expressed in gonocytes and Sertoli cells. In 15-, 30- and 60-day-old rat testis, p97/vcp, Jab1/CSN5 and phospho-smad1/5/8 were overlapped in spermatogonia, Sertoli cells, and spermatocytes. Sertoli cell markers showed the colocalization of Smad and p97/vcp in the developing rat testis. Expression of proteins in the epithelial cells of epididymis was gradually increased from 5 to 60 days of age. Expression of Smads showed uniformity in the different regions of epididymis, however p97/vcp immunoreactivity were higher only in caput epididymis compared to corpus and cauda epididymis in 15- and 60-dayold rat epididymis. Co-immunoprecipitation experiments further confirmed the Smad1- p97/vcp, p-smad1- p97/vcp and ubiquitin-p97/vcp interactions in rat testis. The interaction between some of Smad proteins (Smad1 and phospho-smad1) and UPS proteins (p97/vcp, JAb1/CSN5, ubiquitin) in the postnatal rat testis and epididymis suggests that UPS may play important roles in mediating BMP signaling during spermatogenesis. Key words: p97/vcp, Jab1/CSN5, UPS, Smad, rat testis, epididymis iii

4 ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR) Proje yürütücüsü, bu çalışmanın gerçekleşmesine katkılarından dolayı, aşağıda adı geçen kişi ve kuruluşlara içtenlikle teşekkür eder. Projemizi başından sonuna kadar destekleyen GOP Universitesi BAP yöneticilerine ve tüm çalışanlarına, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı nın tüm çalışanlarına, Tıp Fakültesi Biyokimya ABD. tüm öğretim üyelerine hücre ekstratı hazırlamak için kullanılan homojenizatörü bizlerle paylaştıkları için teşekkür ederim. KBB AB. üyelerinden sayın Doç. Dr. Ahmet Eyibilen, kendi projesinde kullandığımız AEC kromojeni ve kapatma solusyonunu bizim projemizde kullanmamıza izin verdiği için teşekkür ederim. iv

5 İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZET ii ABSTRACT iii ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR) iv İÇİNDEKİLER DİZİNİ v SİMGELER VE KISALTMALAR vii ŞEKİLLER DİZİNİ ix ÇİZELGELER DİZİNİ x GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER Protein Yıkımı Übikütin Protazom Sistemi (UPS) VCP Bağımlı Protein Yıkımı p97/vcp in otofagozom oluşumundaki rolü p97/vcp nin selektif otofajiyi yönetmesi p97/vcp ve Patalojisi p97/vcp ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları COP9 Signalozom (CSN) CSN in Metalloproteaz Ve Denedilaz Aktivitesi CSN İlişkili Protein Kinaz Ve Deübikütinlasyon Aktivitesi Çalışmanın amacı 10 MATERYAL VE METOD Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları Deney Aletleri Ve Markaları Kromojenler Deney hayvanlarının sakrifiye edilmesi İmmunohistokimya İmmunofloresan Çiftli boyama Protein Biyokimyası İle İlgili Methodlar Hücre Ekstraktının Hazırlanması Protein Konsantrasyonunun Belirlenmesi (Bradford Yöntemi) D-SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi İmmunoblotlama Komasi Mavi Boyası Immün-çökeltme (Ko-immunopresipitasyon) 18 İSTATİKSEL ANALİZ Semiquantitative HSCORE analizi 20 BULGULAR Postnatal sıçan testisinde p97/vcp ekspresyonun belirlenmesi 21 v

6 4.2. Postnatal sıçan testisinde p97/vcp ile ilişkili proteinlerin ekspresyonun belirlenmesi p97/vcp ve Jab1/CSN5 birlikte lokalizasyonlarının postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde belirlenmesi Postnatal gelişmekte olan Sertoli hücrelerinde p97/vcp ve Jab1/CSN5 nın immunolokalizasyonları Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde übikütin immunolokalizasyonları Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde. p97/vcp immunolokalizasyonları Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde Jab1/CSN5 immunolokalizasyonları Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde Bone morfogenetik protein (BMP) ailesi üyelerinin p97/vcp ile ilişkisinin belirlenmesi p97/vcp ve Smad1 in birlikte lokalizasyonlarının postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde belirlenmesi Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde Smad1 ve p97/vcp proteinleri arasındaki etkileşimin birlikte çökeltme (ko-immunopresipitasyon ) ile belirlenmesi Smad1 ın übikütinlenmesi ve p97/vcp ile bağlanması 33 TARTIŞMA 35 KAYNAKLAR 40 EKLER 47 vi

7 SİMGELER VE KISALTMALAR aa : Aminoasit APS : Amonyum persülfat ATP : Adenosin 5'-trifosfat bp : Baz çifti BSA : Sığır serum albumin cdna : Komplementer DNA COP : Sürekli fotomorfogenez cpla2 : sitosolik fosfolipaz DNA : Deoksiribonükleik asit DTT : Ditiotereitol DUB : Deübikütinaz ECL : Kemiluminisans EDTA : Etil diamin tetraasetik asit ERAD : Endoplasmik retikulum ilişkili yıkım ERK1/2 : Ekstrasellular sinyal-regüle edici kinaz1/2 FCS : Fetal sığır serumu HRP : Horse radish peroksidaz JAB1 : c-jun-aktivasyon domain-bağlayıcı protein 1 JNK : c-jun N-terminal kinaz kb : Kilo baz. kd : Kilo Dalton LPS : Lipopolisakkarid M : Molar MAPK : Mitojen-aktive edici protein kinaz MES : Morfolin etan sülfonik asit MIF : Makrofaj göçünü engelleyici faktör MOPS : 3-(N-Morpolin)-propan sülfonik asit mrna : haberci RNA NaCl : Sodyum klorit NCBI : Uluslarası Biyoteknoloji Bilgi Servisi NHS : Normal at serumu NP-40 : Nonidet P-40 PAGE : Poliakrillamit jel elektroforesi PBS : Fosfat buferli tuz PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu PFA : Paraformaldehit ph : -log c[h + ] PMSF : Fenilmetilsülfonil florit PVDF : Polivinlidenflorit RNA : Ribonükleik asit RNAi : RNA interferans vii

8 RNase : Ribonükleaz rpm : Revolutions per minute SDS : Sodyum dodesilsülfat TE : Tris-EDTA TEMED : N-N -N -Tetrametilendiamin TNF-α : Tümor nekroz faktörü alfa Tris : Tris (hidroksimetil)-amino-methan UPS : Übikütin protazom sistem UV : Ultraviolet V : Volt VCP : Valosin-içeren protein wt : vahşi tip µ : Mikro viii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa Şekil Übikütin Sinyali 2 Şekil VCP nin yapısal domainleri. 3 Şekil 1.7.1: p97/vcp nin çoklu fonksiyonları. 7 Şekil CSN subunitelerinin birbiriyle ilişkileri. 8 Şekil 4.1.1: Postnatal 5 (A), 15 (B), 30 (C ve D) ve 60 (E ve F) günlük sıçan testisinde p97/vcp lokalizasyonları. 21 Şekil 4.2.1: Postnatal 5 (G), 15 (H), 30 (I) ve 60 (J-L) günlük sıçan testisinde Jab1/CSN5 lokalizasyonları. 22 Şekil 4.5.1: Postnatal 5 (A), 15 (B) ve 60 (C) günlük sıçan testisinde übikütin lokalizasyonları. 23 Şekil 4.6.1: Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) v e 60 (J-L) günlük sıçan epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) bölgelerindeki p97/vcp immunolokalizasyonları 24 Şekil 4.7.1: Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) ve 60 (J-L) günlük sıçan epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) bölgelerindeki Jab1/CSN5 immunolokalizasyonları. 20 Şekil 4.8.1: Postnatal 5 (A, B, G), 15 (C, D, H), 30(I) ve 60 (E, F, I) günlük sıçan testisinde Smad1 ve fosfo-smad1 lokalizasyonları. 22 Şekil Smad1 ve p97/vcp nin gelişmekte olan postnatal sıçan testisinde birlikte lokalizasyonları. 32 Şekil Smad1 in p97/vcp ye gelişmekte olan sıçan testisi ve epididimisinde in vivo bağlanması. 33 Şekil Sıçan testisinde ubikütünlenmiş p-smad1 in p97/ Valosin-containing protein (p97/vcp) ile bağlanması. 34 ix

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Tablo Sayfa p97/vcp ile İlişkili Patolojiler 6 x

11 GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER 1.1. Protein Yıkımı Protein yıkımı, hücre içerisindeki proteinlerin steady-state diye adlandırılan normal düzeylerinde fonksiyon görmelerini sağlamak amacıyla işleyen düzenli bir mekânizmadır. Ökaryotlarda protein yıkımı, hem sitoplâzmada hem de çekirdek Übikütin Protazom Sistemi (UPS) ve onun düzenleyici proteinleri sayesinde gerçekleşmektedir. Bu düzenleyici proteinler arasında hem COP9 signalozom (CSN) hem de p97/valosin containing protein (VCP) belirli substratların yıkımını kontrol etmektedirler (Ye ve arkd., 2001; Wei ve Deng, 2003). Jab1/CSN5, p27kip, Lutenize edici hormon reseptörü (LHR), p53, östrojen reseptörü, Smad4, Smad7, Id1, Id3 ve IκBα gibi birçok proteinin proteazoma bağlı yıkılımına yardımcı olmaktadır (Li ve arkd., 2000; Wan ve arkd., 2002; Berse ve arkd., 2004; Kim ve arkd., 2004; Yun ve arkd., 2004; Callige ve arkd., 2005) Übikütin Protazom Sistemi (UPS) UPS, ökaryotlarda hücreiçi düzenleyici proteinlerin seviyelerini kontrol etmede önemli bir fonksiyona sahiptir. UPS in übikütinleme ve übikütinlenmiş proteinlerin yıkımı olmak üzere iki temel fazı vardır. İlk übikütinleme fazında, übikütin (Ub) ATP yardımıyla übikütin aktive edici enzimin (E1) sistein kuyruğuna eklenir ve sonra übikütin bağlayıcı edici enzimin (E2) sistein kuyruğuna transfer edilir. Son olarak ise, übikütin, protein ligaz (E3) sayesinde substratın lizin kuyruğuna transfer edilir. Ub, substrata izopeptid bağı ile bağlanır. Ub aktivasyonu ve ligasyonu, Ub nin son aminoasidinin (G76) karboksil grubunda gerçekleşir (Şekil 1.2.1) (Pickart, 2001b, a). Tek bir übikütin molekülünün substrata eklenmesi (monoübikütinleme) ise, lizozomal sınıflandırma, gen ekspresyonu ve endositoz gibi substratın farklı görevlerde iş yapmasına neden olmaktadır (Schnell ve Hicke, 2003) 1

12 Şekil Übikütin Sinyali A: Übikütin, übikütin aktive edici enzim (E1) ile aktive edilip ve sonra übikütin bağlayıcı enzime (E2) transfer edilir. Substrat (mavi kutu) ve E2 enzimi özgün olarak übikütin protein ligaza bağlanabilirler ve de aktive olmuş übikütin substrata transfer olur. B: E3, substrata ve E2 ye farklı alanlarda bağlanır. Substrat, übikütinlenme sinyalı ile tanınır. C: Proteolizin gerçekleştiği 26S protazom, 19S kapak kısmı ve esas proteolitik aktiviteye sahip 20S kısmından oluşur. Proteoliz öncesi 19S kapakla bağlantılı deübikütinleyici enzimler ile substratdan übikütin zincirlerinin uzaklaşması sağlanır (Meusser ve arkd., 2005). UPS siklusunun ikinci fazında, protazom poliübikütin zincirleri sayesinde, substratı tanır. Substrat, küçük peptidlerine yıkılır ve Ub nin özgün deübikütinleyici enzimi sayesinde geri eldesi sağlanır. Ub nin substrata konjugasyonu gibi, proteazomal yıkım da, ATP bağımlıdır. 26S proteazomun, hem übikütinlenmiş proteinlerin übikütinden ayrılması hem de onların yıkımlarının katalizlenmesinde önemli bir görevi vardır (Schwechheimer ve Deng, 2001; Pickart ve Cohen, 2004). Protazom, birbirine bağlı 2 farklı bölümden oluşmuştur (Figure 1.2.1C). 20S silindirik temel bölüm, proteolitik aktiviteye sahip iken, silindirik bölümün alt ve üst kısımlarına yerleşmiş 19S lik proteazom kapakları poliübikütinlenmiş substratın tanınması ve proteoliz görevini üstlenmişlerdir. Herbir 19S kompleksi, 6 tanesi ATP az aktivitesine sahip subuniteden oluşmuştur. 2

13 1.3. VCP Bağımlı Protein Yıkımı 97-kDa luk Valosin-içeren protein (p97 ve ya VCP), übikütin-protazom sistemine bağlı proteolizde önemli fonksiyonlara sahiptir. Bu proteoliz, VCP nin, übikütin ve kofaktörleri ile ilişkisine bağlıdır. VCP, UPS de şaperon protein olarak görev yapmaktadır. Toplam hücresel proteinin 1% den fazlasının VCP olduğu bilinmektedir. VCP, tip II AAA (ATPases Associated with a variety of Activities: Birçok aktivitesi bulunan ATPazlar) ATPaz ailesine ait bir proteindir ve AAA domaini olarak adlandırılan iki ATPaz domainine sahiptir (Neuwald ve arkd., 1999; Zwickl ve Baumeister, 1999; Vale, 2000; Maurizi ve Li, 2001; Ogura ve Wilkinson, 2001). VCP çeşitli türlerde farklı isimlerle anılmaktadır. Örneğin: arkebakteride VAT, mayada CDC48, Drosophilada TER94, memeli ve bitkilerde ise p97 ve ya VCP olarak bilinmektedir (Frohlich ve arkd., 1991; Pamnani ve arkd., 1997). VCP, N-terminal domain (N), iki tane ATPaz domaini (D1 ve D2) ve de C-terminal domaini (C) olmak üzere dört domainden oluşmuştur. N terminal domaini, poliübikütin zincirlerine bağlanma ve substrat tanınmasından sorumlu iken, D1 ve D2 domainleri, VCP nin şaperon aktivitesinden sorumludur (Figure ) (Wang ve arkd., 2003). Şekil VCP nin yapısal domainleri. A: Walker A, B: Walker B ve SRH: VCP nin D1 ve D2 domainlerindeki ikinci bölge homoloji motifleri. (Wang ve arkd., 2004). Elektron mikroskobu çalışmaları, VCP nin silindirik şekilli homo hekzemerik yapıda olduğunu kanıtlamıştır (Wang ve arkd., 2003). VCP, hücre içerisinde birçok aktivitede görev yapmaktadır: hücresiklusu gelişimi (Cao ve Zheng, 2004), mitoz sonrası membrane kaynaşması ve iğ ipliklerinin ayrılması (Kondo ve arkd., 1997; Cao ve arkd., 2003; Wojcik ve arkd., 2004), yanlış katlanmış proteinlerin ER dan geri atılımı (Ye ve arkd., 2001; Braun ve arkd., 2002; Jarosch ve arkd., 2002), proteazomda poliübikütinlenmiş proteinlerin degrade edilmesi (Ghislain ve arkd., 3

14 1996; Dai ve Li, 2001) ve transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu (Hitchcock ve arkd., 2001; Rape ve arkd., 2001). VCP, kofaktörlerinin de yardımıyla, übikütinlenmiş proteinlere özgün olarak bağlanır ve bu proteinlere 26S protazomda degrede olmadan önce, şaperonluk yaparak onlara yol gösterir. Substrat übikütinlenmesinden sonra, VCP protein komplekslerini birbirinden ayırmak için ATP yi kullanır ve proteinlerin protazoma yönlenmesini sağlar. Örneğin: Herhangi bir şekilde stimüle edilmeyen hücrelerde, NF-κB sitoplâzmada inaktif formda inhibitör IκB proteini ile etkileşim halindedir (Karin ve Ben-Neriah, 2000; Santoro ve arkd., 2003). Sitimulasyona cevap olarak, NF-κB aktive olur ve IκBα hızlıca fosforile olup, poliübikütinlenir (Karin ve Ben-Neriah, 2000). Bunu takiben, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα ya bağlanır ve onu NF-κB kompleksinden ayırır (Dai ve arkd., 1998). IκBα nın NF-κB dan ayrılmasından sonra, NF-κB hedef genin regülâsyonu nedeniyle nükleusa transfer edilir. Bu arada, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα ya şaperonluk yaparak, onun 26S proteazomda yıkımı için yol gösterir (Dai ve arkd., 1998) p97/vcp in otofagozom oluşumundaki rolü Otofaji, uzun süreli hücrede depo edilen proteinleri, makromolekülleri ve ya hasarlı organelleri elimine etmek için ökaryotlarda kullanılan evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir. Otofaji, genelde hücrenin yaşamını sürdürmesi amacıyla açlık, çeşitli stres ve hücrede emekliye ayrılmış dokuları ortadan kaldırmak amacıyla kullanılır. Otofajinin 3 tipi vardır.1-şaperon aracılı otofaji 2-Makrootofaji 3-Mikrootofaji. Şaperon aracılı otofaji, yüksek ökaryotik canlılarda görülür ve lizozomda sitosolik proteinlerin yıkımına sebep olur. Makrootofaji ise çift membranlı, sitoplazmik materyali yutup bu materyalin yıkımı için lizozom ve ya vakuol ile birleşebilen otofagozomun oluşumu ile karakterizedir. Mikrootofaji ise vakuol ya da lizozom oluşumu ile sitosolik kompartmanların direk yıkımı ile ilişkilidir. Bugüne kadar, mayada 35 tane Autophagy related genes (ATG) (ATG1 den ATG35 e kadar tanımlanmıştır. Bunlardan Atg8 (memelideki karşılığı LC3), otofagozom oluşumu için gereklidir. p97/vcp nin otofagozom maturasyonundaki rolü ilk memeli hücrelerinde, p97/vcp nin N terminal ve D1 domainlerinde mutasyonunun neden olduğu IBMPFD hasta 4

15 lığında ortaya çıkmıştır. IBMPFD li VCP mutasyonu gösteren hücrelerde otofagozom markerlerının LC3II ve p62 nin fazlaca ekspre edildiği görülmüştür. p97/vcp, sirna yöntemiyle nakdavn edildiğinde, p62 ve LC3II nin hücre sitoplazması içerisinde toplandığı saptanmıştır. Bütün bunlar p97/vcp nin otofajik protein degradasyonunda gerekli bir protein olduğunu göstermektedir. Aynı zamanda, p97/vcp nin otofagozom-lizozom füzyonunda ve otolizozom oluşumunda gerekli olduğu çalışılmıştır. p97/vcp mutant hücrelerin otofagozomlarında ubiquitinin toplandığı görülmüş ve p97/vcp nin ubikütinlenmiş substratların otofajik degradasyonları için gerekli olabileceğini önermektedir. Fakat p97/vcp aracılı otofagozom-lizozom füzyonunun mekanizması ve ya bazı otofagozom ilişkili proteinlerin ubikütin benzeri domainler ile ilişkisi tam olarak açıklanamamıştır p97/vcp nin selektif otofajiyi yönetmesi Mitokondri ve peroksizomlar mitofaji ve pekzofaji olarak bilinen yöntem ile yıkılmaktadırlar. Nükleusun bir kısmı, 60S ribozomal ünite ve endoplazmik retikulum yine otofaji yöntemiyle yıkılmaktadır (Dargemont C, 2011, Paris). Maya hücrelerinde yapılan çalışmada, nitrojen yokluğunda olgun ribozomların 60S ünitelerinin degrade olduğu gösterilmiştir. Mitofaji ile ise hasarlı ve ya fonksiyon görmeyen mitokondrinin eliminasyonu sağlanmaktadır. Birçok mitokondriyal proteinin (Atg32, Atg11 ) stress ve ya yaşlılık gibi durumlarda otofajik yıkım için devreye girdiği bilinmektedir. Memeli hücrelerinde mitokondrilerin iş görmemesi Parkinson hastalığı gibi önemli nörodejenaratif patolojiler ile ilişkilendirilmiştir. PARK2 gen ürünü olan Parkin nin mutasyona uğraması, Parkinson hastalığı ortaya çıkmaktadır. Parkin hasarlı mitokondrilerin toplanması ve fonksiyon görmeyenlerin eliminasyonu için gereklidir. p97/vcp ninde, Parkin aracılı mitokondriyal yıkım için gerekli olduğu belirlenmiştir. p97/vcp nin aynı zamanda, hasarlı mitokondriyal membranlarındaki ubikütinlenmiş proteinleri membranlardan ayırıp proteasomda degrade olabilmelerini sağlamaktadır. p97/vcp nin endoplasmik retikulumun ve nükleusun bir parçasının yıkımında da fonksiyon görebileceği gösterilmiştir. 5

16 1.6. p97/vcp ve Patalojisi p97/vcp nin birçok hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır. p97/vcp ile ilişkili, birçok hastalığın farklı sistem ve organlardaki dağılımı Tablo de gösterilmiştir (Lue ve arkd., 2002). Bu hastalıkların çoğunda VCP geninin ilgili bölgesinde mutasyonlar saptamıştır. Tablo p97/vcp ile İlişkili Patolojiler Sistem ve organlar Kemik ve eklemler Kas Beyin Göz Beyin Patoloji Paget hastalığı Inklüzyon cisimcik miyopati Frontotemporal demans Katarak Parkinson, Alzhmeir, ALS 1.7. p97/vcp ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları Birçok proteinle olan ilişkisi nedeniyle, p97/vcp hücrede çok çeşitli aktiviteler göstermektedir (Şekil 1.7.1). Bu şekilde, p97/vcp nin protein degradasyonu, hücre siklusu kontroli, otofaji gibi birçok önemli fonksiyonu yerine getirdiği özetlenmiştir. 6

17 Şekil 1.7.1: p97/vcp nin çoklu fonksiyonları. p97/vcp ve kofaktörleri birçok biyolojik fonksiyonun yerine getirilmesinde görev alırlar. Sarı yuvarlak içindekiler: membran oluşumu ile ilgili fonksiyonları. Mavi ve yeşil yuvarlak içindekiler: Protein yıkımı ile ilgili fonksiyonları, Pembe daire içindekiler: Hücre siklusu ve DNA nın işlenmesi ile ilgili fonksiyonları göstermektedir COP9 Signalozom (CSN) CSN, UPS in en önemli üyelerinden birisidir. Deng ve arkadaşları, 1994 ilk olarak, Arabidops larda (COP: constitutive photomorphogenesis: sürekli ışıkla değişim), ışık bağımlı gelişimin baskılayıcısı olarak tanımlanmıştır (Wei ve arkd., 1994; Wei ve Deng, 1999). Jab1/CSN5 içeren signalozom olarak da bilinen memeli CSN kompleksi, izole edilip, 26S proteazom ile birlikte saflaştırılmıştır (Seeger ve arkd., 1998). CSN, gel filtrasyon kolonlarında, kda moleküler ağırlığında olduğu saptanmış ve CSN1 den CSN8 e kadar 8 subuniteden oluşmuştur (Şekil 1.9.1). CSN subunitelerinin en belirgin karakteristik özellikleri, PCI/PINT (Proteazom, COP9 signalozom, Initiation factor 3/Proteazom subunits, Int-6, Nip-1, ve TRIP-15) ve MPN/MOV34 (Mpr1 Pad1-N-terminal) domainlerinin bulunmasıdır (Aravind ve Ponting, 1998). Bu iki domain aynı zamanda, CSN yanında, 26S proteazom kapak kompleksinde ve ökaryotik translasyon başlatıcı faktör 3 (eif3) de de bulunmuştur (Glickman ve arkd., 1998; Wei ve arkd., 1998). Ökaryatik hücrelerde, lizozomal olmayan protein yıkımından sorumlu 26S proteazom (detaylar için 1.10 da Şekil C ye bakınız,), 20S kor ve 19S 7

18 düzenleyici iki kısımdan oluşmuştur. İlginç olarak, sekiz CSN subunitelerinin herbiri, 19S düzenleyici bölümün kapak kısmındaki unitelerle homoloji göstermektedir. Bu homoloji, CSN ve proteazom kapağının, evrimsel olarak aynı atadan gelebileceğini göstermektedir. Şekil CSN subunitelerinin birbiriyle ilişkileri. MPN domainine sahip olan subuniteler mavi, PCI domainine sahip olanlar ise sarı ile gösterilmiştir. CSN2 ve CSN7 nin fosforilasyonu ise kırmızı ile belirtilmiştir. CSN nin aşağıda açıklanan birçok biyokimyasal aktiviteleri vardır: CSN in Metalloproteaz Ve Denedilaz Aktivitesi Jab1/CSN5, JAMM (Jab1/MPN domain-associated metalloisopeptidase: Jab1/MPN domain-ilişkili metaloizopeptidaz) ya da MPN olarak bilinen metalloproteaz motifini içerir. Bu motifdeki mutasyonun, metalloproteaz aktivitesini engellediği görülmüştür. Benzer bir şekilde, proteazom kapağında yer alan, Jab1/CSN5 paralogu olan ve 26S proteasomun deübikütinleme aktivitesinden sorumlu RPN 11 nın da, aynı motifi içerdiği bilinmektedir (Verma ve arkd., 2002). Diğer bazı proteinlerde, JAMM/MPN motifine sahip olmalarına rağmen (Maytal-Kivity ve arkd., 2002; McCullough ve arkd., 2004; Bellare ve arkd., 2006), bu proteinlerin metalloproteaz aktivitesi göstermedikleri saptanmıştır. Hem Jab1/CSN5 hem de RPN11, ancak CSN kompleksi ya da 26S proteazom yapısında bulundukları zaman bu aktiviteyi gösterdikleri belirlenmiştir (Cope ve arkd., 2002). Jab1/CSN5 ve RPN11 in metalloproteaz aktiviteleri, deübikütinleme ve denedilasyon aktiviteleri ile uyumlu bir şekilde yönetilmektedir. 8

19 Moleküler biyololojide ilgileri çeken CSN nin diğer bir önemli fonksiyonu da, Jab1/CSN5 in MPN motifinden dolayı, SCF kompleksinin denedilasyonunda görev almasıdır. SCF übikütin ligaz kompleksi, CSN nin temel hedefidir. SCF, hedef proteine übikütinin eklenmesinde görev yapan bir E3 übikütin ligazdır. Übikütin eklenmesine benzer bir şekilde, nedilasyon, Nedd8 aktive edici enzimler ile katalize edilmektedir. Fakat, denedilasyon ise Jab1/CSN5 in metaloisopeptidaz aktivitesi ile katalize edilmektedir (Cope ve arkd., 2002). Nedilasyon ve denidilasyonun aktif bir şekildeki bu siklusu, SCF aktivitesinin sağlanması için gereklidir CSN İlişkili Protein Kinaz Ve Deübikütinlasyon Aktivitesi CSN nin c-jun (Ser63 ve Ser73), IκBα, NF-κB prekürsörü p105 i ve de tümör supresörü p53 (Ser149, Thr 150 ve Thr 155) ü fosforladığı in vitro olarak gösterilmiştir (Seeger ve arkd., 1998; Bech-Otschir ve arkd., 2001). Aynı zamanda, bazı CSN subuniteleri üzerinde fosforlanma alanları bulunmasından dolayı da, CSN nin kendisi de fosforlanmaya hedefdir (Henke ve arkd., 1999). Son olarak, übikütin isopeptidaz aktivitelerinin CSN ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (Groisman ve arkd., 2003; Zhou ve arkd., 2003; Hetfeld ve arkd., 2005; Schweitzer ve arkd., 2007). CSN nin deübikütinleme aktivitesi iki yolla açıklanmaktadır: CSN ya monoübikütinlenmiş substratlardan übikütinin ayrılmasını ya da poliübikütin zincirlerinin depolimerize olmasını sağlar (Groisman ve arkd., 2003). CSN nin bu ilk aktivitesi, Jab1/CSN5 indeki metaloproteaz domainine ihtiyaç duyarken (Groisman ve arkd., 2003), sonraki aktivitesi ise tüm CSN ile ilişkilidir (Zhou ve arkd., 2003; Hetfeld ve arkd., 2005; Schweitzer ve arkd., 2007). Kısacası, CSN hem denidilasyon hem de deübikütinlasyon aktivitelerine ya kendisi sahiptir ya da diğer deübikütinleyici enzimlerle ilişkide olması nedeniyle yürütmektedir. 9

20 1.9. Çalışmanın amacı p97/vcp nin, yukarıdaki bölümde detaylı bir şekilde anlatıldığı gibi hücreiçi birçok temel fonksiyonu yerine getirdiği bilinmektedir. Fakat p97/vcp nin erkek üreme hücrelerinde ve testisde ekspresyonu ve etkileşimde olduğu proteinler çalışılmamıştır. Bu nedenle bu çalışmada öncelikle biz p97/vcp nin gelişmekte olan sıçan testisinde ekpresyonunu göstermeyi, ikincil olarak da p97/vcp nin bağlandığı ya da etkileşimde olduğu ya da olabileceği proteinlerin postnatal sıçan testisinde ekspresyonlarını incelemeyi amaçladık. 10

21 MATERYAL VE METOD Projemizin bu bölümünde, deneyler boyunca kullanılan sarf malzemeler ve ait oldukları kaynaklar ayrı başlıklar halinde verildi Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar Asetik asit Akrilamid 30% Kloroform Komasi Mavisi Boyası 1,4-Ditiotetritol Etanol Igepal CA-630 (NP-40) Magnezyum klorid Magnezyum sülfat Mangan klorid β-merkaptoethanol Methanol Morfolinethan sülfonik asit Süttozu Formaldehit Fenilmetilsülfonilflorid Ponseu S Potasyum klorit Sodyum klorid Sodyum dodesil sülfat Tris Triton X-100 Tween-20 Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich, Steinheim Roche, Mannheim Sigma-Aldrich, Steinheim Sigma-Aldrich, Steinheim Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich, Steinheim Merck, Darmstadt AppliChem, Darmstadt Sigma-Aldrich, Steinheim Serva, Heidelberg Bio-Rad, München Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich, Steinheim Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich, Steinheim Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Steinheim Roth, Karlsruhe 2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları Primer antikorlar Firması Dilusyon oranı Rabbit α-jab-1 Santa Cruz, USA 1:500 α-biotin-hrp Amersham, Freiburg 1:1,500 Mouse α-vcp ABR, USA 1:1,000 Rabbit α-vcp Santa Cruz, USA 1:200 Rabbit α-ubiquitin Abcam 1:200 Rabbit α-p27 Biomol, Hamburg 1:1,000 13

22 Mouse α-p27 Santa Cruz, USA 1:3,000 Rabbit α-sitokeratin 18 Abcam, UK 1:250 Rabbit α-smad1 Axxora, USA 1:500 Rabbit α-p-smad1 Abcam, UK 1:500 Sekonder antikorlar Goat α-rabbit-hrp ICN, Ohio, USA 1:10,000 α-rabbit IgG-Rhodamine Chemicon, Hampshire, UK 1:1,000 α-mouse IgG-FITC Dianova, Hamburg 1:1,000 Rabbit α-mouse IgG Cell Signaling, USA 1: Deney Aletleri Ve Markaları Hassas terazi Microdalga fırını Mini santrifüj Floresan mikroskobu Power supply uniteleri Pre-Kast Gel Sistemi SDS jel elektroforez uniteleri IBlot kuru blotlama unitesi Orbital karıştırıcı Shaker Mikrotom Etuv 2.4. Kromojenler DAB (Diaminobenzidine) AEC Fast red Korn ABJ, Turkiye Arcelik, Turkiye Biosan, Turkiye Nikon, Almanya Thermo Scientific Invitrogen, Almanya Invitrogen, Almanya Invitrogen, Almanya Sigma, Almanya Velp Scientifica Leica, Almanya Nüve, EN500 Sigma, Germany Syctek Lab Sigma, Germany 2.5. Deney hayvanlarının sakrifiye edilmesi Bu çalışmada 24 adet Wistar albino erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar postnatal gelişimlerine göre 5 günlük, 150 günlük, 30 günlük ve 60 günlük olmak üzere dört gruba ayrıldı. Bütün gruptaki sıçanlar yüksek doz intraperitonal pentobarbital (100mg/kg) ile sakrifiye edilip, testis ve epididimis dokularının bir kısmı immunohistokimyasal çalışmalar için bouin fiksatifine konuldu ve bir kısmı ise immunopresipitasyon ve western blot çalışmaları için C de saklandı. 14

23 2.6. İmmunohistokimya 5 günlük, 15 günlük, 30 günlük ve 60 günlük sıçanlardan elde edilen testis ve epididimis dokuları Bouin çözeltisinde tespit edilip parafine gömme uygulandı. Uzerinde rutin histolojik doku takipleri yapıldıktan sonra, bir gece 56 C da inkübe edildi. Mikrotomla 5 mikronluk kesitler, poli-l-lizin kaplı lamlarda (Sigma, St. Louis, MO, USA) toplandı ve alınan kesitler ksilol ve dereceli alkol serilerinden geçirilip dehidrate edildi. Suya kadar indirilen dokular, 0.1M sitrik asit solusyonu (ph: 6) içerisinde 5 er dakika 2 kez mikrodalgada kaynatıldı. PBS ile 3 kez 5 er dakika yıkama işleminden sonra, endojen peroksidaz aktivitesi %3 lük hidrojen peroksidazla baskılandı. Tekrar PBS ile 3 kez 5 er dakika yıkama işleminden sonra, oda ısısında kesitler spesifik olmayan reaksiyonu engellemek için 10 dk. bloklama serumla (ScyTek Laboratorları, USA) bloklandı. 10 dk/ lik inkübasyon sonrası, PBS ile oda sıcaklığında yıkamadan sonra sırayla biotinlenmiş sekonder antikorlar (ScyTek Laboratories, USA) ve peroksidaz-işaretli streptavidin (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile toplam 50 dakika inkübe edildi. Peroksidaz aktivitesi, 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) (ScyTek Laboratories, USA) kromojeni ile inkübasyon sonucu görünür hale getirilip, Mayer in hematoksileni (ScyTek Laboratories, Utah, USA) ile zıt boyama yapıldı. Sonrasında, slaytlar su bazlı kapatma solusyonu (Fisher Chemicals, Springfield, NJ, USA) ile kapatıldı. Kontroller için, kesitler primer antikorla benzer konsantrasyonda normal tavşan serumuyla inkübe edildi. Boyanan kesitler Leica mikroskop (Leica DM2500, Nussloch, Almanya) altında fotoğraflandırıldı. Sekonder antikorun horseradish peroxidase (HRP) ya da alkaline fosfotaz (AP) ile konjuge olma durumuna göre, AEC nin yanında, DAB veya Fast red gibi kromojenler de kullanılarak immunopositif bölgeler görünür hale getirildi İmmunofloresan Bir önceki bölümde anlatılan immunohistokimya yönteminin temel basamakları aynı olmak şartıyla, kullanılan sekonder antikorların rhodamine ve FITC gibi belli dalga boylarında floresan renk vermesi nedeniyle özellikle çiftli boyamalarda immunofloresan işaretleme yöntemi tercih edilir. Kısaca bizim çalışmamızda, primer antikorlarla inkubasyondan sonra, rhodamine ile işaretli anti mouse ve FITC ile işaretli anti rabbit 15

24 sekonder antikorları ile 1 saat oda ısısında inkübasyon gerçekleştirildi. Floresana uygun kapatma medyumu ile slaytlar kapatılarak, Nikon microscope (Nikon E600, Germany) altında fotoğraflar çekildi Çiftli boyama Çalışmamızda iki farklı proteinin aynı bölgede lokalizasyonunu göstermek amacıyla testiküler ve epididimal dokular üzerinde çiftli boyamalar yapıldı. Her iki primer antikor (p97/vcp ile Jab1/CSN5, Smad1 ile p97/vcp) belirlenen dilusyon oranlarında aynı zamanda uygulanıp, geceboyu 4 o C de inkübe edildi. Ertesi gün, yıkama işleminden sonra, rhodamine-konjuge anti-mouse-ig ile 1 saat oda ısısında inkübe edilip, ardından ikinci yıkamaya geçildi ve sonrasında, FITC-konjuge anti-rabbit-ig ile 1 saat inkübe edildi. Yıkama işlemlerinden sonra kapatma solüsyonuyla kapatılıp, floresan mikroskobu altında incelendi Protein Biyokimyası İle İlgili Methodlar Hücre Ekstraktının Hazırlanması Sıçandan elde edilen testiküler ve epididimal dokular direk sıvı nitrojen tankı içine atılıp uzun süreli saklama1ar için -80C de bekletildi. Doku lizis edileceği zaman havanla ezilip, un gibi parçalanmış dokular üzerine 1 ml lizis solusyonu (50 mm Tris-Cl ph 8.0, 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP-40, 1 µm leupeptin, 1 mm PMSF) eklendi ve 15 dakika inkübe edildi (0,6 gr doku başına 600µl lizis bufer). Sonrasında, dokular lizis bufer içinde sonikasyona tabi tutuldu (iki kez 10 saniye, W, herbir sonikasyon için 10 saniye örnekler buzda bekletildi). Sonikasyon sonrası, 13,000 x g de 10 dakika, 4 C de santrifüj edildiler. Santrifüj sonrası elde edilen supernatan hücre sitoplazmik ekstraktı olarak kullanılırken, pellet kullanılmadı Protein Konsantrasyonunun Belirlenmesi (Bradford Yöntemi) Bradfort yöntemi, solusyondaki protein konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanıldı. Deneyde kullanılan Bradfort boyası 1:4 oranında distile su ile diluye edildi (1 hacim stok Bradfort boyası, 4 hacim distile su ). Diluye öncesi mavi olan boya, diluye işleminden sonra kahverengini aldı. Standart olarak, 0, 250, 500, 1000, 1500, 2000 µg/ml 16

25 konsantrasyonlarında Bovine serum albumin (BSA) kullanıldı. Hem standartlar hem de örnekler, PBS içerisinde hazırlandı ve 1ml lik diluye Bradfort solusyonu 20 µl örnek ve standart ile karıştırıldı. 5 dakika inkubasyon süresi sonunda 595nm absorbans altında spektrofotometrede ölçümler yapıldı D-SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi Sodyum-dodesil-sülfat (SDS) poliakrilamid jel elektroforezi (Laemmli, 1970), hücre ekstraktlarındaki protein ekspresyonlarını belirlemek amacıyla kullanıldı. %18 lik ayırıcı jel solusyonu (375 mm Tris-HCl ph 8.8, %0.1 SDS, %18 akrilamid, %0.05 APS, %0.05 TEMED), 1 mm aralıklı iki cam plaka arasına döküldü. Polimerasyon sonrası, üst ayrıştırıcı jel solusyonu (125 mm Tris-HCl ph 6.8, %0.1 SDS, %4 akrilamid, %0.05 APS, %0.1 TEMED), bölgeye yerleştirilen taraklar üzerine döküldü. Örnekler ise, l x SDS jel yükleme solusyonu (62.5 mm Tris ph 6.8, %2 SDS, %5 gliserol, %0.3 bromofenol mavisi, %0.9 (v/v) β-merkaptoethanol) içerisinde hazırlanıp, 5 dakika kadar kaynatılıp proteinlerin denature olması sağlandı. Üst jelin polimerazyonu sonucu tarak jelden uzaklaştırılıp, elektroforez kabı içerisine yerleştirildi. Kab 1x SDS elektroforez solusyonu (25 mm Tris, %1.44 glisin, %0.1 SDS) ile doldurulup, tarağın uzaklaşması ile oluşan veller yıkanmış ve örnekler herbir vele teker teker yüklendi. Elektroforez, 150V altında yürütüldü. İmmunoçöktürme için, örnekler NuPAGE % 4-12 lik gradient-jelllerde, elektroforez solusyonu olarak 1x MES solusyonu (50 mm MES, 50 mm Tris, 3.46 mm SDS, mm EDTA) ve ya 1x MOPS (50 mm MOPS, 50 mm Tris, 3.46 mm SDS, mm EDTA ) solusyonu kullanılarak 200 V da 1saat yürütüldü İmmunoblotlama Proteinler, jelde yürütülüp, iblot blotlama stackları (İnvitrogen) kullanılarak kuru blotlama yöntemi ile PVDF membranlara transfer edildi. Proteinlerin membrana transferinden sonra, membran bloklama solusyonu (% 0.1 Tween-20 içeren PBS ile hazırlanmış %5 (w/v) lik non-fat dry milk) ile oda ısısında 1 saat rotator üzerinde inkübe edildi. Hemen ardından, membran geceboyu oda ısısı veya 4 C de bloklama medyumunda hazırlanmış primer antikorla inkübe edildi. Üç kez 10 ar dakika PBS-Tween ile yıkama 17

26 sonrası, membran 1 saat bloklama solusyonu içerisinde hazırlanmış sekonder antikor ile inkübe edildi. Üç kez 10 ar dakika, PBS-Tween ile yıkandıktan sonra, membran ECL Deteksiyon Ajanı ile (1:1 oranında (v/v) Ajan 1: Ajan 2) 2-5 dakika kadar inkübe edildi. Daha sonra, membran plastik folye arasına konulup, X-ray filmi üzerine ekspoz edilip, film geliştirildi Komasi Mavi Boyası Elektroforez sonrası, jel 1 saat fiksatif solusyonu (40% metanol içinde hazırlanmış %7 glasial asetik asit) içerisinde inkübe edildi. Boyama solusyonu ise, 4 volüm 1X Brilliant Blue G-Colloidal (Sigma) ve 1 volüm metanolün karışımı ile hazırlandı. Boyama solusyonu içerisinde, gece boyu rotator üzerinde inkübe edildi. Daha sonra jel, 60 saniye fazla boyanın uzaklaştırılması amacıyla boya uzaklaştırıcı solusyon I (destaining solusyon: % 25 (v/v) lik metanol içinde hazırlanmış %10 asetik asit) ve ardından boya uzaklaştırıcı solusyon II (% 25 metanol) ile yıkandı. Jelin saklanması için, skan edilip, iki sephalon arasında kurumaya bırakıldı Immün-çökeltme (Ko-immunopresipitasyon) Dokular proteinaz inhibitörü içeren 500 µl RIPA solusyonu (50 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 10 mm K 2 HPO 4, %10 gliserol, %1 NP 40, %0.15 SDS, 1 mm Na 3 VO 4, 1 mm sodyum molibdat, 20 mm NaF, 0.1 mm PMSF) ile lizis edildi. Dokular, lizis solüsyonu içinde homojenize edilip, 21 lik insulin iğneleri ile süspansiyon haline getirilirler ve sonrada 10 dakika 4 C de 13,000 x g de santrifüj edildiler. Santrifüj sonrası elde edilen supernatan (500µl), 1:2 oranında immunoçöktürme (IP) solusyonu [20 mm Tris-HCl ph 8.0, 150 mm NaCl, 2 mm EDTA, 1% NP-40, 20 mm NaF, proteaz inhibitor koktail (Sigma)] ile dilüye edildi. Bu arada, 30 µl Protein G-Sepharose 4B Fast Flow boncukları (Amersham), IP için kullanılacak 1-2 µg antikor ile odaısısı veya 4 C de rotator üzerinde (10 r.p.m.) 3 saatten geceboyuna kadar inkübe edildi. Daha sonra, hazırlanan hücre ekstraktı, antikor ile yüklenmiş Protein G boncukları ile 4 C de rotator üzerinde, 3 saatten geceboyuna kadar değişen sürelerde inkübe edildi. İnkübasyon sonunda, boncuklar 3 kez 1ml soğuk IP solusyonu ile yıkandı. Yıkama solusyonunun uzaklaştırılmasından sonra, boncuklar üzerinde toplanmış immun kompleksler, 25 µl lik 3x 18

27 SDS PAGE yükleme solusyonu ile süspanse edilip, 10 dakika 95 C de kaynatılmış ve immun kompleksler NuPAGE % 4-12 Novex Bis-Tris jelinde (Invitrogen) yürütüldü. Amaca uygun olarak, elektroforez sonunda jel ya immunoblot için Nitrosellulöz membrana aktarıldı ya da kollaidal Komasi mavi boyası ile boyandı. 19

28 İSTATİKSEL ANALİZ 3.1. Semiquantitative HSCORE analizi Herbir kesit için ışık mikroskobu altında 40X büyütmede birbirinden habersiz iki araştırmacı tarafından rastgele beş alan seçildi ve bu alanlar içinde hücrelerin boyanma yoğunluğuna göre [0 (boyanma yok), +1 (zayıf, fakat tespit edilebilir boyanma), +2 ( orta şiddetli boyanma) ve +3 (yoğun boyanma)] hücre sayımı yapıldı. Hesaplama için HSCORE formulü kullanıldı [ Pi(i+ l): i boyanma yoğunluğu skorunu, Pi boyanan hücrelerin yüzdesini gösterir]. İki gözlemcinin hesapladığı skorların ortalaması alındı ve HSCORE değerleri grafikle gösterildi. İstatiksel değerlendirmeler SigmaStat versiyon 3.5 (Jandel Scientific Corp., San Rafael, CA) kullanılarak ve anlamlılık p< 0.05 olarak değerlendirilmiştir. Farklı postnatal günlerde elde edilen dokularda ortaya çıkabilecek muhtemel farklılıklar karşılaştırmalı testler (ANOVA, t-test) ve korelasyon regresyon analizleri (Pearson, Spearman) ile değerlendirildi. 20

29 BULGULAR 4.1. Postnatal sıçan testisinde p97/vcp ekspresyonun belirlenmesi Histolojik takipler sonucunda parafine gömülü 5, 15, 30 ve 60 günlük postanatal gelişimlerini tamamlamış sıçan testislerinde p97/vcp immunohistokimyası sonucunda, bu proteinin öncelikle gelişmekte olan testisde immunolokalizasyonu belirlendi. p97/vcp proteinin en fazla ve en güçlü gonosit, Sertoli hücreleri, spermatositler ve uzamış spermatidlerde immunoreakvitide gösterdiği belirlendi (Şekil Şekil de). Şekil 4.1.1: Postnatal 5 (A), 15 (B), 30 (C ve D) ve 60 (E ve F) günlük sıçan testisinde p97/vcp lokalizasyonları. A: 5 günlük sıçan testisinde p97/vcp nin en fazla gonositlerde (GC) ve daha az olarakta intertisyal hücrelerde immunoreaktivitesi gözlenmektedir. Bu resmin üstündeki küçük karade, p97/vcp antikoru kullanılmadan yapılan immunohistokimya sonucundaki negatif kontrol kesiti görülmektedir. B: 15 günlük sıçan testisinde Sertoli (Se) ve spermatogonia (Sg) hücrelerinde nüklear immunoreaktivite ve Spermatositlerde (Sc) sitoplazmik immunoreaktivite izlenmektedir. C ve D: 30 günlük sıçan testisinde, Se, Sg, Sc ve uzamış spermatidlerde (est) p97/vcp immunolokalizasyonu saptanmıştır. Küçük sağ kare: Negatif kontrol E ve F: 60 günlük ergin sıçan testisinde Se, Sc ve est deki belirgin immunoreaktivite gözlenmektedir. Bar: 50 µm. 21

30 4.2. Postnatal sıçan testisinde p97/vcp ile ilişkili proteinlerin ekspresyonun belirlenmesi Postnatal sıçan testisinde p97/vcp ile ilişkili proteinlerden ilk olarak çalıştığımız protein Jab1/CSN5 dır. Öncelikle bu proteinin postnatal gelişmekte olan testisde p97/vcp ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için, Jab1/CSN5 nın immunoekspresyonunu araştırdık. Yapılan immunohistokimyasal çalışmalar sonucunda, Jab1/CSN5 proteininin, gonosit, spermatosit, Sertoli hücreleri ve uzamış spermatidlerde immunolokalizasyonu belirlenmiştir (Şekil 4.2.1). Jab1/CSN5 ekspresyonunun postnatal gelişime bağlı olarak dereceli bir şekilde arttığı yapılan Hscore analizi ile gösterilmiştir (Şekil M). Şekil Postnatal 5 (G), 15 (H), 30 (I) ve 60 (J-L) günlük sıçan testisinde Jab1/CSN5 lokalizasyonları. G: 5 günlük sıçan testisinde Jab1/CSN5 nin sadece gonositlerde (GC) immunoreaktivitesi gözlenmektedir. Bu resmin üstündeki küçük karade, Jab1/CSN5 antikoru kullanılmadan yapılan immunohistokimya sonucundaki negatif kontrol kesiti görülmektedir. H: 15 günlük sıçan testisinde Sertoli (Se), spermatogonia (Sg) ve Spermatositlerde (Sc) immunoreaktivite izlenmektedir. I: 30 günlük sıçan testisinde, Se, Sg, Sc ve uzamış spermatidlerde (est) Jab1/CSN5 immunolokalizasyonu saptanmıştır. J-L: 60 günlük ergin sıçan testisinde Sg, Sc ve est deki belirgin immunoreaktivite gözlenmektedir. Küçük sağ kare: Negatif kontrol M: Gelişime bağlı olarak 5, 15, 30 ve 60 günlük sıçan testisinde p97/vcp ve Jab1/CSN5 nın karşılaştırmalı Hscore analizleri gözlenmektedir. Bu proteinlerin ekspresyonlarında, 5 günlükten 60 günlüğe doğru anlamlı bir artış saptanmıştır (p<0.05). Bar: 50 µm. 22

31 4.3. p97/vcp ve Jab1/CSN5 birlikte lokalizasyonlarının postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde belirlenmesi p97/vcp e bağlandığı ve onun fonksiyonları etkilediğini bildiğimiz Jab1/CSN5 in postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde birlikte lokalize olup olmadıklarını ve lokalize iseler hangi testikular hücrelerde koekspre edilmekte olduklarını anlamak için floresan immunohistokimyası kullanıldı. 5 günlükten 60 günlüğe kadar olan sıçan testislerinde, heriki protein içinde (p97/vcp ve Jab1/CSN5) positivite gösterdiği hücreler belirlendi (Şekil 4.3.1). Gonositler, Spermatositler, Sertoli hücreleri, Spermatogonia ve uzamış spermatidlerde bu proteinlerin birlikte lokalizasyonları saptandı. Şekil Jab1/CSN5 ve p97/vcp nin gelişmekte olan postnatal sıçan testisinde birlikte lokalizasyonları. Jab1 proteini yeşil floresan veren FITC ile işaretlenirken, p97/vcp proteini kırmızı floresan veren rhodamine ile işaretlenmiştir. Her iki proteinin birlikte lokalizasyonunu gösteren kırmızı ve yeşilin birleşmesi (merged) ile sarı renkli işaretli hem Jab1/CSN5 hem de p97/vcp pozitif hücreler üçüncü kolonda gösterilmiştir. Hücre DNA nı boyayan floresan DAPI ile ise 4. kolanda kolalize proteinlerin mavi renkli çekirdek boyanmaları izlenmektedir. Bar: 50 µm. 23

32 4.4. Postnatal gelişmekte olan Sertoli hücrelerinde p97/vcp ve Jab1/CSN5 nın immunolokalizasyonları Ergin testis tübüllerinde, Sertoli hücrelerini etraftaki germinal hücrelerden ayırmak kolaydır. Fakat gelişmekte olan sıçan testisinde, ergin morfoloji tam oturmadığı için Sertoli hücrelerinde protein lokalizasyonunu belirlemek için Sertoli hücre markerlarına ihtiyaç duyulur. Biz de çalışmamızda sitokeratin 18 (erken dönem Sertoli hücre markerı) ve p27 (geç dönem Sertoli hücre markerı) antikorları kullanarak, Sertoli hücrelerinde p97/vcp ve Jab1/CSN5 nın spesifik lokalizasyonlarını belirledik (Şekil 4.4.1). Şekil Postnatal gelişmekte olan sıçan testisindeki Sertoli hücrelerinin immunpositivitesi (A-C) ve p97/vcp ve Jab1/CSN5 in bu hücrelerdeki lokalizasyonu. Sitokeratin 18 (CK) ve p27 Sertoli hücrelerini 15 (A), 30 (B) ve 60 (C) günlük testis tübüllerinde pozitif olarak işaretlemektedir. 60 günlük testis tübüllerinde (D-I), VCP ve Jab1 nın (kırmızı floresan rhodamine ile işaretli) ve p27 (yeşil floresan FITC ile işaretli) ile kolokalizasyonu gösterilmektedir. Bar: 50 µm. 24

33 4.5. Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde übikütin immunolokalizasyonları Bundan önceki sonuçlar, Jab1/CSN5 ın p97/vcp ile ortak lokalizasyonunu göstermiştir. p97/vcp ye bağlandığı bilinen bir başka molekül ubikütindir. Ubikütin birbiri ardı sıra dizilerek p97/vcp nin N domainine bağlanabilen moleküldür ve übikütinlenmiş proteinler p97/vcp aracılığıyla proteazoma taşınmaktadır. Bu nedenle, gelişmekte olan sıçan testisinde übitütinin lokalizasyonu araştırıldı (Şekil 4.5.1). Yapılan çalışmalar sonucunda, übikütinin Sertoli hücreleri, intertisyal hücreler, spermatosit ve uzamış spermatidlerde lokalize oldukları bulundu. Ayrıca, übikütinin 5 günlükten 60 günlüğe doğru ekspresyonunda bir artış belirlendi. Şekil Postnatal 5 (A), 15 (B) ve 60 (C) günlük sıçan testisinde übikütin lokalizasyonları. A: 5 günlük sıçan testisinde ubikütin nin gonositlerde (GC) intersitisyal hücrelerde ve Sertoli hücrelerinde immunoreaktivitesi gözlenmektedir. B: 15 günlük sıçan testisinde spermatogonia (Sg) ve Spermatositlerde (Sc) immunoreaktivite izlenmektedir. C: 60 günlük sıçan testisinde, Sg, Sc ve uzamış spermatidlerde (est) ubikütin immunolokalizasyonu saptanmıştır. Ubikütin ekspresyonunda, 5 günlükten 60 günlüğe doğru anlamlı bir artış saptanmıştır (p<0.05). Bar: 50 µm Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde. p97/vcp immunolokalizasyonları Çalışmamızın bir başka amacı, p97/vcp proteinin testiküler doku yanında testisle direk bağlantılı spermin olgunlaştığı erkek üreme kanalı olan epididimisde ekspresyonun olup olmadığını ve varsa da hangi bölgelerde ve hücrelerde bu proteinin lokalize olduğunu saptamaktı. Epididimis anatomik olarak testise yakınlığına göre kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) 3 bölgeye ayrılmaktadır. Epididimisin bu bölgelerinin ayrı ayrı sperm olgunlaşmasında, depo edilmesinde ve sekresyon fonksiyonunda görevleri bulunmaktadır. 25

34 Şekil Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) ve 60 (J-L) günlük sıçan epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) bölgelerindeki p97/vcp immunolokalizasyonları. 5 günlük sıçan epididimisinde p97/vcp epididimal hücrelerde (EC) ekspre edilirken, 15,30 ve 60 günlük epididimisde principal hücreler (PC) ve basal hücrelerde (BS) ekspre edildiği görülmektedir. Herbir fotografın kenarındaki küçük karaler ise primer antikor kullanılmadan yapılan negatif kontrol kesitleri gözlenmektedir. P97/VCP immunreaktivitesi, epididimisin kaput ve kauda bölgelerinde daha yoğun iken, kauda epididimisde daha az yoğun olarak görülmektedir. Epididimisin epitelyal hücrelerinden clear hücreler de (C) ise hiç bir p97/vcp immunoreaktivitesine rastlanılmamıştır. Bar: 50 µm. 26

35 Bu nedenle çalıştığımız proteinlerin farklı bölgelerde lokalizasyonun belirlenmesi, proteinlerimizin bu bölgelerin fonksiyonlarında görevleri olabileceğini göstermektedir. Şekil 4.6.1, epididimisin bu 3 bölgesinde p97/vcp ekspresyonunu sergilemektedir Postnatal gelişmekte olan sıçan epididimisinde Jab1/CSN5 immunolokalizasyonları p97/vcp proteinin epididimisdeki lokalizasyonu incelediğimiz şekilde, Jab1/CSN5 proteininde epididimisin kaput, korpus ve kauda bölgelerindeki immunoekspresyonu araştırıldı. Şekil Postnatal 5 (A-C), 15 (D-F), 30 (G-I) ve 60 (J-L) günlük sıçan epididimislerinin kaput (CT), korpus (CS) ve kauda (CA) bölgelerindeki Jab1/CSN5 immunolokalizasyonları. 5 günlük sıçan epididimisinde Jab1/CSN5 epididimal hücrelerde 27

36 (EC) ekspre edilirken, 15,30 ve 60 günlük epididimisde principal hücreler (PC) ve basal hücrelerde (BS) ekspre edildiği görülmektedir. Herbir fotografın kenarındaki küçük karalerde ise primer antikor kullanılmadan yapılan negatif kontrol kesitleri gözlenmektedir. Jab1/CSN immunreaktivitesi, epididimisin kaput ve kauda bölgelerinde daha yoğun iken, kauda epididimisde daha az yoğun olarak görülmektedir. İmmunoreaksiyonun 30. ve 60. günlerde sitoplazmada da yoğunlaştığı izlenmektedir. Bar: 50 µm. Postnatal epididimisin bu 3 bölgesindeki principal hücrelerde ve basal hücrelerde Jab1/CSN5 nin ekspre edildiğini ve bu ekspresyonun hem sitoplazmik hem de nüklear olduğu ortaya konulmuştur. 5 günlük sıçan epididimisinin, üç bölgesindede Jab1/CSN5 nin uniform olduğu yani her üç bölgede immunoreavtivite bakımından bir farklılık görülmezken, 15. Günde ve daha sonraki postnatal günlerde kaput ve korpusda Jab1/CSN5 nin daha fazla ekspre edildiği belirlendi. Bu da Jab1/CSN5 nin epididimisin bu bölgelerinin sperm olgunlaşması görevinin yerine getirilmesinde rol alabileceğini vurgulamaktadır Postnatal gelişmekte olan sıçan testisinde Bone morfogenetik protein (BMP) ailesi üyelerinin p97/vcp ile ilişkisinin belirlenmesi Çalışmamızda BMP ailesi üyelerinden Smad1 ve fosfo-smad1 (p-smad1) in p97/vcp ye bağlanıp bağlanamayacağını ve psmad1 in p97/vcp nin bir substarı olarak p97/vcp tarafından yıkılıp yıkılamayacağını anlamak için öncelikle bu iki proteinin testiküler hücrelerde gerçekten birlikte lokalize olup olmadığını inceledik (Şekil 4.8.1). 28