Pleurotus eryngii (DC.) Gillet in Tek Spor İzolatlarının Eldesi, Melezlenmesi ve Yeni Melezlerin Misel Büyüme Hızlarının Saptanması

Transkript

1 Fırat Üniv. Fen Bilimleri Dergisi Fırat Univ. Journal of Science 21 (1), 19-24, (1), 19-24, 2009 Pleurotus eryngii (DC.) Gillet in Tek Spor İzolatlarının Eldesi, Melezlenmesi ve Yeni Melezlerin Misel Büyüme Hızlarının Saptanması Özet Erbil KALMIŞ 1, A. Mehmet ATMACA 2, Fatih KALYONCU 3 1 Ege Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü, Bornova - İzmir 2 Agroma Mantarcılık, Hacıeyüplü Köyü, Denizli 3 Celal Bayar Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Muradiye Manisa fatih.kalyoncu@bayar.edu.tr (Geliş/Received: ; Kabul/Accepted: ) Pleurotus eryngii ticari olarak üretimi yapılan bir şapkalı mantar türüdür. Bu çalışmada, ülkemizin farklı bölgelerinden toplanmış dört yabani Pleurotus eryngii şapkasından elde edilen sporlar çimlendirilmiştir. Elde edilen tek spor izolatları birbirleriyle çaprazlanarak yeni melez bireyler elde edilmiştir. Elde edilen melez bireylerin misel gelişim hızları; Patates Dekstroz Agar (PDA) ortamına aktarılan misellerin oluşturdukları kolonilerin, çaplarının düzenli olarak ölçülmesi ile belirlenmiştir. Bu çalışma sonunda, 9 melez bireyin aktif misel büyüme hızına sahip olduğu ve bunların ticari spawn üretiminde kullanılabileceği saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: Pleurotus eryngii, Melezleme, Misel gelişim hızı, Tek spor Determination of Mycelial Growth Rate of New Heterokaryotic Mycelium Obtained from Mating with Single Spore Isolate of Pleurotus eryngii (DC.) Gillet Abstract Pleurotus eryngii is a commercially produced mushroom. Spores obtained from four wild basidiocarps of Pleurotus eryngii which were collected from different regions of Turkey were germinated in this study. Single spore isolates were crossed by each other in order to obtain new hybrids. Mycelial growth rate of new hybrids were determined by measuring diameter of colonies which incubated in PDA. The nine new hybrids which were determined active mycelial growth rate were improved at the end of this study. New hybrids can be used in the production of commercial spawn. Keywords: Pleurotus eryngii, Hybridization, Mycelium growth rate, Single spore 1. Giriş Pleurotus genusuna ait şapkalı mantarlar dünyada pazar payı yüksek olan mantar türleri arasındadır. Pleurotus eryngii (DC.) Gillet diğer Pleurotus türlerine göre raf ömrünün uzun, paketlemeye daha elverişli ve farklı bir aroma yapısına sahip olması gibi nedenlerden dolayı dünyanın bir çok ülkesinde tercih edilen bir şapkalı mantar türüdür. Yapılan araştırmalar 2003 yılında Japonya da , Çin de ve ABD de ton P. eryngii üretildiğini ortaya koymuştur [1 3]. Türkiye de ise bu şapkalı mantar türünün üretimine ancak son birkaç yılda başlanıldığı bilinmektedir. P. eryngii nin yabani formları ülkemizin çeşitli noktalarından farklı araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir [4]. Bu türün sporları çimlendirildiği zaman genetik açıdan farklılık gösteren misellerin elde edildiği ve bunlar arasında bir uyumluluğun var olduğu (mating type) yapılan araştırmalar sonucunda ortaya konmuştur. Tek bir spordan elde edilen misellerin (homokaryotik misel) melezlenmesi sonucunda, yeni özelliklere sahip (hibrid) bireyler (heterokaryotik misel) elde edilebilmektedir [5]. Şapkalı mantarlarda yapılan klasik ıslah araştırmalarının temelini bu tip denemeler oluşturmaktadır. Bu çalışmalar sonucunda agronomik açıdan tatmin edici

2 özelliklere sahip yeni spawn materyalleri elde edilebilmektedir [6, 7]. Günümüzde P. eryngii ye ait tohumluk materyal (spawn) ülkemize ithal edilmektedir. Maalesef Türkiye de bu mantar türüne ait özellikleri belirlenmiş, patentli bir spawn veya hibrid misel bulunmamaktadır. Bu çalışma kapsamında doğadan toplanan yabani şapkalardan spor eldesi, tek sporlardan gelişen misellerin seçilmesi ve bunların uyumluluk testlerinin yapılması hedeflenmiştir. Çalışmanın son aşamasında ise uyumlu misellerden yeni melez bireylerin eldesi ve melezler içinde aktif misel gelişimi gösterenlerin belirlenmesi gerçekleştirilmiştir. Çalışma ile gen kaynağı ülkemiz olan, büyüme özellikleri saptanmış ve patentli P. eryngii miseli eldesi amaçlanmıştır. 2. Materyal ve Metot 2.1. Organizma ve spor eldesi Yabani P. eryngii (DC.) Gillett şapkaları ülkemizin değişik coğrafik bölgelerindeki karışık ormanlık (çam, sedir, meşe, vb.) alanlardan toplanarak en kısa sürede ve soğuk zincir bozulmadan Agroma Mantarcılık Ltd. Şti ne (Denizli) getirilmiştir. Şapkaların toplandığı lokaliteler Tablo 1 de verilmiştir. Şapkalar steril Petri kaplarına sapları aşağı gelecek şekilde yerleştirildikten sonra bir gece hava akımının olmadığı temiz bir ortamda bekletilmişlerdir. Bu uygulama ile şapkaların sporlarını dökmesi sağlanmış ve sporları içeren Petri kapları kapakları kapalı şekilde kullanılacağı zamana kadar +4 0 C de muhafaza edilmiştir [1]. Tablo 1. Pleurotus eryngii şapkalarının toplandığı lokaliteler Kodu A B C D Elde Edildiği Lokalite Denizli Erzincan Aydın Kars 2.2. Sporların çimlendirilmesi ve tek spor izolasyonu Standart deney tüpleri (16010 mm) içerisine 5 ml distile su ilave edilerek C de 15 dk süre ile sterilize edilmiştir. Steril kabin Erbil Kalmış, A. Mehmet Atmaca, Fatih Kalyoncu 20 içinde ve aseptik koşullar altında, sporlar bu deney tüplerine transfer edilmiştir. Bu hazırlık sonunda çalışmada kullanılacak stok solüsyonlar elde edilmiştir. Sporların seyreltilmesi için steril 9 ml distile su içeren deney tüpleri kullanılmıştır. Her bir stok solüsyonun 1 ml si 9 ml steril distile su içeren deney tüpüne ilave edilerek 1/10 1 lik seyreltme elde edilmiştir [7] ve işleme 1/10 4 seyreltmeye kadar devam edilmiştir. Sporların çimlendirilmesi için Patates Dekstroz Agar (PDA) ve Hagem (KH 2 PO 4 0,5 g, MgSO 4.7H 2 O 0,5 g, NH 4 Cl 0,5 g, Malt Ekstraktı 4 g, Maya Ekstraktı 1 g, Glikoz 5 g, FeCl 3 (%1 lik) 0,5 ml, distile su 1000 ml) besiyerleri kullanılmıştır [8]. Steril besiyeri içeren Petri kaplarına aseptik koşullar altında her bir seyreltmeden 1 er ml spor süspansiyonu ilave edilmiş ve ortamlar 25 0 C de inkübasyona alınmıştır. Petri kapları her gün kontrol edilmiş ve çimlenme gözlenen Petrilerdeki primer misel yapıları numaralandırılarak PDA ve Hagem ortamı içeren yeni Petri kaplarına transfer edilmiş ve +4 0 C de koruma altına alınmıştır [7]. Tüm Petri kabı denemeleri üçer tekrarlı olarak yapılmış ve elde edilen sonuçların aritmetik ortalamaları alınmıştır Tek spor izolatlarının melezlenmesi Seleksiyon sonucunda elde edilen tek spor izolatlarının birbirleriyle uyumlu olup olmadıklarının belirlenmesi için PDA içeren Petri kaplarında melezleme deneyleri yapılmıştır. Bunun için önceden numaralandırılmış olan homokaryotik miseller Petri kaplarının dört köşesine aşılanmış ve 25 0 C deki inkübasyon süresince düzenli olarak kontrol edilmiştir. Birbiriyle uyumlu olan yani kaynaşma (anastomos) yapan bireylerin kaynaşma noktalarından alınan miseller yeni melez bireyler olarak işaretlenip stoğa alınmış ve +4 0 C de saklanmıştır [9]. Bir sonraki adımda ise her bir melez bireyin PDA ortamındaki misel büyüme hızları belirlenmiştir Misel büyüme hızlarının tespiti Bu aşamada, elde edilen melez bireylerin misel büyüme hızları tespit edilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, melezleme denemeleri sonucunda elde edilen yeni bireylerin miselleri steril PDA içeren Petri kaplarına aşılanmıştır.

3 Pleurotus eryngii (DC.) Gillet in Tek Spor İzolatlarının Eldesi, Melezlenmesi Ve Yeni Melezlerin Misel Büyüme Hızlarının Saptanması Standardizasyonu sağlamak amacıyla stokta bulunan her bir melez bireyin miselinden 6 mm çapında diskler çıkarılmış ve aşılama bu diskler ile yapılmıştır. Daha sonra tüm Petri kapları 25 0 C de inkübasyona alınmıştır. Misellerin gelişim hızları Petri kabı içinde oluşturdukları kolonilerin çaplarının günlük olarak ölçülmesi ile saptanmıştır [10]. Tüm denemeler üçer tekrarlı olarak yapılmış ve elde edilen sonuçların aritmetik ortalamaları alınmıştır. 3. Bulgular 3.1. Sporların çimlenme süreleri Çalışmada iki farklı besiyeri kullanılmasına rağmen sporların çimlenme sürelerinde bir farklılık gözlenmemiştir. Her iki ortamda da sporlar aynı sürede çimlenme göstermişlerdir. Tablo 2 de sporların çimlenme süreleri ve çimlenme sayıları verilmiştir. Sporların en erken 6. gün (1/10 2 ) en geç de 9. günde (1/10 4 ) sporların çimlendiği tespit edilmiştir. Tablo 2. Sporların çimlenme süreleri ve çimlenen spor sayıları. A B C D 1/10 2 1/10 3 1/10 4 1/10 2 1/10 3 1/10 4 1/10 2 1/10 3 1/10 4 1/10 2 1/10 3 1/10 4 Gün 6. Çok Çok Çok Çok Çok Çok 12 - Çok Çok Çok Çok Çok: Bir Petri kabı içinde 30 ve üzeri sayıda sporun çimlenmesi Melezleme denemeleri Şapkalardan farklı sayılarda tek spor izolatı elde edilmesine rağmen, melezleme denemelerinde standardizasyonu sağlamak için 12 şer adet tek spor izolatı kullanılmıştır. Melezleme denemesinde, PDA içeren Petri kabının dört noktasına farklı bireylere ait miseller aşılanmış ve gelişme sürecinde birbirleri ile olan ilişkileri incelenmiştir (Şekil 1). Melezleme denemelerinde birbiriyle uyumlu olan bireyler hem mikroskobik hem de Petri kabı incelemeleri ile ayırt edilmişlerdir. Petri kabı incelemelerinde birbiriyle uyumlu olan misellerin anastomoslar yaptığı gözlenmiştir. Uyumsuz bireylerde miseller hiçbir zaman birbirleriyle kaynaşmamışlardır (Şekil 2; a, b). Çıplak gözle yapılan tetkiklerin güvenilirliğini arttırmak için, kaynaşma noktalarından mikroskobik preparatlar hazırlanarak hibrid bireylerde ortaya çıkan karakteristik kanca oluşumları tespit edilmiştir (Şekil 3). Sonuç olarak tüm melezleme denemeleri tamamlandığında A şapkası için 26 adet, B şapkası için 29 adet, C şapkası için 21 adet ve D şapkası için de 24 adet olmak üzere toplam 100 adet uyumlu eşleşme tespit edilmiştir. Şekil 1. Farklı melezleme denemeleri. 21

4 Erbil Kalmış, A. Mehmet Atmaca, Fatih Kalyoncu Şekil 2. a, b: Tek spor izolatlarının birbirleriyle olan etkileşimleri. Şekil 3. Yeni hibrid bireylerin misellerindeki kanca oluşumları Misel büyüme hızları Yapılan melezleme denemeleri sonucunda elde edilen 100 hibrid bireyin tamamının misel gelişim hızları saptanmış ve A şapkasından 7, B şapkasından 5, C şapkasından 4 ve D şapkasından 4 tane olmak üzere aktif misel gelişimi gösteren toplam 20 adet melez birey seçilmiştir (Tablo 3). Aktif misel gelişim hızına sahip 20 melez bireyin 8 tanesi 10. günde, 6 tanesi 9. günde 3 tanesi 8. günde ve 3 tanesi de 11. günde Petri 22 kaplarını doldurmuşlardır. Bu deneme sonunda 8. ve 9. günde Petri kabını dolduran 9 hibrid bireyin diğerlerine göre daha aktif misel gelişim hızına sahip oldukları tespit edilmiştir. 4. Tartışma Ve Sonuç Türkiye nin değişik bölgelerinden toplanan yabani P. eryngii şapkalarından elde edilen tek spor izolatlarının kullanıldığı bu çalışmada, ticari anlamda kullanılabilecek yeni melez bireylerin elde edildiği görülmüştür. Yabani bireyler

5 Pleurotus eryngii (DC.) Gillet in Tek Spor İzolatlarının Eldesi, Melezlenmesi Ve Yeni Melezlerin Misel Büyüme Hızlarının Saptanması doğadaki birçok farklı özelliği bünyelerinde barındırabilmektedirler. Hastalıklara dirençlilik, birim alanda daha fazla ürün vermesi veya daha kaliteli ürün elde edilmesi, bu agronomik özelliklerden bazılarıdır [6]. Tablo 3. Melezlerin Petri kabındaki misel büyüme hızları. Günler Melezler A 2 A 7 A 2 A 10 A 3 A 7 A 3 A 9 A 6 A 8 A 7 A 9 A 11 A 12 BB1 B 3 BB1 B 6 BB2 B 8 BB5 B 10 BB7 B 10 C 4 C 11 C 5 C 1 C 5 C 8 C 9 C 7 D 3 D 5 D 8 D 7 D 9 D 10 D 9 D 12 P. eryngii sporları PDA ve Hagem besiyerlerinde rahatlıkla çimlenmişlerdir. Agaricus bisporus dünyada en çok satılan ve üretimi yapılan bir şapkalı mantar türüdür, ancak klasik ıslah çalışmalarında sporlarının çimlendirilmesi oldukça zordur. Petri kabı içinde belli bir sayıya ulaşmayan sporlar çimlenme yeteneklerini ortaya koyamazlar [7]. Aynı Petri kabı içinde çok sayıda bulunan sporlar aynı anda çimlendikleri için primer miselleri ortamdan almak oldukça zor olmakta ve tek spor izolasyonu gerçekleştirilememektedir. Bu çalışmada kullanılan organizma ise böyle bir özelliğe sahip değildir. Sporların seyreltik olarak besi ortamına düşmesi araştırmacıların tek spor izolatlarını rahatlıkla seçebilmesine imkân vermiştir. Bu çalışmada ticari üretimde kullanılabilecek aktif P. eryngii misellerinin seçilmesi amaçlanmıştır. Bu açıdan bakıldığı zaman birçok melezleme yapılmış ve içlerinden 20 tanesinin diğerlerine göre daha hızlı misel büyüme hızına sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu hızlı misel gelişimine sahip 20 melez birey içinden de 9 adet melezin kendi içinde diğerlerine göre daha aktif gelişim gösterdiği yapılan çalışmalar ile ortaya çıkarılmıştır. Son yıllarda gelişen moleküler biyolojik teknikler ile tüm şapkalı mantarlar için tek spor izolatlarının karakterizasyonu daha kısa zamanda ve daha güvenilir bir şekilde yapılabilmektedir [9, 11]. Ancak moleküler biyolojik tekniklerde kullanılan sarf malzemelerin ve demirbaşların fiyatlarının yüksek olması birçok ticari firmanın önüne engel olarak çıkmaktadır. P. eryngii şapkalı mantarının sporlarının çimlenme sorunu olmaması daha fazla tek spor izolatının rahatlıkla seçilebileceğini göstermiştir. Bu sonuç beraberinde daha fazla melezleme yapılabileceğini ve daha farklı yapıda melezler elde edilebileceğini ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışmada imkânlar dâhilinde her şapkadan 12 tek spor izolatı denemeye alınmış olmasına rağmen sayıyı arttırmak her zaman mümkündür. Yapılan literatür taramalarında ülkemizde bu amaç doğrultusunda yapılan herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışma sonunda tek spor izolatlarından oluşan zengin bir koleksiyon kazanılmış ve ticari üretim için kullanılabilecek 9 adet melez birey elde edilmiştir. Bu çalışma ile Türkiye nin kendine özgü bir spawn materyalinin oluşmasında büyük katkı sağlandığına inanılmaktadır. 5. Kaynaklar 1. Yamanaka, K. (2005). Cultivation of new mushroom species in East Asia. Acta Edulis Fungi, 12, Chang, S. T. (2005). Witnessing the development of the mushroom industry in China. Acta Edulis Fungi, 12, Royse, D. J., Shen, Q., McGarvey, C. (2005). Consumption and production of recently 23 domesticated edible fungi in the United States with a projection of their potential. Acta Edulis Fungi, 12, Solak, M. H., Işıloğlu, M., Kalmış, E., Allı, H. (2007). Macrofungi of Turkey; Check List. Volume 1, Üniversiteliler Ofset, İzmir, 254s. 5. Gioia, T., Sisto, D., Rana, G. L., Figliuolo, G. (2005). Genetic structure of the Pleurotus eryngii

6 Erbil Kalmış, A. Mehmet Atmaca, Fatih Kalyoncu species-complex. Mycological Resource, 109, Peng, J. T., Dai, M. C., Tsai, Y. F., Chen, M. H., Chen, J. T. (2001). Selection and breeding of king oyster mushroom. Journal of Agricultural Research in China, 50, Tanrısever, A., Tanyolaç, B., Solak, M. H., Kalmış, E., Karaçancı, I. Ş. (2001). Agaricus bisporus (Lge.) Sing. türünde ıslah materyalinin oluşturulması ve genetik analizi. Ebiltem-Sanayi, 98/BİL/10 nolu projesi kesin raporu, İzmir. 8. Chou, M. C., Grace, L. J. (1984). Cultural characteristics of Rhizopogon spp. associated with Pinus radiata seedlings. New Zealand Journal of Botany, 22, Larraya, M. L., Perez, G., Iribarren, I., Blanco, J. A., Alfonso, M., Pisabarro, A.G., Ramirez, L. (2001). Relationship between monokaryotic growth rate and mating type in the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus. Applied and Environmental Microbiology, 67, Kalmış, E., Azbar, N., Kalyoncu, F. (2007). Agar plate screening for textile dye decolorisation by white rot fungi Pleurotus species (Pleurotus cornucopiae var. citrinopileatus, P. djamor, P. eryngii, P. ostreatus and P. sajor-caju). Fresenius Environmental Bulletin, 16, Zervakis, G. I., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. (2004). Molecular phylogeny, biogeography and speciation of the mushroom species Pleurotus cystidiosus and allied taxa. Microbiology, 150,