ARVI Screen Real-TM. El Kitabı

Transkript

1 IVD Sadece in Vitro Diagnostic Kullanım ARVI Screen Real-TM El Kitabı İnsan parainfluenza virus-1-4 (hpiv); ОС43, Е229, NL63, and HKUI human coronavirus (hcov); insan rhinovirus (hrv); insan B, C, ve E adenovirus (hadv) ve insan bocavirus (hbov) Tanımlama ve Tespiti için Multiplex RT- PCR REF REF V57-100FRT TV57-100FRT 100

2

3 İSİM ARVI Screen Real-TM GİRİŞ Çoğu akut solunum yolu hastalıkları, viral enfeksiyonlarıdır.akut solunum yolu viral enfeksiyonları (ARVI), dünya çapında bir çok insanın yaşadığı, en sık görülen hastalıklardandır. Küçük çocuklar, her yıl 5 ila 7 kez bu hastalıklara yakalanır (artan yaş ile görülme sıklığındaki genel azalmayla). Yetişkinler ise bu tür hastalıkları yılda yaklaşık iki kez geçirir. Hem RNA hem de DNA ihtiva eden virüs çeşitleri, akut solunum enfeksiyonlarına neden olur. En önemli virüsle; rinovirusler, koranavürüsler, parainfluenza virüsleri,solunum sinstiyal virusleri, adeno virusler ve metafömoviruslerdir. Rinovirüsler soğuk algınlığının en sık nedenidir. Yıl boyunca sirküle olurlar ve solunum yolu hastalıklarının sonbahardaki artışlarının başlıca sebebidirler. Virusün birden fazla tipe sahip olması, sadece tek bir virüs türünün sorumlu olduğu bulaşıcı hastalığın salgınından farklılığa yol açar. Coronaviruse de soğuk algınlığının başlıca ajanlarındandır. Bu viruslerle laboratuarda çalışmanın bilim adamları için zorlukları vardır ve alışıldık metodlarla virus tespiti sonuçlar açısından verimli değildir. Genellikle kış ve bahar aylarında, her biri sınırlı bir zaman süreci boyunca görülen coronaviruslerin en az 2 ana tipi vardır. Parainfluenza virusün dört tipi vardır. Parainfluenza tip 4, soğuk algınlığını biraz daha fazla üreten oluşumdaki sporadik bir ajandır. Bu nedenle bunun aktivitesi, nadiren virüsle karşılaşıdığı durumlar dışında farklı alan çeşitliliğinde aranan kapsamlı bir araştırmanın parçası olarak tarif edilmiştir. Buna karşılık, küçük çocuların hastane ortamında ciddi solunum hastalıklarının nedenleri incelenmiş ve, parainfluenza tip 1, 2 ve 3 ile RSV tespit edilmiştir. Her iki tip de, en tipik olarak yaygın söylenişi croup olan laryngotracheobronchitis'e sebep olur. Bu viruslerle ilk enfeksiyon, tıbbi müdahale gereken bebekler ve çocuk sayısı esas alındığında, üniversal olarak üç-dört yaş aralığındadır, bu virüslerle ilk karşılaşan çocukların tahminen %10'dan fazlasına, bu semptomlar için spesifik tıbbi yardım gerektirebilir. Tüm solunum yolu virüsleri gibi, daha sonraki hafif veya asemptomik enfeksiyonlar ile bu ajanlar hayatı boyunca defalarca yeniden bulaştırırlar. Parainfluenza tip 3 bu sendromu üretmez ancak genelliklere tıkanıklık özellikleriyle daha çok bir pnömoni üretir. Yine, ilk enfeksiyon erken yaşta evrenseldir, ancak bazen hastalığın potansiyel belirtileri çok şiddetli ortaya çıkar. Reinfeksiyon, semptomlu veya değil, yaşam boyu tekrarlanır.

4 KULLANIM AMACI ARVI Screen Real-TM PCR kiti, akut solunum yolu enfeksiyonuna neden olan patojenlerin spesifik nükleik asit fragmanlarının ( insan Parainfluenza virus-1-4 (hpiv) RNA; ОС43, Е229, NL63, ve HKU 1 insan Coronavirus (hcov) RNA insan Rhinovirus (hrv) RNA; insan B, C, ve E Adenovirus (hadv) DNA; ve insan Bocavirus (hbov)dna klinik malzemelrde ( nazal ve orofarijel swablar, balgam, trake aspirasyonu, bronkoalveoler lavaj, bronş yıkama sıvısı ve otopsi malzemesi) Real-time PCR kullanarak mutipleks tespit için in vitro nükleik asit amplifikasyon testidir. TAHLİL PRENSİBİ ARVI Screen Real-TM kiti, örneklerden RNA / DNA izolasyonu, RNA nın ters transkripsiyonu ve her numune için 5 tüpün multipleks Real Time amplifikasyonu olmak üzere, üç ana proses esasına dayanmaktadır. Her tüp, olası reaksiyon inhibasyonunu belirlemek ve her biri ayrı ayrı işlenmiş numuneler için bir ampliifikasyon kontrolü olarak iş gören Internal (iç) kontrol (IC) ve ARVI bölgelerine karşı yönelik primerler içerir. PCR-mix-1-FL hpiv 1/3 PCR-mix-1-FL hpiv 2/4 PCR-mix-1-FL hcov PCR-mix-1-FL hadv hbov PCR-mix-1-FL hrv

5 SAĞLANAN MALZEMELER Module No.1: Real Time PCR kit (V57-100FRT) Part N 1 Reverta-L : Reverse transcription kit (Ters Transkripsiyon Kiti) RT-G-mix-1, 20 x 0,01 ml; RT-mix, 20 x 0,125 ml; Reverse transcriptase (ters transkriptaz) (M-MLV), 2 x 0,06 ml; TE-buffer, 4 x 1,2 ml. 110 test için reaktif içerir. Part N 2 ARVI Screen Real-TM : Real Time amplification kit PCR-mix-1 hpiv 1/3, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hpiv 2/4, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hcov, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hadv hbov, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hrv, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-2-FRT, 5 x 0,6 ml; TaqF Polymerase, 5 x 0,06 ml; Positive Control cdna hpiv 1/3 (C+ hpiv 1/3 ), 2 x 0,1 ml; Positive Control cdna hpiv 2/4 (C+ hpiv 2/4 ), 2 x 0,1 ml; Positive Control cdna hcov (C+ hcov ), 2 x 0,1 ml; Positive Control DNA hadv hbov (C+ hadv-hbov ), 2 x 0,1 ml; Positive Control cdna hrv (C+ hrv ), 2 x 0,1 ml; Internal Control DNA C+, 6 x 0,1 ml; DNA-buffer, 2 x 0,5 ml; Negative Control (C ), 2 x 1,2 ml;* Internal Control RNA C+ (IC RNA), 10 x 0,12 ml** 110 test için reaktif içerir. * izolasyon prosedüründe Ekstraksiyon Negatif Kontrolü olarak kullanılmalıdır. ** 10 µl İnternal Kontrol RNA, RNA purifikasyon prosedürü esnasında direkt numune/lysis karışımına eklenir.

6 Module No.2: Complete Real Time PCR test with DNA/RNA purification kit (TV57-100FRT) (DNA/RNA purifikasyon kitli (TV57-100FRT) komple Real Time PCR testi) Part N 1 Ribo-Sorb : RNA isolation kit Lysis Solution, 2 x 22,5 ml; Washing Solution, 2 x 20 ml; Sorbent, 2 x 1,25 ml. RNA-eluent, 10 x 0,5 ml; test için reaktif içerir. Part N 2 Reverta-L : Reverse transcription kit RT-G-mix-1, 20 x 0,01 ml; RT-mix, 20 x 0,125 ml; Reverse transcriptase (M-MLV), 4 x 0,03 ml; TE-buffer, 4 x 1,2 ml test için reaktif içerir. Part N 3 ARVI Screen Real-TM : Real Time amplification kit PCR-mix-1 hpiv 1/3, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hpiv 2/4, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hcov, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hadv hbov, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-1 hrv, 5 x 0,2 ml; PCR-mix-2-FRT, 5 x 0,6 ml; TaqF Polymerase, 5 x 0,06 ml; Positive Control cdna hpiv 1/3 (C+ hpiv 1/3 ), 2 x 0,1 ml; Positive Control cdna hpiv 2/4 (C+ hpiv 2/4 ), 2 x 0,1 ml; Positive Control cdna hcov (C+ hcov ), 2 x 0,1 ml; Positive Control DNA hadv hbov (C+ hadv-hbov ), 2 x 0,1 ml; Positive Control cdna hrv (C+ hrv ), 2 x 0,1 ml; Internal Control DNA C+, 6 x 0,1 ml; DNA-buffer, 2 x 0,5 ml; Negative Control (C ), 2 x 1,2 ml*; Internal Control RNA C+ (IC RNA), 10 x 0,12 ml** 110 test için reaktif içerir.. *prosedüründe Ekstraksiyon Negatif Kontrolü olarak kullanılmalıdır. ** 10 µl İnternal Kontrol RNA, RNA purifikasyon prosedürü esnasında direkt numune/lysis karışımına eklenir

7 SAĞLANMAYAN, GEREKLİ MALZEMELER Bölge 1: numune hazırlama: RNA extraction kit (Module No. 1) Biolojik kabin eppendorf tipli tüpler için masaüstü mikrosantrifüj 60 C ± 5 C Kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler 1,5 ml polypropylene steril tüpler Atılabilir eldiven, pudrasız Tüp rakları 70% Ethanol (%96 derece etonal reaktifi ve distile suyla yeni hazırlanmış karışım) Aseton Buzdolabı Dondurucu Bölge2: RT veamplifikasyon: Real Time Thermalcycler Çalışma istasyonu Pipetler(ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçları Tüp rakları MUHAFAZA KOŞULLARI Ribo-Sorb 2-8 C*de, Reverta-L vearvi Screen Real-TM -20 Cde muhafaza edilmelidir Kitler 2-8 C'de sevk edilebilirler, ancak alındıklarında hemen 2-8 C ve -20 C de muhafaza edilmelidirler. STABİLİTE ARVI Screen Real-TM etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır. Işık, ısı veya neme maruz kalma, kitin bazı bileşenlerini etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Hassasiyet azalabileceğinden, reaktiflerin tekrarlanan çözülme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır. Bileşenler, etiketlerde belirtilenler dışındaki koşullarda muhafaza edildiğinde düzgün çalışmayabilir ve tahlil sonuçlarını olumsuz etkileyebilir. KALİTE KONTROL Her lot, tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; SACACE, ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir.

8 UYARILAR VE ÖNLEMLER In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Sadece In Vitro Diagnostic kullanım için Kullanıcı her zaman aşağıdakilere dikkat etmelidir: Lysis Solüsyonu,guanidine thiocyanate* içerir. Guanidin tiyosiyanat solunduğunda veya yutulduğunda veya deri ile temas ettiğinde zararlıdır. Asit ile temasında toksik gaz oluşturur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). Ekstrakte edilmiş pozitif malzemeleri (örnekler, kontroller ve amplikonlar) diğer tüm reaktiflerden uzakta tutun ve ayrı bir alanda reaksiyon karışımına ekleyin. Tahlile başlamadan önce tüm bileşenleri oda sıcaklığında tamamen çözün. Çözüldüğünde, bileşenleri karıştırın ve kısa süre santrifüjleyin. Reaktif ve örnekler ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu kullanın.işlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. Laboratuar çalışma alanlarında, sigara içmeyin, herhangi birşey yemeyin- içmeyin, kozmetik uygulamayın veya kontakt lenslere ellemeyin. Son kullanı tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri,yerel yönetim kurallara uygun olarak imha edin. Örnekler potansiyel bulaşıcı olarak dikkate alınmalı ve işlemler uygun biyogüvenlik yöntemlerine uygun olan biyolojik kabinde yapılmalıdır. Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin. Örnek veya reaktifin deri, göz ve mukoza zarları ile temasından kaçının, temas olması halinde su ile yıkayınız ve hemen tıbbi yardım alın. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı Ekstraksiyon alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon ve Tespit alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. Bu kitteki bazı bileşenler koruyucu olarak sodium azid içerir. için metal tüp kullanmayınız. Reaktif transferi * Sadece Modül No.2için

9 ÜRÜN KULLANIM SINIRLARI Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostic için kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır (UNI EN ISO :2012). Kullanım kılavuzu ile tam uyum, optimum PCR sonuçları için gereklidir. Kutu üzerinde ve tüm bileşenlerin etiketlerinde yazılı olan son tarihlerine dikkat edilmelidir.kiti, son kullanım tarihinden sonra kullanmayın. ÖRNEK ALINMASI, MUHAFAZA VE TAŞINMASI Balgam, bronchial veya tracheal lavaj aşağıdaki procedure gore işlenmelidir: Balgam,vida kapaklı tek kullanımlık 50mL PP tüp içine koyulur. Numune, biyolojik güvenlik kabini içinde, % 4 NaOH çözeltisi ile eşit hacimde karıştırıldıktan sonra homojen hale getirilir. (Gerekirse, örnek başına mg arasında bir miktarda, N-asetil-L-sistein ilave edilebilir) daika tüp rotatör ile şiddetli bir biçimde karıştırın. (numune yoğunluğuna bağlı olarak). Numuneleri 3000 rpm ( g) de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı tüp içinde µl bırakarak dikkatlice ayırın. Sediment resüspanse edilir ve 1.5 ml lik tüpe transfer edilir. N u m u n e l e r i rpm de 5-10 d a k i k a s a n t r i f ü j l e y i n, s ü r p e r n a t a n t ı ayırın, numune sedimentinden DNA izolasyonu için aynı 1.5 lik ml tüp kullanın. Dokuyu (~1,0 gr) neşter, cam çubuklar,havan veya mekanik homojenizer ile homojen hale getirin ve 1.0 ml tuzlu su ya da steril PBS de çözün. (1 hacim dokuya 1 hacim tuzlu su solüsyonu). Kuvvetlice vorteksleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Süpernatantı, yeni 1.5 ml lik tüpe aktarın; nasopharyngeal swablar: swab alanı ve yeri 0.5 tuzlu su veya steril PBS li Eppendorf tüptür (Sacace Transport medium önerilir). Kuvvetlice çalkalayın. Swab ve aynı tüp içinde çalkalama tekrarlanır. 1000g/dsk da 5 dakika santrifüjleyin. RNA ekstraksiyonu için yaklaşık 100 µl solüsyon bırakarak süpernatantı ayırın. Numuneler 48 saate kadar +2-8 C de muhafaza edilmeli, veya -20 C to -80 C. de dondurulmalıdır. Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke, federal, eyalet ya da yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır.

10 RNA IZOLASYONU Herhangi bir ticari RNA / DNA izolasyon kiti, burada belirtilen IVD-CE "NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA" paragrafındaki örnek türleri için valide ise, kullanılabilir. Sacace Biotechnologies aşağıdaki kitleri kullanmanızı önerir: Ribo-Sorb- (Sacace, REF K-2-1) DNA/RNA-Prep (Sacace, REF K-2-9) RNA ekstraksiyonunu, lütfen üreticinin talimatına göre gerçekleştirin. 10 µl Internal kontrol (RNA C+ (IC RNA), izolasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına eklenir. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA * 1. Lysis Solution ve Washing Solution (+2-8 C de muhafazası durumunda ) buz kristalleri yok olana kadar C 'ye kadar ısıtılmış olmalıdır. Ektraksiyon Negatif Kontrolü için de bir tüp de dahil olamak üzere, gerekli miktarda1.5 ml polypropylene tüpleri hazırlayın. 2. Her tüpe 450 µl Lysis Solution ve 10 µl Internal Control RNC C+ (IC RNA) ekleyin.pipetlemeyler karıştırın ve oda sıcaklığında 5 daika inkübe edin µl numuneyi, Lysis solüsyonu ve IC içeren uygun tüplere ekleyin. 4. Kontrolleri a ş a ğ ı daki gibi hazırlayın: Cneg etiketli tüpe100 µl C (Negative Control.) ekleyin. 5. Tüpleri vorteksleyin ve 5 saniye 5000g de santrifüjeleyin. Eğer numune tamamen çözülmemişse, tüpün maksimum ( g.) hızda 1 dakika yeniden santrifüjlenmesi önerilir. Süpernatantı RNA ekstraksiyonu için yeni tüpe aktarın. 6. Sorbent i kuvvetlice vorteksleyin ve her tüpe 25 µl ekleyin saniye vortekleyin ve periyodik olarak vorteksleyerek bütün tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin 8. Bütün tüpleri 10000g da 1 dakika santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak ve peleti dağıtmadan, süpernatatntı ayırın. Her tüp için pipet ucunu değiştirin. 9. Her tüpe 400 µl Washing Solution ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin, 1 dakika 10000g de santrifüjeleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak ve peleti dağıtmadan, süpernatatntı ayırın. Her tüp için pipet ucunu değiştirin. 10. Her tüpe 500 µl Ethanol al 70% ekleyin Kuvvetlice vorteksleyin, 1 dakika 10000g de santrifüjeleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak ve peleti dağıtmadan, süpernatatntı ayırın. Her tüp için pipet ucunu değiştirin.

11 Adımı tekrarlayın. 12. Her tüpe 400 µl Aseton ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin, 1 dakika 10000g de santrifüjeleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak her tüpten peleti dağıtmadan dikkatlice süpernatantı ayırın. Her tüp için pipet ucunu değiştirin. 13.Tüm tüpleri ağızları kapalı halde 60 C de 10 dakika inkübe edin. 14. Peletleri 50 µl RNA-eluent te resüspanse edin. Periyodik olarak voteksleyerek 60 C de 10 dakikak inkübe edin. Tüpleri maksimum ( g) hızda 2 dakika santrifüjleyin. 15. Süpernstant kullanıma hazır RNA içerir. RT-PCR aynı gün içinde gerçekleştirilebilir. Eğer mümkün değilse, RNA preparasyonları bir aya kadar -80 C'de muhafaza edilebilir.. * Sadece Modül No.2 için RT ve AMPLIİFİKASYON Reverse Transcription (Ters Transkiripsiyon): 1) Reaksiyon karışımı hazırlayın: 6 reaksiyon için, 5,0 µl RT-G-mix-1 i RT- mix içeren tüpe ekleyin ve en az 5-10 saniye vorteksleyin, kısaca santrifüjleyin. Bu karışım -20 C de 1 ay stabildir. 6 µl M-MLV Reaktif karışımlı tüpe ekleyin,pipetlemeyle karıştırın, 3 saniye vorteksleyin, 5-7 saniye santrifüjleyin (hazırlandıktan sonra hemen kullanılmalıdır). (Eğer gerekirse, 6 numuneden daha az test için, her numune için yeni steril tüpe RT-mix 'li 20*N µl RT-G-mix ve 1,0*N µl M-MVL ekleyin). 2) Her numune tüpüne 20 µl Reaction Mix ekleyin. 3) Uygun tüpe 20 µl RNA örneklerini pipetleyin. (Eğer Ribo-Sorb isolasyon kiti RNA ekstrasiyon kiti olarak kullanılmışsa, ekstrakte RNA'lı tüm tüpler, maksimum ( g) hızda 2 dakika yeniden santrifüjlenmeli ve süpernatant peletleri dağıtmadan dikkatilice alınmalıdır.n.b. sorbent reaksiyonu inhibe eder.). Pipetlemeyle dikkatlice karıştırın. 4) T ü p l e r i thermalcycler a yerleştirin ve 37 o Сde 30 dakika inkübe edin. 5) Elde edilen cdnaörneğini T E - b u f f e r i l e 1 : 2 d i l ü e e d i n. (her tüpe 40µl TE-buffer ekleyin). cdna numuneleri, -20 o С 'de 1 hafta veya -70 o С de yıl boyunca muhafaza edilebilir. Amplifikasyon(Reaksiyon karışımı 25 µl): 1. Gerekli miktarda PCR plate veya tüplerini hazı rlayı n. Reaktif ile tüpleri çözün. 2. N reaksiyonlarının gerçekleştirilmesi için (4 kontrol dahil olmak üzere : 3 PCR control ve 1 negatif ekstraksiyon control) yeni steril bir tüp içinde : 10*N µl PCR-mix-1, 5.0*N µl PCRmix-2-FRT ve 0.5*N µl TaqF polimerazı karıştırın. Tüpü vorteksleyin, sonra kısaça santrifüjleyin. Karışımın adı ile tüpü işaretleyin (örneğin; hpiv 1/3). Bu prosedürü her PCR-mix ile tekrarlayın.

12 3. Her numune için 5 tüp hazırlayın (aşağıdaki tabloya bakınız) ve her tüpe15 µl Reaction Mix (Reaksiyon Karışımı) ekleyin. 4. Reaction Mix li uygun tüpe 10 µl cdna numunesi ekleyin. 5. Her mix (karışım) için 3 kontrol hazırlayın : PCR Negative Control etiketli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; C pos etiketli tüpe 10 µl cdna C+ ekleyin IC DNA Pos etiketli tüpe 10 µl IC DNA ekleyin. Tablo. Numune Dağıtımı Herhangi bir klinik örnek için 5 tüp strip Mix «1» - PCR-mix-1 hpiv 1/3 Mix «2» - PCR-mix-1 hpiv 2/4 Mix «3» - PCR-mix-1 hcov Mix «4» - PCR-mix-1 hadv hbov Mix «5» - PCR-mix-1 hrv C+ hpiv 1/3 ekleyin C+hPiv 2/4 ekleyin C+ hcov ekleyin C+hAdv-hBov ekleyin C+ hrv ekleyin pozitif control stribi (PC cdna ekleyin) Negatif control stribi (DNA-buffe ekkleyinr) Internal control stribi (IC DNA ekleyin) Enstrüman üzerinde aşağıdaki gibi bir sıcaklık profilini oluştur: Rotor-tip enstrümanlar 1 Plate veya modüler tip enstrümanlar 2 Adım Sıcaklık, С Süre Cycles Sıcaklık, С Süre Cycles dakika dakiak sn sn sn sn sn sn sn sn 54 ARVI Screen Real-TM 20 sn Floresan tespiti* sn Floresan tespiti * sn sn 1 Örneğin Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen) 2 Örneğin, SaCycler-96 (Sacace), CFX/iQ5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied Biosystems), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) * Floresan FAM/Green, JOE/SarıHEX/Cy3 ve ROX/Orange/TexasRed floresan kanallarında tespit edilir.

13 ARVI Screen Real-TM PCR kiti icycler iq ve iq5 enstrümanları ile çalışılırken diğer testler ile birlikte «Rhinovirus» testinin gerçekleştirilmesine izin verilmez. ENSTRÜMAN AYARLARI Rotor-tip enstrümanlar Kalibrasyon/Gain Kanal Optimizasyonu Eşik Diğer Ayarlar/Outlier Removal FAM/Yeşil 5 Fl ila 10 Fl 0.1 %0 kapalı JOE/Sarı 4 Fl ila 8 Fl 0.1 %5-10 kapalı Rox/Oranj 4 Fl ila8 Fl 0.1 %5-10 kapalı Plate- veya modüler tip Enstrümanlar Slope Current Eşik çizgisi, sadece pozitif numunelerin sinyal birikiminin sigmoid eğrilerini geçmeli, taban çizgisini geçmemelidir; aksi takdirde, eşik seviyesi yükseltilmelidir. Floresan eğrilerinin doğrusal olduğu seviyede eşiği ayarlayın ve negatif örnek eğrilerini geçmeyin. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Sonuçlar, eşik çizgisi ile floresan eğrisinin geçişi ( ya da geçmeyişi) yoluyla real time PCR entrüman yazılımıyla yorumlanır. Her PCR-mix-1 için veri analizi, kullanılan PCR-mix-1 'e tekabül eden tüplerin çekilmesinden sonra, tek tek gerçekleştirilmelidir. «Rhinovirus» (hrv) testinin analizi için, SADECE FAM ve ROX kanallarını kullanmak gereklidir. Tablo. PCR-mixes-1 uygunluğu ve ARVI patojen tespit kanalları PCR-mix-1 Floresan Tespiti FAM/Green JOE/Yellow/HEX/Cy3 ROX/Orange hadv-hbov IC hbov hadv hrv IC hrv hpiv 1/3 IC hpiv 3 hpiv 1 hpiv 2/4 IC hpiv 2 hpiv 4 hcov IC NL-63, 229E HKU-1, ОС 43 Sonuç Yorumlama Prensibi: - ARVI patojen DNA/RNA 'sı, eğer bu numunenin Ct değeri karşı gelen kanaldaki grid sonuçlarda tespit edilmişse, tespit edilmektedir. Bu numune için floresan eğrisi, floresan eğri eksponensiyal büyüme aralığında eşik çizgisi olmalıdır. - Eğer test edilen numunenin Ct değeri, karşı gelen kanaldaki grid sonuçlarda tespit edilmemişse (yok) ve FAM kanaldaki grid sonuçlarda olan Ct değeri, belirtilen sınır değeri (Ct 32) aşmamışsa, ARVI patojenin DNA/RNA sı tespit edilmez.

14 - Eğer test edilen numunenin Ct değeri, ARVI patojene karşılık gelen kanalda tespit edilmemişse (yok) ve FAM/Green kanaldaki Ct değeri belirtilen sınır değeri aşmamışsa (Ct > 32) ya da yoksa, sonuç geçersiz kabul edilir. Bu gibi durumlarda, numune analizi DNA/RNA ekstraksiyon aşamasından tekrar edilmelidir. Sadece, ekstraksiyon negatif kontrol ve amplifikasyon negatif ve pozitif kontrollerinin elde edilen sonuçları doğru ise (aşağıdaki tabloya bakınız), analiz sonuçları güvenilir olarak kabul edilir. Tablo. Kontrol Sonuçları Kontrol Control Aşaması Ct value in channel FAM/Green JOE/Yellow/HEX/Cy3 ROX/Orange/TexasRed IC tespiti ARVI pathogen tespiti ARVI pathogen tespiti NCE RNA extraction Pos (< 32) Neg Neg NCA Amplification Neg Neg Neg IC DNA C+ Amplification Pos (< 28) Neg Neg Pos C+ Amplification Neg Pos (< 26)* Pos (< 26) * Positive Control cdna hrv JOE kanalda tespit edilmez. PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ Analitik Özgünlük Bu kitin özgünlüğü,aşağıdaki referansların araştırılması (incelenmesi) ile teyit edilmiştir : insan Rhinoviruses (13, 15, 16, 17, 21, 26, ve 29 tipleri). Kitin özgünlüğü, ayrıca aşağıdaki patojen amplifikasyon ürünlerin sıralanmasıyla, müteakip doğrulama ile klinik malzemelerin incelenmesi esnasında kanıtlanmıştır: Parainfluenza virus-1-4; hinsancoronaviruses ОС43, Е229, NL63, ve HKUI; insan Adenoviruses B, C, ve E; ve insan Bocavirus. Bu, ayrıca rhinovirus RNA tespit reaksiyonunda yakın ilişkili enterovirusler arasındaki farkı ayırt etmekle de mümkündür. Adenovirus tespit reaksiyonu, adenovirus ile yakından ilişkili diğer tipler ile olası etkileşimler nedeniyle istenilen değildir. Akut solunum yolu hastalıklarının yanısıra normal nazal ve orofaringeal insan mikroflorası ve insan cdna/dna ile PCR kit bileşenleri arasında (Influenza A ve B virusleri, Urbani SARSilişkiliCoronavirus (Frankfurt), kediden bulaşan peritonitis (F1, F2, ve F5) ve domuzdan bulaşan gastroenteritin (TGEV1, TGEV8 ve TGEV9) sebep olduğu Coronavirusler, Herpes virusler, Cytomegalovirus, Enteroviruses (Echo9 ve Echo30), ve Enterovirüs RNA içeren menenjit 60 hastanın beyin omurilik sıvısı örnekleri) ve bakteriyal (Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Mycoplasma influenza, Chlamydophila pneumonia, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, ve Legionella pneumophila)spesifik olmayan reaksiyonlar gözlemlenmemiştir. Analitik Hassasiyet ARVI Screen Real-TM hassasiyeti 1000 kopya/ml den az değildir.

15 SORUN GİDERME 1. Zayı f ya da olmayan IC (FAM (Green)kanal)sinyali : numuneler yeniden test edilmelidir. İnhibe edilmiş PCR: Önerilen RNA ekstraksiyon metodlarını kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olunuz. Tüm tüpleri ekstrakte RNA pipetlemesinden önce maksimum ( g) hızda 2 dakika yeniden santrifüjleyin ve dikkatlice süpernatantı alın. Peleti dağıtmayın, Sorbent reaksiyonu inhibe eder. Reaktif muhafaza koşulları, talimatlara uygun değil. Muhafaza koşullarını kontrol edin. PCR koşulları, talimatlara uygun değil. Protokolde belirtilen IC tespiti için seçili flororesan kanalını ve PCR koşullarını kontrol edin. IC, reaktiflerin pipetlenmesi esnasında numuneye eklenmedi. RNA ekstraksiyon prosedürü esnasında buna dikkat edin. 2. Joe (Yellow)/Cy3/HEX veya Rox/Orange/TexasRed kanalda zayıf (Ct > 37) sinyal: Numunenin yeniden test edilmesi gereklidir. 3. Sinyali olmayan amplifikasyon pozitif kontrolleri Kullanılan enstrümanda, sıcaklık profilinin yalnış programlanması; PCR reaksiyon konfigürasyonu doğru değil.. Reaktif muhafaza koşulları, talimatlara uygun değil. Reaktif kitin son kullanama tarihi dolmuş. Kullanılan enstrümanın programlanmasını, muhafaza koşullarını, reaktiflerin son kullanma tarihlerini kontrol edin ve sonra PCR I tekrarlayın. 4. Ekstraksiyon Negatif kontrolü Joe (Yellow)/Cy3/HEX veya Rox/Orange/TexasRed sinyalli. RNA ektraksiyon prosedürü esnasında kontaminasyon.tüm numune sonuçları geçersizidir. Enstrümanları ve tüm yüzeyleri sodium hipoklorid ve etanol ile dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü esnasında sadece filter pipet uçları kullanın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. Yeni reaktif seti ile RNA ekstraksiyonu tekrarlayın.

16 5. Sinyalsiz Negatif PCR Kontrol. PCR hazırlama prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm numune sonuçları geçersizidir. Enstrümanları ve tüm yüzeyleri sodium hipoklorid ve etanol veya DNA dekontaminasyon reaktifleri ile dekontamine edin. Pozitif kontrolleri en son pipetleyin. Yeni reaktif seti ile PCR hazırlanmasını ekrarlayın.

17 KULLANILAN SEMBOLLERİN AMLAMLARI Liste Numarası Dikkat! Lot Numarası <n> testleri için yeterli içerik in Vitro Diagnostic kullanım için Versiyon.. de muhafaza Üretici Kullanım Talimatlarına bakınız NCA NCE C+ Negative Control of Amplification Negative control of Extraction Positive Control of Amplification Son Kullanım Tarihi IC Internal Kontrol * SaCycler is a registered trademark of Sacace Biotechnologies * CFX and iq5 are registered trademarks of Bio-Rad Laboratories * Rotor-Gene is a registered trademark of Qiagen * MX3005P is a registered trademark of Agilent Technologies * ABI is a registered trademark of Applied Biosystems * LineGeneK is a registered trademark of Bioer * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: