HİNDİ ETLERİNDE CAMPYLOBACTER JEJUNI NİN KÜLTÜR TEKNİĞİ VE PCR İLE SAPTANMASI

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİNDİ ETLERİNDE CAMPYLOBACTER JEJUNI NİN KÜLTÜR TEKNİĞİ VE PCR İLE SAPTANMASI Ömer ÇAKMAK BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. İrfan EROL ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİNDİ ETLERİNDE CAMPYLOBACTER JEJUNI NİN KÜLTÜR TEKNİĞİ VE PCR İLE SAPTANMASI Ömer ÇAKMAK BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. İrfan EROL ANKARA

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii vi vii ix xi 1. GİRİŞ Tarihçe Taksonomi Campylobacter jejuni nin Morfolojik, Biyokimyasal ve Fizyolojik Özellikleri Morfolojik Özellikleri Bakteri Morfolojisi Koloni Morfolojisi Biyokimyasal Özellikleri Fizyolojik Özellikleri Serotiplendirme ve Biyotiplendirme Campylobacter jejuni nin Gıdalarda Gelişimini Etkileyen Faktörler Sıcaklık ph Değeri Su Aktivitesi (a w ) Değeri Sodyum Klorür (NaCl) Konsantrasyonu Oksijen Duyarlılığı Rutubet Rekabetçi Floranın Etkisi Işınlama Kimyasal İnhibitörler Klorin, Klorindioksit ve Diğer Klorin Türevleri Laktik Asit Laktoperoksidaz (LPO) Sistem Campylobacter jejuni nin Olumsuz Koşullarda Canlı Kalabilme Özellikleri Campylobacter jejuni nin Virülens Faktörleri Adezyon Toksin Motilite ve Kemotaksis İnvazyon ve İntraselüler Yaşayabilirlik Hippurat Hidrolizinin Enzimatik Aktivitesi Demir İhtiyacı Lipooligosakkarit (LOS) ve Lipopolisakkarit (LPS) Campylobacter jejuni nin Antibiyotik Dirençliliği Campylobacter jejuni nin Patojenitesi ve C. jejuni İnfeksiyonları Campylobacter jejuni nin Patojenitesi 21

4 iv C. jejuni İnfeksiyonları İnsanlarda Campylobacteriosis Hayvanlarda Campylobacteriosis Campylobacter jejuni nin Epidemiyolojisi Campylobacter jejuni nin Gıdalarda Bulunuşu Kanatlı Eti ve Ürünleri Kırmızı Et ve Ürünleri Süt ve Süt Ürünleri Su Campylobacter jejuni nin İzolasyon ve İdentifikasyon Teknikleri Kültür Teknikleri Hızlı Teknikler İmmunolojik Teknikler Korunma ve Kontrol GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Campylobacter jejuni nin İzolasyon ve İdentifikasyonunda Kullanılan Besiyerleri ve Test Ayıraçları Preston Broth Charcoal Cephoperazone Desoxycholate (CCD) Agar Kanlı Agar Triple Sugar Iron (TSI) Agar Mueller Hinton Agar (MHA) Brucella Broth Besiyerlerinde Kullanılan Supplementler Hippurat Test Ayıracı Ninhidrin Solusyonu Oksidaz Test Katalaz Test Antibiyotik Diskleri CampyGen Gaz Kitleri PCR'da Kullanılan Maddeler Gene Ruler Seti Primer Çiftleri TBE Solüsyonu Ethidium Bromide Agaroz Jel Campylobacter jejuni İzolatlarının Antibiyotik Dirençlilik Testinde Kullanılan Besiyerleri ve Antibiyotik Diskleri Mueller Hinton Agar Antibiyotik Diskleri Standart Suşlar Yöntem Campylobacter jejuni nin Kültür Tekniğiyle İzolasyon ve İdentifikasyonu Zenginleştirme İşlemi 46

5 v Katı Besiyerine Ekim ve Kolonilerin Değerlendirilmesi Campylobacter jejuni İdentifikasyonu Gram Boyama ve Mikroskobik Bakı Hareketlilik Testi Katalaz Testi Oksidaz Testi Hippurat Hidroliz Testi H 2 S Oluşumu ve Karbonhidrat Fermentasyon Testleri C de Üreme Özelliği Antibiyotik Duyarlılık Testi C. jejuni Suşlarının Saklanması Campylobacter jejuni İzolatlarının PCR Tekniği ile Doğrulanması DNA Ekstraksiyonu PCR Protokolü ve Amplifikasyonu Elektroforez Antibiyotik Dirençlilik Testi İstatistiksel Analizler BULGULAR Kültür Tekniği Sonuçları Mevsimsel Dağılım PCR Sonuçları Antibiyotik Dirençlilik Sonuçları TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 78 ÖZET 79 SUMMARY 80 KAYNAKLAR 81 ÖZGEÇMİŞ 90

6 vi ÖNSÖZ Toplumlarda beslenme alışkanlıklarının ve demografik yapının değişmesi ve sosyoekonomik koşullara bağlı olarak tüm dünyada kanatlı hayvan etlerinin tüketimi artmaktadır. Ülkemizde son 40 yıldır hayvancılık sektörü içinde büyüme gösteren kanatlı eti üretimi günümüzde toplam et üretiminin önemli bir payına sahiptir. Türkiye de kanatlı eti üretiminin büyük bir kısmını piliç eti oluştursa da, besleyici değeri yüksek alternatif protein kaynağı olması nedeniyle son yıllarda entansif yetiştiriciliği yapılan hindi eti üretimi de artış eğilimi göstermektedir. Türkiye de kırmızı et ve piliç etlerinin hijyenik kalitesinin belirlenmesi amacıyla yapılmış çeşitli çalışmalar olmasına karşın özellikle entansif üretimi yapılan hindi eti ve ürünlerinin gıda güvenliği ve halk sağlığı risk boyutunun belirlenmesi açısından yeterli çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, önemli bir patojen bakteri olan termofilik Campylobacter türlerinin kültür tekniği ile hindi etlerinde izolasyon ve identifikasyonu ile termofilik Campylobacter lerin bulunma sıklığı üzerine mevsimsel etkinin saptanması, C. jejuni izolatlarının hipo gen sekansı esas alınarak PCR tekniği ile doğrulanması, PCR ile doğrulanan C. jejuni izolatlarının disk difüzyon yöntemiyle antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu çalışma ve doktora eğitimim süresince bilgi ve desteklerini esirgemeyen, meslek hayatımda daima örnek alacağım danışman hocam Prof. Dr. İrfan EROL a, Tez izleme Komitemde görev alan hocalarım Prof. Dr. K.Serdar DİKER ve Prof. Dr. T. Haluk ÇELİK e, değerli komutanlarım Uzm. Vet. Hekim Kd. Alb. İlhan BÜYÜKYÖRÜK ve Uzm.Vet. Hekim Alb. Ahmet USCA ya, 1 inci Ordu A Tipi Gıda Kontrol Müfreze Komutanlığı personeline, GATA Haydarpaşa Hastanesi Mikrobiyoloji A.D. öğretim görevlisi Doç. Dr. Hv. Vet. Hekim Kd. Alb. Mustafa ÖZYURT a ve katkılarından dolayı Uzm. Dr. Fatma Seda Bilir ORMANCI, Arş. Gör. Dr. Naim Deniz AYAZ ile Arş. Gör. Dr. Muammer GÖNCÜOĞLU na sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tüm kararlarımda arkamda olduğunu daima hissettiğim değerli eşim Neşe ÇAKMAK ile çocuklarım Yılmaz Ömür ve Emirhan ÇAKMAK a teşekkür ederim.

7 vii SİMGELER VE KISALTMALAR aada : Adenil transferaz AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism a w : Activity of water-su aktivitesi AHL : Acyl homoserine laktone AhpC : Alkil hidroperoksit redüktaz AB : Avrupa Birliği Bp : Baz çifti CadF : Fibronektin bağlama proteini CBAB : Columbia Blood Agar Base CDT : Cytolethal Distending Toxin-Sitoletal Distending Toksin ceue : Demir bağlama geni CHO : Chinese Hamster Ovary-Çin Hamster Ovaryumu CJT : Campylobacter jejuni toksini CLT : Cholera-like toksin Cst : Sialtransferaz DNA : Deoksiribonükleik asit ELISA : Enzyme Linked Immunosorbant Assay flaa : Flagellin A GMP : Good Manufacturing Practices-İyi Üretim Uygulamaları GBS : Guillain-Barré Sendromu gyra : DNA gyrase HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Points-Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları HeLA : Henrietta Lacks HLR : High Level Resistance-Yüksek Seviyede Dirençlilik hipo : Hippurate hydrolase htrb : Asetiltransferaz lipid A biyosentezi HUS : Hemolitik üremik sendrom IMC-FPCR: Immunomagnetic Capture-Fluorescent PCR ISO : International Organization for Standardization-Uluslararası Standardizasyon Ofisi JlpA : Yüzey lipoprotein A KatA : Katalaz A kda : Kilodalton kgy : Kilo Gray kob : Koloni oluşturan birim LLR : Low Level Resistance-Düşük Seviyede Dirençlilik LPO : Laktoperoksidaz LOS : Lipooligosakkarit LPS : Lipopolisakkarit mccd : Modified Charcoal Cephoperazone Desoxycholate MFS : Miller Fisher Sendromu µg : Mikrogram µl : Mikrolitre

8 viii µm : Mikrometre µm : Mikromolar Mm : Milimolar MID : Minimal İnfeksiyon Dozu MHA : Mueller Hinton Agar NCCLS : National Committee for Clinical Laboratory Standards-Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi OMP : Outer Membrane Protein-Dış Membran Proteini parc : Topoisomerase IV PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu PEB1 : Polyoma antijenik protein PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA RNA : Ribonükleik asit rpos : RNA polymerase sigma faktör rrna : Ribozomal ribonükleik asit SOD : Süperoksit dismutaz Stx : Shiga-like toksin TetS : Tetrasiklin dirençliliği TSIA : Triple Sugar Iron Agar TÜİK : Türkiye İstatistik Kurumu UV : Ultra viyole VBNC : Viable but nonculturable-canlı fakat kültürü yapılamayan virb11 : Virulens B 11 waac : Heptosiltransferaz I waaf : Heptosiltransferaz II WHO : World Health Organization-Dünya Sağlık Örgütü

9 ix ŞEKİLLER Şekil 1.1. C. jejuni nin konakta infeksiyona neden olan virülens determinantları ile gıda, hayvanlar ve çevredeki yaşam siklusu. 24 Şekil 2.1. Campylobacter jejuni izolasyon ve identifikasyon şeması. 47 Şekil 2.2. CCD Agarda termofilik Campylobacter spp. kolonilerinin görünümü. 48 Şekil 2.3. Gram boyamada termofilik Campylobacter türlerinin mikroskobik görünümü. 49 Şekil 2.4. Campylobacter jejuni şüpheli izolatın katalaz testindeki pozitif ve negatif görünümü. 50 Şekil 2.5. Campylobacter jejuni şüpheli izolatın hippurat hidroliz testi görünümü. 51 Şekil 2.6. Campylobacter jejuni şüpheli izolatın karbonhidrat fermentasyon testi görünümü. 51 Şekil 2.7. Nalidiksik asit ve sefolatin antibiyotik testi görünümü. 52 Şekil 2.8. PCR ile hipo geni tespit edilmiş C. jejuni izolatlarının elektroforez görünümü. 56 Şekil 2.9. PCR ile ceue geni tespit edilmiş C. coli izolatlarının elektroforez görünümü. 56 Şekil C. jejuni nin Mueller Hinton agarda disk difüzyon testi görünümü. 58 Şekil 3.1. Hindi etlerinde kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter spp. ve C. jejuni pozitif örneklerin dağılımı. 60 Şekil 3.2. Kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter kolonilerinin dağılımı. 61 Şekil 3.3. Kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter kolonilerinin örnek tipine göre dağılımı. 62 Şekil 3.4. Firmalara göre hindi etlerinde termofilik Campylobacter spp. ve C. jejuni pozitif örneklerin dağılımı. 63 Şekil 3.5. Hindi etlerinde kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter spp. ve C. jejuni pozitif örneklerin soğuk - sıcak aylara göre dağılımı. 65

10 x Şekil 3.6. Hindi etlerinde kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter spp. kolonilerinin soğuk-sıcak aylara göre dağılımı. 66 Şekil 3.7. PCR tekniği ile C. jejuni olarak doğrulanan izolatların örnek tipine göre dağılımı. 68

11 xi ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Çeşitli ülkelere ve dünya geneline ait yıllık hindi eti üretim miktarları. 1 Çizelge 1.2. Campylobacter cinsinde yer alan tür ve alt türler ile meydana getirdiği hastalıklar. 5 Çizelge 1.3. Termofilik Campylobacter türlerinin biyokimyasal özellikleri. 7 Çizelge 1.4. Bazı dezenfektan ve antiseptiklerin C. jejuni üzerine bakterisit etkilerini gösterdikleri konsantrasyon ile süreleri. 12 Çizelge 1.5. Rapor edilen gıda kaynaklı bazı C. jejuni infeksiyonları. 27 Çizelge 1.6. Avrupadaki bazı ülkelerde marketlerde satışa sunulan kanatlı etlerinde Campylobacter türlerinin bulunma oranları. 28 Çizelge 2.1. Besiyerlerinde kullanılan supplementler ve kullanım miktarları. 41 Çizelge 2.2. Termoflik Campylobacter türlerinin biyokimyasal testleri ve tür ayrımı şeması. 49 Çizelge 2.3. PCR protokolleri. 55 Çizelge 3.1. Hindi etlerinde kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter spp. ve C. jejuni pozitif örneklerin dağılımı. 60 Çizelge 3.2. Kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter kolonilerinin hindi eti örneklerine göre dağılmı. 61 Çizelge 3.3. Firmalara göre hindi etlerinde termofilik Campylobacter spp. ve C. jejuni pozitif örneklerin dağılımı. 63 Çizelge 3.4. Hindi etlerinde kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter spp. ve C. jejuni pozitif örneklerin soğuk - sıcak aylara göre dağılımı. 64 Çizelge 3.5. Hindi etlerinde kültür tekniği ile saptanan termofilik Campylobacter spp. kolonilerinin soğuk- sıcak aylara göre dağılımı. 66 Çizelge 3.6. PCR tekniği ile C. jejuni olarak doğrulanan izolatların örnek tipine göre dağılımı. 67 Çizelge 3.7. PCR tekniği ile doğrulanan 109 örneğe ait C. jejuni izolatlarının antibiyotik dirençlilik profili. 68

12 1 1. GİRİŞ Geleneksel olarak birçok ülkede yılbaşı menülerinde yer alan hindi eti, son yıllarda parça et, kıyma veya ileri işlenmiş ürünler (füme, salam, sosis gibi) formunda tüketime sunulmaktadır (Bremner ve Johnston, 1996). Türkiye de kanatlı eti tüketiminde piliç eti büyük bir paya sahip olmasına rağmen, son yıllarda hindi eti de geleneksel tüketimden bağımsız olarak belli bir düzeye ulaşmıştır. Hindi eti içerdiği yüksek düzeydeki protein, düşük kolesterol ve kalori değeri ile alternatif bir hayvansal gıda olarak önem taşımaktadır. Hindi yetiştiriciliği aile tipi üretime ve entegrasyona elverişli özelliktedir (Anon, 2001a). Dünyada 2008 yılı verilerine göre hindi eti üretimi yaklaşık tondur. Türkiye İstatistik Kurumu nun (TÜİK) verilerine göre Türkiye deki kanatlı eti üretimi de dünyadaki artışa paralel bir artış göstermiştir. Buna göre, ton civarında olan piliç eti üretimine karşılık hindi eti üretimi yaklaşık ton olmuştur. Ancak 2005 yılı sonunda ortaya çıkan kuş gribi nedeniyle Türkiye deki hindi eti üretiminde 2006 yılında büyük bir gerileme yaşanmıştır. Hindi eti üretimi 2007 yılı verilerine göre ise yaklaşık ton olmuştur (Çizelge 1.1) (Anon, 2008a; Anon, 2008b). Çizelge 1.1. Çeşitli ülkelere ve dünya geneline ait yıllık hindi eti üretim miktarları (Anon, 2008a; Anon, 2008b). Ülke adı Üretim Miktarı (1000 ton) (a) 2008(b) Avrupa Birliği ABD Brezilya Kanada Türkiye Rusya Dünya hindi eti üretimi : AB verileri 27 üye ülkeyi içermektedir, a: 2008 yılı başına ait veriler, b: Nisan ayına ait veriler. Kanatlı hayvan etleri önemli bir hayvansal protein kaynağı olarak insan beslenmesinde önemli yer tutmasına karşın üretim teknolojisine bağlı olarak sıklıkla

13 2 önemli patojen mikroorganizmalar ile kontamine olmaktadır. Campylobacter ve Salmonella türlerinden kaynaklanan infeksiyonlar tüm gıda infeksiyonları içerisinde en önemli yere sahiptir (Bryan ve Doyle, 1995). Campylobacter türlerinin, çeşitli hayvanlardan izole edildiği ve çoğunlukla normal bağırsak florasında bulunduğu bildirilmektedir. Kanatlı bağırsak sisteminin Campylobacter türlerinin doğal rezervuarı olduğu ve kesim işlemi sırasında karkas kontaminasyonuna yol açtığı bilinmektedir. Dolayısıyla kontamine kanatlı etleri veya bunların kontamine ettiği diğer gıdalar insanlar için en önemli infeksiyon kaynaklarını oluşturmaktadır (Erol, 2007; Nachamkin, 2007). Campylobacter türlerinin kanatlı hayvanlarda diğer hayvan türlerine göre daha yaygın bulunmasının başlıca nedenleri arasında kanatlı hayvanların vücut sıcaklığının Campylobacter türlerinin optimal üreme sıcaklığı olan 42 C ye yakın olması yer almaktadır (Altekruse ve ark., 1999). Yapılan araştırmalar sonucunda, çiğ kanatlı eti ve ürünlerinin Campylobacter türleri ile kontaminasyon düzeylerinin % 3,7 ile 92,6 arasında değiştiği ve C. jejuni infeksiyonlarının en önemli kaynağının kontamine çiğ veya yetersiz pişirilmiş kanatlı eti olduğu ortaya konmuştur (Jones ve ark., 1991; Nachamkin, 2007). Kanatlı etinin yanı sıra insanlarda Campylobacter infeksiyonlarına neden olan diğer kaynaklar arasında başlıca kontamine çiğ süt ve içme sularının yer aldığı bildirilmiştir (Nachamkin, 2007). Bu çalışmada, but, göğüs ve kuşbaşıdan oluşan hindi etlerinde; i. Termofilik Campylobacter türlerinin kültür tekniği ile izolasyon ve identifikasyonu ve termofilik Campylobacter lerin bulunma sıklığı üzerine mevsimsel etkinin saptanması, ii. C. jejuni izolatlarının hipo gen sekansı esas alınarak PCR tekniği ile doğrulanması, iii. PCR ile doğrulanan C. jejuni izolatlarının disk difüzyon yöntemiyle antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

14 Tarihçe Campylobacter türleri, ilk kez 1886 yılında Theodor Escherich tarafından kolera infantum sonucu hayatını kaybeden çocukların dışkı örneklerinde tanımlanmıştır (Butzler, 2004). Campylobacter jejuni ise 1913 yılında McFadyean ve Stockman tarafından abort yapmış koyun fötuslarında Vibrio benzeri bakteri olarak adlandırılmıştır. Sığırlarda aborta neden olan bakteri ise mikroskopta spiral formda görünmesinden dolayı, Smith ve Taylor (1919) tarafından Spirillum olarak tanımlamıştır. Smith ve Taylor çalışma sonuçlarını McFadyean ve Stockman ın sonuçları ile kıyaslayarak, her iki bakterinin de aynı olduğu kanaati ile bakteriyi Vibrio fetus olarak adlandırmışlardır (Butzler, 2004). Smith ve Orcutt ise 1927 de enteritli buzağıların dalak ve karaciğerinden Vibrio ları izole ettiklerini ancak bu izolatların V. fetus ile benzer olmadığını bildirmişlerdir. Jones ve ark de V. fetus benzeri bakterileri kış dizanterisine yakalanmış sığır ve buzağıların jejunumundan izole ettiklerini ve bunları V. jejuni olarak tanımladıklarını bildirmişlerdir. Benzer şekilde, Amerika Birleşik Devletleri nin Illinois eyaletine bağlı 2 farklı cezaevinde, Mayıs 1938 de çiğ süt tüketimine bağlı olarak toplam 335 kişide diyare ve karın krampları ile seyreden bir salgının meydana geldiği, etkenin ise Vibrio jejuni olduğu bildirilmiştir (Stern ve Kazmi, 1989). Daha sonraki yıllarda, dizanterili domuzlardan izole edilen Vibrio benzeri mikroaerofilik mikroorganizmaların V. coli olarak adlandırıldığı ve 1956 yılında da tavuklarda Vibrio ların hepatitisle bağlantısının ortaya çıkarıldığı bildirilmiştir (Egen, 2000; Weber, 2000). Termofilik Campylobacter spp. nin 42 o C de ürediklerini ve insanlarda akut enteritise neden olduklarını bildiren ilk araştırıcının E.O.King olduğu kaydedilmiştir. Bu araştırıcı, Campylobacter spp. nin morfolojik yapılarının Vibrio türlerine oldukça benzediğini ileri sürmüştür. King, ayrıca sistemik infeksiyonlu hastaların kanlarından izole edilen günümüzde C. fetus subsp. fetus olarak adlandırılan etkenin 42 o C de üreyemediğini, bununla birlikte diyareli örneklerden izole edilen vibrios ilişkili olarak tanımlanan mikroorganizmanın 42 o C de üreyebildiğini saptamıştır (Stern ve Kazmi, 1989). Sebald ve Veron 1963 yılında bu bakterileri DNA larının sitozin/guanin oranına göre

15 4 yeni bir cins olarak düzenlemiş ve bu cinsi Campylobacter olarak adlandırmışlardır (Vandamme ve ark., 1991). Campylobacter spp. nin 70 lerin sonuna kadar insan patojen etkeni olarak görülmediği bildirilmiştir (Corry ve Atabay, 2001) Taksonomi Campylobacter, terimi Yunanca eğik çubukcuk anlamına gelen kampylos kelimesinden köken almıştır (Ruckaberle, 2001). Sebald ve Veron tarafından 1963 yılında Sitozin ve Guanin baz çiftlerinin oranına göre, DNA hibriditasyon yöntemi yardımıyla mikroaerofilik Vibrio lar Campylobacter olarak tanımlanmıştır. Campylobacter ile ilgili 4 tür bildirilmiştir. Bunlar, C. fetus spp. fetus, alt türü C.fetus spp. veneralis, C. jejuni, C. coli, C. sputorum ve 3 alt türü C. bubulus, C. mucosalis ve C. concisus olarak tanımlanmış ve Bergey s Manual of Systematic Bacteriology de yer almıştır (Smibert, 1984). DNS-rRNA hibriditasyon yöntemleri ile Camplobacter, Wolinella ve Helicobacter in rrna ları heterolog olduğundan yeni bir cinse ihtiyaç duyulduğu bildirilmiştir (Vandamme ve ark., 1991). Bakterilerin önceleri 5 rrna süperfamilya grubu ile taksonomisi yapılırken, daha sonra rrna süperfamilya 6 Proteobacteria grubu oluşturulmuştur. Bu grubun içerisine yeni bir familya olan Campylobacteraceae dahil edilerek, Arcobacter, Campylobacter, Wolinella ve Helicobacter cinsleri bu familya içerisinde yer almıştır. 16S rrna sekans analizi gibi yeni moleküler ve biyolojik metodların uygulanması ile 3 ribozamal RNA homolog grublar oluşturularak Campylobacter, Arcobacter ve Helicobacter cinsleri Campylobacteraceae familyası içerisinde klasifiye edilmiştir (Anon, 1994; On, 2001). Son yıllarda yapılan çalışmalarda Proteobacteria grubuna bağlı epsilon alt grubu Epsilonproteobacteria içerisinde yer alan Campylobacteraceae familyasında Campylobacter, Arcobacter ve Sulfurospirillum cinslerinin bulunduğu ve Campylobacter cinsine ait 17 tür olduğu tespit edilmiştir (Nachamkin, 2007; Anon, 2009a). Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari ve C. upsaliensis termofilik Campylobacter ler olarak adlandırılırlar. Campylobacter cinsinde yer alan tür ve alt türler ile meydana getirdiği hastalıklar Çizelge 1.2 de gösterilmiştir (Nachamkin, 2007).

16 5 Çizelge 1.2. Campylobacter cinsinde yer alan tür ve alt türler ile meydana getirdiği hastalıklar (Nachamkin, 2007). Etken Adı Campylobacter jejuni subsp. jejuni Campylobacter jejuni subsp. doylei Kaynak İnsan, sığır, vahşi kuşlar, kanatlı, evcil hayvanlar Meydana Getirdiği Hastalıklar İnsanda Hayvanda İshal, sistemik hastalıklar,gbs, Reaktif artritis İshal, abort İnsan İshal Campylobacter fetus subsp. fetus Sığır, koyun Abort, sistemik hastalıklar, ishal Abort Campylobacter fetus subsp.venerealis Campylobacter coli Sığır İnfertilite Domuz, kuşlar, kanatlı, kedi İshal Campylobacter lari Kuşlar, köpek İshal Campylobacter upsaliensis Evcil hayvanlar, kanatlı İshal İshal Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis Sığır, domuz, hamster, geyik Proktitis, ishal Proliferatif enteritis Campylobacter hyointestinalis subsp. lawsonii Domuz Campylobacter mucosalis Domuz İshal Campylobacter sputorum biovar sputorum Campylobacter sputorum biovar paraureolyticus İnsan Sığır Ağız hastalıkları, apseler İshal Proliferatif enteritis Genital sistem hastalıkları, koyunlarda abort Campylobacter sputorum biovar faecalis Sığır, koyun Enteritis Campylobacter lanienae Domuz, sığır Campylobacter insulaenigrae Deniz memelileri Campylobacter hominis İnsan Campylobacter concisus İnsan Ağız ve diş hastalıkları Campylobacter curvus İnsan Ağız ve diş hastalıkları Campylobacter rectus İnsan Ağız ve diş hastalıkları, pulmoner infeksiyonlar Campylobacter showae İnsan Ağız ve diş hastalıkları Campylobacter helveticus Köpek, kedi İshal Campylobacter gracilis İnsan Baş ve boyun hastalıkları

17 Campylobacter jejuni nin Morfolojik, Biyokimyasal ve Fizyolojik Özellikleri Morfolojik Özellikleri Bakteri Morfolojisi C. jejuni 0,2-0,9 µm genişliğinde, 0,5-5,0 µm uzunluğunda spiral formda ya da martı kanadı şeklinde, Gram negatif özellikte, spor oluşturmayan bir bakteridir (Erol, 2007; Nachamkin, 2007). C. jejuni nin genel olarak kılıfsız mono veya bipolar flagellalara sahip olduğu ve uzunluğu etkenin 2-3 katı olan bu flagellalar vasıtasıyla tirbüşon benzeri vidalama hareketi yaptıkları bildirilmiştir (Hazeleger ve ark., 1998) Koloni Morfolojisi Campylobacter kolonilerinin katı besiyerinde görülmesi için en az 1 günlük inkübasyon süresinin geçmesi gerektiği, kolonilerin hemoliz ve koku oluşturmadığı bildirilmiştir (Roop ve ark., 1984). Koloni morfolojisi nem oranına göre değişkenlik göstermektedir. Buna göre bakteriler; nem oranı düşük besiyerlerinde 1-2 mm çapında konveks, parlak, düzgün kenarlı, hafif opak merkezi koloniler, nem oranı yüksek besiyerlerinde ise 10 mm çapında, basık, yaygın, düzensiz kenarlı ve grimsi renkte koloniler oluştururlar (Buck ve Kely, 1981; Smibert, 1984; Nachamkin, 2007) Biyokimyasal Özellikleri Campylobacter türleri katalaz ve oksidaz pozitif, selenit ve nitratı indirgeyen mikroorganizmalardır. İndol, metil red, voges-proskauer ve sitrat reaksiyonları negatiftir. Ayrıca, jelatin ve üreyi hidrolize etmezler. Lipaz aktivitesine sahip olmadıkları, pigment üretemedikleri ve yüksek miktarda sitokrom b ve c ye sahip oldukları bildirilmiştir. Termofilik Campylobacter türlerinden sadece C. jejuni nin hippuratı hidrolize ettiği, C. coli nin H 2 S üretme yeteneğinin zayıf olduğu kaydedilmiştir. C. jejuni ve C. coli nalidiksik aside duyarlı, sefolotine dirençlidir

18 7 (Stern ve Kazmi, 1989; Egen, 2000). C. lari, nalidiksik aside karşı dirençli olmasıyla diğer türlerden ayrılmaktadır. Ancak, nalidiksik aside karşı bazen C. jejuni ve C. coli türlerinde de dirençlilik gelişiminin saptanması bir problem olarak değerlendirilmektedir (Piddock, 1996). Campylobacter türleri karbonhidratları oksidatif ve fermentatif olarak kullanamazlar. C. jejuni enerji gereksinimini trikarboksilik asit siklusunun ara ürünlerinden, hidrojenin oksidasyonundan, formiattan ya da glutamin, gulutamik asit, asparjin ve aspartik asit gibi amino asitlerin yıkımlanmasından karşılamaktadır (Smibert, 1984). Termofilik Campylobacter türlerini birbirlerinden ayıran başlıca biyokimyasal özellikler Çizelge 1.3 de gösterilmiştir. Çizelge 1.3. Termofilik Campylobacter türlerinin biyokimyasal özellikleri (Corry ve ark., 1995). Tür Adı Oksidaz Şeker fermentasyonu Hidrojensülfür oluşumu Hippurat hidrolizi C. jejuni S R C. coli S R C. lari R R % 1 Glisin (S) Sensitive; duyarlı (R) Resistant; dirençli (-); Negatif (+); Pozitif 25 C de üreme 37 C de üreme 42 C de üreme Nalidiksik asit Sefolotin Fizyolojik Özellikleri Campylobacter türleri; obligat mikroaerofilik bakteriler olup, üremelerinde % 10 CO 2, % 5 O 2 ve % 85 N 2 a gereksinim duyarlar. C. jejuni nin optimum üreme sıcaklığı C arasında olup, 30 C nin altında üreyemez (Stern ve Kazmi, 1989; Hazeleger ve ark., 1998). Etken, düşük a w değerlerine ve kurumaya karşı oldukça duyarlı olup, 0,97 nin altındaki a w değerlerinde canlılığını sürdüremez. Benzer şekilde, % 2 tuz içeren besiyerlerinde de üreyemediği bildirilmiştir. C. jejuni nin üreyebildiği ph değeri 4,9 9,0 olup, optimum ph değeri 6,5 7,5 tir (Stern ve Kazmi, 1989).

19 Serotiplendirme ve Biyotiplendirme Termostabil antijenlerin belirlenmesine yönelik serotiplendirme, pasif aglutinasyondan faydalanılarak geliştirilmiştir. Isıya dayanıklı olan antijen O antijeni olarak tanımlanmış ve bunun lipopolisakkaritlerden oluştuğu bildirilmiştir (Bradbury ve ark., 1985). Lior ve ark. (1982) ise termolabil protein antijenlerinin tespitine yönelik bir serotiplendirme geliştirerek, bu proteini dış membran proteini (OMP: Outer Membrane Protein) olarak tanımlamışlardır Campylobacter jejuni nin Gıdalarda Gelişimini Etkileyen Faktörler Campylobacter jejuni uygun olmayan çevresel koşullarda sahip oldukları fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri ile bunun sonucunda gelişen adaptasyon özellikleri ve moleküler mekanizmaları sayesinde canlı kalabilmektedir. C. jejuni nin canlı kalabilme süresi düşük ve yüksek sıcaklık, kurutma, tuz konstrasyonu, ph değeri, oksijen duyarlılığı, ışınlama ve kimyasal inhibitörler gibi birçok etkene bağlı olarak değişmektedir (Abram ve Potter, 1984) Sıcaklık Etken, o C arasında üreme özelliğine sahip olup 30 C den düşük sıcaklıklarda üreyememektedir (Stern ve Kazmi, 1989; Nachamkin, 2007). Campylobacter ler ısıya duyarlı bakteriler olduklarından, yeterli pişirme işlemi ile kolaylıkla yıkımlanabilmektedir. Ancak pişirme sırasında uygulanan yetersiz ısı işlemi uygulamaları etkenin canlı kalabilmesine neden olmaktadır. Özellikle gıdaların merkezi sıcaklıklarının belli bir dereceye ulaşması gerekmektedir (Erol, 2007; Nachamkin, 2007). C. jejuni nin 63 C de 30 dakikada (pastörizasyon derecesi) kolayca yıkımlandığı, üst limit olarak 48 C de termal inaktivasyonun başladığı, C arasında canlılığını sürdürebildiği, 25 C ve 30 C de 4 C ye göre daha hızlı

20 9 yıkımlandığı ve soğuk muhafaza koşullarında üremediği bildirilmiştir (Stern ve ark., 1992). C. jejuni nin D 55 C değeri % 1 lik peptonlu suda 1,09 dakika, piliç etinde 2,12-2,25 dakikadır (Nachamkin, 2007). Campylobacter türlerinin aynı sıcaklık derecelerinde, farklı gıdalarda varlığını devam ettirebilme süreleri değişkenlik göstermektedir (Zanetti ve ark., 1996; Paulsen ve ark., 2005). Campylobacter türlerinin derin dondurulmuş ürünlerde canlı kalabilme özelliği üzerine yapılan bir çalışmada, ortalama kob/g düzeyinde Campylobacter içeren ürünler -24 C de muhafaza edildikten 48 saat sonra başlangıç populasyonunun % 80,0 ının, 6 gün sonra ise % 90,0 ının azaldığı bildirilmiştir (Arumugaswamy ve Proudford, 1987) ph Değeri Campylobacter jejuni için üreme değerinin ph 4,9-9,0 arasında olduğu, buna karşın optimal ph değerinin 6,7-7,5 arasında değiştiği bildirilmiştir. Campylobacter türleri, yoğurttaki starter kültürlerin laktik ve propionik asit üretmesine bağlı olarak ortam ph değerinin 5,3-4,2 seviyelerine düşmesi sonucunda hızla inaktive olarak yoğurtta 25 dakika canlı kalabilmektedir (Stern ve ark., 1992). Taze, soğutulmuş ve dondurulmuş etlerde C. jejuni nin canlı kalabilme yeteneğine ph değeri ile bozulmaya neden olan diğer bakteriler etkili olmaktadır (Gill ve Haris, 1982) Su Aktivtesi (a w ) Değeri C. jejuni nin optimal a w değeri 0,997 dir. Bakterinin kurumaya karşı yüksek duyarlılık gösterdiği ve a w değeri 0,97 den düşük ortamlarda ancak kısa bir süre yaşayabildiği bildirilmiştir. (Egen, 2000). 4 C de depolanan piliç etinde ve kırmızı ette etkenin izole edilebildiği ve bunun nedeninin gıdaların buzdolabı sıcaklığında daha yüksek rutubet içermesiyle ilişkili olabileceği kaydedilmiştir (Jones, 2001).

21 Sodyum Klorür (NaCl) Konsantrasyonu Campylobacter jejuni için optimal tuz konsantrasyonu 42 C de % 0,5 düzeyindedir. Ancak 42 C de arasındaki a w değerinde % 1,5 ve üzeri tuz konsantrasyonunun C. jejuni üzerine bakterisit etkisi olduğu bildirilmiştir (Doyle ve Roman, 1982) Oksijen Duyarlılığı Campylobacter jejuni oksijene karşı aşırı duyarlılık göstermekte ancak, % 3-5 oksijeni tolere edebilmektedirler. Bazı suşların % 21,0 düzeyindeki oksijeni tolere edebildiği bildirilmiştir (Smibert, 1984; Purdy ve ark., 1999). Oksijen varlığı, C. jejuni nin Brucella brothda, kültür plaklarında ve sütte yıkımlamasını kolaylaştırmaktadır (Purdy ve ark., 1999). Campylobacter ler oksijenli ortamda canlılıklarını sürdürebilmek amacıyla çeşitli enzimler sentezlerler. Bu enzimler; demir taşıma sistemi destekli süperoksit dismutaz (SOD), alkil hidroperoksit redüktaz (AhpC) ve katalaz (KatA) dır. Campylobacter türlerinin sahip olduğu süperoksit dismutaz (SOD) enzimi sayesinde oksijeni, hidrojen peroksit ve dioksijene çevirerek oksidatif strese karşı korundukları bildirilmiştir (Pesci ve ark., 1994) Rutubet Sığır karkaslarında soğutma öncesi Campylobacter spp. insidensinin, soğutma sonrası insidensten daha yüksek olduğu, bunun ise 0 o C deki soğuk havanın karkas yüzeyindeki nemi buharlaştırarak karkas yüzey dokularını kurutmasından kaynaklandığı bildirilmektedir (Anon, 1996). Besiyerlerinin kuruması ve muhafazası sırasında oksijen inhibisyonuna bağlı olarak koloni morfolojileri değişebilmektedir (Buck ve Kelly, 1981).

22 Rekabetçi Floranın Etkisi Campylobacter jejuni nin rekabetçi özelliği zayıf olduğundan, ortamdaki diğer mikroorganizmaların varlığında gelişmesi kolayca baskılanmaktadır (Fricker, 1984). Campylobacter türleri besin öğelerince zengin kanlı agar ve selektif öğeleri içeren Skirrow, Karmali, Preston ve Bolton gibi sıvı besiyerlerinde ve farklı antibiyotiklerin katılarak rekabetçi floranın baskılandığı CCD agar gibi katı besiyerlerinde üremektedir. Rekabetçi floranın varlığında, gıdalarda ve sularda C. jejuni nin baskılandığı bildirilmiştir (Stern ve ark., 1992). Blankenship ve Craven (1982), yaptıkları deneysel çalışmalarda iki ayrı piliç eti örneğine 10 6 kob düzeyinde C. jejuni inokule ederek örnekleri 4 C ve 23 C de 17 gün boyunca normal atmosferik koşullarda depolamışlar ve bu süre sonunda sırasıyla 1-2 log 10 ila 2,5-5 log 10 luk redüksiyon şekillendiğini tespit etmişlerdir. Araştırmacılar aynı sıcaklık derecelerinde aynı örnekleri CO 2 içeren depolarda muhafaza ettiklerini ve benzer sonuçlar aldıklarını, bu sonuçların elde edilmesinin normal atmosferik koşullarda Pseudomanas türlerinin, CO 2 bulunan ortamda ise Lactobacillus türlerinin floraya hakim olmasının etkili olduğuna bağlamışlardır Işınlama C. jejuni, ultra viyole (UV) ve röntgen ışınları ile kolayca inaktive olmaktadır. C. jejuni UV ışınlarına karşı E. coli den, röntgen ışınlarına da Salmonella türlerinden daha duyarlıdır. Kanatlı etlerindeki C. jejuni nin 0,12 kgy ile 2,5 kgy dozunda gamma ışını uygulaması ile yıkımlanabildiği bildirilmiştir (Patterson, 1995). Kanatlı eti, sığır eti ve sütte Campylobacter türlerinin radyasyonla yıkımlanması üzerine yapılan bir çalışmada, 1,8 kgy dozundaki ışının etkenlerin yıkımlanması için yeterli olduğu tespit edilmiştir. Ancak bu doz gıdanın tipine göre değişkenlik göstermektedir. Bu bağlamda, C. coli D 10 değeri kanatlı etinde 0,2-0,4 kgy iken, sütte bu değerin 1,17 kgy olduğu bildirilmiştir (Bhavsar ve ark., 2004).

23 Kimyasal İnhibitörler Klorin, Klorindioksit ve Diğer Klorin Türevleri Kanatlı kesimhanelerinde soğuk su tankı ve yıkama suyuna ilave edilen ppm düzeyindeki klorinin karkas yüzeyindeki toplam Campylobacter spp. sayısını azalttığı, klorine maruz kalan birçok Campylobacter türünün subletal hasara uğradığı ve selektif besiyerlerinde üreyemediği saptanmıştır (Anon, 1996; Corry ve Atabay, 2001). İn vitro koşullarda Campylobacter türlerinin klorine duyarlı olmasına rağmen, kanatlıların tüy folüküllerine yerleşerek burada korunması sonucunda temizlik sularında bulunan yüksek orandaki klorin varlığında dahi canlı kalabildikleri bildirilmiştir (Berndtson ve ark., 1996). Avustralya nın güneyinde asitlendirilmiş sodyum klorit uygulamasının bazı patojen bakteriler üzerine etkisinin belirlemesine yönelik yapılan deneysel bir çalışmada, piliç karkaslarının yüzeyinde başlangıçta % 100 olan Campylobacter varlığının uygulama sonrasında % 23,0 düzeyine düştüğü belirlenmiştir (Sexton ve ark., 2007). % 0,05 lik askorbik asit Campylobacter ler üzerine bakteriyostatik, % 0,09 luk konsantrasyonu ise bakterisit etkiye neden olmaktadır (Nachamkin, 2007). Bazı dezenfektan ve antiseptiklerin C. jejuni üzerine bakterisit etkilerini gösterdikleri konsantrasyon ile süreleri Çizelge 1.4 te gösterilmiştir. Çizelge 1.4. Bazı dezenfektan ve antiseptiklerin C. jejuni üzerine bakterisit etkilerini gösterdikleri konsantrasyon ile süreleri (Wang ve ark., 1983). Dezenfektan/Antiseptik Madde Konsantrasyon Süre Bakterisit etki düzeyi Monokloramin 1 ppm/ lt 15 dakika 10 7 kob/ml Hipoklorid 1,25 ppm/ lt 1 dakika 10 4 kob/ml Etil alkol 70,0 1 dakika 10 7 kob/ml Formalin % 2,5 15 dakika 10 7 kob/ml Gluteraldehit % 0,125 1 dakika 10 7 kob/ml Kuaterner amonyum bileşikleri 1: dakika 10 7 kob/ml

24 Laktik asit Karkas yüzeyine, 4 o C de sprey şeklinde uygulanan % 1,0-2,0 lık laktik asidin karkas yüzeyindeki Campylobacter türlerinin miktarını azalttığı fakat tamamen ortadan kaldırmadığı bildirilmiştir (Cudjoe ve Kapperud, 1991) Laktoperoksidaz (LPO) Sistem Sütte ve süt bezlerinde antibakteriyel etkili sistemler bulunmaktadır. Özellikle laktoperoksidaz sistemin termofilik Campylobacter türlerine etkisi yapılan çalışmalar ile ortaya konmuştur. Bu sistem; tiyosiyanat ([SCN] ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve katalitik etkili laktoperoksidaz sistemi (LPO)N komponentlerinden oluşmaktadır (Kussendrager ve Hooijdonk, 2000) Campylobacter jejuni nin Olumsuz Koşullarda Canlı Kalabilme Özellikleri Campylobacter jejuni olumsuz koşullarda genetik, morfolojik ve biyokimyasal özelliklerini düzenleyerek canlılıklarını devam ettirebilmektedir (Park, 2002). C. jejuni nin, canlı fakat kültürü yapılamayan (VBNC: Viable but nonculturable) formu tam olarak anlaşılamamıştır. Farklı ortamlardaki stres koşullarına bağlı olarak, C. jejuni nin canlılığını koruduğu ancak geleneksel kültür metotları ile izole edilemeyen VBNC formu ilk kez Rollins ve Colwell (1986) tarafından tanımlanmıştır. Başlangıçta bu durum, VBNC forma dönüşüm olarak rapor edilse de, daha sonra azalan nükleik asit ve protein içeriği sonucu hücrenin dejeneratif bir formu olduğu belirlenmiştir (Talibart ve ark., 2000). Uygun olmayan sıcaklık ve ph şartlarında Campylobacter lerin protein yapısında bir madde sentezlediği ve bu proteinin bakteriyi olumsuz şartlara karşı koruduğu bildirilmiştir (Murphy ve ark., 2003). Yüksek sıcaklıklarda C. jejuni'nin canlılığını sürdürebilmek için sıcak şoku proteinlerini (heat shock protein)

25 14 sentezlediği ve bu proteinlerin aynı zamanda kolonizasyonda da rol oynadığı bildirilmektedir (Konkel ve ark., 1998). Buna karşın etkenin soğuk şartlarda herhangi bir soğuk şoku proteini sentezlemediği, 30 C de etkenin neden gelişemediğinin cevabının da bu şekilde açıklanabileceği bildirilmiştir (Parkhill ve ark., 2000). Ayrıca etken süperoksitdismutaz (SOD), alkil hidroperoksit redüktaz (AhpC) ve katalaza (KatA) sahiptir. Bu enzimlerin bakteriyi oksidatif strese karşı koruduğu bildirilmiştir (Baillon ve ark., 1999; Parkhill ve ark., 2000). Durgunluk fazına girerken birçok bakterinin bazı fizyolojik ve yapısal değişimler geçirerek sıcaklık değişimleri ile oksidatif, ozmotik ve asit streslerine karşı daha dirençli olarak konak dışında canlı kalma şanslarını yükselttikleri bilinmektedir. Gram negatif bakterilerde, fizyolojik ve yapısal değişimleri oluşturan genin rpos (RNA polymerase sigma faktör) olduğu ancak C. jejuni nin bu gene sahip olmadığı saptanmıştır (Loewen ve ark., 1998; Parkhill ve ark., 2000). Çok sayıda prokaryotik hücrenin reaktif oksijen ara ürünlerini nötralize eden anti-oksidan enzim sentezini gerçekleştirdiği bildirilmiştir. Campylobacter türlerinin gelişimi için mikroaerofilik ortamın ideal olduğu, oksijen konsantrasyonu yüksek ortamlarda reaktif oksijen ara ürünlerinin bakteriyi inhibe edebileceği ortaya konmuştur (Baillon ve ark., 1999). Campylobacter türlerinin ozmotik stres altında canlılık özelliklerini kaybetmelerinin nedeni, sıvıların sınırlı taşıma ve akümülasyon yeteneğine bağlanmaktadır. C. jejuni nin, atılımı oldukça güç olan prolin, betain ve trehaloz gibi ozmotik stresi arttıran molekülleri, prop geninin kodladığı bir atılım sistemi sayesinde uzaklaştırabilmektedir (Parkhill ve ark., 2000). Bakteriler arası etkileşim (Quorum sensing), çevre koşullarına göre genetik düzenlemelerin yapılarak, bakteriyel etkileşimlerin ve iletişimin sağlanmasıdır. C. jejuni nin quorum sensing için LuxS temelli acyl homoserine laktone (AHL)

26 15 üretemediği bilinmektedir. Buna karşın, sentezlediği otoindüser 2 hücredışı proteinleriyle quorum sensing yaptığı belirtilmiştir (Bassler, 1999) Campylobacter jejuni nin Virülens Faktörleri Adezyon Campylobacter türlerinin bağırsak epitel hücrelerine ve mukus tabakasına yapışmasını sağlayan adezinlerin varlığına yönelik olarak yapılan deneysel bir çalışmada, hem bağırsak epitel hücrelerine hem de mukus tabakasına tutunabilirliği önceden bilinen, flagellalı, flagellası ortadan kaldırılmış ve flagellası hareketsiz hale getirilmiş Campylobacter suşlarından flagellalı olanların bağlanma yeteneğinin yüksek düzeyde olduğu, flagellası kısaltılmış suşların bağlanma yeteneğinde azalma olduğu ve flagellasız suşların ise epitel hücrelerine ve mukus tabakasına bağlanamadığı saptanmıştır. Bunun bir sonucu olarak flagella bir adezyon faktörü olarak tanımlanmıştır. C. jejuni den lipopolisakkarit (LPS) yapısında adezinler tespit edilmiş ve bunların epitel hücreleri ile mukusa bağlanmada önemli rol oynadığı ortaya konmuştur (McSweegan ve Walker, 1986) Toksin Campylobacter türleri sitotoksin ve enterotoksin üretme özelliğine sahiptirler. Yapısal ve fonksiyonel olarak kolera toksinine benzemesi ve kolera antitoksini ile inaktive olması nedeniyle, bir enterotoksin olan C. jejuni toksini (CJT), cholera-like toksin (CLT) olarak tanımlanmıştır (Ruiz-Palacios ve ark., 1983). Sitotoksik özellikteki Campylobacter toksinleri şunlardır: (Wassenaar, 1997). I. 70 kda ağırlığındaki HeLa, Çin hamster ovaryumu (Chinese hamster ovary; CHO) ve diğer hücrelere etkili fakat Vero hücrelerine etkisiz toksinler II. Vero ve HeLa hücrelerine etkili toksinler III. Sitoletal distending toksin (CDT) IV. Stx antitoksini ile nötralize edilen toksinler, Shiga-like toksin

27 16 V. Hemolitik aktivite gösteren toksin IV. Hepatotoksin C. jejuni ile konakçı bağırsak epitel hücreleri arasındaki etkileşim dört aşamada oluşmaktadır: İlk aşamada etken hareketlilik özelliği ile mukus tabakasını geçerek konakçı hücresine tutunabilmektedir. Burada adezin reseptör etkileşimleri [(major OMP, lipooligosakkarit, kapsüler oligosakkarit, fibronektin bağlama proteini (CadF), yüzey lipoprotein A (JlpA) ve polyoma antijenik protein (PEB1)] önemli rol oynamaktadır. İkinci aşamada, mikrofilament ve mikrotubuller yardımıyla hareketlilik kazanan C. jejuni, hücre içinde çoğalmaya başlamaktadır. Üçüncü aşamada, bakteri tarafından salgılanan DNase özelliğine sahip sitoletal distending toksin (CDT), konakçı hücrelerinin gelişimini inhibe etmektedir. CDT nin salınım zamanı tam olarak bilinmemekle birlikte, konakçı tarafından alınımı takiben bağırsaklardan salınmaya başladığı düşünülmektedir. Son aşamada ise hücreler arası bağlantı sağlayarak diğer hücrelerde de invazyona neden olmaktadır (Crushell ve ark., 2004). C. jejuni tarafından üretilen sitotoksinin hücre seçiciliği bakımından farklı özellikler taşıması Shigella benzeri toksinden, CDT den ve hemolizinlerden farklı olduğu gözlenmiştir. Yapılan bir araştırmada, C. jejuni nin enterotoksin ürettiği ve genetik olarak kolera toksini ile ilişkisinin olmadığı fakat kolera toksinine benzer şekilde sulu ishale sebep olduğu saptanmıştır (Wassenaar, 1997). Genellikle sitotoksin olarak bilinen ve E. coli tarafından üretilen cdt ABC genlerinin C. jejuni tarafından da kodlandığı bildirilmiştir (Pickett ve ark., 1996). Bang ve ark. (2003) yaptıkları çalışmada Danimarka daki domuz ve sığırlardan izole ettikleri 40 C. jejuni ve C. coli izolatında 7 farklı virülens ve toksin genini (cadf, ceue, virb11, flaa, cdta, cdtb, cdtc, ve cdt gen cluster) PCR metodu ile incelemişler ve izolatların tamamından cadf (fibronektin bağlama), flaa (flagellin A), ceue (demir bağlama) ve cdtb (sitoletal distending toksin B) genlerini,

28 17 % 82,5 inden CDT cluster genini ve % 7,5 inden de virb11 (virülens B 11) genini saptamışlardır Motilite ve Kemotaksis Konakçı sindirim sisteminde Campylobacter türlerinin kolonizasyonunda temel virülens faktörlerinin kemotaksis ve motilite olduğu, nonkemotaktik Campylobacter mutantlarının hayvanlarda kolonize olamadığı bildirilmiştir (Takata ve ark., 1992). C. jejuni nin polar flagellumu hücreye ve Tip III sekresyon fonksiyonu sağlaması ile birlikte önemli bir virülens ve kolonizasyon faktörüdür. Motilite, protein sekresyon ve invazyonuyla ilişkili düzenlemeler yapan C. jejuni nin flagellar biyosentez genleri flaa ve rpon bu etkenin virülensi ile ilişkilidir (Fernando ve ark., 2007). Deneysel bir çalışmada flagellası bulunmayan hareketsiz Campylobacter mutantlarının da kolonize olabildiği, ancak kolonizasyonun flagellalı türlere göre daha düşük düzeyde gerçekleştiği bildirilmiştir. Flagellanın, flagellin A ve flagellin B olmak üzere iki alt üniteden oluştuğu, asıl kolonizasyonun flagellin A proteini tarafından gerçekleştirildiği ve bu proteini üreten türlerin daha motil olduğu bildirilmiştir (Wassenaar ve ark., 1993). Kemotaksis, kolonizasyonda önemli diğer bir faktördür. C. jejuni nin kemotaktik davranışları üzerine yapılan çalışmalarda, çeşitli aminoasitlerin (L-aspartat, L-sistein, L-glutamat ve L-serin), çeşitli organik asitlerin (piruvat, süksinat, fumarat, sitrat, malat, and ά-ketoglutarat), L-fruktozun ve müsinin Campylobacter türleri için kemotaksik etki yaptığı ve bu etkinin bakteri kolonizasyonunu kolaylaştırdığı tespit edilmiştir (Hugdahl ve ark., 1988) İnvazyon ve İntraselüler Yaşayabilirlik Campylobacter jejuni nin invaze olabilmesi için önce bağırsak epitel hücresine adere olması gereklidir. Özellikle klinik izolatların bu özelliğe daha çok sahip olduğu ortaya konmuştur (Konkel ve Joens, 1989). Bağırsak epitel hücrelerinde invazyon sonucunda yıkımlanmanın ve buna bağlı olarak bazı sindirim sistemi sorunlarının

29 18 görüldüğü bildirilmiştir (Ketley, 1997). Konakçı ökaryotik hücrelerdeki safra tuzları ve bazı komponentlere karşı Campylobacter türlerinde gelişen cevap sonucunda sentezlenen Cia proteinleri invazyon antijeni olarak görev yapmaktadır. Bu proteinleri kodlayan genler çevresel faktörlerden etkilenmektedir (Rivera-Amill ve ark., 2001) Hippurat Hidrolizinin Enzimatik Aktivitesi C. jejuni nin hippurat hidroliz aktivitesi hipo geni tarafından kodlanan spesifik hippurat hidroliz enzimi ile gerçekleşmektedir (Hani ve Chan, 1995). Hippurat hidroliz enzimi, E.coli de olduğu gibi 6 histidin proteinin zincirleme şeklinde birleşmesi ile oluşmaktadır. Saflaştırılmış rekombinant enzim, hippurat hidrolizinin aktivitesi ve yapısal özellikleri ile karakterizedir. Rekombinant enzim 193±11kDa moleküler ağırlığındadır. Enzim metallokarboksipeptidaz etkili olduğundan dolayı gümüş, bakır ve demir iyonlarına duyarlıdır. Optimal aktivitesini ph değeri 7,5 te ve 50 o C de gösterir. In vitro koşullarda karboksipeptidaz substratı ile hidroliz olan enzim, N-benzoil zincirlenen küçük alifatik amino asitlere karşı en yüksek aktiviteyi göstermektedir. Enzim yapısı yüksek oranda, α-helix ve β sheet serilerinden meydana gelmektedir. Hippurat hidroliz enzimi amino asit serisinin, benzer aktivitelere sahip benzer enzimlerle aynı düzeyde olması, metal iyon bağlama veya enzim katalizi gerektiren değişik amino asitlerle açıklanmaktadır (Steele ve ark., 2006) Demir İhtiyacı Campylobacter türlerinin düşük molekül ağırlığındaki demir bağlayıcı bileşikleri üretemedikleri ancak eksojen olarak kullanabildikleri tespit edilmiştir. Campylobacter türlerinin ceue geni tarafından kodlanan demir transport sistemi olarak adlandırılan ve invazyonda önemli rol oynayan bir sisteme sahip olduğu bildirilmiştir. Bu sistemin, bağırsak kanalındaki sideroforları yakalayarak konağa ait demir bağlayıcı proteinleri taşıdığı saptanmıştır (Field ve ark., 1986). C. jejuni ve C. coli nin virülens determinantı olan ceue geninin, 34,5-36,2 kda ağırlığında ve

30 19 lipoprotein yapısında olduğu bildirilmiştir (Gonzalez ve ark., 1997; Hong ve ark., 2003). Demir depolama proteini olan ferritinin C. jejuni tarafından üretilebildiği saptanmıştır. C. jejuni nin, oksidatif streslere karşı duyarlı ve demirden yoksun besiyerlerinde gelişiminin zayıf olmasında ferritini kodlayan cft geninde meydana gelen bir mutasyonun etkili olduğu belirtilmiştir. Ferritin üretimi, C. jejuni nin oksijen seviyesi yüksek koşullarda korunması ve konak hücreye kolonizasyonuna yardımcı olmaktadır (Ketley, 1997) Lipooligosakkarit (LOS) ve Lipopolisakkarit (LPS) Gram negatif bakterilerde olduğu gibi C. jejuni LPS sini oluşturan lipid A komponentinin endotoksik aktiviteye sahip olduğu bildirilmiştir. Etkenin LOS, LPS ya da her ikisine beraber sahip olduğu, fakat LOS/LPS zincir regülasyonu yapısının henüz tam olarak anlaşılamadığı bildirilmiştir (Wassenaar ve Blaser, 1999). LOS un, asetiltransferaz lipid A biyosentezi (htrb), heptosiltransferaz I (waac) ve heptosiltransferaz II (waaf) gibi birkaç gen tarafından kodlandığı saptanmıştır. LPS nin aynı zamanda adezin olarak görev yaptığı, kolonizasyon, invazyon ve yangı gelişiminde de rol oynadığı ileri sürülmektedir (Poly ve ark., 2004). C. jejuni nin özel serotipleri olan O:19 ve O:41 in yüzeyindeki LOS yapılarının konak periferal nöral dokulara karşı otoimmun bir saldırı meydana getirdiği bildirilmiştir (Wassenaar ve ark., 2000). Sialik asit biyosentezinden sorumlu olan neuabc genleri ile cst (sialtransferaz) geninin LOS un yapısında bulunan sialik asit sentezini indüklediği ve bu genlerin C. jejuni den ileri gelen GBS nin (Guillain-Barré Sendromu) patogenezinde önemli rol oynadıkları düşünülmektedir (Poly ve ark., 2004) Campylobacter jejuni nin Antibiyotik Dirençliliği Campylobacter türlerinin basitrasin, sefalotin, novobiosin, rifampin, streptogramin B, trimetoprim, vankomisin gibi antibiyotiklere karşı doğal dirençli olduğu, tetrasiklin, minosiklin ve kloramfenikole karşı plazmider transfer yoluyla, streptomisin, eritromisin, spektinomisin, ampisilin ve nalidiksik aside karşı

31 20 kromozomal transfer yoluyla, kanamisine ise hem plazmider hem de kromozomal transfer yoluyla direnç geliştirdiği bildirilmiştir. Campylobacter lerin kanamisin dirençliliğinde apha, tetrasiklin dirençliliğinde tetm, teto, tetq ve tets, streptomisin dirençliliğinde aada ve aade (adenil transferaz) genlerinin rol oynadığı bildirilmiştir (Taylor ve Courvalin, 1988). Antibiyotik direncinin oluşmasında gyra (DNA gyrase A) ve parc (topoisomerase IV) genlerinde meydana gelen mutasyonların rol oynadığı düşünülmektedir. Campylobacter lerde gelişen dirençlilik hayvanlarda büyümeyi hızlandırmak amaçlı antibiyotiklerin kullanımı ile tedavi amaçlı olarak insan ve hayvanlarda bilinçsiz antibiyotik uygulamalarının bir sonucu olarak ortaya çıkmaktadır. Nalidiksik asit, siprofloksasin gibi florokinolon ve eritromisin gibi makrolid grubu antibiyotiklere karşı Campylobacter lerde gelişen direnç bu sebeple oluşabilmektedir. Campylobacter izolatları eritromisin direncine göre yüksek seviyede dirençlilik (HLR:High Level Resistance) ve düşük seviyede dirençlilik (LLR: Low Level Resistance) olmak üzere iki farklı fenotip sergilemektedir (Kurinčič ve ark., 2007). Ancak gentamisin gibi aminoglikozitlere karşı etkenin halen duyarlılığı devam etmektedir. Hindi örneklerinden izole edilen Campylobacter türlerinin florokinolon ve makrolid grubu antibiyotiklere karşı gelişen dirençliliğinin piliç örneklerine oranla daha fazla olduğu da bildirilmiştir (Engberg ve ark., 2001; Ge ve ark., 2003). Campylobacter türleri neomisin, gentamisin ve kloramfenikole karşı büyük ölçüde duyarlıdır. Ampisilin, tetrasiklin ve streptomisine karşı suşların % 60,0 ı dirençli iken trimethoprin, penisilin ve sülfametoksazola karşı ise dirençlilik oranının % 48,0-72,0 arasında değiştiği bidirilmiştir (Perez-Trallero ve Zigorraga, 1995).

32 Campylobacter jejuni nin Patojenitesi ve C. jejuni İnfeksiyonları Campylobacter jejuni nin Patojenitesi Campylobacter jejuni nin insanlar tarafından gıda ile alınmasını takiben etken ileum ve kolonun distal kısmına ulaşarak önce mukus tabakasına adere olur. Daha sonra intestinal hücre yüzeyine tutunarak burada kolonize olur. Direkt etkilerini hücreye invaze olarak ya da toksin üreterek, indirekt etkilerini ise bulundukları bölgede infeksiyon oluşumu için ortam hazırlayarak gösterirler (Ketley, 1997). Campylobacteriosisin meydana gelişinde yaş, cinsiyet ve konağın immun sistemi önemli rol oynamaktadır. Campylobacteriosis vakalarından en çok 5 yaşın altındaki çocukların etkilendiği, ayrıca erkeklerde hastalığın görülme oranının kadınlara göre daha fazla olduğu bildirilmiştir (Louis ve ark., 2005) C. jejuni İnfeksiyonları İnsanlarda Campylobacteriosis Hastalık etkeni insanlara ya direkt ya da indirekt yolla geçmektedir. Direkt bulaşmanın, insanların hasta hayvanlarla olan temasıyla indirekt bulaşmanın ise yeterli ısı işlemi uygulanmamış kanatlı eti ve karaciğeri, sığır ve domuz eti, çiğ süt, kontamine yüzey suları, klorlanmamış içme suları ve gıdanın hazırlanması sırasındaki çapraz kontaminasyonlarla oluştuğu bildirilmiştir (Skirrow, 1991; Altekruse ve ark., 1999). İnsanlarda minimal infeksiyon dozu (MID) C. jejuni suşlarının virülensi ve/veya bireysel duyarlılıklarına bağlı olarak, 5, ile 1, kob/g arasında değişmektedir (Stern ve Kazmi, 1989). Campylobacter jejuni nin, insanlarda en sık neden olduğu semptom gastroenteritistir. Bunun dışında, Guillain- Barré Sendromu (GBS), Miller Fisher Sendromu (MFS), hemolitik üremik sendrom (HUS), obstrüktif hepatit, reaktif arthritis, pankreatitis, peritonitis, meningitis, proktitis ve abort gibi ekstra intestinal komplikasyonlara da neden olmaktadırlar (Mansfield ve Abner, 2000).

33 22 Campylobacter jejuni infeksiyonlarında diyare bol sulu ishalden (kolera benzeri), sık olarak taze kan, mukus ve lökosit içeren dizanteri benzeri ishale dönüşebilmektedir (Stern ve ark., 1992). İnkübasyon periyodunun 1-7 gün arasında değiştiği, infeksiyonun erken döneminde bakteriyeminin tahmin edilenden daha yaygın olarak görüldüğü kaydedilmiştir. Akut diyarenin genellikle infeksiyonun 2. ya da 3. gününden sonra başladığı ve daha sonra durduğu belirtilmiştir. Bağırsak mukozasında yaygın ödem, hiperemi, mukozal parçalanma ve peteşiyel kanamalar ile karakterize değişiklikler oluşmaktadır. Ayrıca, ileum ve jejenumun bazı bölgelerinde meydana gelen yangıya bağlı mezenterik adenitin şekillendiği de kaydedilmiştir. Klinik belirtiler sonlandıktan birkaç hafta sonra da hastalardan etken izole edilebilmektedir. Yangısal olmayan sulu ishalde mukozal değişikliklere rastlanmadığı, sulu ishalin kan, mukus, ve lökosit içermediği bildirilmiştir (Ketley, 1997). C. jejuni nin neden olduğu infeksiyonları takiben ortaya çıkabilen Guillain Barré sendromu immunolojik olarak gelişen akut inflamatuar demyelinizan polinöropatidir. GBS kranial ve spinal sinirlerle köklerinin yangısal hastalığıdır. Poliovirus infeksiyonunun dünyada eradikasyonunu takiben, GBS eklemlerde sertlik oluşturmadan gelişen akut paralizin en yaygın sebepleri arasında ilk sırayı almaktadır. C. jejuni nin başlattığı antijenik uyarıyla, schwan hücreleri ve aksonların glikopeptidlerine karşı oluşan otoimmunitenin patogenezden sorumlu olduğu bildirilmektedir. Hastalık; yaşlılarda azalan bağışıklık, baskılayıcı mekanizmalar ve bunun sonucunda gelişen otoimmun hastalıklara karşı artan bir eğilimle seyreder (Smith, 1995). Miller-Fisher sendromu, ilk kez 1956 da tanımlanan akut ataksi, refleks kaybı, oftalmopleji belirtileri ile seyreden, GBS nin az rastlanan şeklidir. Reaktif artritin gelişebileceği de bildirilmiş olup, bunun HLA-B 27 genotipine sahip olanlarda gelişme olasılığı daha fazladır. Nadiren HUS da gelişebilir (Peterson, 1994).

34 Hayvanlarda Campylobacteriosis Campylobacter türleri çiftlik hayvanlarından koyun, keçi ve sığırlarda; septik aborta, diyare ve mastitise, kanatlılarda hepatitise, pet hayvanları ve domuzlarda gastroenteritise neden olmaktadır. C. jejuni nin insanlarda görülen gastroenteritlerin önemli sebeplerinden biri olduğu belirtilmiştir (Moore ve ark., 2005). Tavuk, hindi, ördek ve kaz gibi insan beslenmesinde önemli yeri olan evcil kanatlılar ile doğada serbest yaşayan kanatlı türlerinin Campylobacter jejuni nin doğal rezervuarı olduğu ve kanatlılarda kommensal olarak bulunduğu bildirilmiştir (Smibert, 1984). Campylobacter spp. infeksiyonlarında horizontal bulaşma çok önemli bir rol oynamakadır. Rodentler, insektler, pet hayvanları, intensif kanatlı yetiştiriciliği, su ve yem maddelerinin önemli infeksiyon kaynakları olduğu bildirilmiştir (Newell ve Fearnley, 2003; Nachamkin, 2007) Campylobacter jejuni nin Epidemiyolojisi Campylobacter jejuni infeksiyonlarının bir çok ülkede gıda infeksiyonları arasında ilk sırada yer aldığı bildirilmiştir (Parkhill ve ark., 2000; Newell ve Fearnley, 2003). Yirminci yüzyılın sonlarında büyük artış kaydedilen campylobacteriosis olgularının toplumların beslenme alışkanlıkları ve demografik yapısal değişimleri, uluslar arası hayvan, hayvansal ürün ticareti ve turizmin artmasıyla ilgili olabileceği düşünülmektedir. İzolasyon ve identifikasyon metotlarındaki gelişimin de, infeksiyon etkeninin belirlenmesi bakımından kolaylık sağladığı kaydedilmiştir. C. jejuni den kaynaklanan gastroenteritler daha çok sporadik olgular şeklinde ortaya çıkmaktadır. Bunun yanı sıra konakçı ve patojene bağlı birçok faktörün rol oynadığı bildirilmiştir. C. jejuni nin optimum üreme sıcaklığı (42 C) ile kanatlı hayvanların vücut sıcaklıklarının aynı olması nedeniyle bakterinin kanatlı bağırsaklarına çok kolay adapte olduğu ve doğal flora gibi yaşamını sürdürdüğü bilinmektedir (Altekruse ve ark., 1999). Campylobacter türlerinin gıdada çoğalamadığı, insanların genelde etkenle infekte olma yollarının iyi pişirilmemiş kanatlı eti ve ürünlerinin tüketimi başta

35 24 olmak üzere, kırmızı et ve ürünlerinin tüketimi, pastörize edilmemiş süt, yeterli derecede klorlanmamış su, kontamine hazır yiyecekler, salata ve meyvelerin tüketimi, ayrıca hayvanlarla temas, insandan insana temas ile geçiş olduğu bildirilmiştir (Skirrow, 1991; Bryan ve Doyle, 1995; Weber, 2000). İnsanlardaki Campylobacteriosis olgularında mayıs ve temmuz ayları arasında artış olduğu bildirilmiştir (Louis ve ark., 2005). Campylobacteriosisin yaz aylarında daha fazla görülme nedeni, etkenin mevsim şartlarına uyumuna, değişen beslenme alışkanlıklarına, kuş göçlerine ve turistik seyahatlere bağlanmaktadır (Altekruse ve ark., 1999; Sopwith ve ark., 2003). Kanatlı çiftliklerinde kullanılan alet ve malzemenin, ayrıca çalışan personelin kişisel temizliği de Campylobacter kontaminasyonunda önemli rol oynamaktadır. C. jejuni nin konakçıda infeksiyona neden olan virülens determinantları ile gıda, hayvanlar ve çevredeki yaşam siklusu Şekil 1.1. de gösterilmiştir (Anon, 2000; Altekruse ve Tollefson, 2003). Zoonotik Bulaşma Gıda Geçişi Gıda Hazırlama Hayvanlar Kanalizasyon Çevre Yüzey suları Tüketim Yayılma Konak Mide Asidi Enterit oluşumu Virülens Determinantları Hareketlilik İnvazyon Demir Alınımı ve Toksin Üretimi Adezyon Şekil 1.1. C. jejuni nin konakta infeksiyona neden olan virülens determinantları ile gıda, hayvanlar ve çevredeki yaşam siklusu (Anon, 2000; Altekruse ve Tollefson, 2003).

36 25 Luber ve ark. (2003), Almanya da marketlerde satılan hindi ve piliç örnekleri ile insanlardan elde edilen C. jejuni ve C. coli izolatlarının 10 yıllık bir periyot içerisinde çeşitli antibiyotiklere karşı dirençlilik durumlarını incelemişler. Bu periyot içerisinde insan ve kanatlılardan elde edilen izolatların aynı oranda antibiyotiklere karşı dirençliliklerini artırdıklarını ve elde edilen sonuçların insan Campylobacteriosisinin en büyük kaynağının kanatlı eti ve ürünleri olduğu hipotezini desteklediğini bildirmişlerdir. ABD nin sekiz eyaletinde sürdürülen epidemiyolojik çalışmada 2000 yılında kişide görülen gastroenterit olgularının, ünden termofilik Campylobacter türlerinin sorumlu olarak ilk sırada yer aldığı ve 4 kişinin Campylobacter kaynaklı infeksiyonlar neticesinde hayatını kaybettiği bildirilmiştir (Anon, 2001b). Yine ABD de 2002 yılındaki epidemiyolojik verilere göre kişinin etkilendiği olgularda, kişide görülen gıda kaynaklı Campylobacter infeksiyonlarının Salmonella ların ardından ikinci sırada yer aldığı kaydedilmiştir (Anon, 2003). Avrupa Birliğinin (AB) 13 ülkesinden elde edilen verilere göre yılları arasında toplam kişinin etkilendiği Campylobacteriosis olguları bildirilmiştir (Anon, 2001c) yılındaki verilere göre de AB deki insanlarda sıklıkla görülen hastalıkların Campylobacter ve Salmonella infeksiyonları olduğu sırasıyla lik bir populasyondaki olgu dağılımının 51,6 ve 38,2 olduğu rapor edilmiştir (Nørrung ve ark., 2008). Dünya Sağlık Örgütü (WHO), gelişmekte olan ülkelerde 5 yaş altındaki çocuklarda, diyare etkenlerini tanımlamak üzere yaptığı tarama çalışmalarında toplanan dışkı örneklerinden Campylobacter izolasyon oranlarının sırasıyla; Fas ta % 17,7; Kamerun da % 7,7, Etyopya da % 13,8, Nijerya da % 16,5, Tanzanya da % 18,0, Zimbabve de % 9,3, Mısır da % 9,0, Ürdün de % 5,5, Bangladeş de % 17,4, Tayland da % 13,0 ve Laos Adaları nda % 12,1 olduğunu bildirmiştir (Coker ve ark., 2002).

37 26 Japonya da 1997 yılında, kişinin C. jejuni infeksiyonundan etkilendiği ve etkenin Japonya da her yıl salgın veya sporadik olmak üzere yaklaşık den fazla olgudan sorumlu tutulduğu bildirilmiştir (Ono ve Yamamoto, 1999). Çizelge 1.5. de yılları arasında kaydedilen bazı Campylobacteriosis vakaları ve infeksiyona neden olan gıdalar verilmiştir. ABD de Campylobacter spp. ileri gelen gıda kaynaklı hastalıkların tedavisi için tahmini olarak yıllık yaklaşık 1,2 milyar dolar harcandığı bildirilmiştir. Campylobacter infeksiyonları için harcanan tedavi masraflarının yanısıra, iş gücü ve personel verimliliğindeki kayıpların da ekonomik yük oluşturmaktadır (Crutchfield ve Roberts, 2000). Türkiye de akut gastroenterit olguları üzerine yapılan çalışmalarda Campylobacter izolasyon oranlarının % 1,4 ile 14,6 arasında değiştiği bildirilmiştir. Edirne yöresinde yapılan bir çalışmada, 882 diyareli hastanın dışkı örneklerinin 31 inden (% 4,0) Campylobacter türleri (25 i C. jejuni ve 6 sı C. coli) tespit edilmiştir (Ateş-Yılmaz ve Tuğrul, 2005).

38 27 Çizelge 1.5. Rapor edilen gıda kaynaklı bazı C. jejuni infeksiyonları (Stiller, 1998; Altekruse ve ark., 1999; Gillespie ve ark., 2003; Adak ve ark., 2005; Jimenez ve ark., 2005; Baker ve ark., 2006; Mazick ve ark., 2006; Vestergaard ve ark., 2007; Kopılovıć ve ark., 2008; Stafford ve ark., 2008; Yoder ve ark., 2008; Anon, 2009b; Forbes ve ark., 2009 ). Ülke Yıl Gıda Etkilenenlerin sayısı İskoçya Çiğ süt Hollanda 1979 Kızartılmış tavuk 89 ABD 1980 Piliç eti 14 Japonya 1980 Kızartılmış domuz eti 800 (6-15 yaş arası) Yeni Zelanda Kontamine taze piliç eti ABD 1981 Su, çiğ süt, az pişmiş piliç eti 40 İsviçre 1981 Pastörize edilmemiş sütten 500 hazırlanan kakaolu içecek ABD 1982 Piliç eti 10 Almanya 1982 Piliç etinden çapraz kontaminasyon yoluyla bulaşmış yiyecekler Hollanda 1982 Mangalda pişen piliç, domuz eti 54 ABD Çiğ süt (8-20 yaş arası) ABD Az pişmiş piliç eti 218 ABD Piliç eti 45 ABD 1986 Kontamine içme suyu 871 Norveç Piliç sosisi 52 İngiltere 1990 Şişelenmiş süt 29 İngiltere ve Galler Piliç eti, hindi eti, kırmızı et, pastörize edilmemiş süt ve süt ürünleri İngiltere ve Galler 2000 Pastörize edilmemiş süt 333 Avustralya Pişmiş ve çiğ piliç eti 601 Avustralya Şişelenmiş su 72 İspanya 2003 çiğ piliç etinin kontaminasyonu 81 yoluyla bulaşmış UHT sütten yapılmış tatlı Danimarka 2005 Piliç salatası 4 İskoçya 2005 Pişmemiş piliç karaciğer patesi 82 ABD Kontamine içme suyu 32 ABD 2007 Pastörize edilmemiş sütten 67 hazırlanan taze peynir Danimarka 2007 Kontamine içme suyu 16 Slovenya 2008 Kontamine içme suyu 2

39 Campylobacter jejuni nin Gıdalarda Bulunuşu Kanatlı Eti ve Ürünleri Yapılan araştırmalar sonucunda, çiğ kanatlı eti ve ürünlerinin Campylobacter türleri ile kontaminasyon düzeylerinin % 3,7 ile 92,6 arasında olduğu ve Campylobacter infeksiyonlarının en önemli kaynağının kontamine çiğ veya yetersiz pişirilmiş kanatlı eti olduğu saptanmıştır (Jones ve ark., 1991; Hinton ve ark., 2004). Bazı Avrupa ülkelerindeki marketlerde satışa sunulan kanatlı etlerinde Campylobacter türlerinin varlığına yönelik yılları arasında yapılan araştırma sonuçları Çizelge 1.6 da gösterilmiştir. Çizelge 1.6. Avrupadaki bazı ülkelerde marketlerde satışa sunulan kanatlı etlerinde Campylobacter türlerinin bulunma oranları (Anon, 2006c). Ülke Market Sayısı Market Market Sayısı Sayısı Bulunma Oranı (%) Bulunma Oranı (%) Bulunma Oranı (%) Almanya , , ,5 İngiltere , ,2 Fransa ,7 Hollanda , , ,3 İsveç , ,6 Finlandiya , ,0 Danimarka , , ,5 Avusturya 74 9, , ,3 Konuyla ilgili olarak Rosef ve ark. (1984), Norveç te bir kanatlı kesimhanesinde yaptıkları çalışmada iç organları çıkartılmış ve paketlenmeye hazır 30 hindi karkasının 17 sinden (% 56,7) termofilik Campylobacter türlerini izole ettiklerini bildirmişlerdir. Khalafalla (1990) tavuk, ördek, güvercin ve hindiden oluşan kanatlı hayvanlara ait 200 sakadat örneği üzerinde yaptığı çalışmada, hindi taşlığı, kalp, karaciğer ve

40 29 dalak örneklerinin sırasıyla % 16, 4, 30 ve 8 inden C. jejuni izole ettiğini ve hindinin piliçten sonra en yüksek Campylobacter insidensine sahip olduğunu bildirmiştir. Whyte ve ark. (2004), İrlanda nın farklı şehirlerinden topladıkları 444 piliç eti, 33 hindi eti ve 11 ördek etinden oluşan örneklerden sırasıyla % 49,9, % 37,5 ve % 45,8 oranında termofilik Campylobacter türlerini izole etmişlerdir. ABD de dört farklı süpermarket zincirine ait 59 marketten alınan 172 hindi eti örneğinin % 14,0 ının termofilik Campylobacter türleriyle kontamine olduğu bildirilmiştir (Zhao ve ark., 2001). Logue ve ark. (2003), ABD de yaptıkları bir çalışmada iki farklı hindi kesimhanesinden aldıkları hindi karkas örneklerinden sırasıyla % 30,6 ile % 39,2 oranında Campylobacter spp. tespit etmişlerdir. Almanya da 212 hindi karkas örneğinin 32 sinden (% 15,1) ve 190 piliç karkas örneğinin 21 inden (% 11,1) termofilik Campylobacter türleri izole ve identifiye edilmiştir (Hänel, 2004). Alter ve ark. (2004) Almanya da yaptıkları bir çalışmada 419 hindi örneğinin % 6,2 sinden Campylobacter türlerini tespit etmişlerdir. Aynı araştırmacılar tarafından Almanya da yapılan diğer bir çalışmada, hindi kesim işleminin farklı aşamalarında alınan 258 hindi derisi örneğinin kesim aşaması başlangıcında % 76,7 sinden 24 saatlik soğutma işlemi sonrasında ise % 25,6 sından C. jejuni izole edildiği bildirilmiştir (Alter ve ark., 2005). Avusturya da perakende satış noktaları ve kesimhanelerden alınan 256 hindi eti örneğinin 136 sından (% 53,0) termofilik Campylobacter türleri izole edilmiştir (Mayrhofer ve ark., 2004). Benzer bir çalışmada Paulsen ve ark. (2005), Avusturya daki çeşitli kesimhane ve perakende satış noktalarından aldıkları çesitli gıdalarda Campylobacter türlerinin varlığına yönelik yaptıkları araştırmada, derili 30 piliç eti, derisiz 50 piliç eti, 44 piliç karaciğeri, taşlık ve kalbinden oluşan örnekler ile 66 fermente piliç ürünü, 8 dondurulmuş piliç karaciğer örneklerinin sırasıyla,

41 30 17 sinin (% 56,6), 25 inin (% 50,0), 18 inin (% 41,0), 14 ünün (% 21,0) ve 4 ünün (% 50,0) Campylobacter türleri ile kontamine olduğunu tespit etmişlerdir. Belçika da satışa sunulan kanatlı karkas ve ürünlerinden oluşan 772 örnekte yapılan bir çalışmada, örneklerin % 28,5 inin C. jejuni ve C. coli ile kontamine olduğu tespit edilmiştir (Uyttendaele ve ark., 1999). Zanetti ve ark. (1996) 41 sosis, 27 domuz eti, 30 hindi eti ve 30 piliç etinden oluşan 120 örneğin sırasıyla % 2,4, 3,7, 20,0, 37,5 düzeyinde termofilik Campylobacter türleri ile kontamine olduğunu bildirmişlerdir. Kore deki marketlerden 8 aylık (Şubat-Eylül 2004) dönemde toplanan 265 çiğ piliç karkası örneği C. jejuni varlığı yönünden kültür metodu ve multiplex PCR tekniği kullanılarak incelenmiş ve örneklerin % 37,7 sinden C. jejuni izole edilmiştir. Ayrıca, izole edilen 170 C. jejuni nin genetik farklılığı PFGE ile 73 ü pulsotip ve 30 u flaa tip olarak belirlenmiştir. Disk difüzyon yöntemi ile yapılan antibiyotik dirençlilik testi sonucunda da C. jejuni izolatlarının tetrasiklin, nalidiksik asit ve siprofloksasine karşı dirençli oldukları saptanmıştır (Han ve ark., 2007). Katzav ve ark. (2008) Finlandiya da yaptıkları bir çalışmada marketlerde perakende satışa sunulan 194 marine edilmiş ve marine edilmemiş taze hindi ve piliç eti örneğinin 24 ünden (% 12,4) PCR ile Campylobacter spp. tespit etmişlerdir. Praakle-Amin ve ark. (2007) Estonya da perakende satışa sunulan kanatlı etlerinden izole edilen Campylobacter izolatlarının serotiplendirilmesi, PFGE genotiplendirmesi ve antibiyotik dirençliliğine yönelik bir çalışma yapmışlar. Araştırıcılar, 580 çiğ piliç eti örneğinin 48 inin (% 8,2), 30 hindi eti örneğinin ise 22 sinin (% 73,3) Campylobacter türleri ile kontamine olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, elde edilen izolatlardan % 91,4 ünü (64/70) C. jejuni, % 5,7 sini (4/70) C. coli ve % 2,8 ini (2/70) diğer Campylobacter türleri olarak identifiye etmişlerdir.

42 31 Çek Cumhuriyeti nde yapılan bir çalışmada perakende satılan çiğ kanatlı eti ve çiğ domuz etinden elde edilen 111 izolat ile insan orijinli 800 izolat olmak üzere toplam 911 termotolerant Campylobacter izolatından 775 inin (% 85,1) C. jejuni, 114 ünün (% 12,5) C. coli ve 21 inin (% 2,3) karışık kültür (C. jejuni + C. coli) olduğu PCR metodu ile saptanmıştır. Kültür tekniği (hippurat hidrolizi) ile gıda orijinli 111 izolatın 48 inden, PCR metodu ile de 52 sinden C. jejuni tespit edilmiştir (Kolackova ve Karpiskova, 2005). Termofilik Campylobacter türlerinin kanatlı etlerinde varlığına yönelik olarak Türkiye de yapılan bir çalışmada, Uçar ve ark. (2006), hindi eti ürünlerinde Campylobacter türlerine rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Yapılan bir başka çalışmada, Denizli ve bazı ilçelerinde tüketime sunulan piliç but, göğüs ve kanattan oluşan toplam 100 piliç eti örneğinin 40 ından termofilik Campyloacter spp. izole edildiği bildirilmiştir (Köksoy, 2001). Savaşçı (2005) yaptığı çalışmada, Ankara da perakende satılan 127 piliç parça eti örneğinin 106 sının (% 83,5) termofilik Campylobacter türleri ile % 74,8 inin C. jejuni ile kontamine olduğunu saptamıştır. Erbay (2006), 115 yenilebilir hindi iç organ örneğinin 38 inde (% 33,0) termofilik Campylobacter türlerini tespit etmiştir. Termofilik Campylobacter saptanan 38 örneğin 20 sinin (% 55,6) hindi karaciğerinden, 15 inin (% 34,9) paketlenmiş halde birarada bulunan hindi kalp ve karaciğerlerinden ve 3 ünün (% 8,3) hindi kalbinden alınan örneklere ait olduğunu bildirmiştir Kırmızı Et ve Ürünleri Etin normal ph değeri olan 5,5-5,8 aralığının etkenin canlılığını sürdürmesi için uygun bir ortam olmaması ve etin mikroflorasında genellikle ortamda bulunan diğer bakterilerin baskın olması nedeniyle etkenin kırmızı et ve ürünlerinde fazla bulunmadığı bildirilmiştir (Gill ve Harris, 1982). Kırmızı et ve ürünlerinin termofilik

43 32 Campylobacter türleri ile kontaminasyonu kanatlı eti ve ürünlerine göre düşük olmakla beraber, karkasların işlenmesi sırasında çapraz kontaminasyonuna bağlı olarak bulaşmanın C. jejuni için % 1,0 ile 40,0 arasında olduğu rapor edilmiştir (Garcia ve ark., 1985). Enokimoto ve ark. (2007) yaptıkları çalışmada sağlıklı sığırlardan alınan 49 safra örneğinin % 34,7 sinden (17/49) C. jejuni identifiye etmişlerdir. Kramer ve ark. (2000), İngiltere deki marketlerden alınan kuzu, domuz ve sığır karaciğer örneklerinde sırasıyla; % 72,9, % 71,7 ve % 54,2 oranında Campylobacter türlerini izole etmişlerdir. Devane ve ark. (2005), 178 sığır, 162 koyun ve 187 domuz sakatatının sırasıyla, 16 (% 9,0), 69 (% 42,5) ve 18 inden (% 9,6) termofilik Campylobacter türlerini tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Benzer şekilde yılları arasında İngiltere de toplanan 3959 çiğ kırmızı et örneğinde Campylobacter ve Salmonella nın kontaminasyon düzeyinin belirlenmesine yönelik yapılan çalışmada örneklerin % 7,2 sinin Campylobacter spp., % 2,4 ünün de Salmonella ile kontamine olduğu tespit edilmiştir (Little ve ark., 2008). Cloak ve ark. (2001), Dublin deki (İrlanda) perakende satış noktalarından aldıkları 20 kıyma örneğinin 4 ünden (% 20,0) termofilik Campylobacter leri izole ederlerken, domuz karkaslarından etkeni izole edemediklerini bildirmişlerdir. İrlanda da yapılan başka bir çalışmada, 262 kuzu etinin 31 inden (% 11,8), 221 dana etinin 7 sinden (% 3,2) ve 197 domuz etinin 10 nundan (% 5,1) termofilik Campylobacter türleri izole edilmiştir (Whyte ve ark., 2004). Mayrhofer ve ark. (2004), Avusturya da gıdalarda patojen bakterilerin varlığı ile ilgili yaptıkları çalışmada, 105 domuz etinin % 5,0 ının, 84 sığır etinin % 2,4 ünün termofilik Campylobacter türleri ile kontamine olduğunu, 11 sığır kıyması örneğinin ise Campylobacter türleri ile kontamine olmadığını bildirmişlerdir.

44 33 İtalya da yapılan bir çalışmada, 151 sığır eti örneğinin 2 sinden (% 1,3), 175 domuz eti örneğinin 18 inden (% 10,3) C. jejuni identifiye edildiği bildirilmiştir (Pezzotti ve ark., 2003). İran ın başkenti Tahran da yapılan bir çalışmada Nisan-Ekim 2004 de açık olarak satışa sunulan 121 i piliç eti, 120 si sığır eti olmak üzere toplam 241 örneğin 88 inin (% 36,5) Campylobacter spp. ile kontamine olduğu bildirilmiştir (Taremi ve ark., 2006) Süt ve Süt Ürünleri Termofilik Campylobacter türlerinin süt ve süt ürünlerinde bulunma oranı, diğer ürünlere göre oldukça düşük seviyededir. Süte etkenin bulaşmasının genellikle sağım esnasında fekal yolla olduğu, ancak bazı olaylarda mastitisli hayvanların sütlerinden de etkenin izole edilebildiği bildirilmiştir. Bununla birlikte yetersiz pastörizasyon uygulamaları veya sütün daha sonra maruz kaldığı kontaminasyon sonucunda Campylobacter türleriyle kontamine olabilmektedir (Fahey ve ark., 1995). ABD nin Minesota eyaletinde yapılan bir çiftlik gezisinde 49 öğrencinin 22 sinde (% 45,0) ve 21 yetişkin bireyin 3 ünde (% 14,0) Campylobacter spp. kaynaklı infeksiyonların meydana geldiği olguda, 13 öğrenciden ve semptom göstermeyen 1 yetişkinden C. jejuni nin izole edildiği ve hastalığın piknik sırasında çiğ süt tüketimi sonucu ortaya çıktığı kaydedilmiştir (Korlath ve ark., 1985). Pastörize edilmemiş veya hatalı pastörizasyon işlemi uygulanmış süt tüketimine bağlı olarak şekillenen epidemilerde termofilik Campylobacter türleri önemli bir rol oynamaktadır. Çiğ sütte yapılan araştırmalarda etken % 0 ile 2,0 arasında izole edilebilirken, pastörizasyon derecelerinde kolaylıkla yıkımlandığından, pastörize sütlerde izolasyon bildirilmemiştir (Sopwith ve ark., 2003; Devane ve ark., 2005).

45 34 Sütlerde bildirilen en yüksek Campylobacter izolasyon oranlarından biri Yang ve ark. (2003), tarafından real-time PCR tekniği ile yapılan bir çalışmada elde edilmiştir. Araştırma sonucunda, 300 çiğ süt örneğinin 82 sinden (% 27,3) C. jejuni identifiye etmişlerdir. Jayarao ve ark. (2006) ABD nin Pensilvanya eyaletindeki çiftliklerde yaptıkları çalışmada, 248 süt toplama tankından alınan örneklerin % 2,0 ından C. jejuni saptadıklarını bildirmişlerdir. Whyte ve ark. (2004) İrlanda nın 3 farklı şehrindeki perakende satış noktalarından aldıkları 62 çiğ süt örneğinin 1 inden (% 1,6) termofilik Campylobacter türlerini izole ettiklerini, çiğ sütlerden yapılmış 66 peynir örneğinden etken izole edemediklerini bildirmişlerdir. Pakistan ın 3 büyük şehrinde ve bölgedeki çiftliklerde yılları arasında yapılan bir çalışmada, çiftliklerdeki çiğ süt toplama tanklarından alınan 127 örneğin 13 ünden (% 10,2) termofilik Campylobacter türleri izole edilmiş ve izolatların % 92,4 ü C. jejuni, % 7,6 sı ise C. coli olarak identifiye edilmiştir (Hussain ve ark., 2007) Su Bazı sporadik Campylobacter salgınlarından işlem görmemiş içme ve yüzey suları sorumlu tutulmaktadır. Yüzey sularının kontaminasyonunda, infekte su kuşları etkili olmaktadır. Deniz suyu, nehir ve körfez sularının 100 ml sinde 10 ile 230 Campylobacter izole edildiği bildirilmiştir. (Sopwith ve ark., 2003). Kanalizasyon sularında etkenin bulunma oranı, bölgenin hayvan ve insan nüfusu yoğunluğu ile mevsimsel etkiye bağlı olarak değişkenlik göstermektedir. Campylobacter türlerinin atık sularda canlı kalabilmeleri için gerekli yaşam maddeleri ve oksijenin azlığı

46 35 nedeniyle diğer mikroorganizmalara göre daha az canlı kalabildiği bildirilmiştir (Jones, 2001). Yang ve ark. (2003) kaynak ve yüzey sularının C. jejuni ile kontaminasyon düzeyini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada herbiri 75 şer adet olmak üzere toplam 150 örneği analiz etmişler ve kaynak sularının % 8,0 ının, yüzey sularının % 19,3 ünün C. jejuni ile kontamine olduğunu saptamışlardır. Devane ve ark. (2005) 293 nehir suyu örneğini Campylobacter yönünden incelemişler ve örneklerin % 55,3 ünden C. jejuni, % 4,0 ından C. coli identifiye etmişlerdir. İngiltere de arasında yapılan bir çalışmada, 198 nehir suyu örneğinin 74 ünden (% 37,0) C. jejuni identifiye edildiği bildirilmiştir (Sopwith ve ark., 2008) Campylobacter jejuni nin İzolasyon ve İdentifikasyon Teknikleri Campylobacter jejuni nin izolasyon ve identifikasyonunda; kültür, hızlı teknikler ve immunolojik teknikler kullanılmaktadır Kültür Teknikleri: Kültür tekniğinde zenginleştirme işleminde başlıca Preston Broth, Bolton Broth, Campylobacter Enrichment Broth, Exeter Broth, Park ve Sanders Broth kullanılmaktadır (Corry ve ark., 1995). Termofilik Campylobacter türlerinin izolasyonunda antibiyotik supplementi içeren besiyerlerini 37 C yerine, 42 C de inkübasyona bırakan ilk araştırıcılar Butzler ve Skirrow (1979) dur. Bolton ve Robertson ise izolasyonda selektiviteyi sağlayan Preston ve Modifiye Charcoal Cephoperazone Desoxycholate (mccd) agarı geliştirmişlerdir. İzolasyon için kullanılan zenginleştirme brothu Preston ve katı besiyeri CCDA ya oksijen toksisitesinin giderilmesi amacıyla kan, aktif kömür (charcoal), demir sülfat ve

47 36 sodyum piruvat katılmasının uygun olacağı bildirilmiştir (Fricker, 1984; Baylis ve ark., 2000). ISO (The International Organization for Standardization 10272), termofilik Campylobacter türlerinin yem ve gıdadan izolasyonu için ön zenginleştirme amacıyla Preston brothu, katı besiyeri olarakta mccd agarı önermiştir (Anon, 1995). Kültür tekniğinde, termofilik Campylobacter türlerinin identifikasyonunda kullanılan hippurat hidroliz testi, C. jejuni nin diğer türlerden ayrımında kullanılmaktadır. C. jejuni hippuratın peptit bağlarını yıkımlayarak, glisin ve benzoik asit meydana getirmektedir. Benzoik asidin, demir klorit indikatörü ile tespit edilmekte, glisinin ise ninhidrin ile reaksiyona girerek, mor renkli halka oluşturmaktadır. Ancak, hippurat hidrolizi aerob ortamda ve kısa sürede yapıldığı için anaerob ortam, inokulum miktarı, inkübasyon süresi ve sıcaklık derecesi test sonucunu etkilemektedir (Corry ve ark., 1995) Hızlı Teknikler: Kültür tekniklerinin gerek pahalı olması, gerekse uzun zaman almasından dolayı, Campylobacter türlerinin saptanması ve genomik karakterizasyonu amacıyla identifikasyonda daha hassas ve hızlı teknikler geliştirilmiştir. Hızlı teknik ile hem zaman tasarrufu sağlanabilmekte, hem de identifikasyonlar daha duyarlı biçimde yapılabilmektedir. Polymerase Chain Reaction (PCR), flagellin tiplendirme, Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Ribotyping, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Nucleotide Sequencing, multiplex PCR-RFLP ve Immunomagnetic Capture-Fluorescent PCR (IMC-FPCR) gibi genetik tiplendirme metodları uygulamaya konulmuştur (Wassenaar ve Newell, 2000; Liu ve ark., 2006). C. jejuni ve C. coli nin fenotipik identifikasyonları açısından önemli bir test olan hippurat hidrolizinin subjektif değerlendirmeler sonucunda yanılmalara neden olabileceği kaydedilmiştir. Bu nedenle teste tamamlayıcı olmak ve birbirine çok

48 37 yakın olan bu Campylobacter spp. nin ayrımını kolaylaştırmak için PCR ile spesifik identifikasyon çalışmalarının yapılabileceği bildirilmiştir (Bolton ve ark., 2002) İmmunolojik Teknikler: Kültür metodu ile elde edilen Campylobacter türlerinin doğrulanması amacıyla immunolojik tespit metodları kullanılmaktadır. İmmunolojik yöntemlerin prensibi; kültür ortamından alınan bakteri solusyonundan antijenlerin açığa çıkarılarak, spesifik polivalan anti-serumlarla lateks ortamında stabilize edilen Campylobacter türlerinin, antikorlarla reaksiyon vermesi esasına dayanmaktadır (Feng, 2007) Korunma ve Kontrol Avrupa Birliği nin 1999/72/EC sayılı Zoonozlar Direktifi uyarınca, üye ülkelerde meydana gelen campylobacteriosis olgularının yıllık raporlar halinde bildirilmesi zorunlu kılınmıştır. Bu raporların hazırlanmasında bölgesel halk sağlığı ofislerindeki beşeri hekimlerin, veteriner hekimlerin, halk sağlığı ve çevre sağlığı personellerinin ortak çalıştıkları bildirilmiştir (Anon, 2000). Termofilik Campylobacter lerin neden olduğu gıda infeksiyonundan korunma ve kontrolün sağlanması için çiftlik, mezbaha, dağıtım, muhafaza ve mutfak aşamalarında gerekli tedbirler alınmalıdır. Bu kapsamda dikkat edilmesi gerekli hususlar aşağıda belirtilmiştir (Allos, 2001; Altekruse ve Tollefson, 2003; Erol, 2007). Sağlıklı anaç sürülerden elde edilen sağlıklı civcivlere C. jejuni nin yem, su, rodent, insekt, personel ve kullanılan çeşitli ekipmanlarla bulaşması önlenmelidir. Bu amaçla yarışmacı bakterilerin barsağa kolonizasyonunun sağlanmasının (Competetive Exclusion) yanı sıra, özellikle mezbahalarda çapraz kontaminasyonun önlenmesi için başta Kritik Kontrol Noktaları ve Tehlike Analizleri (HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points) olmak üzere,

49 38 İyi Üretim Uygulamaları (GMP: Good Manufacturing Practices) gibi sistemler uygulamaya geçirilmelidir. Altlıklar kuru ve temiz olmalıdır. Tüketim aşamasında ise yapılması gerekenleri şöyle sıralamak mümkündür: Mutfakta çapraz kontaminasyonun önlenmesi için kullanılan alet ve materyaller ayrılmalı, temizlik için sıcak su ve uygun deterjanlar kullanılmalıdır. Kanatlı ürünleri yetersiz pişirilerek tüketilmemeli, ürünün merkez sıcaklığının en az 70 C olmasına dikkat edilmelidir. İçme ve kullanma sularına etkili dezenfeksiyon işlemleri uygulanmalıdır. Tüm aşamalarda personel hijyenine özen gösterilmelidir.

50 39 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Bu çalışmada, yılı Kasım-Aralık-Ocak ve Mayıs-Haziran-Temmuz aylarında 3 farklı firma (A, B, C) tarafından paketlenmiş formda taze olarak satılan hindi but, göğüs ve kuşbaşı örnekleri materyal olarak kullanıldı. Bu çerçevede her ay but, göğüs ve kuşbaşı örneklerinden 15 er adet olmak üzere 6 ayda toplam 270 örnek termofilik Campylobacter yönünden incelendi. 2.2 Campylobacter jejuni nin İzolasyon ve İdentifikasyonunda Kullanılan Besiyerleri ve Test Ayıraçları Preston Broth Kültür tekniğinin zenginleştirme aşamasında kullanılmak üzere, Nutrient broth No:2 (Oxoid CM 67, Hampshire, İngiltere) hazır besiyerinden 12,5 g tartılarak 500 ml distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7,5±0,2 ye ayarlanarak 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edildi. Otoklavdan çıkarılan besiyeri 50 C ye kadar soğutulduktan sonra üzerine 25 ml steril lize at kanı (% 5 lik) (Oxoid SR 048), 1 vial Campylobacter Growth Supplement (Oxoid SR 232E) ve 2 ml aseton ve steril distile su karışımı (1/1) ile süspanse edilmiş 1 vial Preston Campylobacter Selective Supplement (Oxoid SR 117E) ilave edilerek karıştırıldı ve 4 C de muhafaza edildi Charcoal Cephoperazone Desoxycholate (CCD) Agar Kültür tekniğinde selektif katı besiyeri olarak kullanılmak üzere, Campylobacter Blood-Free Selective Agar Base (Oxoid CM 739) hazır besiyerinden 22,75 g tartılarak 500 ml distile su içerisinde çözündürüldü ve ph değeri 7,4 ± 0,2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda iyice eritildi. 121 C de 15 dakika otoklavda

51 40 sterilize edildi. Otoklavdan çıkarılan besiyeri 50 C ye kadar soğutulduktan sonra üzerine 2 ml steril distile su ile süspanse edilmiş Charcoal Cephoperazone Desoxycholate (CCD) Agar Selective Supplementden (Oxoid SR 155E) 1 vial eklendi. Besiyeri steril petrilere dökülerek 4 C de muhafaza edildi Kanlı Agar Columbia Blood Agar Base (CBAB) (Oxoid CM 331) hazır besiyerinden 39 g tartılarak 1 lt distile su içerisinde çözündürüldü ve ph değeri 7,3 ± 0,2 ye ayarlandı. Su banyosunda kaynatılarak eritildi ve 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildi. Otoklavdan çıkarılan besiyeri 50 o C ye soğutulduktan sonra üzerine 50 ml steril defibrine koyun kanı eklenerek % 5 lik olarak hazırlandı. Besiyeri steril petrilere dökülerek 4 o C de muhafaza edildi Triple Sugar Iron (TSI) Agar Triple Sugar Iron (TSI) Agar (Oxoid CM 277) hazır besiyerinden 65 g alınarak 1lt distile su içerisinde çözündürüldü ve ph değeri 7,4 ± 0,2 ye ayarlandı. Su banyosunda kaynatılarak eritildi ve sıvı halde iken tüplere 7-8 ml olacak şekilde dağıtıldı. 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra yatık agar şeklinde hazırlandı ve 4 o C de muhafaza edildi Mueller Hinton Agar (MHA) Mueller Hinton Agar (MHA) (Oxoid CM 337) hazır besiyerinden 38 g tartılarak 1 lt distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7,4 ± 0,2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda tamamen eritildi. 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra, 50 C ye kadar soğutuldu ve üzerine % 5 lik steril defibrine koyun kanı ilave edildi. Besiyeri steril petrilere dökülerek 4 o C de muhafaza edildi.

52 Brucella Broth Brucella Broth Base (Sigma B 3051, Saint Louis, ABD) hazır besiyerinden 14,05 g tartılarak 500 ml distile suda çözündürüldü ve ph değeri 7,0 ± 0,2 ye ayarlandıktan sonra cam tüplere 1 er ml olacak şekilde paylaştırıldı. Tüpler 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilerek 4 o C de muhafaza edildi Besiyerlerinde Kullanılan Supplementler Besiyerlerinde kullanılan supplementler ve kullanım miktarları çizelge 2.1 de gösterilmiştir. Çizelge 2.1. Besiyerlerinde kullanılan supplementler ve kullanım miktarları. Supplement Adı Supplement İçeriği Kullanım Miktarı Campylobacter Growth Supplement (Oxoid SR 232E) Preston Campylobacter Selective Supplement (Oxoid SR 0117E) CCD Agar Selective Supplement (Oxoid SR 155E) Steril Lysed Horse Blood (Oxoid SR 048) Steril Defibrine Koyun Kanı Bir Vialinde 0,125 g Sodium pyruvate 0,125 g Sodium metabisulphite 0,125 g Ferrous sulphate Bir Vialinde 2500 İU Polymyxin B 5,0 mg Rifampicin 5,0 mg Trimethoprim 50,0 mg Cycloheximide Bir Vialinde 16 mg Cefoperazone 5,0 mg Amphotericin B Steril Lize At Kanı Steril Defibrine Koyun Kanı Bir vial supplement 500 ml besiyeri için hazırlanmıştır. Bir vial supplement 500 ml besiyeri için hazırlanmıştır. Bir vial supplement 500 ml besiyeri için hazırlanmıştır. Besiyerine % 5 oranında ilave edilerek kullanılmıştır. Besiyerine % 5 oranında ilave edilerek kullanılmıştır Hippurat Test Ayıracı Hazır kimyasal maddelerden; Sodyum kloritden (Merck , Darmstadt, Almanya) 8,5 g, Disodyum hidrojen fosfat dihidratdan (Merck ) 8,98 g ve Sodyum dihidrojen fosfat monohidratdan (Merck ) 2,71 g tartıldı ve 1lt distile suda çözdürülerek PBS ( Phosphate Buffered Saline ) solusyonu hazırlandı.

53 42 Elde edilen PBS solusyonuna 10 g sodyum hippurat (Merck , Hohenbrunn, Almanya) ilave edilerek % 1 lik Na-hippurat solusyonu hazırlandı ve 0,22 µm por çapına sahip membran filtreden geçirilerek sterilize edildi. Bu solusyon daha sonra kullanılmak üzere 0,4 er ml steril cam tüplere paylaştırıldı ve kullanılıncaya kadar -20 C de saklandı Ninhidrin Solusyonu Hazır ninhidrinden (Merck ) 3,5 g tartılarak 50 ml aseton (Merck ) ve 50 ml bütanol (Merck ) karışımı içerisinde (1/1) süspanse edildi. Hazırlanan % 3,5 lik ninhidrin solusyonu taze olarak kullanıldı Oksidaz Test Bactident Oxidase (Merck ) Katalaz Test Hazır % 30 luk hidrojen peroksitten (H 2 O 2 ) (Merck 8597) 2 ml alındı ve 27 ml distile suda karıştırılarak katalaz testinde kullanılmak üzere % 3 lük H 2 O 2 solusyonu hazırlandı Antibiyotik Diskleri Sefalotin (Oxoid CT 0010B) 30 µg Nalidiksik asit (Oxoid CT 0031B) 30 µg

54 CampyGen Gaz Kitleri Anaerobik jarlar içinde mikroaerofilik ortam sağlayan lt lik CampyGen (Oxoid CN 025A- CN 035A) ticari gaz kitleri kullanıldı PCR da Kullanılan Maddeler Taq DNA polymerase (Promega M3005, Madison, ABD) PCR Buffer (Promega M8901) MgCl 2 ((Promega A3511) dntp s (datp, dctp, dgtp, dttp) (Promega U1515) 500 U (5 U/µl) 10X 25 mm 10 mm Gene Ruler Seti DNA Ladder Plus (Promega G210A) Blue/Orange Loading Dye (Promega G190A) 100bp 6X Primer Çiftleri Campylobacter jejuni için; 735 baz çifti (bp) büyüklüğünde DNA bandı veren, HipO (Hippurat hydrolase) gen primeri (Integrated DNA Technologies- IDT, Leuven, Belçika) kullanıldı (Linton ve ark., 1997). Primer-I (hip 400F) : 5 -GAA GAG GGT TTG GGT GGT 3 Primer-II (hip 1134R) : 5 -AGC TAG CTT CGC ATA ATA ACT TG- 3 Campylobacter coli için; 984 baz çifti (bp) büyüklüğünde DNA bandı veren, ceue (demir bağlama) gen primeri (Integrated DNA Technologies- IDT, Leuven, Belçika) kullanıldı (Gonzalez ve ark., 1997). Primer-I (COL1) : 5 -ATG AAA AAA TAT TTA GTT TTT GCA-3 Primer-II (COL2) : 5 -ATT TTA TTA TTT GTA GCA GCG-3

55 44 Campylobacter lari için; 579 baz çifti (bp) büyüklüğünde DNA bandı veren, 16S rrna gen primeri (Integrated DNA Technologies- IDT, Amerika) kullanıldı (Oyarzabal ve ark., 1997). Primer-I (CL55) : 5 -ATG CAA GTC GAA CGA TGA AGC GAC- 3 Primer-II (CL632) : 5 -CCA CTC TAG ATT ACC AGT TTC CC- 3 HPLC saflıkta sentezletilmiş olan primerler liyofilize olarak temin edildi ve üretici firmanın önerdiği miktarlarda steril bidistile su ile sulandırıldı TBE Solüsyonu Hazır kimyasal maddelerden; Tris-Hidroksimetilaminoetandan (Merck ) 54,5 g, Borik asitden (Merck ) 27,8 g ve Titripleks II den (Merck ) 2,9 g tartıldı ve distile suyla 1 lt ye tamamlandı. Bu şekilde 5X TBE stok solusyonu hazırlandı. Stok solüsyondan 200 ml alınarak distile su ile 1 lt ye tamamlanıp 1X TBE solusyonu elde edildi Ethidium Bromide Ethidium Bromide (AppliChem A 1152 GmbH, Darmstadt, Almanya) stok solüsyonundan 1:9 oranında sulandırılarak 1 µg/ml konsantrasyonda kullanıldı Agaroz Jel Agaroz jel (% 1,5 lik) hazırlamak için, agarozdan (Cambrex SeaKem LE Agarose, Rockland, ABD) 4,5 g tartılarak 300 ml 1X TBE de çözündürüldü. Mikrodalga fırında eritildi ve yaklaşık 50ºC ye soğutuldu. İçerisine 300 µl ethidium bromide eklendi ve elektroforez küvetine dökülerek kullanıma uygun hale getirildi.

56 Campylobacter jejuni İzolatlarının Antibiyotik Dirençlilik Testinde Kullanılan Besiyerleri ve Antibiyotik Diskleri Mueller Hinton Agar Mueller Hinton Agar (Oxoid CM 337) hazır besiyerinden 38 g alınıp 1 lt distile suda çözündürülerek ph değeri 7,3 ± 0,2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda tamamen eritildi. 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra 50 o C ye kadar soğutuldu ve besi yeri steril petrilere yaklaşık 4 mm kalınlıkta dökülerek hazırlandı ve 4 o C de muhafaza edildi Antibiyotik Diskleri Azitromisin (AZM) (Oxoid CT0906B) 15 µg Eritromisin (E) (Oxoid CT0020B) 15 µg Gentamisin (CN) (Oxoid CT0024B) 10 µg Kloramfenikol (C) (Oxoid CT0013B) 30 µg Nalidiksik asit (NA) (Oxoid CT0031B) 30 µg Siprofloksasin (CIP) (Oxoid CT0425B) 5 µg Tetrasiklin (TE) (Oxoid CT0054B) 30 µg 2.5. Standart Suşlar Bu çalışmada, Campylobacter jejuni in izolasyon, identifikasyon ve PCR analizlerinde ATCC (Oxoid 1400 L) referans suşu kullanıldı. Ayrıca PCR ile C. jejuni olarak doğrulanamayan izolatların C. coli veya C. lari olup olmadıklarının PCR analizi ile incelenmesinde C. coli ATCC (Microbiologics, Minnesota, ABD ) ve C. lari NCTC (Refik Saydam No.: 06040) (Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı, Ankara, Türkiye) referans şuşları kullanıldı. C. jejuni izolatlarının antibiyotik duyarlılık testlerinde ise S. aureus ATCC kontrol suşu kullanıldı.

57 Yöntem Değişik marketlerden alınarak soğuk zincir altında laboratuvara getirilen 3 farklı firmaya ait (A, B, C) paketlenmiş formdaki taze hindi but, göğüs ve kuşbaşı örnekleri hemen analize alındı. Bu kapsamda; i) Hindi etlerinde termofilik Campylobacter türleri kültür tekniği ile izole ve identifiye edildi. ii) Termofilik Campylobacter türlerinin mevsimsel dağılımı belirlendi. iii) C. jejuni olarak belirlenen izolatlar hipo gen sekansı esas alınarak PCR tekniği ile doğrulandı. ve iv) PCR ile doğrulanan C. jejuni izolatlarının antibiyotiklere karşı dirençlilikleri saptandı. Yöntem gereğince hindi but, göğüs ve kuşbaşı örneklerinin analizi aşağıda sırasıyla açıklanmıştır Campylobacter jejuni nin Kültür Tekniğiyle İzolasyon ve İdentifikasyonu Örneklerde Campylobacter jejuni nin kültür tekniğiyle izolasyon ve identifikasyonu zenginleştirme işlemine dayalı ISO (The International Organization for Standardization, 10272) yöntemine göre yapıldı (Şekil 2.1) (Anon, 1995) Zenginleştirme İşlemi: Zenginleştirme aşamasında, soğuk zincir altında laboratuvara getirilen paketlenmiş formdaki hindi but eti (derili) ve hindi göğüs eti (derisiz) örneklerinin (en az 200 g.) aseptik koşullarda her birinin yüzeyinden ayrı ayrı steril bistüri ve makas yardımıyla 1-2 mm kalınlığında 10 g kesitler alınarak (Anon, 1995), hindi kuşbaşı eti örneklerinden ise Anon (1995), Whyte ve ark. (2004) ile Saito ve ark. nın (2005) önerdiği yönteme göre 10 ar g tartılarak örnekler içlerinde 90 ar ml Preston Broth (Oxoid CM 67, SR 048, SR 232E, SR 117E) bulunan steril filtreli numune poşetlerinin (Bag Fitler 400P, Interscience, St. Nom La Breteche, Fransa) içerisine konuldu. Karışım stomacherde (AES Laboratoire easymix, Combourg, Fransa) 30 saniye homojenize edildi ve zenginleştirme amacıyla 42 C de 24 saat mikroaerofilik ortamda inkübasyona bırakıldı.

58 47 Zenginleştirme [(10 g Hindi eti + Preston Broth (90 ml)] Mikroaerofilik 42 C de 24 saat inkübasyon Katı Besiyerine Ekim (mccda ) Mikroaerofilik 42 C de saat inkübasyon Columbia Blood Agara Şüpheli kolonilerin geçilmesi Mikroaerofilik 42 C de 24 saat inkübasyon Gram Boyama Hareketlilik Hippurat Hidroliz Testi Brucella Broth Oksidaz Testi Aerob 37 C de 2 saat inkübasyon 25 C de Üreme Özelliği Mueller Hinton Agar Nalidiksik asit Sefalotin diskleri Katalaz Testi Mikroaerofilik 37 C de 24 saat inkübasyon Karbonhidrat Fermentasyon H 2 S oluşumu Mikroaerofilik 42 C de 24 saat inkübasyon Şekil 2.1. Campylobacter jejuni izolasyon ve identifikasyon şeması (Anon, 1995).

59 Katı Besiyerine Ekim ve Kolonilerin Değerlendirilmesi: Preston brothdan inkübasyon sonrası 2 öze dolusu alınarak, önceden hazırlanmış petrilerdeki CCD agara (Oxoid CM 739, SR 155E) çizme yöntemi ile ekim yapıldı ve petriler mikroaerofilik koşullarda 42 C de saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası CCD agarda üreyen 1-2 mm çapında konveks, parlak, düzgün kenarlı ve grimsi renkte termofilik Campylobacter spp. şüpheli tipik kolonilerden, 5 i seçilerek % 5 lik steril defibrine koyun kanı içeren kanlı agara (Columbia Blood Agar Base; Oxoid CM 331) geçildi ve plaklar 42 C de 24 saat mikroaerofilik ortamda inkübe edildi (Şekil 2.2). Şekil 2.2. CCD Agarda termofilik Campylobacter spp. kolonilerinin görünümü Campylobacter jejuni İdentifikasyonu Kanlı agarda üreyen şüpheli kolonilerden öze ile alınarak identifikasyon amacıyla Gram boyama ve mikroskobik bakı, hareketlilik (Brucella Broth Base; Sigma B 3051), katalaz (% 3 lük H 2 O 2 ile) ve oksidaz (Bactident oxidase, Merck ) testleri yapıldı. Gram negatif, spiral veya martı kanadı formlu, katalaz pozitif, oksidaz pozitif ve hareketli Campylobacter kolonilerinin identifikasyonu amacıyla sodyum hippurat çözeltisi içerisinde hippurat hidrolizi, TSI agarda (Triple Sugar Iron Agar; Oxoid CM 277) H 2 S oluşumu ve karbonhidrat fermentasyon testi ile % 5 lik steril defibrine koyun kanı içeren Mueller Hinton agarda (Oxoid CM 337) nalidiksik asit (30 µg; Oxoid CT 0031B) ve sefalotin (30 µg; Oxoid CT 0010B) antibiyotik

60 49 diskleri ile duyarlılık testleri yapılarak izolatların identifikasyonu gerçekleştirildi. Buna göre; hippurat hidrolizi pozitif, glikoz, sukroz ve laktoz negatif ve H 2 S in oluşmadığı karbonhidrat fermentasyon testi pozitif ve Mueller Hinton agarda nalidiksik aside duyarlı, sefalotine dirençli izolatlar Campylobacter jejuni olarak identifiye edildi (Çizelge 2.2). Çizelge 2.2. Termofilik Campylobacter türlerinin biyokimyasal testleri ve tür ayrımı şeması (Anon., 1995). Karakteristikler C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis Katalaz veya zayıf Oksidaz Hippurat hidrolizi H 2 S üretimi - + veya zayıf - - Karbonhidrat fermentasyonu C de üreme Nalidiksik asit Duyarlı Duyarlı Dirençli Duyarlı Sefalotin Dirençli Dirençli Dirençli Duyarlı Gram Boyama ve Mikroskobik Bakı: Şüpheli kolonilerden lam üzerinde preparatlar hazırlanarak alevde tespit edildi, kristal viyole ile 1-2 dakika boyandıktan sonra saf su ile yıkandı. Bir dakika lugol çözeltisi uygulamasını takiben önce % 96 lık alkol ile daha sonra saf su ile yıkandı. Yıkanan preparatlar sulu karbon fuksin çözeltisi ile saniye boyandıktan sonra tekrar saf su ile yıkanıp kurutuldu (Anon, 1995). Bu şekilde Gram boyaması yapılan preparatlar mikroskobun (Nikon Alphaphot-2, Japonya) immersiyon objektifinde incelendi ve kırmızı renk almış, spiral veya martı kanadı formundaki mikroorganizmalar Campylobacter şüpheli olarak kabul edildi (Şekil 2.3). Şekil 2.3. Gram boyamada termofilik Campylobacter türlerinin mikroskobik görünümü.

61 Hareketlilik Testi: Hareketlilik testi Campylobacter şüpheli kolonilerin, 24 saatlik Brucella broth kültürlerinden yapıldı. Bu amaçla, 37 C de 24 saat süreyle inkübasyonu takiben, etüvden çıkarılan broth kültürlerinden bir öze dolusu lam üzerine konularak, faz kontrast mikroskopta hareket muayenesi yapıldı. Martı kanadı, virgül ya da spiral yapıda görülen, hareketli hücreler Campylobacter olarak değerlendirildi (Anon,1995) Katalaz Testi: Kanlı agardan alınan koloniler bir lam üzerinde öze yardımıyla bir damla % 3 lük H 2 O 2 ile karıştırıldı, 30 saniye içinde görülen köpürme şeklindeki gaz oluşumu katalaz pozitif olarak değerlendirildi (Şekil 2.4) (Anon, 1995). Şekil 2.4. Campylobacter jejuni şüpheli izolatın katalaz testindeki pozitif ve negatif görünümü Oksidaz Testi: Test çubuğu kanlı agardaki şüpheli Campylobacter kolonisine dokundurularak, 10 saniye içinde mor menekşe renk oluşması oksidaz test pozitif olarak değerlendirildi (Anon, 1995) Hippurat Hidroliz Testi: Kanlı agarda üreyen şüpheli Campylobacter kolonilerinden, içerisinde 0,4 ml sodyum hippurat çözeltisi bulunan tüp içerisine bir öze dolusu geçilerek, 37 C de 2 saat süreyle su banyosunda inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası, tüplerin kenarından % 3,5 lik taze hazırlanan ninhidrin ayıracından 0,2 ml ilave edilerek, 10 dakika daha inkübasyona devam edildi. İnkübasyon sonrası koyu mavi renk oluşumu hippurat pozitif, açık mavi veya renk oluşmaması hippurat negatif olarak değerlendirildi (Şekil 2.5) (Anon, 1995).

62 51 Pozitif C. jejuni Negatif Kontrol Pozitif Kontrol C. jejuni Şekil 2.5. Campylobacter jejuni şüpheli izolatın hippurat hidroliz testi görünümü H 2 S Oluşumu ve Karbonhidrat Fermentasyon Testleri: Bu amaçla kanlı agarda üreyen şüpheli Campylobacter kolonilerinden bir öze dolusu alınarak TSI agara geçildi ve tüpler 42 C de 24 saat inkübe edildi. Campylobacter jejuni karbonhidratları oksitadif ve fermentatif olarak değerlendiremediği için besiyeri içeriğindeki glikoz, sukroz ve laktozun negatif olması C. jejuni için pozitif olarak değerlendirildi (Şekil 2.6) (Anon, 1995). Pozitif Negatif Şekil 2.6. Campylobacter jejuni şüpheli izolatın karbonhidrat fermentasyon testi görünümü.

63 C de Üreme Özelliği: Bu amaçla, kanlı agarda üreyen şüpheli Campylobacter kolonilerinden bir öze dolusu alınarak Brucella brotha 1 öze dolusu geçildi. 25 C de 2-5 gün süreyle mikroaerofilik ortamda inkübasyona bırakılarak üreme yönünden test edildi (Anon, 1995) Antibiyotik Duyarlılık Testi: Kanlı agarda üreyen kolonilerden bir öze dolusu alınarak içerisinde 1 ml Brucella broth bulunan tüp içerisinde süspansiyonu yapıldı. Daha sonra önceden hazırlanmış olan ve % 5 defibrine koyun kanı içeren Mueller Hinton besiyerine bakteri süspansiyondan 0,1 ml ekildi. Ekim işlemini takiben petriler kurumaya bırakılarak, kuruma işlemi sonrası nalidiksik asit (30 µg) ve sefalotin (30 µg) içeren antibiyotik diskleri konularak 37 C de 24 saat süreyle mikroaerofilik ortamda inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası, disklerin etrafında 6 mm ve daha geniş çapta bir zon oluşması duyarlılık, daha küçük zon oluşması veya hiç zon oluşmaması dirençlilik olarak değerlendirildi (Şekil 2.7) (Anon, 1995). Nalidiksik aside duyarlı, sefalotine dirençli olan şuşlardan hippurat pozitif olanlar C. jejuni, hippurat negatif olanlar C. coli olarak değerlendirildi. Her iki antibiyotiğe dirençli olup, hippurat negatif olan koloniler C. lari olarak değerlendirildi. Pozitif kontrol C. jejuni Pozitif C. jejuni veya C.coli Nalidiksik Asit Nalidiksik Asit Zon Sefalotin Sefalotin Şekil 2.7. Nalidiksik asit ve sefalotin antibiyotik testi görünümü. Sefalotin (dirençli) Nalidiksik asit (duyarlı).

64 C. jejuni Suşlarının Saklanması Kültür tekniği ile 36 sı but, 55 i göğüs ve 32 si kuşbaşı olmak üzere 123 hindi eti örneğinden C. jejuni olarak identifiye edilen toplam 423 koloni (118 i but, 197 si göğüs ve 108 i kuşbaşı olmak üzere) PCR tekniği ile doğrulanmak amacıyla -85 C de muhafaza edildi. Bu amaçla, Brucella broth içerisinde süspanse edilen suşlar, Gorman ve Adley (2004) tarafından önerilen metoda göre % 20 gliserol (Merck ) eklenerek kriyovialler içerisinde -85 C de (Sanyo MDF-U5186S, Japonya) dondurularak saklandılar Campylobacter jejuni İzolatlarının PCR Tekniği ile Doğrulanması Çalışmanın bu aşamasında, kültür tekniği ile C. jejuni olarak belirlenen izolatların PCR ile analizinde önce DNA ekstraksiyonu ve PCR koşulları optimize edildi. Daha sonra uygulanan 3 farklı PCR protokolü ile C. jejuni dışındaki C. coli ve C. lari verifikasyonu da yapıldı. Linton ve ark. (1997) tarafından önerilen protokol gereği hipo gen sekansını oluşturan oligonükleotid primer çifti (hip 400F: 5 -GAA GAG GGT TTG GGT GGT 3 ve hip 1134R: 5 - AGC TAG CTT CGC ATA ATA ACT TG- 3 ) kullanılarak izolatların PCR tekniği ile doğrulanması yapıldı. Tez projesinde olmamasına rağmen çalışmaya katkı sağlamak için PCR ile C. jejuni olarak doğrulanamayan izolatların gerçekte hangi termofilik Campylobacter türüne ait olabileceğinin ortaya konulması amacıyla önce C. coli olup olmadıkları Gonzalez ve ark. nın (1997) kullandığı PCR tekniği kullanılarak belirlendi. C. coli olarak belirlenemeyen izolatların C. lari olup olmadığı ise Oyarzabal ve ark. nın (1997) önerdiği şekilde PCR ile araştırıldı DNA Ekstraksiyonu: DNA ekstraksiyonu amacıyla birçok araştırıcı tarafından kullanılan direkt kaynatma metodu kullanıldı (Englen ve Cray, 2002). Bu amaçla, -85 C de muhafaza edilen izolatlar usülüne uygun olarak çözündürüldükten sonra, 1-2 öze dolusu CCD agara geçilerek, 42 C de saat süreyle mikroaerofilik koşullarda inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası CCD agarda üreyen kolonilerden alınarak, içlerinde 1 er ml steril bidistile su bulunan eppendorf

65 54 tüplerinde süspanse edilerek vortekslendi (Ika, MI 1 Minishaker, Wilmington, NC, ABD). Daha sonra hücre süspansiyonu 95 o C lik su banyosuna (Memmert WB/OB 7-45, WBU45, Schwabagh, Almanya) konularak 20 dakika bekletildi. Su banyosundan çıkartılan örnekler, 5000 g de 10 C de 15 dakika santrifüj (Eppendorf Centrifuge 5417R, Hamburg, Almanya) edilerek DNA ekstraksiyonu sağlandı. Santrifüj sonrası buz üzerine alınan örnek DNA lar PCR işlemi yapılana kadar -20ºC de muhafaza edildi PCR Protokolü ve Amplifikasyonu: C. jejuni ve C. coli için; 0,5 ml lik PCR tüplerinde 2,5 µl MgCl 2 içermeyen 10X PCR buffer (Promega M8901, Madison, ABD), 1,5 mm MgCl 2 (Promega A3511), 200 µm dntp karışımı (datp, dctp, dgtp, dttp) (Promega U1515), 2 U Taq DNA polimeraz (Promega M3005), her bir primerden 1 µm ve 5 µl örnek DNA olmak üzere toplam 25 µl hacimde PCR karışımları hazırlandı (Çizelge 2.3). PCR karışımı üzerine buharlaşmanın önlenmesi amacıyla steril mineral yağ (Sigma M5904) ilave edildi. C. lari için 10 µl hedef DNA, 5 µl PCR buffer 10X, 1 mm MgCl 2, 400 µm dntp karışımı, her bir primerden 1 µm ve 2,5 U Taq DNA polimeraz kullanılarak 50 µl hacimde PCR karışımı hazırlandı (Çizelge 2.3). C. jejuni nin amplifikasyon işlemi; örneklerin 94 C de 1 dakika denatürasyonu, 66 C de 1 dakika primer bağlanması ve 72 C de 1 dakika primer uzaması aşamalarını kapsayan 25 siklus halinde thermal cycler da (Biometra Personal Cycler, Goettingen, Almanya) gerçekleştirildi. Elde edilen amplikonlar son olarak 72 C de 5 dakika bekletilerek ilave primer uzaması işlemi sağlandı (Linton ve ark., 1997). Amplikonlar bir sonraki işleme kadar 4ºC de muhafaza edildi. C. coli için uygulanan amplifikasyon işleminde örnekler 94 C de 3 dakika denatüre edildikten sonra 30 siklus olmak üzere 94 C de 30 saniye, 57 C de 30 saniye ve 72 C de 1 dakika ısı-zaman uygulamalarına tabi tutuldu. Elde edilen ürünler 72 C de 5 dakika ilave primer uzaması için bekletildi. Bu işlemler sonunda

66 55 amplikonlar bir sonraki aşamaya kadar 4ºC de muhafaza edildi (Gonzalez ve ark., 1997). C. lari nin amplifikasyonu için örneklerin 94 C de 2 dakika ön denatürasyonundan sonra 25 siklus olmak üzere 94 C 30 saniye, 65 C 30 saniye ve 72 C 30 saniye ısı-zaman uygulamaları yapıldıktan sonra 72 C 5 dakika son ekstensiyon işlemi uygulandı. Elde edilen amplikonlar 4ºC de muhafaza edildi (Oyarzabal ve ark., 1997). Çizelge 2.3. PCR protokolleri. Bileşen C. jejuni Miktarı (µl) C. coli C. lari 10X PCR Buffer MgCl 2 2,5 1,5 2,5 1,5 5,0 2,0 dntp karışımı 0,5 0,5 4,0 Primer I 1,0 1,0 1,0 Primer II 1,0 1,0 1,0 Taq DNA polimeraz 0,4 0,4 0,5 Steril bidistile su 13,1 13,1 26,5 Örnek DNA 5,0 5,0 10,0 TOPLAM 25,0 25,0 50, Elektroforez: Amplifiye edilen DNA ların saptanması amacıyla, her bir örneğe ait 10 µl PCR ürünü 2 µl 6X Loading Dye (Promega G190A) ile boyandı. Ethidium bromide (AppliChem GmbH) ile 1 µl/ml (% 0,1 lik) oranında boyanmış olan % 1,5 lik agaroz jel (Cambrex SeaKem LE Agarose) hazırlanarak, üzerine yine 1 µl/ml oranında ethidium bromide ile boyanmış TBE solüsyonu konularak jel tamamen kaplandı. 10 ar µl hacminde ve 2 µl 6X Loading Dye ile boyanan pozitif kontroller (C. jejuni ATCC 33291, C. coli ATCC ve C. lari NCTC 11352), negatif kontrol (steril distile su), DNA Marker (Promega G210A) ve örneklere ait PCR ürünü jeldeki kuyucuklara yerleştirilip elektroforezde (Biometra Agagel-Maxi- System B15359) 100 voltda (Biometra Power Pack P25) 1 saat süreyle yürütüldü. Bu

67 56 işlem sonunda, elde edilen spesifik DNA bantları UV-Transilluminator (Biometra TI1 UV ) ve jel görüntüleme sistemlerinde (Syngene Ingenius, Cambridge, İngiltere) pozitif kontroller ve DNA Marker lar yardımıyla belirlendi (Şekil 2.8; Şekil 2.9). 100 bp 500 bp 735 bp Şekil 2.8. PCR ile hipo geni tespit edilmiş C. jejuni izolatlarının elektroforez görünümü (1 ve 8: 100 bp DNA marker, 2: Pozitif kontrol ( C. jejuni ATCC 33291), 3: Negatif kontrol, 4-7: hipo pozitif C. jejuni izolatları). 100 bp 500 bp 984 bp Şekil 2.9. PCR ile ceue geni tespit edilmiş C. coli izolatlarının elektroforez görünümü (1 ve 8: 100 bp DNA marker, 2 ve 7: Pozitif kontrol ( C. coli ATCC 43478), 3 ve 6: Negatif kontrol, 4 ve 5: ceue pozitif C. coli izolatları).

68 Antibiyotik Dirençlilik Testi PCR ile doğrulanan C. jejuni izolatlarının antimikrobiyel dirençlilik profilleri disk difüzyon yöntemi ile belirlendi. Bu işlem; NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) tarafından bildirilen yöntem esas alınarak Mueller-Hinton agarda (Oxoid, CM0337) ve azitromisin (15 µg, Oxoid CT0906B), eritromisin (15 µg, Oxoid CT0020B), gentamisin (10 µg, Oxoid CT0024B), kloramfenikol (30 µg, Oxoid CT0013B), nalidiksik asit (30 µg, Oxoid CT0031B), siprofloksasin (5 µg, Oxoid CT0425B) ve tetrasiklin (10 µg, Oxoid CT0054B) diskleri kullanılarak yapıldı (Anon, 2006a; Anon, 2006b ). İzolatların antibiyotik dirençliliklerini tespit etmek amacıyla -85 C derin dondurucuda (Sanyo MDF-U5186S) muhafaza edilen izolatlar önce CCD agarda 42 C de 24 saat mikroaerofilik ortamda inkübe edildi. Taze kültürden öze ile alınan C. jejuni kolonileri içerisinde 4-5 ml Brucella Broth (Sigma B 3051) bulunan tüplere transfer edildi. 37 o C de mikroaerofilik ortamda, türbiditesi 0,5 McFarland olana kadar yaklaşık 6 saat inkübe edildi. Türbidite kontrolü NanoDrop spektrofotometrede (NanoDrop ND-100, Delaware, ABD) 625 nm dalga boyunda absorbansları 0,08-0,10 olacak şekilde yapıldı. Steril svab zenginleştirilen suşları içeren broth içerisine daldırılıp, tüp çeperinde süzdürülerek % 5 lik defibrine koyun kanı içeren Mueller- Hinton agar ( Oxoid CM 337) yüzeyine svab tekniğiyle yayıldı. 150 mm çapındaki bir petriye 7 disk olacak şekilde ve disklerin merkezleri arasındaki uzaklık 24 mm den yakın olmayacak biçimde Mueller-Hinton agar yüzeyine antibiyotik diskleri yerleştirildi. 15 dakika içerisinde 37 o C de mikroaerofilik ortamda inkübasyona bırakıldı. İnkübasyondan saat sonra azitromisin, gentamisin, kloramfenikol, nalidiksik asit ve siprofloksasin diskleri etrafında oluşan inhibisyon zonlarının çapı Anon (2006a) tarafından NCCLS de Enterobacteriaceae lar için belirlenen standartlar, eritromisin ve tetrasiklin diskleri etrafında oluşan inhibisyon zonlarının çapı ise Anon (2006b) belirtilen standart değerler ile karşılaştırıldı. Buna göre; suşlar antibiyotiklere karşı duyarlı, orta dirençli veya dirençli olarak sınıflandırıldı (Şekil 2.10).

69 58 F A D E B G C Şekil C. jejuni nin Mueller Hinton agarda disk difüzyon testi görünümü (A, B, C ve D: Duyarlı. E, F ve G: Dirençli) İstatistiksel Analizler Hindi but, göğüs ve kuşbaşı örneklerinde termofilik Campylobacter türlerinin prevalansı üzerine mevsimsel ve firmalar arasındaki farklılığın etkisi istatistiksel olarak ki-kare testi ile belirlendi (SPSS, versiyon 14.01, Ref. No: ).