Trakya da İnsanlarda Cryptosporidium ve Giardia Enfeksiyonları

Transkript

1 Trakya da İnsanlarda Cryptosporidium ve Giardia Enfeksiyonları Gürkan Akyıldız 1, Şadiye Küçük Kaplan 1, Rifat Bircan 1, Nadim Yılmazer 1, Ayşen Gargılı 2, Sırrı Kar 1 1 Namık Kemal Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Tekirdağ. 2 Marmara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Fakültesi, Temel Sağlık Bilimleri Bölümü, İstanbul.

2 Dışkı örnekleri Tekirdağ Devlet Hastanesinden gelen 573 dışkı örneği Cryptosporidium için carbol-fuchsin (Heine 1982) Giardia için natif inceleme ve çinko sülfat flotasyon yöntemi (Conboy 1997; Zajac ve ark. 2002) 146 pozitif ve/veya şüpheli örneğin DNA ekstraksiyonu Nested-PCR-RFLP (Xiao and Ryan 2008) (Cacciò et.al. 2002; Lalle et.al. 2005) Giardia pozitif örnekler DNA Dizi Analizi (Cacciò et.al )

3 Mikroskobik ve moleküler teknikler Cryptosporidium için mikroskobik ve moleküler teknikler sırasıyla %0,17 (1/573) ve %8,93 (5/56), Giardia için mikroskobik ve moleküler teknikler sırasıyla %4,54 (26/573) ve %24,3 (27/90) pozitiflik vermiştir. Cryptosporidium pozitif örneklerinin 4 ü C. parvum 1 i C. hominis olarak RFLP metodu ile belirlenmiştir. Giardia pozitif örnekler RFLP metodu ile assemblage bazında incelenmiş olup bunların 15 i Assemblage A, 2 si Assemblage B, 10 u Assemblage B/E mix olduğu belirlenmiştir. Giardia pozitif örnekler için gerçekleştirilen DNA Dizi Analizi sonuçları ile RFLP sonuçları karşılaştırıldığında; RFLP sonucu Assemblage A çıkan örnekler A3, Assemblage B çıkan örnekler B3, Assamblage B/E mix çıkan örnekler A3/B3 mix olduğu belirlenmiştir.

4 Cryptosporidium pozitif örneklerin RFLP Sonuçları Cryptosporidium-SSU rrna geni nested PCR-RFLP ürünlerinin 2.5% agaroz jeldeki görüntüsü. Nested PCR pozitif ürünler VspI ve SspI restriksiyon enzimleri ile kesilmişlerdir. Kesim sonrası beklenen fragmentler: SspI kesiminde C. hominis için 450, 267, 111, 12, ve 11 bp; C. parvum için 450, 267, 108, 12, ve 11 bp dir. VspI kesiminde C. hominis için 561, 115, 104, and 71 bp; C. parvum için 629, 115, and 104 bp dir. 71 bp den küçük fragmentler jelde görülmemektedir.

5 Cryptosporidium rastlanan hastaların klinik verileri

6 Giardia pozitif örneklerin RFLP sonuçları HaeIII enzimi ile kesilen 27 pozitif örneğe ait restriksiyon ürünlerinin PAGE (%12) görüntüsü. Örnek numarası ve çıkan assemblage çeşidi kuyucukların üst kısımlarında verilmiştir

7 Giardia rastlanan hastaların klinik verileri Ocak 1 E Pneumoni Giardia(+), Maya (20< ) sarımsı kahve, katı Giardia +++ A Ocak 10 K Karın ağrısı Giardia(+) Giardia +++ A Ocak 2 E Pneumoni Giardia(+), Maya (20< ) sarımsı kahve, katı Giardia +++ A Şubat 52 K Bronşit Giardia(+), Eritrosit(20<) kanlı Giardia +++ A Mart 11 K Karın ağrısı Giardia(+) Giardia +++ A Mayıs 21 E Portör kontrolü Giardia(+) yumuşak Giardia +++ A Mayıs 10 E Karın ağrısı katı Giardia ++ A Mayıs 8 K Karın ağrısı Giardia(+) katı Giardia +++ A Mayıs 19 K Portör kontrolü Giardia(+) yağlı, katı Giardia +++ A Haziran 26 E Portör kontrolü Giardia(+) yumuşak Giardia +++ A Ağustos 39 K Portör kontrolü Giardia(+) yumuşak Giardia +++ A Ağustos 8 K Karın ağrısı katı Giardia ++ A Eylül 26 K Viral enfeksiyon Giardia(+) katı Giardia + A Ekim 4 E Üriner sis. enf. Giardia(+) katı Giardia +++ A Kasım 4 E Astım Giardia(+), Lökosit (20<), Eritrosit (20<) mukuslu, sıvı Giardia + A Şubat 5 K Beslenme eksik. Giardia (+) Giardia + B Haziran 3 E Öksürük Maya (20< ) yumuşak Giardia +++ B Mayıs 5 E Karın ağrısı Giardia (+) katı-svı karışık Giardia +++ AB Mayıs 8 K Karın ağrısı Giardia (+) yağlı, yumuşak Giardia + AB Temmuz 12 E Bulantı-kusma yumuşak Giardia + AB Ağustos 10 E Bulantı-kusma katı-svı karışık 0 AB Kasım 2 E Gastroenterit Giardia (+) katı Giardia + AB Kasım 10 E Karın ağrısı Giardia (+) yeşil, yumuşak Giardia +++ AB Kasım 59 K Gastroenterit Giardia (+) yumuşak Giardia +++ AB Kasım 6 E Karın ağrısı Giardia (+) katı Giardia + AB Aralık 57 E Gastroenterit Giardia (+) kahverengi Giardia + AB Aralık 24 E Gastroöz. reflü Giardia +++ AB Tarih Yaş Cinsiyet Klinik Tanı Natif Muayene (x40) Gaitada renk içerik şekil Ç.S.F (x40) Assemblage

8 Giardia örneklerindeki Assemblage karmaşası! DNA dizi analizi sonuçlarına göre assemblage A3 çıkan örnekler sadece tek baz değişimi ile HaeIII restriksiyon enzimi için kesim bölgesi oluşturduğu için RFLP analizi sonucunda assemblage E çıkmasına sebep olmuştur. RFLP analizinde HaeIII restriksiyon enzimi için kesim bölgesi oluşturup yanlış sonuç çıkmasına sebep olan dizi ve orjinali sırasıyla 5 -GATCGCCATCCATAACGACGCCATCGCGGCCCTCAG3 ve 5 -GATCGCCATCCATAACGACGCCATCGCGGCTCTCAG3 şeklindedir.

9 Bir çok hayvan türü «özellikle buzağılar» zoonotik cryptosporidiosis için kaynak oluşturmasına rağmen; çalışmamız dahilindeki hastalar şehir merkezinde yaşamakta ve hayvanlarla sık ilişkili değildirler. Bu durum su kaynaklarının kontaminasyonunu işaret etmektedir ve kontaminasyon sıklıkla yılın yağışlı dönemlerinde gerçekleşmektedir. İlginç olarak 5 olgunun 4 ü Tekirdağ ın en az yağış aldığı Haziran ve Temmuz aylarında gerçekleşmiştir. Ayrıca hastalar şehrin ayrı bölgelerinde yaşamaktadır. Bazı çalımalara göre C. parvum un bazı subgenotiplerinin insana özgü olduğu ve antropojenik bulaş gösterdiği düşünülmektedir (Xiao L, Ryan UM; Widmer G, Sullivan S). C. hominis, C. parvum a nazaran daha geç yumurta atılımı ve daha uzun süreli klinik semptomlar sergilemektedir. Bu yüzden insanlarda C. parvum dan daha çeşitli klinik semptomlar oluşturmaktadır. Ayrıca C. hominis, C. parvum un sıklıkla erginlerde rastlanmasına karşın daha çok çocuklarda enfeksiyon oluşturmaktadır (Wielinga PR ve ark; Guk SM ve ark; Bushen OY ve ark).

10 Dünya genelinde Giardia enfeksiyonları sıklıkla Assemblage A, B ve nadiren A-B mix olarak gerçekleşmektedir (Cacció ve ark. 2005; Kohli ve ark. 2008; Franzén ve ark. 2009; Breathnach ve ark. 2010; Jerlström-Hultqvist ve ark. 2010; Ankarlev ve ark. 2010; Al-Mohammed, 2011). İnsan giardiosisinde hayvanların rolü hala tartışmalıdır. Assemblage A nın daha geniş bir konak spektrumuna sahip olduğu ve hatta çeşitli hayvanlardaki yaygınlığı insanlardan daha yüksek olduğu; Assemblage B nin insanlarda daha yaygın olduğu bildirilmiştir. Bu bağlamda zoonotik açıdan assemblage A ön plana çıkmaktadır (Sprong ve ark. 2009). Çalışmamızda, pozitif 27 numunenin 26 sı şehir ve ilçe merkezlerinden gelirken, sadece 1 örnek köyden (assemblage A) gelmiştir. Ancak, her ne kadar olgular şehir merkezlerinden geliyor olsa da, çoğunda assemblage A çıkmış olması, muhtemel bir zoonotik bulaş payının olabileceğini işaret etmektedir. Öte yandan, ilgili assemblage için birincil kaynak olan çiftlik hayvanlarının (Guerden ve ark. 2008; Santín ve ark. 2009) Tekirdağ şehir merkezinde bulunmaması, olası şebeke suyundaki veya köylerden kent pazarlarına getirilen taze sebze ve meyvelerdeki olası kontaminasyonu da akla getirmektedir.

11 Assemblage ve tiplere yönelik tartışmalar devam etmekte olup, assemblage A ve B nin insandan ve hayvandan izole edilen tiplerinin genetik olarak bazı farklılıklara sahip olduğu, olasılıkla da farklı genotipler olabileceği ifade edilmektedir (Cacció ve Ryan 2008). Yine, belli assemblage lere yönelik subgenotip sayısının tahmin edilenden fazla olduğu da öne sürülmüştür. Örneğin, çeşitli konaklardan elde edilen G. duodenalis örnekleri yüksek sekans heterogenitesine sahip ß-giardin gen bölgesi yönünden incelendiğinde, assemblage A nın 8, assemblage B nin 6, assemblage D nin 2 ve assemblage E nin 3 subgenotipinin olduğu, bunlardan A1, A2, A3, A4 ve B3 ün insanlardan, köpeklerden ve buzağılardan izole edildiği, dolayısıyla da ilgili hayvan gruplarının zoonotik açıdan önem taşıdığı bildirilmiştir (Lalle ve ark. 2007). Çalışmamızda elde edilen pozitif örneklerin sekans analizinde bütün subgenotiplerin A3 ve B3 çıkmış olması, bölgedeki hastalık açısından zoonotik bir bulaş dinamiğinin esas olduğu ile ilgili şüphelerimizi pekiştirmektedir.

12 Giardia enfeksiyonları akut ya da kronik diare, su kaybı, karın ağrısı, mide bulantısı, kusma ve kilo kaybı gibi geniş ve çeşitli klinik özellikler gösterir (Eckmann, 2003; Cacciò and Ryan, 2008). Hastalığın şiddeti parazitin virulansına, konağın gelişimine, beslenmesine ve immunolojik konumuna bağlı olarak değişmektedir. G. duodenalis in assemblage ları ile hastalık şiddeti arasındaki ilişkiye yönelik bazı bulgular söz konusu olsa da, veriler genellikle kesin değildir (Sahagún ve ark. 2007). Yapılan bu çalışmada, assemblage A saptanan hastaların %33,33 ü sindirim sistemi şikayetine sahip iken, diğerlerinde ilgili sistemi işaret eden herhangi bir bulguya rastlanamamıştır. Assemblage A-B miks 10 hastanın ilk klinik tanısı ise tamamında gastroenterit ilişkilidir. Her ne kadar, pozitif örnek sayısı kesin bir söylem açısından yetersiz kalsa da, miks olguların klinik açıdan öne çıktığını göstermektedir. Mikslerdeki assemblage A da söz konusu olan tekli mutasyon ile klinik arasında bir ilişki olup olmadığı sorusu akla gelmektedir. Bu durumun nedenini kesin olarak belirlemek daha ayrıntılı bir çalışmayı gerektirmektedir. Kaldı ki, miks olgularda assemblage lar arası beklenmedik interaksiyonların ve bunların da bazı beklenmedik sonuçlarının olabileceği akılda tutulmalıdır. Kaldı ki, temelde eşeysiz bir üreme şekline sahip olan Giardia türlerinin, bir çeşit eşeyli üreme sürecine girebiliyor olabilecekleri, bu durumun ise farklı assemblage lar arası genetik değişimleri mümkün kılabileceğini bildirilmiştir (Cooper ve ark. 2007; Teodorovic ve ark. 2007). Öte yandan, ilgili değişimin derecesi ve parazitin doğal döngüsündeki önemi hala tartışmalıdır (Cacciò ve Sprong 2010).

13 Sonuç olarak.. Tekirdağ ili için Giardia enfeksiyonlarından Assemblage A3 ve B3 sorumlu olduğu ortaya konulmuştur. Bu çalışma ile insanda C. hominis enfeksiyonu Türkiye de ilk kez bildirilmiştir.

14 Kaynaklar Al-Mohammed HI (2011). Genotypes of Giardia intestinalis clinical isolates of gastrointestinal symptomatic and asymptomatic Saudi children. Parasitol Res, 108: Ankarklev J, Jerlström Hultqvist J, Ringqvist E, Troell K, Svärd SG (2010). Behind the smile:cell biology and disease mechanisms of Giardia species. Nat Rev Microbiol, 8(6): Breathnach AS, McHugh TD, Butcher PD (2010). Prevalence and clinical correlations of genetic subtypes of Giardia lamblia in an urban setting. Epidemiol Infect, 138: Bushen OY, Kohli A, Pinkerton RC, Dupnik K, Newman RD, Sears CL, Fayer R, Lima AA, Guerrant R. Heavy cryptosporidial infections in children in northeast Brazil: comparison of Cryptosporidium hominis and Cryptosporidium parvum. Trans R Soc Trop Med Hyg 2007;101(4): Cacció SM, Sprong H (2010). Giardia duodenalis: genetic recombination and its implications for taxonomy and molecular epidemiology. Exp Parasitol, 124(1): Cacció SM, de Giacomo M, Pozio E (2002). Sequence analysis of the β giardin gene and development of a PCR-RFLP assay to genotype Giardia duodenalis cysts from human faecal samples. Int J Parasitol, 32: Cacció SM, Thompson RC, McLauchlin J, Smith HV(2005). Unravelling Cryptosporidium and Giardia epidemiology. Trends Parasitol, 21(9): Cacció SM, Ryan U (2008). Molecular epidemiology of giardiosis. Mol Biochem Parasitol, 160(2): Conboy G (1997). Giardia. Can Vet J, 38: Cooper MA, Adam RD, Worobey M, Sterling CR (2007). Population genetics provides evidence for recombination in Giardia. Curr Biol, 17(22): Eckmann L (2003). Mucosal defences against Giardia. Parasite Immunol, 25(5): Franzén O, Jerlström Hultqvist J, Castro E, Sherwood E, Ankarklev J, Reiner DS, Palm D, Andersson JO, Andersson B, Svärd SG (2009). Draft genome sequencing of giardia intestinalis assemblage B isolate GS: is human giardiosis caused by two different species? PLoS Pathog, 5(8):e Guk SM, Yong TS, Park SJ, Park JH, Chai JY. Genotype and animal infectivity of a human isolate of Cryptosporidium parvum in the Republic of Korea. Korean J Parasitol 2004; 42: Heine J. Eine einfache Nachweismethode für Kryptosporidien im Kot. Zbl Vet Med B 1982; 29: Jerlström-Hultqvist J, Ankarklev J, Svärd SG (2010). Is human giardiosis caused by two different Giardia species? Gut Microbes, 1(6): Kohli A, Bushen OY, Pinkerton RC, Houpt E, Newman RD, Sears CL, Lima AAM, Guerrant RL (2008). Giardia duodenalis assemblage, clinical presentation and markers of intestinal inflammation in Brazilian children. Trans R Soc Trop Med Hyg, 102(7): Lalle M, di Regalbono F, Poppi L, Nobili G, Tonanzi D, Pozio E, Cacciò SM (2007). A novel Giardia duodenalis assemblage A subtype in fallow deer. J Parasitol, 93: Lalle M, Pozio E, Capelli G, Bruschi F, Crotti D, Cacció SM (2005). Genetic heterogeneity at the ß-giardin locus among human and animal isolates of Giardia duodenalis and identification of potentially zoonotic subgenotypes. Int J Parasitol, 35: Sprong H, Cacciò SM, van der Giessen JW, on behalf of the ZOOPNET network and partners (2009). Identification of zoonotic genotypes of Giardia duodenalis. PLoS Negl Trop Dis 3(12):3:e558. Santín M, Trout JM, Fayer R (2009). A longitudinal study of Giardia duodenalis genotypes in dairy cows from birth to 2 years of age. Vet Parasitol, 162: Sahagún J, Clavel A, Goni P, Seral C, llorente MT, Castillo FJ, Capilla S, Arias A, Gomez-Lus R (2007). Correlation between the presence of symptoms and the Giardia duodenalis genotype. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 27(1): Teodorovic S, Braverman JM, Elmendorf HG (2007). Unusually low levels of genetic variation among Giardia lamblia isolates. Eukaryot Cell, 6(8): Wielinga PR, de Vries A, van der Goot TH, Mank T, Mars MH, Kortbeek LM, van der Giessen JW. Molecular epidemiology of Cryptosporidium in humans and cattle in The Netherlands. Int J Parasitol 2007; 38: Widmer G, Sullivan S. Genomics and population biology of Cryptosporidium species. Parasite Immunol 2012;34: Xiao L, Ryan UM. Molecular epidemiology. In: Fayer R, Xiao L, eds. Cryptosporidium and Cryptosporidiosis. 1st ed. Boca Raton: CRC Press; p