Gen Mutasyonu, DNA Onarımı ve Transpozisyon

Transkript

1 Gen Mutasyonu, DNA Onarımı ve Transpozisyon DNA moleküllerinin bilgiyi depolama, replikasyon, transkripsiyon ve translasyon etme becerileri genetik fonksiyonlarının temelini oluşturur. Fakat DNA nın hatalar yapması da aynı oranda önemlidir. DNA dizilerindeki değişikliklerden kaynaklanan varyasyonlar olmaksızın ne bir fenotipik çeşitlenme, ne çevresel değişikliklere uyum, ne de evrim olurdu. Gen mutasyonları çoğu yeni allelin kaynağı ve popülasyonlardaki genetik çeşitlenmenin kaynağıdır.

2 MUTASYONLAR ÇEŞİTLİ ŞEKİLLERDE SINIFLANDIRILIR Mutasyon, DNA dizisindeki bir değişiklik olarak tanımlanabilir. Bir DNA molekülünün herhangi bir yerindeki herhangi bir baz-çifti değşikliği, mutasyon olarak değerlendirilebilir. Mutasyon, tek bir baz çifti yer değişiminden, bir delesyondan ya da bir veya daha fazla baz çiftinin insersiyonundan oluşabilir ya da bir kromozomun yapısında önemli değişimi içerebilir. Mutasyonlar, protein kodlayan bir genin bölgeleri içinde ya da genin nasıl ifade edileceğini etkileyen gen dışı bölgelerde olabilir ya da olmayabilir. Bu nedenle mutasyonlar, fenotipte tanımlanabilie bir değişikliğe yol açabilir ya da açmayabilirler.

3 Mutasyonun bir organizmanın karakteristiklerini değiştirme derecesi mutasyonun nerede olduğuna ve mutasyonun geni ne oranda değiştirdiğinin derecesine bağlıdır. Onların oluşumuyla hiçbir etken ilişkilendirilmiş değildir ve genellikle genlerin nükleotid dizilerindeki rastgele değişiklikler olarak kabul edilirler. Mutasyonlar somatik hücrelerde ya da germ hücrelerinde olabilir. Germ hücrelerinde olanlar kalıtılabilir, genetik hastalıklar kadar genetik çeşitliliğin ve evrimin de temelini oluştururlar. Somatik hücrelerde olanlar, yerel hücre ölümüne, hücresel fonksiyon değişikliğine ya da tümör oluşumuna yol açabilir. Spontan (kendiliğinden), Uyarılmış ve Adaptif (uyumsal) Mutasyonlar Tüm mutasyonlar ya spontan ya da uyarılmış mutasyonlardır. Spontan mutasyonlar doğal olarak oluşan mutasyonlardır.

4 Bu tür mutasyonların çoğu organizmada azotlu bazların yapısını değiştiren normal biyolojik ya da kimyasal işlemlerle ilişkillendirilir. Spontan mutasyonlar, sıklıkla, enzimatik DNA eşleşmesi (replikasyon) işlemi sırasında oluşur. Genetik şifrelemede bir hata oluştuğunda, bu durum kodlanan proteinin Aa kompozisyonuna yansıyabilir. Eğer Aa değişikliği bir proteinin yapısal ya da biyokimyasal aktivitesi için önemli ise fenotipik bir değişikliğe yol açabilir. Spontan mutasyonların aksine, herhangi bir dışsal faktörün etkisi sonucu oluşan mutasyonlara ise uyarılmış mutasyonlar denir. Uyarılmış mutasyonlar doğal ya da yapay ajanlar sonucu oluşabilir. Örneğini kozmik ve mineral kaynaklardan salınan radyasyon ve güneşten gelen UV radyasyonu, organizmaların çoğunun maruz kaldığı enerji kaynaklarıdır ve bu enerjiler uyarılmış mutasyonlara neden olabilmektedir.

5 Adaptif/uyumsal mutasyon algılaması, tartışmalı olan ve organizmaların belirli bir çevresel baskıya uyum sağlamak için gen mutasyonunun doğasını «seçebildiği» ya da «yönlendirebildiği» düşüncesi etrafında dönmektedir te Salvador Luria ve Max Delbrück, mutasyonların adaptif değil, fakat spontan olarak oluştuğuna dair ilk doğrudan kanıtı sunmuşlardır (Luria-Delbrück fluctuation test-luria-delbrück oynama testi). Mutasyonun Yerine Göre Sınıflandırılması Mutasyonlar oluştukları hücre tipi ya da kromozomal bölgelere göre sınıflandırılabilirler. Somatik Mutasyonlar; vücutta germ hücreleri dışında herhangi bir hücrede olabilirler. Germ Mutasyonları; gametlerde oluşur.

6 Otozomal mutasyonlar; otozomlar üzerinde yer alan genlerde oluşurken, X e bağlı mutasyonlar; X kromozomu üzerinde bulunan genlerde oluşur. Somatik hücrelerde olan mutasyonlar gelecek nesillere aktarılmazlar. Diploid bir organizmanın somatik bir hücresinde bir otozomal resesif mutasyon oluştuğunda, tanımlanabilir bir fenotipe yol açma olasılığı azdır. Bu tür mutasyonların çoğunun ifadesinin yabanıl allel tarafından maskelenmesi olasıdır. Somatik mutasyonlar, eğer erkeklerde, X e bağlı ya da dominant iseler, bu tür mutasyonlar büyük olasılıkla erken ifade edileceklerinden, daha büyük bir, etki yapacaklardır. Benzer şekilde, dominant ya da X e bağlı somatik mutasyonlar gelişimin erken evrelerinde, farklılaşmamış hücrelerin bir çok farklılaşmış organ ve dokuya dönüşeceği dönemde oluşursa etkileri daha dikkat çekici olacaktır.

7 Yetişkin dokularında oluşan mutasyonlar genellikle mutasyon geçirmemiş ve normal işlev yapan binlerce kez binlerce sayıda hücrenin etkisiyle maskelenecektir. Germline ın bir bölümü olarak gametlerdeki mutasyonlar yeni nesillere aktarıldıklarından çok daha önemlidirler. Onların yeni neslin tüm hücrelerinde ifade potansiyelleri bulunur. Otozomal dominant mutantlar ilk jenerasyonda fenotipik olarak görülecektir. Homogametik dişilerin gametlerinde oluşan X e bağlı resesif mutasyonlar, etkilenmiş X kromozomunu alan hemizigot erkeklerde ifade edilebilir. Bu durumda ancak erkek çocuğun etkilenmiş X kromozomunu alması durumunda olacaktır. Heterozigotluk nedeniyle, erkek veya dişilerin herhangi birinin gametlerinde oluşan bir otozomal resesif mutasyon, oluşan allel popülasyonda yayılana kadar nesiller boyunca dikkat çekmeden aktarılabilir.

8 Bazı durumlarda, resesif mutant bir allel, heterozigot ya da hemizigot durumda iken tanımlanabilen bir fenotipe yol açabilir. Bu durum, haployetmezlik olarak bilinen, yabanıl allelin gen ürününün fonksiyonunu yerine getirecek kadar, yeterli düzeyde sentezlenememesi durumunda olur. Bazı insan hastalıkları, trasnkripsiyon faktörlerini kodlayan genlerde haployetmezlik sonucu oluşur. Moleküler Değişiklik Tipine Göre Sınıflandırma Gen mutasyonları genellikle, mutasyonu oluşturan nukleotit değişikliklerine göre sınıflandırılırlar. Bir DNA molekülünde bir baz çiftinin diğer bir baz çiftine dönüşümü baz yer değiştirme ya da nokta mutasyonu olarak adlandırılır.

9

10 Bir genin protein kodlayan kısmındaki bir tripletteki bir nükleotidin değişmesi, protein ürününde farklı bir Aa i kodlayan yeni bir tripletin oluşumuna yol açabilir. Eğer bu durum gerçekleşirse, mutasyon yanlış anlamlı mutasyon (missense mutation) olarak bilinir. 2. olası sonuçta, triplet bir durdurucu/stop kodonuna dönüşecek, protein sentezinin/translasyonunun sonlanması sonucunu doğuracaktır. Bu durum anlamsız/nonsense mutasyon olarak bilinir. Eğer nokta mutasyonu bir kodonu değiştirir fakat proteinin o pozisyonunda bir Aa değişikliğine yol açmazsa bu durum sessiz/silent mutasyon olarak değerlendirilir. Eğer bir pirimidin bir pirimidinle yer değiştirir veya bir pürin diğer bir pürinle yer değiştirirse, bir transisyon (geçiş) olmuştur.

11 Eğer bir pürin ve pirimidin karşılıklı yer değiştirirse bir transversiyon (değişim) olmuştur. Diğer bir tip değişim, gen içinde herhangi bir noktaya bir ya da daha fazla nükleotidin girmesi (insersiyon) veya çıkmasıdır (delesyon). Bu örnekler çerçeve kayması mutasyonları olarak adlandırılır.

12 Çünkü translasyon sırasında üçlü okuma çerçevesi değişmiştir. Fenotipik Etkilerine Göre Sınıflandırma Yerleşim yerleri ve tiplerine göre mutasyonlar, sessiz mutasyonlardan dominant öldürücülere kadar geniş bir fenotipik etki gösterebilir. Bir işlev kaybı mutasyonu, gen ürününün işlevini yok eden bir mutasyondur. Nokta mutasyonundan genin tamamının kaybına kadar herhangi bir mutasyon, işlev kaybına neden olabilir. Bu mutasyonlar aynı zamanda null (yokluk) ya da knockout (nakavt) olarak da bilinirler. İşlev kaybı mutasyonunun baskın ya da çekinik olması olasıdır. Baskın işlev kaybı bir mutasyon, bozuk bir proteinin aynı organizmada bulunan normal gen ürününe bağlanması ya da işlevini inhibe etmesiyle oluşabilir.

13 İşlev kazancı (gain of function) mutasyonu, gen ürününün yeni bir işlev kazanmasına yol açar. Bu durum, yeni işlevi yürüten proteinin Aa dizisinde bir değişiklikle, ya da genin düzenleyici bölgesindeki bir mutasyondan dolayı genin anormal derecede; yer, ya da zamanda ifade edilmesine yol açabilir. En kolay gözlenen mutasyonlar, morfolojik bir özelliği etkileyen mutasyonlardır. Görülebilen mutasyonlar olarak da bilinen bu mutasyonlar, normal ya da «yabanıl tip» (wild-type) fenotipi değiştirebilmeleri özellikleriyle tanımlanırlar. Mutasyonların 2. geniş kategorisi; besinsel (nutrisyonel) veya biyokimyasal mutasyonları kapsar. Bakteri ve mantarlarda tipik bir besinsel mutasyon, bir Aa veya vitamini sentezlemedeki yetersizliktir. İnsanlarda orak hücre anemisi ve hemofili, biyokimyasal mutasyon örnekleridir.

14 Üçüncü kategoride; bir organizmanın davranış kalıplarını etkileyen mutasyonlar yer alır. Örneğin, hayvanların günlük ritimleri veya eşleşme davranışlarını değişebilir. Davranış mutasyonlarının primer hedeflerinin belirlenmesi genellikle zordur. Örneğin, meyva sineğinin eşleşme davranışı eğer kanatlarını çırpmazsa bundan etkilenir. Bununla beraber, bozukluk, uçma kasında, kaslara giden sinirlerde, kanat hareketlerini başlatan sinir uyarılarının oluştuğu beyinde olabilir. Diğer bir mutasyon biçimi de genlerin regülasyonunu etkileyebilir. Genetik regülasyon hakkındaki bilgilerimiz bu tür düzenleyici mutasyonların, gen anlatımını etkilediğini göstermektedir.

15 Bir mutasyonun organizmanın yaşamı için mutlak gerekli olan bir süreci engellemesi de olasıdır. Bu durumda mutasyon letal (öldürücü) mutasyon olarak tanımlanır. Örneğin, bir Aa sentezleme yeteneğini kaybetmiş mutant bir bakteri, o Aa in olmadığı bir ortama konulduğunda büyümeyi durduracak ve sonuçta ölecektir. Örneğin, Tay-Sach ve Huntington hastalıkları, insanların hayat döngülerinin farklı noktalarında ölüme yol açan mutasyonlar nedeniyle oluşurlar. Mutasyonların diğer ilginç bir özelliği, onların ifade edilmesinin organizmanın yaşadığı çevreye bağımlı olduğu durumdur. Bu tür mutasyonlara koşullu (şarta bağlı) mutasyonlar olarak adlandırılır. Çünkü organizmanın genomunda mutasyon olabilir, fakat onun varlığı ancak bazı koşullar altında fark edilebilir.

16 Koşullu mutasyonların en iyi örneklerini, birçok organizmada bulunmuş olan sıcaklığa duyarlı mutasyonlar oluşturur. Bazı tolere edici sıcaklıklarda, mutant gen ürünü normal olarak çalışır, fakat «kısıtlayıcı» sıcaklıklarda fonksiyonel becerisini kaybeder. Spontan Mutasyonlar Replikasyon Hatalarından ve Baz Modifikasyonlarından Oluşur DNA Replikasyon Hataları: DNA replikasyon işlemi mükemmel değildir. Arada sırada, DNA nın replike olan zincirinde DNA polimeraz yanlış nukleotitleri yerleştirebilir. DNA polimeraz bu replikasyon hatalarının çoğunu yapılarında bulunan 3-5 yönünde çalışan eksonukleazlarını kullanarak düzeltebilmelerine karşın, yanlış girmiş nukleotitler replikasyondan sonra kalabilirler.

17 Eğer bu hatalar DNA onarım mekanizmalarınca tanınıp onarılmazsa, mutasyona yol açabilirler. Bazların tautomer diye bilinen birkaç formda bulunabilmeleri de DNA replikasyonu sırasında yanlış eşleşmeyi arttırır. Replikasyon Kayması Nokta mutasyonlarına ek olarak, DNA replikasyonu küçük insersiyon ve delesyonlara neden olabilir. Bu mutasyonlar, replikasyon sırasında DNA kalıbının bir zincirinin ilmik oluşturup ayrıldığı zaman ya da DNA polimerazın kayıp, yeniden başlangıç noktasına döndüğü zamanda oluşur. Eğer, replikasyon esnasında kalıp zincirde bir ilmik oluşursa, DNA polimeraz ilmekteki nukleotitleri göremez ve yeni zincirde küçük bir delesyon oluşur.

18 Eğer, DNA polimeraz kalıp zincirde bulunmayan nukleotitleri tekrar yerleştirirse yeni sentezlenen zincirde eşleşmeyen ilmik oluşturacak şekilde bir ya da daha fazla sayıda nukleotitin insersiyonu oluşur. İnsersiyon ya da delesyonlar çerçeve kayması mutasyonlarına ya da gen ürününde Aa in eklenme ya da çıkarılmalarına yol açar. Replikasyon kayması DNA da herhangi bir yerde olabilir, fakat tekrarlayan dizilere sahip bölgeleri tercih ediyor gibi görünmektedir. Tekrarlayan diziler DNA mutasyonu için sıcak noktalardır. Tautomerik Kaymalar 1953 de Watson ve Crick, DNA nın moleküler yapısını tanıttıktan hemen sonra bu yapının genetik getirilerini tartışan bir makale yayımladılar.

19 DNA daki pürin ve pirimidinlerin tautomerik formlarda, yani azotlu bir bazın her birinin, molekülde sadece tek bir protonun kayması farklılık gösteren yapısal izomerleri olarak adlandırılan alternatif kimyasal formları bulunabileceğini gördüler. Biyolojik bir öneme sahip olan tautomerler, sitozin ve adenin amino-imino formları ile timin ve guaninin keto-enol fromlarını içerir. Bu kaymalar molekülün bağ özelliğini değiştireceğinden Watson ve Crick, tautomerik kaymaların baz çifti değişimlerine veya mutasyonlara yol açabileceğini ileri sürdüler. Azotlu bazların en kararlı tautomerleri, DNA nın çift sarmal modelinin temelini oluşturan standart baz eşleşmelerinde rol alırlar. Daha az sıklıkla oluşan geçici tautomerler komplementer olmayan bazlara H bağı kurabilme özelliğindedirler.

20 Bununla beraber, eşleşme her zaman bir pürin ile bir pirimidin arasındadır.

21 Diğer eşleşmelerin yanısıra anormal T=G ve C=A çiftleri de oluşabilir. Mutasyona yol açan bu etki, DNA replikasyonu sırasında kalıp zincir çiftleri üzerindeki nadir bir tautomerin komplementer olmayan bir baz ile eşleşmesi durumunda oluşur. Sonraki replikasyon esnasında, baz çiftinin «mismatched» üyeleri ayrılır ve her biri kendisinin normal komplementer bazı için kalıp haline gelir. Sonuç bir nokta mutasyonudur.

22

23 Depürinasyon ve Deaminasyon Spontan mutasyonların en yaygın nedenlerinden bazılarını DNA baz hasarları oluşturur. Depürinasyon, çift sarmal DNA molekülü bütünlüğü içindeki azotlu bazlardan birinin kaybolmasını içerir. Sıklıkla bu tür bir durum, pürinleri ya guanin ya da adenin içerir. Bu bazlar, eğer, pürin halkasının 9. pozisyonu ile deoksiribozun 1 C nunu bağlayan glikozidik bağ kırılırsa kaybolurlar. Bu durum, DNA nın bir zincirinde bir apürinik (AP) bölge oluşumuna yol açar. Genetikçiler, kültürdeki memeli hücrelerinin DNA sında, günlük olarak bu tür spontan lezyonlardan binlercesinin oluştuğunu tahmin etmektedirler.

24 Eğer AP bölgesi onarılmazsa, DNA replikasyonu esnasında o pozisyonda kalıp rolü oynayacak hiçbir baz bulunmayacaktır. Sonuç olarak, DNA polimeraz bu bölgede bir nükleotidi rastgele yerleştirebilir. Deaminasyon sırasında, adenin ve sitozindeki bir amino grubu keto grubuna dönüşmektedir.

25 Bu iki olayda, sitozin urasile ve adenin hipoksantine dönüştürülür. Bu değişikliklerin en önemli etkisi replikasyon sırasında her iki molekülün baz eşleşme özelliklerinin değişmesidir. Örneğin, C normalde G ile eşleşir. A ile eşleşen U e dönüştükten sonra, orijinal G C çifti A = U çiftine ve daha sonra, bir replikasyon döngüsünden sonra bir A = T çiftine dönüşür. Adenin deamine edildiğinde, oluşan hipoksantin normalde sitozinle eşleştiğinden, orijinal bir A = T çifti bir G C çiftine dönüşür. Deaminasyon, spontan olarak ya da nitroz asit (HNO 2 ) gibi kimyasal mutajenlerle karşılaşma sonucu oluşabilir.

26 Oksidatif Hasar DNA, normal hücresel fonksiyonlarının yan ürünlerince de hasar görebilir. Bu yan ürünler içinde normal oksijenli solunum sırasında oluşan reaktif oksijen türleri bulunur. Örneğin, hücresel metabolizma sırasında süperoksitler (O 2 * - ), hidrpksil radikalleri (*OH) ve hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) oluşurlar ve DNA nın bütünlüğü için sürekli tehdittirler. Trasnspozonlar Yer değiştirebilen genetik elementler hem prokaryotlarda hem de ökaryotlarda spontan mutasyon ajanlarıdır.

27 Uyarılmış Mutasyonlar Radyasyon Kimyasalların Neden Olduğu DNA Hasarlarından Oluşur Dünya daki tüm hücreler, DNA da hasar yapma ve mutasyona neden olma potansiyeline sahip ajanlar (mutajenler) bolluğu ile karşı karşıyadır. Mantar toksinleri, kozmik ışınlar ve UV gibi bu ajanların bazıları çevremizin doğal bileşenleridir. Bazı endüstriyel kirleticiler, tıbbi X ışınları ve sigara dumanındaki kimyasalların da dahil olduğu diğerleri, doğal olmayan ya da modern dünyamıza insan tarafından yapılan katkılar olarak değerlendirilebilir. Baz Analogları Bu mutajenik kimyasallar nükleik asit biyosentezi sırasında, pürin ve pirimidinlerin yerine geçebilirler.

28 Örneğin, urasil in bir türevi olan 5-bromourasil (5-UB), timin analoğu olarak davranır ve pirimidin halkasının 5 numaralı pozisyonunda halojenlenir. Eğer, 5-BU, deoksiriboza kimyasal olarak bağlanırsa, nukleozid analoğu bromodeoksiuridin (BrdU) oluşur.

29 Alkilleyici Ajanlar 1. Dünya Savaşı nda keşfedilen kükürt içeren hardal gazları, kimyasal savaş araştırmalarında tanımlanan ilk kimyasal gruplardan bazılarıydı. Hardal gazları alkilleyici ajanlardır; nükleotidlerdeki amino veya keto gruplarına CH 3 veya CH 3 CH 2 gibi bir alkil grubu eklerler. Örneğin, etilmetan sulfonat (EMS), guaninin 6 numaralı ve timinin 4 numaralı pozisyondaki keto gruplarını alkillerler

30 Akridin Boyaları ve Çerçeve Kayması Mutasyonları Akridin boyaları adını alan kimyasal mutajenler çerçeve kayması mutasyonlarına neden olurlar. En çok çalışılmış akridin mutajeni olan profilavin ve akridin sarısı (oranj) dır.

31 Yaklaşık olarak bir azotlu baz çifti boyutlarında olan akridin boyaları, bütün DNA nın pürin ve pirimidinleri arasına sıkışarak girer veya «interkale» (intercalate) yaparlar. Interkalasyon, DNA sarmalında genişlemeler oluşturarak delesyon ve eklemelere neden olur ve çerçeve kayması mutasyonları meydana gelir. UV Işınları ve Timin Dimerleri Dünya daki tüm enerji, çeşitli dalga boylarında bir seri elektromanyetik bileşenlerden oluşur.

32 Elektromanyetik spektrum olarak tanımlanan, çeşitli bileşenlerle ilişkili olan enerji; dalga boyu ile ters ilişkili olarak değişkenlik gösterir. Görünen ışığı da içeren ve ondan daha uzun dalga boyu olan her şey organik moleküllerin çoğu ile etkileştiğinde iyi huyludur (bening). Buna karşın, daha kısa dalgaboylu olan her şey, daha fazla enerji taşıdığından, canlı dokuları da içine alacak şekilde organik moleküller üzerinde bozucu bir etkiye sahiptir de Drosophila yumurtaları ile yapılan çalışmaların bir sonucu olarak, UV radyasyonunun mutajenik olduğu keşfedilmiştir. UV radyasyonunun esas etkisi özellikle 2 timin bazını ilgilendiren pirimidin dimerleridir.

33

34 Organizmalar Mutasyonlara Karşı DNA Onarım Sistemlerini Kullanır Canlı sistemler, içsel ve dışsal ajanların oluşturduğu DNA hasarının birçok formunu etkisizleştirebilen özenle oluşturulmuş çeşitli onarım sistemleri geliştirmişlerdir. Onarım sistemleri, organizmaların genetik bütünlüklerinin devam etmesi için kesinlikle vazgeçilmezdir ve öyle oldukları için organizmaların yeryüzündeki yaşamları için önemlidir. Hata Okuma (Proofreading) ve yanlış Eşleşme (Mismatch) Onarımı DNA daki en yaygın mutasyonlardan bazıları DNA replikasyonu sırasında, DNA polimeraz tarafından doğru olmayan bir nukleotit yerleştirdiği zaman oluşur. Bakterilerdeki enzim (DNA polimeraz III) yaklaşık olarak her yerleştirmede bir hata yapar ve 10-5 lik bir hata hızına yol açar.

35 Enzim her basamakta hata-okuması (proofreading) yaparak hataların %90 ını yakalar. Polimerizasyon esnasında hatalı bir nukleotit yerleştirildiğinde enzimin hatayı tanıma, hatanın «yönünü» değiştirme ve eksonukleaz gibi davranma, hatalı nukleotiti keserek onu doğrusu ile değiştirme potansiyeli vardır. Bu durum, replikasyon etkinliğini 100 misli arttırır ve DNA replikasyonunun hemen ardından sadece 1/10 7 yanlış eşleşme ve hata sıklığının da 10-7 ye düşmesine yol açar. Proofreading sonrası kalan hatalarla başa çıkmak üzere başka bir mekanizma olan yanlış eşleşme (mismatch) onarımı işlerlik kazanabilir. Robin Holliday bu mekanizmayı önermiştir ve sistemin moleküler temeli iyi anlaşılmıştır.

36 Diğer DNA lezyonlarının onarımında olduğu gibi, değişiklikler ya da yanlış eşleşmeler tanınır, doğru olmayan nukleotitler uzaklaştırılır ve doğru olmayan nukleotitlerin yerine doğru olanlar getirilir. Fakat yanlış eşleşmenin düzeltilmesiyle ilgili olarak özel bir problem vardır. Onarım sistemi hangi zincirin doğru (kalıp) ve hangisinin yanlış eşleşmiş bazı içerdiğini fark edecektir. Eğer yanlış eşleşme tanınır fakat ayırım gerçekleşmezse, kesip-çıkarma rastgele olacaktır ve doğru bazı taşıyan zincir %50 olasılıkla kesilip çıkarılacaktır. Zincir seçimi işlevi, E. coli de dahil olmak üzere, en azından bazı bakterilerde aydınlatılmıştır ve temeli DNA metilasyonuna dayanmaktadır. Bu bakteriler, DNA replikasyonu sırasında 5.. GATC CTAG..5

37 DNA dizisini substrat olarak tanıyan, A nukleotitlerinin her birine bir metil grubu ekleyen bir enzime adenin metilaz- sahiptir. Bu modifikasyon hücre döngüsü boyunca kararlıdır. Bir replikasyon döngüsünü takiben, metilaz enzimi DNA polimerazın arkasında kaldığı için, yeni sentezlenmiş zincirler geçici bir süre metillenmemiş olarak kalır. Onarım enzimi bu noktada yanlış eşleşmiş nukleotit çiftini tanır ve tercihen metillenmemiş (yeni sentezlenmiş) DNA zincirine bağlanır. Metillenmemiş zincirde, yanlış eşleşmenin 5 veya 3 tarafında bir endonukleaz enzimi tarafından bir çentik (nick) açılır. Çentiklenmiş (koparılmış, kırılmış) DNA zinciri daha sonra açılır ve bir eksonukleaz tarafından yanlış eşleşme noktasına kadar sindirilir.

38 Son olarak, DNA polimeraz doğru DNA zincirini kalıp olarak kullanarak, eksonukleaz tarafından oluşturulan boşluğu doldurur. DNA ligaz daha sonra boşluğu kapatır. Replikasyon-Sonrası (Post-Replication) Onarım ve SOS Onarım Sistemi DNA hasarını önlemek için önlemek için evrimleşmiş olan bu tür mekanizmaların çeşitliliğini gösteren bir çok diğer onarım tipleri de keşfedilmiştir. Replikasyon sonrası onarım adını alan bu sistem, adına uygun olarak, hasarlı DNA onarımdan kaçtığında ve tam replike edilemediğinde harekete geçmektedir.

39

40 Herhangi bir çeşit lezyon (pirimidin dimeri gibi) bulunduran DNA replike olurken DNA polimeraz lezyonda duraklayabilir ve sonra, yeni sentezlenen zincir üzerinde bir boşluk bırakarak, onun üzerinden atlar.

41 Aralığı düzeltmek için, RecA proteini aynı yöndeki hasarsız atasal zincir üzerindeki ilgili bölgeyle (donör/verici zincir) rekombinasyonel bir değiş-tokuş işlemi yürütür. Hasarsız DNA parçası hasarlı parçayla yer değiştirdiğinde, bu aralığı donör/verici zincir üzerine transfer eder. Bu boşluk, replikasyon ilerlerken onarım sentezi ile doldurulabilir. Bu tip DNA onarım sisteminde rekombinasyonel bir olay yaşandığından, postreplikasyon onarımı homolog rekombinasyon onarımı olarak da bilinir.

42

43

44

45

46

47

48 E. coli de hasarlı DNA ya farklı bir şekilde yanıt veren SOS onarım sistemi olarak adlandırılan diğer bir onarım yolu daha vardır. DNA replikasyonu sırasında DNA yanlış eşleşmelerinin ve boşlukların varlığında, bakteriler ürünleri bu tür lezyonların varlığında bile DNA replikasyonunun oluşumuna izin veren yaklaşık 20 kadar genin (lexa, reca, ve uvr de dahil olmak üzere), ifade edilmelerini uyarabilirler. Bu tip onarım DNA hasarına karşı son çare olduğundan, SOS onarım olarak bilinir. SOS onarımı sırasında DNA sentezi hataya yatkın, hata oranı yüksek hale gelir, normal olarak DNA replikasyonunu durduracak yerlere rastgele ve olasılıkla da yanlış nukleotitleri yerleştirir. Sonuç olarak da SOS onarımı mutajenik hale gelirken, bununla beraber, hücreye onu öldürecek olan DNA hasarıyla yaşama şansı da verir.

49 Fotoreaktivasyon Onarımı: Bakterilerde UV Hasarının Geri Dönüşümü UV ışını, pirimidin dimerleri oluşturmasının bir sonucu olarak mutajeniktir. UV ile uyarılmış mutajenize çalışmaları, DNA hasarının doğal onarımının birçok formunun keşfedilmesine yol açmıştır. Bakterilerde UV hasarının onarımı ile ilgili olarak ilk keşif 1949 da Albert Kelner in fotoreaktivasyon onarımı fenomenini gözlemlemesiyle yapılmıştır. Kelner E. coli DNA sında UV ile uyarılmış olan hasarın, radyasyonu takiben, hücreler görünür ışık spektrumunun mavi bölgesindeki ışığa kısa süre maruz bırakılırsa, kısmen geriye döndürülebileceğini göstermiştir. Fotoreaktivasyon onarım işlevinin aynı zamanda sıcaklığa bağımlı olduğunun gösterilmesi, ışıkla uyarılan mekanizmanın enzimler tarafından kontrol edilen kimyasal bir reaksiyon olduğunu düşündürmektedir.

50 Diğer fotoreaktivasyon çalışmaları, sistemin fotoreaktivasyon enzimi (FRE) olarak adlandırılan bir proteinin aktivitesine bağımlı olduğunu göstermiştir. Enzimin aktivasyon şekli timin dimerleri arasındaki bağları kırmaktır, böylece UV radyasyonunun DNA üzerindeki etkisini tersine çevirir.

51 Enzim bir dimere karanlıkta bağlanabilirken, dimeri kırmak için bir ışık fotonu absorbe etmek zorundadır. UV ile uyarılan mutasyonları azaltma potansiyeline karşın, fotoreaktivasyon onarımı E. coli de mutlak gerekli değildir. Çünkü, FRE yi kodlayan gendeki bir null mutasyonu öldürücü değildir. Buna ek olarak, insan ve diğer ökaryotlarda bu enzim henüz bulunamamıştır. Baz ve Nukleotit Kesip-Çıkarma (Eksizyon) Onarımı FRE ye ilaveten, tüm prokaryot ve ökaryotlarda ışıktan bağımsız onarım sistemleri bulunur. Bu tip onarım sistemlerindeki temel mekanizma kesip-çıkarma olarak adlandırılır. Aşağıdaki 3 basamaktan oluşur ve genel olarak «kes-ve-yapıştır» sistemleri olarak tanınır.

52 1. DNA sarmalının iki zincirinden birinde bulunan bozuk bölge veya hata tanınır ve enzimatik olarak bir nukleaz tarafından kesip-çıkarılır. Fosfodiester omurgadaki kesip-çıkarmalar genellikle hataya komşu birkaç nukleotiti kapsar ve sarmalın bir zincirinde bir boşluk bırakır. 2. Bir DNA polimeraz, sağlam zinciri kalıp olarak kullanarak, komplementer olan deoksiribunukleotitleri yerleştirerek boşluğu doldurur. Enzim bu bazları, kesilmiş DNA nın 3 OH ucuna ekler. E. coli de bu genellikle DNA polimeraz I tarafından yapılır. 3. DNA ligaz en son yerleştirilen nukleotitin 3 OH ucunda kalan son «çentik»i yapıştırır ve boşluğu kapatır. İki tip kesip-çıkarma onarımı vardır. * Baz kesip-çıkarma onarımı * Nukleotit kesip-çıkarma onarımı

53 Baz Kesip-Çıkarma Onarımı (BKO) Azotlu bazların, spontan hidrolizi ya da onları kimyasal yolla değiştiren etkenler nedeniyle oluşan DNA hasarını onarır. E. coli de BKO yolunun ilk basamağı kimyasal olarak değişmiş olan bazın, farklı tipteki DNA hasarlarına karşı özgün olan DNA glikozilazlar tarafından tanınmasıyla ilgilidir.

54 Örneğin, Urasil-DNA glikozilaz enzimi urasilin DNA daki varlığını tanır. Enzim ilk olarak, bazla şeker arasındaki glikozidik bağı koparır ve apirimidik (AP) bölge oluşturur. Bazı olmayan bu tür bir şeker, daha sonra AP endonukleaz olarak adlandırılan bir enzim tarafından tanınır. Endonukleaz, fosfodiester omurgayı AP bölgesinde keser. Bu durum DNA sarmalında kesip-çıkarma onarımınca tanınan bir bükülme yaratır, aktifleşen kesip-çıkarma onarımı sonuçta hasarı düzeltir. Baz Kesip-Çıkarma onarımı DNA daki modifiye bazları tanır ve değiştirirken, nukleotit kesip-çıkarma onarım yolu (NKO) daha önce anlatılan UV tarafından uyarılıan pirimidin dimerlerini ve çift sarmaldeki «büyük» lezyonları onarır. NKO yolu, UV radyasyonuna duyarlılık gösteren birkaç bağımsız mutantı izole etmeyi başaran Paul Howard-Flanders ve ark. tarafından ilk kez E. coli de keşfedilmiştir.

55

56 uvr (ultraviyole onarımı) olarak tanımlanan bir gen grubu, uvra, uvrb ve uvrc mutasyonlarını kapsar. NKO yolunda uvr gen ürünleri DNA daki lezyonları tanıma ve kesipçıkarmalarıyla ilgilidirler. Genellikle, lezyonun her iki tarafından özgün sayıda nukleotitler kesip-çıkarılır.